UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

WYDEMBERG JOSÉ DE ARAÚJO

CARACTERIZAÇÃO DA COMUNIDADE MICROBIANA DE

RESERVATÓRIO DE PETRÓLEO

NATAL

2017
 WYDEMBERG JOSÉ DE ARAÚJO

CARACTERIZAÇÃO DA COMUNIDADE MICROBIANA DE

RESERVATÓRIO DE PETRÓLEO

Dissertação apresentada ao
Departamento de Bioquímica da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em
Bioquímica.
Orientador: Lucymara Fassarella Agnez-
Lima.

NATAL

2017
 Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -
Centro de Biociências - CB

Araújo, Wydemberg José.

Caracterização da comunidade microbiana de reservatório de petróleo /
Wydemberg José de Araújo. - Natal, 2017.
119 f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro

de Biociências. Programa de Pós-graduação em Bioquímica.
Orientadora: Profa. Dra. Lucymara Fassarella Agnez-Lima.

1. Biotecnologia - Dissertação. 2. Metagenoma - Dissertação. 3. Microbiologia

- Dissertação. 4. Petróleo - Dissertação. 5. Degradação - Dissertação. I. Agnez-
Lima, Lucymara Fassarella. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III.
Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 608.5

 Dedico esta obra

Aos meus pais e amigos pelo incentivo e apoio.

 AGRADECIMENTOS

Às agências de fomento CNPq, CAPES e PetroleoBras pelo suporte financeiro a

este trabalho.

Agradeço a minha orientadora Lucymara Fassarella Agnez Lima pela paciência e

acima de tudo pelos bons puxões de orelha que me orientam.

Ao Departamento de Biologia Celular e Genética da UFRN pela infraestrutura

disponibilizada para o desenvolvimento deste trabalho

Agradeço e dedico esse trabalho aos meus pais que sempre se esforçaram para que
eu estudasse.

A Paulo Honório pelo companheirismo desde o início deste trabalho e por me ajudar
sempre de todas as formas.

As minhas Pós-doc Rita Portela, Carol Minicelli e Marbela Fonseca pela ajuda e
esforço durante esse trabalho acima de tudo pela amizade.

A Sinara Carla e Alaine Guerra por me ensinarem desde a iniciação científica.

Agradeço a Jorge Oliveira por me ensinar e contribuir neste trabalho sobretudo pela
amizade.

À Fabrícia Fontes, Marcos Felipe, Ana Rafaela e Daniel Chaves pelas dicas e
conselhos científicos.

Aos professores do DBQ por todos os conhecimentos transmitidos durante o curso.

Aos colegas de classe pela amizade e

carinho.
 “Somos todos loucos,
caso contrário não teríamos chegado até aqui.”
Paráfrase de Alice no País das Maravilhas
 RESUMO

Os processos bioquímicos de origem microbiana atuantes nos reservatórios de

petróleo exercem grande impacto na extração, estocagem e refino do petróleo. No
entanto o conhecimento a respeito desse metabolismo e diversidade microbiana é
escasso devido as limitações das técnicas de cultivo e identificação
microbiológicas baseadas apenas nas características morfológicas e culturais.
Desse modo, a metagenômica é uma inovadora ferramenta para estudar,
independentemente de cultivo, as comunidades microbianas existentes em
reservatório de petróleo. Essa metodologia ainda permite identificar genes e
organismos com aplicações biotecnológicas nos processos e impactos decorrentes
das comunidades microbianas exercem sobre a qualidade do petróleo. O presente
estudo teve como objetivo identificar, tanto taxonomicamente quanto
funcionalmente, as comunidades bacterianas de poços de petróleo e as
populações envolvidas na degradação de petróleo e produção de moléculas
surfactantes. Para tanto, amostras de água de produção e rochas de reservatório
foram submetidas a extração de DNA bem como preparação de consórcios
bacterianos submetidos a uma seleção de organismos degradadores de petróleo e
produtores de surfactantes. Posteriormente todas as amostras foram
sequenciadas por meio de plataforma de sequenciamento de segunda geração.
Os resultados de bioinformática mostraram que comunidades residentes nas
rochas e água de produção eram predominantemente pertencentes aos gêneros
Halomonas e Marinobacter, respectivamente. Os resultados da seleção dos
consórcios mostraram a predominância de gêneros degradadores e produtores de
biosurfactantes Microbacterium, Ochrobactrum, Devosia e Paenibacillus no
consórcio microbiano R2, enquanto os gêneros Sphingobacterium, Bacillus e
Lysinibacillus predominaram no consórcio R1. Os gêneros predominantes no
consórcio bacteriano de água de produção A1 foram Brevibacillus, Aeribacillus e
Paenibacillus. Os testes funcionais mostraram que tais consórcios são produtores
de biossurfactantes capazes de estabilizar uma emulsão bem como reduzir a
tensão interfacial entre petróleo e água. Utilizando comparações por homologia
com banco de dados de proteínas customizado foi possível identificar que as
moléculas surfactantes eram sintetizadas pelos operons Lichenysin, Plipastatin,
Iturina A e Pultisolvin. Esses dados corroboraram os testes de degradação por
meio do indicador redox, mostrando que houve predominância das vias de
degradação de alcanos lineares, bem como de policicloaromáticos. Portanto, os
resultados indicam que consórcios isolados de reservatório são capazes de
aumentar a fluidez do óleo ao degradá-lo bem como ao produzir moléculas
surfactantes, desse modo possuem um importante potencial de aplicação
biotecnológica.
 ABSTRACT

The bacterial is metabolically diverse and represents a huge source of molecules

with new biotechnological applications. Although this kingdom it is very rich,
microbiological techniques of cultivation and identification are limited to access and
identify this favorable source. Soon metagenomics stands out as an innovative tool to
study bacterial communities independently of cultivation, and in addition, to extract
new proteins and organisms with biotechnological application. The present study
aimed to identify, both taxonomically and functionally, microorganisms residing in the
bacterial community of petroleum wells involved in the degradation of oil and the
production of surfactant molecules. To do so, samples of production water and well
rocks are subjected to DNA extraction, as well as the preparation of cultures
subjected to selection of petroleum degrading organisms and surfactant producers.
Subsequently, all samples were sequenced through new generation sequencing
platforms. The bioinformatics results show that the communities living in the rocks
and in the production water were predominantly belonging to the Halomonas and
Marinobacter genera, respectively. While the results of the consortia classification
show a predominance of degrading and biosurfactant producers of genera
Microbacterium, Ochrobactrum, Devosia and Paenibacillus in the R2 consortium, and
Sphingobacterium, Bacillus and Lysinibacillus in the R1 consortium. Functional tests
show that such bacteria are producers of biosurfactants to stabilize an emulsion as
well as reduce interfacial tension between oil and water. Using homology
comparisons with a protein custom database, it was possible to identify that such
surfactant molecules were synthesized in Lichenysin, Plipastatin and Pultisolvin
operons. This data refers to the degradation tests by means of the oxy-redox
indicator, showing that there was predominance of degradation routes of linear as
well as polycycloaromatic alkanes. These results indicate that isolated reservoir
consortia have potential to increase the fluidity of the oil by degrading it, as well as
the production of surfactants that significantly reduce the interfacial tension between
water and oil, therefore showing potential for biotechnological application.
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Esquema ilustrativo da via de degradação de alcanos lineares por meio das
enzimas Alcano Monooxigenase (AH); Álcool Desidrogenase (AD); Aldeído
Desidrogenase (ALDc) e Acetil Sintetase (ACD)............................................................6
Figura 2 Diagrama de Venn interdisciplinar, ilustrando a intersecção das áreas de
conhecimento envolvidas na metagômica. .....................................................................9
Figura 3 Esquema ilustrativo das duas abordagens metagenômicas, figura adaptada
de HANDELSMAN (2004). ............................................................................................ 10
Figura 4 . Fluxograma da metodologia utilizada neste trabalho. Amostras brutas de
rocha e água de produção foram submetidos a duas pipelines de trabalho. Uma de
sequenciamento direto do DNA ambiental e outra de preparo de consórcio
bacterianos que foram posteriormente sequenciados. ............................................... 17
Figura 5 Procedimento de preparo de consórcios bacterianos: em amarelo
representa as três primeiras semanas de enriquecimento em meio rico, seguido das
três últimas semanas de seleção, representado pela cor cinza para o meio pobre
(BH) contendo apenas 1% de petróleo. ....................................................................... 19
Figura 6 Foto ilustrativa do teste de tensão interfacial utilizando o tensiômetro da
DVT50, indicando a fase hidrofílica (amostra) e fase hidrofóbica analisadas
(petróleo). ....................................................................................................................... 27
Figura 7 Fluxograma da pipeline de bioinformática usada com diferentes programas
para a análise de dados dos sequenciamentos. Apresentando as diferentes
abordagens utilizadas após fase de análise de qualidade de dados. A abordagem
not-assembly utilizando reads bem como a abordagem assembly utilizando contigs.
........................................................................................................................................ 32
Figura 8 Curvas de crescimento dos consórcios de água de produção A1 e A2 à 30
°C. Em A, o consórcio A1, e o seu controle C1 negativo contendo meio e petróleo
sem adição de cultura e o controle C-A1 com consórcio A1 e meio BH sem adição
de petróleo. Em (B) o consórcio A2, controle C1 contendo meio e petróleo sem
adição de cultura e controle C-A2 com consórcio A2 e meio BH sem adição de
petróleo. ......................................................................................................................... 37
Figura 9 Curva de crescimento bacteriano dos consórcios de rocha R1 e R2
crescidos em meio BH, contendo apenas 1 % de petróleo com única fonte de
carbono à 37 ºC. Em (A) curva do consórcio R1, tendo como controle negativo C1
contendo somente meio mineral e óleo bem como o controle C-R1 contendo cultura
bacteriana R1 sem fonte de carbono. Em (B) curva do consórcio R2, controle
negativo C1 contendo apenas petróleo e meio mineral e controle C-R2 contendo
cultura bacteriana R2 sem fonte de carbono. .............................................................. 38
Figura 10 . Ensaio de dispersão do óleo. (A) Sobrenadante do consórcio R2
comparado ao controle positivo SDS 1 % e controle negativo meio mineral BH. Em
(B), sobrenadante do consórcio R1 comparado ao controle positivo SDS 1 % e
controle negativo meio mineral BH. .............................................................................. 40
Figura 11 Ensaio de emulsificação dos consórcios R1 em (A) e R2 em (B). Os
ensaios foram realizados tendo o SDS 1 % como controle positivo. Em (C) são
apresentados os índices de emulsificação dos consórcios de rocha R1 e R2 ao longo
de 13 dias de cultivo, comparativamente a emulsão formada pelo controle positivo
SDS 1 %. ........................................................................................................................ 41
Figura 12 Em A, avaliação da tensão interfacial ao longo do tempo dos consórcios
de água de produção A1 e A2, comparadas ao controle positivo, o surfactante
sintético SDS 1 % bem como ao controle negativo contendo meio BH e óleo.
Diferenças estatísticas, comparadas ao controle negativo, considerando P value <
0,05. Em (B) avaliação da tensão interfacial ao longo do tempo dos consórcios de
rocha R1 e R2, comparadas ao controle positivo o surfactante sintético SDS 1 %
bem como ao controle negativo contendo meio BH e óleo. Diferenças estatísticas,
comparadas ao controle negativo, considerando P value < 0,05. .............................. 42
Figura 13 Teste de degradação de hidrocarbonetos com indicador DCPIP. Em A)
Controle positivo com glicose (C+gli); Consórcios R1 com petróleo (Pet+R1);
Controle negativo sem fonte de carbono com o consórcio de rocha R1(C-pet);
Controle negativo com petróleo (C+pet) e controle negativo do meio BH e o reagente
DCPIP(C+BH). Em B) Controle positivo com glicose (C+gli); Consórcios R2 com
petróleo (Pet+R2); Controle negativo sem fonte de carbono com o consórcio de
rocha R2(C-pet); Controle negativo com petróleo (C+pet) e controle negativo do
meio BH e o indicador DCPIP (C+BH). ........................................................................ 44
Figura 14 Cromatografias à gás dos consórcios de água de produção A1 e A2 para
HPAs totais. São mostrados diferentes tipos de HPAs quantificados nos dois
consórcios e controle negativo contendo apenas óleo e meio. .................................. 45
Figura 15 Cromatografias à gás dos consórcios de rocha R1 e R2 para HPAs totais.
São mostrados os diferentes HPAs que puderam ser quantificados em cada
consórcio, comparativamente ao controle negativo sem cultura bacteriana, contendo
apenas óleo e meio. ...................................................................................................... 46
Figura 16 Curva de rarefação de todas as amostras sequenciadas. Curva simulada
no programa MEGAN, realizada com base no número diferentes níveis taxonômicos
anotados, versos quantidade de sequencias anotadas. ............................................. 49
Figura 17 A figura mostra as quantidades de sequências identificadas, isto é, que
possuem hits (alinharam) contra alguma proteína em banco de dados não
redundante do NCBI. Os gráficos mostram as quantidades de sequências
identificadas que foram classificadas como pertencentes a algum microrganismo
bem como as quantidades de sequências embora identificadas, não foram
classificadas como pertencentes algum microrganismo ( com base nos parâmetros
estatísticos utilizados). Os gráficos mostram ainda as quantidades de sequências
que não foram identificadas nos metagenomas, isto é, as sequências que não
tiveram hits com nenhuma proteína ou gene no banco de dados não redundante
utilizado. ......................................................................................................................... 49
Figura 18 Em A, diagramas de Venn entre os gêneros comuns do consórcio R1 (
preparado a partir da rocha filito), comparativamente aos gêneros do metagenoma
da rocha filito. Em B diagramas de Venn entre os gêneros comuns do consórcio R2
( preparado a partir da rocha carbonática), comparativamente aos gêneros do
metagenoma da rocha carbonática. Na figura C, diagramas de Venn entre os
gêneros comuns do consórcio A1 (preparado a partir da água de produção),
comparativamente aos gêneros do metagenoma de água de produção. .................. 53
Figura 19 Em A, são apresentados os diagramas dos gêneros comuns entre os
metagenomas dos consórcios R1, R2 e A1. Em B, os diagramas entre os gêneros
comuns dos metagenomas de rochas e água de produção. ...................................... 54
Figura 20 Comparação taxonômica ao nível de gênero para os metagenomas da
rocha filito e do consórcio R1. São apresentado apenas as comparações
significativas. .................................................................................................................. 55
Figura 21 Comparação taxonômica ao nível de gênero para os metagenomas da
rocha carbonática e do consórcio R2. São apresentadas apenas as comparações
significativas. .................................................................................................................. 55
Figura 22 Comparação taxonômica ao nível de gênero para os metagenomas do
consórcio A1 e da água de produção. São apresentadas apenas as comparações e
diferenças significativas. ............................................................................................... 56
Figura 23 Comparação entre os dois consórcios R1 e R2 ao nível de gênero. São
apresentadas apenas as comparações e diferenças significativas............................ 57
Figura 24 Comparação entre espécies presentes nas amostras de consórcio R2 de
rocha do poço P2 (966 -972 m) e sua respectiva rocha proveniente, rocha P2 (966 -
972 m), utilizando contigs. São apresentadas apenas as comparações e diferenças
significativas. .................................................................................................................. 58
Figura 25 Comparação entre espécies presentes nas amostras de consórcio R1 de
rocha do poço P2 (1053 – 1056 m) e sua respectiva rocha de onde foi isolado, rocha
P2 (1053 - 1056 m). São apresentadas apenas as comparações e diferenças
significativas. .................................................................................................................. 59
Figura 26 Comparação taxonômica ao nível de espécies para os metagenomas de
água de produção e rocha carbonática. Neste gráfico são apresentadas apenas as
comparações e diferenças significativas. ..................................................................... 60
Figura 27 Comparação taxonômica ao nível de espécies para os metagenomas de
água de produção e rocha filito. Neste gráfico são apresentadas apenas as
comparações e diferenças significativas. ..................................................................... 61
Figura 28 Comparação funcional a nível de vias metabólicas do consórcio A1 com o
metagenoma de água de produção. Apenas resultados significativos são mostrados.
........................................................................................................................................ 62
Figura 29 Comparação funcional a nível de vias metabólicas do consórcio R1 com a
rocha filito de 1053 à 1056 m. Apenas resultados significativos são mostrados. ..... 62
Figura 30 Comparação funcional a nível de vias metabólicas do consórcio R2 com a
rocha carbonato de 966 à 972 m. Apenas diferenças significativas são mostradas
nesse gráfico. ................................................................................................................. 63
Figura 31 Comparação funcional a nível vias metabólicas entre água de produção e
a rocha carbonática. Apenas diferenças significativas são mostradas nesse gráfico.
........................................................................................................................................ 64
Figura 32 Comparação funcional a nível vias metabólicas entre água de produção e
a rocha filito. Apenas as diferenças significativas são apresentadas. ....................... 65
Figura 33 Comparação funcional entre os consórcios R1 e R2, a penas as diferenças
significativas são apresentadas. ................................................................................... 65
Figura 34 Resultados da anotação contra o BIOSSURFDB dos operons nos
genomas de referência de Ochrobactrum depositados no NCBI. .............................. 66
Figura 35 Vias de biossurfactantes de Ochrobactrum anotadas nos consórcios. ..... 67

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Localização geográfica dos poços P1 e P2 e as respectivas datas de

coleta e recebimento no laboratório...........................................................................16

TABELA 2 Tabela apresenta todos os consórcios preparados durante esse trabalho

bem como de qual poço as amostras eram provenientes para isolar os

microrganismos e os modos de preparo....................................................................20

TABELA 3 Métodos de extração e DNA testados neste trabalho para extrair DNA de

microrganismos presentes em rochas de

reservatório................................................................................................. ................23

TABELA 4 consórcios obtidos em diferentes meios de cultivo durante as fases de

enriquecimento e seleção bem com a descrição da observação de crescimento (+)
ou não ( - ) nas respectivas fases. Consórcios selecionados para testes funcionais e
sequenciamento (*)....................................................................................................35

TABELA 5 Quantificação de DNA extraído de todas as amostras pelo método

descrito por (KNAEBEL; CRAWFORD, 1995)............................................................47

TABELA 6 Dados gerais dos sequenciamento e análises de alinhamentos,

montagens e predições de
orfs............................................................................................................................100
TABELA 7 Gêneros mais abundantes em todas as amostras e suas respectivas
frequências.................................................................................................................50

TABELA 8 Genomas de referência baixados do NCBI e suas respectivas referências

do NCBI....................................................................................... .............................101

LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS

(E24%) Índice de emulsificação após 24 horas

ACD Acetil Sintetase

AD Álcool Desidrogenase

AH Alcano Monooxigenase

ALDc Aldeído Desidrogenase

AM Água do mar artificial

BH Bushnell Haas

CG Circlegrow

CTAB Cetyltrimethyl Ammonium Bromide

DCPIP 2,6-diclorofenol indofenol

DGGE Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante

DO Densidade Óptica

FISH Hibridização por Fluorescente in Situ

LB Lysogeny Broth

NGS New Generation Sequencing

ORF Open Read Frame

PAHs Polycyclic Aromatic Hydrocarbon

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

PEG Polietilenoglicol

PERL Practical Extraction and Report Language

SDS Dodecil sulfato de sódio

SRB Sulfate-reducing bacteria

STAMP Statistical Analyse of Metagenomic Profiles

YPD Yeast Extract Peptone Dextrose

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 Microbiologia de reservatório de petróleo 1

1.2 Exploração do petróleo 2

1.3 Redução de enxofre 3

1.4 Metanogênese 4

1.5 Degradação de Hidrocarbonetos 5

1.6 Biossurfactantes 7

1.7 Metagenômica 8

1.8 Bioinformática aplicada em análises metagenômicas 11

1.9 Metagenomica de reservatório de petróleo 13

2 OBJETIVOS GERAIS 15

2.1 Objetivos específicos 15

3 MATERIAL E MÉTODOS 15

3.1 Preparo e caracterização de amostras 15

3.2 Lavagem do rocha 18

3.3 Preparo de consórcios de água de produção e rocha 18

3.4 Estoque e congelamento 22

3.5 Curvas de crescimento dos consórcios de bactérias 22

3.6 Extração de DNA de microrganismos da água de produção 22

3.7 Extração de DNA de rochas dos poços P1 e P2 23

3.8 Extração de DNA consórcios bacterianos 24

3.9 Avaliação quantitativa e qualitativa do DNA 24

3.10 Ensaio de dispersão do óleo 25

3.11 Ensaio de emulsificação 25

3.12 Avaliação da tensão interfacial 26

3.13 Ensaio de degradação de hidrocarbonetos 27

3.14 Cromatografias 28

3.15 Sequenciamento de DNA 29

3.16 Análises de Bioinformática 31

3.17 Análises Estatísticas 34

4 RESULTADOS 35

4.1 Obtenção de consórcios 35

4.2 Curvas de crescimento dos consórcios de bactérias 35

4.3 Ensaio de dispersão de óleo 40

4.4 Ensaio de emulsificação dos consórcios de rocha 40

4.5 Análise de tensão interfacial de consórcios 42

4.6 Teste de degradação com indicador redox 43

4.7 Cromatografias 44
4.8 Metagenomas 47

4.8.1 Extração de DNA 47

4.8.2 Dados de Sequenciamento 47

4.8.3 Abundância taxonômica ao nível de gênero 50

4.8.4 Análise comparativa taxonômica ao nível de espécies 47

4.8.5 Análise funcional 61

5 DISCUSSÃO 67

6 CONCLUSÂO 84

7 PERSPECTIVAS 86

8 REFERÊNCIAS 86

9 ANEXOS 97
1 INTRODUÇÃO

1.1 Microbiologia de reservatório de petróleo

O petróleo é a principal fonte energética mundial, como recurso não renovável,

exige continuo investimento cientifico e tecnológico para sua exploração
(ADMINISTRATION; U.S. ENERGY INFORMATION ADMINISTRATION, 2017). Os
processos bioquímicos de origem microbiana presentes nos reservatórios de
petróleo exercem grande impacto na produção, estocagem e refino do petróleo
(BROWN, 2010). No entanto o conhecimento a respeito desses processos
metabólicos e a diversidade microbiana presente nos reservatórios ainda é escasso
devido as limitações das técnicas microbianas de cultivo e identificação
tradicionais.

Em uma comunidade bacteriana, os microrganismos interagem de diferentes

formas, estabelecem tanto relações de competição, quanto de cooperação. As
diferentes interações metabólicas da comunidade de reservatório de petróleo
envolvem principalmente vias inter-relacionadas de grande interesse para indústria
petroquímica com metabolismo de hidrocarbonetos, síntese de biossurfactantes,
metanogênese, metabolismo de enxofre e nitrogênio (GIEG et al., 2010; TAN et al.,
2015). Diversos fatores físico-químicos como temperatura, pH, pressão, salinidade,
características geológicas bem como processos de exploração e recuperação do
óleo influenciam como também são influenciados pela riqueza da comunidade
microbiológica do reservatório de petróleo.

Espécies dos gêneros Mycobacterium, Paenibacillus. Klebsiella que tanto

são capazes de desulforizar o petróleo quanto são capazes de degradar
hidrocarbonetos e produzir moléculas surfactantes são geralmente encontradas na
comunidade de reservatórios de petróleo (VAN HAMME; SINGH; WARD, 2003).
Metanogênese, oxidação de metano, redução de sulfato e nitrato de ferro também
são processos comuns nos reservatórios. Esses diferentes processos são
relacionados, pois compartilham organismos, vias, enzimas e substratos comuns a
degradação de hidrocarbonetos (ORPHAN et al., 2000). Ademais, existem uma

1
larga distribuição de microrganismos termofílicos produtores de metano que
utilizam enxofre, em reservatórios de óleo, com potencial participação ativa em
outros metabolismos biogeoquímicos do carbono, hidrogênio e enxofre in situ
(ORPHAN et al., 2000).

No entanto nosso conhecimento acerca dessas complexas relações das

comunidades dos reservatórios ainda é limitada devido a dificuldades de
recuperação dessa microbiota de um ambiente tão extremo (HANDELSMAN, 2004;
SIERRA-GARCIA et al., 2014). As técnicas convencionais de cultivo são limitadas
para acessar essa diversidade, fazendo necessário, portanto, o uso de ferramentas
independentes de cultivo, como a metagenômica para estudar, identificar,
comparar e correlacionar potencial metabólico e biotecnológico dos
microrganismos das comunidades de reservatórios de petróleo.

1.2 Exploração do petróleo

Cada reservatório é resultado de um conjunto de características petrofísicas

formadas ao longo de sua evolução geológica, em particular das condições de
sedimentação e dos fenômenos de diagênese. Os reservatórios são constituídos
por rochas que possuem porosidade e permeabilidade que permitem a circulação
dos hidrocarbonetos e água (PLANCKAERT, 2005). A essa rocha está associada a
comunidade microbiana. Quando um poço é perfurado a água (água de produção)
e óleo são expelidos devido a energia natural do poço, sendo essa produção
conhecida como primária. No entanto ao decorrer da exploração, a pressão do
reservatório diminui, fazendo necessário a injeção de água expelida do poço (água
de produção) ou de água do mar para repressurizar o reservatório, metodologia
essa conhecida como produção secundária (PLANCKAERT, 2005). Por último,
metodologias, ditas como recuperação avançada ou produção terciária de poço já
maduros, tentam extrair o óleo residual por meio da injeção de polímeros, CO2,
surfactantes e até mesmo microrganismos (SHIBULAL et al., 2014). No entanto tais
metodologias de recuperação residual exercem grande impacto na comunidade

2
microbiana autóctone por introduzir contaminação externa ao reservatório
(MAGOT; OLLIVIER; PATEL, 2000). Dessa forma é necessário o conhecimento
acerca dos processos metabólicos da comunidade microbiológica dos reservatórios
de modo que seja possível prevenir, controlar ou até mesmo inibir os possíveis
impactos decorrentes da extração bem como recuperação do óleo residual

1.3 Redução de enxofre

Bactérias redutoras de sulfato (SRB) são responsáveis pela produção de sulfito

de hidrogênio (H2S) a partir do íon sulfeto e hidrogênio molecular de modo
anaeróbico nos reservatórios (BARTON; FAUQUE, 2009). Essa produção de H2S
reduz a qualidade do óleo além de promover corrosão de ductos de extração de
óleo e instalações além de ser uma substância potencialmente tóxica (BARTON;
FAUQUE, 2009; MAGOT; OLLIVIER; PATEL, 2000).

A capacidade de redução de sulfato é identificada em quatro diferentes filos de

bactérias (Proteobacteria, Firmicutes, Nitrospira, e Thermodesulfobacterium) bem
como nos filos Euryarchaeota e Crenarchaeota do domínio Archaea (YOUSSEF;
ELSHAHED; MCINERNEY, 2009).

As Proteobactérias redutoras de sulfato isoladas de reservatórios de óleo,

principalmente em amostras de água de produção, são geralmente membros das
ordens Desulfovibrionales, Desulfobacterales e Syntrophobacterales (BARTON;
FAUQUE, 2009).

Espécies do gênero Desulfotomaculum (Filo Firmicutes) apresentam os SRB

mais distribuídos em campos petrolíferos. Microrganismos tanto mesófilos quanto
termófilos desse gênero foram isolados de reservatórios de óleo (AÜLLO et al.,
2013).

Thermodesulfobacteria assim como arqueobactérias redutoras de sulfato

isoladas de poços de petróleo são organismos termofílicos. Apenas Euryarchaeota
possui representantes redutores de sulfato, enquanto Crenarchaeota inclui

3
redutores de sulfato (membros do gênero Caldivirga) foram isolados de campos
petrolíferos até então (BARTON; FAUQUE, 2009; YOUSSEF; ELSHAHED;
MCINERNEY, 2009).

Embora microrganismos anaeróbicos sejam prioritariamente produtores de

H2S nos reservatórios, microrganismos aeróbicas presentes no reservatório ou
em água de produção, tais como Bacillus, Pseudomonas, Proteus, Clostridium,
Thermoproteus e até leveduras como Saccharomyces podem produzir H2S
(ALMEIDA et al., 2006; MENDES-FERREIRA; MENDES-FAIA; LEÃO, 2002). Tais
organismo mesófilos degradam hidrocarbonetos, como composto aromáticos,
ácidos orgânicos de baixo peso molecular tais como acetato, propionato e butirato
que podem ser fontes de carbono para organismo SRB. Embora esses
metabolismos sejam interligados, poucos trabalhos demonstraram substratos ou
vias comuns entre organismos degradadores de hidrocarbonetos e redutores de
sulfato (ALMEIDA et al., 2006). Portanto são necessários mais trabalhos que
ajudem caracterizar melhor a o papel de vias de degradação de hidrocarbonetos
com o metabolismo de enxofre, como por exemplo a redução de sulfato

1.4 Metanogênese

Outro grupo de microrganismos residentes na comunidade de reservatório é o

dos metanogênicos. A síntese de metano ocorre a partir de substratos simples
como hidrogénio e CO2, acetato, metilamina e sulfetos de dimetilo. Atualmente,
organismo metanogênicos são distribuídos em cinco ordens: Methanomicrobiales,
Methanobacteriales, Methanosarcinales, Methanococcales, e Methanopyrales,
assim como em Euryarchaeota no domínio Archaea (MESLE; DROMART; OGER,
2013).

Organismos metanogênicos hidrogenotróficos e metilotróficos são tanto

mesófilos quanto termófilos e são isolados de reservatório de óleo de baixa e alta
salinidades. Por outro lado, metanogênicos que utilizam acetato, como o gênero
Methanosarcinales, tem sido pouco isolados de reservatórios de petróleo. Esses

4
organismos exercem grande impacto na produção e recuperação do óleo nos
reservatórios, visto que compartilham substratos, como o acetato proveniente de
vias de degradação de hidrocarbonetos do petróleo bem como elétrons proveniente
da redução de sulfato e nitrito (GIEG et al., 2010; MESL??; DROMART; OGER,
2013). Desse modo, trabalhos que integrem tanto o metabolismo de metano,
quanto de degradação de hidrocarbonetos são necessários para compreender o
impacto que organismo produtores de metano exercem na comunidade
microbianas e consequentemente nos reservatórios e nos processos de extração e
recuperação do petróleo.

1.5 Degradação de Hidrocarbonetos

A degradação de hidrocarbonetos por bactérias ocorre por meio de vias

tanto aeróbicas quanto anaeróbicas. A degradação dessas moléculas é bem
descrito na literatura em diversos organismos, como fungos e bactérias (VAN
BEILEN et al., 2003). Alcanos são moléculas apolares quimicamente inertes e de
baixa solubilidade em água o que torna seu metabolismo por microrganismos um
desafio. Desse modo, é necessário ativar por meio de hidroxilação as moléculas
de hidrocarbonetos antes de degradá-las (LABINGER; BERCAW, 2002). A via de
degradação de alcanos lineares, conforme se observa na figura 1, é composta por
diversas enzimas que ativam e subsequentemente preparam a moléculas para
serem degradada via B-oxidação.

5
Figura 1 Esquema ilustrativo da via de degradação de alcanos lineares por meio das enzimas
Alcano Monooxigenase (AH); Álcool Desidrogenase (AD); Aldeído Desidrogenase (ALDc) e Acetil
Sintetase (ACD).

A ativação inicial da via de degradação de hidrocarbonetos lineares como

também de aromáticos envolve a hidroxilação realizada por enzimas conhecidas
como Monooxigenases e Citocromo P450, codificadas pelos genes alkB e cyP153
respectivamente. Tais genes foram anotados pela primeira vez no plasmídeo OCT
em P. putida GPo1 e agrupados em dois operons que podem ser transferidos
horizontalmente entre muitas bactérias (MAIER et al., 2001; VAN BEILEN et al.,
1992). Os passos seguintes da via de degradação envolvem uma sequência de
reações oxidativas que transforma a molécula de alcano em um álcool que é
subsequentemente oxidado a um aldeído, e então é convertido a um ácido graxo.
Por último, ao ácido graxo é adicionado uma acetil-CoA e o composto resultante é
então degradado via B-oxidação (ROJO, 2009).

Semelhantemente, a degradação de hidrocarbonetos policíclico aromáticos

(PAHs) também é mediante a hidroxilação por oxigenases que desestabilizam a
ressonância dos anéis aromáticos, ativando-os para clivagem dos anéis (MISHRA;
LAL; SRINIVASAN, 2001). A posição de hidroxilação determina o tipo de clivagem
designada como Orto ou Meta. As reações subsequentes dessa clivagem levam a

6
formação de intermediários comuns das diferentes vias de degradação de PAHs
como o Catecol, que são encaminhados para utilização como fonte de energia, via
clico de Krebs (MISHRA; LAL; SRINIVASAN, 2001; VAN HAMME; SINGH; WARD,
2003). A biodegradação de hidrocarbonetos é um componente importante dos
processos biogeoquímicos e atuam diretamente na renovação da matéria orgânica
no ciclo do carbono. Estudos têm mostrado estratégias de bioestimulção dessas
vias em comunidades bacterianas naturais como modo de biorremediação de
ambientes contaminados por óleo (HASSANSHAHIAN et al., 2014). Outros
estudos mostram a aplicação de consórcios bacterianos alóctones como capazes
tanto de degradar o óleo quanto de produzir moléculas surfactantes durante a
limpeza de ambientes contaminados por resíduos da indústria do petróleo
(CAMEOTRA; SINGH, 2008).

1.6 Biossurfactantes

Os microrganismos usam uma grande variedade de compostos orgânicos

como fonte de carbono e energia. Quando uma fonte de carbono é um substrato
insolúvel em água, tal como os hidrocarbonetos, os microrganismos facilitam a sua
difusão para a célula produzindo uma variedade de substâncias, dentre elas os
biossurfactantes que são moléculas anfifílicas com um domínio hidrofóbico e outro
hidrofílico. Por causa dessa estrutura, os biossurfactantes se acumulam na
interface entre duas substâncias imiscíveis, formando micelas e dessa forma
aumentam a solubilidade de substâncias hidrofóbicas (AL-ARAJI et al., 2007). Os
surfactantes microbianos têm uma ampla gama de estruturas químicas cada um
exercendo diferentes papéis biológicos no ciclo de vida dos microrganismos
produtores (RON; ROSENBERG, 2001).
De acordo com suas estruturas químicas, os biossurfactantes podem ser
classificados como peptídeos, ácidos graxos, lipídeos neutros, fosfolipídeos,
glicolipídeos, glicopeptídeos, lipopeptídeos, lipopolissacarídeos, surfactantes
complexos e particulados (SATPUTE et al., 2010a). Surfactantes são classificados
7
também de acordo com seu peso molecular. Enquanto biossurfactantes de alto
peso molecular são geralmente hetero-polissacarídeos polianiônicos e bons
estabilizantes de emulsão, os biossurfactantes de baixo peso molecular são
frequentemente glicolípideos que reduzem a tensão superficial mais
significativamente, mas não são bons estabilizantes de emulsão (AL-ARAJI et al.,
2007). Podem, ainda, ser classificados de acordo a carga de seu grupamento
hidrofílico, como não aniônicos, aniônicos, e catiônicos (SATPUTE et al., 2010b).
Dessa forma, surfactantes são geralmente moléculas de baixo peso molecular que
tanto reduzem a tensão superficial, quanto estabilizam uma emulsão. Por outro
lado, bioemulsificadores são na sua maioria moléculas de alto peso que são
capazes de estabilizar uma emulsão, mas não necessariamente são capazes de
reduzir a tensão superficial (SATPUTE et al., 2010b).

Biossurfactantes são menos tóxicos, mais biodegradáveis e biocompatíveis

do que surfactantes sintéticos (VELIOGLU; OZTURK UREK, 2015). Os
biossurfactantes são utilizados como biotecnologias de diversas formas. Há
grande aplicação de biossurfactantes na indústria petroquímica durante processos
de recuperação avançada de óleo residual em reservatórios de petróleo, bem
como durante estratégias de biorremediação de ambientes contaminados por óleo
(BROWN, 2010; CAMEOTRA; SINGH, 2008). Há ainda registros de aplicações de
biossurfactantes na indústria farmacêutica como antibióticos, antifúngicos e
antivirais (SINGH; CAMEOTRA, 2004). A diversidade de estruturas faz com que
os biossurfactantes apresentem várias propriedades e utilidades tanto ambientais
quanto industriais. No entanto, neste trabalho foram apenas avaliadas as
propriedades de formação de emulsão e redução da tensão interfacial e suas
possíveis aplicações.

1.7 Metagenômica

Os microrganismos utilizam diversas fontes energéticas, em decorrência

disso são adaptados a diferentes nichos ecológico (OBERHARDT et al., 2015;

8
PACE, 1997). No entanto, apenas 1% de toda essa diversidade microbiana é
conhecida, principalmente devido às limitações técnicas de cultivo que não são
suficientes para fornecer as inúmeras necessidades metabólicas e simbiônticas
exigidas pelos microrganismos para serem cultivados de modo isolado
(HANDELSMAN, 2004; OBERHARDT et al., 2015). Essas limitações vêm sendo
superadas após aliarmos ferramentas da biologia molecular com as técnicas de
microbiologia e informática as quais permitiram acessar esse pool genético
independentemente da obtenção de culturas puras. Dessa intersecção de
conhecimentos (Figura 2), surge a metagenômica que permite identificar
taxonomicamente quais microrganismos, cultiváveis ou não, estão presentes nas
amostras ambientais, além de permitir analisar metabolicamente o que esses
organismos são capazes de realizar (HANDELSMAN, 2004).

Figura 2 Diagrama de Venn interdisciplinar, ilustrando a intersecção das áreas de conhecimento

envolvidas na metagômica.

As abordagens metagenômicas dividem-se em duas formas, conforme se

observa na figura 3 adaptada de HANDELSMAN, (2004). A abordagem por função
consiste na clonagem do material genético das amostras ambientais em vetores
genéticos transferidos a uma linhagem hospedeira. A biblioteca metagenômica é
posteriormente submetida a análise para uma determinada função ou gene de
interesse que é então sequenciado. Como a abordagem por função consiste na
expressão de genes em um hospedeiro heterólogo, ela apresenta a vantagem de

9
estudar genes e proteínas de organismo até mesmo ainda não descobertos ou não
cultiváveis (TOUSSAINT; GHIGO; SALMOND, 2003). Em contrapartida, a
abordagem baseada em sequência, apresenta a vantagem de sequenciar o DNA
das amostras ambientais diretamente e em seguida analisar usando protocolos de
bioinformática (pipeline) arquitetados para um determinado objetivo, como por
exemplo, descoberta de novos genes (HANDELSMAN, 2004).

Figura 3 Esquema ilustrativo das duas abordagens metagenômicas, figura adaptada de

HANDELSMAN (2004).

Essa metodologia não permite apenas pesquisar microrganismos e/ou a

descoberta novos genes de interesse biotecnológico, mas também analisa
relações microbianas nas comunidades e as suas interações com plantas e
animais bem como a dinâmica e influência nos ciclos biogeoquímicos como do
carbono, enxofre e nitrogênio (JU; ZHANG, 2015). Dessa forma, a metagenômica
permite estudar os organismos diretamente de amostras ambientais por meio da
análise de seu material genético.

Embora as técnicas moleculares tradicionais, como a Reação em Cadeia de

Polimerase (PCR), Hibridização por Fluorescência in situ (FISH) e Eletroforese em
Gel de Gradiente Desnaturante (DGGE) tenham ampliado nossos conhecimentos
10
de taxonomia e diversidade microbianos, essas técnicas moleculares são úteis
para elucidar parcialmente sistemas microbianos relativamente simples e de
maneira isolada dos quais se exigem algum conhecimento prévio. Diferentemente,
as análises de New generation sequence (NGS) são mais sensíveis e eficazes por
necessitarem de pouco conhecimento prévio dos organismos e ainda são capazes
de analisar praticamente todos os organismos de uma comunidade bacteriana
tanto os organismos abundantes quanto os raros e desconhecidos (JU; ZHANG,
2015; VAN DIJK et al., 2014). Devido às novas tecnologias de NGS, vivenciamos
uma enorme expansão da quantidade de dados gerados, que exigem uma
crescente capacidade de processamento de dados que auxiliem na melhor
compressão dos dados biológicos (JU; ZHANG, 2015). Para tanto, são necessárias
ferramentas de bioinformática que permitem a interpretação dessa grande
quantidade de dados gerados (PAULSEN; EDITORS; WALKER, 2014).

1.8 Bioinformática aplicada em análises metagenômicas

Devido ao crescimento de informação biológica proveniente tanto da NGS

como outras tecnologias, foi necessário aliar ferramentas de computação científica
e estatística para conseguir processar e interpretar a gigantesca quantidade de
dados gerados.

Essa nova ciência divide-se conforme o tipo de dado biológico estudado e

seu objetivo do estudo, como Biologia de Sistemas, Filogenia Molecular,
Genômica, Transcriptoma, Proteômica, Metagenoma e Dinâmica Molecular (JU;
ZHANG, 2015). Cada área apresenta um conjunto de metodologias, softwares,
parâmetros estatísticos e tecnologias que exigem uma linguagem específica, bem
como um workflow a ser seguido para o tratamento desse dado, análise de
qualidade e posterior interpretação. A partir dessas análises é possível inferir
resultados e conclusões biológicas categóricas.

A bioinformática é extremamente importante para a metagenômica, não

somente por permite processar a grande quantidade de dados gerados, mas

11
também por permitir identificar os microrganismos não cultiváveis. Além disso,
permite quantificar e integrar o que esses organismos estão fazendo
metabolicamente na comunidade bacteriana. O sequenciamento direto do material
genético de comunidades bacterianas ambientais gera uma grande quantidade de
pequenos fragmentos de DNA sequenciados, conhecidos como reads, que
precisam ser qualificados, identificados, quantificados e anotados. Esses reads são
primeiro submetidos a análise de qualidade, necessária para excluir reads de baixa
qualidade geradas durante o sequenciamento. Após essa etapa, existem duas
formas de análise de bioinformática conhecidas como not-assembled ou assembled
(JU; ZHANG, 2015).

A abordagem not-assembled (não montados), utiliza as reads não montadas.

Esse tipo de análise é utilizado para obter um perfil de abundância de genes, taxa e
vias metabólicas em análises quantitativas e comparativas (JU; ZHANG, 2015).
Para tanto, os reads são comparados contra bancos de dados funcionais e
taxonômicos como KEGG e o SEDD, respectivamente (OGATA et al., 1999;
OVERBEEK et al., 2005). Por meio de homologia com sequências já conhecidas é
possível inferir ou identificar a quais táxons pertencem as sequências. No entanto,
a utilização de reads comparativamente a grandes bancos de dados torna a análise
mais lenta e computacionalmente custosa, além disso, pode não ter boa resolução
para alguns níveis taxonômicos, como espécies. Dessa forma são requeridos filtros
e parâmetros estatísticos como e-value que assegura que as identificações não
seja ao acaso bem identidade mínima entre sequências que diminui a ocorrência
de falsos positivos (YANG; JIANG; ZHANG, 2014). Além disso, a atualização de
banco de dados customizados e menores como BIOSURFDB (OLIVEIRA et al.,
2015) podem minimizar a ocorrência de tais problemas e aumentar o poder de
resolução das análises (JU; ZHANG, 2015; YU; ZHANG, 2013).

Em contraste, abordagem utilizando contigs, que são sequencias maiores

geradas pela montagem de pequenas sequencias (reads) concatenados, permitem
análises mais rápidas e fidedignas de espécies específicas e seus genes. Contudo,
a anotação baseada em contigs perde a análise quantitativa, além de apresentar

12
dificuldades para análises de espécies de baixa abundância (JU; ZHANG, 2015).
Essa perda de abundância é decorrente da montagem dos contigs, a qual utiliza
vários reads concatenados para formar um único contig. Essa montagem pode ser
baseada no mapeamento em um genoma de referência, no caso espécies
conhecidas, ou pode ser uma montagem sem referência conhecida, como no caso
de novas espécies (OULAS et al., 2015). A utilização de contigs é mais indicada
para a predição de ORFs (Open Reading Frames) e operons dos quais se tem
interesse em identificar, seja por homologia ou por meio de buscar de padrões de
sequencias de genes específicos, como degradação de hidrocarbonetos ou síntese
de moléculas biossurfactantes as quais são de interesse do presente trabalho
(HESS et al., 2011).

1.9 Metagenômica de reservatório de petróleo

Como as metodologias convencionais de cultivo são limitadas para acessar a

riqueza microbiológica em ambientes extremos como reservatório de petróleo, o
uso da metagenômica permite estudar de modo integrado os diversos organismos
e processos bioquímicos existentes no reservatório de petróleo. Abordagens
metagenômicas por função de interesse buscam nesses ambientes extremos
produtos biotecnológicos, como novas enzimas termoestáveis e tolerantes a sais.
Trabalhos como o de LEWIN et al., (2016) identificaram novas esterases
termoestáveis e tolerantes a altas concentrações de sais e metais em bibliotecas
de fosmídeos clonados de metagenomas derivados de reservatório de petróleo.
Assim como outros estudos tem identificado novas enolases termoestáveis
derivadas de bibliotecas de DNA de poço de petróleo (KOTLAR et al., 2011).
Outros trabalhos utilizando bibliotecas de fosmídeos oriundos de um reservatório
de petróleo brasileiro identificou uma nova via de degradação de hidrocarbonetos
policicloaromáticos (HPAs) (SIERRA-GARCIA et al., 2014).

13
 No entanto, poucos estudos tem buscado avaliar o DNA total das
comunidades microbianas de reservatório de petróleo (KOTLAR et al., 2011). Com
isso, a maioria das abordagens por metagenômica sequencial identificam a
taxonomia dessas comunidades por meio da avaliação do DNA ribossomal 16S
(BAKER, 2016; KOTLAR et al., 2011; SILVA et al., 2013). Análises
metagenômicas comparativas tem revelado diferenças nas proporções entres os
domínios ARCHAEA e BACTERIA nos reservatórios devido a disponibilidade
de nutrientes, temperatura bem como processos decorrentes da exploração do
óleo (LEWIN et al., 2014). Além do mais, por meio da avaliação do DNA 16S,
trabalhos como KOTLAR et al., (2011) tem mostrado a contribuição metabólica
dessas comunidades como predominantemente compostas por microrganismos
redutores de sulfato e metanogênicos, como Methanococcus,
Desulfurovibrionales, Desulfuromonadales, Campylobacterales e Thermotogales.
Assim como por arqueais anaeróbicas, como Thermococcus e Pyrococcustem
identificadas em amostras de água de produção de reservatório (LEWIN et al.,
2014). Outros trabalhos tem anotado vias de degradação de compostos
aromáticos através de homologia a bancos de dados não redundantes públicos
em metagenomas cujo petróleo possui constituição mais leve e refinado (BAKER,
2016). Diferentemente desses estudos, o presente trabalho buscou caracterizar
taxonômica e funcionalmente a comunidade de rocha, água de produção e
consórcios isolados dessas amostras, por meio de uma abordagem
metagenômica de shotgun de genoma total, comparativamente a um banco de
dados específico com genes envolvidos na degradação de hidrocarbonetos,
produção de biossurfactantes, metanogênese e redução de sulfato.

Diante desse exposto, este trabalho teve como objetivos estudar a

comunidade de reservatório de petróleo por meio do sequenciamento do DNA
ambiental oriundo de reservatório de petróleo bem como de consórcios
bacterianos. Para dessa forma responder questões acerca da contribuição
metabólica que diferentes organismos realizam em processos bioquímicos de
interesse biotecnológico bem como da indústria petroquímica.

14
2 OBJETIVOS GERAIS

O presente trabalho tem como objetivo principal caracterizar taxonômica e

metabolicamente os metagenomas de rocha, água de produção e seus respectivos
consórcios proveniente de reservatório de petróleo.

2.1 Objetivos específicos

 Obter o metagenoma de amostras de rocha e água de produção de

reservatório de petróleo.

 Caracterizar taxonômico e funcionalmente os metagenomas de reservatório

de óleo e consórcios a fim estudar as diferentes relações e perfis
metabólicos para a comunidade microbiana residente nos poços de petróleo.

 Obter consórcios microbianos potencialmente degradadores de

hidrocarbonetos e/ou produtores de biossurfactantes.
 Identificar microrganismos e genes com possíveis aplicações
biotecnológicas, como biorremediação e recuperação avançada de petróleo.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Preparo e caracterização de amostras

Foram recebidas amostras de dois poços de óleo: P1 e P2 cedidas pela

empresa PetroleoBras. As amostras do poço P1 de profundidade 975 à 985 m,
constituídas por água de produção e rocha (tipo de rocha não informado). Bem
como três tipos de amostras do poço P2 com profundidade de 1035 m a 1041 m e
constituída de rocha Carbonática; 1053 m a 1056 m rocha Filito e 966 m a 972 m
rocha carbonática, ver discrição da localização na tabela 01 a seguir.

15
Tabela 1. Localização geográfica dos poços P1 e P2 e as respectivas datas de coleta e recebimento
no laboratório.

Tipo de Poço Localização Profundidade Data de Data de

amostra coleta recebimento
no
laboratório

Água de P1 Bacia SE/ AL ----- --- 11/2015

produção

Petróleo --- Bacia SE/ AL 977 - 1010 m --- 11/2015

Rocha P1 Bacia SE/ AL 975 - 985 m 08/2010 11/2015

Rocha P2 Bacia SE/ AL 966 – 972 m; 12/2015 01/2016

1035 -1041 m;

1053 - 1056 m

Petróleo Pré-sal Bacia de Santos 6029 - 6172 m 11/2015 6/2016

01

A tabela 01 informa a localização de cada poço de petróleo, bem como

profundidade, datas de coleta no campo de petróleo e recebimento no laboratório.
Após serem identificadas as amostras de rocha e água de produção foram
submetidas ao preparo para extração de DNA bem com preparo de consórcios
bacterianos, conforme a fluxograma da metodologia apresentado na figura 4 a
seguir.

16
Figura 4 . Fluxograma da metodologia utilizada neste trabalho. Amostras brutas de rocha e água de
produção foram submetidos a duas pipelines de trabalho. Uma de sequenciamento direto do DNA
ambiental e outra de preparo de consórcio bacterianos que foram posteriormente sequenciados.

Para realizar os metagenomas de rocha e água de produção de reservatório,

alíquotas das amostras brutas foram submetidas a extração de DNA e posterior
sequenciamento de DNA ambiental (eDNA). Como também para realizar o preparo
de consórcio, outras alíquotas das mesmas amostras foram submetidas a
preparação dos consórcios bacterianos que posteriormente foram sequenciados e
realizados testes funcionais, conforme é descrito a seguir.

17
3.2 Lavagem da rocha

A etapa de lavagem da rocha descrita consistiu em lavagens com tampões

diferindo nas suas concentrações de EDTA (ANEXO II) para solubilização de
metais pesados e contaminantes de PCR que poderia interferir nas etapas de
extração de DNA e demais experimentos.

3.3 Preparo de consórcios de água de produção e rocha

Os consórcios bacterianos foram preparados durante seis semanas de

cultivo. Durante a fase de enriquecimento, três primeiras semanas, foram usados
os seguintes meios.

1. Meio Bushnell Haas (BH)

2. Meio Lysogeny Broth (LB)
3. MeioYeast Extract Peptone Dextrose (YPD)
4. Meio Circlegrow (CG)
5. Água do mar artificial (AM)

As composições dos meios definidos utilizados neste experimento

encontram-se no anexo I deste trabalho. Durante a fase seguinte de seleção,
correspondente as três últimas semanas de cultivo, foi utilizado apenas o meio
mineral BH em todos os consórcios. Como é possível observar no esquema abaixo
da figura 05. O Petróleo, utilizado como única fonte de carbono no cultivo dos
consórcios, foi esterilizado em autoclave por 30 minutos.

18
Figura 5 Procedimento de preparo de consórcios bacterianos: em amarelo representa as três
primeiras semanas de enriquecimento em meio rico, seguido das três últimas semanas de seleção,
representado pela cor cinza para o meio pobre (BH) contendo apenas 1% de petróleo.

Na primeira semana, um erlenmeyer de 250 ml foi preparado contendo meio

de cultura e água de produção em uma proporção de 1:1 (25 ml de cada) para os
consórcios de água de produção. Enquanto para os consórcios de rocha foram
preparados com 50 ml de meio e adicionados 8 g de rocha (cascalho). Nesta
primeira semana, não foi adicionado petróleo aos consórcios, visto que tanto a
rocha quanto a água de produção possuem hidrocarbonetos residuais do
reservatório. Após sete dias de incubação tanto à 30 °C quanto à 37°C e
submetidos a agitação de 150 rpm, uma alíquota de 5% (v/v) de cada consórcio foi
transferida para seu respectivo meio, contendo desta vez 1 % de petróleo. De
modo semelhante, na terceira semana, foi realizado uma nova transferência de
cultivo sobre as mesmas condições de temperatura e agitação. Ao final da terceira
semana de enriquecimento, uma alíquota de 5 % (v/v) de cada consórcio foi
transferida para o meio mineral BH contendo como única fonte de carbono 1 % de
petróleo para realizar a etapa de seleção de microrganismos biodegradadores de
petróleo e produtores de surfactantes. Após uma semana, 5% dessa cultura foram
19
transferidos para um novo meio BH contendo 1% de petróleo, mantendo as
mesmas condições de temperatura e agitação, sendo tal procedimento repetido
três vezes a cada 7 dias de cultivo, como é demonstrado no esquema da figura 5
acima. Todos os consórcios preparados durante esse trabalho bem como os
diferentes meios testados, amostras e condições de temperatura testadas se
encontram na tabela 2 abaixo.

Tabela 2. Tabela apresenta todos os consórcios preparados durante esse trabalho bem como de
qual poço as amostras eram provenientes para isolar os microrganismos e os modos de preparo

Preparação de consórcios

Consórcio Amostra Poço Meio de Meio de Temperatura

isolada enriquecimento seleção

A1 Água de P1 BH BH 30°
produção

A2 Água de P1 YPD BH 30°

produção

A3 Água de P1 CG BH 30°
produção

A4 Água de P1 LB BH 30°
produção

A5 Água de P1 AM BH 30°
produção

A6 Água de P1 BH BH 37°
produção

20
A7 Água de P1 YPD BH 37°
produção

A8 Água de P1 CG BH 37°
produção

A9 Água de P1 LB BH 37°
produção

A10 Água de P1 AM BH 37°

produção

R1 Rocha- P2 LB BH 37°
Filito

R2 Rocha- P2 LB BH 37°
Carbonato

R3 Rocha P1 LB BH 37°

Como a amostra de água de produção recebida era proveniente apenas de

um poço, foram testados diferentes meios e temperaturas de cultivo.
Diferentemente das amostras de rocha recebidas que eram todas de tipos
diferentes de rocha, sendo desse modo usado a mesmas condições de cultivo.

21
3.4 Estoque e congelamento

Ao final do procedimento de preparo de todos os consórcios microbianos, os

mesmos foram mantidos em glicerol 100 % em uma proporção de 1:1 de cultura e
estocados à - 20 °C e - 80 °C.

3.5 Curvas de crescimento dos consórcios de bactérias

Com o intuito de avaliar o crescimento dos consórcios obtidos a partir da

água de produção bem como das rochas dos reservatórios em meio mínimo BH à
30 e 37 ºC, foram realizadas curvas de crescimento bacteriano aferido por
medidas da Densidade Óptica (DO) verificada no comprimento de onda de 600 nm
(DO600). Para realizar a curva de crescimento dos consórcios crescidos nas duas
diferentes temperaturas, foram feitos pré-inóculos em meio BH contendo 1 %
petróleo como fonte única de carbono e crescido até atingir uma DO600 de 1,0.
Posteriormente a DO600 foi reajustada para a inicial de 0,1 e aferida ao longo do
cultivo.

3.6 Extração de DNA de microrganismos da água de produção

A extração do DNA genômico dos microrganismos presentes na água de

produção foi realizada após o procedimento de filtração a vácuo. Após filtragem a
vácuo de 4 litros de água de produção em um filtro de 0,22 µm da MF-Millipore™,
dois tipos de preparações foram utilizadas para a extração, denominadas AP1
(membrana do filtro à vácuo cortada em pedaços) e AP2 (raspagem da
membrana). Tanto AP1 quanto AP2 foram subsequentemente submetidas ao
protocolo de extração do kit UltraClean® Microbial DNA Isolation (MO BIO
Laboratories, Inc), conforme recomendações do fabricante.

22
3.7 Extração de DNA de rochas dos poços P1 e P2

A extração de DNA genômico a partir das rochas de reservatório foi

conduzida por diferentes métodos a fim de obter o melhor rendimento e qualidade
de DNA extraído, como relacionado na tabela 3 a seguir.

Tabela 3: Métodos de extração e DNA testados neste trabalho para extrair DNA de
microrganismos presentes em rochas de reservatório.

Método Princípio de extração Quantidade de

rocha inicial

Método 1 kit comercial PowerMax® Soil DNA 10g

Isolation (MO BIO Laboratories, Inc)

Método 2* Fenol, clorofórmio e cetyltrimethyl 10g

ammonium bromide (CTAB, Sigma)
e 13% de PEG 6000 em 1,6M NaCl,
validado para extração de DNA de
rocha contaminado (KNAEBEL;
CRAWFORD, 1995)

Método 3* Lavagem de ácidos húmicos com 10g

concentrações decrescentes de
EDTA + Método 2

Método 4* Tampão de extração: EDTA, SDS, 750mg

NaCl e PEG 6000 a 50% para
remoção de ácidos húmicos (Sagar
et al, 2014).

Método 5* Lavagem de ácidos húmicos com 750mg

concentrações decrescentes de

23
 EDTA + Método 4

Método 6 QIAamp® DNA Stool (Qiagen) 220mg

[VM1] Comentário: Como aqui já fala

O método 2 descrito por (KNAEBEL; CRAWFORD, 1995) foi utilizado neste de um resultado preliminar talvez fosse
bom incluir na tabela o rendimento de DNA
trabalho por apresentar o melhor rendimento de DNA genômico das amostras. pra justificar a escolha pelo método 2.

Essa extração consiste na lise química e mecânica por meio detergente sintético e
alta vibração. Seguida por etapas sucessivas de precipitação de material não
genético por meio de sais e proteinase. Os contaminantes orgânicos são lavados
por meio de solventes orgânicos como Fenol, clorofórmio e cetyltrimethyl
ammonium bromide (CTAB). Por fim o material genético é precipitado por meio do
polímero polietilenoglicol (PEG) 6000 em concentração de 13 % em uma solução
1,6 M de NaCl.

3.8 Extração de DNA consórcios bacterianos

A extração de DNA genômico dos consórcios bacterianos foi feita quando a

DO600 dos consórcios atingiu no mínimo 1,5. O método de melhor rendimento e
qualidade de DNA utilizado para a extração de DNA dos consórcios tanto das
rochas quanto da água de produção foi o descrito por (KNAEBEL; CRAWFORD,
1995). O DNA extraído foi mantido em respectivo tampão e armazenado a -20 º C
para análises posteriores.

3.9 Avaliação quantitativa e qualitativa do DNA

A quantificação do DNA genômico foi procedida por fluorometria com o

equipamento Qubit Fluorometer (Invitrogen), utilizando o kit Qubit® dsDNA HS
(High Sensitivity) Assay Kit.

A pureza do DNA extraído foi verificada através de espectrofotômetro

NanodropTM 9000 (Thermo Fisher Scientific), por meio de leituras feitas no
24
comprimento de onda de 260 nm, considerando que uma unidade de densidade
óptica (DO) corresponde a aproximadamente 50 μg/ml para DNA de dupla fita A
pureza das amostras foi estimada pela relação 260/280. Amostras com valores
entre 1,8 e 2,0 foram consideradas com grau de pureza satisfatório.

A integridade do DNA foi avaliada por eletroforese. Foi preparado um mix [

5V de DNA :1V de tampão de corrida cuja composição está no ANEXO II. Em
seguida, o mix foi aplicado em gel de agarose 0,8 % com o corante Sybr® Safe
(Thermo Fisher Scientific) em tampão TAE (ANEXO II).

3.10 Ensaio de dispersão do óleo

O experimento avalia a presença de moléculas surfactantes nas culturas

bacterianas. O ensaio foi realizado em uma placa de Petri de 150 mm de diâmetro
onde foram adicionados 30 ml água destilada e em seguida 500 µL de petróleo, até
formar uma membrana hidrofóbica sobre a água. Logo em seguida, foram
adicionadas 500 µL de sobrenadante de cultura obtido durante a fase estacionária
da curva de crescimento das culturas por meio de centrifugação a 3000 g por 8
minutos à temperatura ambiente. Foi utilizado como controle negativo somente
meio mineral BH e como controle positivo o surfactante sintético Dodecil sulfato de
sódio (SDS) 1 %. A área de dispersão do óleo foi comparada entre os controles e
as amostras em estudo (MORIKAWA; HIRATA, 2000).

3.11 Ensaio de emulsificação

A fim de avaliar a presença de moléculas surfactantes e a formação de

emulsão entre as fases hidrofóbica e hidrofílica ao longo de dias de cultivo. O
ensaio baseado na capacidade de emulsificação produzida pelos
biossurfactantes é utilizado para quantificar a capacidade dos biossurfactantes
em estabilizar uma emulsão de hidrocarbonetos a partir do cálculo do índice de
emulsificação, sendo esse calculado após 24 horas da realização do ensaio

25
(E24%) (SATPUTE et al., 2010b). O índice de emulsificação é calculado como a
razão entre a altura da camada de emulsão e a altura total do sistema multiplicado
por 100, como mostrado na equação abaixo.

O ensaio foi realizado em triplicatas em um tubo onde foram adicionados 2

ml de querosene, 2 ml da sobrenadante obtidos após centrifugação de 30 ml da
cultura à 3.000 g por 10 minutos à temperatura ambiente, tendo como controle
positivo surfactante sintético SDS 1 %.

3.12 Avaliação da tensão interfacial

O teste de avaliação da tensão interfacial entre a sobrenadante de cultura

bacteriana e petróleo foi realizado usando o tensiômetro DVT50 da Kruss. O
método padronizado neste trabalho foi o Rising Drop que consiste na avaliação da
tensão interfacial entre duas substancias testadas (SATPUTE et al., 2010b).
Durante o teste é avaliada a força existente na substância presente na Bulk Phase
e entre a gotícula de óleo presente na Dispense phase, conforme figura 6
ilustrativa a seguir.

26
Figura 6 Foto ilustrativa do teste de tensão interfacial utilizando o tensiômetro da DVT50, indicando
a fase hidrofílica (amostra) e fase hidrofóbica analisadas (petróleo).

Como Bulk Phase foram utilizadas as amostras dos sobrenadantes dos

consórcios. Como controle negativo foi utilizado somente meio de cultura,
enquanto para controle positivo o surfactante sintético SDS em concentração de
1% diluído em água destilada. Como Dispense Phase foi utilizado petróleo para
aferir a tensão interfacial entre a amostra e óleo. Espera-se que a presença de
moléculas surfactantes na Bulk Phase seja capaz de reduzir a tensão interfacial
entre as duas fases. O teste foi realizado durante fase estacionária da curva de
crescimento bacteriano conforme anteriormente descrito e tendo todas as
amostras em triplicatas. Para realizar esse teste, 30 ml de consórcio bacteriano foi
centrifugação 3.000 g por 10 min à temperatura ambiente e o sobrenadante obtido
foi utilizado para as análises.

3.13 Ensaio de degradação de hidrocarbonetos

A fim realizar uma avaliação inicial da biodegradação de hidrocarbonetos

pelos consórcios bacterianos ao longo da curva de crescimento, foi realizado um
teste de degradação utilizando o aceptor artificial de elétrons 2,6-
diclorofenol indofenol (DCPIP) descrito por KUBOTA et al., (2008), o qual ao

27
incorporar elétrons muda de sua forma oxidada e de coloração azul para sua
forma reduzida e incolor, sendo um indicativo da reações de oxidação e utilização
do hidrocarboneto pelo microrganismo. O teste foi realizado conforme descrito por
KUBOTA et al., (2008), no qual o DCPIP foi diluído em 100 ml de água para uma
concentração de 37,5 μg/ml e filtrado com filtro 0,22 µm Millipore da MF-
Millipore™. As culturas crescidas em BH com 1% de petróleo até uma DO600 de
1,0 foram centrifugadas 2500 g e ressuspendidas em meio BH. Para a realização
desse ensaio foram utilizados 800 μl de meio BH, 100 μl DCPIP para
concentração final de 3,7 μg/ml, 80 μl de cultura bacteriana para uma DO final de
0,5 e 10 μl de petróleo como fonte de carbono. Para controle positivo de todos os
consórcios, foi utilizado 800 μl de meio BH, 100 μl DCPIP para concentração final
de 3,7 μg/ml, 80 μl de cultura bacteriana para uma DO final de 0,5 e 10 μl de
glicose 1M. Para controle negativo 01 de cada consórcio foi utilizado apena
cultura bacteriana, DCPIP e BH sem adição de fonte de carbono. Para controle de
todo o experimento foi realizado controle negativo 02 contendo DCPIP, BH, sem
adição de bactérias e fonte de carbono; controle negativo 03 contendo petróleo,
DCPIP e BH sem adição de cultura.

3.14 Cromatografias

Os testes cromatográficos presentes neste trabalho foram realizados em

colaboração com o Centro de Tecnologia do Gás e Energias Renováveis (CTGAS-
ER). A cromatografia foi realizada durante a fase estacionária da curva de
crescimento bacteriana dos consórcios. Durante essa fase foram preparadas
culturas bacterinas dos respectivos consórcios em erlenmeyer de 250 ml contendo
50 ml de meio mineral BH acrescido de 1 % de petróleo. O controle negativo desse
experimento foi usado apenas meio mineral e petróleo sem cultura bacteriana. O
óleo bruto residual foi extraído por mistura solvente Vol / vol. Os procedimentos do
ensaio das amostras foram realizadas conforme a norma EPA8270 para a
determinação de Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos – HPAs. Como padrão
de calibração de HPA da Cromatografia Gasosa com Detecção por Espectrometria
28
de Massas, foi utilizado padrão de referência rastreado ao NIST e preparado
volumetricamente. Foi utilizado como surrogate p-terfenil-d14, com recuperação de
57 % e tendo como limite de quantificação da curva analítica = 0,10 mg/L.

3.15 Sequenciamento de DNA

O sequenciamento foi realizado por meio da plataforma de nova geração

ION torrent PGMTM (Life Technologies) seguindo as etapas abaixo:

3.15.1 Avaliação da qualidade do DNA genômico

A integridade e tamanho do DNA foram avaliados por eletroforese em gel
de agarose e fluorometria por Qubit, como descrito no item 3.9. Desse modo,
foram elencadas para o sequenciamento, seis amostras que preencheram os
critérios da avaliação do grau de pureza de DNA (água de produção do poço P1 e
rocha do poço P2 nas faixas de profundidade de 966 à 972 m e 1053 à 1056
m), além dos consórcios de rocha R1, R2 e água de produção A1.

3.15.2 Fragmentação enzimática do DNA genômico

As reações de fragmentação enzimática do DNA foram realizadas com o kit

IonXpressTM Plus Fragment Library (Life Technologies), partindo de uma

concentração de 200 ng/µl de cada amostra, seguido de purificação do DNA
fragmentado com o uso de beads magnéticos (Agencourt ® AMPure XP, Life

Technologies) e rack magnético (DynaMagTM -2 magnet, Life Technologies), de

acordo com as recomendações do fabricante.

3.15.3 Ligação de adaptadores e reparo de extremidades do DNA

O DNA fragmentado e purificado teve as extremidades ligadas a
adaptadores (Ion P1 Adapters) que fornecem a sequência específica para
anelamento de primers acoplada a uma sequência que funciona como um
barcode das amostras, seguindo as instruções do kit Ion Plus Fragment Library
29
(Life Technologies). Em seguida, o DNA fragmentado foi ligado a adaptadores e
barcodes e mais uma vez purificado com o uso de beads magnéticos, como
descrito anteriormente, seguindo as recomendações do fabricante (Life
Technologies).

3.15.4 Seleção por tamanho da biblioteca não amplificada

Os fragmentos de DNA de 400 pares de base foram selecionados em E-

Gel® (Life Technologies) na unidade de eletroforese iBase TM (Life Technologies).

3.15.5 Amplificação da biblioteca

A amplificação da biblioteca metagenômica foi realizada em 100 µl de
Platinum PCR Super Mix Hgh Fidelity e 5 µl de mix de primer. A desnaturação do
DNA ocorreu a 95 °C por 5 min, seguido de oito ciclos de 95 °C por 15 s, 58 °C
por 15 s e 70 °C por 1 min. A seguir, a biblioteca amplificada foi purificada com o
uso de beads magnéticas, como descrito anteriormente, seguindo as
recomendações do fabricante (Life Technologies).

3.15.6 Preparo do template

O preparo do template incluiu o uso do mix de reagentes Ion PGM Hi-QTM

OT2 para que ocorresse a amplificação clonal em partículas IonSphere™.
Posteriormente, os templates ligados a esferas (IPS) foram recuperados e

enriquecidos no IonOneTouchTM.

3.15.7 Sequenciamento das amostras

Os templates enriquecidos e ligados às esferas foram inseridos no Ion

318TM chip. O princípio do sequenciamento de nova geração do IonTorrent

envolve a medição do pH a cada incorporação de bases nucleotídicas.
Naturalmente, um próton é liberado quando um nucleotídeo é incorporado na
molécula de DNA pela polimerase, resultando em uma mudança local e detectável
de pH. Cada micro- poço do chip de sequenciamento contém aproximadamente
um milhão de cópias de uma molécula de DNA. O sequenciador Ion Personal
Genome Machine (PGM™) sequencialmente carrega o chip com cada uma das
30
diferentes bases nucleotídicas que compõem o DNA (guanina, citosina, adenina e
timina) uma após a outra. Dessa forma, se um nucleotídeo é complementar a
sequência de uma molécula de DNA em um poço em particular, o mesmo será
incorporado e íons de hidrogênio serão liberados. O pH da solução é alterado
naquele poço e é detectado pelo sensor de íons, transformando a informação
química em digital.

3.16 Análises de Bioinformática

Após a realização das reações de sequenciamento foram gerados em

média 4 Gbs de sequências de DNA para cada amostra. Tais resultados foram
obtidos utilizando a plataforma de bioinformática da Life Technologies Ion
Reporter e salvos no formato Fastq com as informações de qualidade para
posterior análise e filtragem de dados. A partir de então foi desenvolvido uma
pipeline de bioinformática com diferentes objetivos, conforme é descrito no
esquema da figura 7 abaixo. A pipeline é composta por uma fase preliminar de
análise de qualidade, em seguida é subdividida em duas abordagens diferentes.
Na metodologia assembly são montados os contigs para anotação taxonômica de
espécies bem como identificação de ORFs, anotação gênica bem como
montagens de genomas. Para realizar uma avaliação quantitativa dos
metagenomas foi utilizado uma abordagem do tipo not assembly na qual foram
utilizados reads para uma quantificação taxonômica até o nível de gênero
presentes nas amostras. Enquanto para uma análise qualitativa e anotação
genética foi utilizado uma abordagem assembly por meio de contigs para
anotação ao nível de espécies bem como funcional.

31
Figura 7 Fluxograma da pipeline de bioinformática usada com diferentes programas para a análise
de dados dos sequenciamentos. Apresentando as diferentes abordagens utilizadas após fase de
análise de qualidade de dados. A abordagem not-assembly utilizando reads bem como a
abordagem assembly utilizando contigs.

Visto que o processo de sequenciamento pode gerar erros e sequências de

baixa qualidade ou significativamente curtas, as quais podem comprometer as
análises, os dados obtidos foram previamente submetidos a um controle de
qualidade, utilizando-se os programas Trimmomatic, FastQC e FastQ/A_collapser.
O Trimmomatic (BOLGER; LOHSE; USADEL, 2014) foi empregado para remoção
de bases no início e final dos fragmentos sequenciados, com índice de qualidade
<20, bem como fragmentos de tamanho menor que 30 pb. Em seguida, os dados
foram submetidos ao FastQC, FastX-trimmer e FastQ/A_collapser, presentes no
pacote FASTX-toolkit 0.010 (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/). O FastQC foi
usado para analisar o resultado das métricas previamente usadas e avaliar a
qualidade do sequenciamento. Extremidades finais dos fragmentos (reads) com
alta variação de proporção de nucleotídeos foram removidas pelo FastX-trimmer.
32
Reads duplicados provenientes de erros sintéticos foram removidos dos dados
através do programa FastQ/A_collapser.

Após o controle de qualidade, foi realizada a montagem dos contigs, usando

o programa Spades (JU; ZHANG, 2015) aplicando-se os parâmetros: “careful”, o
qual tenta reduzir o número de “mismatches“ e “indels” e “only-assembler”, que
desativa a opção de correção de bases, o que pode enviesar a montagem de
metagenomas. As sequências obtidas no processo de montagem foram
submetidas à predição de regiões codificantes de genes (ORFs – Open Reading
Frames), utilizando o programa Metagenemark (BESEMER; BORODOVSKY,
1999) específico para sequências metagenômicas, com parâmetros default. A
presença de genes pertencentes a vias metabólicas de interesse foi avaliada para
todas as amostras. Para isso, foram extraídas do banco de dados KEGG (JU;
ZHANG, 2015) as sequências em formato FASTA dos genes presentes nas vias
metabólicas de interesse em todos os organismos do repositório e com isso foi
construído um banco de dados locais BIOSURFDB. O programa BLASTp foi então
utilizado para comparações de similaridade por homologia entre as proteínas
preditas e os bancos de dados BIOSURFDB para análises funcionais de interesse
utilizando contigs como input . Os resultados do programa BLASTp foram filtrados
utilizando um script in-house desenvolvido em PERL para selecionar
automaticamente os melhores alinhamentos, segundo os critérios: e-value <= 1e-
05, identidade >= 50%, cobertura do alinhamento superior a 80 % de ambas as
sequências comparadas e um mínimo de 5 alinhamentos significativos no banco de
dados para cada sequência predita examinada.

Em paralelo à predição de ORFs, os contigs obtidos para cada amostra

foram comparados por alinhamento com sequências não redundantes disponíveis
no banco de dados GenBank, utilizando o programa Diamond (BUCHFINK; XIE;
HUSON, 2014) aplicando um valor de e-value mínimo de 10-5. Os grupos
microbianos contidos nos metagenomas foram identificados através do algoritmo
de classificação taxonômica LCA (Lowest Common Ancestor) do MEGAN (HUSON
et al., 2007), com os parâmetros de escore mínimo de alinhamento de 50, e-value

33
superior a 10 -5, identidade mínima de 60%, mínimo suporte de 5 "hits",
porcentagem LCA = 80. Reads com baixa complexidade (inferior a 0.3) foram
filtrados da análise.

As espécies identificadas pelo MEGAN em cada amostra, e que

apresentarem maior número de contigs, foram utilizadas como referência para o
mapeamento, usando o Bowtie2 (LANGMEAD; SALZBERG, 2012) para uma
identificação dos reads que compõem cada contig previamente montado. Os reads
mapeados serão utilizados para uma montagem, utilizando novamente o Spades,
para tentativa de se obter uma montagem mais fidedigna do genoma.

A comparação do sequenciamento das amostras de rocha e água de

produção foi feita através de uma análise de componentes principais (PCA) a fim
de evidenciar a relação entre a natureza das amostras com taxonomia e
funcionalidade de genes.

3.17 Análises Estatísticas

As análises comparativas de bioinformática e estatísticas foram realizada

usando o software Statistical Analyse of Metagenomic Profiles (STAMP) (PARKS et
al., 2014). Para análise significativa de diferença de proporção relativa na
distribuição taxonômica e funcional foi utilizado o teste exato de Fisher de dois
lados, com o método de intervalo de confiança de Newcombe-Wilson, utilizando a
taxa de descoberta falso de Storey (FDR), e o teste de Benjamin-Hochberg (FDR)
foi aplicado para correção. Os resultados com q <0,05 foram considerados
significativos e os reads não classificados foram removidos das análises. A
relevância biológica dos taxa estatísticos foi determinada aplicando-se uma
diferença entre as proporções de pelo menos 1%. Enquanto que as curvas de
crescimento, cromatografias e avaliação da tensão interfacial foi aplicado do teste
não paramétrico ANOVA sendo os valores de p < 0,05 considerados significantes.

34
4 RESULTADOS

4.1 Obtenção de consórcios

Foram testados diferentes meios e condições de cultivo a fim de selecionar

diferentes microbiotas a partir das amostras de rocha e água de produção. A
tabela 4 abaixo mostra todos os consórcios obtidos após a seleção microbiana.

Tabela 4: consórcios obtidos em diferentes meios de cultivo durante as fases de enriquecimento e

seleção bem com a descrição da observação de crescimento (+) ou não ( - ) nas respectivas fases.
Consórcios selecionados para testes funcionais e sequenciamento (*).

Consórcio Preparo Temperatura Crescimento Crescimento

(Meio De (fase de (Fase de
enriquecimento/seleção) Cultivo enriquecimento) seleção)
*A1 BH/BH 30 ºC ++ ++
A2 YPD/BH 30 ºC ++ ++
A3 CG/BH 30 ºC ++ --
A4 LB/BH 30 ºC ++ --
A5 AM/BH 30 ºC ++ --
A6 BH/BH 37 ºC ++ --
A7 YPD/BH 37 ºC ++ --
A8 CG/BH 37 ºC ++ --
A9 LB/BH 37 ºC ++ --
A10 AM/BH 37 ºC ++ --
*R1 LB/BH 37 ºC ++ ++
*R2 LB/BH 37 ºC ++ ++
R3 LB/BH 37 ºC ++ ++

Com base no aspecto visual (maior turvação do meio) os consórcios A1 e A2

de água de produção apresentaram melhor crescimento, comparativamente ao
controle negativo, contendo petróleo e meio mineral apenas, ver figura 1S (anexo
IV). Esses consórcios foram preparados a partir de água de produção a 30 °C. A
fim de obter um consórcio hidrocarbonoclásticos (contendo mais organismo
degradadores de petróleo como fonte preferencial de carbono), o consórcio A1 foi
tanto enriquecido quanto selecionado somente em meio mineral BH, ou seja, os
microrganismos deste consórcio não tiveram contato com qualquer outra fonte de
carbono além das fontes presentes na própria amostra de água de produção e o

35
petróleo. Por outro lado, o consórcio A2 foi enriquecido em YPD e posteriormente
selecionado em BH. Tais consórcios foram então escolhidos para testes funcionais
de degradação e identificação de moléculas surfactantes bem como extração de
DNA genômico, para posterior reação de sequenciamento de DNA.

Os consórcios de água de produção crescidos a 37 °C, (A6 à A10 tabela 4)

por outro lado, durante a fase de seleção para obtenção dos consórcios não foi
observada turbidez similar a observada a 30°C (Figura 2S em anexo IV). Desse
modo, decidiu-se trabalhar apenas com os consórcios de água de produção
obtidos a 30 ºC (tabela 4).

Embora tais consórcios de água de produção preparados a 37 °C não

tenham demostrado crescimento bacteriano satisfatório ao final 6º semana de
isolamento, foram notadas mudanças no aspecto visual do óleo, como é possível
observar na figura 9 (Figura 2S em anexo IV). Tais consórcios estão estocados
em glicerol 100% e nos seus respectivos meios ricos, de modo que o processo de
preparo dos consórcios seja repetido posteriormente de modo a otimizar as
condições de cultivo.

Os consórcios de rocha foram crescidos e enriquecidos em meio LB e

posteriormente selecionados em meio mineral BH à 37 °C. Nota-se que todos os
consórcios de rocha, nomeados R1, R2 e R3, apresentaram turbidez indicativa de
crescimento bacteriano ao final da 6° semana de cultivo, diferentemente do
observado para o controle negativo (Figura 3S em anexo IV). O consórcio R1 é
proveniente da rocha filito do poço P2 com profundidade de 1053 à 1056 m. O
consórcio R2 foi isolado da rocha carbonática do poço P2 de profundidade de 966
à 972 m. Enquanto o consórcio R3 é proveniente da rocha do poço P1. Todos os
três consórcios de rocha foram submetidos as mesmas condições de cultivo, isto
é, foram enriquecidos em meio LB e posteriormente selecionados em BH, visto
que se tratavam de amostras diferentes.

Embora todos os consórcios de rocha preparados tenham demonstrado

bom crescimento, somente foram sequenciados e testados os consórcios de

36
rocha do poço P2 (R1 e R2). Os testes com o consórcio R3 encontram-se em
andamento, os quais serão seguidos por extração do DNA e juntamente com o
DNA da rocha P1 serão submetidos a outra abordagem de sequenciamento de
DNA.

4.2 Curvas de crescimento dos consórcios de bactérias

Com o intuito de verificar o crescimento bacteriano, foi realizada uma curva

de crescimento para os consórcios A1 e A2, somente em meio mineral BH,
utilizando apenas 1% de petróleo como única fonte de carbono e energia a 30 ºC.

Figura 8 Curvas de crescimento dos consórcios de água de produção A1 e A2 à 30 °C. Em A, o

consórcio A1, e o seu controle C1 negativo contendo meio e petróleo sem adição de cultura e o
controle C-A1 com consórcio A1 e meio BH sem adição de petróleo. Em (B) o consórcio A2, controle
C1 contendo meio e petróleo sem adição de cultura e controle C-A2 com consórcio A2 e meio BH
sem adição de petróleo.

Na figura 8 (A) nota-se que tanto a consórcio A1 quanto o controle sem

petróleo C-A1 obtiveram crescimentos similares. Diferentemente, o consórcio A2,
37
obteve um excelente crescimento nas primeiras 24 horas de cultivo, sendo o
mesmo superior ao seu controle C-A2 sem petróleo (Figura 8B), sugerindo que
os microrganismos são potencialmente degradadores de hidrocarbonetos do
petróleo crescem mais rápido do que organismo quimioautotróficos possivelmente
abundantes no consórcio crescido na ausência de petróleo.

Os consórcios de rocha que obtiveram melhor resultado foram os crescidos

à 37 ºC R1 e R2 como é possível observar na figura 9. A curva de crescimento
mostra que os consórcios têm dinâmicas de crescimento diferentes. O consórcio
R1 apresenta crescimento mais rápido, chegando a fase exponencial nas primeiras
24 horas, enquanto o consórcio R2 cresce mais lentamente demorando até três
dias para chegar a fase exponencial, no entanto ambos consórcios chegam
praticamente juntos na fase estacionária.

Figura 9 Curva de crescimento bacteriano dos consórcios de rocha R1 e R2 crescidos em meio BH,
contendo apenas 1 % de petróleo com única fonte de carbono à 37 ºC. Em (A) curva do consórcio
R1, tendo como controle negativo C1 contendo somente meio mineral e óleo bem como o controle
C-R1 contendo cultura bacteriana R1 sem fonte de carbono. Em (B) curva do consórcio R2, controle
negativo C1 contendo apenas petróleo e meio mineral e controle C-R2 contendo cultura bacteriana
R2 sem fonte de carbono.

38
 É possível verificar que o controle sem petróleo C-R1 cresceu
comparativamente ao controle negativo sem cultura bacteriana (C1), o qual não
cresceu, Figura 9 (A). No entanto esse controle sem petróleo (C-R1) apresenta
crescimento lento e inferior a cultura com petróleo R1. Esse resultado permite inferir
que o crescimento de bactérias não degradadoras ou degradadores na ausência de
fonte de carbono é mais lento. Ou ainda organismos que utilizariam outras formas
de obtenção de energia como quimioautotrófica presentes no consórcio R1 são
favorecidos na ausência de petróleo. Diferentemente, o consórcio R2 não se
observa crescimento do seu controle C-R2 na ausência de petróleo (Figura 9 B).

4.3 Ensaio de dispersão de óleo

A imiscibilidade existente entre óleo e água é devido a diferença entre

natureza das forças intermoleculares nas duas substâncias, moléculas tensoativas
possuem a capacidade de dispersão dessas duas fases imiscíveis, reorganizando
a fase hidrofóbica na forma de micelas. A figura 10 apresenta o resultado do ensaio
de dispersão do óleo que avalia presença de moléculas surfactantes capazes de
desorganizar a fase hidrofóbica.

39
Figura 10 . Ensaio de dispersão do óleo. (A) Sobrenadante do consórcio R2 comparado ao controle
positivo SDS 1 % e controle negativo meio mineral BH. Em (B), sobrenadante do consórcio R1
comparado ao controle positivo SDS 1 % e controle negativo meio mineral BH.

O ensaio mostra que ambos os consórcios são positivos para a presença de

moléculas surfactantes devido a dispersão do óleo após a adição do sobrenadante,
semelhantemente ao controle positivo o SDS1 % (Figura 10 A e B). Como
esperado o controle negativo contendo apenas meio BH e óleo não apresentou
dispersão do óleo.

4.4 Ensaio de emulsificação dos consórcios de rocha

O teste de emulsificação do querosene indicou a produção de

biossurfactantes e a conseguinte formação de emulsão entre o sobrenadante e a
fase hidrofóbica por ambos os consórcios testados R1 e R2 em até 15 dias de
cultivo.

40
Figura 11 Ensaio de emulsificação dos consórcios R1 em (A) e R2 em (B). Os ensaios foram
realizados tendo o SDS 1 % como controle positivo. Em (C) são apresentados os índices de
emulsificação dos consórcios de rocha R1 e R2 ao longo de 13 dias de cultivo, comparativamente a
emulsão formada pelo controle positivo SDS 1 %.

O ensaio de emulsificação demonstrou que o consórcio R2 foi mais eficiente

na produção de biossurfactantes, visto que a sua emulsão foi mais densa e
41
estável do que a emulsão formada pelo consórcio R1 (Figura 11 A e B). Além
disso, o índice de emulsificação foi crescente ao longo dos dias de cultivo
observados para ambos os consórcios, atingindo E24% superior a 60%, próximo ao
controle SDS 1 %, considerado um bom emulsificante sintético, figura 11 (C).

4.5 Análise de tensão interfacial dos consórcios

Para avaliar a presença de moléculas surfactantes com a ação tensoativa no

sobrenadante das culturas dos consórcios bacterianos tanto de água de produção
A1 e A2 quanto de rocha R1 e R2, foi realizado medição da tensão interfacial entre
o sobrenadante da cultura e o petróleo (Figura 12).

Figura 12 Em A, avaliação da tensão interfacial ao longo do tempo dos consórcios de água de

produção A1 e A2, comparadas ao controle positivo, o surfactante sintético SDS 1 % bem como ao
controle negativo contendo meio BH e óleo. Diferenças estatísticas, comparadas ao controle
negativo, considerando P value < 0,05. Em (B) avaliação da tensão interfacial ao longo do tempo
dos consórcios de rocha R1 e R2, comparadas ao controle positivo o surfactante sintético SDS 1 %

42
bem como ao controle negativo contendo meio BH e óleo. Diferenças estatísticas, comparadas ao
controle negativo, considerando P value < 0,05.

A figura 12 mostra os resultados obtidos da avaliação da tensão interfacial

para os consórcios de água de produção na figura 12 (A) e para os consórcios de
rocha na figura 12 (B). Houve redução significativa da tensão interfacial ao longo do
tempo de todos os consórcios, assim como ocorre no controle positivo SDS 1% nas
Figuras 12 (A e B). Comparativamente ao controle negativo, figura 12 (A) para os
consórcios de água de produção figura 12 (B) para os consórcios de rocha, os
resultados obtidos mostram a redução da tensão interfacial ao longo do tempo
devido provavelmente a presença de moléculas tensoativas no sobrenadante das
culturas bacterianas.

4.6 Teste de degradação com indicador redox

A fim de avaliar primariamente a atividade de biodegradação de

hidrocarbonetos durante a curva de crescimento dos consórcios R1 e R2, foi
utilizado um indicador redox para sugerir a ocorrência de degradação do petróleo.
Observa-se nas figuras 13 A e B que os consórcios se mostram positivos para a
degradação de hidrocarbonetos, quando comparados aos controles negativos sem
carbono. Os controles sem fonte de carbono (Figura 13 A) também mostram certa
atividade (mudança de cor), o que possivelmente é um indicativo de organismos
quimioautotrófico presentes nas amostras, no entanto, testes cromatográficos estão
em execução para confirmar essa hipótese.

43
Figura 13 Teste de degradação de hidrocarbonetos com indicador DCPIP. Em A) Controle positivo
com glicose (C+gli); Consórcios R1 com petróleo (Pet+R1); Controle negativo sem fonte de carbono
com o consórcio de rocha R1(C-pet); Controle negativo com petróleo (C+pet) e controle negativo do
meio BH e o reagente DCPIP(C+BH). Em B) Controle positivo com glicose (C+gli); Consórcios R2
com petróleo (Pet+R2); Controle negativo sem fonte de carbono com o consórcio de rocha R2(C-
pet); Controle negativo com petróleo (C+pet) e controle negativo do meio BH e o indicador DCPIP
(C+BH).

4.7 Cromatografias

Com o intuito de quantificar os hidrocarbonetos residuais decorrentes da

degradação realizada pelos consórcios de água de produção A1 e A2, foram feitas
cromatografias a gás, tendo como controle o meio mineral BH sem petróleo durante
a fase estacionária da curva de crescimento dos consórcios. Os primeiros
resultados das cromatografias para hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs)
são mostradas na figura 14 a seguir para os consórcios de água de produção.

44
Figura 14 Cromatografias à gás dos consórcios de água de produção A1 e A2 para HPAs totais.
São mostrados diferentes tipos de HPAs quantificados nos dois consórcios e controle negativo
contendo apenas óleo e meio.

A cromatografia gasosa indicou que houve redução de HPAs totais

decorrente da degradação para ambos os consórcios (Figura 14). Na amostra do
consórcio A1 houve uma redução de mais de 50% comparada ao controle negativo.
De forma semelhante também houve diminuição da quantidade de HPAs no
consórcio A2 de 17,3 % em relação ao controle negativo. Os testes
cromatográficos dos consórcios R1 e R2 são mostrados na figura 15 abaixo.

45
Figura 15 Cromatografias à gás dos consórcios de rocha R1 e R2 para HPAs totais. São mostrados
os diferentes HPAs que puderam ser quantificados em cada consórcio, comparativamente ao
controle negativo sem cultura bacteriana, contendo apenas óleo e meio.

Os resultados cromatográficos dos diferentes HPAs que puderam ser

quantificados para os consórcios de R1 e R2, mostram que houve uma redução 68
% do HPA totais no consórcio R1. Enquanto que houve uma redução de 46 % do
HPAs no consórcio R2, comparativamente ao controle negativo contendo apenas
petróleo e meio mineral. No entanto tais resultados não são estatísticos, pois essas
cromatografias são os primeiros e não foram feitas duplicatas experimentais.

46
4.8 Metagenomas

4.8.1 Extração de DNA

Foram realizados diferentes métodos de extração de DNA, conforme foram

descritos na tabela 3. Os resultados da quantificação de DNA extraído para cada
amostra são apresentados na tabela 5 abaixo.

Tabela 5: Quantificação de DNA extraído de todas as amostras pelo método descrito por
(KNAEBEL; CRAWFORD, 1995).

Amostra Concentração (ng/µl)

Água de produção 15,2

Rocha P2 (966-972m) 4,58

Rocha P2 (1053- 1056m) 32,2

Rocha P1 ( 975 - 985 m) 12,5

Consórcio da Rocha R1(1053 - 1056m) 9,7

Consórcio da Rocha R2 (966-972m) 998

Consórcio de água de produção A1 51

Consórcio de água de produção A2 214

De todos os métodos utilizados, o melhor rendimento observado foi com o

método 1 que utilizou o kit comercial PowerMax® Soil DNA Isolation (MO BIO
Laboratories, Inc) para água de produção. Já método 2 que utilizou os reagentes
fenol, clorofórmio e CTAB (KNAEBEL; CRAWFORD, 1995) foi que apresentou
melhor rendimento de DNA das amostras de rocha P1 e P2 bem como para os
consórcios bacterianos. No entanto a quantificação e a qualidade do DNA
genômico extraído para a rocha G53 não foram suficientes para realizar o
47
sequenciamento do tipo shotgun de genoma complete para essa amostra. Desse
modo, tanto a rocha P1 quanto os seu respectivos consórcio (R3) serão
submetidos a outra metodologia de seqüenciamento que exija um menor input de
DNA.

4.8.2 Dados gerais de bioinformática dos sequenciamentos

Para identificar as comunidades bacterianas da água de produção e das

rochas do poço de petróleo bem como dos consórcios R1 e R2 e A1 foi realizado o
sequenciamento de genoma completo do tipo shotgun com a plataforma Ion
Torrent PGM. As quantidades de dados brutos gerados (reads) para cada amostra
sequenciada estão na tabela 6 do anexo III. Tais dados foram submetidos a análise
de qualidade em seguida à pipeline de bioinformática com diferentes objetivos. Os
resultados após análise e filtragem de dados também se encontram na tabela 6 do
anexo III. A seguir na figura 16 é possível observar a quantidade de dados gerados
para cada metagenoma e a curva de rarefação de cada comunidade bacteriana
sequenciada.

48
Figura 16 Curva de rarefação de todas as amostras sequenciadas. Curva simulada no programa
MEGAN, realizada com base no número diferentes níveis taxonômicos anotados, versos quantidade
de sequencias anotadas.

A análise da curva de rarefação indicou que todos os sequenciamentos

realizados apresentaram quantidades de sequências suficientes, mesmo após
filtragem de dados, para amostrar a riqueza de espécies existente em cada
comunidade. Destaca-se que a quantidade de sequencias necessárias para
alcançar a riqueza de espécies da comunidade da água de produção foi maior do
que as demais amostras. Além disso, é possível notar também que o metagenoam
do consórcio A1 é o menos rico. Após análise de qualidade, filtragem e montagens
de contigs, tais sequências foram alinhadas contra bancos de dados não
redundantes do NCBI, na figura 17 são apresentados os resultados desses
alinhamentos globais para todas as amostras.

Figura 17 A figura mostra as quantidades de sequências identificadas, isto é, que possuem hits
(alinharam) contra alguma proteína em banco de dados não redundante do NCBI. Os gráficos
mostram as quantidades de sequências identificadas que foram classificadas como pertencentes a
algum microrganismo bem como as quantidades de sequências embora identificadas, não foram
classificadas como pertencentes algum microrganismo ( com base nos parâmetros estatísticos
utilizados). Os gráficos mostram ainda as quantidades de sequências que não foram identificadas

49
nos metagenomas, isto é, as sequências que não tiveram hits com nenhuma proteína ou gene no
banco de dados não redundante utilizado.

Como é possível observar na figura 17, a maioria das sequências, por volta
de 50 % das sequências das amostras foram identificadas, isto é, apresentaram
algum match contra o banco de dados no NCBI. No entanto, em média 30 %
dessas sequências identificadas não puderam ser classificadas como pertencentes
a nenhum microrganismo depositado no NCBI com base nos parâmetros de
identidade, cobertura e e-value estabelecidos. Exceto o consorcio A1 no qual 72%
das sequências identificadas foram classificadas como pertencentes há algum
microrganismo. Além disso, poucas sequências, média de 26 %, não obtiveram hit
algum, ou seja, não foram identificadas nos metagenomas.

4.8.3 Abundância taxonômica ao nível de gênero

Para realizar uma análise quantitativa dos gêneros mais abundantes nos
metagenomas, os reads foram comparados contra o banco de dados não
redundante do NCBI, conforme anteriormente descrito. Os resultados das
sequências identificadas estão na tabela 7 a seguir que mostra a frequência
relativa dos gêneros mais abundantes identificados em todas as amostras.

Tabela 7. Gêneros mais abundantes em todas as amostras e suas respectivas frequências.

Água de Produção Rocha P2 (966-972 m) carbonato

Gêneros bacterianos Frequência Gêneros bacterianos Frequência
predominantes relativa (%) predominantes relativa (%)
Marinobacter 19,81 Halomonas 15,73
Halanaerobium 2,91 Vibrio 11,66
Desulfohalobium 1,73 Halolactibacillus 1,24
Desulfovibrio 0,65 Gracilibacillus 0,52
Halothiobacillus 0,13 Idiomarina 0,5
Halomonas 0,12 Shewanella 0,38
Rocha P2 (1053-1056 m) filito Consórcio R1
Gêneros Frequência Gêneros Frequência
predominantes relativa (%) predominantes relativa (%)
Halomonas 10,37 Ochrobactrum 12,41
50
 Halolactibacillus 7,32 Sphingobacterium 4,39
Vibrio 2,6 Bacillus 1,36
Shewanella 2,37 Brucella 0,86
Bacillus 0,46 Lysinibacillus 0,51
Zunongwangia 0,43 Mesorhizobium 0,14
Amphibacillus 0,34 Rhizobium 0,12
Consórcio R2 Consórcio A1
Gêneros Frequência Gêneros Frequência
predominantes relativa (%) predominantes relativa (%)
Ochrobactrum 25,43 Brevibacillus 50,48
Microbacterium 1,74 Paenibacillus 0,25
Brucella 1,33 Aeribacillus 0,25
Paenibacillus 1,16 Bacillus 0,11
Devosia 0,92 Aneurinibacillus 0,032
Sphingobacterium 0,52 Clostridium 0,024
Mesorhizobium 0,34 Mucor 0,019

Observa-se que não há gêneros predominantes com frequência acima 50 %

nas amostras de rocha e água de produção, visto que a maioria dos gêneros
identificados apresentam frequência relativamente baixa. No entanto no consórcio
R2, 25 % dos reads são classificados como pertencentes ao gênero Ochrobactrum,
o que pode ser decorrente do enriquecimento de organismo degradadores neste
consórcio. Por outro lado, no consórcio A1 de água de produção houve dominância
do gênero Brevibacillus. Além disso, embora esse consórcio apresente
predominantemente bactérias, foi identificado o gênero Mucor pertencente ao reino
fungi o que possivelmente pode indicar uma associação entre bactérias e fungos
biodegradadores. Destaca-se também no consórcio A1 o gênero de bactérias
anaeróbicas, embora aerotolerantes, do gênero Clostridium foram cultivadas nesse
consórcio.

A figura 18 compara, por meio de diagramas de Venn, todos os gêneros

comuns entre os consórcios e suas respectivas amostras das quais foram isolados.
É possível observar que houve uma seleção de gêneros específicos entre as
rochas e seus respectivos consórcios. Foram identificados 79 gêneros na amostra

51
de rocha fileto, enquanto 50 gêneros na rocha carbonato. Nos consórcios R1 e R2,
por outro lado, foram identificados 66 e 72 gêneros, respectivamente. Houveram 7
gêneros comuns tanto entre o consórcio R1 e a rocha filito, figura 18 (A), como
também no consórcio R2 e a rocha carbonato, figura 18 (B). Indicando
possivelmente que a mesma condição de cultivo utilizada em ambos os consórcios
favoreceu populações de microrganismos semellhetes. A figura 18 (C) mostra que
os gêneros comons entre o metagenoma de água de produção e o consórcio A1, o
qual não houve fase de enriquecimento em meio rico, neste consórcio apenas 11
gêneros favorecidos durante o processo de seleção.

Também foram encontrados gêneros exclusivos aos consórcios, isso

possivelmente se deva ao fato que esses microrganismos aeróbicos exclusivos
dos consórcios eram pouco abundantes nas amostra de rocha e água de produção
ao ponto de não terem sido detectados pelo sequenciamento, dessa forma, o
processo de enriquecimento usando a pressão seletiva (petróleo como única fonte
de carbono) e de modo aeróbico fez com que tais gêneros se tornassem
abundantes nos consórcios.

52
Figura 18 Em A, diagramas de Venn entre os gêneros comuns do consórcio R1 ( preparado a partir
da rocha filito), comparativamente aos gêneros do metagenoma da rocha filito. Em B diagramas de
Venn entre os gêneros comuns do consórcio R2 ( preparado a partir da rocha carbonática),
comparativamente aos gêneros do metagenoma da rocha carbonática. Na figura C, diagramas de
Venn entre os gêneros comuns do consórcio A1 (preparado a partir da água de produção),
comparativamente aos gêneros do metagenoma de água de produção.

A figura 19 mostra os gêneros comuns entre os três consórcios bem como

entre os metagenomas das amostras de rocha filito, carbonato e água de produção.
Entre os consórcios de rocha, 35 gêneros são comuns entre eles, figura 19 (A).
Desse modo, existem mais gêneros comuns produtores de biossurfactantes e
degradadores de petróleo entre os consórcios de rochas do que entre eles e o
consórcio de água de produção (Figura 19 A).

Na figura 19 (B), o metagenoma de água de produção apresenta um número

maior com 86 gêneros, comparativamente aos metagenomas de rochas, sendo que
50 gêneros são exclusivos do metagenoma de água de produção. Nota-se ainda
que a comunidade bacteriana da água de produção é similar taxonomicamente a
rocha filito, visto que 34 gêneros pertencentes a rocha filito são comuns aos
53
gêneros pertencentes a água de produção, isso se deva provavelmente, a
profundidade similar entre essas duas amostras. Diferentemente da rocha
carbonática que mostrou ser mais distinta da comunidade da água de produção,
apresentando apenas 24 gêneros comuns entre essas duas amostras, sendo que 3
gêneros são exclusivos da amostra de rocha carbonática. Enquanto que entre
todos os três metagenomas houve 21 gêneros comuns.

Figura 19 Em A, são apresentados os diagramas dos gêneros comuns entre os metagenomas dos
consórcios R1, R2 e A1. Em B, os diagramas entre os gêneros comuns dos metagenomas de
rochas e água de produção.

Comparando os consórcios sequenciados com suas respectivas faixas de

rocha das quais foram isolados, podemos verificar quais gêneros foram favorecidos
durante o preparo dos consórcios. A figura 20 mostra quais gêneros são mais
predominantes estatisticamente no consórcio R1 em comparação a rocha filito de
1053 à 1056 m de profundidade.

54
Figura 20 Comparação taxonômica ao nível de gênero para os metagenomas da rocha filito e do
consórcio R1. São apresentado apenas as comparações significativas.

Os gêneros Sphingobacterium, Ochrobactrum, Bacillus, Brucella e

Lysinibacillus são significativamente mais abundantes no consórcio R1 (Figura 20).
De modo semelhante, o consórcio R2 apresenta os três gêneros Ochrobactrum,
Brucella e Sphingobacterium comuns ao consórcio R1, figura 21. Todavia o
consórcio R2 apresenta exclusivamente, em relação ao R1, os gêneros
Microbacterium, Devosia, Mesorhizobiume e Paenibacillus mais predominantes
(Figura 21). Em ambos os consórcios o gênero dominante identificado foi
Ochrobactrum (Figuras 20 e 21).

Figura 21 Comparação taxonômica ao nível de gênero para os metagenomas da rocha carbonática

e do consórcio R2. São apresentadas apenas as comparações significativas.
55
 Os cinco gêneros Idiomarina, Shewanella, Halomonas, Halolactibacillus e
Vibrio, foram comuns e mais abundantes em ambas amostras de rocha, figuras 20
e 21, destacando que nas duas rochas o gênero Halomonas é dominante. Por
outro lado os gêneros Zunongwangia, Amphibacillus são exclusivos da rocha 1053
à 1056 m (Figura 20), enquanto os gêneros Marinobacter e Gracilibacillus foram
exclusivos da rocha 966 à 972m, figura 21.

Figura 22 Comparação taxonômica ao nível de gênero para os metagenomas do consórcio A1 e da

água de produção. São apresentadas apenas as comparações e diferenças significativas.

Na figura 22, é possível notar que a predominância do gêneros Marinobacter

na amostra de água de produção. Além disso, bactérias resultaras de sulfato assim
como anaeróbicas presentes na água de produção nos gêneros Desulfohalobium,
Halamaerobium, Desulfovribrio não foram isoladas no consórcio A1 no qual há
predominâncias dos gêneros aeróbicos Brevibacillus e Paenibacillus. A figura 23 a
seguir mostra a comparação entre os dois consórcios de rocha.

56
Figura 23 Comparação entre os dois consórcios R1 e R2 ao nível de gênero. São apresentadas
apenas as comparações e diferenças significativas.

Os gêneros Microbacterium, Ochrobactrum, Devosia e Paenibacillus são

mais abundantes no consórcio R2, enquanto no consórcio R1 os gêneros
Sphingobacterium, Bacillus e Lysinibacillus são mais predominantes.

4.8.4 Análise comparativa taxonômica ao nível de espécies

Para confirmar as análises quantitativas utilizando reads, foram realizadas

montagens de contigs dos metagenomas e esses também foram alinhados
contra o banco de dados para refinar as anotações gênicas e predições de
ORFs. Os números totais de contigs montados bem como o tamanho médio e o
número de contigs com tamanho superior N50 utilizados nessas análises estão
na tabela 4 do anexo III desse trabalho. Os resultados dos alinhamentos contra o
banco global não redundante, usando como input as sequencias de contigs,
após montagens de genomas dos consórcios bacterianos de rocha, confirmam
as espécies mais abundantes nos consórcios e nas suas respectivas faixas de
rocha das quais foram preparados. Conforme o gráfico da figura 24, observa-se
a comparação das espécies mais abundantes no consórcio R2
comparativamente a rocha do qual foi isolado.

57
Figura 24 Comparação entre espécies presentes nas amostras de consórcio R2 de rocha do poço
P2 (966 -972 m) e sua respectiva rocha proveniente, rocha P2 (966 -972 m), utilizando contigs. São
apresentadas apenas as comparações e diferenças significativas.

Nota-se que, dentre as espécies que puderam ser identificadas, as espécies

mais abundantes na rocha P2 (966 -972 m) são Gracilibacilus lacisalsi,
Halolactibacilus sp bem como predominantemente contigs ao nível de espécies que
não poderão ser classificadas taxonomicamente (Not assignment). Assim como na
rocha, no consórcio R2 houve a predominância de contigs not assignment, os quais
podem pertencer espécies não identificadas nos bancos de dados utilizados nas
análises desse trabalho. Além do mais, a metodologia de seleção utilizada no
consórcio foi capaz de isolar nesta amostra as espécies de Ochrobactrum e
Paennibacilus, as quais têm sido descritas como degradadoras de hidrocarbonetos
do petróleo e produtoras de biossurfactantes, confirmando que a pressão seletiva
criada durante as fases de obtenção dos consórcios microbianos foi eficiente.

A figura 25 a seguir, mostra a comparação das espécies mais abundantes

no consórcio R1 em comparação com a faixa de rocha P2 filito (1053 – 1056 m).

58
Figura 25 Comparação entre espécies presentes nas amostras de consórcio R1 de rocha do poço
P2 (1053 – 1056 m) e sua respectiva rocha de onde foi isolado, rocha P2 (1053 - 1056 m). São
apresentadas apenas as comparações e diferenças significativas.

Como é possível observar na figura 25, a comunidade da rocha P2 (1053 –

1056 m) apresenta as espécies mais abundantes, como Shewanella sp.,
Shingobacterium sp., Halolactibacillus sp., e Amphibacillus jilinensis.
Semelhantemente ao consórcio o R2, o consórcio R1 também isolou
predominantemente as bactérias Ochrobactrum sp. No entanto, na amostra R1
houve a presença exclusiva das espécies Bacilus luchniformes, Sphingobacterium
sp, e Lysinibacillus sp.

As análises comparativas entre as rochas e água de produção, mostram a

riqueza de espécies existente nas comunidades dos reservatórios (Figura 26).

59
Figura 26 Comparação taxonômica ao nível de espécies para os metagenomas de água de
produção e rocha carbonática. Neste gráfico são apresentadas apenas as comparações e
diferenças significativas.

A comunidade residente na água produção é predominantemente não

identificada, no entanto apresenta ainda as espécies Marinobacter sp e
Desulfohalobium retbaense, Pelobacter carbinolocus, Halothiobacillus sp,
Desulfovibrio gigas e Flexistipes sinusarabici como abundantes. Igualmente a água
de produção, a rocha carbonática apresenta a maioria dos contigs como não
identificados (not assignment). Dentre as espécies que puderam ser identificadas, a
mais abundantes na comunidade da rocha carbonato estão presentes as espécies
Halolactibacillus sp, Gracilibacillus lacisaisi, Halomonas hydrothermalis, Vibrio
natriegens, Shewanella sp. e Flexistips sinusarabici. A figura 27 a seguir mostra a
comparação da rocha 1053 à 1056 m com água de produção.

60
Figura 27 Comparação taxonômica ao nível de espécies para os metagenomas de água de
produção e rocha filito. Neste gráfico são apresentadas apenas as comparações e diferenças
significativas.

As espécies Marinobacter sp e Desulfohalobium retbaense ainda continuam

predominantes na água de produção, assim como a espécie Halolactibacillus sp é
também mais predominante na rocha filito de 1053 à 1056 m. Porém, a rocha 1053
à 1056 apresentou outras espécies exclusivas, como Amphibacillus jilinesis.

4.8.5 Análise funcional

Com intuito de analisar funcionalmente os genes e via metabólicas de

interesse nas amostras, os contigs foram alinhados contra o banco de proteínas
customizado BIOSURFDB. Na figura 28 a seguir, é possível observar o resultado
da anotação funcional entre o consórcio de água de produção A1,
comparativamente ao metagenoma de água de produção.

61
Figura 28 Comparação funcional a nível de vias metabólicas do consórcio A1 com o metagenoma
de água de produção. Apenas resultados significativos são mostrados.

É possível verificar que houver significativo enriquecimento de vias de

degradação hidrocarbonetos no consórcio A1 bem como de vias de
biossurfactantes iturina A e lichenysin. Em contrapartida, houver significativa
abundancia de vias relacionadas ao metabolismos de enxofre, como redução de
sulfato no metagenoma de água de produção.

Os resultados da figura 29 comparam ao nível de metabolismo as amostras

do consórcio R1 com sua respetiva rocha que foi isolado.

Figura 29 Comparação funcional a nível de vias metabólicas do consórcio R1 com a rocha filito de
1053 à 1056 m. Apenas resultados significativos são mostrados.

62
 O perfil metabólico do consórcio mostra que houve um enriquecimento para
vias de degradação de hidrocarbonetos lineares significativamente no consórcio
R1, comparado a rocha 1053 à 1056 m, assim como houve o favorecimento de vias
de degradação de compostos aromáticos como Naftaleno e Fluorbenzeno. Além do
mais, as vias de biossíntese das moléculas biossurfactantes Lichenysin e
Plipastatin mostraram significativo enriquecimento no consórcio R1. A figura 30
apresenta o perfil metabólico do consórcio R2, comparativamente a rocha 966 à
972 m.

Figura 30 Comparação funcional a nível de vias metabólicas do consórcio R2 com a rocha

carbonato de 966 à 972 m. Apenas diferenças significativas são mostradas nesse gráfico.

Nota-se que as vias de degradação de compostos aromáticos como

Fluorbenzoato assim como a via de possíveis genes não identificados para um
substrato especifico ou via ( Generic Degradation Pathway ) mostram mais
predominância. Da mesma forma a vias de biossíntese do biossurfactante
Putisolvins bem como de Streptomycine são abundantes. No consórcio R2 houve
também expressivo favorecimento de genes envolvidos no metabolismo de
enxofre.

Os resultados comparativos entre a amostra bruta e os consórcios derivados

destas amostras corroboram com os testes funcionais realizados para detectar a
habilidade de degradação de petróleo e biossíntese de surfactantes e confirmam
mais uma vez o sucesso da estratégia de obtenção dos consórcios microbianos.

63
Figura 31 Comparação funcional a nível vias metabólicas entre água de produção e a rocha
carbonática. Apenas diferenças significativas são mostradas nesse gráfico.

Na comparação metabólica entre a rocha 966 à 972 m com a água de

produção (Figura 31) é possível observar que as vias de degradação de compostos
aromáticos e cíclicos, como tolueno, clorociclohexano e benzeno são
predominantes na comunidade proveniente da água de produção. Além de vias de
síntese de antibióticos como streptomicina e vancomicina que são mais
abundantes nessa comunidade. Diferentemente, a comunidade rocha 966 à 972 m
apresenta maior quantidade de genes relacionados com a via de degradação de
hidrocarbonetos lineares como n-alcanos bem como de biossíntese de surfactantes
tais como pultisolvins. De modo diferente, o metagenoma da rocha filito de 1053 à
1056 m (Figura 32) mostrou prevalência de vias relacionadas degradação de
xileno e compostos aromáticos, por outro lado, houve maior abundância de
biossíntese de surfactantes na comunidade de água de produção.

64
Figura 32 Comparação funcional a nível vias metabólicas entre água de produção e a rocha filito.
Apenas as diferenças significativas são apresentadas.

Semelhantemente ao consórcio dessa faixa (consórcio R2), assim como na

água de produção, houve predominância significativa de genes relacionados ao
metabolismo de enxofre.

A figura 33 apresenta as diferenças metabólicas significativas entre os

consórcios de rocha R1 e R2. Os resultados mostram que os genes envolvidos
com metabolismo de enxofre são predominantes no consórcio R2. Enquanto que
vias de biossíntese de biossurfactantes Plipastatin e Lichenysin são predominantes
no consórcio R1.

Figura 33 Comparação funcional entre os consórcios R1 e R2, a penas as diferenças significativas

são apresentadas.

Para caracterizar tais genes envolvidos na síntese de biossurfactantes para

o gênero mais representativo nos consórcios, Ochrobactrum, foram baixados os
genomas e plasmídeos de referência depositados no NCBI desse gênero (Tabela 6
anexo III) e realizado Blast contra o banco de dados específico BIOSURFDB para
anotar tais genes por homologia. Na figura 34 são apresentadas quais vias de
biossurfactantes foram anotadas nos genomas de referências de Ochrobactrum.

65
Figura 34 Resultados da anotação contra o BIOSSURFDB dos operons nos genomas de referência
de Ochrobactrum depositados no NCBI.

A maioria dos hits está envolvida com as vias de biossíntese dos

biossurfactantes pultisolvins e iturin A. Outros hits estão anotados como
pertencentes as vias de síntese de antibióticos e o metabolismo genérico de
surfactantes via não ribossomal (Figura 34). No entanto, para refinar tais
anotações nas sequência dos consórcios R1 e R2, as sequências identificadas
como pertencentes ao gênero Ochrobactrum foram extraídas dos metagenomas
por meio de um script in the house, e também alinhadas contra o banco de
biossurfactantes (Figura 35).
66
Figura 35 Vias de biossurfactantes de Ochrobactrum anotadas nos consórcios.

Os resultados dos alinhamentos, com as sequencias dos consórcios de

rocha, confirmam as vias de síntese de biossurfactantes para o gênero
Ochrobactrum (Figura 34). Enquanto que no consórcio R1 há mais genes
envolvidos com a biossíntese lichenyin, no consórcio R2 há mais sequencias
envolvidas com síntese de pultisolvins. No entanto, ainda é necessário refinar
essas análises, as sequencias referidas ao gênero Ochrobactrum serão montadas
com base no mapeamento do genoma de referência de Ochrobactrum para que
dessa forma seja possível anotar com maior segurança esses genes nos
metagenomas dos consórcios bem como realizar análises futuras de expressão e
clonagem gênica.

5 DISCUSSÃO

No presente trabalho foram utilizadas diferentes estratégias para enriquecer,

cultivar e identificar comunidades bacterianas residentes no reservatório de
petróleo. Por meio de uma abordagem metagenômica e por bioinformática foi
possível analisar e comparar taxonômica e metabolicamente tais metagenomas e
inferir possíveis aplicações biotecnológicas.

Foram testados diferentes meios de cultivo no preparo de consórcios

bacterianos, visto que diferentes fatores como temperatura, pressão e oferta de
67
recursos nutricionais podem influenciar na abundância de espécies de uma
comunidade bacteriana (LEAHY; COLWELL, 1990). Diferentemente de outros
trabalhos, como o de PATOWARY et al., (2016) que enriqueceram e selecionaram
consórcios bacterianos potencialmente degradadores provenientes de reservatório
de petróleo utilizando meio mineral enriquecido com 0,1 % de extrato de levedura,
o presente trabalho utilizou para seleção de microrganismos biodegradadores e
produtoras de biossurfactantes apenas o meio mineral BH, sem adição de extrato
de levedura, tendo apenas 1% de petróleo como fonte de carbono. Dessa forma, a
metodologia de seleção utilizada no preparo dos consórcios permitiu o
enriquecimento de microrganismos potencialmente degradadores de petróleo e
produtores de biossurfactantes provenientes de reservatório de petróleo, conforme
demonstrado por diferentes ensaios de atividade e predito por análises de
sequências, utilizando ferramentas de bioinformática.

Durante a curva de crescimento bacteriano os consórcios apresentaram

diferentes dinâmicas de crescimento. Os consórcios R2 e A1 crescem mais
lentamente, atingindo a fase estacionária mais tardiamente, porque possivelmente
nesses consórcios há maior competição por recursos entre as espécies desta
comunidade o que afeta a taxa de crescimento dos organismos (MADIGAN;
MARTINO; PARRKER, 2010). Além disso, o consórcio A1, diferentemente do
consórcio A2, consome mais eficientemente os substratos do tipo HPAs, os quais
são mais difíceis de serem degradados, ditos recalcitrantes, bem como mais
tóxicos (Figura 14). Tais compostos aromáticos (HPAs) são mais estáveis devido
as suas ligações em ressonância dos anéis aromáticos, sendo necessário um
maior investimento energético para degradá-los, conseguintemente, a eficiência
energética do consumo de HPAs é menor do que outras fontes de hidrocarbonetos,
afetando dessa forma a taxa de crescimento bacteriano (MISHRA; LAL;
SRINIVASAN, 2001). Diferente disso, os organismos da cultura A2 atingem a fase
estacionária mais rapidamente, em até 24 horas, muito provavelmente, devido a
comunidade bacteriana conseguir utilizar outras fontes de hidrocarbonetos, além de
HPAs.

68
 Os consórcios R1 e R2 também apresentam comportamentos diferentes. A
cultura R1 cresce mais rapidamente do que a cultura R2, isso pode ser reflexo do
metabolismo mais flexível do consórcio R1. A análise in silico dos sequenciamentos
mostrou que as vias energéticas do consórcio R1 são tanto de degradação de
alcanos lineares quanto de HPAs (Figura 29). Alcanos lineares são menos tóxicos
e mais fáceis de serem degradados do que HPAs (CHIKERE et al., 2011; MISHRA;
LAL; SRINIVASAN, 2001). Além dessas vias, o consórcio R1 possui mais vias de
biossíntese de biossurfactantes Plipastatin e Lichenysin, predominantemente (
Figura 33). Desse modo o consórcio R1 seria capaz de degradar substratos menos
tóxicos, com alcanos lineares e solubilizar mais substratos diferentes que o
consórcio R2, fazendo com que o consórcio R1 cresça mais rápido do que o
consórcio R2 (MISHRA; LAL; SRINIVASAN, 2001; ROJO, 2009). Além disso, as
avaliações por cromatografia indicaram que o consórcio R1 consome mais
hidrocarbonetos policíclico aromáticos do que consórcio R2 (Figura 18). Outros
trabalhos mostraram que culturas bacterianas crescem mais lentamente quando
degradam HPAs, devido tais substratos serem mais tóxicos e menos solúveis
(MISHRA; LAL; SRINIVASAN, 2001; MROZIK; MIGA; PIOTROWSKA-SEGET,
2011).

Como é sabido, ao atingir a fase estacionária os organismos predominantes

nesta fase são aqueles que obtiveram sucesso, logo são os melhores em captar
recursos disponíveis (BAČUN-DRUŽINA et al., 2011). A fase estacionária de cultivo
laboratorial é que melhor representa os organismos em ambientes naturais nos
quais a competição por nutrientes induz as células a expressarem vias energéticas
auxiliares. Diferentes moléculas atuantes na resposta ao estresse, tais como
antibióticos estreptomicina (Figura 30) e os biossurfactantes Plipastatin e
Lichenysin (Figura 33) são sintetizados pelos os microrganismos a fim de inibir
competidores na comunidade bem como captar recursos energéticos com mais
eficiência (BAČUN-DRUŽINA et al., 2011; FINKEL, 2006; KOLTER, 1993). Dessa
forma, a extração de DNA genômico dos consórcios após fase de seleção
bacteriana em meio BH e no início da fase estacionária, teve objetivo de analisar

69
quais microrganismos são capazes de degradar o petróleo bem como produzir
moléculas surfactantes.

Bactérias sintetizam biossurfactantes na presença de substratos hidrofóbicos

para solubilizá-los e aumentar a biodisponibilidade desse substrato para a célula.
Moléculas surfactantes são expressas, assim como alguns tipos de antibióticos,
durante o crescimento bacteriano a fim de inibir os demais organismos
competidores presentes na comunidade. Além disso, surfactantes estão envolvidos
no controle populacional da comunidade bacteriana e na regulação do biofilme.
(DAS; MUKHERJEE; SEN, 2009; KUIPER et al., 2004; SINGH; CAMEOTRA,
2004). Para identificar a presença de tais moléculas nas culturas bacterianas foram
utilizadas diferentes metodologias. O ensaio de dispersão do óleo foi escolhido
como triagem primária para identificar a produção de moléculas surfactantes por
ser um ensaio clássico, bem descrito na literatura, rápido e eficaz para esse fim
(SATPUTE et al., 2010b). O resultado mostrou que o consórcio R2 se destaca na
síntese de moléculas surfactantes, capazes de reorganizar a fase hidrofóbica e
hidrofílica, quando em comparação com o consórcio R1, provavelmente porque a
concentração das moléculas dos tensoativos no consórcio R2 é maior do que no
R1, sendo essa suposição baseada na comparação do diâmetro do halo formado
no ensaio de dispersão. Visto que essa área de dispersão produzida após a adição
do surfactante é diretamente proporcional a concentração de biossurfactantes na
cultura bacteriana (MORIKAWA; HIRATA, 2000). Além disso, tem sido descrito [R2] Comentário: FALTOU DISCUTIR
SEU RESULTADO AQUI... FALAR SOBRE SEU
que lipopeptídeos, como plipastatin e pultisonina, isolados em Pseudomonas HALO ABERTO NO ENSAIO

mostraram que a área de dispersão do óleo é inversamente proporcional ao

tamanho da cadeia lipídica do biossurfactante (THANIYAVARN et al., 2006). Tal [R3] Comentário: FALTOU DISCUTIR
SEU RESULTADO AQUI...RELAÇÃO COM
propriedade de dispersão do óleo pelas moléculas surfactantes decorre da ALTO E BAIXO PESO MOLECULAR E
DIMINUIÇÃO DA TENSÃO E SEUS
capacidade do surfactante em diminuir as forças atrativas entre as moléculas RESULTADOS!!!

semelhantes do óleo, dessa forma permitindo a desagregação das fases insolúveis

(SATPUTE et al., 2010b). [WA4] Comentário: Discutir outros
trabalhos de pultisolvina, lyquenisina e
plistatina
A fim de analisar se tais moléculas surfactantes são capazes de formar uma
emulsão estável, foi calculado o índice de emulsificação das culturas ao longo de

70
dias de cultivo. Foi verificado que os índices de emulsificação da cultura R2 são
maiores, bem como a emulsão formada por essa cultura é mais estável do que a
formada pela cultura R1. A emulsão é uma dispersão coloidal de um líquido em
outro (óleo / água) que é frequentemente estabilizada por um biossurfactante ou
por um bioemulsificador de alto peso molecular (SATPUTE et al., 2010b). A
emulsão formada pela cultura R2 é mais estável, possivelmente devido a
população de moléculas surfactantes presentes na cultura R2 possuírem alto peso
molecular, uma vez que biossurfactantes de alto peso molecular tendem a
estabilizar um emulsão mais facilmente do que surfactantes de baixo peso
(RAMESH et al., 2010). Além disso, os resultados anteriores mostram que
provavelmente as moléculas surfactantes presentes na cultura R2 estão em maior
concentração tanto por apresentar uma dispersão de óleo maior quanto por mostrar
índice de emulsificação crescente ao longo do cultivo. A maioria das bactérias
degradadoras de petróleo produzem surfactantes que tornam as células mais
hidrofóbicas, facilitando a associação das células bacterianas na superfície das
gotículas de óleo. Tal contato pode facilitar a assimilação de petróleo pelos
microrganismos. Esta observação, portanto sugere que surfactantes /
emulsionantes contribuem para a biodegradação de hidrocarbonetos (HARAYAMA
et al., 1999).

No entanto, nem toda molécula surfactante capaz de estabilizar uma

emulsão é capaz de reduzir tanto a tensão superficial quando interfacial entre duas
fases imiscíveis. Foi verificado por meio das análises de tensão interfacial que as
moléculas produzidas pelas duas culturas são capazes de reduzir
significativamente a tensão interfacial comparadas ao controle negativo. Portanto,
os tensoativos presentes nas culturas tratam-se de biossurfactantes, visto que são
capazes tanto de produzir emulsão quanto reduzir a tensão interfacial (SATPUTE
et al., 2010b). Essas propriedades demonstram possivelmente que há
biossurfactantes de baixo peso molecular em ambas culturas em estudo, visto que
os surfactantes de baixo peso possuem a capacidade de reduzir a tensão
interfacial mais do que surfactantes de alto peso (SATPUTE et al., 2010b). Outros

71
estudos utilizando biossurfactantes puros e isolados das cepas de Ochrobactrum
sp. e Brevibacterium mostraram resultados de redução da tensão interfacial da
-1
água pura de até 32 mN m (FERHAT et al., 2011). Diferentemente disso, os
biossurfactantes dos consórcios, mesmo não estando purificados, mostram
-1
redução mais significativa de até 23 mN.m . Dessa maneira, os surfactantes
presentes no consórcio R1, como plipastatin e lichenesin (Figura 29), são em sua
maioria de peso molecular menor do que o consórcio R2, pois tanto o consórcio R1
apresentou redução interfacial mais significante, quanto também apresentou
formação de emulsão menor. Por outro lado, o consórcio R2 apresentar
possivelmente uma população surfactantes de peso molecular maior, tais como
pultisolvins (Figura 30), pois formam uma emulsão mais estável, mas diminuem a
tensão interfacial menos do que o consórcio R1 (SATPUTE et al., 2010b).
Bioemulsificadores formam emulsões estáveis, devido ao seu peso molecular
elevado, no entanto não reduzem a tensão interfacial de maneira significativa. Essa
redução decorre da propriedade dos surfactantes em desagregar a rede de forças
coesivas existentes no interior dos líquidos, dessa forma permitindo que se
dissolvam (SOBERO´N-CHA´VEZ et al.,2011).

Similarmente aos consórcios de rocha, o consórcio isolado de água de

produção A1 e A2 apresentaram redução significativa da tensão interfacial. No
consórcio A1, os resultados funcionais por homologia a banco de dados identificam
que há dois tipos de surfactantes: lichenesin e iturina A (Figura28). Iturina A
consiste em uma família de biossurfactantes lipopeptídicos sintetizados por várias
cepas do gênero Bacillus. Estes compostos anfifílicos são caracterizados por um
anel peptídico de sete resíduos de aminoácidos incluindo um D-Tyr invariável, com
uma sequência quiral constante LDDLLDL fechada por uma cadeia alifática de 14 a
17 carbonos e um β- aminoácido (MAGET-DANA; PEYPOUX, 1994).

Estudos tem demonstrado o efeito antifúngico do lipopeptídeo Iturina A

produzido por Bacillus contra cepas do fungo pertencente ao gênero Fusarium,
uma importante praga que afeta plantações de trigo e milho (GONG et al., 2015;
WINDELS, 2000) Interessantemente, o consórcio A1 possui abundantemente

72
bactérias pertencentes ao gênero Bacillus, (tabela 7) nos quais também foram
identificados neste trabalho via de síntese de iturina A predominantemente no
consórcio A1 (Figura 28). Embora iturina A seja descrita com atividade antifúngica,
no consórcio A1 foram identificados sequências pertencentes ao gênero do fungo
biodegradador de petróleo Mucor (SUNDAY; SAMUEL, 2011). Possivelmente tal
fungo pode ser resistente a tal biossurfactante, mas são necessários testes futuros
para avaliar tal hipótese.

Biossurfactantes são de interesse biotecnológico, tanto por serem menos

tóxicos do que surfactantes sintéticos quanto devido a sua maior
biodegradabilidade (BANAT, 1997; JUWARKAR et al., 2008). As propriedades de
formação de emulsão e de redução da tensão interfacial possuem o potencial para
aplicações biotecnológicas como recuperação de óleo em reservatório (BANAT,
1997). Os surfactantes capazes de reduzir a tensão entre as fases hidrofílica e
hidrofóbica, formando dessa maneira uma emulsão que permite a maior fluidez do
óleo e, por conseguinte maior degradação dos hidrocarbonetos (HARAYAMA et al.,
1999; POWELL et al., 2006).

Vários trabalhos mostram o efeito sinérgico da síntese de moléculas

surfactantes com a degradação do óleo. Biossurfactantes aumentam a
biodisponibilidade do óleo para a célula bacteriana, favorecendo dessa maneira a
degradação dos hidrocarbonetos (DEZIEL et al., 1996; FALATKO; NOVAK, 1992).
Neste trabalho foi utilizado como teste preliminar de indicação de degradação de
hidrocarbonetos o indicador redox (Figura 13) por esse se tratar de um teste
clássico e rápido (BRADDOCK; CATTERRAL, 1999). Esse teste mostra que ambas
as culturas são capazes de degradar hidrocarbonetos do petróleo como fontes de
carbono. No entanto, tal teste é inespecífico, visto que as culturas utilizadas neste
trabalho não são puras, sendo possível a ocorrência de vários tipos de organismos
tanto heterotróficos capazes de utilizar o carbono proveniente do petróleo como
também de organismo quimioautotróficos capazes de fixar CO2. Desse modo, se
observa na curva de crescimento do consórcio R1 que tanto o controle sem
carbono C-R1 cresceu quanto o controle (C- Pet ) sem carbono do indicador redox

73
apresenta mudança de cor, sugerindo a presença de organismo(s)
quimioautotrófico(s) na comunidade do consórcio R1, como os organismos
pertencentes o gênero Nitrobacter descritos como quimioautotróficos presentes
neste consórcio (POUGHON; DUSSAP; GROS, 2001). De modo semelhante, os
controles dos consórcios de água de produção sem carbono C-A1 e C-A2 também
crescem. Quanto ao consórcio R2, o seu controle sem carbono o (C-R2), durante a
curva de crescimento, não apresenta crescimento assim como o seu controle sem
carbono do indicador redox (C-Pet) não apresenta mudança de coloração (Figura
13 B), sugerindo a presença e/ou predominância de microrganismos degradadores
de hidrocarbonetos do petróleo. Os testes cromatográficos reforçam os dados
funcionais e de bioinformática. A cromatografia mostra que houve uma redução
total de HPAs em ambos os consórcios, porém no consórcio R2 há uma redução
maior dos HPAs totais.

Outros trabalhos mostram o enfeito benéfico do mutualismo entre fungos e

bactérias em consórcios biodegradadores (GRUBE; BERG, 2009). Similarmente ao
consórcio de água de produção A1, outros estudos que avaliaram consórcios
simbiônticos entre bactérias e fungos biodegradadores de hidrocarbonetos
enriquecidos com Bacillus sp. APHP6, Pseudomonas sp. APHP9, Pseudomonas
sp. APBP1 e Micrococcus, mostram também a ocorrência de degradação de
hidrocarbonetos de até 50 % (PRAKASH et al., 2014). Além disso, parece que o
cultivo utilizando somente meio mineral e incubado a 30 º C, como utilizado no
consórcio A1, favorece o enriquecimento das bactérias dos gêneros Bacillus,
Brevibacillus e o fungo do gênero Mucor, como também foi notado no trabalho de
PRAKASH et al., (2014) que cultivou Bacillus e Micrococcus nas mesmas
condições.

Essa degradação de hidrocarbonetos pela célula bacteriana decorre por

meio oxigenases que adicionam radicais hidroxilas a moléculas e, posteriormente,
as convertem em moléculas de ácidos graxos que são, então, degradadas via β-
oxidação (ROJO, 2009). A análise da degradação de hidrocarbonetos totais é
relevante em processos da indústria petroquímica, como a recuperação avançada

74
de óleo, uma vez que por meio da degradação de hidrocarbonetos de cadeias mais
longas ou com número maior de anéis aromáticos, o petróleo torna-se mais fluido e
mais facilmente extraído do reservatório (BROWN, 2010; LEAHY; COLWELL,
1990).

Por meio das análises de bioinformática foi possível identificar quais

organismos estavam realizando essa degradação e produção de moléculas
surfactantes presentes nas amostras. A curva de rarefação mostra que tanto os
consórcios quanto as amostras de rocha apresentam riqueza de espécies
parecidas. Diferentemente da amostra de água de produção que mostrou um
número de espécies maior, sendo necessário um volume de sequenciamento maior
para atingir a riqueza de espécies dessa comunidade. Essas diferenças se devem
à diversidade entre as amostras, visto que as características ambientais das duas
amostras determinam o perfil taxonômico da comunidade bacteriana residente
(JEFFRIES et al., 2011).

Nota-se que foram enriquecidos mais gêneros comuns aos dois consórcios
de rocha (Figura 19A), do que comuns entre os consórcios e suas respectivas
rochas (Figura 18 A e B). Provavelmente isso foi devido às condições físicas de
temperatura bem como o meio de cultura e de seleção igual para as duas amostras
(JEFFRIES et al., 2011). Muito embora houvessem alguns gêneros e bactérias
exclusivas para cada consórcio, possivelmente devido a diferenças entre tipos de
rochas das quais cada consórcio foi preparado (LEAHY; COLWELL, 1990). Além
do mais, esses organismos exclusivos identificados nos consórcios podem ser
indígenos ao reservatório, porém por serem organismos mesófilicos e aeróbicos
em condições extremas, como em alta pressão e temperatura do reservatório, tais
organismo são muito pouco abundantes ou estão na forma de esporos ou cistos ao
ponto de não serem detectados (MAGOT; OLLIVIER; PATEL, 2000). Outra
hipótese decorre que tais gêneros podem ser exógenos ao reservatório, mas foram
introduzidos nesta comunidade por meio dos processos de extração do óleo ou
injeção de água, polímeros ou outros métodos de recuperação avançada (MAGOT;
OLLIVIER; PATEL, 2000; SPARK et al., 2000). Semelhantemente a outro trabalho,

75
no qual comparando microcosmos bacterianos isolados de sedimentos e tratados
com óleo, verificou que houve significativa diferença entre as comunidades
bacterinas do sedimento tratado com óleo, comparativamente a comunidade do
sedimento não tratado. Ao ponto de gêneros, como Shewanella, Halomonas,
Oleibacter e Pseudomonas embora permaneçam indetectáveis nos sedimentos não
tratados, foram significativamente favorecidas após o tratamento com óleo (KOO
et al., 2014).

Além disso, a comunidade da rocha filito é mais próxima taxonomicamente

da comunidade da água de produção do que da rocha carbonática, isso pode ser
devido a profundidades semelhantes. Ademais, as rochas apresentam mais
gêneros comuns entre si do que entre a água de produção, visto que as
comunidades das rochas estão submetidas a condições ambientais semelhantes
(JEFFRIES et al., 2011). [WA5] Comentário: Rever esse
paraágrafo informações controversas

O consórcio R1 selecionou as bactérias que pertencem ao género

Sphingobacterium que são representadas por microrganismos gram-negativos, não
fermentadores de lactose e positivos para os testes de catalase e oxidase. Outra
característica importante das bactérias que pertencem a este gênero é a presença
de concentrações elevadas de esfingofosfolípideos na sua membrana celular
(YABUUCHI; KANEKO, 1983). São descritos como capazes de biorremediação
ambientes contaminados por óleo por meio da produção de biossurfactantes
(BARAHONA; SLIM, 2015; NOPARAT; MANEERAT; SAIMMAI, 2014)

Ainda estão presentes tanto no consórcio de rocha R1 quanto no de água

de produção A1 bactérias pertencentes ao gênero Bacillus, tratando-se de um
gênero muito bem descrito quanto a sua capacidade de degradar hidrocarbonetos
(KUMAR et al., 2007). Além sintetizar moléculas biossurfactantes com interesse
biotecnológico com aplicação em estratégias de biorremediação (TAO et al.,
2016).

Outro gênero de importante aplicação biotecnologia trata-se de

Lysinibacillus, presente no consórcio R1. Esses organismos são comumente

76
encontrados em solo, são gram-positivos, tem forma de bastonetes, são
formadores de endósporos e capazes de crescer tanto em condições aeróbicas
quanto anaeróbicas (PRAVEEN; BISHT; PANIGRAHY, 2012). Esse gênero
apresenta habilidade de produção de moléculas antibióticas e de toxinas com
aplicação inseticida contra vetores de doenças como malária, febre amarela e o
vírus do Nilo Ocidental (ABIDEEN; BABUSELVAM, 2014). Outra aplicação
biotecnológica descrita refere-se ao uso de cepas de Lysinibacillus em
biorremediação, sendo capazes de biodegradar petróleo e produzir
biossurfactantes lipopeptídicos, sendo este também abundante neste consórcio R1
(Figuras 26 e 33) e ainda há trabalhos que demonstram sua aplicação durante a
biorremediação de metais tóxicos (HERNÁNDEZ; DUSSÁN, 2013).

O gênero Microbacterium foi um dos gêneros mais representativos no

consórcio R2. Tal gênero compreende mais de 30 espécies versáteis isoladas em
vários ambientes. Esse gênero consistem em bactérias aeróbicas, gram-positivas,
catalase-positivo, oxidase negativa e não produtoras de H2S. Já foram descritos
crescimento na faixa de temperatura de 30 e 42 ºC e em até 2 e 4%NaCl
(BEHRENDT; ULRICH; SCHUMANN, 2001). Trabalhos como SCHIPPERS et al.,
(2005), , descreveram cepas de Microbacterium capazes de degrada petróleo a 30
ºC, diferentemente desse trabalho, o gênero Microbacterium foi cultivada a 37º
com potencial degradadora de petróleo.

Outro gênero abundante no consórcio R2 foi Devosia, representado por

bactérias gram negativas, em forma de bastonetes e não formadoras de esporos,
geralmente presentes no solo (KUMAR; VERMA; LAL, 2008). Foi caracterizada por
apresentar, na composição de sua membrana, o ácido graxo de cadeia longa 3’
hidroxil (KUMAR; VERMA; LAL, 2008; NAKAGAWA; YOKOTAT, 1996). Tal gênero
ainda é descrito como capaz de utilizar hexaclorociclohexano como fonte de
carbono (KUMAR; VERMA; LAL, 2008). E representa uma grande oportunidade
biotecnológica por apresentar espécies recentemente descobertas como capazes
de fixar nitrogênio, mesmo não pertencendo ao gênero Rhizobium,
tradicionalmente conhecido por essa propriedade (RIVAS et al., 2002).

77
 O gênero Paenibacillus é comum tanto ao consórcio de rocha R2 quanto ao
consórcio de água de produção A1, tais microrganismos são anaeróbias
facultativas e formadoras de endósporos. Tal gênero é isolado em vários
ambientes, inclusive contaminados por petróleo, mas são majoritariamente
encontradas no solo (GRADY et al., 2016). Paenibacillus são de grande interesse,
pois são capazes de fixar nitrogênio de modo diazotrófico ou por uma via
alternativa dita como não diazotrófica (XIE et al., 2014). Além disso, possuem
grande interesse para saúde, pois são descritas cepas patogênicas bem como
produtoras de antibióticos e moléculas inseticidas capazes de combater vetores de
doenças (GRADY et al., 2016). São ainda capazes de produzir moléculas
anfipáticas não ribossomais do tipo lipopeptídicas, classificadas como lineares
catiônicas, cíclicas catiônicas ou cíclicas não catiônicas, que apresentam atividades
surfactante, antibacteriana, antifúngica, anticâncerígena e antiviral (COCHRANE;
VEDERAS, 2014). Tais vias de síntese de lipopeptídeos, como pultisolvins são
enriquecidas no consórcio R2 (Figura 30) no qual o gênero Paenibacillus é
abundante (Figuras 21).

Por outro lado, o gênero Ochrobactrum é abundante em ambos os

consórcios de rocha. Essas bactérias são bacilos gram negativos, não
fermentadores e oxidativo-positivo bem como capazes de produzir H2S. Tais
organismos são de ótima aplicação biotecnológica, uma vez que apresentam baixa
virulência, sendo capazes apenas de produzir infecções em pacientes
imunossuprimidos (YU et al., 1998). Trabalhos mostram a capacidade de bactérias
pertencentes ao gênero Ochrobactrum como capazes de degradar hidrocarbonetos
bem como produzir moléculas surfactantes. Conforme reportado por (WU et al.,
2009) cepas de Ochrobactrum são capazes de consumir hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos, porém de modo inespecífico. Outros trabalhos ainda
demonstram o potencial de biorremediação de cepas capazes de degradar cloreto
de vinilo, eteno, fenol bem como petróleo (CITY; SCIENTIFIC, 2016; DANKO et al.,
2006; EL-SAYED et al., 2003). Trabalhos ainda apontam a necessidade de mais
dados a respeito do metabolismo de hidrocarbonetos nesse gênero (WU et al.,

78
2009), a fim de investigar quais vias, genes ou substratos preferencialmente tal
gênero é capaz de degradar. Uma vez que esse gênero apresenta uma
organização genômica incomum a todas outras bactérias, Ochrobactrum são
pertencentes a um subgrupo de alfa-Proteobactérias que apresentam dois ou até
três cromossomas, o que torna a montagem bem como anotação do genoma
dessas bactérias mais difícil (JUMAS-BILAK et al., 1998).

Quanto a síntese de biossurfactantes para o gênero Ochrobactrum a

literatura é controversa e ainda limitada. Trabalhos demostraram a capacidade de
cepas pertencentes ao gênero Ochrobactrum como capazes de sintetizar
biossurfactantes de características glicolipídicas (FERHAT et al., 2011; NOPARAT;
MANEERAT; SAIMMAI, 2014). Porém outros trabalhos o identificaram como
características lipopeptídicas e ainda como glicolipopeptídica (BEZZA; BEUKES;
CHIRWA, 2015). No entanto, nenhum desses trabalhos demonstraram quais genes
e operons estão envolvidos na síntese de biossurfactantes neste gênero.

As análises por homologia contra o banco especifico BIOSURDB (Figura 34

e 35) confirmam que Ochrobactrum possui hits relacionados com a biossíntese de
biossurfactantes pultisolvin bem como iturina A. Como Ochrobactrum não é o único
gênero presente nos consórcios, as sequências identificadas como pertencentes a
esse gênero nos consórcios, foram extraídas e alinhadas contra o banco de dados
específico BIOSURFDB. Desse modo, quando analisamos todas as espécies do
consórcio R1, as vias de síntese de surfactantes Plipastatin e Licheysin são
estatisticamente mais abundantes, figura 33. Porém quanto analisamos apenas as
vias pertencentes a Ochrobactrum no consórcio R1 apenas a via de síntese de
Putisolvins é significativa assim como nos genomas de referência de
Ochrobactrum, figuras 34 e 35. No consórcio R2, por outro lado, quando
analisamos apenas as sequências de biossurfactantes de Ochrobactrum a via de
Licheysin é predominante, figura 35. Essas diferenças possivelmente se devam as
diferentes comunidades bacterianas dos consórcios R1 e R2 nas quais há
diferentes relações bem como ofertas de recurso nutricionais que influenciam na

79
abundância de espécies produtoras de biossurfactantes em cada consórcio
(BANAT, 1997; DAS; MUKHERJEE; SEN, 2008)

Os gêneros predominantes neste trabalho nas mostras de rocha e água de

produção são Halomonas e Marinobacterium que são muito bem descritas a
respeito da capacidade degradar hidrocarbonetos (FATHEPURE, 2014).
Comparativamente a outros trabalhos também realizados na bacia potiguar, não
foram identificados até o momento os gêneros Halomonas e Marinobacteriumium
em amostras de rocha e água de produção de reservatório de petróleo (SILVA et
al., 2013). Conforme se observa nas figuras 26 e 27, Halomonas são
representadas por bactérias aeróbias gram-negativas halotolerantes, tipicamente
encontradas em solos salinos bem como contaminados por óleo (LLAMAS et al.,
2006). São de grande interesse biotecnológico devido a capacidade de degradar
HPAs (ALVA; PEYTON, 2003) bem como produzir diferentes exopolissacaridades
de interesse comercial (FATHEPURE, 2014). Outros trabalhos mostraram
Halomonas empregadas em estratégias de biorremediação (SADEGHI HADDAD
ZAVAREH et al., 2016) tanto por degradarem hidrocarbonetos quanto por
produzirem surfactantes (MNIF et al., 2011).

A amostra de água de produção, por outro lado, apresenta significativamente

o gênero Marinobacterium. Este gênero acomoda bactérias gram negativas,
aeróbias, não fermentadoras e acima de tudo carbonoclásticas, isto é, utilizam
hidrocarbonetos como fonte de energia preferencialmente (GAUTHIER et ai.,
1992). Foram coletadas em vários locais do mundo, mas são exclusivamente
espécies marinhas ou halofílicos com características físico-químicas diversas,
incluindo água do mar e sedimentos. Possuem o genoma altamente diverso para a
utilização de várias frações do petróleo, a capacidade de formar biofilme, bem
como produzir moléculas emulsificadoras que aumentam a biodisponibilidade dos
hidrocarbonetos para as células (TIMMIS et al., 2010). [WA6] Comentário: Cap de livro

A metodologia utilizada no preparo de consórcios mostrou-se eficaz para

selecionar e enriquecer espécies capazes de degradar hidrocarbonetos e produzir
moléculas surfactantes de grande interesse biotecnológico. Adicionalmente, as
80
análises funcionais utilizando o alinhamento contra o banco de dados customizado
BIOSURFDB confirmam essa hipótese, mostrando qual o perfil metabólico de cada
amostra e confirmam a seleção de microrganismos degradadores de petróleo e
produtores de surfactantes nos consórcios.

Neste trabalho foi demonstrado que ambos os consórcios são produtores de

moléculas surfactantes capazes de estabilizar uma emulsão e reduzir a tensão
interfacial entre óleo e água. Os resultados das análises de bioinformática
identificaram que tais moléculas estão relacionadas com as vias de biossíntese dos
surfactantes Licheysin e Plipastatin no consórcio R1 (Figura 29), enquanto
Putisolvins no consórcio R2 predominantemente (Figura 30).

Licheysin consiste em um Operon (Operon Lic) envolvido na síntese não

ribossomal do biossurfactantes de característica lipopeptídica, primeiramente
identificado em Bacillus licheniformis (HOROWITZ; GILBERT; GRIFFIN, 1990). O
Operon Lic possui 26,6 kb e é formado por quatro genes LicA, LicB e LicC que
codificam um sistema multienzimático peptídico sintetase, além do gene LicTE que
codifica uma Tioesterase (KONZ et al., 1999). Licheysin é constituída por uma
sequência de aminoácidos característica L-Glx–L-Leu–D-Leu–L-Val–L-Asx–D-Leu–
LIle/Leu/Val no qual o primeiro aminoácido é ligado a uma cadeia de ácido graxo β-
hidroxil e a carboxila terminal forma um anel de lactona (JENNY et al., 1991).
Diferentemente de outros lipopetideos, Licheysin é sintezado tanto em condições
aeróbias quanto anaeróbicas e mostra tanto atividade antibactericida quanto
fungicida. Licheysin reduz significativamente a tensão superficial, demonstrando
ótimo potencial biotecnológico (JAVAHERI et al., 1985; JENNY et al., 1991).

Plipastatin é outro lipopeptídeo isolado de Bacilus subtilis que possui

propriedades antibióticas e tensoativas (NISHIKIORI et al., 1986; THANIYAVARN
et al., 2003). Seu operon é policistrônico (ppsABCDE) formado por 5 genes ppsA,
ppsB, ppsC, ppsD e ppsE que juntos codificam um sistema multienzimático além
de dois genes necessários para a sua síntese sfp e degQ,(TSUGE; ANO; SHODA,
1996; TSUGE; MATSUI; ITAYA, 2007). Sfp codifica uma 4-Fosfopanteteinil

81
transferase, enquanto degQ possui o papel regulador da expressão do operon
ppsABCD (TSUGE; MATSUI; ITAYA, 2007).

Por outro lado, o consórcio R2 mostrou significativa abundância de contigs

relacionados com biossurfactante Pultiolvin, este que primeiramente isolado em
Pseudomonas putida. Essa molécula tem características lipopeptídicas e consistem
em 12 aminoácidos em círculo por meio de uma ligação éster formada entre a
cadeia lateral do primeiro aminoácido com a carboxila C-terminal do último.
Possuindo uma cadeia de ácido hexanóico em ligação amida com o N-terminal.
Pultisolvin além de produzir emulsão estável ainda parece estar relacionada como
o desenvolvimento do biofilme, podendo inibir a sua formação em Pseudomonas
(KUIPER et al., 2004).

Embora os operons de Pultiolvin, Licheysin e Plipastatin foram

primeiramente identificados em Bacillus e Pseudomonas, esses genes foram
anotados por homologia nas sequências dos consórcios. É provável que os
gêneros mais abundantes dos consórcios, como Ochrobactrum, possuam esses
genes homólogos. Alinhamentos utilizando apenas as sequências pertencentes a
tal gênero contra o banco de dados especifico de biossurfactantes confirmam tal
hipótese, figura 34. Além do mais, foram anotados genes envolvidos com a síntese
dos biossurfactantes pultisolvin e iturina A nos genomas de referência de
Ochrobactrum depositados no NCBI (Figura 34).

Embora a maioria das sequências foram identificadas em todas as amostras,

muitas dessas sequências identificadas não foram classificadas como pertencentes
aos taxa conhecidos (NANDASENA et al., 2014). Semelhantemente a outros
estudos de metagenoma de reservatório de petróleo, houve significativa
abundancia de sequencias tanto de arqueobactérias como bactérias não
classificadas bem como não identificadas, muito provavelmente devido as
limitações de bancos dados existentes para identificar tal comunidade extremófila
(KOTLAR et al., 2011; LEWIN et al., 2014)

82
 De modo semelhante, o metagenoma da rocha P2 carbonato e o consórcio
R2 a grande maioria dos contigs não são classificados ao nível de espécies, sendo
nomeados como “not assignment ” na figura 25. Isso é decorrente provavelmente
das limitações dos bancos de dados não redundantes atuais que possuem apenas
um genoma de referência depositado para cada cepa, fazendo com que
sequências diferentes dessas não sejam agrupadas como tais. Ou devido a
limitações de métodos taxonômicos que utilizam marcadores gênicos para agrupar
sequências, no entanto essa metodologia também é limitada para sequências que
foram transferidas horizontalmente, por exemplo, que podem mascarar as
identificações (LINDNER; RENARD, 2015). Além disso, apenas 1 % das espécies
bacterianas existentes nos ambientes são conhecidas e depositadas em bancos de
dados (HANDELSMAN, 2004; OBERHARDT et al., 2015) No entanto, por meio de
metodologia de sequenciamento de nova geração utilizada neste trabalho é
possível acessar tal pool gênico desconhecido e inferir função por homologia em
comparação com banco de dados específicos mesmo para organismo
desconhecidos (YANG; JIANG; ZHANG, 2014). Isso representa uma importante
fonte de novos conhecimentos e de novas enzimas e organismos.

As análises de bioinformática mostram que as vias de degradação de

hidrocarbonetos são mais abundantes nos consórcios, figuras 29 e 30. O consórcio
R1 possui um perfil de degradação de alcanos lineares maior do que o consórcio
R2 (Figuras 29 e 30). As enzimas iniciais da via de degradação de alcanos
lineares são monooxigenases e citocromo P450 responsáveis pela degradação de
hidrocarbonetos de até 30 carbonos (WANG; SHAO, 2012). A degradação de
alcanos, principalmente de alto peso molecular, é de grande interesse para
indústria petrolífera, pois por meio do consumo de alcanos de cadeia longa é
possível tornar óleo pesado mais fluido e portanto mais fácil e barato de ser
extraído do reservatório de petróleo (BROWN, 2010). Outra via de degradação
mais enriquecida no consórcio R1 foi a degradação de Naftaleno, um
policicloaromático cancerígeno e imunossupressor. Consórcios capazes de

83
degradar e mineralizar o naftaleno presente no ambiente representa enorme
atrativo biotecnológico (NZILA et al., 2016).

Por outro lado, o consórcio R2 apresentou o perfil metabólico mais envolvido

com a degradação de compostos aromáticos, figura 30. Outra via muito enriquecida
neste consórcio foi a do metabolismo de enxofre, figura 33. A literatura mostra a
correlação existente entre o metabolismo de enxofre, metano e a degradação de
hidrocarbonetos (GIEG et al., 2010). Embora esses metabolismos compartilhem
enzimas e substratos ainda não é conhecida uma via comum entre tais
metabolismos (ORPHAN et al., 2000). No consórcio R2 houve ainda bactérias dos
gêneros Paenibacillus que além de produzirem moléculas surfactantes e degradar
hidrocarbonetos são descritas também como envolvidas no metabolismo de
enxofre, sendo capazes de dessulforalizar moléculas de hidrocarbonetos (VAN
HAMME; SINGH; WARD, 2003).

Portanto, há uma complexa relação entre os organismos presentes na

comunidade dos consórcios e do reservatório de petróleo. Esse trabalho mostrou
por meio de um estudo metagenômico a abundância de organismos degradadores
de hidrocarbonetos e produtores de biossurfactantes bem como os perfis funcionais
que a comunidade bacteriana apresenta. Além disso, mostrou a predominância do
gênero Ochrobactrum pouco ainda estudada quando ao seu perfil genético de
produção de biossurfactantes e degradação de hidrocarbonetos.

6 CONCLUSÃO

O presente trabalho mostrou por meio de uma abordagem metagenômica a

abundância de organismos residentes na comunidade do reservatório de petróleo
bem como as diferentes relações existentes entre esses e suas possíveis
aplicações biotecnológicas. Os consórcios isolados a partir de amostras dos poços
em estudo mostraram ser enriquecidos tanto para a degradação quanto produção
de moléculas biossurfactantes, ambas vias de interesse biotecnológico,
confirmando a metodologia utilizada como eficiente para o objetivo proposto. Além

84
do mais, o processo de seleção dos consórcios bacterianos de rocha enriqueceram
o gênero Ochrobactrum pouco descrito quanto a sua capacidade de síntese de
biossurfactantes. Enquanto a metodologia usada na seleção do consórcio
proveniente de água de produção favoreceu a seleção de um consócio mutualista
entre procariotos e eucariotos. A análise dos resultados funcionais, corroborando
com o perfil metabólico obtido após análise in silico, confirmam o banco de dados
customizado BIOSURFDB como uma excelente ferramenta, específica para
estudos de genes sobre biossurfactantes, biodegradação e metabolismo de enxofre
de modo integrado. Adicionalmente, muitas sequências mesmo não classificados
em bancos de dados globais do NCBI foram anotados para as funções de interesse
quando comparados com bancos de dados específico. Desse modo, a
caracterização das comunidades microbianas de reservatório de petróleo mostrou
integração e a riqueza de microrganismos tanto já bem descritas como também
não classificadas ou mesmo novos como envolvidos na degradação de
hidrocarbonetos, síntese de moléculas surfactantes e no metabolismo de enxofre.

7 PERSPECTIVAS

 Particionar os resultados dos alinhamentos, de modo a analisar por

homologia quais seqüências pertencem a quais organismos.
 Anotar e identificar novos genes de interesse biotecnológico.
 Análise de expressão das diferentes vias de degradação e síntese de
biossurfactantes.
 Clonagem dos genes descobertos e de interesse biotecnológico.
 Isolar bactérias dos consórcios
 Sequenciamento de 16S de amostras P1 e consórcio R3
 Montar genomas.

85
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95
9 ANEXOS

Anexos I - Composição dos meios de cultura utilizados para isolamento

microbiano

Meio LB:

10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura e 10 g/L de NaCl

Meio YPD:

10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona ou triptona e 20 g/L de glicose

Meio Bushnell-Haas (BH):

0,2 g/L de MgSO4, 0,02 g/L de CaCl2, 1 g/L de KH2PO4, 1 g/L de K2HPO4, 1 g/L de

(NH4)2SO4 e 0,05 g/L de FeCl3

Água do Mar Artificial (AM)

23,4 g/L de NaCl, 0,75 g/L de KCl, 7,0 g/L de MgSO4, 0,3 g/L de KH2PO4 e 0,7 g/L
de K2HPO4

Meio Circlo Grow (CG)

Meio indefinido

ANEXO II - Composição das soluções utilizadas

96
Tampão de corrida

0,03 % de azul de bromofenol

0,03 % de xileno cianol

60 % de glicerol

1 % de sódio dodecil sulfato

100 mM de EDTA a pH 7,6, ajustado com Tris

TAE 50 X

Volume: 1 litro

242 g de TRIS BASE

57,1 ml Ácido Acético Glacial

100 ml de EDTA 0,5M pH 8,0

q.s.p. com ddH2O 100 ml.

Tampão de lavagem 1

50 mM Tris–HCl pH 8.3

200 mMNaCl,

5 mM Na2EDTA

0.05 % Triton X-100

Tampão de lavagem 2

50 mM Tris–HCl pH 8.3

200 mMNaCl

97
5 mM Na2EDTA

Tampão de lavagem 3

10 mM Tris–HCl pH 8.3

0.1 mM Na2EDTA

Solução de lise (Crawford et al, 1995)

125-mM Tris HCI, pH 8.0

62.5-mM EDTA, pH 8.0

2.5% SDS

TE

10-mM Tris HCI, pH 8.0

1mM EDTA, pH 8.0

Solução de lise (Sagar et al, 2014)

1.5 m NaCl

0.1 M Na2EDTA

4% SDS

ANEXO III – Dados gerais dos sequenciamentos de DNA e analises de

bioinformática.

98
Tabela suplementar 1. Dados gerais dos sequenciamento e análises de alinhamentos, montagens e
predições de ORFs.

99
Tabela 8. Genomas de referência baixados do NCBI e suas respectivas referências no NCBI

100
Anexo IV Fotografias de consórcios após 6 semanas de cultivo

Figura 1S. Consórcios obtidos a partir de amostras de água de produção preparados a 30 °C,
comparativamente ao controle (CTL), contendo meio mineral e petróleo. Melhor crescimento
observado para os consorcios A1 e A2 em meio mineral BH, comparativamente ao controle negativo
contendo apenas meio mineral e petróleo (CTL).

101
Figura 2S. Consórcios obtidos a partir de amostras de água de produção preparados a 37 °C,
comparativamente ao controle (CTL), contendo meio mineral e petróleo. Não foram observados
crescimento satistatóio para esses consorcios.

102
Figura 3S. Consórcios obtidos a partir de amostras de rocha preparados a 37 °C, comparativamente
ao controle (CTL), contendo meio mineral e petróleo. Melhor crescimento observado para os
consorcios R1, R2 e R3 em meio mineral BH, comparativamente ao controle negativo contendo
apenas meio mineral e petróleo (CTL).

103