JOÃO AGOSTINHO MACHADO NETO

INVESTIGAÇÃO FUNCIONAL DE ANKHD1 E PROTEÍNAS

RELACIONADAS EM NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS

CAMPINAS
2015

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ii
 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas

JOÃO AGOSTINHO MACHADO NETO

INVESTIGAÇÃO FUNCIONAL DE ANKHD1 E PROTEÍNAS

RELACIONADAS EM NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de Doutor em Clínica
Médica na Área de Concentração em Clínica Médica.

ORIENTADOR: Profa Dra Fabíola Traina

CO-ORIENTADOR: Profa Dra Sara Teresinha Olalla Saad

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO
JOÃO AGOSTINHO MACHADO NETO, E ORIENTADO
PELA PROF(a). DR (a). FABIOLA TRAÍNA

_________________________

CAMPINAS
2015

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vi
 Dedico este trabalho à minha noiva,
Keli, à minha mãe, Cristiane, e ao meu irmão,
João Otávio.

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 AGRADECIMENTOS

À minha noiva Keli o apoio constante, incentivo, carinho, amizade,

compreensão e amor. Obrigado por fazer parte da minha vida.
À minha mãe, Cristiane, e ao meu irmão, João Otávio, e aos meus sogros,
Felisberto e Iracy, o apoio e a linda família que compomos. Agradeço ao
compartilharem de minhas conquistas, dos momentos de incertezas e de alegria.
À minha orientadora Profa. Dra. Fabíola Traina, a sua orientação na
realização deste trabalho. Agradeço a sua compreensão, confiança, as
oportunidades oferecidas e o privilégio de trabalhar ao seu lado; um exemplo de
pessoa, médica e orientadora. A finalização deste trabalho é mais uma conquista
que compartilhamos juntos, fruto de sua orientação.
À Profa. Dra. Sara Teresinha Olalla Saad, a sua co-orientação desde o
projeto de iniciação científica, mestrado e a co-orientação neste trabalho, a
disponibilidade e apoio em seu laboratório. Agradeço as oportunidades oferecidas
e ao fazer parte da minha formação.
Às minhas amigas Mariana Lazarini e Patrícia Favaro, que tiveram grande
participação na minha formação, a constante presença e incentivo durante a
realização deste trabalho. Agradeço a seus ensinamentos e acima de tudo,
agradeço a sua amizade.
Às minhas colaboradoras e amigas, Paula de Melo Campos e Renata
Scopim Ribeiro, que me ajudaram nos experimentos, análises e me deram força
para seguir em frente. Agradeço a amizade e a oportunidade de compartilhar as
experiências acadêmicas e pessoais.
Aos alunos e à equipe de trabalho da Profa. Dra. Sara Teresinha Olalla
Saad que me auxiliaram em diferentes momentos durante a realização deste
trabalho; em especial à Tereza Sueko Ide Salles, que sempre me incentivou e me
guiou, desde a minha iniciação científica na resolução dos mistérios de cada
experimento. A todos os alunos, Matheus, João Kleber, Fernanda Roversi,
Anamika, Karin, Vanessa, Marina, Victor, Andrana, Samuel, Rita, Bruna Palodetto,
Flávia, Isabela, Renata, Jures, Marisa, Ada e Cristiane, e todos os funcionários,

ix
Adriana, Simone, Lena, Ana Leda, Janine, Fernanda Niemann, Irene, Audrey e
Karla, agradeço a oportunidade de compartilhar as experiências e o carinho.
Aos amigos da graduação, Meire, Jacqueline, Luciana e Silvana que
compartilharam os primórdios deste sonho, me incentivaram e me permitiram
crescer ao seu lado. Valeu a pena.
Ao Gilberto e ao Dr. Alexandre a disponibilidade do biotério no CIPOI e a
ajuda nos experimentos com animais.
Ao Prof. Dr. José Barreto Carvalheira, a disponibilidade de seu laboratório.
Ao aluno Guilherme agradeço a excelente recepção e auxílio com as dúvidas nos
experimentos.

.
Aos docentes da disciplina de Hematologia da UNICAMP, Prof. Dr.
Fernando F. Costa, Profa. Dra. Irene Lorand-Metze, Prof. Dr. Cármino A. de
Souza, - o apoio e estrutura na
realização deste trabalho.
Aos pacientes, um agradecimento especial, pois sem eles este trabalho não
teria sido idealizado e nem realizado.
À Dra. Nicola Conran o auxílio na correção ortográfica do inglês e a
convivência no laboratório.
À Cleide e Juliana o auxílio com as análises estatísticas.
Ao Michel o auxílio na confecção de painéis e formatação de figuras.
Às secretárias Patrícia e Raquel a disponibilidade no serviço burocrático e
amizade.
À secretária da pós-graduação Adriana pela disponibilidade no serviço
burocrático.
Agradeço a Deus a oportunidade da vida, da saúde, de uma família feliz, de
ter conhecido todas as pessoas aqui citadas, de ter seguido este caminho e, mais
uma vez, conquistar um objetivo.

x
 Este estudo foi financiado com recursos fornecidos pela FAPESP (Projetos
2009/00268-8; 2011/06840-5; 2011/51959-0; 2012/09982-8) e do Instituto
Nacional de Ciência e Tecnologia do Sangue/CNPq (610021/2009-5)

xi
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"Um Homem é constituído por aproximadamente
sete octilhões de átomos, agrupados em cerca
de dez trilhões de células. Essa aglomeração de
células e átomos tem algumas propriedades
assombrosas: é viva, experimenta alegria e
sofrimento, discrimina entre o belo e o feio,
distingue o bem do mal."
Theodosius Dobzhansky
(Genética do Processo Evolutivo)

xiii
xiv
 ABSTRACT
The identification of genes/proteins differentially expressed in hematopoietic
neoplasms and the functional investigation of these proteins in the neoplastic
phenotype are essential for the understanding of disease biology. ANKHD1 is
highly expressed in acute leukemia cells and has a potential role in regulating
many cellular processes through its ankyrin repeat domains. Our research group
has previously identified the interaction between ANKHD1 and SIVA through two-
hybrid assay. Other proteins potentially related to ANKHD1 that were of interest of
this research are Stathmin 1 that interacts with SIVA, and YAP1 that interacts with
ANKHD1 in non hematologic cells. The aim of this study was to investigate the
functional role of ANKHD1 and its related-proteins in hematologic malignancies.
We used human leukemia cell lines and primary hematopoietic cells from healthy
donors (n=52) and patients with myelodysplastic syndromes (MDS; n=65),
myeloproliferative neoplasms (MPN; n=82), acute myeloid leukemia (AML; n=60)
and acute lymphoid leukemia (ALL; n=19). Techniques for the evaluation of gene
expression (qPCR), protein expression and interaction (western blotting), functional
assays of migration (transwell assay), proliferation (in vitro MTT and clonogenicity,
in vivo tumor formation) and apoptosis (Annexin V/PI, TUNEL), and inhibition of
proteins of interest through pharmacologic agents or gene therapy tools were used.
The interaction between ANKHD1 and SIVA was confirmed by co-
immunoprecipitation assays. In leukemia cell lines U937 and Jurkat, ANKHD1
silencing reduced cell proliferation, migration and tumor growth, while SIVA
inhibition increased migration and tumor growth, and reduced sensitivity to UV-
induced apoptosis of U937 cells. Inhibition of ANKHD1 reduced Stathmin 1 activity
and the interaction between SIVA/Stathmin 1. A large proportion of leukemia cell
lines and primary samples from patients with hematologic malignancies did not
present YAP1 expression, and ANKHD1 silencing did not modulate YAP1 activity
in U937 cells. Stathmin 1 expression was significantly higher in primary
hematopoietic cells from patients with hematological malignancies (MDS RAEB-
1/RAEB-2, AML, ALL and primary myelofibrosis) compared to samples from
healthy donors. Stathmin 1 silencing reduced cell proliferation and clonogenicity of
U937 and Namalwa leukemia cells, and HEL JAK2V617F cells. Specifically in HEL
JAK2V617F cells, Stathmin 1 silencing or treatment with the microtubule-stabilizing
agent paclitaxel had a potentiating effect to treatment with the JAK1/2 inhibitor
ruxolitinib on apoptosis induction. In conclusion, we propose that ANKHD1
participates in the leukemia phenotype through its interaction with SIVA, SIVA
inhibition, and Stathmin 1 activation. Our results indicate that ANKHD1 plays a role
in leukemogenesis independently of its interaction with YAP1. In human cells with
a constitutive activation of the JAK2/STAT pathway, we identified the relevant role
of Stathmin 1 in the malignant phenotype.

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xvi
 RESUMO
A identificação de genes/proteínas diferencialmente expressos em
neoplasias hematológicas e a investigação funcional destas proteínas no fenótipo
neoplásico são essenciais para o entendimento da biologia da doença. ANKHD1 é
altamente expressa em células de leucemia aguda e tem potencial para regular
vários processos celulares através de seus domínios de repetição de anquirina.
Nosso grupo de pesquisa havia previamente identificado a interação entre
ANKHD1 e SIVA através de ensaio de duplo híbrido. Outras proteínas
potencialmente relacionadas à ANKHD1 que foram de interesse deste trabalho
foram a Stathmin 1 que interage com SIVA e a YAP1 que interage com ANKHD1
em células não hematológicas. O objetivo principal do presente trabalho foi
investigar a participação funcional de ANKHD1 e proteínas relacionadas em
neoplasias hematológicas. Utilizamos modelos de linhagens leucêmicas humanas
e células hematopoéticas primárias provenientes de indivíduos normais (n=52) e
de pacientes com diagnóstico de síndrome mielodisplásica (SMD; n=65),
neoplasia mieloproliferativa (NMP; n=82), leucemia mieloide aguda (LMA; n=60) e
leucemia linfoide aguda (LLA; n=19). Técnicas para avaliação de expressão
gênica (qPCR), expressão e interação proteica (western blotting), ensaios
funcionais de migração (ensaio transwell), proliferação (MTT e clonogenicidade in
vitro, formação de tumor in vivo) e apoptose (Anexina V/IP, TUNEL), e inibição de
proteínas de interesse através do uso de inibidores farmacológicos ou ferramentas
de terapia gênica foram utilizados. A interação entre ANKHD1 e SIVA foi
confirmada por ensaios de coimunoprecipitação. Em linhagens celulares
leucêmicas U937 e Jurkat, o silenciamento de ANKHD1 reduziu a proliferação
celular, migração e o crescimento tumoral, enquanto que a inibição de SIVA
aumentou a migração e o crescimento tumoral e reduziu a sensibilidade à
apoptose induzida por radiação UV de células U937. A inibição de ANKHD1
reduziu a atividade de Stathmin 1 e a interação entre SIVA/Stathmin 1. Grande
parte das linhagens leucêmicas e amostras primárias de pacientes com neoplasias
hematológicas não apresentou a expressão de YAP1, e o silenciamento de
ANKHD1 não modulou a atividade de YAP1 em células U937. A expressão de
Stathmin 1 foi significativamente elevada em amostras de células hematopoéticas
de pacientes com neoplasisa hematológicas (SMD AREB-1/AREB-2, LMA, LLA e
mielofibrose primária) quando comparada às amostras de doadores saudáveis. O
silenciamento de Stathmin 1 reduziu a proliferação celular e clonogenicidade em
células leucêmicas U937, Namalwa e células HEL JAK2V617F. Especificamente em
células HEL JAK2V617F, a inibição de Stathmin 1 ou o tratamento com o agente
estabilizador de microtúbulos paclitaxel teve um efeito potencializador ao
tratamento com ruxolitinib, inibidor de JAK1/2, na indução de apoptose. Em
conclusão, propomos que a ANKHD1 participa do fenótipo neoplásico de células
leucêmicas através de sua interação com SIVA, inibição de SIVA e ativação de
Stathmin 1. Os nossos resultados indicam que a função de ANKHD1 na
leucemogênese independe de sua interação com YAP1. Em células humanas com
ativação constitutiva da via JAK2/STAT, identificamos a relevância funcional da
participação de Stathmin 1 no fenótipo neoplásico.

xvii
xviii
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ANKHD1 - Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1
APC - Allophycocyanin
BAX - BCL2-associated X protein
BCL2 - B-cell lymphoma 2
BCL-XL - B-cell lymphoma-extra large
BSA - Bovine serum albumin
CALR - Calreticulin
cDNA - Complementary DNA
CMSP - Células mononucleares de sangue periférico normal
CTH - Célula tronco hematopoética
CXCL12 - Chemokine (C-X-C motif) ligand 12
DNA - Deoxyribonucleic acid
ERK - Extracellular signal-regulated kinase
ET - Trombocitemia essencial
FITC - Fluorescein isothiocyanate
GFP - Green fluorescent protein
HPRT - Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1
IP - Iodeto de propídeo
JAK2 - Janus Kinase 2
JNK - c-Jun N-terminal kinase
LLA - Leucemia linfoide aguda
LMA - Leucemia mieloide aguda
Mask - Multiple Ankyrin repeat and single KH domain
MFP - Mielofibrose primária
MO - Medula óssea
MOI - Multiplcity of infection
MTT - Methylthiazoletetrazolium
NMP - Neoplasias mieloproliferativas
NOD/SCID - Non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency
OMS - Organização Mundial de Saúde

xix
OP18 - Oncoprotein 18
PHA - fitohemaglutinina A
PV - Policitemia vera
qPCR: Reação em cadeia da polimerase quantitativa
R-IPSS - Sistema Internacional de Escore Prognóstico Revisado
RNA - Ribonucleic acid
SFB - Soro fetal bovino
SHP2 - src homology 2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase 2
shRNA - Short hairpin RNA
SMD - Síndromes mielodisplásicas
SP - Sangue periférico
STAT - Signal transducer and activator of transcription
STAT5 - Signal transducer and activator of transcription 5
STAT3 - Signal transducer and activator of transcription 3
STMN1 - Stathmin 1
TUNEL - Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling
UV - Ultra violeta
Vs. - Versus
YAP1 - Yes-associated protein 1

xx
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características dos pacientes. .............................................................. 28
Tabela 2. Características das linhagens celulares humanas. ............................... 30
Tabela 3. Sequência e concentração dos iniciadores. .......................................... 33
Tabela 4. Sequências alvo usadas para shRNA. .................................................. 38
Tabela 5. Características clínicas e laboratoriais dos pacientes com SMD
estratificados de acordo com a expressão de Stathmin 1 ..................................... 65
Tabela 6. Análises univariadas da sobrevida global e sobrevida livre de evento
para os pacientes com SMD. ................................................................................ 66

xxi
xxii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura esquemática da proteína ANKHD1. Os domínios com
repetições de anquirina (Ankyrin repeat domain, ANKRD) e o domínio homólogo à
K (K homology domain, KH) são ilustrados. A posição dos ácidos aminados (aa)
são indicadas na figura. .......................................................................................... 6

Figura 2. Interação entre ANKHD1 e SIVA identificada em sistema de duplo

híbrido. Representação esquemática das estruturas primárias das proteínas, a
região de ANKHD1 usada como isca e a região de SIVA identificada em nosso
ensaio de duplo híbrido. O alinhamento das sequências de aminoácidos obtidos
do clone do duplo híbrido foi realizado pelo software Multalin
(http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin); as regiões contendo similaridades
estão indicadas em vermelho. Abreviações: ANKRD, domínio de repetição de
anquirina; KH, domínio de homologia K; SAH, região Amphipathic helical; DDRH,
região homologa death domain; ZF, domínio zinc finger-like. ................................. 9

Figura 3. Estrutura esquemática das proteínas SIVA1 e SIVA2. A região

helicoidal anfipática (amphipathic helical region, SAH), na região N-terminal, uma
região homóloga ao domínio de morte (death domain homology region, DDHR) na
parte central, e uma estrutura semelhante ao dedo de zinco (Zinc finger-like, ZF)
na sua região C-terminal são ilustrados. A posição dos aminoácidos (aa) é
indicada na figura. ................................................................................................. 11

Figura 4. Vias de sinalização de SIVA1. (1) SIVA1 liga-se a receptores de morte

e modula a via extrínseca da apoptose. (2) SIVA1 liga-se a proteínas da família
BCL2, inibe as proteínas antiapoptóticas BCL2 e BCL-XL, induz a oligomerização
de proteínas pró-apoptóticas BAD, e modula a via intrínseca da apoptose. (3)
SIVA1 se liga à proteína XIAP, equilibra a sinalização pró-apoptótica e
antiapoptótica através da via JNK e NFkB, respectivamente, e modula a via
extrínseca da apoptose. (4) O gene SIVA1 é um alvo transcricional de p53, p73 e
E2F1. (5) SIVA1 atua como uma proteína adaptadora entre p53 e MDM2, e
promove a ubiquitinação de p53. (6) SIVA1 atua como uma ubiquitina ligase E3
para ARF (CDKN2A) e regula a proliferação celular através da via de sinalização
ARF/p53/MDM2. (7) SIVA1 promove a interação entre Stathmin 1 e CaMKII,
induzindo a fosforilação de Stathmin 1 e modulando a dinâmica dos microtúbulos.
Abreviações: P, fosforilação; Ac, acetilação; Ub, ubiquitinação. A figura foi
produzida utilizando o Servier Medical Art (http://www.servier.com/Powerpoint-
image-bank). ......................................................................................................... 13

Figura 5. Estrutura esquemática da proteína Stathmin 1. A região N-terminal

promotora de catástrofe, o domínio de ligação à tubulina na região C-terminal e os
quatro sítios de fosforilação em serina (S16, S25, S38 e S63) estão ilustrados. A
posição dos aminoácidos está indicada na figura. ................................................ 15

Figura 6. Via de sinalização de Stathmin 1. Cyclin-dependent kinases (CDKs),

Mitogen-activated protein kinases (MAPKs), phosphoinositide 3-kinase (PI3K),

xxiii
Aurora kinase B (AURKB), Protein kinase A (PKA) e Ca2+/calmodulin-dependent
protein kinases (CamKs) fosforilam Stathmin 1 em sítos de serina e modulam sua
associação com heterodímeros de alfa/beta tubulina. Protein phosphatase 2A
(PP2A), Protein phosphatase 2B (PP2B) e Phosphoprotein phosphatase 1 (PP1)
defosforilam Stathmin 1. A alternância no estado de fosforilação e desfosforilação
de Stathmin 1 contribui para a regulação da dinâmica dos microtúbulos.
Abreviações: RTK, receptor de tirosina kinase; P, fosforilação; Ac, acetilação.
Figura foi produzida utilizando o Servier Medical Art
(http://www.servier.com/Powerpoint-image-bank). ................................................ 16

Figura 7. Representação esquemática da relação entre a expressão de

Stathmin 1 e a participação na diferenciação de células hematopoéticas. Este
modelo baseia-se em estudos que avaliaram a participação de Stathmin 1 na
diferenciação de células hematopoéticas primárias. A expressão de Stathmin 1 é
alta durante a proliferação das células progenitoras mieloides e é negativamente
regulada durante a diferenciação celular, em paralelo à redução do potencial de
proliferação dessas células. .................................................................................. 19

Figura 8. Via de sinalização Hippo em células de tecidos normais e tumores

sólidos. Na presença do contato célula-célula, as quinases que compõem a via de
sinzalização Hippo são fosforiladas em forma de cascata e culminam na
fosforilação do ativador de transcrição YAP1, fazendo com que YAP1 seja
degradada ou fique sequestrada no citoplasma. Em células normais, na perda do
contato célula-célula, a fosforilação das quinases que compõem a via Hippo deixa
de ocorrer e YAP1 é translocada para o núcleo e liga-se a fatores de transcrição
(TF), ativando a transcrição de genes relacionados com proliferação e
sobrevivência celular. Em células neoplásicas, a via Hippo não é ativada mesmo
na presença do contato célula-célula, e YAP1 exerce sua função oncogênica. A
figura foi produzida utilizando o Servier Medical Art
(http://www.servier.com/Powerpoint-image-bank). ................................................ 23

Figura 9. Titulação dos lentivírus em células HT1080, coradas com violeta

cristal. A: diluição 1:2, B: diluição 1:50, C: diluição1:100, D: diluição 1:1000, E
diluição 10000 e F: ausência de lentivírus. ........................................................... 39

Figura 10. ANKHD1 associa-se com SIVA. (A) Imunoprecipitação (IP) e

Immunoblotting (IB) de lisados de HEK293T coexpressando ANKHD1-HA e
SIVA1-GFP ou SIVA2-GFP com anticorpos específicos. (B) Imunoprecipitação (IP)
e Immunoblotting (IB) de lisados de células U937 com o anticorpo anti-ANKHD1
ou anti-SIVA. Extrato de proteína total (input) e anticorpos IgG isotipo foram
utilizados como controles. (C) Análise confocal de células U937, Jurkat e Namalwa
marcando: SIVA (verde), ANKHD1 (vermelho) e DAPI (azul); MERGE indica as
imagens sobrepostas. A análise de colocalização foi realizada através do uso da
ferramenta "colocalization finder" do software ImageJ NIH e evidencia a
colocalização de ANKHD1 e SIVA (pontos brancos). Os valores do coeficiente de
correlação (r) da colocalização estão indicados. ................................................... 46

xxiv
Figura 11. Silenciamento eficiente de ANKHD1 e SIVA em células U937 e
Jurkat. Células leucêmicas mieloides U937 e linfoides Jurkat foram transduzidas
com lentivírus contendo shRNA controle (shControle) ou shRNA tendo como alvo
ANKHD1 (shANKHD1) ou SIVA (shSIVA). Níveis de mRNA (A) e proteína (B) de
ANKHD1 em células shANKHD1 relativos às células shControle. Níveis de mRNA
(C) e proteína (D) de SIVA1 em células shSIVA relativos às células shControle. Os
anticorpos utilizados para immunoblotting (IB) estão indicados. ........................... 48

Figura 12. O silenciamento de ANKHD1 e SIVA tem efeito oposto na

migração de células leucêmicas e na ativação de Stathmin 1. Ensaios de
migração transwell de células U937 e Jurkat submetidas à transdução com
shControle, shANKHD1 (A) ou shSIVA (B) na presença de 0,5% BSA, 10% FBS or
200 ng/mL de CXCL12. Os resultados representam a média±DP de pelo menos
três experimentos independentes; *P<0,05; **P<0,01; teste t Student. Análise por
Western blot da fosforilação da Stathmin 1 e acetilação de alfa-tubulina em células
U937 e Jurkat submetidas à transdução com shControle, shANKHD1 (C) or
shSIVA (D). Immunoprecipitação (IP) de SIVA e immunoblotting (IB) com anti-
Stathmin 1 em células shControle e shANKHD1; extrato proteico total (input) foi
usado como controle (E). Análise por Western blot para Stathmin 1 e acetilação de
alfa-tubulina em células shControle e shSTMN1 (F). As linhagens leucêmicas
utilizadas estão indicadas...................................................................................... 50

Figura 13. ANKHD1 não modula a apoptose induzida por radiação UV em

células leucêmicas. A apoptose foi detectada por citometria de fluxo em células
U937 e Jurkat transduzidas com shControle, shANKHD1 (A) e shSIVA (B) após a
exposição com radiação UV (40 J/m2) usando método de marcação com Anexina-
V/iodeto de propridío (IP). As barras indicam o número relativo (%) de células
viáveis (Anexina- −/I −) p p ó ( x - +/I −) ó ( x -
V+/IP+ mais Anexina- −/I +) p p
experimentos independentes; *P<0,05; ***P<0,001 teste t Student. ..................... 52

Figura 14. ANKHD1 não modula a expressão e a ativação de proteínas

relacionadas com a apoptose. Análise por Western blot da expressão de BCL-
XL, BAX, BCL2 e p-JNK em extrato celular de células shControle, shANKHD1 (A)
e shSIVA (B). As linhagens leucêmicas utilizadas estão indicadas. ...................... 52

Figura 15. ANKHD1, mas não SIVA, modula a proliferação celular de células
leucêmicas in vitro. A proliferação foi determinada pelo ensaio de MTT após 48
horas de incubação de células shANKHD1 (A) ou shSIVA (B) através de
comparação com as células shControle. Os resultados estão respresentados
como média±DP de seis replicatas, sendo estas representativas de pelo menos
três experimentos independentes; *P<0,05; **P<0,01; Teste de Mann–Whitney.
Colônias contendo células viáveis foram detectadas por MTT após 8 dias de
cultura de células shANKHD1 (C) ou shSIVA (D), e normalizadas pelas células
shControle correspondentes. Os resultados estão respresentados como

xxv
média±DP de pelo menos três experimentos independentes; **P<0,01;
***P<0,001; teste t Student.................................................................................... 54

Figura 16. ANKHD1 e SIVA têm efeitos opostos na formação de tumores de

xenoenxerto de células U937 em camundongos NOD/SCID. Medição do tumor
(volume e peso) 12 dias após a injeção de células shANKHD1 (A), shSIVA (B),
shANKHD1/shSIVA (C) versus shControle via subcutânea em camundongos
fêmeas NOD/SCID. O volume do tumor (V) foi calculado utilizando a fórmula (V =
W2 x L x 0,52), em que W e L são os diâmetros menor e maior, respectivamente.
Número de animais está indicado; *P<0,05; **P<0,01; teste de Mann-Whitney.... 55

Figura 17. A inibição de ANKHD1 não modulou a ativação das vias de

sinalização Hippo, SHP2 ou JAK2/STAT em células leucêmicas. Análises por
Western blot para expressão e fosforilação de proteínas da via sinalização Hippo
(YAP1), SHP2 (SHP2 e ERK1/2), e JAK2/STAT (JAK2, STAT3 e STAT5) foram
realizados em extratos proteicos provenientes de células shControle e shANKHD1;
os anticorpos usados para immunoblotting (IB) estão indicados. As linhagens
celulares usadas estão indicadas. Extratos proteicos de células DU145 (para via
Hippo) e HEL (para vias SHP2 e JAK2/STAT) foram utilizadas como controle
positivo. ................................................................................................................. 57

Figura 18. Expressão de YAP1 em células normais, mielodisplásicas e

leucêmicas. (A) Análise da expressão proteica de YAP1 por Western blotting em
células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de doadores normais e em
linhagens leucêmicas. Os anticorpos utilizados para immunoblotting (IB) estão
indicados. (B) O gráfico de barras indica as porcentagens de amostras positivas
para a expressão do gene YAP1 por PCR quantitativo (qPCR) em doadores
saudáveis e em pacientes com síndromes mielodisplásicas (SMD), leucemia
mieloide aguda (LMA) e leucemia linfoide aguda (LLA). O número total de
amostras e porcentagem de amostras positivas e negativas para YAP1 estão
indicados na figura. (C) O gráfico de dispersão ilustra os níveis de mRNA de YAP1
para os indivíduos que apresentaram expressão de YAP1 (P>0,05, teste de Mann-
Whitney). O número de indivíduos é indicado na figura e as linhas horizontais
representam a mediana. (D) Eletroforese em gel de agarose representativa dos
fragmentos gerados pela qPCR dos genes YAP1 e HPRT. Uma reação sem
adição de cDNA foi utilizada como controle negativo (N), e cDNA de células HeLa
foi utilizado como controle positivo. ....................................................................... 59

Figura 19. A expressão de Stathmin 1 é aumentada em células

hematopoéticas em proliferação. (A) Análise da expressão de mRNA de
Stathmin 1, através de qPCR, em células mononucleares do sangue periférico
(CMSP) normais e em linhagens celulares leucêmicas. (B) Análise da expressão
da proteína Stathmin 1 por Western blotting em células hematopoéticas normais e
em linhagens celulares leucêmicas, (C) em CMSP normais, linfócitos do sangue
periférico (LSP), monócitos do sangue periférico (MSP) e granulócitos do sangue

xxvi
periférico (GSP) e (D) em LSP tratados com fitohemaglutinina (PHA). Os
anticorpos utilizados para immunoblotting (IB) estão indicados na figura. ............ 61

Figura 20. Elevada expressão de Stathmin 1 em células totais e CD34+ de

medula óssea de pacientes com SMD AREB-1/AREB-2 e leucemia aguda. (A)
Análise por qPCR dos níveis de mRNA de Stathmin 1 em células totais da medula
óssea de doadores saudáveis e de pacientes com diagnóstico de síndrome
mielodisplásica (SMD), leucemia mieloide aguda (LMA) e leucemia linfoide aguda
(LLA) e (B) pacientes com SMD estratificados de acordo com a classificação da
Organização Mundial de Saúde (OMS) 2008. (C) Análise por qPCR dos níveis de
mRNA de Stathmin 1 em células CD34+ da medula óssea de doadores saudáveis
e de pacientes com diagnóstico de SMD e LMA, (D) pacientes com SMD
estratificados de acordo com a classificação OMS 2008. O número de indivíduos
incluídos no estudo e os valores de P (teste de Mann-Whitney) estão indicados
nos gráficos. (E) Expressão de Stathmin 1 em células totais de medula óssea de
cinco pacientes com SMD no momento do diagnóstico e da progressão da
doença. O gráfico de barras representa a média±DP de três análises por qPCR. 63

Figura 21. Silenciamento eficiente de Stathmin 1 em células U937 e Namalwa.

As células mieloides U937 e linfoides Namalwa foram transduzidas com lentivírus
mediando a entrega de uma sequência de shRNA controle (shControle) ou tendo
como alvo Stathmin 1 (shSTMN1). (A) Análise por qPCR dos níveis de mRNA de
Stathmin 1 em células shSTMN1 relativos às células shControle. (B) Análise da
expressão proteica de Stathmin 1 por Western blot em extratos celulares
shControle e shSTMN1. Os anticorpos para immunoblotting (IB) estão indicados.
.............................................................................................................................. 67

Figura 22. A inibição de Stathmin 1 reduz a proliferação celular e o

crescimento clonal em células U937 e Namalwa. (A) A proliferação celular foi
determinada pelo ensaio de MTT após 48 horas de incubação de células
shSTMN1 normalizada pelas células shControle correspondente. Os resultados
são apresentados como média±DP de quatro experimentos independentes,
*P<0,05; **P<0,01; teste de Mann-Whitney. (B) As colônias contendo células
viáveis foram detectadas por MTT após 8 dias de incubação de células shSTMN1
normalizadas pelas células shControle correspondentes. Imagens das colônias
são representativas de um experimento e os gráficos de barras representam a
média±DP de pelo menos três experimentos independentes realizados em
triplicata; **P<0,01; ***P<0,001; teste t de Student. .............................................. 69

Figura 23. O silenciamento de Stathmin 1 não modula a apoptose em células

U937 e Namalwa. (A) A apoptose foi detectada por citometria de fluxo em células
shControle e shSTMN1 usando o método de marcação com Anexina V/IP. O
quadrante inferior direito contém a população apoptótica (Anexina V+/IP-). Os
resultados são representativos de pelo menos quatro experimentos
independentes. (B) A apoptose foi detectada por citometria de fluxo em células
shControle e shSTMN1 utilizando TUNEL. A região P1 contém a população

xxvii
apoptótica. Os resultados são representativos de pelo menos quatro experimentos
independentes. As linhagens celulares são indicadas nas figuras. ....................... 70

Figura 24. O tratamento com ruxolitinib induz atividade de Stathmin 1 e

instabilidade dos microtúbulos em células HEL. Análises por Western blot dos
níveis de p-Stathmin 1 (S16) (um sítio inibitório) e acetilação de alfa-tubulina (um
marcador de estabilidade dos microtúbulos) em extratos proteicos de células HEL
tratadas ou não com diferentes concentrações de ruxolitinib (100 e 300 nM). Os
anticorpos usados para immunoblotting (IB) estão indicados. Fosfo-STAT3 (p-
STAT3) foi utilizada como controle da eficiência do tratamento com ruxolitinib e
actina como controle da quantidade de proteína aplicada no gel.......................... 72

Figura 25. Silenciamento eficiente de Stathmin 1 em células HEL. Células HEL

foram transduzidas com lentivírus mediando a entrega de shRNA controle
(shControle) ou tendo como alvo Stathmin 1 (shSTMN1). Níveis de mRNA (A) e
proteína (B) de Stathmin 1 em células shSTMN1 relativas às células shControle.
Os anticorpos usados para immunoblotting (IB) estão indicados. ......................... 73

Figura 26. O silenciamento de Stathmin 1 reduz a proliferação e a

clonogenicidade de células HEL. (A) A proliferação/viabilidade celular foi
determinada por ensaio de MTT após 48 horas de incubação de células shSTMN1
normalizadas pelas células shControle na presença ou ausência de ruxolitinib (100
e 300 mM). Os resultados são representados como média±DP de seis
experimentos independentes; *P<0,05; **P<0,01; Teste Mann–Whitney. (B)
Colônias contendo células viáveis foram detectadas por MTT após 8 dias de
cultura de células shSTMN1 e normalizadas pelas células shControle na presença
ou ausência de ruxolitinib (100 e 300 mM). Imagens das colônias são
representativas de um experimento e os gráficos de barras representam a
média±DP de onze experimentos independentes; **P<0,01; Teste t Student....... 74

Figura 27. A inibição de Stathmin 1 aumenta os efeitos pró-apoptóticos de

ruxolitinib (A) A apoptose foi detectada por citometria de fluxo em células HEL
transduzidas com shControle ou shSTMN1 tratadas ou não com ruxolitinib (100 e
300 nM) usando o método de marcação com Anexina-V/IP. Um dot plot
representativo está ilustrado. (B) O gráfico de barras representa a média±DP de
seis experimentos independents; **P<0,01; Teste t Student................................. 75

Figura 28. O silenciamento de Stathmin 1 previne a instabilidade de

microtúbulos induzida pelo tratamento com ruxolitinib. Análises realizadas por
Western blot para verificar os níveis de Stathmin 1, acetilação de alfa-tubulina, p-
JAK2 (Y221), p-STAT3 (Y705) e caspase 3 (total e clivada) em extratos proteicos
de células shControle e shSTMN1 tratadas ou não com ruxolitinib (100 e 300 nM);
os anticorpos usados para immunoblotting (IB) estão indicados........................... 76

Figura 29. A estabilidade dos microtúbulos induzida por paclitaxel melhora a

resposta ao ruxolitinib. (A) A apoptose foi detectada por citometria de fluxo em

xxviii
células HEL tratadas ou não com paclitaxel (5 nM e 10 nM) e/ou ruxolitinib (300
nM) utilizando o método de marcação com Anexina-V/IP; um dot plot
representativo do ponto é ilustrado. (B) As médias±DP de seis experimentos
independentes são indicados no gráfico; *P<0,05 vs. células não tratadas,
#P<0,05 vs. ruxolitinib ou paclitaxel isoladamente; Teste t Student. (C) A
viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT após 48 horas de
incubação de células HEL tratadas ou não com paclitaxel (5 nM e 10 nM) e/ou
ruxolitinib (300 nM) e normalizada por células HEL não tratadas. Os resultados
são apresentados como média±DP de seis experimentos independentes; *P<0,05
vs. Células não tratadas, #P<0,05 vs. ruxolitinib ou paclitaxel isoladamente; Teste
Mann-Whitney. ...................................................................................................... 78

Figura 30. O tratamento com paclitaxel induz fosforilação de Stathmin 1 e

potencializa a clivagem de caspase 3 induzida por ruxolitinib. A análise por
Western blot para os níveis de p-Stathmin 1 (S16), alfa-tubulina acetilada, p-JAK2
(Y221), p-STAT3 (Y705) e caspase 3 (total e clivada) em extratos proteicos
provenientes de células HEL tratadas ou não com paclitaxel (5 nM e 10 nM) e/ou
ruxolitinib (300 nM). Os anticorpos utilizados para immunoblotting (IB) estão
indicados. .............................................................................................................. 79

Figura 31. Níveis de mRNA de Stathmin 1 em células CD34+ de sangue

periférico de pacientes com neoplasias mieloproliferativas e doadores
saudáveis. (A) Análise por qPCR da expressão de Stathmin 1 (STMN1) em
amostras de células CD34+ de sangue periférico de doadores saudáveis e de
pacientes com diagnóstico de trombocitemia essencial (TE), policitemia vera (PV)
e mielofibrose primária (MFP), e de pacientes com neoplasias mieloproliferativas
estratificados de acordo estado mutacional para JAK2V617F (B) ou CALR éxon 9
(C). As linhas horizontais indicam as medianas. O número de indivíduos e os
valores de P (teste Mann-Whitney) são indicados no gráfico. ............................... 81

Figura 32. Modelo potencial para a participação de ANKHD1 e SIVA em

células leucêmicas. 1: SIVA é uma proteína adaptadora que promove a
fosforilação e a inativação de Stathmin 1, a estabilidade dos microtúbulos e regula
negativamente a migração de células leucêmicas; 2: ANKHD1 associa-se com
SIVA, inibe SIVA, induz ativação de Stathmin 1, despolimerização da tubulina e
aumento da migração e da proliferação celular, 3: SIVA pode induzir apoptose
através da regulação positiva das proteínas pró-apoptóticas BAX e p-JNK, e
regulação negativa da proteína antiapoptótica BCL-XL. Abreviações: Ac:
acetilação; P: fosforilação. A figura foi produzida usando o Servier Medical Art
(http://www.servier.com/Powerpoint-image-bank). ................................................ 89

Figura 33. Modelo proposto para a participação de Stathmin 1 nas células

HEL. (A) A ativação constitutiva de STAT3 pela presença da mutação JAK2 V617F
induz a inibição de Stathmin1 e estabilização de microtúbulos. (B) O tratamento
com ruxolitinib resulta na inibição de JAK2, inibição de STAT3, ativação de
Stathmin 1 e aumento da instabilidade dos microtúbulos. (C) O tratamento com

xxix
paclitaxel ultrapassa o efeito de tratamento ruxolitinib, mantendo a estabilidade de
microtúbulos e inibindo Stathmin 1. Abreviações: Ac, acetilação; P, fosforilação. 92

xxx
SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1
1.1. Neoplasias hematológicas ....................................................................... 1
1.2. ANKHD1 .................................................................................................. 5
1.3. SIVA....................................................................................................... 10
1.4. Stathmin 1.............................................................................................. 14
1.5. YAP1...................................................................................................... 21
2. OBJETIVOS ................................................................................................. 25
2.1. Objetivo geral ......................................................................................... 25
2.2. Objetivos específicos ............................................................................. 25
3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................ 27
3.1. Casuística .............................................................................................. 27
3.1.1. Células hematopoéticas normais .................................................... 27
3.1.2. Células hematopoéticas de pacientes com diagnóstico de neoplasia
hematológica ............................................................................................. 27
3.2. Linhagens celulares ............................................................................... 29
3.3. Métodos ................................................................................................. 30
3.3.1. Processamento das amostras ......................................................... 30
3.3.2. Obtenção do cDNA ......................................................................... 31
3.3.3. PCR quantitativo (PCRq) ................................................................ 32
3.3.4. Western Blot .................................................................................... 33
3.3.5. Proliferação de linfócitos ................................................................. 36
3.3.6. Imunofluorescência e microscopia confocal .................................... 36
3.3.7. Plasmídeos e Tranfecção ................................................................ 37
3.3.8. Produção de lentivírus ..................................................................... 38
3.3.9. Transdução de lentivírus ................................................................. 39
3.3.10. Ensaios de Migração ..................................................................... 40
3.3.11. Ensaio de Methylthiazoletetrazolium (MTT) .................................. 41
3.3.12. Ensaio de formação de colônia ..................................................... 41
3.3.13. Indução de apoptose com exposição à radiação UV .................... 41
3.3.14. Avaliação de apoptose por marcação com anexina-V e PI ........... 42

xxxi
 3.3.15. Avaliação de apoptose pelo ensaio de TUNEL ............................. 42
3.3.16. Modelo de xenoenxerto de células U937 em camundongos NOD/SCID
.................................................................................................................. 43
3.3.17. Análise Estatística ......................................................................... 43
4. RESULTADOS ............................................................................................. 45
4.1. Investigação da interação entre ANKHD1 e SIVA e da relevância funcional
desta interação proteica no fenótipo leucêmico ............................................ 45
4.1.1. ANKHD1 associa-se com SIVA ....................................................... 45
4.1.2. ANKHD1 e SIVA têm efeitos opostos na migração e na ativação de
Stathmin 1 em células leucêmicas ............................................................ 47
4.1.3. ANKHD1 não modula a apoptose induzida por UV em células
leucêmicas ................................................................................................ 51
4.1.4. ANKHD1 modula proliferação e clonogenicidade de células leucêmicas
.................................................................................................................. 53
4.1.5. ANKHD1 e SIVA têm efeitos opostos no crescimento tumoral de células
leucêmicas in vivo ..................................................................................... 54
4.1.6. O silenciamento de ANKHD1 não modula as vias de sinalização Hippo,
SHP2 e JAK2/STAT em células leucêmicas ............................................. 56
4.2. Investigação da expressão de YAP1 em células hematopoéticas
neoplásicas ................................................................................................... 57
4.3. Investigação da expressão e participação funcional de Stathmin 1 em
síndromes mielodisplásicas e leucemias agudas ......................................... 60
4.3.1. Stathmin 1 é altamente expressa em células hematopoéticas em
proliferação ............................................................................................... 60
4.3.2. Elevada expressão de Stathmin 1 em células de medula óssea de
pacientes com SMD AREB-1/AREB-2, LMA e LLA ................................... 62
4.3.3 O silenciamento de Stathmin 1 reduz a proliferação celular e a
clonogenicidade de linhagens celulares leucêmicas ................................. 67
4.4. Investigar a expressão e a participação funcional de Stathmin 1 em modelos
de neoplasia hematológica com ativação constitutiva de JAK2/STAT3 ........ 70

xxxii
 4.4.1. O tratamento com ruxolitinib modula a estabilidade dos microtúbulos em
células HEL JAK2V617F .............................................................................. 70
4.4.2. O silenciamento de Stathmin 1 reduz a proliferação, a clonogenicidade,
e aumenta os efeitos pró-apoptóticos de ruxolitinib em células HEL JAK2V617F
.................................................................................................................. 73
4.4.3. Stathmin 1 é um possível alvo da via de sinalização JAK2/STAT3 e
modula a dinâmica de microtúbulos em células HEL JAK2V617F ............... 75
4.4.4. A indução da estabilidade dos microtúbulos melhora a resposta ao
ruxolitinib em células HEL JAK2V617F ........................................................ 77
4.4.5. Stathmin 1 é altamente expressa em células CD34 + de sangue
periférico de pacientes com mielofibrose primária .................................... 80
5. DISCUSSÃO ................................................................................................ 83
6. CONCLUSÃO............................................................................................... 95
7. REFERÊNCIAS ............................................................................................ 97
8. ANEXOS .................................................................................................... 115

xxxiii
xxxiv
1. INTRODUÇÃO

1.1. Neoplasias hematológicas

Em humanos, a hematopoese é um processo hierárquico responsável pela

formação das células sanguíneas. Em adultos, a hematopoese ocorre a partir de

uma célula tronco hematopoética (CTH) pluripotencial de longo prazo, que possui

capacidade de auto-renovação e progride para CTH de curto prazo, que se

diferenciam nas células comprometidas com linhagens mieloide e linfoide. A

divisão das CTH na medula óssea ocorre de maneira assimétrica, onde uma CTH

dá origem a duas células filhas distintas, uma mantém a identidade de CTH e a

outra se transforma em um progenitor mais diferenciado. Um precursor mieloide

comum dá origem a progenitores mais diferenciados e finalmente às células

maduras da série eritrocítica, granulocítica e megacariocítica, e o precursor

linfoide origina os linfócitos T e B e células natural killer. A hematopoese depende

não apenas das CTH, mas também do microambiente da medula óssea, fatores

de crescimento e vias de sinalização [1,2]. A ocorrência de alterações moleculares

na CTH pode ter como consequência diferenciação e proliferação celulares

anormais e o desenvolvimento de neoplasisa hematológicas, especialmente as

neoplasias mieloides, como síndromes mielodisplásicas [SMD], neoplasias

mieloproliferativas [NMP] e leucemias mieloides agudas [LMA], e as neoplasias

linfoides, como a leucemia linfoide aguda [LLA].

As SMD constituem um grupo heterogêneo de neoplasias hematológicas

caracterizadas por citopenias no sangue periférico, hematopoese ineficaz e risco

de evolução para LMA [3]. A classificação da Organização Mundial de Saúde

1
(OMS) 2008, através da avaliação da porcentagem de blastos, número de

linhagens displásicas, presença de sideroblastos em anel e alterações

citogenéticas definiu 7 subtipos de SMD. A classificação da OMS 2008 é

importante para o diagnóstico e estabelecimento do prognóstico dos pacientes e

auxilia no seguimento clínico [4]. Na tentativa de refinar o prognóstico dos

pacientes com SMD, o Sistema Internacional de Escore Prognóstico (IPSS)

categorizou os pacientes em 4 subgrupos de acordo com a porcentagem de

blastos na medula óssea, número de citopenias no sangue periférico e alterações

citogenéticas [5]. Recentemente, o IPSS revisado (IPSS-R) incorporou a gravidade

das citopenias e a nova classificação citogenética como critérios na definição do

escore prognóstico e definiu 5 subgrupos de pacientes com prognóstico distinto

[6]. Apesar da diversidade clínica entre os pacientes com SMD, do ponto de vista

fisiopatológico, dois grandes grupos podem ser identificados de acordo com a

porcentagem de blastos na medula óssea. De forma geral, pacientes com SMD e

porcentagem de blastos <5% na medula óssea são caracterizados por altas taxas

de apoptose das células hematopoéticas, hipercelularidade na medula óssea e

citopenias no sangue periférico [7]. Pacientes com SMD e ≥5% b

medula óssea são caracterizados por aumento da proliferação, baixa taxa de

apoptose, falha na diferenciação celular e consequente acúmulo de blastos [8]. Os

mecanismos moleculares envolvidos com a patogênese da SMD são diversos,

incluindo alterações cromossômicas, mutações, haploinsuficiência, alterações

epigenéticas, alteração na expressão gênica e na ativação de vias de sinalização

[3].

2
 As NMP são desordens clonais que acometem uma ou mais linhagens

mieloides (granulocítica, eritroide, megacariocítica ou de mastócitos),

caracterizadas por hematopoese eficaz com consequente amplificação da

proliferação celular, podendo haver hepatoesplenomegalia. As NMP podem

apresentar um curso clínico insidioso, progressão da doença como resultado de

fibrose da medula óssea ou progressão para LMA [9,10]. De acordo com a

classificação da OMS 2008 [4], as NMP são divididas conforme a presença do

gene de fusão BCR-ABL1, que apresenta atividade tirosino-quinase e é

responsável pelo desenvolvimento da leucemia mieloide crônica (LMC). As

principais NMP BCR-ABL1 negativas são a policitemia vera (PV), trombocitemia

essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) [9]. Em 2005, quatro grupos de

pesquisa independentes identificaram uma única mutação somática, valina para

fenilalanina na posição 617 (V617F) no gene Janus Kinase 2 (JAK2). Essa

mutação, com ganho de função da proteína JAK2, é encontrada em

aproximadamente 65-97% dos pacientes com PV e 23-57% dos pacientes com TE

e MFP [11,12,13,14,15,16]. Outras mutações recorrentes menos frequentes nas

NMP são as mutações no éxon 12 do gene JAK2 e mutações no gene MPL [17].

Em 2013, dois grupos de pesquisa independentes identificaram mutações

somáticas indel no éxon 9 do gene calreticulina (CALR) em cerca de 56-88% dos

pacientes com TE e MFP negativos para mutação no gene JAK2 e MPL [18,19].

Estudos de perfil de expressão gênica indicam que mutações em JAK2 e CALR

compartilham mecanismos de transformação maligna, reafirmando o papel central

da via de sinalização JAK/STAT na patogênese das NMP [20].

3
 As leucemias agudas constituem um grupo heterogêneo de doenças

malignas caracterizadas por defeitos na diferenciação e proliferação elevada de

progenitores hematopoéticos, resultando na expansão e acúmulo de blastos

[21,22]. As leucemias agudas são subdivididas em leucemia mieloide aguda (LMA)

e leucemia linfoide aguda (LLA) dependendo da presença de mieloblastos ou

linfoblastos, respectivamente. A classificação da OMS 2008 definiu os subgrupos

de LMA e LLA de acordo com características morfológicas, imunofenotípicas e

moleculares específicas [4]. A presença da translocação entre os cromossomos 15

e 17, t(15;17)(q24;q21), define a leucemia promielocítica aguda, que possui

características fisiopatológicas e clínicas específicas. A presença da translocação

entre os cromossomos 9 e 22, t(9;22)(q34;q11) define um subgrupo de LLA com

pior prognóstico e necessidade de tratamento específico com inibidores da

atividade tirosina-quinase do BCR-ABL1. Dentre os outros subgrupos de LMA e

LLA, os mecanismos moleculares envolvidos são diversos e não totalmente

esclarecidos [4].

A identificação de genes/proteínas e vias de sinalização diferencialmente

expressas e reguladas entre células hematopoéticas normais e células

hematopoéticas neoplásicas representa um grande desafio para os pesquisadores

e pode gerar novas oportunidades terapêuticas ou a identificação de marcadores

de diagnóstico/prognóstico. Apesar de SMD, NMP e leucemias agudas (LMA e

LLA) serem resultantes de alterações na CTH, mecanismos moleculares e

fisiopatológicos distintos devem ocorrer entre as diferentes entidades diagnósticas

definidas pela classificação da OMS 2008. Desta forma, apesar do conhecimento

de que diversas neoplasias apresentam desregulação de algumas vias de

4
sinalização celular em comum [23], o estudo da função de uma determinada

proteína ou via de sinalização deve levar em conta mecanismos específicos

presente em cada neoplasia.

1.2. ANKHD1

Na tentativa de se identificar novos genes diferencialmente expressos em

neoplasias, o Projeto Genoma Humano do Câncer, desenvolvido pela Fundação

de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo e pelo Instituto Ludwig, realizou o

sequenciamento de Expression Sequence Tags (ESTs) de tecidos humanos

neoplásicos através de uma estratégia denominada Open Reading Frame ESTs

(ORESTES), que gerou sequências localizadas na região central dos transcritos

[24]. Com o objetivo de estudar novas proteínas do citoesqueleto relacionadas às

neoplasias, nosso grupo de pesquisa identificou uma EST com similaridade à

proteína anquirina do citoesqueleto de espectrina, EST RC3-CT0255-200100-024-

c05 (número de acesso AW854359), que correspondia à proteína humana

denominada Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 (ANKHD1) (número

de acesso AF521882) [25,26].

A proteína humana ANKHD1, inicialmente denominada Human Multiple

Ankyrin repeat and single KH domain (hMASK), e depositada no NCBI por Poulin e

colaboradores [25] em dezembro de 2003, foi identificada, em humanos, em

linhagem celular de adenocarcinoam de próstata LNCaP. Posteriormente, o nosso

grupo de pesquisa descreveu que ANKHD1 é uma proteína citoplasmática

altamente expressa em linhagens de leucemias agudas humanas (KG1, HEL,

K562, NB4, HL60, Jurkat, MOLT4, Raji, Daudi e Namalwa) e em amostras de 38

5
pacientes com diagnóstico de leucemia aguda, quando comparadas às células

hematopoéticas normais [27].

O cDNA completo da ANKHD1 possui 8120 pb com a cauda poli-A,

apresenta um quadro aberto de leitura de 7614 pb, com códon de iniciação no

nucleotídeo 61. O gene encontra-se no cromossomo 5 (banda 5q31.3) e possui 34

exons. A proteína ANKHD1 é constituída de 2542 aminoácidos, com peso

molecular de 270 kDa; possui 20 repetições de anquirina, distribuídas em 2

blocos, e um domínio homólogo à K (K homology domain, KH) na região C-

terminal [25,26,27]. A representação esquemática da proteína ANKHD1 está

ilustrada na Figura 1.

Figura 1. Estrutura esquemática da proteína ANKHD1. Os domínios com repetições de

anquirina (Ankyrin repeat domain, ANKRD) e o domínio homólogo à K (K homology domain, KH)
são ilustrados. A posição dos ácidos aminados (aa) são indicadas na figura.

ANKHD1 é uma proteína ortóloga à Mask da Drosophila [28], sugerindo que

ANKHD1 pertence a uma família de proteínas conservada durante a evolução das

espécies. Os domínios mais conservados correspondem às repetições de

aquirina, o que sugere que esta proteína participe de interações proteicas e vias

de sinalização celular relevantes, motivo que gerou nosso interesse em estudar

esta proteína. ANKHD1 possui também um domínio KH na região C-terminal, o

qual foi inicialmente identificado em human heterogeneous nuclear

ribonucleoprotein K. Este domínio possui aproximadamente 70 aminoácidos e foi

descrito em algumas proteínas que se ligam a ácidos nucléicos [29,30].

6
 Ao contrário de outros domínios proteicos, como os domínios SH2 e SH3,

as repetições de anquirina não reconhecem apenas uma sequência específica de

aminoácidos ou estrutura proteica, mas podem interagir com diversos outros

domínios [31,32]. Várias interações proteicas são mediadas pelas repetições de

anquirina em diferentes vias de sinalização [32]. Novas proteínas contendo

repetições de anquirina têm sido descritas como importantes na proliferação de

células neoplásicas. Ankyrin repeat domain 11 (ANKRD11) foi descrito como um

candidato a gene supressor de tumor em adenocarcinoma de mama. Células de

adenocarcinoma de mama apresentam baixa expressão de ANKRD11, mas,

quando sua expressão é re-estabelecida, ocorre inibição do crescimento tumoral.

Este efeito provavelmente ocorre através da interação entre os domínios de

repetição de anquirina de ANKRD11 e p53 [33]. Ankyrin repeat domain 28

(ANKRD28) foi descrita como importante na migração celular em células de

adenocarcinoma de colo uterino (HeLa), através de sua associação com

DOCK180 [34]. Ankyrin repeat domain 1 (ANKRD1) foi identificada como fator

prognóstico em adenocarcinoma de ovário e sua inibição aumentou a

sensibilidade das células neoplásicas à cisplatina [35]. Nosso grupo de pesquisa

indenficou que ANKHD1 interage com a tirosina fosfatase SHP2 em células K562

[27]. Em 2005, Xu e colaboradores [36] demonstraram que SHP2 está altamente

expressa e constitutivamente fosforilada em células leucêmicas de indivíduos

adultos, em especial leucemia mieloide crônica (LMC), comparadas às células

mononucleares de indivíduos normais. A fosforilação da SHP2 confere ativação de

sua atividade catalítica [37] e, em células leucêmicas, a inibição da expressão da

SHP2 induziu apoptose e inibição do crescimento celular [36]. Apesar do fato de

7
que ANKHD1 associa-se com SHP2, estudos funcionais investigando a função de

ANKHD1 nos processos celulares e na regulação de SHP2 ainda não foram

realizados.

A elevada expressão gênica e proteica de ANKHD1 em células leucêmicas

comparadas às células hematopoéticas normais [27] sugere que ANKHD1 possa

ter um possível papel no fenótipo leucêmico. Entretanto, fica evidente a

necessidade da identificação de proteínas que interagem com ANKHD1 e a

identificação de vias de sinalização reguladas por esta proteína em células

hematopoéticas neoplásicas. Neste contexto, nosso grupo de pesquisa havia

previamente realizado um ensaio de duplo híbrido em uma biblioteca de cDNA de

medula óssea humana normal usando a construção pGBKT7-ANKHD1 (aa 1130-

1243) como isca. Dentre as diferentes presas isoladas, foi identificada uma

sequência que codifica o C-terminal de ambas as isoformas de SIVA [38] (Figura

2).

8
Figura 2. Interação entre ANKHD1 e SIVA identificada em sistema de duplo híbrido.
Representação esquemática das estruturas primárias das proteínas, a região de ANKHD1 usada
como isca e a região de SIVA identificada em nosso ensaio de duplo híbrido. O alinhamento das
sequências de aminoácidos obtidos do clone do duplo híbrido foi realizado pelo software Multalin
(http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin); as regiões contendo similaridades estão indicadas em
vermelho. Abreviações: ANKRD, domínio de repetição de anquirina; KH, domínio de homologia K;
SAH, região Amphipathic helical; DDRH, região homologa death domain; ZF, domínio zinc finger-like.

A partir da identificação de uma possível interação entre ANKHD1 e SIVA

em células hematopoéticas, formulamos a hipótese que ANKHD1 participa do

fenótipo neoplásico através desta interação proteica e da sua participação em vias

de sinalização celular reguladas por SIVA. Dentre as funções de SIVA, destaca-se

a sua participação como proteína pró-apoptótica em modelos de células de

leucemia linfoide aguda [39], e sua atuação na modulação da atividade do

supressor tumoral p53 [40]. Estas evidências iniciais constituíram as bases para

justificar o presente trabalho. Durante o desenvolvimento deste projeto de

pesquisa, novas informações publicadas por outros pesquisadores, aliadas aos

nossos resultados, contribuíram para o nosso raciocínio científico e permitiram a

geração de provas de conceito através de experimentos in vitro e in vivo em

9
linhagens celulares, e validação de alguns dados em amostras de pacientes com

possível aplicação clínica. Neste contexto, informações relevantes que foram

consideradas na formação de nosso raciocínio científico foram: (i) a identificação

da interação de SIVA com Stathmin1 em linhagens celulares de osteosarcoma e

carcinoma de mama [41], (ii) a participação de ANKHD1 na modulação da

proliferação celular em carcinoma de próstata [42], (iii) a identificação da interação

entre ANKHD1 e/ou sua proteína ortóloga Mask com YAP1 e/ou sua ortóloga

Yorkie (yki) em células HEK293 e células da Drosophila melanogaster

[42,43,44,45], (iv) o efeito do silenciamento de Mask na modulação negativa da via

de sinalização de Hopscotch (hop) (ortóloga da proteína JAK2 em humanos) em

Drosophila melanogaster [46]. Estas evidências são detalhadas a seguir.

1.3. SIVA

O gene SIVA1 possui dois transcritos variantes que codificam proteínas

distintas. SIVA1 contém uma região helicoidal anfipática (amphipathic helical

region, SAH) na região N-terminal, uma região homóloga ao domínio de morte

(death domain homology region, DDHR) na parte central da proteína, e uma

estrutura semelhante ao dedo de zinco (Zinc finger-like, ZF) na sua região C-

terminal. A isoforma SIVA2 não possui o domínio DDHR (Figura 3).

10
Figura 3. Estrutura esquemática das proteínas SIVA1 e SIVA2. A região helicoidal anfipática
(amphipathic helical region, SAH), na região N-terminal, uma região homóloga ao domínio de morte
(death domain homology region, DDHR) na parte central, e uma estrutura semelhante ao dedo de
zinco (Zinc finger-like, ZF) na sua região C-terminal são ilustrados. A posição dos aminoácidos (aa)
é indicada na figura.

SIVA foi inicialmente identificada como uma proteína potente na indução de

apoptose, fato que motivou esta proteína a receber um nome semelhante ao da

divindade Hindu da destruição, Shiva [47]. A função pró-apoptótica da SIVA é bem

elucidada e caracterizada. SIVA liga-se a receptores de morte, incluindo CD27 e

TNFRSF18, e desempenha um papel na transdução do sinal pró-apoptótico pela

via extrínseca [47,48]. SIVA interage com BCL2 e BCL-XL, inibe suas funções

antiapoptóticas e modula a via intrínseca de apoptose [49,50]. Além disso, SIVA1

interage com XIAP e regula a apoptose mediada pela sinalização NFB e JNK

[51]. O gene de SIVA é um alvo transcricional de p53, p73 e E2F1 e é regulado

positivamente sob estresse ou dano ao DNA [52,53].

Em 2009, o paradigma de que SIVA1 teria uma função estritamente

relacionada com a apoptose foi quebrado quando a sua função na estabilidade de

p53 foi relatada, indicando a participação de SIVA1 na modulação da proliferação

celular [40]. SIVA1 liga-se a p53 e regula sua estabilidade, agindo como uma

proteína adaptadora entre p53 e MDM2, e participa de um mecanismo de auto-

11
regulação entre p53 e o gene SIVA1 [40,54]. SIVA1 associa-se com ARF

(CDKN2A) proporcionando a ubiquitinação e degradação de ARF; este

mecanismo representa uma outra via de regulação da sinalização mediada por

p53/MDM2 [55].

SIVA1 é uma proteína adaptadora que promove interação com Stathmin

1/CaMKII. SIVA1 inibe a atividade de Stathmin 1 através do aumento da

fosforilação no sítio inibitório serina 16, o que resulta na redução da migração

celular e metástase através da estabilização de microtúbulos em células de

tumores sólidos [41]. Os principais mecanismos envolvidos na sinalização

mediada por SIVA1 são ilustrados na Figura 4.

12
Figura 4. Vias de sinalização de SIVA1. (1) SIVA1 liga-se a receptores de morte e modula a via
extrínseca da apoptose. (2) SIVA1 liga-se a proteínas da família BCL2, inibe as proteínas
antiapoptóticas BCL2 e BCL-XL, induz a oligomerização de proteínas pró-apoptóticas BAD, e
modula a via intrínseca da apoptose. (3) SIVA1 se liga à proteína XIAP, equilibra a sinalização pró-
apoptótica e antiapoptótica através da via JNK e NFkB, respectivamente, e modula a via extrínseca
da apoptose. (4) O gene SIVA1 é um alvo transcricional de p53, p73 e E2F1. (5) SIVA1 atua como
uma proteína adaptadora entre p53 e MDM2, e promove a ubiquitinação de p53. (6) SIVA1 atua
como uma ubiquitina ligase E3 para ARF (CDKN2A) e regula a proliferação celular através da via
de sinalização ARF/p53/MDM2. (7) SIVA1 promove a interação entre Stathmin 1 e CaMKII,
induzindo a fosforilação de Stathmin 1 e modulando a dinâmica dos microtúbulos. Abreviações: P,
fosforilação; Ac, acetilação; Ub, ubiquitinação. A figura foi produzida utilizando o Servier Medical
Art (http://www.servier.com/Powerpoint-image-bank).

A participação de SIVA no fenótipo maligno de células neoplásicas já foi

reportada. Em linhagens celulares de LLA, a expressão induzida de SIVA1

aumenta a apoptose [56], enquanto que a inibição de SIVA1 reduz a apoptose

[51]. Em linhagens celulares de câncer de mama, SIVA1 atua sinergicamente com

a cisplatina na indução de apoptose [50]. Recentemente, foi reportada a redução

da expressão de SIVA em tumores de mama primários e metastáticos. Além disso,

13
o silenciamento de SIVA1 aumenta a metástase em modelo de xenoenxerto de

câncer de mama [41].

Em amostras primárias de câncer coloretal, através do uso de microarranjo

de DNA, foi observada uma expressão reduzida de SIVA1 nas amostras de câncer

em comparação com o tecido normal [57]. Em linhagens celulares de câncer de

cólon, SIVA1 foi encontrada como alvo transcricional de p53 e E2F1 e participa da

apoptose induzida pela inibição de MDM2 [52]. O silenciamento de SIVA1 reduz a

apoptose de modo dependente de p53 em células de câncer de cólon tratadas

com cisplatina [58]. Em um modelo de xenoenxerto de osteossarcoma, o

silenciamento de SIVA1 aumenta a estabilidade de p53 e reduz o crescimento do

tumor [40]. Em linhagens celulares de osteosarcoma, a inibição de SIVA1 aumenta

migração celular e metástase, enquanto que a indução de expressão de SIVA1

tem um efeito oposto [41]. Em um estudo com foco na identificação de genes

modulados em células de câncer de próstata sob apoptose, os transcritos de

SIVA1 foram encontrados aumentados, indicando uma possível participação de

SIVA1 na via apoptótica de células de câncer de próstata [59].

As principais evidências que foram consideradas em nosso raciocínio

científico foram a atuação de SIVA na migração, proliferação e apoptose e sua

participação na regulação de proteínas da família BCL2 e Stathmin 1.

1.4. Stathmin 1

Stathmin 1 é uma fosfoproteína citoplasmática de 18 kDa (também

conhecida como Oncoprotein 18 (OP18), Leukemia-associated phosphoprotein

p18 (LAP18) ou Metablastin) que pertence à família Stathmin. Todos os membros

14
desta família possuem um domínio Stathmin-like que contém até quatro sítios de

fosforilação em serina (resíduos 16, 25, 38 e 68) na região N-terminal e um

domínio de ligação à tubulina [60,61]. A representação esquemática de Stathmin 1

está ilustrada na Figura 5.

Figura 5. Estrutura esquemática da proteína Stathmin 1. A região N-terminal promotora de

catástrofe, o domínio de ligação à tubulina na região C-terminal e os quatro sítios de fosforilação
em serina (S16, S25, S38 e S63) estão ilustrados. A posição dos aminoácidos está indicada na
figura.

A principal função de Stathmin 1 baseia-se na atividade desta proteína em

desestabilizar os microtúbulos, o que permite a promoção de catástrofe dos

microtúbulos ou o sequestro de heterodímeros de alfa/beta tubulina impedindo a

formação de microtúbulos [62,63,64]. O nome "Stathmin" deriva de "Stathmos" o

que significa "retransmissão"; esta proteína recebe este nome devido a sua

participação na transdução de sinal de múltiplas vias de sinalização que estão

resumidamente representadas na Figura 6 [65,66].

15
Figura 6. Via de sinalização de Stathmin 1. Cyclin-dependent kinases (CDKs), Mitogen-activated
protein kinases (MAPKs), phosphoinositide 3-kinase (PI3K), Aurora kinase B (AURKB), Protein
2+
kinase A (PKA) e Ca /calmodulin-dependent protein kinases (CamKs) fosforilam Stathmin 1 em
sítos de serina e modulam sua associação com heterodímeros de alfa/beta tubulina. Protein
phosphatase 2A (PP2A), Protein phosphatase 2B (PP2B) e Phosphoprotein phosphatase 1 (PP1)
defosforilam Stathmin 1. A alternância no estado de fosforilação e desfosforilação de Stathmin 1
contribui para a regulação da dinâmica dos microtúbulos. Abreviações: RTK, receptor de tirosina
kinase; P, fosforilação; Ac, acetilação. Figura foi produzida utilizando o Servier Medical Art
(http://www.servier.com/Powerpoint-image-bank).

A fosforilação de Stathmin 1 em sítios inibitórios de serina (16 e/ou 63)

reduz a afinidade de Stathmin 1 pelos heterodímeros de alfa/beta tubulina,

representando um importante mecanismo da sua regulação [67]. Durante a

mitose, uma regulação precisa da dinâmica dos microtúbulos é necessária para o

sucesso da progressão do ciclo celular de múltiplas vias de sinalização que

participam neste processo, tendo como alvo os sítios de fosforilação em serina de

Stathmin 1. Aurora kinase B, Protein kinase A (PKA), P21 Protein (Cdc42/Rac)-

16
Activated Kinase (PAK1) e Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases (CamKs)

podem fosforilar Stathmin 1 no sítio de serina 16 e/ou 63, resultando em uma

potente inativação da capacidade de ligação à tubulina [68]. Cyclin-dependent

kinases (CDKs), mitogen-activated protein kinases (MAPKs) e phosphoinositide 3-

kinase (PI3K) podem induzir a fosforilação de Stathmin 1 na posição S25 e/ou

S38, que não é suficiente para inibir a associação entre Stathmin 1 e alfa/beta-

tubulina, mas representa um mecanismo potencial de regulação dos demais sítios

[68]. Adicionalmente, STAT3 fosforilada pode se ligar e inibir Stathmin 1, induzindo

maior estabilidade dos microtúbulos [69,70,71]. Stathmin 1 pode ser defosforilada

por proteínas fosfatase, incluindo Protein phosphatase 2A (PP2A), Protein

phosphatase 2B (PP2B) e Phosphoprotein phosphatase 1 (PP1) [72,73,74]. Além

das funções de Stathmin 1 na progressão do ciclo celular, esta proteína também

está implicada na correta segregação dos cromossomos, clonogenicidade,

motilidade celular e sobrevivência de células normais e cancerosas [67].

Focando na participação de Stathmin 1 em processos relacionados com a

hematopoese, os estudos da função dessa proteína foram inicialmente realizados

utilizando linhagens celulares leucêmicas. A diminuição da expressão de Stathmin

1 ocorre durante a diferenciação megacariocítica induzida quimicamente em

células K562 e HEL, e a sua inibição resulta em uma maior capacidade de

diferenciação e poliploidização [75]. Em células hematopoéticas murinas, a

expressão de Stathmin 1 é elevada em megacariócitos imaturos, baixo em

megacariócitos maduros e indetectável em plaquetas, suportando a hipótese que

Stathmin 1 é regulada negativamente durante a maturação megacariocítica [75].

Recentemente, lancu-Rubin e colaboradores [76] reportaram que a expressão

17
induzida de Stathmin 1 em células humanas primárias CD34 + reduz a

poliploidização dos megacariócitos e a produção de plaquetas [76].

Rabilloud e colaboradores [77] reportaram um aumento da expressão de

Stathmin 1 durante a diferenciação eritroide. Stathmin 1 foi identificada como

sendo altamente expressa em células murinas e humanas de eritroleucemia após

indução de diferenciação eritroide. Estes resultados foram confirmados utilizando

células hematopoéticas primárias humanas normais induzidas à diferenciação

eritroide com eritropoietina in vitro. Curiosamente, o nível mais elevado de

Stathmin 1 foi observado em proeritroblastos em comparação com os

eritroblastos, e não foi detectável em eritrócitos maduros. Estes resultados indicam

que Stathmin 1 pode estar relacionada com a capacidade proliferativa mais

elevada de progenitores eritroides precoces [77].

Camundongos nocaute para Stathmin 1 apresentam dois fenótipos que se

assemelham a desordens hematológicas humanas: anemia megaloblástica e

trombocitose [78]. Estes resultados estão de acordo com os achados anteriores

em relação à função de Stathmin 1 na megacariocitopoese e eritropoese [76,77].

Um modelo sobre a expressão de Stathmin 1 e sua relação com a diferenciação

de células hematopoéticas é ilustrado na Figura 7.

18
Figura 7. Representação esquemática da relação entre a expressão de Stathmin 1 e a
participação na diferenciação de células hematopoéticas. Este modelo baseia-se em estudos
que avaliaram a participação de Stathmin 1 na diferenciação de células hematopoéticas primárias.
A expressão de Stathmin 1 é alta durante a proliferação das células progenitoras mieloides e é
negativamente regulada durante a diferenciação celular, em paralelo à redução do potencial de
proliferação dessas células.

Stathmin 1 foi inicialmente identificada em células de leucemia HL60

durante a diferenciação monocítica [79]. As primeiras descobertas relativas a

Stathmin 1 foram intimamente ligadas à expressão diferencial desta proteína na

leucemia aguda; naquele momento, esta proteína foi nomeada como leukemia-

associated phosphoprotein p18 [80]. Hanash e colaboradores, usando

bidimensional PAGE, identificaram um polipeptídio de 18 kDa altamente expresso

em células de leucemia aguda primária, independentemente da sua linhagem [81].

O mesmo grupo de pesquisa clonou e sequenciou o gene que seria

19
correspondente à Stathmin 1 [81] e reportou que a fosforilação de Stathmin 1

correlaciona-se com a contagem de células brancas do sangue periférico e a

percentagem de células na fase S em uma coorte de 177 pacientes com leucemia

aguda infantil [82]. Roos e colaboradores [83] descreveram uma expressão

anormal de Stathmin 1 em linfoma não Hodgkin de alto grau e leucemia aguda,

porém a correlação com a fase S do ciclo celular não foi encontrada.

É importante notar que o silenciamento de Stathmin 1 resulta na inibição

acentuada da tumorigenicidade da linhagem de células K562 in vitro e em um

modelo murino, sugerindo que os altos níveis de Stathmin 1 são necessários para

a manutenção do fenótipo leucêmico [84]. Achados semelhantes foram

observados por outros pesquisadores, que confirmaram que a inibição de

Stathmin 1 reduz a proliferação de células K562 [85].

Em relação às neoplasias linfóides, Stathmin 1 foi encontrada altamente

expressa em linhagens celulares de LLA (HPB-ALL) em comparação com células

linfoides normais [86], e em amostras de linfomas comparadas com o tecido

linfóide normal [87]. Utilizando a abordagem de microarranjo de DNA, Stathmin 1

foi incluído em um conjunto de 15 genes relevantes para a determinação da

sobrevida global em pacientes com mieloma múltiplo [88]. Além disso, Marafioti e

colaboradores [89] identificaram Stathmin 1 como um possível marcador

diagnóstico para o linfoma não Hodgkin folicular.

Um ponto importante a ser esclarecido é se a modulação de Stathmin 1 é

uma causa ou uma consequência durante a transformação maligna de células

hematopoéticas. A expressão da forma mutada de Stathmin 1 (Q18E), que confere

ganho de função à proteína, possui capacidade de induzir a transformação de

20
fibroblastos murinos 3T3, resultando na formação de agregados e sobreposição

de células in vitro e no crescimento de tumor in vivo em camundongos

imunodeficientes [90]. A transformação maligna induzida por BCR-ABL1 resultou

em aumento acentuado da expressão de Stathmin 1 em células BaF3. Além disso,

Zada e colaboradores [91] reportaram que a oncoproteína PML-RAR é capaz de

induzir expressão e ativação de Stathmin 1, indicando que Stathmin 1 pode

contribuir para o fenótipo transformado causado por oncogenes [92].

1.5. YAP1

Em 2013, foram descritas a interação entre ANKHD1 e YAP1 e a relevância

de ANKHD1 na atividade de YAP1 em células embrionárias de rim humano

HEK293 e Drosophila [43,44]. Esta informação instigou a nossa curiosidade em

investigar a relevância desta interação proteica em células de carcinoma de

próstata [42] e hematopoéticas neoplásicas.

A via de sinalização Hippo foi inicialmente caracterizada em Drosophila

como um mecanismo que controla o crescimento do tecido e o tamanho do órgão,

e os componentes dessa via de sinalização são evolutivamente conservados e

desempenham a função de um supressor de tumor em mamíferos [93]. Os

componentes humanos mais importantes da via de sinalização Hippo são: Yes-

associated protein 1 (YAP1; ortólogo de Yorkie), Large tumor suppressors 1 e 2

(LATS1/2; ortólogo de Wts), Mammalian STE-20 kinases 1 e 2 (MST1/2; ortólogo

de Hpo) e Msp-one-binder (MOB1; ortólogo de Mats) [94].

21
 YAP1 é o efetor nuclear da via de sinalização Hippo e atua como um

coativador de transcrição. A fosforilação de YAP1 em sítios de serina induz o seu

sequestro no citoplasma e/ou sua degradação [94]. YAP1 liga-se a vários fatores

de transcrição, que incluem ErbB4 [95], p53BP-2 [96], RUNX2 [97], TEAD1-4

[98,99] e p73 [100], e regula a expressão de diversos genes. Aberrações na via de

sinalização Hippo já foram descritas em um grande número de tumores sólidos

[94]. Camundongos transgênicos com elevada expressão de Yap1 apresentam

aumento do crescimento hepático e câncer [101], e a expressão ectópica de YAP1

promove a proliferação celular e a transformação oncogênica in vitro [102].

Existem várias evidências da participação de YAP1 no fenótipo maligno de

tumores sólidos; no entanto, a função desta proteína em neoplasias hematológicas

permanece pouco elucidada. A Figura 8 ilustra a via de sinalização Hippo em

células de tecidos normais e tumores sólidos.

22
Figura 8. Via de sinalização Hippo em células de tecidos normais e tumores sólidos. Na
presença do contato célula-célula, as quinases que compõem a via de sinzalização Hippo são
fosforiladas em forma de cascata e culminam na fosforilação do ativador de transcrição YAP1,
fazendo com que YAP1 seja degradada ou fique sequestrada no citoplasma. Em células normais,
na perda do contato célula-célula, a fosforilação das quinases que compõem a via Hippo deixa de
ocorrer e YAP1 é translocada para o núcleo e liga-se a fatores de transcrição (TF), ativando a
transcrição de genes relacionados com proliferação e sobrevivência celular. Em células
neoplásicas, a via Hippo não é ativada mesmo na presença do contato célula-célula, e YAP1
exerce sua função oncogênica. A figura foi produzida utilizando o Servier Medical Art
(http://www.servier.com/Powerpoint-image-bank).

Jansson e Larsson [103] relataram que a expressão induzida de YAP1 em

células-tronco hematopoéticas murinas não resultou na transformação maligna e

não alterou a hematopoese ou as funções das CTH, sugerindo que YAP1 não

23
exerce uma função oncogênica em células hematopoéticas. Safari e

colaboradores [104] reportaram que os genes MST1, MST2 e YAP1 não são

diferencialmente expressos em células de medula óssea e/ou sangue periférico

proveniente de pacientes com LMA e doadores saudáveis.

A partir dos nossos resultados anteriores que evidenciaram uma alta

expressão de ANKHD1 em neoplasias hematológicas e um nova interação

proteica entre ANKHD1/SIVA, somadas às evidências da literatura da interação de

Stathmin 1/SIVA e YAP1/ANKHD1 em células não hematológicas, surgiram os

objetivos deste trabalho.

24
2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Investigar a função e a sinalização celular de ANKHD1 e proteínas

relacionadas em neoplasias hematológicas.

2.2. Objetivos específicos

- Investigar a interação entre ANKHD1 e SIVA e a relevância funcional desta

interação proteica no fenótipo leucêmico.

- Investigar a expressão de YAP1 em células hematopoéticas neoplásicas.

- Investigar a expressão e participação funcional de Stathmin 1 em síndromes

mielodisplásicas e leucemias agudas.

- Investigar a expressão e a participação funcional de Stathmin 1 em modelos de

neoplasia hematológica com ativação constitutiva de JAK2/STAT3.

25
26
3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Casuística

3.1.1. Células hematopoéticas normais

As células hematopoéticas normais foram obtidas de sangue periférico (SP)

(n=30) ou de medula óssea (MO) (n=22) de doadores normais com idade mediana

de 35 anos (18-56 anos), recrutados junto ao banco de sangue do Hemocentro

Campinas / Unicamp com aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (Parecer

CEP Nº 1209/2011 Anexo I, Parecer CEP Nº 1129/2011 Anexo II) após

consentimento informado.

3.1.2. Células hematopoéticas de pacientes com diagnóstico de neoplasia

hematológica

As amostras foram obtidas de medula óssea de pacientes atendidos

regularmente no ambulatório de Hematologia do Hemocentro Campinas/Unicamp,

com aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (Anexo I e Anexo II) e

consentimento informado.

Amostras de medula óssea de pacientes com diagnóstico de SMD foram

coletadas no momento do diagnóstico ou durante o seguimento clínico, antes de

qualquer tratamento. Amostras de medula óssea de pacientes com LLA e LMA

foram coletadas no momento do diagnóstico; pacientes com diagnóstico de

leucemia promielocítica aguda não foram incluídos no estudo. Amostras de

sangue periférico de pacientes com diagnóstico de NMP BCR-ABL1 negativas

foram coletadas durante o seguimento clínico dos pacientes, sendo que 76 de 82

27
pacientes estavam em uso de hidroxiuréia no momento da coleta das amostras. O

diagnóstico de neoplasia hematológica foi realizado de acordo com

recomendações da OMS 2008 [4] e revisado pela equipe de médicos da

hematologia e da patologia da institução. As amostras utilizadas neste estudo

foram coletadas entre o período de maio de 2001 à outubro de 2014, e

apresentavam RNA de boa qualidade no momento da realização dos

experimentos. As características demográficas e clínicas dos pacientes com

neoplasia hematológica incluídos no estudo estão descritas na Tabela 1.

Tabela 1. Características dos pacientes.

Pacientes Número
SMD 65
Gênero
Masculino/Feminino 33/32
Idade (anos), mediana (intervalo): 69 (16-90)
Classificação OMS 2008
AR/ARSA/del(5q)/CRDM 4/5/1/36
AREB-1/AREB-2 9/10
Risco citogenético*
Baixo 53
Intermediário 7
Alto 2
Ausência de metáfase 3
Blastos na MO (%)
<5% 46
≥5 < 10% 9
≥10 < 20% 10

Leucemias Agudas 79
LMA 60
Gênero
Masculino/Feminino 29/31
Idade (anos), mediana (intervalo): 60 (18-93)
Blastos na MO (%), mediana (intervalo) 60 (20-98)
Risco citogenético**
Baixo 4
Intermediário 31
Alto 14
Ausência de metáfase 11
LLA 19

28
Gênero
Masculino/Feminino 7/12
Idade (anos), mediana (intervalo): 33 (19-79)
Blastos na MO (%), mediana (intervalo) 89 (54-99)
Cariótipo
Normal 8
t(9;22) 1
t(4;11) 1
Complexo 1
Ausência de metáfase 8

NMP BCR-ABL1 negativas 82

Gênero
Masculino/Feminino 49/33
Idade (anos), mediana (intervalo): 64 (20-88)
PV/TE/MFP 34/23/25
Status mutacional
JAK2V617F 52
CALRMUT 19
JAK2WT/CARLWT 9
JAK2 WT/CALR não avaliado 2
Cariótipo
Normal 52
11p+ 1
Ausência de metáfase 29
Abreviações: SMD, síndrome mielodisplásica; MO, medula óssea; OMS, Organização Mundial da
Saúde; AR, anemia refratária; ARSA, anemia refratária com sideroblastos em anel; SMD com
deleção 5q isolada; CRDM, citopenia refratária com displasia multilinear; AREB-1, anemia refratária
com excesso de blastos-1; AREB-2, anemia refratária com excesso de blastos-2; LMA, leucemia
mieloide aguda; LLA, leucemia linfoide aguda; NMP, neoplasia mieloproliferativa; PV, policitemia
vera; TE, trombocitemia essencial; MFP, mielofibrose primária; JAK2, Janus Kinase 2; CARL,
Calreticulina.
* Na coorte de SMD, os achados da citogenética incluem cariótipos de baixo risco: -Y (n=1), normal
(n=51), del(5q) (n=1); risco intermediário: trissomia 8 (n=2), outros (n=4); alto risco: monossomia 7
(n=1), > 3 anormalidades (n=2) [5].
** Na coorte de LMA, os achados da citogenética incluem cariótipos de baixo risco: t(8;21) (n=3),
inv(16) (n=1); risco intermediário: normal (n=22), trissomia 8 (n=4), outras anormalidades (n=5);
alto risco: monossomia 7 (n=4), del(5q) (n=1), >3 anormalidades (n=9) [105].

3.2. Linhagens celulares

Linhagens celulares humanas foram adquiridas da ATCC (Philadelphia, PA,

EUA) e cultivadas em meio apropriado contendo 10% soro fetal bovino, glutamina,

penicilina/estreptomicina e mantidas a 37ºC, 5% CO2. As células 293FT foram

obtidas da Life Tecnologies. As linhagens celulares NB4 e Karpas 422 foram

29
gentilmente cedidas pelos pesquisadores: Prof. Dr. Eduardo Magalhães Rego

(Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, Brasil) e Prof. Dr. Martin Dreyling

(University Hospital Grosshadern/LMU, Munich, Alemanha), respectivamente. A

descrição das linhagens celulares está na Tabela 2.

Tabela 2. Características das linhagens celulares humanas.

Nome Linhagem Descrição
K562 Mieloide Leucemia mieloide crônica, t(9;21)
KU812 Mieloide Leucemia mieloide crônica, t(9;21)
NB4 Mieloide Leucemia promielocítica aguda, t(15;17)
HL60 Mieloide Leucemia mielocítica aguda
U937 Mieloide Linfoma histiocitóide*
HEL Mieloide Eritroleucemia
KG1 Mieloide Leucemia mieloide aguda
THP1 Mieloide Leucemia monocítica aguda
Jurkat Linfoide Leucemia aguda de células T
MOLT4 Linfoide Leucemia linfoide aguda T
Raji Linfoide LLA B/Linfoma de Burkitt
Daudi Linfoide LLA B/Linfoma de Burkitt
Namalwa Linfoide LLA B/Linfoma de Burkitt
Karpas 422 Linfoide LLA B/Linfoma de Burkitt
HEK293T - Células embrionária de rim
DU145 - Carcinoma de próstata
HeLa - Adenocarcinoma de colo uterino
HT1080 - Fibrosarcoma
293FT - Células embrionária de rim
* Linhagem celular utilizada como modelo de LMA [106].

3.3. Métodos

3.3.1. Processamento das amostras

Para obtenção de células totais de MO, o sangue de MO coletado em EDTA

foi submetido à lise de hemácias com tampão contendo cloreto de amônio. A

seguir, as células foram submetidas à extração de RNA.

Para separação de células CD34+, linfócitos e monócitos, as células

mononucleares de MO ou SP foram isoladas em gradiente de Ficoll-Hypaque

(Sigma, St. Louis, MO, EUA) e separadas através de colunas de imunoafinidade

30
MIDI-MACS utilizando anti-CD34, anti-CD3 ou anti-CD14, respectivamente, de

acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,

Alemanha). Os granulócitos foram obtidos da fração inferior do gradiente de Ficoll-

Hypaque (Sigma), após lise de hemácias. Após purificação, as células foram

submetidas à extração de RNA ou proteína.

3.3.2. Obtenção do cDNA

O RNA de linhagens celulares ou células primárias foi isolado utilizando

Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). Ao precipitado de células, contendo

5x106 a 1x107 células, foi acrescentado 1 mL de Trizol e a amostra foi

homogeneizada até que se tornasse bastante fluida. A purificação do RNA deu-se

segundo o protocolo do fabricante. O RNA de células CD34 + foi obtido através do

kit RNAspin Mini RNA Isolation (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, UK)

seguindo as instruções do fabricante. A quantificação do RNA obtido foi realizada

através da leitura da densidade óptica (DO) de uma alíquota da amostra em

espectofotômetro com comprimento de onda equivalente a 260 nm, considerando

que 1 DO a 260 nm equivale a 40 µg/mL de RNA. A relação entre as leituras

realizadas a 260 e 280 nm foi utilizada como parâmetro na estimativa do grau de

contaminação do RNA por proteínas, e esse varia normalmente entre 1,6 e 2,1.

O RNA obtido pelo método que utilizou Trizol foi tratado com DNAse livre de

RNAse (Life Technologies), utilizando 1 U da enzima para tratar 1 µg de RNA por

30 minutos a 37ºC, a fim de eliminar uma possível contaminação deste material

com DNA genômico. A reação foi interrompida pela adição de uma solução de

EDTA com concentração final de 2 mM e a enzima foi inativada por incubação de

31
10 minutos a 65ºC. O RNA obtido pelo kit RNAspin Mini RNA Isolation (GE) foi

tratado com DNAse nas etapas de purificação com reagentes do próprio kit.

As amostras de RNA total, contendo 1 µg de RNA e tratadas com DNAse I,

foram transcritas reversamente em cDNA em uma reação de volume final de 20 µL

utilizando o kit RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis (MBI Fermentas, St.

Leon-Rot, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Como controle

da eficiência da transcrição reversa do RNA em cDNA foi realizada uma reação

em cadeia da polimerase (PCR) para o gene β2–microglobulina, cujos inciadores

reconhecem apenas o cDNA desse gene como molde. A PCR para amplificação

de β2–microglobulina foi realizada para um volume final de 50 µL de reação que

contém: 1,5 µL do cDNA síntetizado, 5 µL de tampão de reação, 3 µL MgCl2 50

mM, 2,5 unidades de Taq polimerase e 200 nM de cada iniciador. Foi realizado um

controle negativo, sem adição de cDNA. As sequências dos iniciadores de β2–

microglobulina utilizados foram: FW: ATGTCTCG CTCCGTGGCCTTAGCT; RV:

CCTCCATGATGCTGCTTACATGTC. O programa das condições de amplificação

foi composto de 5 minutos de desnaturação a 94ºC, seguido por 35 ciclos de 40

segundos a 94ºC, 40 segundos a 55ºC e 40 segundos a 72ºC, com uma fase final

de 72ºC por 7 minutos. Os fragmentos resultantes de 300 pb foram visualizadas

em luz ultravioleta em gel de agarose 2%.

3.3.3. PCR quantitativo (PCRq)

Amplificação em tempo real foi realizada no ABI 7500 Sequence Detector

System (Life Technologies) utilizando-se Maxima Sybr green qPCR master mix

(MBI Fermentas). Duzentos e quarenta ng de cada amostra de cDNA foram

32
utilizados na reação com os iniciadores para os genes alvos. As sequências e as

concentrações dos iniciadores foram definidas a partir da análise da sequência de

nucleotídeos e testes de eficiência, e são descritas na Tabela 3. Um controle

negativo, sem adição de cDNA, foi realizado para cada par de iniciadores. O

protocolo de dissociação foi realizado no final de cada reação para verificar

amplificações não específicas. Cada reação foi repetida três vezes no mesmo

experimento. A expressão do gene HPRT (Hypoxanthine

Phosphoribosyltransferase 1) foi utilizada como controle endógeno. A

quantificação relativa da expressão gênica foi calculada utilizando-se a fórmula 2–

∆∆CT
[107].

Tabela 3. Sequência e concentração dos iniciadores.

Gene Concentração Seqüência dos Iniciadores
FW: 5’ CCT GCT TGG C CCT TG T 3’
ANKHD1 300 nM
RW: 5’ CGT GCC GG CC T CTG 3’
FW: 5’ TCT TCG G G CC GC G 3’
SIVA1 300 nM
RW: 5’ TGC CC GG CTC CTG TC 3’
FW: 5’ TTG G C TG CG CC T GCT 3’
YAP1 600 nM
RW: 5’ GCTGCTC TGCTT GTCC CTGT 3’
FW: 5’ GCCCTCGGTC G TC 3’
STMN1 300 nM
RW: 5’ G CGTCTTGCTCG G TGTG 3’
FW: 5’ G CGT CTT GCT CG G T GTG 3’
HPRT 150 nM
RW: 5’ TCC GC GG TC GC G T 3’

3.3.4. Western Blot

Ao precipitado celular contendo 5x106 a 1x107 células foi acrescentado

tampão de extração de proteínas contendo 100 mM Tris (pH 7.6), 1% Triton X-

100, 150 mM NaCl, 35 mg PMSF/mL, 10 mM Na3VO4, 100 mM NaF, 10 mM

Na4P2O7, e 4 mM EDTA. As amostras foram homogeneizadas até que se

tornassem bastante fluidas. Após 30 minutos a 4ºC, as amostras passaram por um

processo de centrifugação a 4ºC durante 20 minutos para remoção dos restos

33
celulares. Ao produto do extrato total proteico, adicionou-se tampão de Laemmli

contendo 100 mmol/L de ditiotreitol e aqueceu-se em banho seco a 94ºC por 5

minutos. Após isso, as amostras foram submetidas à eletroforese ou armazenadas

a -80ºC. Para produção de imunoprecitado adicionou-se ao extrato proteico o

anticorpo de interesse e proteína A-Sepharose 6MB (para anticorpos produzidos

em coelho) ou proteína G-Sepharose 4MB (para anticorpos produzidos em cabra

ou camundongo). Após o término da incubação e da lavagem, os precipitados

foram ressuspendidos em 25 µL tampão de Laemmli contendo 100 mmol/L de

ditiotreitol e aquecidas em banho seco a 94ºC por 5 minutos. Em seguida, os

extratos proteicos ou as proteínas imunoprecipitadas foram submetidas à

eletroforese em gel de poliacrilamida 6,5-15%-SDS-PAGE em aparelho de

eletroforese (Mini-Protean, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EUA). A

eletrotransferência das proteínas do gel para a membrana foi realizada em 90

minutos a 120 V (constante) em aparelho de transferência da Bio-Rad. A ligação

dos anticorpos a proteínas não-específicas foi reduzida por pré-incubação da

membrana por 1 hora com tampão de bloqueio (5% leite em pó magro, 10 mmol/L

Tris, 150 mmol/L NaCl, e 0,02% Tween-20) à temperatura ambiente. A membrana

de nitrocelulose foi então incubada com anticorpos específicos diluídos em tampão

de incubação (0,3% leite em pó magro, 10 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl, e 0,02%

Tween-20) por 12 horas a 4°C e então lavadas 3 vezes com solução basal (10

mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl e 0,02% Tween-20). Os anticorpos que

reconhecem ANKHD1 (sc-160960), SIVA (sc-7436), GFP (sc-8334), HA (sc-805),

p-Stathmin 1 (sc-12948-R), Stathmin 1 (sc-55531), alfa tubulina (sc-5286), BCL-XL

(sc-8392), BAX (sc-20067), BCL2 (sc-492), YAP1 (sc-101199), SHP2 (sc-280),

34
JAK2 (sc-294), STAT3 (sc-7179), STAT5 (sc-835) e Actina (sc-1616) foram

obtidos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Os anticorpos que

reconhecem p-JNK (44690G), JNK (446826), p-ERK1/2 (44654G) e ERK1/2

(700012) foram obtidos da Life Technologies. Os anticorpos que reconhecem p-

YAP1 (#4911S), p-SHP2 (#3751S), p-JAK2 (#3774S), p-STAT3 (#9131S), p-

STAT5 (#9359S) e caspase 3 (#8G10) foram obtidos da Cell Signaling Technology

(Danvers, MA, EUA). O anticorpo anti-ANKHD1 (A303-306A) foi obtido da Bethyl

Laboratories (Montgomery, TX, EUA), e o anti-acetil-alfa tubulina (ab24610) foi da

Abcam (Cambridge, MA, EUA). O sistema de revelação usado foi baseado em

quimioluminêscencia e realizado de acordo com orientações do fabricante, ECL TM

Western Blot Analysis System (Amersham Pharmacia Biotech, UK). Em suma, as

membranas foram incubadas por 1 hora com o anticorpo secundário, conjugado a

HRP (Horseradish peroxidase), lavadas novamente por três vezes, e então

submetidas ao substrato da enzima, resultando em um produto luminescente,

detectado por autoradiografias em filmes Kodak XAR (Eastman Kodak, Rochester,

NY, EUA) ou pelo aparelho foto-documentador UVItec Cambridge (UVItec Limited,

Cambridge, UK). Análises quantitativas da intensidade das bandas de proteínas

foram determinadas utilizando-se o programa UN-SCAN-IT gel 6.1 (Silk Scientific

Inc., Utah, EUA). A intensidade de expressão proteica foi normalizada pela

expressão da actina e a intensidade da fosforilação proteica foi normalizada pela

expressão da proteína correspondente.

35
3.3.5. Proliferação de linfócitos

Células mononucleares de sangue periférico obtidas através de gradiente

de Ficoll-Hypaque (Sigma) foram mantidas em placas de plástico durante duas

horas. Após esse período, o sobrenadante que contém os linfócitos foi recolhido.

Uma fração dos linfócitos foi incubada com fitohemaglutinina A (PHA) por 72

horas. Após a incubação, os linfócitos induzidos ou não a proliferar foram

submetidos à extração proteica.

3.3.6. Imunofluorescência e microscopia confocal

As linhagens Jurkat e U937 foram cultivadas sobre lamínulas de vidro

previamente tratadas com poli-L-lisina (1 mg/mL), lavadas com PBS e fixadas com

uma solução de paraformaldeído 4%. Em seguida, foram realizados o bloqueio e a

permeabilização das células com uma solução 3% BSA e 0,5% Triton. Os

anticorpos primários anti-ANKHD1 (produzido em cabra; sc-160960; Santa Cruz

Biotechnology) e anti-SIVA1 (produzido em coelho; sc-48767, Santa Cruz

Biotechnology) foram utilizados na diluição 1:200 em solução 3% BSA e incubados

com as células em câmara úmida a 4ºC durante 18 horas. Após 3 lavagens com

PBS, seguiu-se a incubação com os anticorpos secundários marcados com anti-

cabra Alexa488 (produzido em frango) e anti-coelho Alexa633 (produzido em

asno) (Life Technologies) por 2 horas à temperatura ambiente. Anticorpos

primários e secundários de espécies diferentes foram escolhidos para evitar

ligações cruzadas entre eles, uma vez que 4 anticorpos diferentes foram utilizados

em uma mesma reação. As lamínulas foram novamente lavadas com PBS e

36
montadas em lâminas utilizando-se o meio de montagem para fluorescência

(ProLong® Gold com DAPI, da Life technologies). As lâminas foram analisadas

por escaneamento em microscópio Zeiss LSM 780-NLO confocal montado sobre

um microscópio Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss AG, Jena, Alemanha), utilizando-se

a objetiva de 40x de imersão em óleo. Em todos os experimentos foram feitos

controles negativos somente com anticorpo secundário, os quais não

apresentaram fluorescência. A ferramenta do programa ImageJ quantification

(U.S. National Institutes of Health, Bethesda U ) “colocalization finder”

utilizada para a análise de colocalização entre ANKHD1 e SIVA.

3.3.7. Plasmídeos e Tranfecção

Os plasmídeos pEGFPC1, pEGFPC1-SIVA1 e pEGFPC1-SIVA2 foram

gentilmente cedidos pelo Dr. Serge Benichou (Institut Cochin, Université Paris

Descartes, Paris, França.) [108]. O plasmídeo pcDNA3-3HA-ANKHD1 foi

gentilmente cedido pelo Dr. Nahum Sonenberg (Biochemistry Dept., McGill

University, Montreal, Canadá) [25]. Células HEK293T foram semeadas em placas

p100 (106 células/placa) em meio de cultura DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's

Médium; Gibco, Rockville, MD, EUA) com 10% de soro fetal bovino (SFB) (Gibco,

Rockville, MD, EUA). Após 12-16 horas, seguiu-se transfecção utilizando-se o

reagente fosfato de cálcio. O meio de cultura foi substituído por DMEM 5% SBF e

a cada placa foram adicionados 8 µg de cada plasmídeo em solução contendo 450

µL de água, 30 µL de CaCl2 2,5M e 500 µL de solução de HEBES 2x. As células

foram coletadas após 24 horas de transfecção e submetidas à extração de

proteína.

37
3.3.8. Produção de lentivírus

O kit BLOCK-iT Lentiviral RNAi Expression System (Life Technologies)

foi utilizado para a produção de vetores de lentivírus para a transferência do short

hairpin RNA (shRNA) específico para ANKHD1 (shANKHD1) ou um shRNA

controle (LacZ). As sequências-alvo são descritas na Tabela 4. ShRNA é uma

classe artificial de RNA que leva ao silenciamento gênico através da interação

com componentes celulares comuns das vias de iRNA e miRNA. O sistema

BLOCK-iT contém o vetor U6 RNAi para a produção do clone expressando a

sequência de dupla fita do shRNA de interesse.

Tabela 4. Sequências alvo usadas para shRNA.

Gene Sequência Alvo
ANKHD1 TGTCCGAGGTTGAATCATTTT
LacZ CTACACAAATCAGCGATTT

A produção do vetor foi feita de acordo com as instruções do fabricante.

O nível de biossegurança 2 é o sugerido para trabalhar com esses vetores, de

acordo com o NIH (National Institutes of Health). Além da sequência de inibição, a

construção possui gene de resistência a um antibiótico, possibilitando a seleção

das células transduzidas; o vetor lentiviral que foi produzido pelo sistema BLOCK-

iT Lentiviral RNAi Expression System confere a resistência à blasticidina. A

concentração da blasticidina utilizada para os experimentos foi a mesma descrita

na literatura como ideal para linhagens celulares leucêmicas,10 µg/mL [109]. Os

lentivírus foram titulados em células HT1080, que, após 15 dias de seleção com

blasticidina, foram coradas com violeta cristal. As colônias foram contadas nas

38
diferentes diluições do lentivírus (Figura 9), gerando o MOI (número de partículas

lentivirais por célula; multiplicity of infection).

Figura 9. Titulação dos lentivírus em células HT1080, coradas com violeta cristal. A:
diluição 1:2, B: diluição 1:50, C: diluição1:100, D: diluição 1:1000, E diluição 10000 e F:
ausência de lentivírus.

As partículas lentivirais constituídas de um conjunto de 4 sequências

diferentes para cada gene de interesse foram obtidas da Santa Cruz Bitechnology,

incluindo partículas lentivirais para inibição de SIVA (shSIVA; sc-37385-V),

Stathmin 1 (shSTMN1; sc-36127-V) e uma sequência controle (shControle; sc-

108080).

3.3.9. Transdução de lentivírus

Linhagens celulares leucêmicas foram transduzidas com lentivírus contendo

shRNA controle (que não reconhece nenhum gene humano) ou shRNA tendo

como alvo um gene específico. Resumidamente, 2x105 células foram transduzidas

com lentivírus através da técnica de inoculação por centrifugação, que consiste

em centrifugar as células por 60 minutos a 800 x g na presença de 3 µg/mL de

39
polibrene (Sigma). O MOI utilizado foi igual ou superior a 2. Após a transdução, as

células foram selecionadas com 0,75 - 1 μg/ L p (S g ) p

S C 10 μg/ L b (L T g ) por

pelo menos 10 dias antes dos experimentos. A efetividade do silenciamento das

proteínas de interesse foi testada através de qPCR e western blotting. Células

silenciadas para as proteínas de interesse e células-controle foram submetidas

aos experimentos funcionais.

3.3.10. Ensaios de Migração

Os ensaios de migração foram efetuados em duplicata, utilizando placas

transwell com poros de tamanho de 8 m (Corning Costar, Cambridge, MA, EUA).

Essas placas são compostas por dois compartimentos: um inferior, onde são

colocados os quimioatrativos, e um superior, onde são colocadas as células. As

placas transwell foram inicialmente lavadas duas vezes com PBS e bloqueadas

durante 1 hora a 37°C com meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute; Gibco,

Rockville, MD, EUA) suplementado com 0,5% de BSA (albumina sérica bovina). O

compartimento inferior foi preenchido com 500 L de RPMI contendo 10% de soro

fetal bovino (SFB), 0,5% BSA ou 0,5% BSA mais 200 ng/mL de CXCL12. As

células (1x105 em 100 L) foram aplicadas ao compartimento superior e mantidas

na estufa a 300C, 5% CO2, durante 24 horas. As células que migraram foram

contadas e expressas como uma percentagem das células inicialmente colocadas

no ensaio.

40
3.3.11. Ensaio de Methylthiazoletetrazolium (MTT)

A viabilidade celular foi mensurada através do ensaio de

Methylthiazoletetrazolium (MTT; Sigma). Para privação de SFB, células foram

cultivadas em meio RPMI contendo 0,5% SFB por 12 horas. Um total de 2,5 x 104

células por poço foram semeadas em uma placa de 96 poços em 100 µL de meio

RPMI contendo 10% SFB. Em resumo, 10 µL de uma solução a 5 mg/mL de MTT

foram adicionadas aos poços e incubadas a 37ºC por 4 horas. A reação foi parada

pela adição de 100 μL 0 1N HC p p A viabilidade celular foi

avaliado pela mensuração da absorbância a 570 nm, utilizando um leitor

automático de placas. Todas as condições foram testadas em seis replicatas.

3.3.12. Ensaio de formação de colônia

A formação de colônias foi realizada em meio semissólido de metilcelulose

(0,5 x 103 células/mL; MethoCult 4230; StemCell Technologies Inc., Vancouver,

Canadá). As colônias foram detectadas após 8 dias de cultura pela adição de 1

mg/mL de reagente MTT e as contagens foram realizadas com o auxílio do Image

J quantification software (U.S. National Institutes of Health). Todas as condições

foram testadas em duplicatas.

3.3.13. Indução de apoptose com exposição à radiação UV

Células foram semeadas em placas de 12 poços e submetidas a uma única

exposição na dose de radiação UV de 40 J/m 2. A células foram coletadas nos

tempos de 0, 3, 6 e 12 horas após a exposição e submetidas à avaliação de

apoptose.

41
3.3.14. Avaliação de apoptose por marcação com anexina-V e PI

As células foram lavadas duas vezes com PBS gelado e ressuspendidas

em tampão de ligação conten 1μg/ L I 1μg/ L FITC ou APC anexina-

V (Becton–Dickinson, CA, EUA). Após incubação no escuro durante 15 minutos

em temperatura ambiente, todas as amostras foram analisadas em um

FACSCalibur (Becton–Dickinson). Dez mil eventos foram adquiridos para cada

amostra.

3.3.15. Avaliação de apoptose pelo ensaio de TUNEL

O kit utilizado foi APO-BrdUTM TUNEL Assay (Life Technologies) e os

procedimentos foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. Em

resumo, as células (2X106) foram lavadas com PBS, fixadas com 5 mL de PBS

paraformaldeído 1% no gelo por 15 minutos, seguida de uma nova lavagem com

PBS. Após a fixação, as células foram armazenadas por pelo menos 18 horas em

5 mL de etanol 70% à -20ºC. Em seguinda, as células foram centrifugadas e

lavadas duas vezes com o tampão de lavagem e resupendidas em uma reação

que continha: 0,75 L da enzima TdT, 8 L de BrdUTP e 31,25 L de água. A

reação foi incubada por 60 minutos à 37ºC. Ao fim da reação as células foram

lavadas duas vezes com tampão de enxágue, ressuspendidas em 95 L de

tampão de enxágue e 5 L Alexa Fluor 488 anti-BrdU e incubada por 30 minutos à

temperatura ambiente no escuro. As amostras foram analisadas em um

42
FACSCalibur (Becton–Dickinson). Dez mil eventos foram adquiridos para cada

amostra.

3.3.16. Modelo de xenoenxerto de células U937 em camundongos NOD/SCID

Os camundongos foram fornecidos pelo Centro Multidiciplinar para

Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratórios (CEMIB)

da Universidade Estadual de Campinas. Os grupos experimentais consistiram de

camundongos NOD/SCID fêmeas entre 6 e 8 semanas de idade. Células U937

(1x107) tranduzidas com shControle, shANKHD1, shSIVA, ou shANKHD1 e

shSIVA foram p 100 μL S e implantadas por injeção

subcutânea na região dorsal dos camundongos. Após 12 dias, os tumores foram

removidos, medidos e pesados. As medições do tumor foram convertidas para o

volume do tumor (V) por meio da fórmula (V = W2 x L x 0,52), em que W e L são

os menores e maiores diâmetros, respectivamente [25]. Todos os experimentos

foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Campinas (Protocolo

CEUA nº 3288-1, Anexo III).

3.3.17. Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Instat 5

(GraphPad Software, Inc., CA, EUA) ou SAS System for Windows 9.2 (SAS

Institute, Inc., NC, EUA). Para as comparações, foi utilizado o teste exato de

Fisher para variáveis categóricas com dois níveis. Foram utilizados o teste t de

Student ou o teste de Mann-Whitney para fatores mensuráveis, conforme

apropriado. Análise de correlação de Spearman foi utilizada para os testes de

43
correlação. O teste Log-rank (Mantel-Cox) foi utilizado para as estimativas de

sobrevida global (SG) e sobrevida livre de eventos (SLE). SG foi definida a partir

do tempo de coleta da amostra até a data do óbito; os pacientes vivos foram

censurados na data da última avaliação. Para pacientes com SMD, SLE foi

definida como o intervalo de tempo entre a coleta da amostra e a data de

progressão de SMD (AR/ARSA/del(5q)/CRDM para AREB-1, AREB-2 e/ou LMA,

AREB-1 para AREB-2 e/ou LMA, ou AREB-2 para LMA com alterações

mielodisplásicas) ou a data do óbito; os pacientes vivos e que não apresentaram

progressão da doença foram censurados na data da última avaliação. Um valor de

P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

44
4. RESULTADOS

4.1. Investigação da interação entre ANKHD1 e SIVA e da relevância

funcional desta interação proteica no fenótipo leucêmico

4.1.1. ANKHD1 associa-se com SIVA

A associação de ANKHD1 com SIVA1 e SIVA2 sugerida pelo ensaio de

duplo híbrido realizado anteriormente pelo nosso grupo de pesquisa [38] foi

confirmada in vivo utilizando células HEK293T coexpressando as proteínas

ANKHD1-HA e SIVA1-GFP ou SIVA2-GFP. Os extratos proteicos foram

imunoprecipitados com anticorpo anti-GFP e submetidos a immnoblotting (IB) com

anti-HA. A imunoprecipitação (IP) com anti-GFP em extratos coexpressando as

proteínas ANKHD1-HA e GFP foi utilizada como controle negativo (Figura 10A). A

interação das proteínas endógenas foi verificada por IP e IB com anticorpos

específicos para ANKHD1 e SIVA em extratos proteicos da linhagem celular

leucêmica humana U937 (Figura 10B). Adicionalmente, análise de microscopia

confocal revelou a colocalização das proteínas ANKHD1 e SIVA no citoplasma de

células leucêmicas humanas U937 e Jurkat (Figura 10C).

45
Figura 10. ANKHD1 associa-se com SIVA. (A) Imunoprecipitação (IP) e Immunoblotting (IB) de
lisados de HEK293T coexpressando ANKHD1-HA e SIVA1-GFP ou SIVA2-GFP com anticorpos
específicos. (B) Imunoprecipitação (IP) e Immunoblotting (IB) de lisados de células U937 com o
anticorpo anti-ANKHD1 ou anti-SIVA. Extrato de proteína total (input) e anticorpos IgG isotipo
foram utilizados como controles. (C) Análise confocal de células U937, Jurkat e Namalwa
marcando: SIVA (verde), ANKHD1 (vermelho) e DAPI (azul); MERGE indica as imagens
sobrepostas. A análise de colocalização foi realizada através do uso da ferramenta "colocalization
finder" do software ImageJ NIH e evidencia a colocalização de ANKHD1 e SIVA (pontos brancos).
Os valores do coeficiente de correlação (r) da colocalização estão indicados.

46
4.1.2. ANKHD1 e SIVA têm efeitos opostos na migração e na ativação de

Stathmin 1 em células leucêmicas

Apesar da participação de ANKHD1 no fenótipo neoplásico não ter sido

elucidada até o momento da realização deste trabalho, a participação de SIVA em

processos celulares e na inibição de Stathmin 1 já havia sido verificada em

tumores sólidos [41]. Para investigarmos a participação de ANKHD1 no fenótipo

neoplásico, através de sua interação com SIVA, nosso próximo passo foi realizar

experimentos funcionais para verificar o efeito do silenciamento de ANKHD1 nos

processos celulares modulados por SIVA, incluindo migração, proliferação e

apoptose celular e atividade de Stathmin 1 em modelos de células de LMA (U937)

e LLA (Jurkat). Em paralelo, realizamos experimentos para comprovar a

participação de SIVA nos mesmos modelos celulares utilizados para os estudos

de ANKHD1. As linhagens U937 e Jurkat foram transduzidas estavelmente com

lentivírus contendo shRNA que tinha como alvo ANKHD1 (shANKHD1), SIVA

(shSIVA) ou um controle apropriado (shControle). Após seleção com antibiótico,

foi obtido um silenciamento eficiente, como pode ser observado através da

diminuição dos níveis de mRNA e proteína de ANKHD1 e SIVA1, determinados

por qPCR e Western blot, respectivamente (Figura 11).

47
Figura 11. Silenciamento eficiente de ANKHD1 e SIVA em células U937 e Jurkat. Células
leucêmicas mieloides U937 e linfoides Jurkat foram transduzidas com lentivírus contendo shRNA
controle (shControle) ou shRNA tendo como alvo ANKHD1 (shANKHD1) ou SIVA (shSIVA). Níveis
de mRNA (A) e proteína (B) de ANKHD1 em células shANKHD1 relativos às células shControle.
Níveis de mRNA (C) e proteína (D) de SIVA1 em células shSIVA relativos às células shControle.
Os anticorpos utilizados para immunoblotting (IB) estão indicados.

Ensaios de migração através de transwell revelaram que o silenciamento de

ANKHD1 reduziu a capacidade de migração celular de células U937 e Jurkat

quando estimuladas com SFB ou CXCL12 (P<0.05; Figura 12A). Em contraste, foi

observado um aumento significativo na migração celular em células shSIVA

quando comparadas às células shControle (P<0.05; Figura 12B).

A inibição de ANKHD1 resultou na redução da ativação de Stathmin 1

(aumento da fosforilação no sítio serina 16) e na maior acetilação da alfa-tubulina

quando comparada às células shControle (Figura 12C). Por outro lado, a inibição

de SIVA resultou na ativação de Stathmin 1 (diminuição da fosforilação no sítio

serina 16) e na desacetilação da alfa-tubulina (Figura 12D), indicando

48
desestabilização dos microtúbulos e maior capacidade de migração. A seguir, nós

investigamos se ANKHD1 modula a interação entre SIVA/Stathmin 1. Em células

U937, o silenciamento de ANKHD1 aumentou a associação entre SIVA/Stathmin 1

(Figura 12E). Notavelmente, nós observamos que o silenciamento de ANKHD1

apresenta um fenótipo similar ao previamente descrito para a inibição de Stathmin

1 em relação a proliferação, clonogenicidade e apoptose em células leucêmicas

BCR-ABL1 positivas K562 [75,84], e comprovamos que a inibição de Stathmin 1

induziu establidade dos microtúbulos através da avaliação da acetilação da alfa-

tubulina em células leucêmicas U937(Figura 12F).

49
Figura 12. O silenciamento de ANKHD1 e SIVA tem efeito oposto na migração de células
leucêmicas e na ativação de Stathmin 1. Ensaios de migração transwell de células U937 e Jurkat
submetidas à transdução com shControle, shANKHD1 (A) ou shSIVA (B) na presença de 0,5% BSA,
10% FBS or 200 ng/mL de CXCL12. Os resultados representam a média±DP de pelo menos três
experimentos independentes; *P<0,05; **P<0,01; teste t Student. Análise por Western blot da
fosforilação da Stathmin 1 e acetilação de alfa-tubulina em células U937 e Jurkat submetidas à
transdução com shControle, shANKHD1 (C) or shSIVA (D). Immunoprecipitação (IP) de SIVA e
immunoblotting (IB) com anti-Stathmin 1 em células shControle e shANKHD1; extrato proteico total
(input) foi usado como controle (E). Análise por Western blot para Stathmin 1 e acetilação de alfa-
tubulina em células shControle e shSTMN1 (F). As linhagens leucêmicas utilizadas estão indicadas.

50
4.1.3. ANKHD1 não modula a apoptose induzida por UV em células

leucêmicas

Utilizando o modelo de apoptose induzida por radiação UV, o silenciamento

de ANKHD1 não modulou a apoptose em células U937 e Jurkat e não modulou a

expressão de proteínas relacionadas à apoptose: BCL-XL, BAX, BCL2 e p-JNK

(Figura 13A). Em células U937 expostas à radiação UV, o silenciamento de SIVA

resultou em uma redução significativa na resposta à apoptose quando comparada

às células shControle (P<0,05) (Figura 13B). Adicionalmente, em células U937, a

inibição de SIVA resultou na diminuição da fosforilação de JNK e da expressão de

BAX, e em um aumento da expressão de BCL-XL (Figura 14), indicando uma

menor sensibilidade à apoptose. O silenciamento de SIVA não modulou a

sensibilidade à apoptose (Figura 13B) e não modulou as proteínas apoptóticas em

células Jurkat expostas à UV (Figura 14B).

51
Figura 13. ANKHD1 não modula a apoptose induzida por radiação UV em células
leucêmicas. A apoptose foi detectada por citometria de fluxo em células U937 e Jurkat
transduzidas com shControle, shANKHD1 (A) e shSIVA (B) após a exposição com radiação UV (40
2
J/m ) usando método de marcação com Anexina-V/iodeto de propridío (IP). As barras indicam o
número relativo (%) de células viáveis (Anexina- −/I −) apoptóticas (Anexina- +/I −)
necróticas (Anexina-V+/IP+ mais Anexina- −/I +), e representam a média de pelo menos três
experimentos independentes; *P<0,05; ***P<0,001 teste t Student.

Figura 14. ANKHD1 não modula a expressão e a ativação de proteínas relacionadas com a
apoptose. Análise por Western blot da expressão de BCL-XL, BAX, BCL2 e p-JNK em extrato
celular de células shControle, shANKHD1 (A) e shSIVA (B). As linhagens leucêmicas utilizadas
estão indicadas.

52
4.1.4. ANKHD1 modula proliferação e clonogenicidade de células leucêmicas

As evidências da participação de SIVA, mas não de ANKHD1, na apoptose

de células leucêmicas U937 e Jurkat, aliadas às evidências da modulação da

atividade de Stathmin 1 por ANKHD1, nos instigaram a investigar a participação

de ANKHD1 na proliferação celular, que sabidamente pode ser modulada por

Stathmin 1 através da sua atuação na dinâmica de microtúbulos [67]. Dados de

nosso grupo de pesquisa obtidos em estudos utilizando células de

adenocarcinoma de próstata [42] corroboraram a nossa hipótese de que ANKHD1

modula a proliferação celular. Desta forma, nós investigamos o papel de ANKHD1

e SIVA na proliferação e na clonogenicidade de células U937 e Jurkat in vitro. A

proliferação e o crescimento clonal foram significativamente reduzidos em células

shANKHD1 quando comparados às células shControle (P<0.05). No entanto, o

silenciamento de SIVA não modulou a proliferação e a clonogenicidade in vitro

nestes modelos celulares (Figura 15).

53
Figura 15. ANKHD1, mas não SIVA, modula a proliferação celular de células leucêmicas in
vitro. A proliferação foi determinada pelo ensaio de MTT após 48 horas de incubação de células
shANKHD1 (A) ou shSIVA (B) através de comparação com as células shControle. Os resultados
estão respresentados como média±DP de seis replicatas, sendo estas representativas de pelo
menos três experimentos independentes; *P<0,05; **P<0,01; Teste de Mann–Whitney. Colônias
contendo células viáveis foram detectadas por MTT após 8 dias de cultura de células shANKHD1
(C) ou shSIVA (D), e normalizadas pelas células shControle correspondentes. Os resultados estão
respresentados como média±DP de pelo menos três experimentos independentes; **P<0,01;
***P<0,001; teste t Student.

4.1.5. ANKHD1 e SIVA têm efeitos opostos no crescimento tumoral de

células leucêmicas in vivo

Nosso próximo passo foi avaliar o efeito do silenciamento de ANKHD1 e

SIVA na formação de tumor de células leucêmicas U937 in vivo. A formação de

tumor xenográfico é um processo de múltiplas etapas que envolve apoptose e

proliferação celular, processos regulados por SIVA ou ANKHD1 no modelo celular

U937.

Células U937 transduzidas estavelmente com shANKHD1, shSIVA,

shANKHD1/shSIVA ou shControle foram implantadas em camundongos

NOD/SCID fêmeas por injeção subcutânea, e os tumores foram avaliados após 12

54
dias de crescimento. ANKHD1 e SIVA tiveram efeitos opostos no crescimento

tumoral in vivo. Enquanto a inibição de ANKHD1 resultou em uma redução

significativa do crescimento tumoral de células leucêmicas in vivo (P<0.05, Figura

16A), o silenciamento de SIVA potencializou o crescimento tumoral de células

leucêmicas (P<0.05; Figura 16B). Fato interessante foi que o efeito de ANKHD1 ou

SIVA foi perdido quando as duas proteínas foram silenciadas simultaneamente

(Figura 16C), sugerindo que ambas podem estar envolvidas em uma mesma via

de sinalização, e que o fenótipo do silenciamento de ANKHD1 depende da

presença de SIVA.

Figura 16. ANKHD1 e SIVA têm efeitos opostos na formação de tumores de xenoenxerto de
células U937 em camundongos NOD/SCID. Medição do tumor (volume e peso) 12 dias após a
injeção de células shANKHD1 (A), shSIVA (B), shANKHD1/shSIVA (C) versus shControle via
subcutânea em camundongos fêmeas NOD/SCID. O volume do tumor (V) foi calculado utilizando a
2
fórmula (V = W x L x 0,52), em que W e L são os diâmetros menor e maior, respectivamente.
Número de animais está indicado; *P<0,05; **P<0,01; teste de Mann-Whitney.

55
4.1.6. O silenciamento de ANKHD1 não modula as vias de sinalização Hippo,

SHP2 e JAK2/STAT em células leucêmicas

Nossos resultados indicam a participação funcional de ANKHD1 no fenótipo

neoplásico de células U937 e Jurkat através da participação de ANKHD1 na via de

sinalização SIVA e Stathmin 1. Entretanto, estudos recentes descreveram que

ANKHD1 e/ou sua proteína ortóloga Mask (Multiple Ankyrin Repeats Single KH

domain) estão envolvidas na sinalização mediada por YAP1 (ortólogo de Yorkie;

yki) [42,43,44], SHP2 (ortólogo de Corkscrew; csw) [28] e JAK2 (ortólogo de

Hopscotch; hop) [46] em outros modelos celulares. Tais evidências nos induziram

a investigar a ativação destas vias de sinalização e o efeito do silenciamento de

ANKHD1 na modulação destas vias de sinalização nos modelos celulares U937 e

Jurkat. Entretanto, nós observamos que essas vias de sinalização não são

ativadas e não são moduladas pela inibição de ANKHD1 em células U937 e Jurkat

(Figura 17). Desta forma, concluímos que os efeitos do silenciamento de ANKHD1

na proliferação e no crescimento clonal de células leucêmicas Jurkat e U937 não

estão relacionados com as vias de sinalização Hippo, SHP2 ou JAK2/STAT.

56
Figura 17. A inibição de ANKHD1 não modulou a ativação das vias de sinalização Hippo,
SHP2 ou JAK2/STAT em células leucêmicas. Análises por Western blot para expressão e
fosforilação de proteínas da via sinalização Hippo (YAP1), SHP2 (SHP2 e ERK1/2), e JAK2/STAT
(JAK2, STAT3 e STAT5) foram realizados em extratos proteicos provenientes de células
shControle e shANKHD1; os anticorpos usados para immunoblotting (IB) estão indicados. As
linhagens celulares usadas estão indicadas. Extratos proteicos de células DU145 (para via Hippo)
e HEL (para vias SHP2 e JAK2/STAT) foram utilizadas como controle positivo.

4.2. Investigação da expressão de YAP1 em células hematopoéticas

neoplásicas

Apesar de não termos observado modulação da expressão e fosforilação de

YAP1 em células leucêmicas U937 e Jurkat silenciadas para ANKHD1, a

identificação da interação entre YAP1 e ANKHD1 em Drosophila melanogaster foi

valorizada na literatura científica [43,44,45,110], fato que nos instigou a investigar

a expressão de YAP1 em outros modelos celulares leucêmicos e em células

hematopoéticas primárias normais e neoplásicas obtidas de pacientes com

diagnóstico de SMD, LMA e LLA. A expressão da proteína YAP1 foi encontrada

57
em apenas 2 das 14 linhagens de células leucêmicas estudadas, e nenhuma

expressão foi observada em células mononucleares de sangue periférico normal

(Figura 18A). Em células primárias de medula óssea de indivíduos normais e

pacientes com SMD, LMA e LLA, a expressão do gene YAP1 foi encontrada em

48 das 121 amostras testadas. A frequência de expressão YAP1 não diferiu

significativamente entre os pacientes com neoplasia hematológica e doadores

saudáveis (6/22 [27%] dos doadores saudáveis, 24/42 [60%] dos pacientes com

SMD, 22/42 [52%] dos pacientes com LMA, 5/15 [33%] dos pacientes com LLA,

P>0,05, teste exato de Fisher) (Figura 18B). Entre os indivíduos que

apresentavam expressão de YAP1, não foram observadas diferenças nos níveis

de mRNA entre doadores normais (mediana: 7,10 [mínimo-máximo: 0,06-615,60]),

pacientes com SMD (9,90 [0,02-260,84]), LMA (8,40 [0,01-25,48]) e LLA (8,30

[2,64-11,37]), P>0,05 (Figura 18C). Quando os pacientes com SMD foram

estratificados pela classificação da OMS 2008, não foram observadas diferenças

na expressão de YAP1 em relação ao percentual de amostras positivas (58% vs.

67%) ou nos níveis de mRNA (9,55 [0,02-260,85] vs. 10,43 [3,64-74,80]) entre as

amostras provenientes de pacientes com SMD AR/ARSA/del(5q)/CRDM vs.

AREB-1/AREB-2. Para confirmar a presença e a especificidade da expressão de

YAP1, os fragmentos resultantes da qPCR foram separados por eletroforese, e as

células HeLa foram utilizadas como controle positivo (Figura 18D).

58
Figura 18. Expressão de YAP1 em células normais, mielodisplásicas e leucêmicas. (A)
Análise da expressão proteica de YAP1 por Western blotting em células mononucleares do sangue
periférico (CMSP) de doadores normais e em linhagens leucêmicas. Os anticorpos utilizados para
immunoblotting (IB) estão indicados. (B) O gráfico de barras indica as porcentagens de amostras
positivas para a expressão do gene YAP1 por PCR quantitativo (qPCR) em doadores saudáveis e
em pacientes com síndromes mielodisplásicas (SMD), leucemia mieloide aguda (LMA) e leucemia
linfoide aguda (LLA). O número total de amostras e porcentagem de amostras positivas e
negativas para YAP1 estão indicados na figura. (C) O gráfico de dispersão ilustra os níveis de
mRNA de YAP1 para os indivíduos que apresentaram expressão de YAP1 (P>0,05, teste de Mann-
Whitney). O número de indivíduos é indicado na figura e as linhas horizontais representam a
mediana. (D) Eletroforese em gel de agarose representativa dos fragmentos gerados pela qPCR
dos genes YAP1 e HPRT. Uma reação sem adição de cDNA foi utilizada como controle negativo
(N), e cDNA de células HeLa foi utilizado como controle positivo.

59
4.3. Investigação da expressão e participação funcional de Stathmin 1 em

síndromes mielodisplásicas e leucemias agudas

4.3.1. Stathmin 1 é altamente expressa em células hematopoéticas em

proliferação

As evidências da participação de ANKHD1 no fenótipo neoplásico através

da sua interação com SIVA e da modulação da atividade de Stathmin 1 induziram-

nos a melhor investigar a participação de Stathmin 1 em neoplasias

hematológicas. Apesar da expressão aberrante de Stathmin 1 já ter sido relatada

em leucemias e linfomas [111], o conhecimento sobre a expressão de Stathmin 1

em outras neoplasias hematológicas ainda era limitado no momento do

desenvolvimento deste trabalho. Do ponto de vista funcional, a participação de

Stathmin 1 está bem elucidada e caracterizada em uma grande variedade de

tumores sólidos [67]; entretanto, em neoplasias hematológicas, as consequências

funcionais da inibição de Stathmin 1 haviam sido investigadas apenas em células

K562 [75,84].

Através das técnicas de qPCR e Western blotting, observamos uma

expressão elevada de Stathmin 1 em todas as linhagens celulares leucêmicas

analisadas quando comparadas às células mononucleares de sangue periférico

normal (CMSP) (Figura 19A-B) e quando comparadas aos linfócitos, monócitos e

granulócitos normais (Figura 19C), que constituem células hematopoéticas com

baixa taxa de proliferação. Observamos um aumento significativo na expressão de

Stathmin 1 em linfócitos de sangue periférico induzidos a proliferar com tratamento

60
com fitohemaglutinina (PHA) durante 72 horas (Figura 19D). Estes resultados

estão de acordo com relatos anteriores que evidenciaram que Stathmin 1 é

altamente expressa em tumores e células leucêmicas [67,83], e durante a

proliferação de células normais induzida com mitógenos [112].

Figura 19. A expressão de Stathmin 1 é aumentada em células hematopoéticas em

proliferação. (A) Análise da expressão de mRNA de Stathmin 1, através de qPCR, em células
mononucleares do sangue periférico (CMSP) normais e em linhagens celulares leucêmicas. (B)
Análise da expressão da proteína Stathmin 1 por Western blotting em células hematopoéticas
normais e em linhagens celulares leucêmicas, (C) em CMSP normais, linfócitos do sangue
periférico (LSP), monócitos do sangue periférico (MSP) e granulócitos do sangue periférico (GSP)
e (D) em LSP tratados com fitohemaglutinina (PHA). Os anticorpos utilizados para immunoblotting
(IB) estão indicados na figura.

61
4.3.2. Elevada expressão de Stathmin 1 em células de medula óssea de

pacientes com SMD AREB-1/AREB-2, LMA e LLA

Nosso próximo passo foi determinar a expressão de Stathmin 1 em células

da medula óssea de doadores saudáveis e de pacientes com SMD, LMA e LLA,

utilizando qPCR. Os transcritos de Stathmin 1 foram significativamente

aumentados em células provenientes de LMA e LLA em comparação com as

células hematopoéticas normais (mediana: 2,02 [mínimo-máximo: 0,25-8,88]; 3,61

[1,16-10,82] vs. 1,01 [0,38-4,08], respectivamente, P<0,001), mas não houve

diferença na expressão de Stathmin 1 entre doadores saudáveis e pacientes com

SMD (Figura 20A). Quando o grupo de SMD foi estratificado pela classificação da

OMS 2008, foi observado um aumento significativo da expressão de Stathmin 1 no

grupo de SMD AREB-1/AREB-2 quando comparado com o grupo de SMD

AR/ARSA/del(5q)/CRDM (1,70 [0,42-3,28] vs. 1,11 [0,11 -2,61], P=0,01) (Figura

20B). Resultados semelhantes foram encontrados em células CD34 + isoladas da

medula óssea: a expressão de Stathmin 1 foi significativamente aumentada em

células CD34+ provenientes de LMA em comparação com células CD34 + normais

(3,23 [1,79-4,96] vs. 1,31 [0,22-2,37], P=0,007) e provenientes de SMD AREB-

1/AREB-2 vs. AR/ARSA/del(5q)/CRDM (2,42 [1,52-3,13] vs. 1,13 [0,60-2,01],

P=0,02) (Figura 20C-D). Um achado interessante foi o fato de 3 dos 5 pacientes

com SMD apresentarem um aumento marcante na expressão de Stathmin 1 após

a progressão da doença (Figura 20E).

62
 +
Figura 20. Elevada expressão de Stathmin 1 em células totais e CD34 de medula óssea
de pacientes com SMD AREB-1/AREB-2 e leucemia aguda. (A) Análise por qPCR dos
níveis de mRNA de Stathmin 1 em células totais da medula óssea de doadores saudáveis e de
pacientes com diagnóstico de síndrome mielodisplásica (SMD), leucemia mieloide aguda
(LMA) e leucemia linfoide aguda (LLA) e (B) pacientes com SMD estratificados de acordo com
a classificação da Organização Mundial de Saúde (OMS) 2008. (C) Análise por qPCR dos
+
níveis de mRNA de Stathmin 1 em células CD34 da medula óssea de doadores saudáveis e
de pacientes com diagnóstico de SMD e LMA, (D) pacientes com SMD estratificados de
acordo com a classificação OMS 2008. O número de indivíduos incluídos no estudo e os
valores de P (teste de Mann-Whitney) estão indicados nos gráficos. (E) Expressão de
Stathmin 1 em células totais de medula óssea de cinco pacientes com SMD no momento do
diagnóstico e da progressão da doença. O gráfico de barras representa a média±DP de três
análises por qPCR.

63
 Para melhor avaliar a correlação da expressão de Stathmin 1 com o

fenótipo clínico e a progressão da doença, pacientes com SMD foram divididos em

dois grupos com base em tercil dos níveis de expressão de Stathmin 1. Alta

expressão de Stathmin 1 foi definida pelo tercil mais alto (mediana: 1,89; mínimo-

máximo: 1,67-3,28); baixa expressão de Stathmin 1 foi definida pelos dois tercis

inferiores (1,05; 0,11-1,58). Os pacientes com SMD do grupo de alta expressão de

Stathmin 1 tiveram uma predominância maior no grupo de AREB-1/AREB-2 (OMS

2008), no grupo de risco intermediário-2 e alto (IPSS), e alta porcentagem de

blastos na medula óssea, em comparação com pacientes no grupo de baixa

expressão de Stathmin 1 (P<0,04; Tabela 5). Corroborando esses achados, foi

observada uma correlação positiva entre a porcentagem de blastos na medula

óssea e a expressão de Stathmin 1 nos pacientes com SMD (r=0,30, P=0,01; teste

de correlação de Spearman). Em nossa coorte de pacientes com SMD, os fatores

clínicos associados significativamente com a SLE e SG foram: a estratificação de

risco pela OMS 2008, IPSS, hemoglobina, contagem de leucócitos e neutrófilos no

sangue periférico e porcentagem de blastos na medula óssea (P<0,02; Tabela 6).

Entretanto, a expressão de Stathmin 1 não foi identificada como marcador

prognóstico na coorte de pacientes com SMD estudada. A análise multivariada

evidenciou que os grupos AREB-1/AREB-2 da classificação OMS 2008 (Hazard

ratio: 2,94; IC95%: 1,02-8,44 P=0,04), alto risco pelo IPSS (6,68; 2,19-20,36;

P=0,0008) e hemoglobina <10 g/dL (2,73; 1,03-7,29; P=0,04) foram fatores

independes de pior SLE, enquanto que alto risco pelo IPSS (13,93; 4,74-40,94;

P<0,0001) e hemoglobina <10 g/dL (4,69; 1,72-12,79; P=0,02) foram fatores

independes de pior SG.

64
Tabela 5. Características clínicas e laboratoriais dos pacientes com SMD
estratificados de acordo com a expressão de Stathmin 1
Alta expressão Baixa expressão
Fatores de Stathmin 11 de Stathmin 11 P2
n=20 n=41
Gênero, n (%)
Masculino 10 (50) 24 (59)
Feminino 10 (50) 17 (41) 0,59
Idade, mediana (intervalo) 69 (40-85) 69 (16-87) 0,95
Blastos na MO, mediana %
5 (0-17) 2 (0-16) 0,15
(intervalo)
Idade no momento da coleta
< 60 4 (20) 13 (32)
≥ 60 16 (80) 28 (68) 0,38
Estratificação pela OMS 2008, n (%)
AR/ARSA/del(5q)/CRDM 10 (50) 34 (83)
AREB-1/AREB-2 10 (50) 7 (17) 0,01
Estratificação pela IPSS3, n (%)
Baixo/Intermediário-1 13 (68) 37 (92)
Intermediário-2/Alto 6 (32) 3 (8) 0,02
3
Grupos de risco citogenético , n
(%)
Baixo 19 (84) 34 (85)
Intermediário/Alto 3 (16) 6 (15) 1,0
Dados do hemograma, mediana
(intervalo)
Hemoglobina, g/dL 8,9 (3-13,5) 9,5 (7,1-14,5) 0,18
9
Leucócitos, x10 /L 3,6 (0,9-10,6) 3,1 (1,2-11,7) 0,53
Neutrófilos, x109/L 1,3 (0,2-5,7) 1,4 (0,2-9,1) 0,79
9
Plaquetas, x10 /L 109 (6,7-589) 124 (9-499) 0,97
Blastos na MO, %
<5 10 (50) 34 (83)
≥5 10 (50) 7 (17) 0,014
<10 14 (70) 38 (93)
≥ 10 6 (30) 3 (7) 0,045
1
Pacientes com SMD foram categorizados em dois grupos de acordo com a expressão de
Stathmin 1; alta expressão de Stathmin 1 (tercil superior) e baixa expressão de Stathmin 1 (dois
tercis inferiores).
2
O teste exato de Fisher e teste de Mann–Whitney foram utilizados para variáveis categóricas e
numéricas, respectivamente.
3
Metáfases ausentes em dois pacientes.
4
Comparação de pacientes com porcentagem de blastos na medula óssea <5 vs. ≥ 5
5
Comparação de pacientes com porcentagem de blastos na medula óssea <10 vs. ≥ 10
Abreviações: MO, medula óssea; OMS, Organização Mundial da Saúde; IPSS, sistema
internacional de escore prognóstico.

65
Tabela 6. Análises univariadas da sobrevida global e sobrevida livre de evento para os pacientes com SMD.
Sobrevida livre de evento Sobrevida global
1 1
Fatores Hazard Ratio (I.C. 95%) P Hazard Ratio (I.C. 95%) P
Genêro
Masculino vs. feminino 1,45 (0,66-3,17) 0,35 1,70 (0,72-3,99) 0,21
Idade no momento da coleta
≥ 60 vs. <60 1,37 (0,57-3,26) 0,47 1,50 (0,59-3,79) 0,39
Estratificação pela OMS 2008
AR/ARSA/del(5q)/CRDM vs.
6,40 (2,67-15,35) 0,0001 6,41 (2,58-15,91) 0,0001
AREB-1/AREB-2
2
Grupos de risco pela IPSS
Alto/Int-2 vs. Int-1/Baixo 8,53 (3,40-21,38) 0,0001 9,08 (3,41-24,14) 0,0001
1
Risco citogenético
Intermediário/Alto vs. Baixo 2,32 (0,92-5,85) 0,07 2,15 (0,79-5,87) 0,13
Hemoglobina, g/dL
<10 vs. ≥ 10 3,07 (1,24-7,61) 0,01 3,42 (1,30-9,02) 0,01
9
Leucócitos, x10 /L
< 3 vs ≥ 3 2,54 (1,17-5,49) 0,01 2,49 (1,10-5,64) 0,02
9
Neutrófilos, x10 /L
< 1,5 vs. ≥ 1 5 2,56 (1,12-5,87) 0,02 2,16 (0,92-5,06) 0,07
9
Plaquetas, x10 /L
< 100 vs. ≥ 100 1,50 (0,69-3,24) 0,29 1,48 (0,65-3,34) 0,34
Número de citopenias
3/2 vs. 1/0 1,70 (0,78-3,70) 0,17 1,64 (0,72-3,71) 0,23
Blastos na MO, %
≥ 5 vs. <5 3,96 (1,82-8,60) 0,0005 4,17 (1,84-9,47) 0,0001
≥ 10 vs. <10 7,22 (2,91-17,90) 0,0001 9,97 (3,74-26,56) 0,0001
3
Expressão de Stathmin 1
Alta expressão vs. Baixa expressão 1,44 (0,61-3,38) 0,40 1,96 (0,81-4,74) 0,13
1
Hazard Ratio >1 indica que o primeiro fator confere pior prognóstico
2
Metáfases ausentes em dois pacientes.
3
Pacientes com SMD foram categorizados em dois grupos de acordo com a expressão de Stathmin 1; alta expressão de Stathmin 1
(tercil superior) e baixa expressão de Stathmin 1 (dois tercis inferiores ).
Abreviações: MO, medula óssea; OMS, Organização Mundial da Saúde; IPSS, sistema internacional de escore prognóstico.

66
4.3.3 O silenciamento de Stathmin 1 reduz a proliferação celular e a

clonogenicidade de linhagens celulares leucêmicas

Nosso próximo passo foi investigar a participação funcional de Stathmin 1

em linhagens celulares de LMA (U937) e LLA (Jurkat). Células U937 e Namalwa

foram estavelmente transduzidas com lentivírus mediando a entrega de uma

sequência de shRNA tendo como alvo Stathmin 1 (shSTMN1) ou um controle

apropriado (shControle). Após seleção com antibiótico, a eficiência do

silenciamento de Stathmin 1 foi verificada por qPCR (Figura 21A) e Western blot

(Figura 21B).

Figura 21. Silenciamento eficiente de Stathmin 1 em células U937 e Namalwa. As células

mieloides U937 e linfoides Namalwa foram transduzidas com lentivírus mediando a entrega de
uma sequência de shRNA controle (shControle) ou tendo como alvo Stathmin 1 (shSTMN1). (A)
Análise por qPCR dos níveis de mRNA de Stathmin 1 em células shSTMN1 relativos às células
shControle. (B) Análise da expressão proteica de Stathmin 1 por Western blot em extratos
celulares shControle e shSTMN1. Os anticorpos para immunoblotting (IB) estão indicados.

67
 Para determinar se o silenciamento de Stathmin 1 modula a proliferação

e/ou a viabilidade das células leucêmicas, ensaios de MTT foram realizados. A

proliferação de células U937 e Namalwa transduzidas com shSTMN1 foi

significativamente reduzida quando comparada com células shControle (P<0,05;

Figura 22A). Avaliação do potencial proliferativo de longo prazo foi realizada por

meio de ensaios de formação de colônias. Uma redução significativa no número

de colônias foi observada nas células shSTMN1 em comparação com células

shControle (P<0,01; Figura 22B). Não foram observadas diferenças nas taxas de

apoptose através dos ensaios de Anexina V e TUNEL (Figura 23). Estes dados

indicam um efeito específico de Stathmin 1 na proliferação celular observado no

ensaio de MTT.

68
Figura 22. A inibição de Stathmin 1 reduz a proliferação celular e o crescimento clonal em
células U937 e Namalwa. (A) A proliferação celular foi determinada pelo ensaio de MTT após 48
horas de incubação de células shSTMN1 normalizada pelas células shControle correspondente.
Os resultados são apresentados como média±DP de quatro experimentos independentes, *P<0,05;
**P<0,01; teste de Mann-Whitney. (B) As colônias contendo células viáveis foram detectadas por
MTT após 8 dias de incubação de células shSTMN1 normalizadas pelas células shControle
correspondentes. Imagens das colônias são representativas de um experimento e os gráficos de
barras representam a média±DP de pelo menos três experimentos independentes realizados em
triplicata; **P<0,01; ***P<0,001; teste t de Student.

69
Figura 23. O silenciamento de Stathmin 1 não modula a apoptose em células U937 e
Namalwa. (A) A apoptose foi detectada por citometria de fluxo em células shControle e shSTMN1
usando o método de marcação com Anexina V/IP. O quadrante inferior direito contém a população
apoptótica (Anexina V+/IP-). Os resultados são representativos de pelo menos quatro
experimentos independentes. (B) A apoptose foi detectada por citometria de fluxo em células
shControle e shSTMN1 utilizando TUNEL. A região P1 contém a população apoptótica. Os
resultados são representativos de pelo menos quatro experimentos independentes. As linhagens
celulares são indicadas nas figuras.

4.4. Investigar a expressão e a participação funcional de Stathmin 1 em

modelos de neoplasia hematológica com ativação constitutiva de

JAK2/STAT3

4.4.1. O tratamento com ruxolitinib modula a estabilidade dos microtúbulos

em células HEL JAK2V617F

Os resultados obtidos até este ponto do trabalho indicam que o

silenciamento de ANKHD1 ou Stathmin 1 reduz a proliferação celular, mas não

modula a apoptose in vitro em modelos de células de LMA e LLA. Em paralelo, o

silenciamento de SIVA induz a apoptose mas não modula diretamente a

proliferação celular in vitro nos modelos de células estudados. Estes resultados

indicam que ANKHD1 associa-se com SIVA e modula seu efeito sobre Stathmin 1,

70
mas não sobre as outras vias de sinalização mediadas por SIVA. Informação

relevante que também norteou nosso raciocínio científico foi o conhecimento de

que o silenciamento de Mask modulou negativamente a via de sinalização de

Hopscotch (hop) (ortóloga da proteína JAK2 em humanos) em Drosophila

melanogaster [46]. Estes dados nos instigaram a investigar a participação

funcional de ANKHD1 em um modelo de células com ativação constitutiva da via

JAK2/STAT3, como a célula HEL, portadora da mutação JAK2V617F em

homozigose. Dessa forma, consideramos que um passo inicial para o

desenvolvimento desta hipótese seria a caracterização da participação funcional

de Stathmin 1 em células HEL.

Além da atividade transcricional que a proteína STAT3 desempenha no

núcleo, a STAT3 ativada é capaz de se ligar e inibir Stathmin 1 e induzir a

estabilidade dos microtúbulos no citoplasma, conforme descrito em células de

linfoma Hut78 [70] e células de tumor gástrico humano SGC7901 e MGC803 [71].

A via de sinalização JAK/STAT é constitutivamente ativada em neoplasias

mieloproliferativas, e a mutação com ganho de função JAK2 V617F é encontrada em

grande parte dos pacientes com esta classe de neoplasias. O ruxolitinib é um

inibidor seletivo de JAK1/2 aprovado pelo FDA para o tratamento da mielofibrose

primária de alto-risco. Uma vez que o ruxolitinib inibe a atividade de STAT3, nós

verificamos se Stathmin 1 poderia ser ativada como consequência dessa inibição.

Células HEL tratadas com ruxolitinib 300 nM apresentaram uma pequena

diminuição na fosforilação de Stathmin 1 (um sítio inibitório), e células HEL

tratadas com ruxolitinib 100 nM e 300 nM apresentaram uma marcante redução da

71
acetilação da alfa-tubulina (um marcador de estabilidade dos microtúbulos),

indicando um aumento na instabilidade dos microtúbulos (Figura 24).

Figura 24. O tratamento com ruxolitinib induz atividade de Stathmin 1 e instabilidade dos
microtúbulos em células HEL. Análises por Western blot dos níveis de p-Stathmin 1 (S16) (um
sítio inibitório) e acetilação de alfa-tubulina (um marcador de estabilidade dos microtúbulos) em
extratos proteicos de células HEL tratadas ou não com diferentes concentrações de ruxolitinib
(100 e 300 nM). Os anticorpos usados para immunoblotting (IB) estão indicados. Fosfo-STAT3
(p-STAT3) foi utilizada como controle da eficiência do tratamento com ruxolitinib e actina como
controle da quantidade de proteína aplicada no gel.

72
4.4.2. O silenciamento de Stathmin 1 reduz a proliferação, a clonogenicidade,

e aumenta os efeitos pró-apoptóticos de ruxolitinib em células HEL JAK2V617F

Para investigar a função de Stathmin 1 em uma célula com ativação

constitutiva da via JAK2/STAT3, células HEL foram estavelmente transduzidas

com uma construção lentiviral contendo shRNA específico para inibir Stathmin 1

(shSTMN1) ou shRNA controle (shControle). Após a seleção policlonal com

puromicina, a eficiência da inibição de Stathmin 1 foi verificada por qPCR e

Western blotting (Figura 25).

Figura 25. Silenciamento eficiente de Stathmin 1 em células HEL. Células HEL foram
transduzidas com lentivírus mediando a entrega de shRNA controle (shControle) ou tendo como
alvo Stathmin 1 (shSTMN1). Níveis de mRNA (A) e proteína (B) de Stathmin 1 em células
shSTMN1 relativas às células shControle. Os anticorpos usados para immunoblotting (IB) estão
indicados.

Para determinar se a inibição de Stathmin 1 afeta a proliferação/viabilidade

celular, foram realizados ensaios de MTT na presença ou ausência do ruxolitinib.

A proliferação celular foi significativamente reduzida nas células shSTMN1

73
comparada às células shControle, e o silenciamento de Stathmin 1 teve um efeito

potencializador ao tratamento com ruxolitinib (P<0.05, Figura 26A). Em relação à

capacidade clonogênica, o silenciamento de Stathmin 1 reduziu significativamente

o número de colônias (P<0.01, Figura 26B). No entanto, o tratamento com

ruxolitinib foi capaz de diminuir drasticamente o número de colônias de células

HEL, e não foi observado o efeito adicional à inibição de Stathmin 1 (Figura 26B).

Figura 26. O silenciamento de Stathmin 1 reduz a proliferação e a clonogenicidade de

células HEL. (A) A proliferação/viabilidade celular foi determinada por ensaio de MTT após 48
horas de incubação de células shSTMN1 normalizadas pelas células shControle na presença ou
ausência de ruxolitinib (100 e 300 mM). Os resultados são representados como média±DP de seis
experimentos independentes; *P<0,05; **P<0,01; Teste Mann–Whitney. (B) Colônias contendo
células viáveis foram detectadas por MTT após 8 dias de cultura de células shSTMN1 e
normalizadas pelas células shControle na presença ou ausência de ruxolitinib (100 e 300 mM).
Imagens das colônias são representativas de um experimento e os gráficos de barras representam
a média±DP de onze experimentos independentes; **P<0,01; Teste t Student.

Nosso próximo passo foi determinar se a diminuição no número de células

após o silenciamento de Stathmin 1 foi devido a redução na proliferação celular ou

aumento da apoptose. As análises por citometria de fluxo revelaram que o

silenciamento de Stathmin 1 não alterou os níveis de apoptose em células HEL,

mas aumentou a apoptose induzida por ruxolitinib 300 nM (P<0.01, Figura 27).

Estes resultados indicam que o silenciamento de Stathmin 1 reduz a proliferação

celular e o crescimento clonal, além de sensibilizar as células HEL ao tratamento

com ruxolitinib.

74
Figura 27. A inibição de Stathmin 1 aumenta os efeitos pró-apoptóticos de ruxolitinib (A) A
apoptose foi detectada por citometria de fluxo em células HEL transduzidas com shControle ou
shSTMN1 tratadas ou não com ruxolitinib (100 e 300 nM) usando o método de marcação com
Anexina-V/IP. Um dot plot representativo está ilustrado. (B) O gráfico de barras representa a
média±DP de seis experimentos independents; **P<0,01; Teste t Student.

4.4.3. Stathmin 1 é um possível alvo da via de sinalização JAK2/STAT3 e

modula a dinâmica de microtúbulos em células HEL JAK2V617F

O efeito do silenciamento de Stathmin 1 e/ou do tratamento com ruxolitinib

na dinâmica de microtúbulos e na apotose foi investigado através da expressão e

ativação de alvos chave nestes processos: a acetilação da alfa-tubulina (marcador

de estabilidade dos microtúbulos) e a clivagem de caspase 3 (marcador de

apoptose). Análise por Western blot das células shControle tratadas com

ruxolitinib revelaram uma diminuição nos níveis de acetilação de alfa-tubulina,

indicando instabilidade dos microtúbulos. Em contraste, o silenciamento de

Stathmin 1 aumentou os níveis de alfa-tubulina acetilada e preveniu a perda da

estabilidade de microtúbulos induzida por ruxolitinib (Figura 28). Como esperado,

as células shControle e shSTMN1 apresentaram uma redução da ativação de

JAK2 e STAT3 após o tratamento com ruxolitinib (Figura 28). Corroborando com

nossos achados da marcação com Anexina V, os níveis de caspase 3 clivada

aumentaram durante o tratamento com ruxolitinib, e os níveis maiores foram

75
observados nas células shSTMN1 comparadas às células shControle na dose de

ruxolitinib 300 nM. Estes resultados indicam que Stathmin 1 está envolvida na

instabilidade de microtúbulos durante o tratamento com ruxolitinib em células HEL,

possivelmente através da diminuição da atividade de STAT3.

Figura 28. O silenciamento de Stathmin 1 previne a instabilidade de microtúbulos induzida

pelo tratamento com ruxolitinib. Análises realizadas por Western blot para verificar os níveis
de Stathmin 1, acetilação de alfa-tubulina, p-JAK2 (Y221), p-STAT3 (Y705) e caspase 3 (total e
clivada) em extratos proteicos de células shControle e shSTMN1 tratadas ou não com ruxolitinib
(100 e 300 nM); os anticorpos usados para immunoblotting (IB) estão indicados.

76
4.4.4. A indução da estabilidade dos microtúbulos melhora a resposta ao

ruxolitinib em células HEL JAK2V617F

Neste momento do trabalho, concluímos que o silenciamento de Stathmin 1

induziu uma melhor resposta de células HEL ao tratamento com ruxolitinib,

possivelmente através do efeito do silenciamento de Stathmin 1 na manutenção

da estabilidade dos microtúbulos. Nosso próximo passo foi avaliar se a indução

farmacológica da estabilidade dos microtúbulos poderia contribuir para uma

melhor resposta das células HEL ao tratamento com ruxolitinib. O tratamento com

paclitaxel foi utilizado para induzir a estabilidade dos microtúbulos, mimetizando o

efeito de silenciamento Stathmin 1. Notavelmente, o tratamento com paclitaxel em

conjunto com ruxolitinib resultou em uma maior redução na viabilidade das células

e em níveis mais elevados de apoptose em comparação ao tratamento com

apenas uma das drogas (Figura 29; P<0,05). A análise por Western blot indicou

que o paclitaxel foi capaz de induzir a fosforilação de Stathmin 1 na serina 16 (um

sítio inibitório), sobrepondo-se ao efeito do ruxolitinib, e mantendo níveis elevados

de acetilação de alfa-tubulina indicando estabilidade dos microtúbulos (Figura 30).

Além disso, o tratamento com paclitaxel mais ruxolitinib resultou em aumento dos

níveis de caspase 3 clivada em comparação com paclitaxel ou ruxolitinib isolados

(Figura 30).

77
Figura 29. A estabilidade dos microtúbulos induzida por paclitaxel melhora a resposta ao
ruxolitinib. (A) A apoptose foi detectada por citometria de fluxo em células HEL tratadas ou não
com paclitaxel (5 nM e 10 nM) e/ou ruxolitinib (300 nM) utilizando o método de marcação com
Anexina-V/IP; um dot plot representativo do ponto é ilustrado. (B) As médias±DP de seis
experimentos independentes são indicados no gráfico; *P<0,05 vs. células não tratadas, #P<0,05
vs. ruxolitinib ou paclitaxel isoladamente; Teste t Student. (C) A viabilidade celular foi determinada
pelo ensaio de MTT após 48 horas de incubação de células HEL tratadas ou não com paclitaxel (5
nM e 10 nM) e/ou ruxolitinib (300 nM) e normalizada por células HEL não tratadas. Os resultados
são apresentados como média±DP de seis experimentos independentes; *P<0,05 vs. Células não
tratadas, #P<0,05 vs. ruxolitinib ou paclitaxel isoladamente; Teste Mann-Whitney.

78
Figura 30. O tratamento com paclitaxel induz fosforilação de Stathmin 1 e potencializa a
clivagem de caspase 3 induzida por ruxolitinib. A análise por Western blot para os níveis de p-
Stathmin 1 (S16), alfa-tubulina acetilada, p-JAK2 (Y221), p-STAT3 (Y705) e caspase 3 (total e
clivada) em extratos proteicos provenientes de células HEL tratadas ou não com paclitaxel (5 nM e
10 nM) e/ou ruxolitinib (300 nM). Os anticorpos utilizados para immunoblotting (IB) estão indicados.

79
4.4.5. Stathmin 1 é altamente expressa em células CD34+ de sangue

periférico de pacientes com mielofibrose primária

Uma vez que identificamos a relevância funcional de Stathmin 1 em

modelos de células com ativação constitutiva da via de sinalização JAK2/STAT3,

nós investigamos a expressão de Stathmin 1 em uma coorte de pacientes com

neoplasias mieloproliferativas (NMP), incluindo pacientes com policitemia vera

(PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP). Os transcritos

de Stathmin 1 foram significativamente aumentados em células CD34+ de

pacientes com MFP em comparação com as células normais CD34 + (mediana de

2,73 [intervalo de 0,49-8,32] vs. 1,08 [0,08-7,17]; P=0,005), mas não foi observada

diferença significativa na expressão de Stathmin 1 entre pacientes com TE, PV e

doadores saudáveis (1,10 [0,07-6,98], 0,98 [0,18-6,02] vs. 1,08 [0,07-7,17],

respectivamente; P>0,05; Figura 31A). Nós também analisamos a expressão de

Stathmin 1 de acordo com o estado mutacional de JAK2V617F e mutações em

CALR no éxon 9 nos pacientes com NMP, não sendo observadas diferenças entre

os pacientes com ou sem a presença de JAK2 V617F (mediana de 1,61 [intervalo de

0,19-8,32] vs. 1,08 [0,07-6,99], P=0,20; Figura 31B) ou mutações em CALR

(mediana 1,10 [intervalo 0,07-6,99] vs. 1,39 [0,19 -5,84], P=0,63; Figura 31C).

80
 +
Figura 31. Níveis de mRNA de Stathmin 1 em células CD34 de sangue periférico de
pacientes com neoplasias mieloproliferativas e doadores saudáveis. (A) Análise por qPCR da
+
expressão de Stathmin 1 (STMN1) em amostras de células CD34 de sangue periférico de
doadores saudáveis e de pacientes com diagnóstico de trombocitemia essencial (TE), policitemia
vera (PV) e mielofibrose primária (MFP), e de pacientes com neoplasias mieloproliferativas
V617F
estratificados de acordo estado mutacional para JAK2 (B) ou CALR éxon 9 (C). As linhas
horizontais indicam as medianas. O número de indivíduos e os valores de P (teste Mann-Whitney)
são indicados no gráfico.

81
82
5. DISCUSSÃO

Para explorar a possibilidade de ANKHD1 como uma proteína relevante na

leucemogênese, nós inicialmente buscamos identificar novas proteínas que

poderiam interagir com ANKHD1 e possibilitar o início de nossa investigação em

uma via de sinalização específica. Usando um domínio de repetição de anquirina

de ANKHD1 em ensaio de duplo híbrido em levedura, nós fomos capazes de

identificar SIVA como uma proteína ligante de ANKHD1 [38]. Através desse

achado, a participação de ANKHD1 foi avaliada em processos celulares

importantes e sabidamente modulados por SIVA: migração, apoptose e

proliferação [54]. Inicialmente, nossa hipótese foi que ANKHD1 poderia modular a

apoptose, pois SIVA possui uma função pró-apoptótica bem estabelecida [54]. Nós

confirmamos que o silenciamento de SIVA reduz a apoptose, diminui a expressão

das proteínas pró-apoptóticas p-JNK e BAX e aumenta a expressão da proteína

antiapoptótica BCL-XL em células leucêmicas mieloides U937, como previamente

descrito em outros tipos de linhagens celulares neoplásicas [39,50,51,58,113]. No

entanto, o silenciamento de ANKHD1 não afetou a porcentagem de células

apoptóticas nem a expressão de proteínas relacionadas com a apoptose. O fato

de que ANKHD1 interage com SIVA, mas apenas SIVA desempenha um papel no

processo de apoptose, pode ser uma consequência da complexidade das vias de

sinalização em células leucêmicas e dos domínios de ligação específicos

necessários para a interação de cada proteína. Possivelmente, a interação de

ANKHD1 com SIVA não estaria modulando as proteínas apoptóticas, mas poderia

modular outra via regulada por SIVA.

83
 Em 2011, foi descrito que SIVA1 suprime a transição epitelial-mesenquimal

e a metástase de células de tumores sólidos através da inibição de Stathmin 1 e

da estabilização dos microtúbulos [41]. Stathmin 1 é uma proteína

desestabilizadora de microtúbulos com um papel central na progressão do ciclo

celular e migração. Sua expressão encontra-se aumentada em uma variedade de

tipos de câncer, incluindo as leucemias [67,81,83,112]. Em células leucêmicas

silenciadas para SIVA, nós observamos um aumento da migração celular e

ativação de Stathmin 1. Um fato interessante foi que a inibição de ANKHD1 teve

um efeito oposto na ativação de Stathmin 1 e na migração quando comparadas às

células inibidas para SIVA; o silenciamento de ANKHD1 resultou na inativação de

Stathmin 1, na acetilação da alfa-tubulina e na redução da migração celular. Li e

colaboradores [41] descreveram que a expressão induzida de SIVA resultou em

um fenótipo semelhante ao que nós observamos após a inibição de ANKHD1.

Estes efeitos opostos sugerem que ANKHD1 liga-se a SIVA e inibe sua função na

via de sinalização de Stathmin 1. Modalidades terapêuticas que interferem na

expressão ou na atividade de Stathmin 1 e que inibem a proliferação e a migração

celular são de interesse em vários tipos de câncer [67,68,114,115]. O melhor

entendimento da complexidade das vias de sinalização em que Stathmin 1 atua

pode contribuir no entendimento das vias de sinalização alteradas em neoplasias.

ANKHD1 e SIVA apresentaram efeitos opostos sobre a migração, a

ativação de Stathmin 1 e o crescimento tumoral. Além disso, ANKHD1, mas não

SIVA, modulou a proliferação de células leucêmicas in vitro. O efeito de Stathmin 1

sobre a proliferação tem sido bem definido: os baixos níveis de Stathmin 1

estabilizam o fuso mitótico, prevenindo a mitose e inibindo a proliferação de

84
células tumorais [114,115,116]. Em concordância, verificou-se que o silenciamento

de ANKHD1 resultou na inibição de Stathmin 1 e na diminuição da proliferação de

células leucêmicas in vitro e do crescimento tumoral in vivo. Em Drosophila,

estudos recentes identificaram que a proteína ortóloga de ANKHD1 (Mask) é

essencial para a proliferação celular e o crescimento de tecidos [117,118], o que

corrobora os nossos resultados em células humanas.

O silenciamento de SIVA resultou em um aumento no crescimento do tumor

in vivo, mas não modulou a proliferação celular e a formação de colônias in vitro.

Dois pontos principais precisam ser discutidos aqui: (i) por que o efeito oposto do

silenciamento de ANKHD1 e SIVA na proliferação celular foi observado apenas in

vivo, mas não em ensaios in vitro, (ii) como justificar os nossos resultados sobre o

efeito do silenciamento de SIVA sobre a proliferação, em relação ao trabalho de

Du e colaboradores [40].

Du e colaboradores [40] demonstraram que a inibição de SIVA resultou em

uma redução significativa da proliferação de células cancerosas selvagens para o

gene TP53, células de carcinoma de cólon (HCT116) e de osteossarcoma (U2OS),

mas não em células cancerosas com TP53 ausente (ou mutado) em ensaios in

vitro e in vivo [40]. Na LMA, mutações em TP53 são frequentes e estão

associadas a pior prognóstico e menor sobrevida [119]. Todas as linhagens

leucêmicas utilizadas em nossos estudos apresentam TP53 mutado (forma

inativa) [120,121]. Desta forma, tal como indicado por Du e colaboradores [40], os

efeitos de SIVA sobre a proliferação e o crescimento tumoral podem variar de

acordo com a presença ou não da mutação de TP53. Em células leucêmicas com

mutação de TP53, como células U937, pode-se inferir que o efeito de SIVA sobre

85
o crescimento tumoral foi relacionado com o aumento da resistência à apoptose

apenas e/ou pode também ter sido modulado pelo efeito de SIVA na ativação de

Stathmin 1. Em células leucêmicas U937, o silenciamento de SIVA resultou na

ativação de Stathmin 1, o que poderia contribuir para o aumento do crescimento

tumoral.

Nosso estudo evidenciou uma alta expressão de Stathmin 1 em células

hematopoéticas proliferando e um aumento significativo da expressão de Stathmin

1 em células primárias de LMA e LLA, quando comparadas a células

hematopoéticas normais, corroborando achados anteriores [81,83,112]. Os nossos

resultados demonstraram que a inibição de Stathmin 1 reduz o potencial de

proliferação de linhagens celulares leucêmicas. Um efeito semelhante já foi

demonstrado em células de tumores sólidos [115,122,123] e em uma linhagem

celular de leucemia mieloide crônica (células K562) [75,84]. Em conjunto, estes

dados reforçam a hipótese de que Stathmin 1 participa na proliferação de células

leucêmicas.

Um perfil semelhante de expressão de Stathmin 1 foi observado entre

doadores saudáveis e pacientes com SMD; no entanto, quando pacientes com

SMD foram estratificados pela classificação da OMS 2008, foi observado um

aumento de Stathmin 1 no grupo de pacientes com SMD AREB-1/AREB-2 em

comparação com o grupo de SMD AR/ARSA/del(5q)/CRDM. Apoiando esses

dados, foi encontrada uma correlação positiva entre a porcentagem de blastos na

medula óssea e a expressão de Stathmin 1. Três dos cinco pacientes com SMD

AR/ARSA/del(5q)/CRDM apresentaram um aumento acentuado na expressão de

Stathmin 1 no momento da progressão da doença. Um trabalho anterior, com foco

86
na identificação de biomarcadores de doenças relacionadas com o

envelhecimento humano, descreveu que Stathmin 1 é uma proteína altamente

expressa no plasma de pacientes com SMD em comparação com doadores

saudáveis, mas não foram fornecidas características clínicas dos pacientes com

SMD incluídos no estudo [124]. As funções biológicas de Stathmin 1 no plasma

ainda não foram elucidadas. Considerando que Stathmin 1 é uma proteína

citoplasmática importante para a segregação precisa dos cromossomos, divisão

celular, proliferação e migração [67,116], somando-se aos resultados aqui

apresentados, sugerimos que Stathmin 1 está envolvida na progressão de SMD.

Em resumo, relatamos uma elevada expressão de Stathmin 1 no grupo de SMD

AREB-1/AREB-2, em pacientes com SMD no momento da progressão da doença,

e em pacientes com LMA e LLA, sugerindo que Stathmin 1 participa no fenótipo

altamente proliferativo destas neoplasias hematológicas.

Em relação à expressão de YAP1, nossos resultados corroboram os

achados de Safari e colaboradores em LMA [104] e fornece novas evidências em

outras neoplasias hematológicas. Jansson e Larsson [103] relataram um elegante

estudo mecanístico indicando que a expressão forçada de Yap1 em células-tronco

hematopoéticas murinas não resultou na transformação maligna e não alterou a

hematopoese in vivo ou as funções de células-tronco hematopoéticas in vivo e in

vitro. Simultaneamente à divulgação dos nossos resultados [125], um trabalho

publicado por Cottini e colaboradores [126] também observou a ausência de

expressão de YAP1 em um painel de linhagens leucêmicas. Neste mesmo estudo,

foi reportado que a recuperação da expressão de YAP1 é capaz de desencadear a

apoptose induzida por dano ao DNA através da ativação de p73 [126], sugerindo

87
que, diferentemente do que ocorre em tumores sólidos, onde YAP1 atua como um

oncogene, YAP1 atua como um supressor tumoral em leucemias.

Os resultados sobre a expressão de Stathmin 1 e YAP1 em células

leucêmicas ajudaram a pavimentar os caminhos para exploração da função de

ANKHD1 em neoplasias hematológicas. Por exemplo, é de se notar que a inibição

de Stathmin 1 apresentou um fenótipo similar ao da inibição de ANKHD1, fato

interessante, uma vez que a inibição de ANKHD1 resultou na inibição da atividade

de Stathmin 1 via aumento da fosforilação em serina 16 mediada por SIVA. Outro

ponto de destaque é o fato de que, das duas linhagens submetidas à inibição de

ANKHD1 (U937 e Jurkat), apenas a linhagem U937 expressou YAP1 (em baixos

níveis). Resultados semelhantes foram observados nos experimentos funcionais

nas duas linhagens avaliadas, indicando que, em células leucêmicas, os efeitos da

inibição de ANKHD1 independem da proteína YAP1. Desta forma, apesar da

interação ANKHD1 e YAP1 ter sido descrita em células humanas HEK293 (células

embrionárias de rim) [43,44] e DU145 (adenocarcinoma de próstata) [42], a

participação de ANKHD1 no fenótipo leucêmico não deve ocorrer através da via

Hippo.

Em resumo, observou-se que SIVA é capaz de contribuir para o aumento

da apoptose, inibição da proteína Stathmin 1, da migração celular e do

crescimento do tumor in vivo das células leucêmicas U937. Adicionalmente,

identificou-se que ANKHD1 interage com SIVA e induz a ativação de Stathmin 1, a

despolimerização da tubulina, o aumento da migração e da proliferação celular. O

modelo potencial para a participação de ANKHD1 e SIVA na célula leucêmica está

88
representado na Figura 29. Desta forma, ANKHD1 deve ser um oncogene que

participa do fenótipo leucêmico.

Figura 32. Modelo potencial para a participação de ANKHD1 e SIVA em células leucêmicas.
1: SIVA é uma proteína adaptadora que promove a fosforilação e a inativação de Stathmin 1, a
estabilidade dos microtúbulos e regula negativamente a migração de células leucêmicas; 2:
ANKHD1 associa-se com SIVA, inibe SIVA, induz ativação de Stathmin 1, despolimerização da
tubulina e aumento da migração e da proliferação celular, 3: SIVA pode induzir apoptose através
da regulação positiva das proteínas pró-apoptóticas BAX e p-JNK, e regulação negativa da
proteína antiapoptótica BCL-XL. Abreviações: Ac: acetilação; P: fosforilação. A figura foi produzida
usando o Servier Medical Art (http://www.servier.com/Powerpoint-image-bank).

Outra via de sinalização possivelmente regulada por ANKHD1 é a via

JAK/STAT, conforme sugerido em estudos realizados em Drosophila

89
melanogaster, em que o silenciamento de Mask modulou negativamente a via de

sinalização de Hopscotch (hop) (ortóloga da proteína JAK2 em humanos) [46].

Nós elaboramos a hipótese que a participação funcional de ANKHD1 na via

JAK/STAT poderia ocorrer através do efeito de ANKHD1 na modulação da

Stathmin 1. Na tentativa de pavimentar novos caminhos para futuras investigações

de ANKHD1 na via JAK/STAT em outros modelos celulares, nós investigamos a

participação da Stathmin 1 na regulação da via JAK2/STAT3 em células HEL

JAK2V617F, que apresenta ativação constitutiva da via JAK2/STAT3 e é utilizada

como modelo biológico para o estudo de neoplasias mieloproliferativas (NMP)

BCR-ABL1 negativas. Em paralelo, avaliamos a expressão de Stathmin 1 em

células primárias de pacientes com NMP.

Nossos resultados demonstraram que Stathmin 1 é altamente expressa em

células CD34+ de pacientes com MFP. Os megacariócitos provenientes dos

pacientes com MFP apresentam anormalidades morfológicas e capacidade

prejudicada de gerar pró-plaquetas [127]. lancu-Rubin e colaboradores [76]

relataram que a diminuição da expressão de Stathmin 1 é necessária para uma

maturação eficiente de megacariócitos e para a produção de plaquetas durante a

megacariocitopoese normal. A elevada expressão de Stathmin 1 em progenitores

hematopoéticos provenientes de pacientes com MFP poderia contribuir para a

diferenciação megacariocítica anormal.

O silenciamento de Stathmin 1 foi capaz de reduzir a proliferação celular e o

crescimento clonal de células HEL JAK2V617F. Estes resultados estão de acordo

com os nossos resultados em células U937 e Namalwa, e com os dados obtidos

em células K562 previamente publicados por dois grupos de pesquisa

90
independentes[84,85]. É importante notar que a inibição de Stathmin 1 teve um

efeito potencializador na redução da viabilidade celular induzida por ruxolitinib. Na

MFP, resultados de ensaios clínicos de fase III demonstraram que ruxolitinib é

bem tolerado, reduz as citocinas inflamatórias e a esplenomegalia e melhora

sintomas constitucionais, mas não é capaz de reverter a fibrose da medula óssea

[128,129,130], sugerindo que o desenvolvimento de outras abordagens são

necessárias. Neste sentido, estudos pré-clínicos com drogas combinadas estão

emergindo na tentativa de melhorar a resposta aos inibidores de JAK

[131,132,133,134,135].

No que diz respeito à sinalização celular, ruxolitinib é capaz de inibir a

ativação constitutiva da mutação JAK2V617F e seus alvos a jusante, incluindo

STAT3. A relação entre a sinalização mediada por STAT3 e Stathmin 1 já foi

descrita anteriormente em outros modelos celulares [69,70,71]. STAT3 é um

ativador de transcrição, e, quando ativado no citoplasma, é capaz de induzir a

estabilidade dos microtúbulos e inibir a atividade de Stathmin 1 [70,71]. Nossos

resultados evidenciaram que o tratamento de células HEL JAK2V617F com

ruxolitinib induziu instabilidade dos microtúbulos, possivelmente pela redução dos

níveis de atividade de STAT3 e ativação de Stathmin 1. Corroborando esta

hipótese, foi observado que o silenciamento de Stathmin 1 preveniu a instabilidade

de microtúbulos causada pelo tratamento com ruxolitinib. Em janeiro de 2015, foi

reportado que camundongos Jak2V617F noucate para a proteína Stat3 em células

da medula óssea apresentaram maiores níveis de fibrose na medula óssea e

menor sobrevida [136]. Desta forma, inferimos que, assim como a menor atividade

de Stat3, a maior expressão de Stathmin 1 poderia contribuir para os efeitos

91
indesejáveis do ruxolitinib e para a fibrose na medula óssea, uma vez que a menor

atividade de STAT3 tem como consequência a ativação de Stathmin 1.

Com o intuito de verificar a hipótese de que a estabilidade de microtúbulos

pode estar envolvida com a melhor resposta das células inibidas para Stathmin 1

ao tratamento com ruxolitinib, foi utilizado o tratamento com paclitaxel. O paclitaxel

é um quimioterápico que induz a estabilidade de microtúbulos, bloqueia a

progressão do ciclo celular e induz a apoptose, sendo o tratamento de primeira

linha para diversos tumores sólidos [137]. Curiosamente, o tratamento combinado

(paclitaxel mais ruxolitinib) resultou em uma redução significativa da viabilidade

celular em comparação com a monoterapia, copiando o fenótipo da inibição de

Stathmin 1. Um modelo proposto da participação de Stathmin 1 nas células HEL é

ilustrado na Figura 33.

Figura 33. Modelo proposto para a participação de Stathmin 1 nas células HEL. (A) A ativação
V617F
constitutiva de STAT3 pela presença da mutação JAK2 induz a inibição de Stathmin1 e
estabilização de microtúbulos. (B) O tratamento com ruxolitinib resulta na inibição de JAK2, inibição
de STAT3, ativação de Stathmin 1 e aumento da instabilidade dos microtúbulos. (C) O tratamento
com paclitaxel ultrapassa o efeito de tratamento ruxolitinib, mantendo a estabilidade de
microtúbulos e inibindo Stathmin 1. Abreviações: Ac, acetilação; P, fosforilação.

Em conclusão, propomos que a ANKHD1 é oncogene e participa do

fenótipo neoplásico de células leucêmicas através de sua interação com SIVA e

modulação da atividade de Stathmin 1. Observamos que a participação funcional

92
de uma determinada proteína depende do modelo biológico estudado, e, neste

sentido, ressaltamos que a função de ANKHD1 na leucemogênese independe de

sua interação com YAP1. Em células humanas com ativação constitutiva da via

JAK/STAT, como no caso de NMP BCR-ABL1 negativas, identificamos a

relevância funcional da participação de Stathmin 1 no fenótipo neoplásico. Estes

dados podem nortear a realização de novos estudos com o objetivo de investigar a

participação de ANKHD1 na via JAK/STAT.

93
94
6. CONCLUSÃO

- ANKHD1 associa-se com SIVA e inibe a associação entre SIVA e Stathmin 1,

promovendo a migração e a proliferação celular através da ativação de Stathmin 1

e da instabilidade dos microtúbulos em células leucêmicas U937 e Jurkat.

- A expressão de YAP1 é ausente na maioria das células hematopoéticas normais

e neoplásicas estudadas, incluindo SMD, LMA e LLA. A baixa expressão de YAP1

em leucemias agudas indica que o mecanismo de ação de ANKHD1 nestas

células, diferentemente de neoplasias sólidas, independe da via Hippo.

- Stathmin 1 é altamente expressa em células com alta taxa de proliferação

celular, incluindo linfócitos normais induzidos a proliferarem com mitógeno,

linhagens leucêmicas, pacientes com SMD AREB-1/AREB-2, LMA, e LLA

comparados com células hematopoéticas normais. Stathmin 1 induz a proliferação

celular e o crescimento clonal através de uma maior instabilidade de microtúbulos,

mas não modula a apoptose em células leucêmicas U937 e Namalwa. Estes

resultados estão de acordo com nossos achados de que a inibição de ANKHD1

inibe Stathmin 1, estabiliza os microtúbulos e reduz a proliferação celular.

- Em células HEL JAK2V617F, a ativação constitutiva de STAT3 pela presença da

mutação JAK2V617F induz a inibição de Stathmin 1 e estabilização de microtúbulos.

O tratamento com o inibidor de JAK1/2 ruxolitinib resulta na inibição de JAK2,

inibição da atividade de STAT3, ativação de Stathmin 1 e aumento da instabilidade

95
dos microtúbulos. A inibição farmacológica da instabilidade dos microtúbulos

através do tratamento com paclitaxel ultrapassa o efeito do tratamento com

ruxolitinib, mantendo a estabilidade de microtúbulos e inibindo Stathmin 1. Estes

dados indicam que Stathmin 1 participa do fenótipo neoplásico de células HEL e

que a ativação indireta de Stathmin 1 deve ser um efeito indesejável do ruxolitinib.

O uso de ruxolitinib associado à inibição de Stathmin 1 poderia contribuir para a

reversão do fenótipo neoplásico. Estes achados constituem a base para a

continuidade de estudos da participação de ANKHD1 na via JAK/STAT.

Os resultados desta tese geraram a publicação de dois capítulos de livro

(Anexo IV e V), um artigo de revisão (Anexo VI), uma correspondência (Anexo VII)

e dois artigos originais (Anexo VIII e IX). Um terceiro manuscrito no formato de

artigo original foi realizado e publicado (Anexo X) durante o desenvolvimento desta

tese, o trabalho está indiretamente relacionado ao tema da tese e foi citado na

introdução e discussão [42].

Um novo manuscrito contendo os resultados da investigação da

participação funcional de Stathmin 1 em células HEL JAK2V617F está em fase de

submissão no formato de artigo original.

96
7. REFERÊNCIAS

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114
8. ANEXOS

ANEXO I

115
116
ANEXO II

117
118
ANEXO III

119
ANEXO IV

120
ANEXO V

121
ANEXO VI

122
ANEXO VII

123
ANEXO VIII

124
ANEXO IX

125
ANEXO X

126