Universidade Federal de São Paulo

Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas Campus Diadema

Análise instrumental II - ADE - 2021

RELATÓRIO 1- Cromatografia Líquida - HPLC

IMPORTANTE: ENCAMINHAR CONFORME AS REGRAS. SALVE EM PDF COM O NOME: EX.: GRUPO01_HPLC
ALUNOS
1 FERNANDA CALABRÓ GARCIA – RA: 115.112
2 JESSICA REIMBERG DA SILVA – RA: 135.098

EXPERIMENTO: Influência do fluxo da bomba na separação de triptofano, tirosina e fenilalanina.

ROTEIRO
1. Instrumentação e condições analíticas
● Equipamento: HPLC marca Shimadzu
● Detecção UV em 254 nm
● Coluna: C18, 15 cm de comprimento, tamanho de partícula 3 µm;
● Fluxo da bomba a ser avaliado: 1,0 1,5 e 2, 0 ml/min;
● Volume de Injeção: 20 µL
● Fase móvel: Água/metanol (75:25)

2. Amostra
Solução A contendo uma mistura de padrões: triptofano, tirosina e fenilalanina na concentração
de 1,0 mMol L-1 cada.

3. Procedimento (fazer em triplicata)

● Injetar o branco (água) em uma fluxo de 1.0 ml/;
● Injetar a solução A em um fluxo de 1.0 ml/;
● Injetar a solução A em um fluxo de 1.5 ml/;
● Injetar a solução A em um fluxo de 2.0 ml/

Qual o valor de prato teórico em cada condição de separação para cada

4. Relatório
a) (2,0) Qual a ordem de eluição dos compostos? Apresentar as estruturas químicas e
discutir como chegou nesta ordem.

Imagem 1: Estrutura dos compostos: Triptofano, Tirosina e Fenilalanina.

Nessa situação trata-se de uma cromatografia de fase reversa em que a fase móvel tem
característica polar, no caso água e metanol (75:25) e a fase estacionária é apolar. Aquele
composto que tiver maior interação com a fase móvel irá percorrer a coluna cromatográfica
primeiro, e aquele que tiver maior interação com a fase estacionária será o último composto a
eluir por ela. Dadas as estruturas demonstradas na imagem 1 os compostos são aminoácidos e
este grupo funcional confere uma característica polar para a molécula, no entanto o restante da
cadeia se diferencia em alguns aspectos: a tirosina possui um grupo hidrofílico, no caso a
hidroxila, que confere uma característica fortemente polar. Já o triptofano tem um grupo
funcional amina que também é hidrofílico, mas possui dois anéis, um de 4 e outro de 6
membros que confere uma menor polaridade na molécula. Enquanto a fenilalanina não possui
nenhum grupo funcional em sua estrutura além do aminoácido, sendo assim o de menor
polaridade dentre os três.
Portanto a ordem de eluição dos compostos é primeiro a tirosina, seguida do triptofano e por
último a fenilalanina.

b) (2,0) Discutir a variação do tempo de retenção dos compostos em cada fluxo. Segundo
van Deemter, seria possível diminuir o tempo de eluição sem alterar a resolução?
Como?
Para se obter uma diminuição no tempo de eluição, sem perda de eficiência e sem alterar a
resolução, nós podemos diminuir o tamanho das partículas, e aumentar a temperatura da
coluna. A teoria de Van Deemter originalmente proposta para cromatografia gasosa e posterior
mente para a cromatografia líquida, relaciona a eficiência da coluna (dada por H) com a
velocidade linear média da fase móvel (fluxo ou vazão). Quando diminuímos o tamanho da
partícula, temos um aumento significativo na pressão do sistema, uma diminuição no tempo de
análise e uma melhora nas separações. Essa diminuição no tamanho das partículas nos permite
utilizar fase móvel a uma elevada velocidade linear média, com fluxos volumétricos maiores, e
sem perda de eficiência. Com o aumento da temperatura da coluna, ela acaba auxiliando na
transferência do analito da fase estacionária para a fase móvel, diminuindo também o tempo de
análise e aumentando a eficiência das colunas e a sensibilidade da detecção.
 c) (2,0) Discutir o aumento da pressão da bomba de acordo com o aumento do fluxo.
Devido à coluna do equipamento ser fechada e preenchida com partículas na ordem de
micrômetros é necessário o uso de pressões elevadas para que ocorra a passagem do solvente
(fase móvel) pelo sistema, desde modo para aumentar o fluxo faz-se necessário o aumento da
pressão.

d) (2,0) Qual o valor do prato teórico para o ultimo pico em cada fluxo?
O número de pratos teóricos é determinado, por meio de uma fórmula que relaciona o tempo
de retenção e a largura do pico analítico, conforme descrito abaixo:

𝑡𝑟 2
𝑁𝐴 = 16 . ( )
𝑤𝑏
Deste modo substituindo os valores do ultimo pico em cada fluxo que estão tabelados a baixo
obtém-se o número de pratos teóricos.

Tabela 1: Calculo para determina o número de pratos teóricos.

Fluxo de 1,0 mL/min Fluxo de 1,5 mL/min Fluxo de 2,0 mL/min
4,4 2 2,9 2 2,3 2
𝑁𝐴 = 16 . ( ) = 1239 𝑁𝐴 = 16 . ( ) = 841 𝑁𝐴 = 16 . ( ) = 940
0,5 0,4 0,3

e) (2,0) Se uma indústria tem 10 cromatógrafos e opera 360 dias por ano, 24 horas, qual
o volume de resíduo produz em cada condição de fluxo. Qual fluxo seria o ideal pra
trabalhar e porquê.
Cálculos referentes ao volume residual:
Fluxo 1,0 mL/min:
1,0 𝑚𝐿 1𝐿 60 𝑚𝑖𝑛 24 ℎ 360 𝑑𝑖𝑎𝑠
𝑉𝑟𝑒𝑠í𝑑𝑢𝑎𝑙 = 10 . . . . . = 5.184 𝐿/𝑎𝑛𝑜
1 𝑚𝑖𝑛 1000 𝑚𝐿 1ℎ 1 𝑑𝑖𝑎 1 𝑎𝑛𝑜

Fluxo 1,5 mL/min:

1,5 𝑚𝐿 1𝐿 60 𝑚𝑖𝑛 24 ℎ 360 𝑑𝑖𝑎𝑠
𝑉𝑟𝑒𝑠í𝑑𝑢𝑎𝑙 = 10 . . . . . = 7.776 𝐿/𝑎𝑛𝑜
1 𝑚𝑖𝑛 1000 𝑚𝐿 1ℎ 1 𝑑𝑖𝑎 1 𝑎𝑛𝑜
Fluxo 2,0 mL/min:
2,0 𝑚𝐿 1𝐿 60 𝑚𝑖𝑛 24 ℎ 360 𝑑𝑖𝑎𝑠
𝑉𝑟𝑒𝑠í𝑑𝑢𝑎𝑙 = 10 . . . . . = 10.368 𝐿/𝑎𝑛𝑜
1 𝑚𝑖𝑛 1000 𝑚𝐿 1ℎ 1 𝑑𝑖𝑎 1 𝑎𝑛𝑜
Tendo em vista os cálculos apresentados acima para cada um dos fluxos propostos e os gráficos
representados a baixo, o fluxo ideal para se trabalhar é o de 2,0 mL/min. Pois apesar de ter um
volume residual maior em comparação ao de 1,0 mL/min e o de 1,5 mL/min, no gráfico do primeiro
fluxo é possível notar que o tempo da análise é de 5minutos aproximadamente e para o segundo
gráfico de 3,5 minutos, enquanto no terceiro gráfico são necessários 2,5 minutos aproximadamente
para realizar uma análise o que permite um maior número de análises no período de 1 ano como
proposto, se analisarmos os cálculos a seguir:
 1 𝑎𝑛á𝑙𝑖𝑠𝑒 60𝑚𝑖𝑛 24ℎ 360 𝑑𝑖𝑎𝑠
𝑛𝑎𝑛á𝑙𝑖𝑠𝑒𝑠 = . . . = 103.680 𝑎𝑛á𝑙𝑖𝑠𝑒𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑎𝑛𝑜
5𝑚𝑖𝑛 1ℎ 1 𝑑𝑖𝑎 1 𝑎𝑛𝑜
1 𝑎𝑛á𝑙𝑖𝑠𝑒 60𝑚𝑖𝑛 24ℎ 360 𝑑𝑖𝑎𝑠
𝑛𝑎𝑛á𝑙𝑖𝑠𝑒𝑠 = . . . = 148.114 𝑎𝑛á𝑙𝑖𝑠𝑒𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑎𝑛𝑜
3,5 𝑚𝑖𝑛 1ℎ 1 𝑑𝑖𝑎 1 𝑎𝑛𝑜
1 𝑎𝑛á𝑙𝑖𝑠𝑒 60𝑚𝑖𝑛 24ℎ 360 𝑑𝑖𝑎𝑠
𝑛𝑎𝑛á𝑙𝑖𝑠𝑒𝑠 = . . . = 207.360 𝑎𝑛á𝑙𝑖𝑠𝑒𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑎𝑛𝑜
2,5 𝑚𝑖𝑛 1ℎ 1 𝑑𝑖𝑎 1 𝑎𝑛𝑜

Além disso, se analisarmos o número de pratos teóricos, o primeiro e o terceiro gráfico são os que
possuem os maiores valores, no entanto como discutido a primeira condição de fluxo permite um
menor número de análises.
Portanto o uso do fluxo de 2,0 mL/min é o ideal por permitir um maior número de análises
garantindo a eficiência da coluna apesar de gerar um maior volume de resíduo.
DADOS DO EXPERIMENTO :
Fluxo (mL/min) Pressão da bomba (kgf) Tr ultimo pico (min) Wb do último pico (min)
1 171 4,4 0,5
1,5 245 2,9 0,4
2,0 320 2,3 0,3

Fluxo 1 mL/min
Fluxo 1,5 mL/min

Fluxo 2,0 mL/min