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Dissertacao Entero Bactaria Sakazaki
Dissertacao Entero Bactaria Sakazaki
INTRODUÇÃO
1
Pouco se sabe sobre sua ecologia, taxonomia (WHO, 2004) e sobre o seu
baixa, tendo sido relatada por STOLL et al. (2004) como sendo de 1:10660 bebês
com peso muito baixo. Já a taxa de mortalidade é bastante elevada, com relatos
2004; FARBER, 2004) com neonatos indo à óbito poucos dias após o parto. Os
(FARBER, 2004).
diferentes cepas. O estudo realizado por BLOCK et al. (2002) sugere que existam
humanos.
2
A infecção por E. sakazakii é rara sendo que, ao redor do mundo, há até o
montante de crianças filhas de mulheres portadoras de HIV, uma vez que estas
3
Em 1961, na Inglaterra, foi publicado o primeiro relato de meningite de
infecção generalizada após alguns dias de vida. A incubadora foi implicada como
4
sim, da garganta e do reto dos neonatos que apresentaram sinais clínicos
complicações.
após alguns dias de vida. Na avaliação realizada, o patógeno não foi isolado dos
5
fórmula. Foram administrados gentamicina e ampicilina e a criança sobreviveu
durante o nascimento.
Na revisão realizada por LAI (2001) constam cinco casos de infecções por
VAN ACKER et al. (2001) descreveram o que ficou conhecido como “surto
similaridade genética entre cepas isoladas dos pacientes e aquelas isoladas das
6
colhidas do liquidificador utilizado na reconstituição das fórmulas infantis foram
7
proibiu, em todo o território nacional brasileiro, o ingresso, a comercialização, a
infantil com ferro para lactentes”, em pó, das marcas Pregestimil e Enfamil
nascido prematuro, que mesmo após tratamento com antibióticos, veio a falecer
Brasil. O primeiro caso relatado foi descrito por OLIVEIRA et al. (1999). Os
falecer.
O caso mais recente foi relatado por BARREIRA et al. (2003) que
8
amamentado exclusivamente ao seio. Na cultura do líquor, foi detectada E.
à infecção em adultos.
meningite em adultos.
sakazakii, como por exemplo, febre e irritabilidade (WILLIS; ROBISON, 1988) são
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do grupo B, seguidos pela Listeria monocytogenes, Staphylococcus, Candida spp
algumas alterações para simular o leite materno. Dentre estas alterações pode-se
desidratados.
a seco.
ainda utiliza o processo úmido, mas irá mudar para o seco, para se alinhar com
10
Fórmulas infantis em pó são utilizadas quando as mães são
infantil consumida no mundo todo. Como não é um produto estéril, pode conter
mecanismos que a bactéria usa para sobreviver nessas condições, como por
exemplo, o acúmulo de trealose nas células. Para isso, eles testaram “in vitro” a
enteritidis.
11
É importante destacar que as fórmulas infantis incriminadas nos surtos e
cinco amostras examinadas (n), uma (c) poderia conter população de coliformes
Este novo plano, mais estrito, visa garantir uma maior segurança aos bebês.
2002a).
Por esta razão, o Food and Drug Administration (FDA, EUA) tem se
preocupado cada vez mais com o uso desse produto na alimentação de recém-
minimizar riscos de infecção tem sido recomendado por eles que as fórmulas
infantis em pó não sejam utilizadas nestas unidades, a menos que não exista
12
potencial de multiplicação do microrganismo durante o preparo e o tempo de
temperatura ambiente;
25, 36 e 45°C. Eles verificaram ainda que 15 das cepas testadas se multiplicaram
13
aureus, Candida albicans, Mycobacterium em cinco amostras de fórmulas infantis
valores D para cada temperatura foram, respectivamente, 54.8, 23.7, 10.3, 4.2 e
2.5 min. Com base nestes resultados, os autores concluíram que E. sakazakii é
14
térmico de 68°C por 16 segundos. Isto indica que a pasteurização padrão é
et al. (1980).
15
MUYTJENS et al. (1988), na Holanda, examinaram 141 amostras
16
SORIANO et al. (2001), na Espanha, isolaram E. sakazakii de alface “in
natura” (um entre 40 amostras), mas não de alface processada pronta para o
embutidos e hortaliças.
Visto que o organismo não faz parte da flora intestinal normal humana e
HAMILTON et al., (2003) que verificaram que o E. sakazakii pode ser encontrado
família Enterobacteriaceae.
17
(fábricas produtoras de leite em pó, massas, cereais, chocolate, farinha de batata
estábulo indica, que o esterco animal é uma reserva natural em potencial deste
patógeno.
18
Nos casos de doenças provocadas por fórmulas infantis administradas em
em todos os materiais.
19
Da mesma forma que ocorre na indústria ou em lactários, os biofilmes de
α-glucosidase.
dois enriquecimentos.
20
violeta (VRBGA) e incubado por 18 horas a 36°C. Cepas características de
reação positiva α-glucosidase. O API 20E pode ser usado para identificar as
provável.
Além disso, até cinco colônias são transferidas para placa contendo ágar soja
tripticase (TSA) e incubadas a 25°C por 48-72 horas. Colônias de cor amarela
21
submetidas ao teste de produção de oxidase, identificação empregando-se o kit
22-24h. A seguir é semeada em TSA com sais biliares que é então incubado a
37°C por 24 horas com luz. O microrganismo nestas condições produz colônias
26% das amostras analisadas pelo método preconizado pelo FDA (UNITED
STATES, 2002a).
22
DFI com colônias de E. sakazakii (verde), Proteus (amarela) e Serratia
apresentam-se de cor azul-escuro após incubação a 35°C por 24 horas (figura 2).
esverdeadas.
tanto para alimentos como para amostras ambientais (BAX® System, 2000). O
23
combinadas com uma solução de lise e tratadas termicamente, o que leva a
paramagnéticas e após lavagem, estas podem ser utilizadas tanto para PCR
UFC/100g de amostra.
24
1.
E. sakazakii
Serratia
Proteus
Figura 1. Placa de ágar DFI com colônias de E. sakazakii (verde), Proteus (amarela)
e Serratia (vermelha) (http://www.rapidmicrobiology.com/news/603h93p.JPG).
2.
25
2. OBJETIVOS
sakazakii.
na enumeração de E. sakazakii.
26
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. MATERIAL
foram examinados 5 tipos de fórmulas infantis (com ferro indicada para crianças
27
As amostras foram transportadas para o laboratório e armazenadas em
A tampa plástica das latas foi sanificada com álcool 70%, antes da retirada
modelo AS2000, Brasil) porções de 1g, 10g e 100g com o auxílio de colher
3.2 MÉTODOS
Unido).
3.1.1) foram ativadas por semeadura em placa contendo ágar infusão de cérebro
e coração (BHI) e incubadas a 37°C por 24 horas. Após esse período, uma
28
população no tempo zero e a cada 30 minutos até o período máximo de seis
expressa em UFC/ml. Estes experimentos foram repetidos pelo menos três vezes
37°C/24 horas. A seguir, uma colônia isolada foi adicionada a 50 ml de caldo TSB
com posterior incubação a 35°C com agitação 140-150 rpm por 2,5 horas para E.
coli e E. aerogenes e por 5 horas para E. sakazakii. Após esse período, diluições
29
3.2.3.1. Avaliação da eficiência do meio cromogênico E. sakazakii
(formulação DFI)
placa contendo ágar BHI e incubado a 37°C por 24 horas. Após este período,
placas contendo ágar DFI (anexo 2). As placas foram incubadas a 37°C por 24
diluídas com 900 ml, 90ml e 9ml (1:10), respectivamente, em água destilada
violeta (VRBGA) que foram incubadas a 36°C por 18 horas. Até cinco colônias
típicas (cor púrpura com halo também púrpura) foram transferidas para placa
contendo ágar soja tripticase (TSA) e incubadas a 25°C por 48-72 horas.
30
Colônias de cor amarela intenso no ágar TSA foram consideradas
caldo lauril sulfato triptose modificado (mLST) (LST adicionado de 0,5M de NaCl)
mLST (anexo 1). Os tubos foram incubados a 45°C por 24 horas. Após
DFI que foram incubadas a 37°C por 24 horas. Uma a cinco colônias
placas de ágar TSA e incubadas a 25°C por 48 horas para verificar a produção
31
de pigmento amarelo. A confirmação das colônias apresentando coloração
32
A. FDA B. ISO
Pré- enriquecimento
10ml 0,1ml
VRBGA DFI
Isolamento
incubação 35-37°C/24h
Alça 0,1 ml
Colônias características
TSA
Identificação Incubação 25°C / 48-72h
33
100g leite + 900ml de BPW 10g leite + 90ml BPW 1g leite + 9ml de BPW
Incubação 37°C/18 ± 2 h
0,1ml
Incubação 45°C/24 ± 2 h
DFI
Incubação 35-37°C/24h
colônias características
TSA
Colônias características
Provas bioquímicas
34
3.2.5. ENUMERAÇÃO DE Enterobacteriaceae (KORNACKI;JOHNSON,
2001)
vermelhas com bolhas de gás com ou sem zonas amarelas são consideradas
35
Homogeneização -1 -2 -3
Placas de PetrifilmTM
contagem de
enterobactérias
Incubação a 37°C/ 24 h
Leitura
36
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
foram realizadas. Os caldos (TSB) foram incubados a 37°C sob agitação de 140
em fase estacionária após 3,5 horas de incubação, tendo atingido 108 UFC/ml
UFC/ml (figura 8)
10,00
Log UFC/ ml de E. coli
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
0 1 2 3 4 5
Tempo (horas)
37
10,00
8,00
E. aerogenes
Log UFC/ ml
6,00
4,00
2,00
0,00
0 1 2 3 4 5
Tempo (horas)
12,00
Log UFC/ ml E. sakazakii
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
0 2 4 6 8
Tempo (horas)
38
4.2. AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DO MEIO CROMOGÊNICO-DFI
primeira vez por MUYTJENS et al. (1984). Esses autores verificaram que
39
alimentos testados quando utilizaram o ágar DFI, enquanto somente 19 amostras
E. sakazakii, como por exemplo, o ESIA (AES laboratoire) e o ESPM (R&F Lab)
entre tanto, estes meios não possuem representantes em nosso país, o que
dificultaria sua aquisição. Uma vez que o DFI apresentou bom desempenho,
40
A
41
4.3. AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DAS METODOLOGIAS ISO E FDA
Uma vez que VRBGA não é um meio específico para E. sakazakii, seu
emprego faz com que um maior número de colônias suspeitas sejam testadas,
totalidade das colônias presentes nas placas deveria ser analisada, o que é
42
Como o meio DFI permite a diferenciação de E. sakazakii dos demais
simples e segura.
sakazakii pelo método ISO. Nesse método, o caldo secundário tem como base o
vancomicina.
com semeadura em ágar DFI para este estudo. Uma vez que se propôs a
43
4.4. ENUMERAÇÃO DE Enterobacter sakazakii e Enterobacteriaceae
Os dados necessários para ARM devem ser quantitativos, o que faz com
que boa parte dos dados existentes sobre patógenos na literatura seja de pouca
valia por serem qualitativos. Para que se possa estimar o risco de ocorrência de
(“Data Colection for International Microbial Food Safety Risk Assessments”, ILSI
ter uma estimativa da ocorrência do patógeno em questão (ou sua toxina) e sua
(“risk management”).
44
Todas as 150 amostras examinadas neste estudo, independente de marca
sua preparação, mas o microrganismo foi, por inúmeras vezes, isolado na fórmula
45
MUYTJENS et al. (1988) relataram populações variando entre 0,36 a 66,0
lata de fórmula infantil em pó aberta que estava sendo utilizada durante o tempo
UFC/100g.
46
IVERSEN; FORSYTHE (2004) utilizando o método do FDA e semeadura
coliformes em 1322 (84%) amostras era inferior 3 NMP/g e nas demais amostras
et al, 2005).
47
A fim de minimizar problemas ocorridos durante a produção de fórmulas
pontos.
BAX®.
48
A fim de facilitar a visualização dos resultados apresentados na Tabela 2
49
Tabela 1. Identificação dos pontos amostrados pela empresa B no
ambiente da linha de processamento de fórmulas lácteas infantis
desidratadas.
50
100%
80%
60%
40%
20%
0%
%(E1) %(E2)
51
pós-pasteurização do produto (BREEUWER et al., 2003; EDELSON-MAMMEL et
al., 2005).
inativação de E. sakazakii.
medidas, quatro podem ser aplicadas pelas indústrias processadoras. São elas:
preparação.
52
É importante enfatizar que a fórmula infantil em pó produzida de acordo
fabril quanto na fórmula infantil em pó. Para isto, a indústria deve levar em
53
6. CONCLUSÕES:
54
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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61
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out. 2004.
62
ANEXOS
63
1. Formulação do meio caldo lauril sulfato triptose modificado (mLST)
adicionado de vancomicina
Componente g/l
Cloreto de sódio (NaCl) 34
Enzima digestiva de tecido animal e planta 20
Lactose (C12H22O11) 5
Fosfato de potássio monobasico (KH2PO4) 2,75
Fosfato de potássio dibasico anidro (K2HPO4) 2,75
Sulfato lauril (C12H25NaO5S) 0,1
Água 1000ml
por filtração. Esta solução pode ser mantida de 0 a 5°C por até 15 dias.
10 µg/ ml de mLST.
Este meio pode ser preparado a partir do meio comercial lauril sulfato
64
2. Formulação ágar cromogênico Enterobacter sakazakii
(formulação DFI)
Componente g/litro
Triptona 15,00
Peptona de soja 5,00
Cloreto de sódio 5,00
Citrato de amônio férrico 1,00
Desoxicolato de sódio 1,00
Tiosulfato de sódio 1,00
Reagente cromogênico 0,10
ágar 15,00
autoclave a 121°C por 15 minutos. Este meio é comercializado pela Oxoid sob
número CM1055.
65