Espermograma Manual PDF

Laboratório Clínico ...
Setor: Líquidos Corporais Espermograma Manual

Sub-setor: Esperma Indexação:
Espermograma Manual
1. Introdução
A análise do esperma fornece uma fotografia instantânea do potencial de fertilidade masculina e é um teste inicial,
uma triagem, para a avaliação da fertilidade do casal. Por ser relativamente barato e não-invasivo, em geral é o
primeiro teste solicitado na avaliação do casal infértil ou em caso de vasectomia (antes da sua realização e para a
verificação de seu sucesso). O espermograma pode ainda ser usado para a avaliação de exposição a substâncias
tóxicas em análises ambientais ou ocupacionais. É necessário enfatizar que a análise seminal não é, isoladamente,
um teste de fertilidade, mas constitui-se na pedra básica da avaliação do fator masculino, pois é capaz de prover
informações da produção testicular, de algumas propriedades funcionais dos espermatozóides e da função secretora
das glândulas acessórias.
Por razões de padronização e para que resultados obtidos em locais diferentes sejam comparáveis e confiáveis, os
testes que envolvem sêmen devem ser realizados de acordo com diretrizes públicas, como as estabelecidas pela
Organização Mundial de Saúde (OMS). O presente documento descreve o procedimento para realização do perfil de
análises “Espermograma” do Laboratório XXX, exclusivamente por meio de análises não-automatizadas.
2. Princípio
A análise seminal não permite uma conclusão direta sobre a fertilidade do paciente, a qual depende de características
do espermatozóide não-identificáveis por meio desse exame. Entretanto, o exame pode evidenciar o potencial de
reprodução do indivíduo e apontar doenças subjacentes curáveis.
O sêmen é em geral coletado por masturbação, após período variável de abstinência sexual. Devido à variação
biológica que ocorre na emissão do sêmen, as conclusões sobre infertilidade devem ser baseadas em um mínimo de
duas amostras distintas. As condições fisiológicas normais orientam a coleta com intervalos de três meses. (tempo
de renovação completa da espermatogênese).
O esperma ou sêmen é o produto de fluidos e células dos testículos e das glândulas masculinas acessórias e é
composto primariamente do seguinte:
• Pequena quantidade de secreções ácidas da próstata, as quais contêm zinco, ácido cítrico, fosfatase ácida e
antígeno prostático específico (PSA);
• Secreções da ampola e dos vasos deferentes contendo os espermatozóides; e
• Secreções alcalinas das vesículas seminais que perfazem a maior parte do volume seminal e contêm frutose e
seminogelina.
O espermograma é, na verdade, um painel de testes para a avaliação da função dos testículos e das glândulas
acessórias, cada uma destas análises requer técnicas e habilidades distintas.
Tabela 1- O que o espermograma avalia

Fluidos e produtos protéicos das glândulas acessórias Volume
(avaliação indireta) Coagulação
Liquefação
Consistência (“viscosidade”)
Espermatogênese Concentração
Motilidade
Maturação
Morfologia
Viabilidade
Inflamação ou Infecção Leucócitos
2.1. Análise Automatizada (CASA)

Alguns laboratórios usam o computador para a análise de alguns parâmetros do esperma. Ela é chamada
CASA, ou Computer Assisted Semen Analysis. Por um lado, esta análise parece mais objetiva e, portanto
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reprodutível. Por outro lado, há controvérsias quanto ao seu real valor, uma vez que muitos de seus detalhes
técnicos são específicos de cada sistema e variam entre os laboratórios.
Fig1 – Equipamento CASA Fig. 2 – Exemplo de tela (Motilidade)
Nota do LABConsult: Uma automação prática e custo-efetiva para a análise do sêmen não está ainda disponível
na maior parte dos laboratórios e, em geral os “computer-assisted semen analyzers” (CASA) são dispendiosos.
Além do mais, qualquer sistema automatizado deve ser validado por comparação com as técnicas manuais. As
análises automatizadas não são abordadas neste documento.
2.2. Termos relacionados

• Normozoospermia: ejaculado sem alterações segundo os critérios de normalidade.
• Aspermia: ausência de fluído ejaculado na presença de orgasmo e sensação ejaculatória, o mesmo que
"orgasmo seco".
• Anejaculação: ausência de ejaculação, orgasmo e sensação ejaculatória.
• Hipospermia: volume ejaculado menor que 2,0 ml.
• Hiperespermia: volume ejaculado maior que 5,0ml.
• Azoospermia: ausência de espermatozóides.
• Polizoospermia: concentração espermática maior que 250 milhões/ml ou maior que 600 milhões/
ejaculado.
• Astenospermia: motilidade menor que 50% de espermatozóides progressivos.
• Teratozoospermia: morfologia normal menor que 30% (OMS) ou que 14% (Kruger).
• Oligo-astenoteratozoospermia: alteração das três variáveis.
• Necrozoospermia: todos os espermatozóides mortos.
• Criptozoospermia: somente alguns esparsos espermatozóides em todo o ejaculado.
3. Significado clínico
Estudos atuais têm demonstrado que aproximadamente 20% dos casais, ou seja, um em cada cinco, apresenta
dificuldades no que tange à fertilidade. Além das causas masculinas, a infertilidade pode ter causa feminina, ou uma
combinação de ambas, e ainda há casos onde não há causas aparentes para o problema. É extremamente relevante
que a avaliação da infertilidade que se considere o casal como uma unidade durante a avaliação e o tratamento, e
que se estudem ambos paralelamente até se descobrir o problema. Já foi demonstrado que quanto mais tempo o casal
permanece subfértil, piores são as chances de uma cura eficaz. Deve-se considerar a possibilidade de iniciarem-se
imediatamente exames no homem e essa avaliação inicial deve ser rápida, não-invasiva e com relação custo-eficácia
favorável.
Cerca de 40% a 50% dos casos se devem a fatores masculinos e estão ligados à produção de espermatozóides. As
estatísticas mostram que, entre as causas de infertilidade masculina conhecidas, as mais freqüentes são a varicocele
(70%), os processos inflamatórios (20%) e a disfunção hormonal (10%). Aproximadamente 40% dos casos de
infertilidade masculina não apresentam causa identificada.

Por meio do espermograma podem ser evidenciadas ausência de espermatozóides (azoospermia), a diminuição do
seu número (oligospermia), alteração na forma (teratospermia), na capacidade de movimento (astenospermia) ou na
vitalidade (necrospermia).
Para auxiliar no diagnóstico da infertilidade masculina, o sêmen deve passar por análises citológicas, bioquímicas e
outras que auxiliam esse diagnóstico. A OMS recomenda a análise de pelo menos um marcador bioquímico para
cada glândula acessória genital. Para um diagnóstico preciso de infertilidade qualquer resultado anormal deve ser
sempre relacionado com alterações em outros parâmetros. Além disso, os cuidados com a coleta do material, a
conservação da amostra, o intervalo de tempo entre o ejaculado e as análises, bem como a qualidade das
metodologias empregadas, devem ser observados, considerando que todos podem interferir no resultado final.
3.1. O aparelho reprodutor masculino

O aparelho reprodutor masculino é formado por uma série de importantes órgãos com a finalidade moldada
no sentido da reprodução humana. Divide-se em quatro conjuntos de órgãos: dois testículos com função de
produzir espermatozóides e hormônios sexuais masculinos (nos tubos seminíferos e nas células intersticiais);
uma série de tubos e condutos por onde passará o esperma, isto é, passará o espermatozóide junto ao plasma
seminal (tubos retos, canalículos eferentes, conduto do epidídimo, canal deferente, ampola do canal
deferente, canal ejaculador, uretra prostática e uretra peniana); glândulas acessórias do aparelho reprodutor
masculino: próstata, vesículas seminais, glândulas de Cowper ou bulbo-uretrais e glândulas de Littré ou
uretrais; um órgão de cópula, o pênis.
Fig. 3 – Aparelho Reprodutor Masculino
3.2. Infertilidade masculina

O fator masculino está envolvido em cerca de 40 a 50% dos casos de infertilidade conjugal, por isso, uma
avaliação inicial minuciosa do esperma deve ser sempre realizada, no intuito de que doenças potencialmente
curáveis possam ser diagnosticadas e tratadas adequadamente. É essencial na investigação do homem infértil
um histórico detalhado e um exame físico minucioso.
O número de homens inférteis tem aumentado não só devido ao crescimento da população, mas também em
função de uma diminuição em nível mundial da fertilidade masculina. Estima-se que durante os últimos 50
anos a média de contagem dos espermatozóides tenha diminuído em 50%. As razões dessa diminuição não
estão claramente definidas, porém acredita-se que podem estar influenciadas por fatores ambientais
(poluição), por exemplo, gerando mais dificuldades na função reprodutiva.
A produção de espermatozóides pode sofrer interferência de fatores como a idade do indivíduo - quanto mais
avançada a idade, menor a produção; sua ocupação profissional - contato com substâncias tóxicas como
agrotóxicos e inseticidas; ou se trabalha em áreas de muito calor, como altos-fornos e, os antecedentes
familiares - se há doenças hereditárias envolvidas, ou casos de infertilidade familiar. Outros antecedentes e
alguns hábitos pessoais também podem determinar a existência de espermatozóides com motilidade e
vitalidade diminuídas, entre eles: certos tipos de cirurgias, traumatismos, uso de drogas (tanto ilícitas como
substâncias químicas terapêuticas podem provocar degeneração das células germinativas), álcool, atividade
sexual (a abstinência prolongada, ou a freqüência aumentada, podem diminuir a capacidade de fecundação do
homem, em alguns casos), temperatura (o calor excessivo é prejudicial aos testículos, doenças que causam

febre produzem alterações nos níveis de espermatozóides, a mudança súbita de temperatura externa e de
altitude, como por exemplo, passando-se rapidamente de uma região fria para outra quente e úmida, podem
diminuir a fertilidade masculina durante algum tempo), nutrição (a boa alimentação influencia o
desenvolvimento e função das glândulas genitais), vitaminas (há estudos mostrando que o homem precisa das
vitaminas A e E para se manter fértil, embora ainda haja muitas dúvidas sobre o assunto, a falta acentuada de
vitamina A produz lesões progressivas nas células germinativas, considerando que o sêmen é constituído de
vários sais minerais), doenças como diabetes (acarreta lesões vasculares e neurológicas, que podem levar à
diminuição da fertilidade, ou mesmo à impotência) e, finalmente, o estresse (fatores emocionais podem
influenciar diretamente a diminuição do número de espermatozóides, segundo alguns estudos).
As estatísticas mostram que, entre as causas identificadas de infertilidade, as mais freqüentes são a varicocele
(70%), os processos inflamatórios (20%) e a disfunção hormonal (10%). Em cerca de 40% dos casos de
infertilidade masculina, a causa não chega a ser identificada. Além destas causas, ainda podem ocorrer
produção ou excreção inadequada do espermatozóide, anticorpos anti-espermatozóides, obstrução do trato
genital, criptorquidia, distúrbios do canal da ejaculação e anormalidades genéticas. O interesse no estudo das
causas da infertilidade sempre foi grande, atualmente, porém, tem aumentado paralelamente ao
desenvolvimento de novas tecnologias reprodutivas. O advento da fertilização in vitro e, principalmente, da
injeção intra-citoplasmática de esperma têm permitido que homens com alto grau de infertilidade possam,
finalmente, tornarem-se pais.
Quando o homem infértil procura o urologista, a varicocele é o diagnóstico mais comum, felizmente, é
também o mais tratável. A varicocele é uma veia dilatada e varicosa do cordão espermático, podendo se
apresentar como um "enovelado" dentro da bolsa escrotal. É provocada por fluxo sanguíneo retrógrado
secundário a válvulas incompetentes ou ausentes nas veias espermáticas. A varicocele não é mais do que a
dilatação das veias que provém do testículo, por refluxo e estagnação do sangue. Esta doença pode estar
presente em 30 a 40% dos homens, ocasionando desconforto e dores relacionados com os testículos quando
seu tamanho é volumoso, porém, na maioria das vezes não causa sintomas. Uma varicocele pode ser
descoberta pela primeira vez durante um exame físico quando se pede ao paciente que, na posição de pé,
tussa ou realize a manobra de Valsalva. Se a varicocele estiver presente, a pressão intra-abdominal produzida
pela tosse ou pela manobra de Valsalva transmite-se às veias testiculares dilatadas e pode ser sentida no
escroto. Sempre que uma varicocele é detectada, deve ser feito um espermograma. Uma varicocele que cause
problemas de fertilidade, geralmente resulta em um espermograma com diminuição da quantidade de
espermatozóides e o chamado "padrão de estresse", isto é, numerosas formas imaturas, imóveis e mortas.
Estudos recentes demonstram a associação da infertilidade masculina com pequenas deleções
(microdeleções), em uma região localizada no braço longo do cromossomo Y (Yq), definida como AZF
(Fator para Azoospermia). Geralmente 7% dos homens inférteis apresentam microdeleções no cromossomo
Y. Levando-se em consideração apenas os casos de homens com Azoospermia Idiopática ou Oligospermia
Grave, que correspondem a 20% de todos os casos de infertilidade masculina, microdeleções em AZF são
encontradas em aproximadamente 38% dos homens azoospérmicos e em 23% dos homens com oligospermia
grave. Com o advento da técnica de reprodução assistida, a injeção intracitoplasmática de espermatozóides
(ICSI), homens com esta microdeleção podem se tornar pais. Entretanto, se a causa da infertilidade do pai for
devida à microdeleções no cromossomo Y e como a herança do cromossomo Y é sempre de origem paterna,
o filho gerado através desta técnica também pode ser infértil. Por tanto, a detecção destas microdeleções no
pai é indispensável quando se deseja realizar esta técnica.
Tradicionalmente, o diagnóstico de infertilidade masculina depende de uma avaliação descritiva dos
parâmetros do ejaculado, com ênfase na concentração, motilidade e morfologia dos espermatozóides. A
filosofia fundamental dessa abordagem é que a fertilidade masculina pode ser definida em termos de um
número mínimo de espermatozóides morfologicamente normais, com movimento progressivo, que deve ser
excedido para que um determinado indivíduo seja considerado fértil. O espermograma deve ser solicitado
logo no início da investigação do casal infértil. Em caso de alteração espermática, a rotina é pedir pelo menos
dois testes com intervalos de três meses, isto porque, este é o período, aproximadamente, necessário para o
nascimento de uma nova “fornada” de espermatozóides. Em alguns casos, um fator ambiental ou
medicamentoso poderá estar alterando temporariamente a qualidade do sêmen. É de grande importância
afastar uma provável infecção espermática e até mesmo uma prostatite.
Infelizmente, pelo menos 25% a 40% dos homens inférteis apresentam infertilidade idiopática, para a qual
não existe nenhuma causa identificada. É de se esperar que mais causas sejam descobertas com a expansão
do conhecimento sobre a fisiologia reprodutiva masculina.
3.3. Espermograma Pós-vasectomia

O espermograma para confirmar o sucesso da vasectomia visa unicamente identificar a presença ou ausência
de espermatozóides. A amostra deve ser coletada seis semanas ou 20 ejaculações após a cirurgia e sempre
centrifugadas e a busca de espermatozóides deve ser feita no sedimento. Caso sejam ainda vistos
espermatozóides, outra amostra deve ser coletada quatro semanas mais tarde. O espermograma deve ainda ser
repetido após alguns meses para se ter certeza de que os vasos deferentes não se recanalizaram.
3.4. Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide (ICSI)

A injeção intracitoplasmática de espermatozóide ou ICSI foi um método desenvolvido na Universidade de
Bruxelas, na Bélgica, e os primeiros resultados foram publicados em 1992. Com o auxílio de um micro
manipulador acoplado a um microscópio, o ovócito é segurado com uma micropipeta, enquanto que com
outra, o espermatozóide é captado e introduzido dentro do citoplasma do ovócito. Através desta técnica, a
fertilização é normal em mais de 50% dos ovócitos injetados. Os resultados mostram que a incidência de
anormalidades genéticas entre os bebês nascidos pela ICSI está dentro da normalidade da reprodução
assistida e da população geral. Para pacientes azoospérmicos ou vasectomizados, esta nova técnica pode ser
usada com espermatozóides obtidos do epidídimo ou do testículo, com resultados igualmente satisfatórios.
Fig.4 - ICSI
4. Fase Pré-analítica
4.1. Preparo do Paciente

Nota do LABConsult: O Laboratório deve acrescentar aqui a sua rotina para coleta: locais, dias, horários,
marcação prévia, instruções a serem entregues para o paciente, procedimento para coleta em domicílio e
etc.
• Quanto à coleta do material, o paciente deverá coletá-lo preferencialmente no próprio laboratório e na

unidade onde o exame será feito, em um ambiente calmo e privado para evitar inibição.
• A abstinência sexual varia entre 2 e 7 dias, padronizando-se abstinência de 5 dias ou conforme a
orientação do médico. Para reduzir a variabilidade dos resultados das análises seminais, o número de
dias de abstinência sexual deveria ser o mais próximo possível do ritmo ejaculatório habitual do
paciente.
• O paciente deve se abster de bebidas alcoólicas ou substâncias tóxicas desde 48 horas antes da coleta.
• Caso seja dosada a frutose deve-se fazer jejum alimentar de 12 horas.
• Duas amostras devem ser coletadas para uma avaliação inicial. O intervalo ideal entre duas coletas é de
três meses. Contudo, deve ser seguida a orientação do médico. Se os resultados forem significativamente
diferentes, amostras adicionais podem ser analisadas.

4.2. Formulário Próprio

O nome do paciente, o período de abstinência, a data e a hora da coleta, perda ou não de material durante a
coleta e o intervalo entre a coleta e análise da amostra são anotados em cada análise seminal.
4.3. Coleta
• Idealmente a amostra deveria ser coletada numa sala particular perto do laboratório (do local da análise).
Se isso não for possível, ela deve ser entregue ao laboratório dentro de no máximo 1 hora e idealmente
em 30 minutos.
• A amostra deve ser obtida por masturbação, sem uso de saliva, água ou outro lubrificante.
• A amostra deve ser ejaculada num frasco adequado de vidro ou plástico estéril e de "boca larga". O
recipiente não deve apresentar, comprovadamente, efeitos tóxicos sobre os espermatozóides.
• Caso a masturbação não seja possível ou desejável, preservativos especiais inertes (ex: poliuretano)
podem ser utilizados, entretanto preservativos de látex comuns não podem ser utilizados porque
interferem na viabilidade dos espermatozóides. Coito interrompido também não é aceitável como um
método de coleta pois a primeira porção do ejaculado, que normalmente contém a maior concentração de
espermatozóides, pode ser perdida.
Fig. 5 – Exemplo de kit para coleta de Fig. 6 – Exemplo de preservativo para coleta de
espermograma espermograma
4.4. Transporte
Como a análise de esperma não é urgente, de preferência deve ser agendada de forma a evitar demoras na
execução. O esperma deve ser analisado dentro de 60 a 90 minutos após a coleta e o registro do horário de
coleta e do horário de início da análise é essencial. Caso haja demora da análise, ela deve constar do laudo. A
motilidade da amostra declina consideravelmente após 3 horas e continua a declinar nas próximas 6 a 18
horas. Quando a demora for inevitável, manter o esperma em temperatura ambiente.
A amostra deve ser protegida de extremos de temperatura (menos de 20°C e mais de 40°C) durante o seu
transporte ao laboratório. Uma estratégia é mantê-la junto ao corpo durante o transporte.
Após a ejaculação, alguns autores recomendam homogeneizar bem a amostra e mantê-la na estufa a 37o C,
até a liquefação final, examinando-a de 5 em 5 minutos. O exame deve ser iniciado imediatamente após a
liquefação ou deve ser feito dentro de 60 a 90 minutos da coleta.
4.5. Identificação
O frasco deve ser adequadamente etiquetado com pelo menos o nome do paciente, número de identificação,
data e hora da coleta.
5. Fase Analítica - Exame Macroscópico

A análise seminal se divide em duas partes: macroscópica e microscópica. Em relação ao exame físico, os testes só
poderão ser realizados após a liquefação total do sêmen, pois durante a fase de coagulação, além de o esperma ser
naturalmente heterogêneo, os espermatozóides ficam retidos nos "coágulos" formados após a ejaculação, o que
altera a análise física. Portanto, a maioria das provas será iniciada dentro dos primeiros 30 minutos após a coleta do
material.
5.1. Liquefação ou Tempo de Duração da Coagulação (TDC)

O esperma passa por 3 estados após ter sido ejaculado:
• 1ª. Fase - liquefação inicial: de duração aparentemente virtual;
• 2ª. Fase - fase de coagulação: tempo normal de duração é de 5 a 30 minutos;
• 3ª. Fase - fase final ou de liquefação secundária: definitiva.
O sêmen normal se liquefaz em até 30 minutos em temperatura ambiente, embora isso normalmente ocorra
em 15 minutos. Os espermatozóides ficam retidos nas "malhas" dos coágulos, até estar completada a
liquefação. Este mecanismo é uma forma de proteger os espermatozóides do pH vaginal e sua ação deletéria
aos gametas masculinos. A coagulação e a liquefação espermáticas são altamente influenciadas pela ação
hormonal, principalmente pela di-hidrotestosterona e a testosterona, que regulam as secreções das glândulas
acessórias, em especial as produtoras de coagulação. Quedas nos níveis hormonais provocam diminuição da
produção de secreções prostáticas e vesiculares, alterando o TDC, geralmente produzindo liquefação
primária. Em alguns casos a liquefação completa não ocorre em 60 minutos e isto pode indicar uma
disfunção da próstata.
O PSA causa a proteólise da proteína seminogelina (antígeno específico das glândulas seminais) e ocasiona a
liquefação do sêmen. Portanto, a perda ou a secreção incompleta da primeira porção (prostática) das secreções, por
exemplo, durante a coleta, pode causar a liquefação incompleta. Amostras que falham em se liquefazer ou que têm
uma consistência aumentada podem ser difíceis de homogeneizar e pipetar, e isto deve ser alertado no laudo.
O período de liquefação inicial é extremamente curto nos casos normais. O processo de coagulação ocorre
imediatamente após a ejaculação e permanece por um período de 5 a 30 minutos, havendo, após isso, a
liquefação, fase final (definitiva), que produz um fluido de viscosidade variável, semelhante à sérica.
O TDC pode ser determinado através da análise visual ou por métodos que possam demonstrar de forma
quantitativa o final do período de coagulação (método conta-gotas), sendo para qualquer método, válidos os
tempos de referências de 5 a 30 minutos. Os semens com liquefação menor que 60 minutos podem ser
considerados normais.
A ausência de coagulação, conhecida por liquefação primária, pode ocorrer devido à falta completa ou
parcial de fatores de coagulação. Existem, paralelamente à liquefação primária, altas concentrações de alfa-1-
antitripsina no líquido espermático. Baixos níveis de di-hidrotestosterona e testosterona podem igualmente
ser responsáveis pela ausência de coagulação. A persistência do estado líquido do esperma reduz no meio
vaginal o número de espermatozóides de boa motilidade, o que comprova a ação protetora da coagulação
contra os efeitos indesejáveis do pH vaginal sobre os espermatozóides. Os casos de azoospermia e liquefação
primária são devidos na maioria dos casos a agenesias dos ductos deferentes e vesículas seminais.
A maioria das amostras com distúrbios do TDC apresentam liquefação entre 60 e 120 minutos. Por exemplo,
liquefação retardada do sêmen maior que 60 minutos pode indicar a presença de distúrbios funcionais da
glândula acessória. Porém, em alguns casos, o coágulo seminal não liqüefaz-se, mesmo após 24 horas de
observação, e isso resulta num líquido espermático de viscosidade elevada e geralmente com aspecto
heterogêneo ou ainda numa persistência de coágulo. Essa alteração, denominada liquefação parcial e
incompleta é uma causa relativamente comum de infertilidade, pois prejudica a motilidade espermática e
reduz a penetração dos espermatozóides no muco cervical. Se os espermatozóides são capazes de atingir o
muco cervical, os problemas de liquefação seminal não apresentam relevância clínica.
5.2. Aspecto/Cor/Odor
A amostra seminal deve ser imediatamente analisada após a liquefação. Uma amostra normal tem uma
aparência homogênea e uma cor branca-acinzentada opalescente. Pode parecer menos opaca se a
concentração seminal for muito baixa ou se houver ausência de espermatozóides; avermelhada pode indicar
sangue no sêmen, câncer de próstata ou prostatite; amarelada sugere infecção. Alterações podem ocorrer com
grandes períodos de abstinência.

O odor da amostra em geral é descrito como “sui generis” ou “característico”. Um odor desagradável e mais
intenso pode estar relacionado a uma infecção ou à deterioração da amostra.
5.3. Volume
Há evidências de que para muitos homens a coleta por meio de masturbação produz um volume de esperma menor
do que o gerado durante o coito. Portanto as medidas de volume, no melhor cenário, são uma estimativa
aproximada do débito seminal normal e provavelmente o subestimam. Usando uma pipeta sorológica de 5-ml
pode-se estimar o volume com a confiabilidade adequada.
ATENÇÃO: Não pipetar com a boca.
O volume total do esperma ejaculado representa a somatória das secreções das glândulas anexas. O volume
de sêmen em si, porém, somente afeta a fertilidade quando cai abaixo de 1,5 ml, já que o tamponamento
contra a acidez vaginal se torna inadequado, ou quando o volume é superior a 5 ml. O volume do ejaculado
normal é de 2,0 a 5,0 ml.
Volumes baixos (hipospermia) podem estar associados a coleta incompleta de sêmen, ejaculação retrógrada,
obstrução do ducto ejaculatório, deficiência androgênica, ou ainda pode tratar-se de um processo inflamatório
crônico. Mas a causa mais freqüente de hipospermia é a insuficiência vesicular, que geralmente é infecciosa,
com grande incidência de infecções por micoplasmas e clamídias.
Um volume acima de 5 ml (hiperespermia) gera a suspeita de infecção aguda nas glândulas anexas, mas pode
ser causado também pelo excesso de abstinência sexual (acima de 7 dias), geralmente acompanhado de altas
concentrações de espermatozóides de baixa vitalidade, com níveis de ácido cítrico e frutose levemente
diminuídos, assim como as taxas de diversas enzimas prostáticas. A hiperespermia pode ser um dos primeiros
sinais de tumores benignos ou malignos tanto da próstata como vesiculares. Os casos de aspermia podem ser
provocados por agenesia de glândulas vesiculares associadas à agenesia de ductos deferentes.
Valores inferiores a 1 ml são insuficientes para a realização de todas as provas de rotina do espermograma.
Mas a insuficiência de volume isolada não significa, em muitos casos, um problema muito importante sob o
aspecto infertilidade, principalmente, quando há boa vitalidade dos espermatozóides.
5.4. Consistência (Viscosidade)

Durante a pipetagem da amostra para a medição do volume a sua consistência pode ser avaliada. A
consistência (ou “viscosidade”) da amostra liquefeita é classificada como normal quando gotas são formadas
quando o líquido deixa a pipeta. No caso de viscosidade anormal verifica-se no processo de gotejamento a
formação de um filamento de cerca de 2 cm.
O aumento da consistência pode estar relacionado com disfunção prostática por inflamação crônica ou com
disfunção de vesículas seminais, afetando a produção de enzimas proteolíticas (espermolisinas prostáticas),
que agem na liquefação. A consistência anormal também pode intervir na avaliação de várias características
do sêmen, tais como motilidade, concentração ou determinação de anticorpos anti-espermatozóides. O
aumento da viscosidade diminui a motilidade dos espermatozóides, o que pode ser uma das causas de
infertilidade.
5.5. pH
A medição de rotina do pH do esperma não é necessária. O pH do esperma está relacionado às secreções da
próstata (ácida) e vesícula seminal (básica). Nos casos com baixo volume e completa ausência de
espermatozóides (azoospermia), o pH pode dar alguma indicação quanto à associação do problema às
glândulas acessórias ou à perda de volume durante a coleta, mas há outros testes com marcadores
bioquímicos mais confiáveis.
Os métodos para a medida do pH do esperma são potenciômetros com micro eletrodo ou tiras indicadoras,
graduadas em décimos de unidade, com faixa entre 6 e 9. A medida do pH deve ser executada dentro do
período de uma hora da coleta do sêmen e, normalmente, varia entre 7,2 e 7,8 ou 8,0.
As amostras com pH superior a 7,8 devem ser avaliadas quanto à presença de infecção ou prostatite. Um pH
acima de 8 pode indicar uma deficiência de secreção prostática no material, geralmente relacionada a
processos infecciosos graves e agudos. Frequentemente está relacionado à ausência de liquefação secundária
ou liquefação parcial, produzindo-se coágulos indissolúveis ou espermas com alta viscosidade,
respectivamente (deficiência de espermolisinas).

Em caso de pH menor que 7,2 pode-se suspeitar de agenesia ou oclusão das vesículas seminais e obstrução
de ducto ejaculatório. O pH ácido do esperma indica insuficiência da secreção vesicular, ocorrendo nos
processos de vasculites (geralmente com hiperespermia), ou agenesia uni ou bilateral das vesículas, sempre
em concomitância com agenesia dos deferentes e devido à baixa produção de secreções vesiculares são
sempre concomitantes à liquefação primária.
6. Fase Analítica – Exame Microscópico

Durante a investigação microscópica inicial da amostra, determina-se a concentração de espermatozóides
(contagem), a presença de aglutinação de espermatozóides, a sua motilidade, a morfologia, a vitalidade e a citologia
geral (presença de outros elementos celulares além dos espermatozóides).
6.1. Contagem ou Concentração

A melhor maneira de visualizar os espermatozóides é por meio de um microscópio dotado de objetiva de contraste
de fase com aumento de 20x. Muitos laboratórios, contudo, usam uma objetiva comum com aumento de 10x, o que
torna o processo mais difícil.
A melhor opção para a contagem é o uso de câmaras específicas para a contagem de esperma, de preferência
descartáveis. As câmaras específicas não necessitam que a amostra seja diluída e têm uma profundidade de campo
adequada (de 10 µm a 20 µm), o que permite a visualização de espermas imóveis e móveis no mesmo plano focal.
A homogeneização da amostra é crítica para a exatidão da contagem. A amostra liquefeita deve ser pipetada em um
tubo cônico de centrífuga e passada no vórtex a velocidade média por 2 a 3 segundos, duas vezes. Durante esta
pipetagem, a consistência pode ser avaliada. Alguns autores recomendam que em algum momento o esperma seja
colocado entre lâmina e lamínula para um exame a fresco em busca de bactérias, células redondas, aglutinação ou
agregação de espermatozóides a outras células e debris. O uso da câmara específica elimina também este passo.
A contagem em hematocitômetro está descrita no Anexo 1 deste documento.
Fig. 7 – Exemplos de câmaras de contagem de esperma.

Fig. 8– Câmara Específica de Contagem de Esperma - Fabricante: Hausser Scientific
Nome: Câmara de Contagem Petroff-Hausser
Características: Câmara de Neubauer melhorada para a contagem de bactérias, espermatozóides,
hemácias e vacinas. A Câmara tem 0,2 mm de profundidade e 1,5mm de espessura, em vidro, para uso
também em microscopia de campo escuro.
Fig. 9- Câmara Específica de Contagem de Esperma - Fabricante: Fisher Scientific
(www.fishersci.com)
Nome: Cell-Vu (DRM 600)
Características: Usada para a contagem de esperma em amostra não diluída. De vidro com lamínula
e duas câmaras para contagem em duplicata e profundidade ideal para a avaliação da motilidade do
esperma em monocamada.
A concentração dos espermatozóides é definida segundo as normas da Organização Mundial de Saúde
(WHO, 1992):
• Normozoospermia: > 20 x 106 espermatozóides/ml. (concentração normal)

• Oligozoospermia: < 20 x 106 espermatozóides/ml. (concentração abaixo dos valores de
normalidade)
• Polizoospermia: > 200 x 106 espermatozóides/ml. (concentração muito acima dos valores de
normalidade)
• Azoospermia: nenhum espermatozóide no ejaculado (análise do sedimento após centrifugação).
Portanto, o valor normal para concentração é de mais de 20 milhões de espermatozóides por ml ou de mais
de 40 milhões por ejaculado.
6.2. Motilidade
A presença e a qualidade da motilidade dos espermatozóides no líquido seminal são um fator importante na
determinação da fertilidade masculina. Somente um espermatozóide móvel é capaz de penetrar no muco
cervical, migrar pelo sistema reprodutor feminino, penetrar o óvulo e conseguir a fertilização. A motilidade
espermática é a mais importante medição individual da qualidade seminal e pode ser fator compensador em
homens com contagem espermática reduzida. A motilidade sofre influência de vários fatores, entre eles, a
viscosidade, a temperatura e as radiações eletromagnéticas (raios-X, luz ultravioleta e a própria luz visível).
Após longos períodos de abstinência (superior a 30 dias), há um aumento significativo de espermatozóides
imóveis. A motilidade é um fator necessário para a fertilidade, porém, não é suficiente para indicar
capacidade de fertilização.
A motilidade dos espermatozóides é uma área analítica sujeita a erros. Os três métodos manuais mais usados
estão na Tabela 2.
Tabela 2- Comparação dos métodos para determinação da motilidade
Método Facilidade Exatidão Precisão
Estimativa dos Difícil Pobre Pobre
espermatozóides móveis
Contagem dos Difícil Pobre Pobre
espermatozóides móveis
Contagem dos Fácil Excelente Excelente
espermatozóides imóveis
O método mais usado para avaliar a motilidade é estimar a percentagem de esperma móvel em vários campos
microscópicos e computar a média, sendo este um método altamente subjetivo, com pequenas
reprodutibilidade e exatidão. Outro método difícil requer a contagem tanto dos espermatozóides móveis
como dos imóveis e calcular a percentagem dos móveis. Este método só dá bons resultados em amostras com
poucos espermatozóides com movimentos lentos.
Um método mais fácil e objetivo pode ser recomendado: Uma pequena alíquota (~100 µL) de uma amostra
bem homogeneizada e liquefeita é pipetada em um microtubo com tampa de 1-mL. O microtubo é colocado
em um banho-maria a 56ºC por 5 minutos, para imobilizar os espermatozóides. A amostra fresca, não
incubada, é colocada imediatamente na câmara de contagem e apenas os espermatozóides imóveis são
contados. Ao final do período de incubação, conta-se todos os espermatozóides (para o que também será a
contagem total). A diferença entre as duas contagens (imobilizados – imóveis) é o número de
espermatozóides móveis. Destas cifras calcula-se a concentração de espermatozóides por mL, a contagem
global (concentração x volume) e a motilidade percentual. Esta é uma técnica fácil e reprodutível, intra e
inter observadores. A motilidade é realizada na câmara de contagem específica com microscopia de fase
aumentada 200 vezes, em duplicata. Caso ocorra uma diferença >10% entre as duas avaliações, deve ser
executada uma média de três observações, que será relatada como a motilidade final.
Os padrões de motilidade, segundo a OMS, são:
Tipo A - espermatozóides móveis com progressão rápida;
Tipo B - espermatozóides móveis com progressão lenta;
Tipo C - espermatozóides móveis porém sem progressão;
Tipo D - espermatozóides imóveis.
Valor de Referência: 50% de tipos A e B (móveis).

6.3. Morfologia
Morfologia significa aparência do espermatozóide, e é um parâmetro sensível da sua qualidade. Podem ser
avaliadas: cabeça, pescoço, peça intermediária e cauda. Há vários sistemas de classificação em uso, cada qual
com seus próprios critérios quanto ao que constitui uma célula normal. Alguns sistemas reportam a localização dos
defeitos, alguns reportam os tipos específicos dos defeitos e alguns reportam apenas a presença de anormalidade.
Não é de se estranhar a dificuldade que os laboratórios encontram nesta questão (Ver Tabela 3).
Tabela 3- Sistemas de Classificação usuais para a morfologia dos espermatozóides

ASCP MACLEOD OMS-4a.Edição OMS OMS
Estrita 2a. Edição 3ª. Edição
Valor de >80% >60% >14% >50% >30%
Referência
(normais)
Cabeça
Formato Oval Oval Oval Oval Oval
Contorno liso
Acrossomo 1/2 a 2/3 da X 40-70% da >1/3 da 40-70% da
superfície da superfície da superfície da superfície da
cabeça* cabeça cabeça cabeça
Tamanho 4-5 µ comp X 3-5 µ comp 3-5 µ comp 4-5,5 µ comp
2-3 µ largura 2-3 µ largura 2-3 largura 2,5-3,5 µ largura
(largura= 1/2- largura/comp
2/3 comp) =1,5-1,75
Vacúolos Não fica claro Não estabelecido Até 4 X <20% da área da
cabeça
Peça Intermediária
Formato X Não considerado Afilada Reta, Reta,
Reta Contorno Contorno
Contorno regular regular, regular,
Afixada Afixada Afixada
axialmente axialmente. axialmente.
Tamanho 1 µ largura X <1 µ largura <1/3 <1/3 largura da
5 µ comprimento Comprimento 7-8 µ cabeça
1,5 X cabeça comprimento 7-8 µ
comprimento
Gotícula X Sinal de esperma <1/2 da área da X <1/3 da área da
citoplasmática imaturo cabeça cabeça
Cauda X Não considerada Tamanho Afilada Afilada
uniforme Não-contorcida Não-contorcida
Não -contorcida Contorno regular Contorno regular
Largura 1 µ na base X Menor que a da X X
0,1 µ na ponta peça
intermediária
Comprimento 50-55 µ comp X 10 x cabeça > 45 µ comp > 45 µ comp
O primeiro passo na avaliação da morfologia espermática é elaborar um esfregaço de sêmen de boa

qualidade, nem muito fino nem muito espesso. Caso se use muita força para sua produção, podem ser gerados
artefatos, principalmente da peça intermediária.
Para a confecção do esfregaço, uma pequena gota de esperma (aproximadamente 10 µL) deve ser colocada
próxima ao final onde se coloca o rótulo. Outra lâmina deve ser apoiada a um ângulo de 45◦C e então usada para o
esfregaço. O ângulo pode ser diminuído ou acentuado de forma a regular a espessura do esfregaço. Idealmente, o
esfregaço deve ser fixado imediatamente com um spray fixador para citologia, deixado secar completamente e
então conservado em um local escuro e seco até a sua coloração.

A melhor coloração para esperma é a de Papanicolaou Modificada, a qual possibilita clareza na diferenciação das
diferentes regiões celulares. É também uma coloração estável, que permite a guarda de lâminas para revisão
durante longos períodos (a lâmina deve ser arquivada pelo menos por uma semana após a leitura). Esta é uma
coloração de preparo manual trabalhoso, mas existem versões comerciais, inclusive para coloração rápida em três
passos, que funcionam adequadamente.
Uma vez que o espermograma muitas vezes é realizado no Setor de Hematologia, costuma-se usar colorações tipo
Romanovsky, como a de Wright-Giemsa. Uma coloração tipo peroxidase (como a de Endtz) pode ser usada
especialmente para a detecção de leucócitos, mas um técnico experiente raramente necessitará deste artifício para
fazer a distinção entre neutrófilos e células precursoras imaturas.
Nota: O Laboratório deve definir a coloração a ser usada e citar aqui o POP respectivo.
Independente da coloração usada, o esfregaço deve ser avaliado por meio de uma ocular com aumento de 10x e
com uma objetiva de imersão 100x. Basicamente, cada um de 200 espermatozóides deve ser observado no que
tange à cabeça, peça intermediária e cauda (Figura 10).
Fig.10 – Imagens de Espermatozóides normais
6.4.1. Morfologia Normal

O espermatozóide normal tem a cabeça oval, quando vista frontalmente, e em formato de pêra (piriforme),
quando visto de lado. Ela comporta duas regiões bem demarcadas por uma linha transversal. O comprimento
é de cerca de 4-5 µm e a largura transversal é de 2-3 µm. A região anterior da cabeça, menos corada, é a
região acrossomial, que cobre os 2⁄3 anteriores do núcleo e termina ao longo da linha transversal. O capacete
acrossomial fornece as enzimas necessárias para auxiliar na penetração do ovo. A região mais corada da
cabeça, localizada na região inferior,é chamada de região pós-acrossomial e contém o núcleo que se arqueia
dentro do acrossomo. O núcleo ocupa 65% da cabeça e contém o material genético. A região anterior do
núcleo habitualmente não é vista por estar coberta pelo capacete acrossomial.

A cauda normal tem cerca de 50-55 µm de comprimento e a espessura varia desde 1 µm na peça
intermediária até 0,1 µm na peça final. Ela consiste de um centro axial complexo, o axonema, o qual é
circundado por várias bainhas. O axonema contém 2 microtúbulos centrais circundados por 9 pares de
microtúbulos duplos e um anel exterior formado por 9 fibras densas. Quatro regiões da cauda podem ser
diferenciadas à microscopia de campo claro, por apresentarem leves variações da espessura da cauda devidas
às variações das bainhas que as circundam o axonema em uma determinada seção.
O pescoço é quase indiscernível e se conecta à cabeça e à cauda. Um pescoço anormalmente longo se dobra e
permite que a cabeça tombe sobre a cauda ocasionando uma propulsão em círculos ou muito lenta, com a
cabeça sendo arrastada.
A peça intermediária é a porção mais larga da cauda, com cerca de 5-8 µm de comprimento e 1 µm de
largura. É a porção mais larga da cauda por conter o axonema circundado por uma bainha de mitocôndrias
que produzem a energia necessária para a motilidade. A bainha mitocondrial termina abruptamente no ânulo.
A peça principal tem cerca de 45 µm de comprimento e 0,5 µm de largura, começando no ânulo. Nesta seção,
as 9 fibras densas vão gradualmente diminuindo e desaparecem deixando apenas o axonema circundado por
uma bainha fibrosa. A bainha fibrosa termina deixando a peça final, a qual não tem bainha alguma e tem 5-7
µm de comprimento.
Caso qualquer uma das três partes principais esteja anormal, o espermatozóide é também considerado anormal. Um
pianinho pode ser usado para manter a contagem e para registrar normais, limítrofes (borderline) e anormais. Na
dependência da padronização do laboratório, poderá ser preciso informar a localização das anormalidades (cabeça,
peça intermediária e cauda) e alguns laboratórios ainda requerem o detalhamento da anormalidade, como tamanho
e formato da cabeça e assim por diante. Pelo menos 200 células devem ser analisadas.
A Classificação da OMS 3a. Edição é a mais usada nos espermogramas de rotina e a da 4a. Edição (Estrita ou
Kruger) costuma ser a mais usada por clínicas de infertilidade, mas elas são tão complexas e detalhadas que
aprender apenas uma delas já constitui um desafio, e comparar ambas se torna difícil (Ver Tabela 4).
Tabela 4 – Comparação entre dois métodos de classificação da morfologia dos espermatozóides

OMS Terceira Edição OMS Quarta Edição - estrita
Valores de Referência da Normalidade > 30% > 14%
Classificação do borderline anormal Normal Anormal
Utilidade da Classificação Triagem, tratamento de Tratamento de infertilidade
infertilidade
Yeung CH, Cooper TG, Nieschlag E. A technique for standardization and quality control of subjective motility
assessments in semen analysis. Fertil Steril. 1997; 67; 1156- 1158.
Nota: O laboratório deve definir a classificação morfológica que usará e a mesma deve ser colocada neste
documento e explicitada no laudo. Como uma forma de simplificar a questão, sugerimos que o laboratório que
realiza o espermograma como triagem implemente a Classificação da OMS Terceira Edição. Caso o laboratório
seja uma referência para clínicas de infertilidade deve adotar a Classificação da OMS Quarta Edição (Estrita),
tendo em mente que nenhuma das duas oferece um padrão de referência inequívoco e requerem experiência.
Fig. 11 - Espermatozóides (Normais e Anormais)
6.3.1. Morfologia – OMS Terceira Edição

O espermatozóide humano é classificado usando-se microscópio óptico, após coloração especial.
Neste sistema os espermatozóides são classificados como:

- Normais (ovais e piriformes)

- Macrocefálicos,
- Macrocefálicos,
- Bicefálico,
- Bicaudado,
- Ectásicos,
- Fusiformes ou Afilados,
- Amorfos,
- Defeitos de peça intermediária,
- Defeitos de cauda.
Este sistema aceita pequenas irregularidades no espermatozóide. É um critério mais relaxado, mas
não menos importante, como triagem. Pode ajudar a identificar defeitos na espermatogênese, típicos
de algumas doenças.
Valor de Referência: Normais > 30%
6.3.2. Morfologia - Critério estrito de Kruger (OMS 4ª. Edição)

Critério rigoroso de classificação, onde são contados 200 espermatozóides e aqueles potencialmente
normais são mensurados com uma régua (micrômetro). Diversas medidas são realizadas em cada
espermatozóide, que é classificado como normal (oval ou piriforme) ou anormal. Talvez seja o
parâmetro mais importante de toda a análise seminal, e correlaciona-se com diversos testes de
função espermática. O espermatozóide é considerado normal quando a cabeça tem comprimento de
5 - 6µm. e espessura de 2,5 - 3,5µm, configuração oval, lisa, regular e com região acrossômica entre
40 - 70% da área da cabeça do espermatozóide. As cabeças fora do padrão são consideradas
anormais. Não deve haver nenhum defeito no pescoço, peça intermediária ou cauda.
Valor de Referência: Normais > 14%.
Abaixo de 4% correlaciona-se com pior prognóstico, e entre 5-13% - poderão ser realizados testes
de função espermática, avaliados caso a caso.
6.4. Citologia - Células Redondas

O sêmen pode apresentar outros elementos celulares além dos espermatozóides. São eles: espermatócitos e
espermátides (células precursoras dos espermatozóides ou espermatogênicas), leucócitos (células de defesa),
eritrócitos (hemácias), células epiteliais poligonais do trato uretral, bactérias, fungos, tricomonas, entre
outros. Estas células são chamadas coletivamente por alguns de células redondas, outros chamam de células
redondas apenas as células precursoras dos espermatozóides. Consideramos que para evitar mal entendidos as
células vistas devem ser categorizadas adequadamente (precursoras, leucócitos, hemácias, células epiteliais).
As hemácias e as células epiteliais são facilmente reconhecíveis por seu tamanho e forma.
Qualquer leucócito ou célula espermática imatura devem ser contados durante a análise de 200
espermatozóides no esfregaço e deve ser estimada a média por campo vista em aumento de 400 x. Quando
houver mais de 1 leucócito/campo ou mais de 5 células precursoras imaturas/campo a contagem de cada uma
das células deve ser feita. A cada célula por campo equivalem aproximadamente um milhão de células/mL de
sêmen.
6.4.1. Células espermatogênicas (espermátides e espermatócitos)

As células espermatogênicas são células germinativas. Células imaturas são encontradas
ocasionalmente no esperma, mas um número excessivo pode indicar uma interrupção da maturação
normal. A parada da maturação pode ser idiopática ou pode ser causada por varicocele, orquite por
caxumba, exposição a substâncias tóxicas ou drepanocitose. As células espermatogênicas não têm
tamanho ou formato regulares e a razão núcleo-citoplasmática varia de acordo com o estágio de
maturação. Os corpúsculo intra-citoplasmáticos não estão interconectados e a célula pode lembrar
uma massa citoplasmática com brotamentos. Uma espermátide amadurece no epidídimo, onde perde
o citoplasma que circunda o núcleo. Um espermatozóide que contenha mais de um terço da cabeça
contendo citoplasma é considerado anormal e imaturo. A gotícula citoplasmática é também
conhecida como massa de extrusão citoplasmática e é em geral vista na área em torno do pescoço e

da peça intermediária, mas ocasionalmente pode ser vista circundando a cabeça ou entranhada na
cauda contorcida de um espermatozóide com anormalidades da cauda.
Células Imaturas: Valor de Referência < 5 milhões/mL
Fig.12- Espermatogênese Fig.13 – Cels. Redondas
6.4.2. Leucócitos
Os leucócitos estão presentes na maioria dos ejaculados humanos, sendo que a célula predominante
é o neutrófilo. A determinação do número de leucócitos é importante porque a presença excessiva
dessas células (conhecida como leucocitospermia) pode indicar a existência de infecção do trato
reprodutivo a qual poderia responder a uma terapia com antibióticos. Além, disso, a
leucocitospermia pode estar associada com defeitos no perfil seminal, incluindo redução tanto no
volume do ejaculado quanto na concentração e motilidade dos espermatozóides, e ainda também
alteração na função espermática como resultado do stress oxidativo ou da secreção de citoquinas
citotóxicas. O impacto destas células depende do lugar no qual os leucócitos invadem o sêmen, tipos
de leucócitos envolvidos e o seu estado de ativação. Em virtude da susceptibilidade dos
espermatozóides humanos ao estresse oxidativo, a presença de neutrófilos é tida como prejudicial
particularmente se a infiltração ocorre no nível da rete-testis ou epidídimo. Por outro lado, a invasão
dos leucócitos no momento da ejaculação, via próstata ou vesículas seminais, é provavelmente
menos prejudicial devido ao poder antioxidante do plasma seminal. Os leucócitos podem ser
detectados através do Teste de Endtz, uma técnica histoquímica na qual os granulócitos peroxidase
positivos (leucócitos e polimorfonuclerados) se coram de marrom escuro. Contudo, um técnico
experiente também é capaz de diferenciar os neutrófilos das outras células redondas por meio das
coloração hematológicas tipo Romanovsky. Os leucócitos polimorfonucleados são identificados por
seu tamanho e formato regulares e núcleo com lobos interconectados. Um limiar de concentração de
leucócitos, a partir do qual a fertilidade possa estar comprometida, contudo, é difícil de definir, mas
a presença de mais de 1 milhão de células de defesa por ml de sêmen ejaculado ou mais de 5
milhões no total ejaculado pode indicar um processo infeccioso.
Valor de Referência < 1 milhão de Leucócitos/mL

6.5. Viabilidade (vitalidade)

O estudo da viabilidade (ou vitalidade) espermática tipicamente utiliza um corante tipo exclusão nuclear para
determinar se os espermatozóides imóveis estão vivos, mas incapazes de se mover, ou realmente mortos
(necrospermia). O teste de viabilidade requer uma coloração muito simples na qual se usa a eosina como
corante e a nigrosina como contra-corante. O método é rápido e simples de avaliar. Espermatozóides que
excluem o corante estão vivos, e os que tomam o corante estão mortos. Ambos podem ser visualizados contra
o fundo escuro, preto-azulado, criado pela nigrosina (Figura 10). Em uma amostra de coleta recente, a
percentagem de espermatozóides móveis e viáveis deve ser semelhante, tornando a viabilidade um bom
parâmetro para avaliar a qualidade da análise da motilidade. Uma vez que os espermatozóides mortos não
nadam, o número de espermatozóides viáveis deve ser um pouco mais alto ou mesmo semelhante ao de
espermatozóides móveis. Na prática, os testes de vitalidade podem ser realizados apenas quando houver
menos de 30% de móveis. A necrospermia como condição clínica é muito rara, estando mais associada a
condições de coleta (ex: contaminação com lubrificantes ou amostra envelhecida).
Valor de Referência: Vitalidade > 60%.
6.5.1. Coloração Eosina-Nigrosina

Há inúmeras variações da coloração de Eosina-Nigrosina. Uma fórmula bastante usada é:
• 5% peso/volume de nigrosina;
• 0,6% peso/volume de eosina;
• 3% peso/volume de citrato de sódio di-hidratado (para obter a osmolalidade fisiológica);

• Dissolver em água reagente ARLC ou outra validada para esta finalidade.
Ajustar o pH do corante para 7,0 com algumas gotas de NaH2PO4 0,1 M ou Na2HPO4 0,1 M e
filtrar em papel filtrante.
Nota: O Laboratório deve citar o documento de coloração Eosina-Nigrosina que utiliza ou pode
acrescentar a técnica que utiliza.
.
Figura 14– Coloração eosina-nigrosina
7. Garantia da Qualidade
O Programa de Acreditação da Laboratórios Clínicos (PALC), Item 11.1 diz: “O Sistema de Gestão da Qualidade do
laboratório deve contemplar um programa documentado de garantia da qualidade que contemple de forma regular a
avaliação da qualidade analítica, incluindo o Programa de Controle Interno da Qualidade (PCIQ) e o Programa de
Avaliação Externa da Qualidade (PAEQ) para todas as análises que realiza. O programa deve proporcionar
informações claras e facilmente compreensíveis para as decisões técnicas e médicas e deve criar condições para
eliminar enganos nos processos relativos a amostras, requisições, análises e laudos.”

7.1. Controle Interno da Qualidade
7.1.1. Contagem de Espermatozóides

Uma suspensão de esperma humano preservado é o único material válido para o controle interno da
qualidade da contagem de espermatozóides. Adicionalmente, as contagens devem ser realizadas em
duplicata pelo mesmo observador e a diferença entre elas não deve ser superior a 10%. Pelo menos uma
amostra ao dia deve ser contada em duplicata cega por um segundo observador e ao final do dia os dois
resultados devem ser analisados m função da consistência clínica dos laudos por um supervisor
qualificado.
Nota: O Laboratório deve definir a(s) sistemática(s) de controle interno (repetitividade e

reprodutibilidade) que usará e deve acrescentá-las aqui, em lugar das nossas sugestões.
7.1.2. Motilidade
Materiais para o controle da qualidade da motilidade estão disponíveis em dois formatos: alíquotas
congeladas e amostras frescas para serem descongeladas para análise e registros em vídeo (CD-
ROM ou outros formatos). As alíquotas congeladas permitem a análise dos controles em câmaras
,após o descongelamento, mas há uma variação esperada devida ao descongelamento, o que torna a
determinação da motilidade esperada após o descongelamento um tanto desafiante. A experiência
acumulada (histórico) deve ser usada para estabelecer o valor alvo da contagem das amostras
descongeladas. Além do mais, este controle exige armazenamento especializado em nitrogênio
líquido, o que pode gerar custo e a necessidade de precauções adicionais no que tange à
biossegurança. Contudo, caso o exame seja realizado em associação a clínicas de fertilidade, as
quais em geral usam a tecnologia de nitrogênio líquido para outras finalidades, esta possibilidade de
controle se viabiliza. Pelo menos uma amostra ao dia deve ser contada em duplicata cega por um
segundo observador e ao final do dia os dois resultados devem ser analisados m função da consistência
clínica dos laudos por um supervisor qualificado.
Nota: O Laboratório deve definir a(s) sistemática(s) de controle interno (repetitividade e

reprodutibilidade) que usará e deve acrescentá-las aqui, em lugar das nossas sugestões.
7.1.3. Comparação entre observadores

O Programa de Acreditação da Laboratórios Clínicos (PALC), Item 11.9 diz: “Quando uma mesma
análise pode ser feita por meio de diferentes sistemas analíticos, diferentes equipamentos ou
analistas, diferentes locais, ou de maneira que reúna todas ou parte dessas condições, o PCIQ deve
contemplar um procedimento para a verificação da comparabilidade dos resultados de amostras de
clientes ao longo do intervalo clinicamente apropriado. Essa verificação deve ser realizada
periodicamente, de acordo com as características do procedimento ou sistema. O PCIQ deve
contemplar a periodicidade de realização das comparações e as especificações da qualidade analítica
para estabelecer os critérios de aceitabilidade para as diferenças encontradas, desde que seja
garantida a comutatividade dos resultados das amostras de clientes para um mesmo analito.”
Várias das análises do espermograma são subjetivas ou têm um componente subjetivo e deve haver
registros de treinamento de todos os analistas, ministrado pelo supervisor qualificado, e evidências
posteriores, periódicas (mínimo de seis em seis meses) de que todos os analistas geram laudos
equivalentes do ponto de vista médico. Isto pode ser demonstrado por meio das análises em
duplicata das mesmas amostras e de análises de materiais da literatura ou de ensaios de proficiência,
por exemplo.
Nota: O Laboratório deve definir a(s) sistemática(s) de verificação da equivalência entre analistas
que usará e deve acrescentá-las aqui, em lugar das nossas sugestões.

7.1.4. Avaliação externa da qualidade

O Programa de Acreditação da Laboratórios Clínicos (PALC), Item 11.11 diz: “O laboratório deve
participar ativamente de pelo menos um Programa de Avaliação Externa da Qualidade (PAEQ)
oferecido por provedores habilitados, de forma regular e com a abrangência apropriada.”
Portanto, o laboratório deve participar dos ensaios de proficiência disponíveis para espermograma
ou alguns de seus analitos.
Notat: Acrescentar aqui os analitos disponíveis por meio de ensaios de proficiência ou citar o
documento que contempla esta participação.
O Programa de Acreditação da Laboratórios Clínicos (PALC), Item 11.15 diz: “Para os analitos não
cobertos por PAEQ deve haver uma avaliação externa alternativa documentada para avaliação da
confiabilidade dos resultados. O laboratório deve definir claramente os limites de aceitabilidade e os
critérios de avaliação para cada forma alternativa que utiliza.”
Periodicamente (pelo menos duas vezes ao ano) alguns laudos completos de Espermograma, de
preferência cobrindo uma variedade de situações clínicas, devem ser apreciados em conjunto com o
médico solicitante para validação clínica. Após a análise crítica e a tomada de ações corretivas
quando apropriado, os registros respectivos devem ser arquivados.
Nota : O Laboratório deve definir a(s) sistemática(s) de avaliação externa da qualidade que deve
acrescentá-las aqui, em lugar das nossas sugestões.
7.1.5. Especificações da qualidade analítica

O Programa de Acreditação da Laboratórios Clínicos (PALC), Item 11.3 diz: “O PCIQ deve
contemplar a definição das especificações dos requisitos da qualidade analítica para os resultados
dos materiais de controle utilizados ou para outros processos de monitoração dos procedimentos
analíticos. Essas especificações devem se basear em um modelo cientificamente válido.”
Apresentamos na Tabela 5 (abaixo) as especificações da qualidade analítica para parâmetros do
espermograma disponíveis no momento, para uso nas análises críticas do CIQ e da AEQ.
Tabela 5- Variação Biológica e Especificações da Qualidade de Analitos do Esperma

Imprecisão Bias Erro Total
CVi* CVg** Máxima Máximo Máximo
Analito
(%) (%) Desejável Desejável Desejável
(%) (%) (%)
Concentração de Espermatozóides 26,8 56,4 13,4 15,6 37,7
Morfologia dos Espermatozóides 19,6 44,0 9,8 12,0 28,2
Motilidade progressiva dos Espermatozóides 15,2 32,8 7,6 9,0 21,6
Motilidade Rapidamente Progressiva dos
18,8 51,8 9,4 13,8 29,3
Espermatozóides
Motilidade Total dos Espermatozóides 18,4 29,8 9,2 8,8 23,9
Vitalidade dos Espermatozóides 10,3 25,8 5,2 6,9 15,4
*CVi = Coeficiente de Variação Biológica Intra-individual
**Cvg = Coeficiente de Variação Biológica Inter-individual
Fonte: Desirable specifications for total error, imprecision, and bias, derived from biologic variation.
http://www.westgard.com/biodatabase1.htm

8. Testes complementares
8.1. Pesquisa de Anticorpos Anti- Espermatozóides (MarScreen)

Os espermatozóides contêm diversos componentes antigênicos em sua estrutura, os quais estimulam uma
resposta imune em determinadas circunstâncias, levando ao aparecimento de anticorpos anti-espermatozóides
no homem (resposta auto-imune), ou na mulher (resposta iso - imune).
Os anticorpos anti-espermáticos no sêmen pertencem quase que exclusivamente a duas classes imunológicas:
IgA e IgG. Os anticorpos IgA têm maior importância clínica que os anticorpos IgG. Estes anticorpos
interferem em diversas etapas do processo de reprodução humana e reduzem as chances de fertilização. Os
anticorpos anti-espermáticos não destroem nem imobilizam os espermatozóides, mas podem interferir no
funcionamento espermático através da sua simples aderência à membrana plasmática dos espermatozóides.
Essa aderência pode levar a aglutinação dos espermatozóides. Os anticorpos anti-espermáticos interferem
também na penetração normal e no trânsito dos espermatozóides no muco cervical. Esse teste é indicado em
casos de aglutinação espontânea ou baixa motilidade, em testes pós-coito negativos com espermograma
normal e em casos de infertilidade conjugal sem causa aparente.
Nota: Caso realize este exame, citar o POP correspondente. Caso não realize, acrescentar as informações
do laboratório de apoio quanto a coleta, armazenamento e transporte.
8.2. Análise bacteriológica

A presença de bactérias no sêmen (bacteriospermia) é um achado comum e pode estar ou não relacionada
com infecções. Os processos infecciosos genitais geralmente são assintomáticos mas afetam a atividade
funcional dos órgãos sexuais. Isso faz com que ocorra uma redução na qualidade do sêmen, que
consequentemente, causa infertilidade. Por isso, recomenda-se a investigação destes microorganismos na
rotina do espermograma, que pode ser feita através de um simples exame bacterioscópico. Deve ser levado
em consideração, que, os sêmens normais apresentam alguns cocos Gram positivos e, às vezes, uma flora
mista constituída por bactérias anaeróbicas.
Deve-se ter um cuidado especial na coleta da sêmen para cultura. É necessário uma higienização mais
rigorosa e o paciente deve urinar antes da coleta da amostra, para evitar contaminações. A cultura do plasma
seminal para verificar a presença de microorganismos tanto aeróbicos quanto anaeróbicos pode ajudar no
diagnóstico da infecção de glândula acessória, particularmente da próstata. Na cultura de bactérias aeróbicas,
se a concentração de bactérias exceder a 1000 unidades formadoras de colônias (UFC)/ml deve-se determinar
os tipos de colônias. Se as colônias parecerem uniformes, precisa-se fazer a determinação da sensibilidade a
antibióticos. Se tiverem aspectos distintos, pode-se suspeitar de contaminação. Se a concentração de bactérias
for menor que 1000 UFC/ml, a cultura deve ser considerada negativa com respeito a microorganismos
aeróbicos.
8.3. Testes bioquímicos

A OMS recomenda a análise de pelo menos um marcador bioquímico para cada glândula acessória genital, e
há vários parâmetros seminais disponíveis para esta avaliação.
• Glândula Prostática: Ácido cítrico, inositol, zinco, g-glutamil transpeptidase, fosfatase ácida, zinco,
cálcio, magnésio.
• Vesículas Seminais: frutose, prostaglandinas e ácido ascórbico.
• Epidídimos: L-carnitina livre, glicerilfosforilcolina e alfa-glucosidase neutra.
Uma função secretora diminuída reflete-se em uma baixa emissão de marcadores específicos, o que pode ser
utilizado na análise da função secretora da glândula acessória. Uma infecção pode algumas vezes causar uma
considerável diminuição na função secretora, mas, apesar disso, a quantidade total de marcadores pode estar
dentro da faixa normal que pode ser muito ampla. Uma infecção pode ainda causar danos irreversíveis ao
epitélio secretor de sorte que, mesmo depois do tratamento, a capacidade secretora pode permanecer baixa.

8.3.1. Frutose
Se nenhum espermatozóide for observado e não se trata de controle pós-vasectomia,, um teste
quantitativo para a detecção de frutose deve ser efetuado. A frutose é uma substância androgênica
dependente e é produzida nas vesículas seminais. A maior parte dos estudos sobre frutose usam o
método de resorcinol. Ela pode ser dosada pelo método espectrofotométrico de Roe. Níveis baixos
de frutose geralmente indicam deficiência na atividade secretora das vesículas seminais, exceto em
sêmens polizoospérmicos, isto é, aqueles com densidade espermática maior que 250 x 106
espermatozóides/ml. A ausência de frutose e um volume baixo de ejaculado, associado a
incapacidade do sêmen de coagular-se, sugere a ausência congênita do vaso deferente e das
vesículas seminais ou a obstrução dos ductos ejaculatórios. Valores elevados são raros e de
significado clínico pouco conhecido.
Nota: Caso realize este exame, citar o POP correspondente. Caso não realize, acrescentar as
informações do laboratório de apoio quanto a coleta, armazenamento e transporte.
Exemplo (Laboratório ARUP) Fase pré-analítica: Jejum de 12 horas. A amostra congelada é
estável por 2 anos.
Fase Analítica: Espectrofotometria (Roe, J. H., A colorimetric method for the determination of
fructose in blood and urine. ,J. Biol. Chem. 107, 15-22, 1934)
Fase Pós-Analítica: Intervalo de Referência 91 a 520 mg/dL.
8.3.2. Ácido cítrico

Reflete a capacidade secretora da glândula prostática. Mantém o equilíbrio osmótico do sêmen,
potencializa a atividade da hialuronidase, estabiliza o processo de coagulação-liquefação. Há boas
correlações entre zinco, ácido cítrico e fosfatase ácida prostática.
8.3.3. Cálcio
A dosagem de cálcio no esperma pode ser de grande interesse devido à sua relação com a
motilidade, o metabolismo e a fertilização. Apenas 2 a 4% do cálcio no esperma está presente na
forma ionizada. A dosagem da concentração de cálcio pode ser complicada uma vez que a exposição
ao ar resulta em uma redução dos níveis de cálcio ionizado. A dosagem pode também ser
complicada pela ligação a outros compostos (citrato, fosfato, proteínas, etc.), reduzindo a atividade
do cálcio.
8.3.4. Zinco
Níveis seminais deste cátion são determinados pelo método de Vallee & Gibson. Consideram-se
normais os valores entre 100 e 200 mg/ml. Valores diminuídos são detectados quando há uma
deficiência na atividade secretora da próstata, sobretudo aquela causada por infecções. Valores
elevados indicam que há um predomínio de secreção prostática no ejaculado. Neste caso, o pH
seminal geralmente é igual a 7,3.
8.3.5. Alfa-glicosidase
Até recentemente a L-carnitina era o marcador epididimário mais utilizado, mas a dosagem da alfa-
glicosidase foi instituída ultimamente em algumas clínicas. Há duas formas isômeras da alfa-

glicosidase no plasma seminal: a mais importante, neutra, origina-se exclusivamente dos epidídimos
e a menos importante, ácida, origina-se principalmente da próstata. A alfa-glicosidase neutra tem se
mostrado um marcador epididimário mais específico e sensível que a L-carnitina e a
glicerilfosforilcolina e sua dosagem é, portanto, de melhor valor diagnóstico para a obstrução ductal
distal, quando usada em conjunção com parâmetros hormonais e testiculares. Além do mais, a
técnica de dosagem da alfa-glicosidase neutra é mais simples, mais barata e consome menos tempo
que as dos outros marcadores.
9. TESTES FUNCIONAIS
A validade do exame do sêmen para o diagnóstico de infertilidade é hoje questionada por muitos especialistas e
pesquisadores, porque estudos feitos a partir da década de 80 mostraram que o espermograma, em sua rotina básica,
avalia a qualidade do sêmen, mas não fornece qualquer informação sobre as transformações que os espermatozóides
sofrem no trato genital feminino, desde a ejaculação, até sua fusão com o oócito. De modo a suprir esta deficiência,
vários procedimentos complementares foram desenvolvidos nas últimas décadas para analisar especificamente a
capacidade dos espermatozóides de fertilizar o oócito, ou, seja, sua atividade funcional. Além do mais, desde a
criação da ICSI, a partir de alguns poucos núcleos de espermatozóides pode-se obter a fecundação in vitro, o que
vem reduzindo a importância de encontrar uma causa curável da infertilidade masculina.
9.1. Teste HOS (teste hipo-osmótico ou “swelling test”)

Mede a capacidade de difusão de água através da membrana espermática, em condições hipo-osmóticas.
Quando a membrana é íntegra, há entrada de água no interior do espermatozóide causando um inchaço
("swelling"), que é mais evidente no flagelo.
O teste HOS apresenta boa correlação com parâmetros seminais e associa-se com baixos índices de
fertilização quando se detectam percentuais de espermatozóides inchados diminuídos, pois a integridade da
membrana espermática é um pré-requisito para a interação do espermatozóide com o oócito. Amostra com
mais de 62% dos espermatozóide apresentando edema, tem capacidade de fertilizar ovos, enquanto taxas de
edema inferiores a 60%, são observadas em amostras de sêmen infértil. Esse teste não tem sido adotado de
forma generalizada e atualmente constitui mais uma ferramenta de pesquisa.
9.2. Teste de Penetração Espermática

O teste de penetração espermática tem como finalidade medir a habilidade em que os espermatozóides
penetrem no muco cervical, ou qualquer fluido substitutivo, como o bovino, clara de ovo, entre outros. A
penetração dos espermatozóides é avaliada por um sistema graduado em milímetros utilizando-se um
microscópio de contraste de fase com um aumento de 400 vezes. O teste de penetração é considerado normal
quando o espermatozóide vanguardeiro atinge ou ultrapassa o valor de 30 mm. Estudos relatam que o teste de
penetração dos espermatozóides na clara do ovo pode identificar uma população masculina com maior
probabilidade de fertilizar oócitos em cultura.
9.3. Interação Espermatozóide-Muco Cervical

Para a fertilização acontecer in vivo, os espermatozóides devem ser capazes de atravessar o muco cervical. O
teste pós-coito avalia a capacidade dos espermatozóides de penetrar e progredir através do muco cervical. O
muco cervical é examinado 2-8 horas após a relação sexual, no momento em que teoricamente a ovulação
ocorre. A presença de mais de 10-20 espermatozóides móveis por campo de alta potência é geralmente aceito

como normal no exame pós-coito. Os testes pós-coito são bio-ensaios, e proporcionam informações sobre a
função sexual, motilidade dos espermatozóides e a interação espermatozóide-muco cervical. Resultado
desfavorável numa pessoa com parâmetros seminais normais implica em anormalidade cervical ou a presença
de anticorpos espermáticos. A interação espermatozóide muco-cervical também pode ser avaliada in vitro.
Nota : Caso realize este exame, citar o POP correspondente. Caso não realize, acrescentar as informações
9.4. Capacitação Espermática

Capacitação é o nome dado ao processo que torna o espermatozóide mais capaz de fecundar um óvulo. Na
capacitação realizada no laboratório os espermatozóides são separados do plasma seminal através de
centrifugação. Após a separação são incubados em meios de cultivo com substâncias que proporcionam
mudanças estruturais e químicas no espermatozóide. Este processo pode ser realizado artificialmente em
laboratório através de duas técnicas descritas a seguir:
- Capacitação pelo método de "Swim up", que, em inglês, significa nadar para cima, descreve uma técnica
de capacitação espermática, a qual faz com que os espermatozóides móveis, vivos e sem patologias, se
desprendam de um pellet (concentrado de espermatozóides e outras células do sêmen) formado após
centrifugação. Os espermatozóides que se desprendem e nadam para a superfície (para cima) do tubo de
ensaio contento meio de cultura, tornaram-se capacitados pela técnica. O tubo em questão fica em uma estufa
de CO2, com uma mistura de gases, temperatura e umidade controladas, durante um período de incubação de
1h. Os espermatozóides capacitados são aqueles que conseguiram chegar à superfície. Daí são coletados
através da separação da fração do líquido do tubo de ensaio que os contém.
- Capacitação por gradiente descontínuo "Isolate": O princípio básico deste método é a força centrífuga
responsável pela passagem dos espermatozóides através de duas camadas de uma substância coloidal
(Isolate) com concentrações diferentes. Essas camadas retêm os espermatozóides mortos, células redondas e
debris (resíduos celulares) deixando chegar ao fundo, formando um pellet, somente os espermatozóides
móveis, vivos e sem patologia. Este pellet deve ser lavado com meio de cultura para a retirada da substância
coloidal e, diluído em meio de cultura apropriado para o procedimento de reprodução assistida a escolhido. O
tubo em questão fica em uma estufa de CO2, com uma mistura de gases, temperatura e umidade controladas,
durante um período de incubação de 1 hora. Os espermatozóides capacitados são aqueles que conseguiram
chegar à superfície. A seguir, são coletados através da separação da fração do líquido (meio de cultura) do
tubo de ensaio que os contém.
Logo após os espermatozóides estão prontos para serem usados em uma inseminação artificial, fertilização in
vitro ou ICSI. O material processado de maneira estéril é encaminhado ao médico solicitante em uma seringa
juntamente com uma sonda "Tom Cat".
Nota: Caso realize este procedimento, citar o POP correspondente. Caso não realize, acrescentar as
10. Leituras adicionais

1. MORAES, G. E. S. Espermocitograma. 1a ed. Caxias do Sul: Editora Médica Missal Ltda, 1994. P.14.
2. PIVA, S. Análise do Sêmen - Considerações sobre métodos, qualidade, parâmetros e padronização. Laes &
Haes, (junho/julho, 1998).
3. PIVA, S. Espermograma: Análises e Técnicas. 7a ed. São Paulo: Editora Santos, 1998.
4. ROCHA, F. T. A. Espermograma: considerações gerais e procedimentos laboratoriais. Newslab, São Paulo,
2000. Disponível em: Acesso em: 06 jul. 2000.
5. Adelman MM, Cahill EM. Atlas of Sperm Morphology. Chicago, IL: ASCP Press, 1989.
6. Adelman MM. Sperm Morphology. Lab Med 1986; 17:32-34.
7. Menkveld R, Stander FSH, Kotze TJ et al. The evaluation of morphological characteristics of human
spermatozoa according to stricter criteria. Human Reprod 1990; 5:586-592.
8. Menkveld R, Oettlé EE, Kruger TF et al. Atlas of Human Sperm Morphology. Baltimore: Williams and Wilkins,
1991.

11. Referências
1. Espermograma. Instituto de Andrologia e Medicina Reprodutiva. www.androscience.com.br, Mar 2008.
2. Filippini, FCA et Al. Infertilidade Masculina. Newslab, v.44, p.114-130, 2001
3. Rothman, SA & Reese, AA. Semen analysis: the test techs love to hate. MLO, April 2007.
4. World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and
Sperm-Cervical Mucus Interactions. 3rd Ed. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1992.
5. SBPC/ML. Norma PALC v 2007.
6. Pereira O.S. J.Janini Atlas de Morfologia Espermática – Ed Atheneu 2001
Nome Rubrica Data

Redigido por:
Aprovado por: Dir.Tec.:
UGQ:
Revisto por:
Aprovado por: Dir. Tec.:
UGQ:
Revisto por:
Aprovado por: Dir.Tec.:
UGQ:
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ANEXO 1 – Contagem em câmara tipo Hematocitômetro

Os hematocitômetros foram desenvolvidos para a contagem
de células sanguíneas, mas podem ser usados para a
contagem de espermatozóides. Um hematocitômetro tipo
Neubauer tem duas câmaras e cada câmara tem uma grade
cravada na superfície do vidro. As câmaras são cobertas por
uma única lamínula que descansa sobre pilares de exatos
0,1 mm de altura da superfície de contagem. Desta forma, o
volume contido na grade de contagem pode ser conhecido
com precisão.
Procedimento passo a passo
1. Os espermatozóides devem ser mortos e diluídos para que o movimento não perturbe a contagem. Isto pode ser
feito com água de torneira (que contém cloro) ou com um tampão com pequena quantidade de formaldeído. O fator
de diluição usado deve ser registrado. Quando há 20-25 cels. por quadrado maior a amostra está diluída
adequadamente.
Uma diluição habitual é 1:40 - 0,1 ml de esperma e 3,9 ml de diluente (Ex: Água de Torneira - clorada).
2. Para preencher o hematocitômetro, a ponta da pipeta

deve ser colocada em na ranhura em “V” para colocara a
amostra diluída (cerca de 15 microlitros). A capilaridade
fará a câmara se completar. É importante não encher
excessivamente e não mover a lamínula após o
preenchimento.
3.A amostra deve descansar por 2 a minutos de forma que

as células a serem contadas se depositem e fiquem no
mesmo plano focal. É importante não permitir que as
células descansem por tempo excessivo pois a Câmara pode
secar e concentrar. Para evitar a secagem, colocar a Câmara
em placa de Petri com tampa contendo um papel filtro ou
algodão úmido.
4. A grade completa do hematocitômetro contém 9

quadrados, cada um com 1 mm de lado. O quadrado central
contém 25 quadrados (5x5) e cada um dos 25 contém 16
quadradinhos (4x4). Ao contar, conte apenas as células
(cabeças) que tocam apenas dois lados (por exemplo
esquerdo e superior) para evitar contar a mesma célula duas
vezes.
5. O exemplo ao lado mostra linhas vermelhas

representando os lados que devem ser contados. Os 5
pontos vermelhos representam as células, dos quais apenas
3 seriam contadas.

6. Podem ser contados os 25 quadrados ou contar os 5

quadrados assinalados. É importante distribuir
uniformemente os quadrados a serem contados de forma a
evitar bias da distribuição das células. Caso se conte apenas
5 dos 25 quadrados, multiplicar por um fator 5.
Pelo menos duas câmaras devem ser contadas (duplicata) e
deve-se usar a média das duas contagem, cujo CV não deve
ser superior a 10%.
Cálculo da Concentração
Cada um dos 9 quadrados da grade completa, incluindo o quadrado central de 25 quadrados menores, tem uma área
de 1 mm quadrado, e a lamínula fica a 0,1 mm acima da superfície. Portanto, o volume sobre a área central é de
0.1 mm3 ou 0.1 microlitro. O número médio de espermatozóides contados nos 25 quadradinhos deve ser
multiplicado pela diluição utilizada e por 50.000 para obter o número de espermatozóides na amostra diluída por
ml. Pode-se também contar somente 5 quadradinhos, multiplicado pela diluição e por 50.000 para obter o resultado
em milhões por ml.
Modificado de: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/semeneval/hemacytometer.html
Nota: Caso o laboratório utilize uma câmara específica para a contagem de espermatozóides, o respectivo
procedimento de contagem deve ser acrescentado a este documento.

Anexo 2– Gabarito do Espermograma

Nome: Registro:
Analista: Data: Unidade:
Hora da Coleta: _____h____min Hora da Análise: ____h____min
ANÁLISE MACROSCÓPICA
Liquefação O Líquido Espermático, caso tenha coagulado imediatamente após a ejaculação, permanece coagulado por 5 a 30 minutos, quando ocorre a
liquefação. Observar por inclinação do material a cada 5 minutos e anotar com este intervalo.
□ Não observada □ Não ocorreu ⁭□ Ocorreu aos___Min
Valor de Referência: Até 30 minutos
Aspecto □ Opalescente □ Purulento □ Rajas de sangue

□ Hemorrágico □ Homogêneo □ Heterogêneo
Aspecto Normal Opalescente homogêneo
Cor □ Branco-opaco □ Cinza-claro □ Amarelado

□ Róseo □ Avermelhado □ Acastanhado
Cor Normal Branco opaco ou cinza-claro ou amarelado claro
Odor: □ Característico ou sui generis (Normal) □ Outro_______________________
Volume Medir com uma pipeta sorológica (não pipetar com a boca)
Volume medido: mL Volume Normal: 2 a 5 mL
Consistência Deve ser realizado logo após a liquefação. Ao pipetar o material, verificar se ele se desprende da pipeta por gotejamento ou formando um filete.
Consistência □ Normal (Gotejamento) □ Aumentada (Filete)
observada
pH Medir com o papel indicador (faixa 6,0 a 9,0)

pH medido: pH Normal: 7,0 a 8,0

ANÁLISE MICROSCÓPICA
Contagem
Contagem por mL Milhões por mL Contagem (Volume Total) Milhões no ejaculado

Valor de Referência: > 20 milhões por ;mL Valor de Referência: > 40 milhões no ejaculado
Análise do sedimento após centrifugação: Não foram visualizados espermatozóides Foram visualizados espermatozóides
Motilidade
Contagem Global (CG) ⁄mL
Contagem de imóveis e não-progressivos (CI) ⁄mL
Móveis (CG-CI) ⁄mL
Móveis (Percentagem) %
Valor de Referência: Móveis > 50%
Citologia – “Células Redondas”

Neutrófilo PMN Célula Epitelial Hemácias
________/campo ____________/campo ____________/campo
Espermatócitos:
_____________/campo
Espermátide Espermátide Espermatozóide imaturo

(inclusão citoplasmática)
________/campo ________/campo
________/campo
Células Espermatogênicas (Totais): _________/Campo

Morfologia Contar e classificar 200 células coradas

Tipos Morfológicos Contados Percentual Observações:
(em 200 espermat.) (VR> 30%)
Oval ou piriforme
Tipos Morfológicos Contados Percentual Tipos Morfológicos Contados Percentual

(em 200 espermat.) (VR> 30%) (em 200 espermat.)
“Células redondas”
Total de Normais: Contados: Percentual: Total de Anormais: Contados: Percentual:


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Tabela 1- O que o espermograma avalia

2.1. Análise Automatizada (CASA)

Distribuição: Versão 1.0

Fig1 – Equipamento CASA Fig. 2 – Exemplo de tela (Motilidade)

2.2. Termos relacionados

Distribuição: Versão 1.0

3.1. O aparelho reprodutor masculino

Fig. 3 – Aparelho Reprodutor Masculino

3.2. Infertilidade masculina

Distribuição: Versão 1.0

3.3. Espermograma Pós-vasectomia

3.4. Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide (ICSI)

4.1. Preparo do Paciente

• Quanto à coleta do material, o paciente deverá coletá-lo preferencialmente no próprio laboratório e na

Distribuição: Versão 1.0

4.2. Formulário Próprio

5. Fase Analítica - Exame Macroscópico

5.1. Liquefação ou Tempo de Duração da Coagulação (TDC)

Distribuição: Versão 1.0

5.4. Consistência (Viscosidade)

Distribuição: Versão 1.0

6. Fase Analítica – Exame Microscópico

6.1. Contagem ou Concentração

Fig. 7 – Exemplos de câmaras de contagem de esperma.

• Normozoospermia: > 20 x 106 espermatozóides/ml. (concentração normal)

Distribuição: Versão 1.0

Tabela 3- Sistemas de Classificação usuais para a morfologia dos espermatozóides

O primeiro passo na avaliação da morfologia espermática é elaborar um esfregaço de sêmen de boa

Distribuição: Versão 1.0

Fig.10 – Imagens de Espermatozóides normais

6.4.1. Morfologia Normal

Distribuição: Versão 1.0

Tabela 4 – Comparação entre dois métodos de classificação da morfologia dos espermatozóides

Fig. 11 - Espermatozóides (Normais e Anormais)

6.3.1. Morfologia – OMS Terceira Edição

Distribuição: Versão 1.0

- Normais (ovais e piriformes)

6.3.2. Morfologia - Critério estrito de Kruger (OMS 4ª. Edição)

6.4. Citologia - Células Redondas

6.4.1. Células espermatogênicas (espermátides e espermatócitos)

Distribuição: Versão 1.0

Fig.12- Espermatogênese Fig.13 – Cels. Redondas

Distribuição: Versão 1.0

6.5. Viabilidade (vitalidade)

6.5.1. Coloração Eosina-Nigrosina

• 0,6% peso/volume de eosina;

• 3% peso/volume de citrato de sódio di-hidratado (para obter a osmolalidade fisiológica);

Distribuição: Versão 1.0

7.1. Controle Interno da Qualidade

7.1.1. Contagem de Espermatozóides

Nota: O Laboratório deve definir a(s) sistemática(s) de controle interno (repetitividade e

Nota: O Laboratório deve definir a(s) sistemática(s) de controle interno (repetitividade e

7.1.3. Comparação entre observadores

Distribuição: Versão 1.0

7.1.4. Avaliação externa da qualidade

7.1.5. Especificações da qualidade analítica

Tabela 5- Variação Biológica e Especificações da Qualidade de Analitos do Esperma

Distribuição: Versão 1.0

8.1. Pesquisa de Anticorpos Anti- Espermatozóides (MarScreen)

8.2. Análise bacteriológica

8.3. Testes bioquímicos

/campo /campo ____/campo