Braz. J. vet. Res. anim. Sei.

,
São Paulo, v.33, n.3, p./36-138, 1996.

Utilização de marcadores de DNA para o diagnóstico genômico de CORRESPONDENCE TO:

José Fernando Garcia

animais domésticos: 2. Detecção da mutação pontual causadora da Departamento de Reprodução Animal

Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da USP
Paralisia Hipercalêmica Periódica (HYPP) em eqüinos da Av. Prot. Dr. Orlando Marques de
Paiva, 87 - Cidade Universitária
raça Quarto de Milha Armando de Salles Oliveira
05508-900 - São Paulo - SP - Brasil
e-mail: jtgarcia@usp.br

Use of DNA markers for genomic diagnosis of domestic 1 - Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia da USP - SP
animals: 2. Detection of point mutation causing Hyperkalemic 2 - Centro de Biotecnologia do
Estado do Rio Grande do Sul da
Periodic Paralysis (HYPP) in Quarter horses UFRGS- RS
3 - Rancho’s Tânia - Uberaba - MG
4 - Associação Brasileira dos
Criadores de Cavalo Quarto de
José Fernando GARCIA'; André Sanches do Amaral GURGEL José Antonio VISINTIN2; Milha - São Paulo - SP
Vagner Ricardo LUNGE2; Marcelo Barbante DUARTE1; Jarbas Leonel BERTOLLI4

RESUMO
Analisaram-se 12 eqüinos da raça Quarto de Milha, descendentes da linhagem Impressive. Submeteram-se os DNAs,
purificados a partir de leucócitos destes animais, à técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR) e posterior digestão
com a enzima de restrição Taq I. Estabeleceu-se, dessa maneira, o diagnóstico genômico da Paralisia Hipercalêmica
Periódica (HYPP). Os exames revelaram que 9 animais eram portadores heterozigotos (N/H) e 3, normais homozigotos
(N/N). A partir do desenvolvimento da metodologia de PCR tornou-se possível diagnosticar o problema e propor
maneiras de controle do alastramento desse gene defectivo na população por meio da detecção de animais porta­
dores e normais.
UNITERMOS: Cavalos; Equidae; DNA; Paralisia; Hipercalemia.

INTRODUÇÃO apresentaram publicamente a linhagem sangüínea na qual foi

localizado o gene defeituoso.
Paralisia Hipercalêmica Periódica (HYPP) é uma Esse defeito genético altera a abertura e fechamento dos

A doença muscular causada por um defeito genético

hereditário que afeta o balanço de sódio e potássio
das células musculares, podendo afetar tanto eqüinos quanto
humanos. A HYPP foi descrita primeiramente nos anos 50
em um agrupamento familiar humano, no qual foi reconheci­
da uma herança autossomal dominante (Gamstorp3; 1956).
Uma síndrome de debilidade muscular em cavalos acompanha­
da de elevada concentração de potássio sérico, e que tinha
bastante semelhança com uma doença hereditária humana,
HYPP, foi descrita por C ox1 (1985) e Steiss; Naylor12 (1986).
A hereditariedade em eqüinos foi conjecturada desde que a
doença foi identificada pela primeira vez nesta espécie, mas
a linhagem sangüínea suspeita era muito popular e valiosa,
levando à atuação cautelosa da comunidade veterinária na
identificação da doença como herança específica e na citação
da linhagem sangüínea envolvida. Desde então o conheci­
mento sobre esta doença tem aumentado drasticamente, tanto
em humanos quanto em eqüinos. A possibilidade de uma he­
rança autossomal dominante na HYPP eqüina foi sugerida por
Naylor et al.5 (1992), e, na convenção de 1992 da Associação
Americana dos Criadores de Eqüinos, Spier et a l.u • 12 (1990)
canais de sódio das células musculares, dirigindo de
m aneira irregular o fluxo de sódio para dentro e o de potás­
sio para fora das células. Essas alterações no fluxo de sódio
e potássio mudam a corrente elétrica das células causando
tremores incontrolados ou profunda debilidade muscular
(Naylor et al.4, 1993). Altos níveis de potássio na corrente
sangüínea podem estar associados com o aparecimento da
paralisia. Eqüinos com HYPP podem apresentar paralisias
repentinas que, em casos graves, podem levar ao colapso e
morte súbita decorrente de parada cardíaca e/ou insuficiên­
cia respiratória (Steiss; N aylor12, 1986). Os sinais clínicos
de HYPP podem variar amplamente nos diferentes ani­
mais, e os eqüinos homozigotos são afetados mais grave­
mente do que os heterozigotos. Em condições ideais de
manejo, o gene defectivo não m anifesta efeitos adversos,
mas o estresse e/ou o aumento de potássio sérico podem ini­
ciar sinais clínicos de disfunção muscular (Duarte2, 1993).
Pode ser realizado tratamento clínico eficaz que varia desde
o exercício leve do animal, que auxilia no retorno do potás­
sio para dentro das células até a utilização de acetazolamida,
que age como suave diurético, auxiliando na eliminação do

136
GARCIA, J.F.; G U R G EL , A .S.A .; V ISIN TIN , J.A .; LU N G E, V.R.; DUA RTE, M .B.; BERTOLL1, J.L. U tilização de m arcadores de DNA para o diagnóstico genôm ico de animais
dom ésticos: 2. D etecção da m utação pontual causadora da Paralisia H ipercalêm ica P eriódica (H Y PP) em eqüinos d a raça Q uarto de M ilha. Braz. J. vet. Res. anim . Sei. São
Paulo, v.33, n.3, p .136-138, 1996.
potássio pela excreção urinária (Naylor et al.6, 1992).
A alteração genética que causa HYPP foi resultado de
uma mutação natural, transmitida por um gene autossômico
dominante, não ligado ao sexo, com igual freqüência e não
se diluindo de geração em geração. Os animais que pos­
suem o gene defeituoso podem ser heterozigotos (N/H, ape­
nas um alelo afetado) ou homozigotos (H/H, os dois alelos
estão afetados).
HYPP está associada a eqüinos com musculatura bem
desenvolvida, não significando, entretanto, que a musculatu­
ra bem desenvolvida relacione-se com a doença. O gene
mutante causador de HYPP tem sido identificado nos
descendentes do garanhão Impressive, tanto na raça Quarto de
Milha quanto nas raças Appaloosa e American Paint Horse.
Teoricamente é possível que outras mutações causem HYPP
em diferentes linhagens, entretanto estas são mais difíceis de
ser identificadas, porque não estão tão disseminadas.
A presença da mutação genética foi associada à doença
em mais de 600 animais examinados nos Estados Unidos até
janeiro de 1993 (Spier et a /.10, 1993). Entretanto, 4 destes
animais apresentaram sinais clínicos variáveis da doença
muscular, mas os resultados para a mutação do gene da
subunidade a da proteína do canal de sódio foram negativos
(falsos negativos) (Spier et a /.10, 1993). Porém existem
evidências clínicas de que estes animais provavelmente
apresentavam outra doença muscular, e não HYPP. Não
houve a identificação de animais portadores da mutação
genética que não tinham a doença (falsos positivos).
Com o aprimoramento de técnicas de biologia molecular,
a identificação dos animais portadores é possível através da
amplificação exponencial de um fragmento de DNA da
região do gene da proteína do canal de sódio, pela técnica de
PCR (Polymerase Chain Reaction) (Rudolph et al.*, 1992).
Posteriormente esses fragmentos são submetidos ao trata­
mento com enzimas de restrição, capazes de clivar especifi­
camente o fragmento de DNA no ponto onde ocorre a
mutação. A eletroforese desses fragm entos de DNA em gel
de poliacrilam ida perm ite a identificação dos anim ais
heterozigotos e hom ozigotos, sendo possível elim inar o
problema por meio do cruzamento direcionado com animais
negativos.
O objetivo deste trabalho foi identificar eqüinos
brasileiros da raça Quarto de Milha portadores de HYPP, por
meio da técnica de PCR, previamente descrita por Rudolph
et al.H 1992).
MATERIAL E MÉTODO
DNAs genômicos foram purificados de amostras de
sangue colhidas com EDTA, de 12 eqüinos da raça Quarto
de Milha, descendentes da linhagem Im pressive, utilizan­
do protocolo clássico de fenol-clorofórmio (Sambrook et
al,9, 1989). Os DNAs foram submetidos à técnica de
Polymerase C hain Reaction (PCR) nas seguintes
condições: 200 ng de DNA; 100 ng de cada oligonu-
cleotídeo específico para a região do gene onde ocorre a
mutação (5’ GGGGAGTGTGTGCTCAAGATG 3 ’ e 5 ’
AATGGACAGGATGACAACCAC 3 ’) (Rudolph et alJ,
1992); Taq Polimerase - 2 unidades; dNTPs 1,25 mM de
cada nucleotídeo; tampão apropriado para a enzima; volume
final 50 pl; coberto com 2 gotas de óleo mineral. Foram rea­
lizados 30 ciclos de amplificação (94°C, I min.; 65°C, 4
min.). Após esta etapa, alíquotas de 20 (al das reações de
amplificação foram digeridas com 1 unidade da enzima de
restrição Taq I (incubação por I hora a 62°C) e submetidas
a eletroforese em gel de poliacrilamida 20% em tampão
TBE. O gel foi corado com brometo de etídeo (0,5 |lg/ml) e
os fragmentos de DNA visualizados em transiluminador
ultravioleta.
RESULTADOS
Foram analisados 12 animais dos quais 9 eram portadores
(N/H) e 3 normais (N/N). A amplificação do DNA de todos
os animais gerou um fragmento de 92 pares de bases que,
após a digestão com a enzima Taq I, apresentou 3 fragmen­
tos nos animais portadores (N/H) (92 pb, 64 pb e 28 pb) e 2
fragmentos nos normais (N/N) (64 pb e 28 pb). A Fig. I
mostra o resultado das amplificações por PCR de 3 animais,
nas séries A e B animais N/H e, na série C, animal N/N. O
fragmento de 28 pb não pode ser visualizado na eletroforese.
DISCUSSÃO
A adaptação da técnica de PCR para o diagnóstico da
HYPP permite selecionar os animais negativos para a repro­
dução, auxiliando a eliminação do gene deletério da popu­
lação eqüina dentro das próximas gerações. Por ser o HYPP
uma doença de caráter dominante, ao acasalar-se animais
Figura 1
Eletroforese em gel de poliacrilamida 20% em TBE dos frag­
mentos amplificados por PCR e clivados com a enzima de
restrição Taq I. Linha M: padrão de peso molecular (esca­
da de fragmentos de 100 pares de bases); Linhas 1 e 2
resultado da am plificação de dois animais heterozigotos
(N/H); Linha 3: resultado da am plificação de um animal
livre (N/N).
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GA RCIA , J.F.; G U RG EL, A .S.A .; V ISIN TIN , J.A.; LU N G E, V.R.; DUARTE, M.B.; BERTOLLI, J.L. U tilização de m arcadores dc DNA para o diagnóstico genôm ico de animais
dom ésticos: 2. D etecção da m utação pontual causadora da Paralisia H ipercalêm ica P eriódica (H YPP) em eqüinos da raça Q uarto dc M ilha. Braz. J. vet. Res. anim . Sei. São
Paulo, v.33, n.3, p. 136-138, 1996.

portadores (N/H) com animais livres da doença (N/N), obter-
se-á 50% de animais portadores, porém a avaliação desses
animais e a utilização desses resultados como critério para a
seleção de reprodutores deve ser observada. Apesar de outros
fatores estarem envolvidos nos critérios de seleção dos
reprodutores (alto valor de determ inados anim ais e
importância afetiva do cavalo para o homem), o acasala­
mento dirigido de animais previamente avaliados pode levar
à redução drástica do aparecimento desse gene na popu­
lação. Espera-se que com o controle correto, o número de
portadores seja desprezível dentro de algumas gerações,
sendo tendência a utilização somente de animais negativos.
Além disso, o controle da gestação através do monitora­
mento ultrassonográfico, com a coleta do líquido amniótico
para o teste precoce de HYPP, parece ser uma das soluções
para a prevenção dessa doença.

SUMMARY
Twelve Quarter horses, descendants from Impressive line, have been analyzed. DNAs, purified from leukocytes of
those animals, were submitted to Polymerase Chain Reaction technique (PCR) and digested by Taq I restriction
enzyme. Accordingly the Hyperkalemic Periodic Paralysis (HYPP) genomic diagnosis was established. The tests
revealed that 9 animals were carrier heterozygotes (N/H) and 3 normal homozygotes (N/N). Since the development of PCR
methodology, it has been possible to diagnose the problem and plan ways to control the spreading of this defective
gene in the population, through detection of carrier and normal animals.
UNITERMS: Paralysis; Hyperkalemia; Horses; Equidae; DNA.

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