UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

BIOMEDICINA

ASPECTOS HISTOLÓGICOS DO TRATAMENTO DE TUMOR

EHRLICH POR HIPERTERMIA MEDIADA POR NANOPARTÍCULAS
MAGNÉTICAS BSA - IR 780 - MnFe2O4 EM CAMUNDONGOS

CARLA MARIA DE SOUSA SILVA

GOIÂNIA – GO
2018
 CARLA MARIA DE SOUSA SILVA

ASPECTOS HISTOLÓGICOS DO TRATAMENTO DE TUMOR

EHRLICH POR HIPERTERMIA MEDIADA POR NANOPARTÍCULAS
MAGNÉTICA BSA - IR 780 - MnFe2O4 EM CAMUNDONGOS

Monografia apresentada ao curso de

Biomedicina da Universidade Federal de
Goiás, como requisito para aprovação na
disciplina de Trabalho de Conclusão de
Curso.

Orientad
or:
Prof. Dr. Clever Gomes Cardoso

GOIÂNIA - GO
2018
 CARLA MARIA DE SOUSA SILVA

ASPECTOS HISTOLÓGICOS DO TRATAMENTO DE TUMOR

EHRLICH POR HIPERTERMIA MEDIADA POR NANOPARTÍCULAS
MAGNÉTICA BSA - IR 780 - MnFe2O4 EM CAMUNDONGOS

Monografia apresentada ao curso de

Biomedicina da Universidade Federal de
Goiás, como requisito para aprovação na
disciplina de Trabalho de Conclusão de
Curso.

Orientador: Prof. Dr. Clever Gomes Cardoso

Goiânia, 30 de novembro de 2018.

BANCA EXAMINADORA

Aprovada em: 30/11/2018

Dr. Clever Gomes Cardoso (Orientador)

Instituto de Ciências Biológicas - ICB - UFG

Dra. Marina Pacheco Miguel

Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública - IPTSP - UFG

Dra. Elisângela Silveira Lacerda

Instituto de Ciências Biológicas - ICB – UFG
Dedico este trabalho a minha mãe, Maria José
de Sousa Silva (in memoriam), que tanto
sinto saudade, a meu pai Jovercino Antônio da
Silva e ao meu marido Murilo Gonçalves
Pereira.
 AGRADECIMENTOS

A minha mãe, Maria José de Sousa Silva (in memoriam), meus

agradecimentos por fazer parte de minha vida e por toda a dedicação ao cuidar de
mim, com tanto carinho e paciência.
Ao meu pai, Jovercino Antonio da Silva, que sempre batalhou com
honestidade e força, sem medir esforços para cuidar de minha família.
Ao meu marido, Murilo Gonçalves Pereira, que está sempre ao meu lado, me
incentivando a crescer cada dia mais. Agradeço também por sua presença e carinho
durante o momento mais difícil de minha vida, sempre me tratando com cuidado,
proteção e amor.
Ao meu irmão, Willian Henrique de Sousa Silva, e a minha cunhada, Tatiany
Marinho Salgado Silva, agradeço-os por todos os conselhos e cuidados disfarçados
de broncas e puxões de orelha. Sou grata a Deus por tê-los em minha vida.
A minha avó, Maurina Sebastiana (in memoriam), e a minha tia, Maria Dália
(in memoriam), por terem feito parte de minha vida, por estarem sempre presentes
em minhas melhores lembranças e por terem cuidado de mim com tamanha
amizade e proteção.
A Universidade Federal de Goiás - UFG, por me proporcionar a oportunidade
de fazer o curso que tanto amo, nesta renomada instituição.
A toda equipe técnica do Instituto de Ciências Biológicas – ICB, que permitiram
a execução do meu trabalho.
Ao meu orientador Clever Gomes Cardoso por todo o apoio e contribuição
para que este trabalho se realizasse. Sou muito grata por estes dois anos de
convivência e trabalho no laboratório, durante minha Iniciação Científica e Trabalho
de Conclusão de Curso. Foi uma honra para mim poder trabalhar e aprender com o
senhor.
A minhas amigas Ana Karulline, Andressa Ribeiro, Esther Figueredo e
Marcella Miranda por todos os momentos durante a nossa graduação. Estar com
vocês é muito bom, fez com que estes quatro anos se passassem rápido, por meio
de boas risadas, bons lanches e bons papos.
 A toda equipe do Hospital e Maternidade Dona Íris – HMDI, que me deram a
oportunidade de conhecer o seu trabalho por meio do meu primeiro estágio
supervisionado, local onde fui recebida com um enorme carinho por todos o
profissionais. Agradeço imensamente a minha preceptora Hérica da Costa, por toda
a atenção e carisma que teve comigo durante meus três meses de estágio no
laboratório do hospital. Agradeço também as biomédicas Dalila Oliveira, Débora
Motta, Fernanda Bastos, Lorrane Barcelos e Sara Assunção, e toda equipe técnica
do laboratório do Hospital e Maternidade Dona Íris, especialmente aos técnicos
Juliana, Lucyhellem, Marlene, Milla e Pablo, serei eternamente grata a vocês. Poder
colocar em prática, pela primeira vez, os meus conhecimentos teóricos e conhecer o
mercado de trabalho junto desta equipe foi muito gratificante para mim.
A equipe do Laboratório DASA, do Hospital de Urgências de Goiânia –
HUGO, por todo o aprendizado durante o meu estágio supervisionado. Agradeço a
minha preceptora Glaucie Mendes, a Biomédica Nágila Martins por todo o apoio,
atenção, ensinamentos e orientações que me deu durante esses três meses, ao
Biomédico Luciano Sousa por todo apoio e ensinamentos sobre a área da
Microbiologia, a Biomédica Brena por toda contribuição nos ensinamentos sobre
Hematologia e Microbiologia, a Biomédica Raíssa Leite e a toda a equipe técnica do
laboratório, em especial aos técnicos Bruna, Camila, Danielle, Élida, Fernanda,
Gabriel e Jean, foi muito bom trabalhar com vocês.
A banca examinadora, Dra. Elisângela Silveira Lacerda, Dra. Marina Pacheco
Miguel e suplente Dra. Francyelli Mello Andrade, agradeço pelo tempo
disponibilizado, pela paciência, empenho e tamanha contribuição na correção de
meu trabalho de conclusão de curso. Saibam que, mesmo em pouco tempo, aprendi
muito com vocês.
Agradeço também corpo docente da UFG, pela a influência e orientação
durante esses quatro anos de graduação, onde pude aprender muito mais que
teorias, mas a me preparar para o mundo lá fora.
“A felicidade pode ser encontrada mesmo
nas horas mais escuras, se você lembrar
de acender a luz”.

(Alvo Dumbledore)
 RESUMO
Introdução: A hipertermia é um tipo de tratamento contra o câncer que envolve a
indução de calor no tumor para promover morte celular e indução do sistema
imunológico. A hipertermia por indução magnética mediada por nanopartículas
magnéticas (NPM) é baseada no aumento de calor no local do tumor decorrente da
agitação das NPM em campo magnético alternado. A técnica é considerada eficiente
e não invasiva no tratamento do câncer, pois promove a ocorrência de morte celular
no tecido tumoral por meio da hipertermia e indução do sistema imunológico.
Objetivos: Este estudo buscou determinar se a hipertermia mediada por
nanopartículas magnéticas causa aumento da taxa de necrose ou apoptose no
tumor Ehrlich induzido em camundongos, utilizando a técnica de varredura
histológica para uma melhor análise quantitativa através do software IMAGE J.
Buscou-se também inferir se houve lesões celulares, a partir da análise dos tecidos
em microscópio óptico, nos órgãos renal, esplênico, hepático e pulmonar após a
hipertermia mediada por nanopartículas magnéticas, a fim de avaliar a capacidade
de efeitos tóxicos, visíveis a microscópio óptico. Metodologia: Foram utilizados
camundongos albinos Swiss, com 6 a 8 semanas de vida. Após 20 dias da indução
do tumor de Ehrlich, foi injetado a NPM BSA - IR 780 – MnFe2O4 diretamente no
tumor de Ehrlich. Os camundongos foram submetidos à hipertermia magnética em
campo magnético alternado nos tempos zero (logo após a injeção de NPM), 24 e 72
horas, em seguida, os animais foram sacrificados e retirados o tumor e tecidos para
análise histopatológica. Resultados: A taxa de morte celular foi avaliada por meio
da análise de varredura histológica e mostrou uma maior área de morte celular no
grupo de camundongos tratados nos tempos 24 e 72 horas após a hipertermia. Os
tecidos rins, fígado, baço e pulmões dos camundongos tratados por hipertermia
foram analisados para verificação de lesões celulares, onde foi observado que as
NPM não induziram alterações histológicas visíveis por meio de microscópio óptico.
Conclusão: Este estudo determinou que houve diminuição do tumor Ehrlich de
camundongos, através da quantificação da região de morte celular no tumor, após
hipertermia mediada por nanopartículas. Não foram visualizados lesões celulares
que inferem efeitos tóxicos nos tecidos renal, esplênico, hepático e pulmonar.
Palavras-chaves: Alterações histológicas. Lesão celular. Varredura histológica.
 ABSTRACT
Introduction: Hyperthermia is a type of cancer treatment that involves inducing heat
in the tumor to promote cell death and induction of the immune system. Magnetic
nanoparticle-mediated (NPM) magnetic induction hyperthermia is based on increased
heat at the tumor site resulting from the agitation of NPMs in alternating magnetic
field. The technique is considered efficient and noninvasive in the treatment of
cancer, as it promotes the occurrence of cell death in the tumor tissue through
hyperthermia and induction of the immune system. Objectives: This study aimed to
determine if hyperthermia causes a decrease in the Ehrlich tumor by determining
regions with cell death using the IMAGE J software, through the analysis of
histopathological scanning after hyperthermia mediated by magnetic nanoparticles. It
was also sought to infer if the cellular lesions found after hyperthermia can lead to
toxic effects on the tissues of the kidneys, spleen, liver and lungs. Method: Swiss
albino mice, 6 to 8 weeks old, were used. After 20 days of Ehrlich tumor induction,
NPM BSA - IR 780 - MnFe 2 O 4 was injected directly into the Ehrlich tumor. The
mice were submitted to magnetic hyperthermia in alternating magnetic field at zero
times (shortly after the injection of NPM), 24 and 72 hours, then the animals were
sacrificed and the tumor and tissue removed for histopathological analysis. Results:
The presence of NPM in tumors at 24 and 72 hours was determined in the tumor
sections by the Perls technique. The rate of cell death region was assessed by
histological scanning analysis and showed a greater area of cell death in the group of
mice treated at times 24 and 72 hours after hyperthermia. The tissues of the kidneys,
liver, spleen and lungs of hyperthermia treated mice were analyzed for cellular
lesions, where it was observed that the NPM did not induce visible histological
alterations by means of an electron microscope. Conclusion: This study determined
that there was a decrease in the Ehrlich tumor of mice, by quantifying the region of
tumor cell death after hyperthermia mediated by nanoparticles. Cell lesions that infer
toxic effects on renal, splenic, hepatic and pulmonary tissues were not visualized in
an electronic microscope.
Keywords: Histological changes. Cell injury. Histological scanning.
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Universidade Federal de Goiás

UFG
Ácido desoxirribonucleico
DNA
Instituto Nacional do Câncer
INCA
Nanopartículas magnéticas
NPM
Soro albumina bovina
BSA
Molécula fluorescente em infravermelho próximo
IR
Manganês
Mn
Ferro
Fe
Hematoxilina e eosina
HE
Três dimensões
3D
Proteínas de choque térmico
HPS
Sistema Único de Saúde
SUS
 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 13
1.1 CÂNCER E TUMOR EHRLICH 13
1.2 TRATAMENTO DE CÂNCER 14
1.3 HIPERTERMIA 15
1.4 HIPERTERMIA MEDIADA POR NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS 16
2 JUSTIFICATIVA 18
3 OBJETIVOS 19
3.1 GERAIS 19
3.2 ESPECÍFICOS 19
4 METODOLOGIA 20
4.1 ASPECTOS ÉTICOS 20
4.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 20
4.2.1 Animais e grupos 20
4.3 INDUÇÃO DO TUMOR EHRLICH 21
4.4 TRATAMENTO 21
4.5 NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS BSA – IR 780 – MnFe2O4 21
4.6 PROCESSAMENTO DO MATERIAL HISTOLÓGICO
(TUMOR E TECIDOS) 22
4.6.1 Coloração de Perls 23
4.6.2 Hematoxilina - Eosina (HE) 23
4.7 ANÁLISE DA CITOTOXICIDADE E HISTOPATOLOGIA 24
4.8 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E MORFOMÉTRICA DO TUMOR
EHRLICH INDUZIDO EM CAMUNDONGOS: EFETIVIDADE 24
4.9 DETERMINAÇÃO DA ÁREA TOTAL DE NECROSE UTILIZANDO
O SOFTWARE IMAGE J 25
5. RESULTADOS 28
6 DISCUSSÃO 31
7 CONCLUSÃO 33
8 CONSIDERAÇÕES FINAIS 34
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 13

1 INTRODUÇÃO

1.1 CÂNCER E TUMOR EHRLICH

O câncer está entre as maiores causas de óbitos no mundo e

consequentemente é considerado um grande problema de saúde pública. Essa
doença compreende uma série de doenças que convergem em uma
característica principal, a perda do controle normal da proliferação e
crescimento celular. A proliferação e o crescimento celular anormal pode dar
origem a neoplasias, sendo consideradas benignas ou malignas (ROBBINS,
2010; ABBAS, 2012).
A neoplasia benigna apresenta uma massa de células que se
assemelham ao tecido original e sua multiplicação é vagarosa. Suas células
crescem unidas entre si, não infiltram tecidos vizinhos e sua massa tumoral é
bem delimitada (RUDDON, 2007; INCA, 2018).
A neoplasia maligna é formada por células anaplásicas (não se
assemelham ao tecido de origem) e tem a capacidade de infiltração. Sua
multiplicação celular ocorre de forma rápida, podendo infiltrar tecidos vizinhos,
causar mestástase e angiogênese, sendo a angiogênese definida pela
formação de novos vasos sanguíneos a partir de casos pré-existentes
(FERNANDES, 2005; ABBAS, 2012; RUDDON, 2007; HANAHAN e
WEINBERG, 2011, de LAPLANCHE et al. 2015).
A angiogênese ocorre por meio da indução de fatores pré/anti-
angiogênicos. A rede vascular, uma vez estabelecida no ambiente tumoral
fornece ao tumor nutrientes, oxigênio e remoção de produtos metabólicos e
possibilita a invasão de células tumorais em tecidos vizinhos em um processo
denominado metástase (ZIYAD E IRUELA-ARISPE, 2011).
A metástase é definida por disseminação tumoral por via sanguínea ou
linfática, com o comprometimento de tecidos subjacentes do foco primário
tumoral. É um passo fundamental na progressão do câncer indicativo de um
pior prognóstico, causando 90% das mortes de pacientes acometidos pela
doença (INCA, 2011; CHAFFER e WEINBERG, 2011; SU et al. 2015).
 14

O tumor utilizado neste trabalho foi o tumor de Ehrlich, que se trata de

uma neoplasia experimental transplantável de origem epitelial maligna,
correspondente ao adenocarcinoma mamário do camundongo fêmea. É um
dos tumores mais comumente utilizados em estudos, surgiu inicialmente como
câncer de mama espontâneo em fêmeas de camundongos sendo utilizado pelo
pesquisador Ehrlich Apolant (1905) como um tumor experimental. Sua
formação ocorre tanto na forma sólida quanto ascítica (AKTAS, 1996; TASKIN,
2002).
Em comparação às demais neoplasias utilizadas em estudo, as
vantagens da utilização de neoplasias transplantáveis, como no caso do tumor
Ehrlich são o crescimento prévio do tumor e a baixa quantidade de células
tumorais a serem inoculadas, levando a um rápido desenvolvimento da
neoplasia, o que reduz o tempo de estudo. Outra vantagem na utilização deste
tumor é a vasta bibliografia disponível e facilidade de manuseio experimental.
Devido a essas características o tumor Ehrlich tem sido aplicado nos estudos
de Oncologia Experimental (VILELA, 2009; OZASLAN, et al. 2011).

1.2 TRATAMENTO DE CÂNCER

O tratamento de câncer tem o objetivo de cura, prolongamento de

sobrevida e melhoria para a qualidade de vida do paciente. As principais
formas de tratamento são a cirurgia para remoção do tumor, radioterapia e
quimioterapia (INCA, 2011).
A técnica cirúrgica é utilizada no tratamento da doença regional e
localizada, sendo indicada em estágios iniciais do câncer e é eficaz na
remoção de tumores em casos de ausência de metástase, que, caso esteja
presente, é necessário a associação de outras formas de tratamento (INCA,
2011).
A radioterapia pode reduzir tumores grandes, mesmo quando utilizada
isoladamente. Pode também diminuir as chances de metástases, entretanto
quando associada a cirurgia resulta numa maior eficiência do tratamento
(NISHIKAWA & SAKAGUCHI, 2010; VON WINCKWITZ; MARTIN, 2012).
 15

Já a quimioterapia é o método de tratamento que se baseia no emprego

de substâncias químicas, isoladas ou em combinação, que combatem as
neoplasias malignas a nível celular, podendo interferir nos processos de
crescimento e divisão das células tumorais. Uma desvantagem da
quimioterapia é a baixa especificidade para as células tumorais, agredindo
também as células normais, principalmente as que possuem características
semelhantes às células tumorais (DINIZ, 2008).
Um outro tipo de tratamento é a imunoterapia, onde são estimulados os
próprios mecanismos imunológicos de defesa do organismo por meio de
substâncias modificadoras da resposta biológica, usadas após intervenção
cirúrgica ou outro tratamento, para indução de apoptose de células cancerosas
residuais. O tratamento por imunoterapia tem o foco principal em tumores
malignos, não apenas no tratamento, mas também na prevenção (INCA, 2018).
A imunoterapia, apesar de apresentar um bom resultado, ainda é considerada
uma terapia adjuvante (INCA, 2018).
Um dos meios de estimular o sistema imunológico é através da técnica
de hipertermia, que pode ser empregada no tratamento antitumoral por meio do
aumento da temperatura do local tumoral por um determinado tempo, onde
para se obter efeitos terapêuticos deve haver aquecimento entre 41-46° C
(TORAYA, 2014).

1.3 HIPERTERMIA

Segundo a American Cancer Society, na década de 80, a hipertermia na

terapia contra câncer era um método de terapia não comprovada. Mas após
estudos laboratoriais e análises da possibilidade de tratamento combinado a
outras terapias, mudou este conceito considerando a hipertermia como uma
terapia moderna de tratamento do câncer e ainda colocando-a como destaque
para o futuro da cancerologia (HORNBACK, 1989).
Por meio do aumento da temperatura na região tumoral, ocorre dano às
células tumorais devido a indução de efeitos termo-imunes, além da ativação da
resposta imunológica contra o tumor. A hipertermia é uma técnica capaz de induzir
morte celular, dependendo da temperatura, onde temperaturas acima de 43° C
podem matar um número significativo de células tumorais, porém pode também
 16

ocorrer morte celular de tecidos vizinhos normais devido ao aumento da

temperatura na região (BAUER, 1979).

1.4 HIPERTERMIA MEDIADA POR NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS

A hipertermia associada a nanopartículas no tratamento tumoral faz que

com ocorra o aquecimento direcionado no ambiente tumoral, assegurando o
aumento da especificidade do tratamento e diminuição de toxicidade e efeitos
adversos, como indução de morte celular em tecidos não tumorais e saudáveis
(VAN DER ZEE, 2002; GAZEAU et al.,2008, BOLFARINI et al., 2012; TORAYA-
BROWN & FIERING, 2014; BEIK et al., 2016).
A utilização de nanopartículas magnéticas como carreadores de calor
hipertérmico direcionam o aquecimento de forma a garantir menos danos a
tecidos adjacentes, pois as nanopartículas conseguem absorver a energia
originada de uma fonte externa, levando a inversão da direção da perda de
calor (Figura 1), ou seja, hipertermia de dentro para fora do corpo (BEIK et al.
2016; LU, 2008).
 17

Figura 1 – Na imagem podemos ver a hipertermia originada de fonte externa e interna. Na parte
esquerda, temos a utilização da hipertermia, no tumor, de fonte externa o aquecimento ocorre
na superfície do corpo, onde a temperatura irá diminuit à medida que aprofunda os tecidos,
levando a geração de calor em regiões não específicas e dissipação da maior parte de energia
térmica para tecidos saudáveis situados ao longo do caminho pelo calor induzido. Na parte
direita da imagem, temos um tumor carregado com nanopartículas magnéticas onde, através
do aquecimento destas partículas, podem direcionar o aquecimento de forma a garantir
menores danos aos tecidos laterais (normais).

Fonte: BEIK, et al. 2016.

A terapia de hipertermia por indução magnética baseada na utilização de

nanopartículas magnéticas (NPM) podem gerar o aumento da temperatura
através de movimentação de rotação e translação ou podem ser aquecidas
com a ação de um campo magnético externo. A técnica é considerada eficiente
e não invasiva no tratamento do câncer. Além da morte esperada das células
tumorais, a hipertermia por NPM pode induzir respostas imunes específicas do
tumor como resultado da expressão da proteína de choque térmico, o que
poderia permitir que a hipertermia não mate apenas tumores locais, expostos
ao tratamento térmico, mas também tumores distantes do local de origem e
também células cancerígenas metastáticas (KUMAR, 2011; LU, 2008; BEIK, et
al. 2016).
 18

2 JUSTIFICATIVA

Esse trabalho faz parte de um projeto que busca investigar os

mecanismos físicos e biológicos associados à geração de calor produzido por
nanocarreadores magnéticos quando os mesmos interagem com campo
magnético alternado. Para isso foram desenvolvidas NPM, dentre elas a NPM
BSA - IR780 – MnFe2O4, no Instituto de Física da UFG. As NPM foram
aplicadas diretamente no tumor de Ehrlich induzido em camundongos e
submetidos a hipertermia magnética.
A hipertermia magnética tem efeitos sobre o tumor que são reconhecidos
e analisados por pesquisadores, contudo, existe uma dificuldade em
determinar, de forma precisa, a eficácia da técnica na indução de morte de
células tumorais em diferentes regiões do tumor.
Portanto esse trabalho buscou avaliar a taxa de morte celular no tumor
de Ehrlich tratado por hipertermia mediada por nanopartículas, além de verificar
a ocorrência de lesões celulares que podem indicar efeito tóxico das NPM aos
tecidos renal, esplênico, hepático e pulmonar. A taxa de morte celular na região
tumoral foi determinada através da análise de varredura histopatológica de
tumor Ehrlich oriundo de camundongos submetidos a esse tipo de hipertermia.
A varredura histológica pode ser útil para determinação exata da taxa de morte
celular em estudos para o tratamento de tumores.
 19

3 OBJETIVOS

3.1 GERAIS

Determinar a taxa de necrose tumoral por varredura histopatológica do tumor

de Ehrlich após hipertermia mediada por nanopartículas.

3.2 ESPECÍFICOS

Determinar a presença de nanopartículas no tumor até o momento de

tratamento por hipertermia.
Determinar a taxa de necrose nos tumores tratados por hipertermia
mediada por nanopartículas, através do software IMAGE J.
Inferir a segurança toxicológica das nanopartículas por meio de análise
histopatológica de tecidos de camundongos tratados por hipertermia mediada
por nanopartículas.
 20

4 METODOLOGIA

4.1 ASPECTOS ÉTICOS E ANIMAIS

Desenvolvimento experimental aprovado pela Comissão de Ética da

Universidade Federal de Goiás (UFG) com parecer consubstanciado referente
ao pedido de emenda do protocolo nº 098/2014.
Foram utilizados camundongos albinos Swiss com peso entre 25 a 40
gramas, de 6 a 8 semanas no momento da inoculação do tumor. Os animais
são oriundos do biotério central da UFG. Os animais foram mantidos sob
condições padrão em laboratório (temperatura entre 22 a 25 C° com ciclo de
luz 12h claro/12h escuro) mantidos em gaiolas de polipropileno com dimensões
40x30x1 cm com 5 animais cada, forradas com maravalha trocada diariamente,
alimentados com ração comercial e água filtrada, ambos oferecidos “ad
libitum”.

4.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

4.2.1 Animais e grupos

Foram utilizados camundongos albunos Swiis com peso entre 25 a 40

gramas, e com 6 a 8 semanas de vida no momento da inoculação do tumor
ascítico de Ehrlich. Os animais foram oriundos do Biotério Central da UFG e
foram mantidos sob condições padrão em laboratório (temperaturas entre 22 a
24 C° com ciclo de luz 12h claro/12h escuro), Os camundongos foram mantidos
em gaiolas de polipropileno com dimensão 40x30x16 cm com 5 animais cada,
forradas com maravalha trocada diariamente e alimentados com ração
comercial e água filtrada, ambos oferecidos ad libitum.
Os grupos de camundongos estudados foram separados em grupo
controle e grupo tratado. Ambos os grupos receberam a inoculação do
carcinoma ascítico de Ehrlich para seu posterior desenvolvimento, mas
somente o grupo tratado recebeu o tratamento por hipertermia mediada por
nanopartículas magnéticas BSA – IR 780 – MnFe2O4.
 21

4.3 INDUÇÃO DO TUMOR EHRLICH

O carcinoma ascítico de Ehrlich foi mantido intraperitonealmente em

camundongos Swiss. Sete dias após a inoculação, o fluido peritoneal de um
animal com carcinoma ascítico foi aspirado, as células lavadas com PBS e uma
alíquota da suspensão celular foi colocada em azul de tripan 1% (m/v) (Sigma,
St Louis, MO) e quantificada por contador automático de células Luna (Logos,
Biosystems, Annandale, VA). Somente as diluições com 90% de células viáveis
foram injetadas no tecido subcutâneo dos camundongos para indução do tumor
sólido.
A indução do câncer por meio da implantação subcutânea da forma
ascítica é um dos modelos mais usados por ser tecnicamente fácil de realizar e
por apresentar ótima possibilidades de monitoramento da progressão tumoral e
na avaliação dos efeitos do tratamento (HEIJSTEK, 2011).

4.4 TRATAMENTO

O tratamento consistiu na injeção de 150 uL da nanopartículas BSA - IR

780 – MnFe2O4 diretamente no tumor de Ehrlich após 20 dias da indução. Os
camundongos foram submetidos à hipertermia magnética nos tempos zero
(logo após a injeção de nanopartículas), 24 ou 72 horas após a injeção de
nanopartículas e em seguida eutanasiados para retirada dos tecidos.

4.5 NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS BSA – IR 780 – MnFe2O4

A nanopartícula utilizada no projeto foi a MalbIR (Figura 2), constituída

por uma parte proteica denominada BSA (albumina de soro fetal bovino), uma
porção fluorescente (IR 780) e uma uma porção férrica (MnFe2O5 – ferrita de
magnésio).
A BSA tem a função de fazer com que a nanopartícula passe pela
corrente sanguínea sem desencadear mecanismos de reconhecimento
antigênico pelo sistema imunológico. A IR 780 é uma molécula fluorescente em
infravermelho próximo, que permite a detecção da NPM MalbIR no organismo
por espectrometria de fluorescência ou tomografia molecular de fluorescência.
 22

A Ferrita de magnésio é a parte férrica da nanopartícula, com a finalidade de

aquecimento através da hipertermia.

Figura 2: Imagem mostrando a nanopartícula MalbIR, utilizada no trabalho, e seus constituíntes

BSA, IR 780 e MnFe2O4.

4.6 PROCESSAMENTO DO MATERIAL HISTOLÓGICO (TUMOR E TECIDOS)

Primeiramente foi realizado o processamento histológico dos tecidos

retirados dos grupos de camundongos tratados e controle. Os tecidos
(incluindo o tumor) de camundongos tratados e controle por inoculação de
NPM via intra-orbital foram fixados em solução de formaldeído a 10% por 24
horas. Em seguida foi feito a desidratação gradativa das membranas em
soluções crescentes de álcool (70%, 80%, 95%), por uma hora em cada
solução, seguidos de três banhos em álcool 100% por uma hora cada. Logo
após os tecidos foram diafanizadas com dois banhos de uma hora de xilol,
seguidos por dois banhos de uma hora em parafina líquida, sendo
posteriormente inclusas em parafina para formação dos blocos.
Os tecidos foram emblocados e cortadas com 5µm de espessura em
micrótomo semi-automático (Leica RM2245). Depois de realizado o
processamento e os cortes dos tecidos de camundongo foi realizado a
coloração de Perls e coloração por Hematoxilina e Eosina (HE).
 23

4.6.1 Coloração de Perls

A coloração de Perls foi executada para a identificação e análise dos

átomos de sais de ferro nos tecidos e esta técnica é utilizada para a verificação
da presença das nanopartículas no tumor de Ehrlich induzido e nos tecidos
analisados (via intra-orbital). Na primeira etapa para a realização da coloração
de Perls é feita desparafinização dos tecidos em xilol e álcool, onde logo após
foram lavados em água destilada e corados pelo reagente de Perls.
A coloração de Perls é realizada utilizando duas soluções, Solução A
(durante 1 hora) e Solução B (durante 1 minuto), sendo a Solução A composta
por ferrocianeto de potássio 2% e ácido clorídrico 2% e Solução B composta
por 99mL de água destilada, safranina 0,2g e ácido acético glacial 1 mL.
Seguidamente, foi realizado a desidratação gradativa dos tecidos em soluções
crescentes de álcool (álcool 50%, 60%, 70%, 95%) e três banhos de 2 minutos
cada em álcool 100%.
Após executado o processo de desidratação foi realizado a diafanização
dos tecidos em três banhos de xilol, durante 1 minuto cada, e feito a montagem
das lâminas com adição de lamínula fixada ao corte por Entellan. As lâminas
foram observadas no microscópio, onde o objetivo foi obter a coloração azul
claro nas partes do tecido onde se encontra o ferro férrico.

4.6.2 Hematoxilina - Eosina (HE)

Para a análise histológica e de citotoxicidade foi realizado a coloração

por Hematoxilina e Eosina (HE), onde na primeira etapa é feita a
desparafinização dos tecidos em três banhos de xilol por 20 minutos, seguido
por banhos de 3 minutos cada em soluções decrescentes de álcool (100% três
vezes, 95%, 80%, 70%, 60% e 50%) e água deionizada. Logo após, os tecidos
foram corados com Hematoxilina durante 30 segundos e lavados em água
corrente por 10 minutos, seguidos pela etapa de desidratação gradativa dos
tecidos em soluções crescentes de álcool (50%, 60% e 70%) e corados em
solução de Eosina por 4 minutos. Posteriormente foi realizado um banho em
álcool 95% por 2 minutos, seguido de três banhos em álcool 100% por 2
minutos e realizado a diafanização dos tecidos, onde os cortes foram
 24

submetidos a três banhos em xilol durante 1 minuto cada e em seguida foi feito
a montagem das lâminas com adição de lamínula fixada ao corte por Entellan.
Após a coloração, os tecidos foram fotografados para análise em
Microscópio de Captura Leica do laboratório multiusuário do Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública.

4.7 ANÁLISE DA CITOTOXICIDADE E HISTOPATOLOGIA

Para análise histológica e de citotoxicidade foram retirados os tecidos

dos animais (baço, fígado, rins, pulmões) após a eutanásia e submetidos à
coloração por Hematoxilina/Eosina (HE).
Diferentes parâmetros foram utilizados para análise histológica para
verificação da citotoxicidade dos compostos nos animais tratados: (1) presença
de infiltrado celular, (2) análise do parênquima tecidual, (3) hiperemia, e (4)
presença de morte celular. Os resultados foram visualmente classificados de
acordo com a intensidade e os dados transformados em variáveis quantitativas
por meio da atribuição das seguintes pontuações: ausência (0), discreto (1-
25%), moderado (26-50%) e acentuado (acima de 50%). Os resultados foram
avaliados usando ANOVA e teste de Tukey com nível de significância de 5 %
(p < 0.05).

4.8 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E MORFOMÉTRICA DO TUMOR EHRLICH

Para análise da histopatologia e efetividade da ação da nanopartículas

BSA - IR780 – MnFe2O4 IR-780 no tecido tumoral de Ehrlich foram utilizados
diferentes parâmetros: (1) presença de infiltrado celular, (2) análise do
parênquima tecidual; (3) presença morte celular, e (5) presença de vasos
sanguíneos. Para análise morfométrica foi quantificado a área e o diâmetro
médio do tumor, bem como área e diâmetro médio das áreas de morte celular
presentes no tumor de camundongos controle e tratados. Para essa análise foi
utilizado o software IMAGEJ delimitando sua área média em micrômetros
quadrados e seu diâmetro maior e menor em micrômetros.
 25

4.9 DETERMINAÇÃO DA TAXA DE MORTE CELULAR NOS TUMORES DOS

GRUPOS CONTROLE E TRATADO

Foram realizados cortes em sequência do grupo tratado e grupo controle

para uma montagem em 3D da morfologia do tumor, antes e após o tratamento
com NPM BSA - IR780 - MnFe2O4 inoculadas em camundongos com tumor de
Ehrlich. As sequências de cortes histológicos foram coradas com corante HE e
as lâminas (em sequência) montadas normalmente, com meio de montagem
Entellan.
Os cortes em sequência foram fotografados e as fotos agrupadas por
meio de software. Essa técnica busca determinar de forma precisa a área de
necrose nos tumores tratados e controle.
Devido ao tamanho dos tumores optamos por utilizar um
Estereomicroscópio, o que permitiu a análise de toda a área tumoral em uma
foto. As fotos em sequência foram agrupadas através do software IMAGE J e a
taxa de morte celular foi quantificada utilizando os cortes histológicos seriados
de todo o tecido tumoral (Figura 4).
 26

Figura 4 – Demonstração da varredura histológica do tecido tumoral.

A determinação da área total de morte celular, das imagens de varredura

histológica, foi determinada pelo software IMAGE J por meio do limiar de
intensidade de cor (Threshold), em que o limiar de cor para determinada região
(morte celular) é ajustado de forma a permitir a análise por meio do limiar de
intensidade de cor (Figuras 5 e 6). As manipulações foram feitas em cada
imagem dos cortes histológicos do tumor e depois são aplicadas em todos os
cortes para análise quantitativa da região tumoral e não tumoral.
 27

Figura 5 - Determinação da área total de necrose por meio do limiar de intensidade de cor.

Figura 6 – Conversão da imagem para a escala de cinza (8 bits).

 28

5 RESULTADOS

A técnica de Perls confirmou a presença das NPM nos tumores tratados

após 24 e 72 horas após a sua inoculação (Figura 3). Foi possível verificar a
presença das nanopartículas nos tecidos a partir da coloração azul.

Figura 3 – Legenda: Coloração de Perls nos tumores com 24 (A) e 72 (B) horas de inoculação do
tumor, indicando a presença das nanopartículas. As setas indicam a presença de íons de Ferro,
corados em azul.

Após o tratamento por hipertermia mediada por nanopartículas

magnéticas em camundongos, foi possível observar que as áreas de morte
celular foram mais evidentes no grupo tratado (Figura 7). O perfil
histopatológico observado nos tumores indica necrose do tipo coagulativa onde
se evidencia uma massa homogênea eosinofílica, com alguns núcleos
picnóticos e núcleos fragmentados (cariorrexe), especialmente na periferia
além de tecido fibrótico difuso. Nessas regiões necróticas é possível observar
que as células perdem seus contornos e formatos.
 29

Figura 7 – Análise histopatológica dos tumores do grupo controle (A) e grupo tratado (B). As
setas indicam região de morte celular no tumor Ehrlich induzido em camundongos e tratados
por hipertermia mediada por nanopartículas magnéticas. Podemos observar na imagem B que
houve uma maior área com morte celular.

Foi verificado nos tumores tratados por hipertermia mediada por

nanopartículas uma taxa de morte celular de 75,5% e nos tumores controle,
que não receberam o tratamento por hipertermia mediada por nanopartículas,
uma taxa de morte celular de somente 30,6%, (Tabela 1).

Tabela 1 – Comparação da taxa de necrose nos tumores tratado e controle. A

determinação das áreas foi realizada através do software Image J.
TUMOR INTEIRO REGIÃO NECRÓTICA
Área [mm²] Área [mm²] %
GRUPO CONTROLE 7689,3 2535,3±675,4 30,6±8,7

GRUPO TRATADO 3921,61 2535,3±675,4 75,5±6,8

Os tecidos renal, esplênico, hepático e pulmonar foram coletados para

verificação de lesão celular (análise feita através de microscópio óptico) após o

tratamento do tumor Ehrlich por hipertermia mediada por nanopartículas magnéticas e

mostraram que não houveram alterações histológicas nos tecidos analisados (Figura

8).
 30

Figura 8 - Legenda: Baço (A), Rim (B). Pulmão (C) e Fígado (D) sem alterações no

parênquima tecidual das células.

 31

6 DISCUSSÃO

A determinação da taxa de necrose foi verificada e mostra que a

utilização da hipertermia mediada por NPM em camundongos é eficiente para o
tratamento do tumor Ehrlich, pois foi encontrado no grupo controle uma taxa de
30,6% de necrose e no grupo tratado 75,5% de necrose. Diante destes
resultados obtivemos o levantamento dos benefícios da técnica, ampliando o
entendimento sobre a proposta de hipertermia.
Estudos que avaliam o tratamento de tumores utilizando diferentes
técnicas, inclusive a hipertermia, dependem da análise histopatológica para a
determinação de sua eficácia. Contudo, o que geralmente se observa é que a
análise histopatológica é realizada somente em algumas partes do tumor.
Miranda Vilela, et al, 2014 verificaram o perfil histopatológico do tumor
por meio da análise de 5 secções histológicas com 100 micrômetros de
distância um do outro. Isso pode ser prejudicial ao estudo, uma vez que as
reações podem ter efeitos diferentes em determinadas áreas do tecido tumoral
(região central ou periférica).
Assim, o estudo permitiu quantificar toda a região necrótica e não
necrótica de tumores tratados e não tratados por hipertermia magnética
mediada por nanopartículas. Para isso foi utilizado fotos seriadas (varredura)
do tecido tumoral emblocados em parafina e corados em HE. Com isso foi
possível obter uma melhor análise quantitativa das regiões necróticas e não
necróticas por toda a área tumoral.
A acumulação de nanopartículas magnéticas no tecido tumoral e
aplicação de um campo magnético alternado para a geração de calor, faz com
que ocorra a elevação da temperatura somente no ambiente tumoral. Além
disso, ocorre a indução da expressão de proteínas de choque térmico (HSPs) e
de outros fatores responsáveis pela ativação do sistema imunológico
(KOBAYASHI, et al. 2014) o que pode resultar na regressão do tumor de não
apenas um tecido tumoral local exposto ao calor, mas também tumores
metastáticos distantes e não expostos ao calor (YANASE, et al. 1998; VAN
DER ZEE, 2002; KOBAYASHI, et al. 2014).
 32

Através da análise histopatológica dos tecidos rins, baço, fígados e

pulmões, foi identificado que todos estes órgãos mantiveram a histologia
normal, com parênquima tecidual inalterado, sem evidências de infiltração
celular, hiperemia e edema. Portanto, não houve evidências, através de análise
em microscópio óptico, de lesão celular nos tecidos analisados utilizados e
submetidos a hipertermia mediada por NPM.
Um dos problemas da técnica está nas vias de inoculação, pois a
determinação do grau de entrega das nanopartículas varia de acordo com a via
de inoculação. Em nosso estudo utilizamos a via intra-tumoral, contudo,
experimentos utilizando a via circulatória (intra-orbital) estão sendo realizados,
com taxas de entrega significativas e efeitos histopatológicos similares aos
encontrados nos experimentos de inoculação direta.
A hipertermia em células cancerosas tem muitas vantagens, como por
exemplo: a ativação do sistema imunológico que leva a indução de morte
celular; menores efeitos colaterais em relação aos tratamentos convencionais
do câncer, como quimioterapia, radioterapia e cirurgia. A determinação da taxa
de morte celular pode também auxiliar na avaliação da eficácia do tratamento,
auxiliando o médico no acompanhamento da regressão tumoral.
A incorporação de nanomateriais na medicina é um projeto físico-
químico que busca alcançar e melhorar o desempenho da técnica de
hipertermia mediada por nanopartículas magnéticas no tratamento de tumor
Ehrlich, onde o primeiro desafio é o estudo do design da nanopartícula, pois o
tamanho da partícula, morfologia de superfície e distribuição determinam sua
eficiência (ZHIYANG, 2016).
A aplicação da técnica é promissora nos sistemas de Saúde Pública
(SUS) e em Saúde Privada, pois apresenta um menor gasto financeiro. Após a
realização de mais testes poderá haver o desenvolvimento de um dispositivo
médico portátil capaz de aplicar de forma segura a hipertermia nos pacientes.
 33

7 CONCLUSÃO

Em relação a atividade das nanopartículas magnética BSA - IR 780 –

MnFe2O4, no tratamento de tumor de Ehrlich induzido em camundongos, a
utilização de hipertermia mediada por NPM mostrou-se eficaz na indução de
morte celular.
A técnica mostrou ser eficaz no tratamento de câncer, pois houve uma
taxa de morte celular de 75,5% no grupo tratado e 30,6% no grupo controle, ou
seja, os resultados demonstraram a eficácia da técnica de hipertermia mediada
por NPM em camundongos com tumor Ehrlich.
Através da análise dos tecidos (fígado, rins, baço e pulmões) dos
animais, analisado por meio de microscópio óptico, não foi visualizado, a partir
da análise em microscópio óptico, alterações no parênquima tecidual ou
indicativos de lesões celulares causadas pelo tratamento de hipertermia
mediada por NPM no organismo.
 34

8 CONSIDERAÇÕES FINAIS

A quantificação da taxa de necrose aplicada em combinação com

outras tecnologias de análise de imagem, como a Tomografia de Fluorescência
Molecular, poderá ser utilizada, futuramente, para determinação da regressão
tumoral durante o tratamento médico.
A tecnologia de varredura histopatológica dos tumores permitiu avaliar
de forma quantitativa a taxa de necrose nos tecidos tumorais. Esta técnica
pode contribuir para acompanhamento médico durante tratamento tumoral por
hipertermia mediada por nanopartículas magnéticas e consequentemente para
o aperfeiçoamento da técnica.
 35

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