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INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
A célula, o objeto de estudo da Biologia Celular, pode ser estudada sob diversos
aspectos: podemos procurar conhecer sua forma e a de seus constituintes, a natureza
química desses constituintes e seu modo de funcionamento. Em outras palavras, essas
investigações são denominadas morfológicas, químicas ou bioquímicas e fisiológicas e a
cada uma delas correspondem métodos de estudo particulares. Esta parte do curso de
Biologia Celular tratará justamente de introduzir o aluno nos diversos tipos de abordagem
normalmente utilizados no estudo da célula.
De uma maneira geral, podemos dizer que, devido às suas pequenas dimensões, um
estudo detalhado da célula e de seus constituintes com a vista desarmada é virtualmente
impossível. Para se ter uma idéia, as dimensões mais comumente observadas entre as
células de animais e vegetais superiores situam-se na faixa de 10 a 20 m (lembrar que 1
m = 10-3 mm; 1 nm = 10-6 mm e 1 Å = 10-7 mm). Por isso, o citologista é obrigado a se
utilizar de instrumentos de aumento para a observação conveniente da célula.
Os estudos morfológicos ou morfofisiológicos da célula começam normalmente com
o emprego do microscópio óptico, mais corretamente denominado de microscópio fotônico
(por se utilizar da luz como fonte de formação de imagens) ou microscópio composto (pode
ser constituído por dois sistemas de lentes sobrepostas: a objetiva e a ocular). Este
instrumento pode ser considerado como a ferramenta básica e indispensável de todo o
citologista.
A observação da célula ao microscópio fotônico é feita por luz transmitida,
possibilitando assim que detalhes estruturais internos possam ser evidenciados. Contudo,
esta observação por transmissão de luz exige que o objeto a ser estudado responda a certas
condições. Para que a luz possa atravessá-lo, o objeto deve ser suficientemente fino. No
caso da célula, para se ter uma imagem conveniente sem grande sobreposição de estruturas,
essa espessura deve ser da ordem de 5 m. Como raramente uma célula apresenta uma
espessura tão pequena, somos obrigados a fazer fatias ou cortes da célula para atingir a
espessura desejada.
Além da espessura, a observação da célula por transmissão ao microscópio fotônico
apresenta ainda outro problema: ela só é efetiva se certas regiões do objeto absorverem mais
luz do que outras, ou seja, se esse objeto apresentar contrastes. Como em geral os
constituintes celulares têm muito pouco contraste, o citologista é obrigado a lançar mão de
certos artifícios para contornar esse problema. A alternativa mais lógica é criar,
artificialmente, este contraste, no nível de certas estruturas celulares. Isto pode ser obtido
através do uso de corantes, que são substâncias que absorvem certos comprimentos de
onda da luz visível e têm afinidade por determinados constituintes celulares. Outra maneira
de se criarem contrastes artificialmente é através da utilização de certas montagens ópticas
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especiais que são capazes de ampliar as pequenas diferenças de contrastes existentes entre
as diversas regiões da célula. Como exemplo dessas montagens, temos o microscópio de
fase, o microscópio de interferência, o microscópio de polarização, etc.
A) Partes Mecânicas
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B) Sistema de iluminação
C) Sistema de ampliação
1. OBJETIVA
2. OCULAR
A luz proveniente da fonte luminosa, seja ela direta ou refletida, após atravessar o
condensador, é concentrada sobre a preparação. A luz incidente no condensador deve ser
paralela para que toda a luz emergente possa convergir no foco daquele sistema óptico.
Assim, no caso da existência de espelho, a face plana deve ser utilizada quando a luz for
artificial e emitir luz paralela e a face côncava quando a luz for natural (difusa) ou artificial
divergente.
A preparação (objeto) a ser observado deve ter, como vimos, uma espessura reduzida
para permitir a transmissão da luz. Cada um de seus pontos funciona como fonte intensa
para a formação de imagens pela objetiva.
A objetiva fornece uma imagem real, ampliada e invertida da preparação, conforme
se pode ver na construção geométrica da Figura 1. Nessa figura, Ho é a preparação, Hi a
imagem formada pela objetiva, F1 e F2 os focos, f a distância focal da objetiva e D a distância
entre a objetiva e a imagem. Note que a objetiva foi considerada, para efeitos didáticos, como
uma lente simples, apesar de ser, na realidade, um sistema de lentes. Como veremos
adiante, o mesmo foi feito com relação à ocular. Contudo, as relações obtidas são as
mesmas.
Analisando a construção geométrica da Figura 1, pode-se tirar a relação:
Hi = D - 1
Ho f
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De onde se conclui que a distância focal e o poder de ampliação de uma objetiva são
inversamente proporcionais, ou seja, quanto menor for a distância focal da objetiva, maior
será seu poder de ampliação (maior o Hi).
A imagem fornecida pela objetiva será novamente ampliada pela ocular, funcionando
essa imagem, portanto, como "preparação" ou "objeto" para a ocular. Assim, esta lente
fornecerá uma imagem virtual, ampliada e direta dessa imagem já formada pela objetiva,
como se pode ver na Figura 2. Nessa figura temos também que o Ho é a preparação (no
caso a imagem formada pela objetiva), Hi a imagem formada pela ocular, F1 e F2 os focos, f
a distância focal e D a distância entre a lente e a imagem.
Analisando-se a construção geométrica da Figura 2, temos:
Hi = D + 1
Ho f
- Poder de Resolução
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- Abertura Geométrica de uma Objetiva
É um parâmetro que caracteriza uma objetiva, sendo definido como o ângulo máximo
formado pelos raios luminosos extremos que partem de um ponto da preparação, situado
sobre o eixo óptico, atingindo os bordos da lente. Na Figura 4:
ag = 2
an = n . sen
No caso de uma objetiva seca, não existe óleo, e o índice de refração (n)
corresponderá ao do ar que é 1. Portanto:
an = sen
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Poder Penetrador
1. EXAME A FRESCO
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Para que a célula sobreviva o maior tempo possível, é necessário o uso de líquidos chamados
conservadores fisiológicos, que são soluções que proporcionam às células que estão sendo
observadas condições as mais aproximadas possíveis do seu ambiente natural. Isso
possibilita um exame mais prolongado.
Podemos classificar os líquidos conservadores em naturais e artificiais:
(a) Líquidos naturais: água doce (organismos aquáticos), água do mar (para organismos
marinhos), humor aquoso (do globo ocular de bovinos), soro sangüíneo (técnicas de
cultura de tecido), líquido amniótico, líquido ascítico (obtido de processos patológicos),
etc.
(Esses últimos, além dos sais acima, levam em sua composição magnésio, glicose, etc.).
A grande vantagem desse método é não produzir modificações nem na forma nem na
função do objeto examinado, servindo, portanto, de contraprova para outros métodos. Outra
vantagem é a sua rapidez.
O emprego do exame a fresco está restrito dentro de estreitos limites: só se aplica a
objetos finos e transparentes; não permite observações prolongadas e mostra apenas uma
pequena parte dos detalhes das estruturas. É, portanto, relativamente grosseiro e leva
eventualmente à morte celular.
O exame a fresco pode ser feito entre lâmina e lamínula, utilizando-se líquidos
fisiológicos. O condensador deve ser abaixado nos microscópios comuns ou a observação
deve ser feita em fase. Se for necessário, para evitar o esmagamento (por exemplo, para
visualizar o movimento de protozoários), deve-se suspender a lamínula entre quatro pilares
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de cera, ou utilizar o método da gota pendente, que tem a vantagem de criar uma micro-
câmara úmida para observações mais prolongadas. Consiste na utilização de uma lâmina
escavada com uma lamínula contendo uma pequena gota de material nessa região. A gota
deve ficar suspensa. A câmara assim construída pode ser vedada com parafina.
2. COLORAÇÃO VITAL
Corantes vitais
- Azul de Metileno - para observação, por exemplo, de protozoários entre lâmina e lamínula.
- Vermelho Neutro.
- Verde Janus - cora mitocôndria.
- Carmin Lítico.
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III. FIXAÇÃO
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- A Qualidade dos fixadores
1) Poder de Penetração: o fixador deve penetrar rapidamente tanto nas camadas superficiais
como nas profundas; de outro modo, as camadas internas poderão se necrosar antes de
serem atingidas por ele.
2) Deve alterar os constituintes da célula, de modo a torná-los insolúveis: esta ação não deve
ser violenta e instantânea; ao contrário, deve-se produzir secundariamente em relação à
morte das células, de modo a não produzir contrações.
3) A acidez é uma qualidade importante, sendo o ácido acético um dos mais empregados. O
meio alcalino dificulta a coagulação, nos fixadores que agem desta maneira.
Em resumo, o bom fixador deve: favorecer a observação das estruturas; impedir o
aparecimento de alterações; impedir o aparecimento de estruturas artificiais; não impedir
colorações posteriores; aumentar a afinidade do tecido pelos corantes; impedir o
desaparecimento dos elementos solúveis e possuir alto poder de penetração.
Agentes Fixadores
Físicos
O frio não é, em geral, um bom agente fixador, no máximo ele suspende as alterações
devidas à necrose e à digestão enzimática. Além disso, a formação de cristais e o aumento
de volume dos líquidos com o congelamento acarretará distorções no material.*
O calor exerce uma ação bem diferente, segundo seja aplicado a objetos úmidos ou
secos. Os fixadores em ebulição são utilizados para certos casos. O calor seco tem uso em
esfregaços previamente desidratados, podendo, entretanto, provocar distorções.
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Empregado juntamente com agentes crioprotetores (como o glicerol), que impedem a
formação de cristais, é muito utilizado em exames citológicos rápidos como, por
exemplo, em patologia.
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Químicos
São preferíveis para o estudo dos tecidos. Podemos classificá-los de modo a reuni-
los em dois grandes grupos de acordo com seu efeito sobre as proteínas (o que pode ser
testado com uma solução de albumina).
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IV - COLORAÇÃO
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Classificação dos Corantes
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- Mordente
Uma coloração pode ser direta ou indireta, dependendo do fato de haver ou não uma
substância intermediária entre o corpo a ser colorido e o corante.
Os sais de certos metais alteram radicalmente o comportamento de certos corantes.
Esses sais metálicos são chamados mordentes. Forma-se um complexo tecido-mordente-
corante e, uma vez formado, ele é insolúvel em todos os fluidos neutros usados
ordinariamente em histologia, de modo que facilita os procedimentos posteriores. O mordente
provoca uma combinação química entre dois corpos que não têm afinidade química entre si.
Forma-se então o precipitado fortemente colorido e insolúvel em água.
Exemplo: os alúmens que, em geral, são sulfatos duplos de alumínio e outro metal,
têm a propriedade de formar, com certos corantes, soluções intensamente coloridas e com
propriedades seletivas.
- Marcha de Coloração
Tipos de Coloração
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V. INCLUSÃO E MICROTOMIA
A maior parte das peças fixadas deverá ser tratada posteriormente, de modo a permitir
sua observação por meio da luz transmitida.
Para isso, é preciso reduzi-la a fatias delgadas, obtidas por cortes. Esses cortes, com
espessura de 3 a 4 m são impossíveis de obter em tecidos frescos ou mesmo fixados. Desse
modo, faz-se a inclusão da peça numa substância plástica que permita a obtenção de
secções finas do tecido. A substância deve penetrar totalmente até os componentes celulares
mais delicados, de modo a preservar a estrutura fina.
É possível então orientar e manusear as peças.
(a) Celoidina
Nesse caso, é feita a impregnação a frio dos objetos com nitrocelulose dissolvida
numa mistura de álcool e éter. O uso dessa massa de inclusão permite executar cortes de
grandes diâmetros, sem riscos de quebras, como ocorre com a parafina. É conveniente para
objetos pouco homogêneos ou que apresentam grandes cavidades, para materiais duros ou
fibrosos (artrópodos, por ex.), ou para tecidos que suportam mal as elevações de
temperatura. Não há necessidade de remover a celoidina dos cortes, o que facilita o manejo.
Entretanto, é um processo muito demorado (pode levar meses), sendo muito difícil obter
cortes finos e quase impossível obtê-los em série. A conservação dos blocos é difícil e é
necessário o uso de um micrótomo de deslizamento, especial, que molha automaticamente
o bloco e a navalha com álcool 70%, à medida que vai cortando.
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(b) Inclusão em parafina
A parafina é uma mistura de hidrocarbonetos saturados sólidos extraídos por
resfriamento dos resíduos pesados do petróleo. Tem pouca afinidade (parum affinis) química
(inerte). É muito solúvel no xilol, sendo, entretanto, insolúvel no álcool e na água.
As vantagens da parafina consistem em permitir a obtenção de cortes finos; o
processo de inclusão é rápido (24 horas); é possível obter cortes seriados pela facilidade de
produção de fitas; os blocos podem ser guardados indefinidamente.
Existem, também, algumas desvantagens, como, por exemplo, tecidos de difícil
penetração, tais como ossos, dentes, etc. Estes tecidos necessitam de longo tempo de
inclusão, o que é desaconselhado, pois este processo extrai lipídeos, uma vez que os
agentes de diafanização e desidratação são solventes de lipídios.
(c) Inclusão em resinas plásticas - particularmente as resinas acrílicas têm sido cada vez
mais empregadas em histologia no lugar da parafina, principalmente por permitirem cortes
mais finos (1-3 m) e, portanto, com melhor definição das estruturas celulares.
1) Desidratação pelo álcool - com duração variável, de acordo com o tamanho da peça.
2) Impregnação em solvente de parafina - consiste em trocar por um solvente de parafina o
álcool que impregna o objeto desidratado. Essa operação é chamada diafanização, uma
vez que os líquidos utilizados tornam o material transparente. Os líquidos devem ser
solúveis em álcool em todas as proporções. O xilol é bastante utilizado neste
procedimento.
3) Impregnação em parafina - não pode ser feita a frio, uma vez que a parafina é sólida à
temperatura ambiente. Durante a impregnação, a parafina deve ser mantida na estufa,
próxima ao seu ponto de fusão (aproximadamente 60oC).
4) A peça agora é retirada do banho de parafina e levada para uma forma vaselinada cheia
de parafina fundida. A peça deve ser orientada. A parafina se solidifica rapidamente, de
modo que a orientação do corte fica fácil. Esfria-se rapidamente a parafina, de modo a
não formar cristais de grande tamanho ou bolhas.
Quando o processo é bem feito, pode-se guardar o material indefinidamente.
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• Corte dos blocos - usa-se um micrótomo automático que regula a espessura dos cortes,
aderindo-se uns aos outros, de modo a se obter uma fita. As fitas são fáceis de manipular,
com o auxílio de um pincel e se pode obter cortes em série (cortes seriados).
• Montagem dos cortes - os cortes são esticados em água aquecida a 40oC e "pescador"
com uma lâmina albuminizada com o auxílio de um pincel o excesso de água é escorrido
e os cortes secos em estufa a 40oC. Posteriormente a parafina é retirada das preparações,
banhando-se as lâminas em xilol.
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