Meios alternativos na micropropagação de Cyrtopodium saintlegerianum

Introdução e Justificativa
Espécies de orquídeas do cerrado estão sendo ameaçadas de extinção. Por suas
características ornamentais e medicinais elas são coletadas predatoriamente para fins
recreativos ou comerciais (KEIKO UNEMOTO et al., 2007). De todos os indivíduos da
família Orchidaceae ameaçadas Segundo o Livro vermelho da flora do Brasil 2013,
22% delas são encontradas nesse bioma. As espécies desse táxon também enfrentam a
perda de seu habitat e de seus especializados polinizadores com a constante degradação
desse bioma que conta com somente 8% de sua área protegida
(HINSLEY et al., 2018; RIBEIRO; WALTER, 2008; SILVA et al., 2012
.
O Cerrado é um hotspot mundial de biodiversidade, apresentando uma grande
abundância de flora e fauna endêmicas. Ele tem uma área de cerca de 2.036.448 km 2 o
que o torna o segundo maior bioma da américa do sul (MMA, 2021). Apesar disso,
somente 8% de sua área se encontra protegida (IPAM, 2017). Esse bioma que abrange
cerca de 12 estados é a savana mais ameaçada do mundo, já tendo perdido cerca de 42%
de sua cobertura original. Assim, muitas espécies de orquídeas nativas deste bioma
perdem seu habitat. O cultivo in vitro de é de interesse ecológico, medicinal e
econômico
(RODRIGUES et al., 2015a, 2015b; SARASAN, 2010; SOUSA et al., 2017)
. Essa forma de propagação é muito útil para programas de reintrodução de
espécies em áreas degradadas, pois gera indivíduos geneticamente diferentes.
(SARASAN, 2010)
. Sua capacidade de produção massiva é de grande benefício para a
indústria farmacêutica e para o comercio já que em laboratório as sementes têm taxas
germinativas que chegam a 100% (FRANCO, 1942). Contudo, seus altos custos bem
como a dificuldade de aquisição do nitrato de potássio e o nitrato de amônio que são
necessários na composição dos meios de cultura tendo sua distribuição altamente
controlada pelo exército devido sua natureza explosiva, são contrapontos ao uso desse
método (“Instituto Agro,” [s.d.]; - BBC News Brasil,” [s.d.]) .Encontrar novos meios de
culturas que sejam eficientes a reprodução das orquídeas in vitro se mostra então como
uma alternativa.
Cyrtopodium saintlegerianum se destaca se enquadrando em todas as áreas de
interesse já citadas. Se mostrando como uma boa alternativa a programas de
reintrodução de espécies nativas (RODRIGUES et al., 2015a). Possuindo pseudobulbos
que armazenam uma seiva com utilizações medicinais e da indústria farmacêutica em
emplastros (SOUSA et al., 2019) . Também possuindo flores amarelas com regiões em
vermelho ou marrom que se encontram aglomeradas em inflorescências de até 1 metro e
que tem uma permanência de até 60 dias, que fazem com que ela atraia a atenção de
comerciantes e consumidores (RODRIGUES et al., 2015c; SOUSA et al., 2019) .
Entretanto ainda há uma lacuna de conhecimento a se preencher, poucos estudos falam
da eficiência dos meios de cultura usuais (Knudson, B&G, MS)
(FRANCO, 1942; RODRIGUES et al., 2015c; SOUSA
. Todavia poucas foram as pesquisas
testando a eficiência de outros meios a essa espécie (SOUSA et al., 2019).
Além disso, elas também possuem uma baixa taxa germinativa na natureza,
somente 5% das sementes produzidas (STOUTAMIRE, 1964, citado por
SCHNEIDERS et al., 2012), bem como um desenvolvimento vegetativo lento, o que
diminui ainda mais sua propagação.
Dentre as orquídeas nativas desse bioma encontra-se a Cyrtopodium
saintlegerianum que possui pseudobulbos com bainhas foliares fortemente apoiadas,
suas flores são amarelas maculadas em vermelho ou marrom que se encontram
aglomeradas em grandes inflorescências (RODRIGUES, 2015; SOUSA, 2019). Elas são
comumente encontradas em palmeiras e possuem uma ampla utilização, desde a
ornamentação até a indústria médica sendo utilizada como emplasto (SOUSA et
al., 2019).
O cultivo in-vitro das diferentes espécies de orquídeas vem se destacando na
indústria, se mostrando como uma alternativa para que esse processo de germinação
ocorra de maneira mais rápida e eficiente. Entretanto, o alto custo dos equipamentos e a
dificuldade de aquisição de alguns materiais como o nitrato de potássio e o nitrato de
amônio são contratempos que dificultam esse processo.
Testaremos novos meios de cultura, assim como meios usuais modificado numa
tentativa de reduzir ou excluir a presença dos nitratos puros. P
Objetivos
Encontrarara encontrar meios de cultura que possuam em sua composição materiais
mais baratos e de fácil aquisição (frutas, legumes e verduras) com relação aos nitratos e
que tenham paralelamente uma boa taxa de germinação. Por fim será feita uma análise
comparativa da eficiência de cada um deles na germinação das sementes de alternativos
eficientes Cyrtopodium saintlegerianume de menor custo e maior facilidade de
aquisição para . a propagação in vitro de Cyrtopodium saintlegerianum.
Metodologia Materiais e métodos
Os experimentos serão conduzidos no Laboratório de Biotecnologia, na casa
de vegetação e no telado do Setor de Horticultura da EA/UFG. As orquídeas adultas de
Cyrtopodium saintlegerianum serão mantidas no telado e a coleta da cápsula madura
será realizada após o início de sua abertura. Além da germinação in vitro os ensaios
serão realizados para o desenvolvimento de protocolos de micropropagação completo,
iniciando com o estabelecimento in vitro até a aclimatação das mudas. Para
desinfestação das sementes, estas serão colocadas em uma seringa de 20 ml autoclavada
juntamente com uma solução de hipoclorito 30% (3 ml de hipoclorito e 7 ml de água
autoclavada). As sementes na solução serão agitadas por 12 minutos. Posteriormente, a
solução com as sementes será colocada em um Becker de 100 ml e o volume será
completado com água autoclavada. A solução será distribuída nos frascos com meio de
cultura com auxílio de uma seringa.
Além do meio de cultura Knudson, muito utilizado no cultivo de orquídeas,
serão realizados diferentes ensaios para verificar o melhor meio, inclusive buscando
meios alternativos diante da dificuldade na aquisição dos nitratos. Após a inoculação
das sementes, os frascos serão mantidos em sala de crescimento com fotoperíodo de 16
horas e temperatura de 25 ± 1ºC. A análise da taxa de germinação (germinabilidade)
para as orquídeas será trinta dias após a inoculação das sementes obtendo-se a
porcentagem de sementes germinadas e não germinadas, a partir da retirada de três
amostras de cada um dos frascos dos diferentes meios de cultura. Cada amostra será
depositada sobre uma lâmina quadriculada e analisada em microscópio. Serão
consideradas germinadas as sementes com embrião intumescido e clorofilado,
característico do estádio de protocormo em orquídeas. Após 120 e 180 dias da
inoculação das sementes, dez amostras de cada tratamento será retirada e avaliada
quanto às diferentes fases do desenvolvimento inicial, sendo considerado quatro
estádios distintos de desenvolvimento: a) estádio 1 = protocormo intumescido
clorofilado; b) estádio 2 = plântula com formação da primeira folha; c) estádio 3 =
plântula com duas ou mais folhas; d) estádio 4 = plântula com folhas e uma ou mais raíz
(Suzuki et al., 2009). Dessa forma, no caso das orquídeas, os ensaios para multiplicação
terão início com plantas com 180 dias de cultivo após a inoculação das sementes, com
comprimento de 1 ± 0,2 cm de altura (medida da base do caule até a extremidade da
folha maior). Após a verificação do melhor método de germinação da semente serão
realizados ensaios para: determinação do melhor meio de cultura para indução de
brotações e raízes com determinação da melhor concentração de auxinas e citocininas;
estabelecimento de metodologia de aclimatação de plântulas produzidas in vitro e
produção de mudas. Independente da fase da micropropagação, meios de cultura
alternativos serão testados, como por exemplo, uso de banana e até mesmo a diminuição
ou substituição dos nitratos de amônio e de potássio. Os nitratos são utilizados em
grandes quantidades nos meios de cultura convencionais e apresentam dificuldades no
momento da compra devido ao rígido controle pelo exército. O pH do meio de cultura
será ajustado para 5,8 antes da esterilização em autoclave. As avaliações que serão
realizadas são: porcentagem de explantes com brotações axilares, aumento do
comprimento médio (comprimento final – comprimento inicial) e número médio de
brotações por explante (número final de brotações / número inicial de explantes)
(MULTIPLICAÇÃO); e porcentagem de alongamento (obtida pela fórmula: (f-i)/i 100,
onde f é o comprimento final da brotação e i é o comprimento inicial), número de raízes
e comprimento da maior raíz obtida (ENRAIZAMENTO) e a porcentagem de
sobrevivência (ACLIMATIZAÇÃO).
 Os dados em porcentagem serão primeiramente transformados em arcsen (x
+ 10)1/2. Os dados serão submetidos a análise de variância (teste F) e as médias dos
fatores qualitativos comparadas pelo teste de Tukey, a 5%. As médias dos fatores
quantitativos serão submetidas a análise de regressão para ajustes de equações que
explicam biologicamente os resultados.

Resultados Esperados

Espera-se desenvolver um protocolo de micropropagação de Cyrtopodium

saintlegerianum utilizando meios de cultura com menores quantidades ou até ausência
de nitratos em sua composição. Dessa forma, contribuir para a otimização na produção
de mudas da espécie e consequentemente preservar a espécie em seu habitat natural.
Enriquecimento e aumento da disponibilidade de informações sobre a propagação de
espécie nativas do Cerrado com potencial ornamental através da publicação de artigos
científicos em revistas de impacto da área e de documentos básicos que sirvam de
referência para ações futuras. Como consequência, reduzir o extrativismo predatório
dessas espécies. Além da melhoria da qualidade e da capacitação do discente de
graduação.

Referências
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1942.

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O que é nitrato de amônio, principal “suspeito” de ter causado megaexplosão em Beirute -

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RODRIGUES, L. A. et al. In vitro propagation of Cyrtopodium saintlegerianum rchb. f.
(orchidaceae), a native orchid of the Brazilian savannah. Crop Breeding and Applied
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Levantamento
bibliográfico
Coleta e germinação das
sementes de Cyrtopodium
saintlegerianum
Desenvolvimento de
protocolo de
estabelecimento
Desenvolvimento de
protocolo de
multiplicação in vitro
Desenvolvimento de
protocolo de
enraizamento in vitro
Aclimatização das plantas
produzidas in vitro para
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