UNIVERSIDADE SALGADO DE OLIVEIRA UNIVERSO Campus de Niteri

Controle de Qualidade Cromatografia Liquida de alta eficincia

Professora: Roberta Katlen Fusco Alunos: Ana Maria Motta Janine Simeo Dayane Marins Kariny Santos Evelyn Castro Ricardo Jos Fabiane Barros Silvnia Almeida Iasminy Barros Viviana Soares

Junho/2012

Cromatografia liquida de alta eficincia (CLAE)

Pode ser utilizada isoladamente ou em conjunto com outras tcnicas instrumentais de analise, vem tendo destaque devido a facilidade em efetuar a separao, identificao e quantificao de espcies qumicas. Trata-se de um mtodo fsico-qumico e fundamenta-se no deslocamento diferencial dos componentes de uma mistura, devido a diferentes interaes entre duas fases imiscveis (fase mvel e estacionria). Utiliza colunas fechadas que contm partculas muito finas que proporcionam separaes muito eficientes, so utilizadas altas presses para forar a passagem do solvente e assim diminuir o tempo da anlise.

Tipos de Cromatografia
A classificao dos mtodos cromatogrficos pode ser quanto ao mecanismo de separao, quanto a tcnica empregada e em relao ao tipo de fase utilizada. No entanto, a classificao mais popular a que leva em considerao o tipo de superfcie na qual ocorre a separao, sendo dividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar.

Diferenas entre a CLAE e a cromatografia lquida clssica (CLC)

A cromatografia lquida clssica utiliza-se de um equipamento barato no qual o empacotamento da coluna descartado, pois parte da amostra pode se adsorver de forma irreversvel; a coluna deve ser cheia a cada separao acarretando desperdcio de material e de mo-de-obra; o analista deve ser experiente; a eluio feita pela ao da gravidade tornando o processo demorado; a quantificao e deteco so feitas pela anlise manual das fraes individuais, o que requer muito tempo devido ao grande nmero de fraes coletadas, tambm pode ser usada alguma tcnica que auxilie neste processo, como, espectrofotometria, anlise qumica ou registro gravimtrico e os resultados so registrados em forma de cromatograma, um grfico da concentrao da amostra versus o nmero da frao.

Na cromatografia lquida de alta eficincia a coluna fechada, podendo ser utilizada inmeras vezes; as colunas utilizadas so bastante eficientes, mas oferecem resistncia vazo da fase mvel necessitando aplicao de sistemas de bombas de alta presso, isso faz com que a velocidade da eluio aumente. As anlises so mais precisas, pois a vazo da fase mvel facilmente controlada. A injeo feita com microsseringas ou atravs de vlvulas de injeo e diversos tipos de detectores podem ser utilizados. Este mtodo no necessita tanta experincia do operador; tem alta resoluo, sensibilidade e reprodutibilidade, mas dispe de equipamentos caros e de alto custo de manuteno e operao.

Comparao da CLAE com a cromatografia gasosa (CG)

Na cromatografia gasosa as amostras devem ser volteis, para que possam passar pela coluna na forma de vapor, e termicamente estveis. A amostra no deve interagir com a fase mvel, por este motivo que a fase mvel um gs inerte tendo como funo somente carregar a amostra volatilizada. Neste mtodo os equipamentos so mais baratos e o tempo de anlise reduzido. Na CLAE as amostras no precisam ser volteis nem termicamente estveis, basta que sejam solveis na fase mvel, por isso tem uma maior aplicao. Este mtodo possui maior versatilidade, pois pode ocorrer a variao tanto na fase mvel como na fase estacionria, o que ocorre no na CG, pois a fase mvel sempre um gs inerte.

Vantagens e desvantagens

O Processo Cromatogrfico
Na cromatografia lquida a fase estacionria constituda de partculas slidas empacotadas em uma coluna, a qual atravessada pela fase mvel. So as foras fsicas e qumicas que atuam entre os solutos e as duas fases so responsveis pela reteno dos solutos sobre a coluna cromatogrfica. A diferena na magnitude dessas foras que determina a resoluo e portanto a separao dos solutos individuais. As foras elementares que agem sobre as molculas so de cinco tipos: 1) Foras de disperso de London ou Foras de Van der Waals; 2) Interaes de dipolo induzido; 3) Ligaes de hidrognio; 4) Interaes dieltricas;

Fases Fases Mveis (FM)

Para que um solvente possa ser utilizado como fase mvel na HPLC este deve apresentar alto grau de pureza ou ser de fcil purificao; deve dissolver a fase mvel sem decompor seus componentes, para que estes sejam transportados pela coluna sem que haja modificao; no deve dissolver a fase estacionria; deve ser compatvel com o detector; no ser txico e deve ter baixa viscosidade, pois isso ir interferir diretamente na eficincia da separao, devido ao fato de solventes viscosos alm de dificultarem a transferncia de massa entre a fase mvel e a fase estacionria, tambm influenciarem na intensidade da vazo.

Uma fase mvel adequada indispensvel para a HPLC, por isso necessrio examinar fatores que determinam sua escolha, como a polaridade desta, que determina seu poder de eluio juntamente com a polaridade da fase estacionria e com a natureza dos componentes da amostra. Se a separao for com fase normal, o poder de eluio aumenta com o aumento da polaridade, se a separao for em fase reversa, o poder de eluio diminui com o aumento da polaridade. Outros fatores que tambm devem ser considerados so o ponto de ebulio, a viscosidade, a compatibilidade com o detector e a toxidez.

Fases - Fases Estacionrias (FE)

Devem ter alta resoluo entre os componentes da amostra, devem ser de fcil introduo na coluna, ter dimetro uniforme, partculas porosas ou peliculares e serem slidos rgidos, semirgidos ou no rgidos. As partculas da fase estacionrias podem ser classificadas quanto ao seu tamanho em: macropartculas, quando apresentam dimetro entre 20 e 40m; intermedirias, quando tem entre 20 e 10m; micropartculas, de 3 a 10m. Quanto menor for a partcula, maior ser a eficincia da separao, melhorando assim o processo de difuso das molculas da amostra dentro e fora das partculas. Elas podem ser de formato esfrico, tambm chamado de regular, e de formato irregular, sendo que as regulares so mais eficientes por oferecerem um enchimento mais uniforme e mais reprodutvel da coluna e por esse motivo so mais caras.

De acordo com a natureza das fases mvel e estacionria pode-se classificar o processo como: cromatografia em fase normal e cromatografia em fase reversa. Cromatografia em fase normal: a fase estacionria utilizada polar e a fase mvel apolar, em relao eluio, os solutos mais apolares so eludos primeiramente, enquanto que os polares so retidos pela fase estacionria e so eludos depois. Cromatografia com fase reversa (FR): a fase estacionria apolar e a fase mvel polar, portanto os compostos polares so eludos primeiro e os mais apolares eludos posteriormente.

Principais tcnicas de CLAE Cromatografia de partio

Nesta

fase a fase estacionria lquida. Este processo baseado na diferente solubilidade dos componentes da mistura nas duas fases lquidas O mtodo consiste de uma fase lquida (estacionria) que por adsoro fsica retida na superfcie da coluna empacotada geralmente com slica e de uma fase mvel, tambm lquida, que passa sobre esta fase estacionria sendo uma destas polares e a outra apolar. Esse mecanismo de separao baseia-se nas diferentes solubilidades que apresentam os componentes da amostra da fase mvel e estacionria. Os componentes da amostra que so mais solveis na fase mvel so eluidos primeiro enquanto os que tm maior afinidade com a fase estacionria so seletivamente retidos por ela.

Desvantagens: O inconveniente desta tcnica a solubilidade da fase estacionaria e mvel que pode acarretar a deteriorao da coluna, levando a no reprodutibilidade nas separaes repetidas. Pode ser resolvido de duas maneiras: 1 Saturando a fase mvel com a fase estacionaria por meio de uma pr-coluna, colocada antes do injetor que tenha uma alta percentagem de fase estacionaria. 2 Utilizado materiais que contenham a fase estacionaria quimicamente ligada a um suporte solido.

Cromatografia de absoro

A forma mais clssica da cromatografia lquida e devido a recentes adaptaes tornou-se o mais importante membro dos mtodos de HPLC. O mecanismo de separao se baseia na competio que existe entre molculas da amostra e as da fase mvel em ocupar os stios ativos na superfcie de um slido (fase estacionria). O equilbrio estabelecido :

 Para que a molcula do soluto possa ser adsorvida na fase

estacionria, primeiro uma molcula da fase mvel deve ser deslocada da superfcie. Se assumir que o adsorvente possui uma superfcie polar (por exemplo: slica ou alumina), grupos apolares (por ex.; hidrocarbonetos) tero pouca afinidade por essa superfcie e no iro deslocar a molcula da fase mvel; por isso, no sero retidos. Grupos funcionais polares capazes de formar pontes de hidrognio tero fortes afinidades pela superfcie e sero fortemente retidos.

Cuidados a serem tomados

Antes de ser iniciar o processo cromatogrfico, a cmara, contendo a mistura de solvente, j deve estar saturada de seus vapores, O solvente no deve correr at o bordo superior do papel (cuidado com o nmero de horas de processamento) e nem tampouco uma pequena distncia. De preferncia at uns 2 a 3 cm do bordo superior.

Equipamentos
As principais caractersticas que devem ser levadas em considerao na escolha de um equipamento para CLAE so: a) Versatilidade: o equipamento deve resolver amostras de diferentes tipos, servir a distintas tcnicas cromatogrficas e realizar o mximo de operaes, tais como, gradiente de fase mvel, coleta das fraes, reciclagem de fraes, etc., necessrias s anlises sofisticadas. b) Rapidez: Para se conseguir anlises rpidas, deve-se obter as melhores condies de CLAE, isto , fase mvel de baixa viscosidade, bomba de alta presso e colunas com partculas de pequeno dimetro (grande rea de superfcie, que ajuda os processos de separao).

 c) Reprodutibilidade e Estabilidade: caractersticas essenciais

para obter do equipamento um bom funcionamento em longo prazo. O equipamento deve ter controle adequado sobre os parmetros de operao, como vazo, temperatura, presso e composio da fase mvel. d) Sensibilidade: Um bom equipamento, mesmo trabalhando com pequenas quantidades de amostra, deve gerar sinais de intensidade aprecivel.

Aplicaes

A identificao dos componentes de uma amostra feita atravs da comparao dos cromatogramas obtidos com padres, nestes padres o componente em questo eludo nas mesmas condies da amostra a ser analisada, tendo a formao de um pico em um determinado tempo chamado de tempo de reteno, sendo assim os componentes so identificados pelo tempo de reteno. Os cromatogramas so grficos do tempo em minutos pela resposta do detector.

Cromatograma tpico da separao dos tocoferis em amora-preta (Rubus sp) cv. Tupy, por HPLC, com coluna de fase reversa e detector de fluorescncia a 290nm de excitao e de 330nm de emisso.

Os padres so obtidos comercialmente e so analisados em diferentes concentraes, formando assim uma curva de calibrao, esta trata-se de um grfico da concentrao do componente pela rea do pico obtido. Atravs desta pode-se quantificar os componentes da amostra quando se obtm a rea dos picos. A cromatografia lquida de alta eficincia tem uma ampla aplicao na anlise de alimentos na quantificao de compostos. Alguns exemplos mais comuns so: Vitaminas hidrossolveis e lipossolveis, antocianinas, carotenides, compostos fenlicos, lipdios, acares, hidrolisados proticos.

Referncias Bibliogrficas
RUTZ,

Josiane Kuhn. Avanos na cromatografia lquida. 2009. 41f. Trabalho acadmico (Seminrio em Alimentos) - Bacharelado em Qumica de Alimentos. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. BARBOSA, Ndia Rezende. et al. Cromatografia lquida de alta eficincia aplicada ao controle da qualidade de cis-permetrina em loo capilar. 2008. v.34, n.1, p.19-25. HU Revista, Juiz de Fora. COLLINS, Carol H. et al. Fundamentos de cromatografia, Ed. Unicamp, 2007. A importncia da cromatografia. Revista Controle de Contaminao - Editora Nova Tcnica Editorial (www.engenhariaearquitetura.com.br) Cromatografia liquida de alta eficincia HPLC (http://pfarma.com.br/farmaceutico-industrial/130-cromatografialiquida-de-alta-eficiencia)

FIM