MATERIAL

COMPLEMENTAR
CONTROLE DE
QUALIDADE

RESUMOS
 SUMÁRIO

1. GARANTIA DE QUALIDADE.......................................................................................... 4

2. CONTROLE DE QUALIDADE DE ÁGUA.......................................................................... 6

2.1 Tipos de Água.................................................................................................................................7

3. MÉTODOS GERAIS EM CONTROLE DE QUALIDADE...................................................... 9

3.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)...........................................................................10
3.2 Espectrometria de Massa (MS).....................................................................................................10
3.3 Espectrofotômetro Ultravioleta.....................................................................................................10
3.4 Testes Microbiológicos.................................................................................................................11
3.5 RAMAN.........................................................................................................................................11
3.6 FT-NIR..........................................................................................................................................11
3.7 Peso Médio...................................................................................................................................11
3.8 Dureza..........................................................................................................................................11
3.9 Friabilidade...................................................................................................................................12
3.10 Desintegração.............................................................................................................................12
3.11 Dissolução..................................................................................................................................12

4. TESTE DE EQUIVALÊNCIA FARMACÊUTICA............................................................... 13

5. BIOEQUIVALÊNCIA.................................................................................................... 14

6. VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS.................................................................... 15

6.1 Critérios de Validação...................................................................................................................15
6.1.1 Exatidão..........................................................................................................................................................................................................................15
6.1.2 Precisão..........................................................................................................................................................................................................................15
6.1.3 Sensibilidade ...............................................................................................................................................................................................................16
6.1.4 Linearidade....................................................................................................................................................................................................................17
6.1.5 Intervalo de Trabalho.................................................................................................................................................................................................17
6.1.6 Limite de Detecção (LD)...........................................................................................................................................................................................17
6.1.7 Limite de Quantificação (LQ)..................................................................................................................................................................................17
6.1.8 Robustez........................................................................................................................................................................................................................17
 SUMÁRIO

6.2 Especificidade/Seletividade..........................................................................................................17
6.3 Função da Resposta (Gráfico Analítico).........................................................................................18

7. MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS PARA PRODUTOS ESTÉREIS ..................................... 20

8. MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS PARA PRODUTOS NÃO ESTÉREIS.............................. 22

8.1 Limites Microbianos.....................................................................................................................22

9. CLASSIFICAÇÃO DE SALA LIMPA E CONTROLE AMBIENTAL...................................... 24

9.1 Controle de Partículas...................................................................................................................24
9.1.1 Princípios do Fluxo de Ar da Sala Limpa............................................................................................................................................................25
9.1.2 Classificações de Sala Limpa................................................................................................................................................................................25
9.2 Controle Ambiental.......................................................................................................................27

10. TESTE DE PIROGÊNIOS IN VITRO......................................................................... 28

10.1 Teste De Pirogênios In Vivo.........................................................................................................31

REFERÊNCIAS............................................................................................................... 32
 Controle de Qualidade 4

1. GARANTIA DE QUALIDADE
Garantia da qualidade é um dos setores considerados mais relevantes da indústria
farmacêutica. Está relacionada a todas as etapas da cadeia produtiva: desde a seleção
do fornecedor dos insumos farmacêuticos e materiais de embalagem, passando por to-
das as etapas do processo de fabricação até a liberação final do produto para o merca-
do. A garantia da qualidade também está presente até mesmo durante o transporte de
medicamentos por meio da qualificação das transportadoras, da qualificação do cliente
até chegar ao consumidor final, inclusive no atendimento às necessidades e reclama-
ções desse consumidor.

Figura 1. Logística da Garantia da Qualidade13

A Garantia da Qualidade está relacionada a todos os fatores que podem influenciar

na qualidade de um produto, tanto individualmente como coletivamente, visando garantir
que os medicamentos estejam dentro dos padrões de qualidade exigidos para que pos-
sam ser utilizados no consumo da população. Controle de Qualidade é o conjunto de me-
didas destinadas a garantir, a qualquer momento, a produção de lotes de medicamentos e
demais produtos, que satisfaçam às normas de identidade, atividade, teor, pureza, eficácia
e inocuidade2.
Esses conceitos podem gerar muitas dúvidas. Para ficar mais claro: o setor de Ga-
rantia de Qualidade está relacionado ao processo, ou seja, será responsável por verificar
e garantir que as políticas e procedimentos, de todas as áreas envolvidas, estão sendo
cumpridos. Quanto ao Controle de Qualidade, este se relaciona ao produto e é responsável
por analisar as matérias-primas e produtos acabados para verificar se estão atendendo as
suas devidas especificações.
Controle de Qualidade 5

Figura 2. Etapas do Controle de Qualidade

Aquisição

Expedição Armazenamento

Controle
de
Qualidade

Armazenamento Produção

Embalagem

Fonte: Autoria Própria, 2020.

 Controle de Qualidade 6

2. CONTROLE DE QUALIDADE
DE ÁGUA
A água pode veicular um elevado número de enfermidades e essa transmissão pode
se dar por diferentes mecanismos. O mecanismo de transmissão de doenças mais co-
mumente lembrado e diretamente relacionado à qualidade da água é o da ingestão, por
meio do qual um indivíduo sadio ingere água que contenha componente nocivo à saúde e
a presença desse componente no organismo humano provoca o aparecimento de doença.
É importante destacar que tanto a qualidade da água quanto a sua quantidade e re-
gularidade de fornecimento são fatores determinantes para o acometimento de doenças
no homem. Conforme mostram os mecanismos de transmissão descritos, a insuficiente
quantidade de água pode resultar em (i) deficiências na higiene; (ii) acondicionamento da
água em vasilhames, para fins de reserva, podendo esses recipientes tornarem-se am-
bientes para procriação de vetores vulneráveis à deterioração da qualidade; e (iii) procura
por fontes alternativas de abastecimento, que constituem potenciais riscos à saúde, seja
pelo contato das pessoas com tais fontes (risco para esquistossomose, por exemplo), seja
pelo uso de águas de baixa qualidade microbiológica (risco de adoecer pela ingestão).
Segundo a farmacopeia brasileira são considerados como água para uso farmacêu-
tico os diversos tipos de água empregados na síntese de fármacos; na formulação e pro-
dução de medicamentos; em laboratórios de ensaios; diagnósticos e demais aplicações,
relacionadas à área da saúde, inclusive como principal componente na limpeza de utensí-
lios, equipamentos e sistemas. A estrutura química da água é peculiar, com um momento
dipolo e grande facilidade em formar ligações de hidrogênio. Essas propriedades tornam a
água um excelente meio para solubilizar, absorver, adsorver ou suspender diversos com-
postos, inclusive para carrear contaminantes e substâncias indesejáveis, que vão alterar a
pureza e eficácia de um produto farmacêutico. Em face de suas características, os proces-
sos de purificação; armazenamento e distribuição devem garantir que as especificações
farmacopeicas sejam atendidas, mantidas e controladas adequadamente. Os requisitos
de qualidade da água dependerão de sua finalidade e emprego, e a escolha do sistema de
purificação destina atender ao grau de pureza estabelecido. O usuário é responsável pela
seleção do tipo de água adequado aos seus objetivos, bem como pelos controles e veri-
ficações necessários, em intervalos que garantam a manutenção da qualidade desejada.
Ele deve assegurar que o sistema apresenta desempenho adequado e capacidade para
fornecer água com o nível de qualidade estabelecido, para atender aos parâmetros espe-
cificados nas monografias individuais.
O controle da contaminação da água é crucial, uma vez que a água tem grande ca-
pacidade de agregar compostos diversos e, também, de se contaminar novamente após a
 Controle de Qualidade 7

purificação. Os contaminantes da água são representados por três grandes grupos: quí-
mico, biológico e físico.

Figura 3. Contaminantes da Água

Contaminantes

Químico Biológico Físico

Orgânicos Orgânicos Sólidos em

Inorgânicos
Sintéticos Patogênicos Suspensão

Orgânicos
Bactérias, Vírus e
Biodegradáveis: Metais
Protozoários
Petróleo

Orgânicos
Recalcitrantes ou
Refratários

Fonte: Autoria Própria, 2020.

2.1 Tipos de Água

Basicamente, há três tipos de água para uso farmacêutico: a água purificada (AP); a
água para injetáveis; (API) e a água ultrapurificada (AUP). Encontram-se em monografias,
compêndios oficiais de outros países ou internacionais, que especificam, além desses,
outros tipos de água, como: acondicionadas em frascos, estéreis ou bacteriostáticas,
para irrigação ou inalação. Porém, todas possuem características de pureza semelhante
aos tipos fundamentais já mencionados. Além dessas há a água potável, que é ampla-
mente utilizada e tem aplicação direta em instalações farmacêuticas, principalmente em
procedimentos gerais de limpeza. Assim, são considerados os quatro tipos de água a
seguir, em relação às suas características principais e às sugestões de aplicação. As
monografias específicas, quando disponíveis, detalham os parâmetros de pureza esta-
belecidos para cada tipo.
 Controle de Qualidade
Figura 4. Tipos de Água e suas Aplicações14,15
Tipo de Água Parâmetros Críticos Sugeridos
Possui legislação específica (Portaria nº
Água Potável
5/2017).
Condutividade máxima de 1,3 µS/cm a 25,0
°C (resistividade > 1,0 MΩ-cm); COT ≤ 0,50
Água purificada mg/L; Contagem do número total de bactérias
heterotróficas: no máximo, 100 UFC/mL;
Ausência de Pseudomonas sp e coliformes.
Atende aos requisitos químicos da água
purificada e exige controle de endotoxinas.
Contagem do número total de bactérias
Água para injetáveis heterotróficas: no máximo, 10 UFC/100 mL.
Endotoxinas < 0,25 UE/mL.
Ausência de Pseudomonas sp e coliformes.
Condutividade máxima de 0,055 µS/cm a 25,0 °C
(resistividade > 18,0 MΩ-cm); COT ≤ 0,50
mg/L; Contagem do número total de bactérias
Água Ultrapurificada heterotróficas: no máximo, 10 UFC/100 mL.
Endotoxinas < 0,25 UE/mL (quando alta qualidade
biológica é requerida)
Ausência de Pseudomonas sp e coliformes.
8
Exemplos de Aplicação
Limpeza em geral e fonte de alimenta-
ção de sistemas de tratamento.
Produção de medicamentos e cos-
méticos em geral, farmácias, lavagem
de material, preparo de soluções re-
agentes, meios de cultura, tampões,
diluições, microbiologia em geral,
análises clínicas, técnicas por Elisa,
radioimunoensaio, aplicações diver-
sas na maioria dos laboratórios, prin-
cipalmente em análises qualitativas ou
quantitativas menos exigentes (em %).
Em CLAE (em %).
Como veículo ou solvente de injetá-
veis, fabricação de princípios ativos
de uso parenteral, lavagem final de
equipamentos, tubulação e recipientes
usados em preparações parenterais.
Usada como diluente de preparações
parenterais.
Dosagem de resíduos minerais ou or-
gânicos, endotoxinas, preparações de
calibradores, controles, SQR, espec-
trometria de absorção atômica, ICP/
IOS, ICP/MS, espectrometria de mas-
sa, procedimentos enzimáticos, cro-
matografia a gás, CLAE (ppm ou ppb),
biologia molecular e cultivo celular etc.
Eventualmente em preparações farma-
cêuticas que requeiram água de alta
pureza.
 Controle de Qualidade 9

3. MÉTODOS GERAIS EM
CONTROLE DE QUALIDADE
Os Controles da Qualidade Físico-químico e Microbiológico são vitais para a indús-
tria farmacêutica e devem ter laboratórios próprios e independentes da produção. Estas
áreas têm o objetivo de analisar os produtos fabricados conforme os métodos e especi-
ficações padronizadas e registradas junto ao órgão regulador. Visam também evitar ou
reduzir erros durante o processo produtivo, seja por meio de intervenções, monitoramento
da área de produção e avaliação de matérias-primas, materiais de embalagem, rótulos,
bulas, produtos intermediários e acabados.
Para verificar se de fato os medicamentos estão atendendo aos padrões de qualida-
de exigidos, são realizados testes e medições que permitem aprovar ou reprovar fármacos
e excipientes antes mesmo que estes sejam disponibilizados para a fabricação. As ativi-
dades desenvolvidas pelo Controle da Qualidade das indústrias farmacêuticas refletem
em todos os setores da empresa. Além de diversas análises laboratoriais, monitoram-se a
água utilizada no processo, a qualidade do ar das áreas fabris, a limpeza dos equipamen-
tos, os produtos de degradação e o gerenciamento de solventes residuais.

Figura 5. Controle de qualidade físico-químico de medicamentos16

Controle de qualidade
Físico-químico de
medicamentos
 Controle de Qualidade 10

Figura 6. Áreas do Controle de Qualidade

Laboratório
Físico-Químico

Laboratório
Laboratório
de Material de
Microbiológico
Embalagens

Laboratório
de Controle de
Processo

Fonte: Autoria Própria, 2020.

Para controlar a qualidade do medicamento, é imprescindível a utilização de equipa-

mentos para medir os aspectos químicos ou físicos dos materiais e dos produtos, como
teor ou concentração dos ativos.
De acordo com Calixto12, é uma indústria muito avançada no ponto de vista de con-
trole de qualidade. “Existe teste para identificação do princípio ativo e do teor e outro, por
exemplo, que mede a dissolução do comprimido, que incide no que ocorreria no organismo
e qual o tempo máximo de solução dele”, exemplifica.

3.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

É um método de cromatografia a líquido de alta eficiência, que faz a separação de
compostos químicos em solução. É utilizado em análises qualitativas, para a identificação
de substância, e quantitativas, para a determinação do teor ou concentração de um ele-
mento. Nos equipamentos de CLAE é possível a realização desses testes.

3.2 Espectrometria de Massa (MS)

Equipamento que faz a análise física das substâncias para detectar e identificar mo-
léculas por meio da medição da sua massa e caracterização de sua estrutura química.

3.3 Espectrofotômetro Ultravioleta

Equipamento utilizado para medir e comparar a quantidade de luz absorvida por de-
terminada solução. Assim, é utilizado para identificar e delimitar a concentração de subs-
tâncias.
 Controle de Qualidade 11

3.4 Testes Microbiológicos

São testes físico-químicos, utilizados para dosar a quantidade de microrganismos
de contaminação microbiológica que eventualmente possa haver em algum produto.

3.5 RAMAN
Espectrômetro para a identificação de substâncias, verificação de amostras para
garantia de qualidade, para análise química de amostras e também para o estudo de vi-
brações moleculares. Tem como vantagem utilizar amostras pequenas, fazer uma rápida
identificação e uma análise não destrutiva de produtos acabados nas formas sólida, líqui-
da e gasosa.

3.6 FT-NIR
Método conhecido como Espectroscopia de Infravermelho com Transformações de
Fourier, é indicado para análises físico-química dos medicamentos. Tem como diferencial
a execução rápida por conta das medições remotas de processos por meio de fibra óptica.

3.7 Peso Médio

A determinação do peso é importante já que as fórmulas estão baseadas no peso das
formas farmacêuticas, e influenciam na concentração do princípio ativo. O teste se aplica
a formas farmacêuticas sólidas em dose unitária (comprimidos não revestidos, comprimi-
dos revestidos, pastilhas, cápsulas duras e moles e supositórios), formas farmacêuticas
sólidas acondicionadas em recipientes para dose unitária (pós estéreis, pós liofilizados,
pós para injetáveis e pós para reconstituição de uso oral) e a formas farmacêuticas sóli-
das e semissólidas acondicionadas em recipientes para doses múltiplas (granulados, pós,
géis, cremes, pomadas e pós para reconstituição).

3.8 Dureza
O teste de dureza permite determinar a resistência do comprimido ao esmagamento
ou à ruptura sob pressão radial. A dureza de um medicamento é importante, já que garante
a integridade do comprimido, permitindo que ele suporte choques causados durante os
processos pós-fabricação. A dureza de um comprimido é proporcional à força de com-
pressão e inversamente proporcional à sua porosidade. O teste se aplica, principalmente,
a comprimidos não revestidos, e consiste em submeter o comprimido à ação de um apare-
lho que mede a força, aplicada diametralmente, necessária para esmagá-lo ou quebrá-lo.
 Controle de Qualidade 12

3.9 Friabilidade
O teste de friabilidade permite determinar a resistência dos comprimidos à abrasão,
quando submetidos à ação mecânica de aparelhagem específica. O teste se aplica, unica-
mente, a comprimidos não revestidos. O teste consiste na pesagem, com exatidão, de um
número determinado de comprimidos, submetê-los à ação do aparelho e retirá-los depois
de efetuadas 100 rotações (25rpm por 4 minutos). Após a remoção de qualquer resíduo de
pó dos comprimidos, eles são novamente pesados. A diferença entre o peso inicial e o final
representa a friabilidade, medida em função da porcentagem de pó perdido.

3.10 Desintegração
A desintegração é definida, para os fins desse teste, como o estado no qual nenhum
resíduo das unidades testadas (cápsulas ou comprimidos) permanece na tela metálica do
aparelho de desintegração, salvo fragmentos insolúveis de revestimento de comprimidos
ou invólucros de cápsulas. Consideram-se, também, como desintegradas as unidades que
durante o teste se transformam em massa pastosa, desde que não apresentem núcleo
palpável. A importância do teste está no fato de que a desintegração afeta diretamente
na absorção, biodisponibilidade e ação do fármaco. É necessário, portanto, para que o
princípio ativo fique disponível e exerça sua função terapêutica, que a forma farmacêutica
se desintegre em partículas menores, aumentando a superfície de contato com o meio.
O teste de desintegração se aplica a comprimidos não revestidos, revestidos com filme,
drágeas, comprimidos com revestimento entérico, comprimidos sublinguais, comprimi-
dos solúveis, comprimidos dispersíveis, cápsulas duras e cápsulas moles, supositórios e
óvulos. O teste não se aplica a pastilhas e comprimidos ou cápsulas de liberação contro-
lada (prolongada).

3.11 Dissolução
O teste de dissolução possibilita determinar a quantidade de substância ativa dis-
solvida no meio de dissolução quando o produto é submetido à ação de aparelhagem es-
pecífica, sob condições experimentais descritas. O resultado é expresso em porcentagem
da quantidade declarada no rótulo. O teste se destina a demonstrar se o produto atende
às exigências constantes da monografia do medicamento em comprimidos, cápsulas e
outros casos em que o teste seja requerido.
 Controle de Qualidade 13

4. TESTE DE EQUIVALÊNCIA
FARMACÊUTICA
A equivalência farmacêutica entre dois medicamentos relaciona-se à comprovação
de que ambos contêm o mesmo fármaco (mesma base, sal ou éster da mesma molécula
terapeuticamente ativa), na mesma dosagem e forma farmacêutica, o que pode ser ava-
liado por meio de testes in vitro. Portanto, pode ser considerada como um indicativo da
bioequivalência entre os medicamentos em estudo, sem, contudo, garanti-la. A legislação
brasileira, tendo como base a regulamentação técnica e a experiência de diversos países
na área de medicamentos genéricos, estabelece que, para um medicamento ser registrado
como genérico, é necessário que se comprove sua equivalência farmacêutica e bioequi-
valência (mesma biodisponibilidade) em relação ao medicamento de referência indicado
pela Anvisa. A equivalência farmacêutica é um conjunto de avaliações in vitro realizadas
para comprovar que o medicamento genérico é equivalente ao medicamento de referência,
se ambos contêm o mesmo fármaco, na mesma dosagem e forma farmacêutica.

Figura 7. Ensaio de Equivalência Farmacêutica17

Figura 8. Controle de Qualidade

Peso Médio

Uniformidade de
Friabilidade
Conteúdo

Equivalência
Farmacêutica

Perfil de Desintegração
Dissolução

Dissolução

Fonte: Autoria Própria, 2020.

 Controle de Qualidade 14

5. BIOEQUIVALÊNCIA
Os estudos de bioequivalência/biodisponibilidade relativa são realizados em seres
humanos e devem assegurar a identidade dos produtos (teste e referência) em relação à
velocidade da absorção e quantidade do fármaco absorvido. O estudo da bioequivalência
se desenvolve em três etapas: Clínica, Analítica e Estatística. A etapa clínica compreende
o recrutamento e a seleção de voluntários, a administração dos medicamentos e a coleta
de amostras para análises referentes ao estudo e monitoramento clínico dos voluntários
durante as etapas pré e pós-estudo. A etapa analítica compreende a análise das amostras
coletadas na etapa clínica com a quantificação do fármaco inalterado e/ou seu metabó-
lito ativo estudado, utilizando para isso métodos bioanalíticos validados, desenvolvidos
no laboratório ou obtidos de compêndios e literatura adequada, conforme a legislação
e normatização vigente. A etapa estatística compreende a análise dos dados obtidos na
etapa analítica com o cálculo dos parâmetros farmacocinéticos através de intervalos de
confiança e testes de hipóteses, utilizando-se para isso ferramentas como planilhas e
softwares devidamente validados. Todas as atividades realizadas nas três etapas devem
apresentar ferramentas de comprovação da rastreabilidade, de forma a permitir a recupe-
ração segura e confiável dos dados do estudo.
Biodisponibilidade significa a quantidade de fármaco e a velocidade com a qual esse
atinge a corrente circulatória. Dois medicamentos são considerados bioequivalentes quan-
do possuem a mesma biodisponibilidade, ou seja, não apresentam diferenças significativas
na quantidade absorvida do fármaco ou na velocidade de absorção, quando administrado
em dose equivalente, sob as mesmas condições experimentais. Se dois medicamentos são
considerados bioequivalentes, é possível aproveitar os estudos clínicos completos de um
medicamento para outro. Ou seja, diminui a complexidade de provas de segurança e efi-
cácia que o fabricante precisa apresentar no momento do registro do medicamento. Outra
aplicação dos estudos de bioequivalência é para o pós-registro de medicamentos. Quando
um produto sofre algum tipo de alteração pode ser demandado a comprovar novamente
que ainda é bioequivalente ao medicamento de referência (comparador).
Os estudos de equivalência e bioequivalência são de relevância considerável para
a saúde pública e interesses socioeconômicos, sendo importante a criação de mecanis-
mos e ferramentas que possam dar garantias de que os medicamentos a serem lançados
no mercado apresentem as mesmas características e propriedades físico-químicas que o
medicamento inovador, conhecido como de referência. Sendo assim, faz-se necessário o
desenvolvimento de metodologias seguras e dinâmicas de avaliação da garantia da qua-
lidade e dos processos referentes aos estudos realizados.
 Controle de Qualidade 15

6. VALIDAÇÃO DE
MÉTODOS ANALÍTICOS
O desenvolvimento de um método analítico, a adaptação ou implementação de mé-
todo conhecido, envolvem processo de avaliação que estime sua eficiência na rotina do
laboratório. Esse processo costuma ser denominado validação. Várias definições estão
descritas na literatura para validação, tratando-se, portanto, de termo não específico. De-
terminado método é considerado validado se suas características estiverem de acordo
com os pré-requisitos estabelecidos. O objetivo da validação consiste em demonstrar que
o método analítico é adequado para o seu propósito. A validação deve ser considerada
quando se desenvolve ou efetua adaptações em metodologias já validadas, inclusão de
novas técnicas ou uso de diferentes equipamentos.

6.1 Critérios de Validação

Os parâmetros de validação de métodos analíticos envolvem Especificidade/Se-
letividade, Função da Resposta (gráfico analítico), Intervalo de Trabalho, Linearidade,
Sensibilidade, Exatidão, Precisão, Limite de Detecção (LD), Limite de Quantificação (LQ)
e Robustez.

6.1.1 Exatidão

Um método é considerado exato quando o valor do resultado se aproxima do valor

absoluto verdadeiro para a amostra analisada. Esses resultados são comparados com
valores conhecidos, provenientes de controles positivos e negativos submetidos a várias
avaliações com o padrão ouro para a técnica empregada.

6.1.2 Precisão

Um método é considerado preciso quando uma grande quantidade de análises são

repetidas na mesma amostra e exibem resultados semelhantes. Nesse caso, a variação
aleatória é pequena e o método mostra-se confiável, porque os resultados podem ser re-
produzidos (reprodutibilidade).
 Controle de Qualidade 16

Figura 9. Exatidão x Precisão18

baixa precisão e baixa exatidão alta precisão e baixa exatidão

baixa precisão e boa exatidão baixa precisão e alta exatidão

6.1.3 Sensibilidade

A sensibilidade é a capacidade do método em distinguir, com determinado nível de

confiança, duas concentrações próximas. Sob o ponto de vista prático, a sensibilidade
constitui o coeficiente angular do gráfico analítico.

Figura 10. Avaliação de Concentração/Resposta19

Vamos falar sobre essa figura, na qual constam 3 equações da reta e 3 coeficien-
tes angulares distintos, o coeficiente angular é o valor ligado diretamente ao x (1,6265x;
1,0104x; 0,4008x); nessa imagem podemos observar que a reta de maior inclinação é a
 Controle de Qualidade 17

de coeficiente angular 1,6265x, logo ela apresenta maior sensibilidade, pois conseguimos
distinguir valores de concentrações próximas, mas caso tenha ficado alguma dúvida, com
o auxílio de um lápis trace retas entre a concentração e o sinal respectivo, e você irá ob-
servar o mesmo.

6.1.4 Linearidade

A linearidade refere-se à capacidade do método de gerar resultados linearmente pro-

porcionais à concentração do analito, enquadrados em faixa analítica especificada.

6.1.5 Intervalo de Trabalho

O intervalo do método analítico corresponde à faixa do maior ao menor nível que

possa ser determinado com precisão e exatidão, usando a linearidade do método.

6.1.6 Limite de Detecção (LD)

A menor concentração do analito que pode ser detectada, mas não necessariamente
quantificada, sob condições experimentais estabelecidas constitui o limite de detecção.
Analistas, quando desenvolvem métodos novos ou modificados para análise de traços,
frequentemente definem Limites de Detecção (LD) em termos do desvio-padrão de medi-
das do branco.

6.1.7 Limite de Quantificação (LQ)

O limite de quantificação é definido como a menor concentração do analito, que pode

ser quantificada na amostra, com exatidão e precisão aceitáveis, sob as condições expe-
rimentais adotadas. Pode ser estimado por meio do sinal/ruído, do desvio-padrão e por
processos estatísticos.

6.1.8 Robustez

Segundo a International Conference on Harmonisation (ICH), a robustez do método

é a medida da sua capacidade de permanecer inalterado sob pequenas, mas estudadas
variações nos parâmetros do método e prover indicação da sua dependência durante o
uso normal.

6.2 Especificidade/Seletividade
O termo especificidade, muitas vezes utilizado como sinônimo de seletividade, de-
fine a capacidade do método em detectar o analito de interesse na presença de outros
 Controle de Qualidade 18

componentes da matriz. Já a seletividade refere-se à capacidade de detecção de substân-

cias. O processo para demonstrar a especificidade do método depende do seu objetivo.
Em diversas técnicas analíticas (como nas análises cromatográficas, por exemplo) esse
parâmetro pode ser estabelecido pela comparação do resultado
obtido com a combinação de vários fatores. Como substâncias
diferentes podem apresentar respostas similares em dadas con-
dições deve-se proceder à análise, seguida por outras técnicas
comprobatórias (como cromatografia ou eletroforese acoplada à
espectrometria de massas). Outra maneira de avaliar a especifi-
cidade envolve a adição de padrão analítico (muito empregada
em análises por espectrometria de absorção ou de emissão atô-
mica) ou a comparação com padrão externo.

6.3 Função da Resposta (Gráfico Analítico)

O gráfico analítico deve apresentar os dados estatísticos de intersecção, da equação
da regressão linear, o coeficiente de correlação ou de determinação e a concentração es-
timada dos calibradores (soluções-padrão). Assim, torna-se necessário o uso de número
suficiente de soluções-padrão para definir adequadamente a relação entre a concentração
e a resposta. O gráfico analítico pode ser construído usando-se, no mínimo, cinco valores
de concentração enquadrados no intervalo definido.

A suposição clássica do gráfico de calibração é que a resposta instrumental y está

linearmente relacionada com a concentração do padrão y, tal como:

y = F(x) + ey

Na qual: ey = erro randômico ou indeterminado (distribuição normal); y = sinal analí-

tico (ou resposta instrumental).

Geralmente, o erro randômico é desprezado na relação, ficando y = F(x):

F(x) = B + Sx

Na qual: B = média das medidas do branco (ou linha de base); S = sensibilidade do

método; x = concentração do analito na amostra.

Julga-se satisfatória a linearidade do gráfico quando o coeficiente de correlação da

reta obtida não é estatisticamente diferente da unidade (9). No caso, considera-se:
 Controle de Qualidade 19

Quadro 1. Interpretação do Valor de R

Valor de R Correlação da Reta

R=1 Correlação Perfeita

0,91 < R < 0,99 Correlação Fortíssima

0,61 < R < 0,91 Correlação Forte

0,31 < R < 0,60 Correlação Média

0,01 < R < 0,30 Correlação Fraca

R=0 Correlação Nula

Fonte: Autoria Própria, 2020.

Embora sempre se busque obter relação linear entre a propriedade a ser medida e
a concentração ou quantidade do analito pode-se também admitir a relação não linear
(16) (por exemplo, nas análises eletroquímicas, utilizando eletrodos de íon seletivo ou
biossensores).
 Controle de Qualidade 20

7. MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
PARA PRODUTOS ESTÉREIS
Para realizar o teste de esterilidade em produtos farmacêuticos, as amostras devem
ser preparadas de modo a evitar possíveis falsos resultados, portanto, os frascos ou am-
polas contendo o medicamento que será analisado, devem ser tratados, a fim de minimizar
contaminação cruzada proveniente da parte externa da embalagem. A assepsia pode ser
realizada por imersão dos frascos ou ampolas de medicamentos em soluções antissépti-
cas, tal como álcool. Durante o preparo das amostras de medicamentos, deve-se identificar
as mesmas, a fim de não haver misturas de lotes para facilitar a liberação de resultados,
bem como garantir a confiabilidade dos mesmos. Esse teste deverá ser realizado em áreas
limpas e dentro de um fluxo laminar. O teste baseia-se em constatar a total esterilidade do
medicamento, uma vez que o mesmo deve ser isento de qualquer contaminação. O teste de
esterilidade pode ser realizado utilizando os métodos de filtração em membrana por sistema
aberto ou fechado (Figura 10 e 11) ou por inoculação direta, no qual a amostra é diretamente
inoculada no meio de cultura. Qualquer meio de cultura utilizado deverá ter sido aprovado no
seu teste de promoção de crescimento. Ambos os métodos são realizados através de uma
inoculação da amostra em frascos estéreis, e em seguida é adicionado meios de cultura e os
mesmos são incubados em estufas até o momento da leitura. O que difere o sistema aberto
do fechado é a forma de inoculação e manipulação do teste. No sistema aberto, o operador
utiliza um frasco estéril contendo meio de cultura e inocula a amostra a ser analisada, esse
processo é todo realizado manualmente. No sistema fechado, o operador manipula um equi-
pamento no qual irá fazer a inoculação da amostra e do meio de cultura, evitando assim o
contato direto e minimizando os riscos de contaminação cruzada.

Figura 11. Equipamento em sistema fechado para teste de esterilidade5

 Controle de Qualidade 21

Figura 12. Bolsas com meio de cultura em sistema fechado para teste de esterilidade5

Os dois meios de cultura utilizados para testes de esterilidade são: o caldo de tiogli-
colato e o caldo de caseína soja. O primeiro é utilizado para cultura de bactérias anaeróbi-
cas, embora, também detecta o crescimento de bactérias aeróbicas. O segundo é indicado
para a cultura de leveduras, fungos e bactérias aeróbicas. Após realizado os testes, os
meios de cultura são incubados por 14 dias em estufas de incubação com a temperatura
adequada para cada meio. São realizadas leituras diárias para observar se houve algum
tipo de contaminação.
 Controle de Qualidade 22

8. MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
PARA PRODUTOS NÃO ESTÉREIS
A garantia de qualidade e os controles de produção devem ser tais que os micro-or-
ganismos capazes de proliferar e contaminar o produto estejam dentro dos limites. Os
limites microbianos devem ser adequados às várias categorias de produtos que reflitam o
tipo de contaminação mais provável introduzida durante a fabricação, bem como a via de
administração, o consumidor final (neonatos, crianças, idosos), o uso de agentes imunos-
supressores, corticosteroides e outros fatores. Ao avaliar os resultados dos testes micro-
biológicos, o número e os tipos de micro-organismos presentes devem ser considerados
no contexto mais abrangente uso do produto.
Os métodos de análise, envolvendo tanto os medicamentos não estéreis quanto
os cosméticos, abrangem três etapas fundamentais: amostragem, englobando coleta,
transporte e preparação da amostra para análise; determinação numérica ou contagem
das formas viáveis; isolamento e identificação dos micro-organismos indesejáveis a se-
rem pesquisados.
Para os ensaios microbiológicos em produtos não estéreis, devem ser utilizadas
técnicas assépticas na amostragem e na execução do teste. O teste deve ser realizado,
preferencialmente, em capela de fluxo laminar e empregar, quando possível, a técnica de
filtração por membrana. Se a amostra possuir atividade antimicrobiana, essa deve ser
convenientemente removida ou neutralizada.

8.1 Limites Microbianos

Os limites microbianos de matérias-primas e produtos acabados podem se constituir
em ausência absoluta de formas viáveis (produtos estéreis) ou sua presença em grande-
zas definidas, restritos ou não a determinadas cepas microbianas (produtos não estéreis).
No caso de produtos cosméticos, observam-se os valores máximos aceitáveis de conta-
minantes viáveis, desde que somado a ausência de determinadas cepas microbianas.
A análise comparativa da Farmacopeia Brasileira1 e da United States Pharmacopeia11
indica uma relação de similaridade quanto aos aspectos dos limites microbianos preconi-
zados para produtos farmacêuticos não estéreis. Sendo assim, pode-se fazer uma abor-
dagem dos limites microbianos tendo como base ambos os compêndios oficiais.
Os limites de aceitação estão descritos no quadro seguinte e são interpretados do
seguinte modo:

 101 UFC: valor máximo aceitável = 20;

 102 UFC: valor máximo aceitável = 200;

 103 UFC: valor máximo aceitável = 2000 e, assim sucessivamente.

 Controle de Qualidade 23

Quadro 2. Limites microbianos para produtos não estéreis1

Contagem total Contagem total

de bactérias de Fungos/
Via de Administração* Pesquisa de Patógenos
aeróbias UFC/g leveduras
ou mL UFC/g ou mL
Produtos de origem vegetal, mineral e/ou animal

Ausência de Escherichia coli e Staphylococ-

Preparação para uso oral
cus aureus em 1g, ou mL. Limite Máximo de
contendo matéria-prima 104 102
10² bactérias Gram negativa bile tolerante em
de origem natural
1 g, ou mL.

Limite Máximo de 10² Escherichia coli em 1g.

Drogas vegetais que se-
rão submetidas a proces-
sos extrativos a quente
Limite Máximo de 104 bactérias Gram nega-
10 7
104
tiva bile tolerante em 1 g, ou mL. Ausência de
Salmonella em 10g.

Limite Máximo de 10¹ Escherichia coli em 1g.

Drogas Vegetais que se-
rão submetidas a proces-
sos extrativos a quente
Limite Máximo de 10³ bactérias Gram negati-
10 5
103
va bile tolerante em 1 g, ou mL. Ausência de
Salmonella em 10g.

Ausência de Salmonella spp e Escherichia coli

Extrato Seco 104 103
em 10g.

Tintura, Extrato Fluido 104 103 -

Substâncias para uso farmacêutico

Ausência de Escherichia coli, Pseudomonas

Matéria-prima, base ga- aeruginosa e Staphylococcus aureus em 1g,
103 102
lênica ou mL. Ausência de Salmonella spp e em 10g,
ou mL.

Produtos sintéticos e biológicos

Preparação aquosa para

102 101 Ausência de Escherichia coli em 1g, ou mL.
uso oral

Preparação não aquosa

103 102 Ausência de Escherichia coli em 1g, ou mL.
para uso oral

Preparação para uso retal 103 102 -

Preparação uso tópico

Ausência de Staphylococcus aureus e Pseu-
(oromucos, nasal, gengi- 103 102
domonas aeruginosa em 1g, ou mL.
val, cutâneo, auricular)

Ausência de Staphylococcus aureus, Pseudo-

Inalatórios 102 101 monas aeruginosa e Bactéria Gram negativa
bile tolerante em 1g, ou mL.

Ausência de Staphylococcus aureus, Pseudo-

Preparação Vaginal 102 101 monas aeruginosa e Candida albicans em 1g,
ou mL.

Dispositivo Transdérmico Ausência de Staphylococcus aureus e Pseu-

102 101
(limite por unidade) domonas aeruginosa/dispositvo
 Controle de Qualidade 24

9. CLASSIFICAÇÃO DE SALA LIMPA

E CONTROLE AMBIENTAL
Sala limpa são ambientes controlados usados na indústria para procedimentos onde
a presença de particulado ou microrganismos pode alterar o produto ou resultado de aná-
lises, são áreas que ficam totalmente isolados das demais instalações, dentro de um sis-
tema que é regulado por padrões de tipos de atividades e técnicas interativas.
Esse tipo de ambiente pode ser esterilizado ou não, com controle ambiental defini-
do em termos de:

 Fluxo de ar;

 Pressão;

 Temperatura;

 Umidade;

 Ruído;

 Vibração;

 Iluminação;

 Contaminação microbiana e por partículas.

todo o sistema da sala limpa é desenvolvido de forma a reduzir a introdução, geração
e a retenção de contaminantes em seu interior.

9.1 Controle de Partículas

No processo de produção de medicamentos parenterais, partículas indesejáveis po-
dem infectar o produto e acabar injetadas na corrente sanguínea do paciente. A fabricação
de produtos seja de uso humano ou veterinário, principalmente medicamentos, qualquer
falha que possa surgir implica em sérios prejuízos ao nome da indústria e à saúde dos
consumidores.
Para garantir a devida proteção aos processos e aos produtos, a pureza do ar exigida
em uma  sala limpa, deve ser determinada conforme as necessidades de cada situação
específica. A fim de distinguir sistematicamente diferentes níveis de qualidade de áreas
limpas, foram estabelecidas classes de pureza de ar.
As salas limpas são classificadas através de normas, de acordo com o grau de pure-
za do ar interior e da concentração de partículas por unidade de volume de ar.
 Controle de Qualidade 25

9.1.1 Princípios do Fluxo de Ar da Sala Limpa

A sala limpa mantém o ar livre de partículas através do uso de filtros HEPA ou ULPA,

empregando princípios de fluxo de ar laminar ou turbulento. Laminar, ou unidirecional,
sistemas de fluxo de ar direcionam o ar filtrado para baixo em um fluxo constante. Os sis-
temas de fluxo de ar laminar são tipicamente empregados em 100% do teto para manter
um fluxo constante e unidirecional. O critério de fluxo laminar é geralmente estabeleci-
do em estações de trabalho portáteis, e é obrigatório em salas limpas com classifica-
ção ISO-1 a ISO-4.
O projeto adequado de sala limpa engloba todo o sistema de distribuição de ar, in-
cluindo provisões para retornos de ar adequados ao fluxo normal. Em salas de fluxo verti-
cal, isso significa que o uso de ar de parede baixa retorna ao redor do perímetro da zona.
Em aplicações de fluxo horizontal, requer o uso de retornos de ar no limite do fluxo do
processo. O uso de retorno de ar montado no teto é contraditório ao projeto adequado
do sistema de sala limpa.

Figura 13. Esquema de Funcionamento de uma Sala Limpa20

Ventilador Filtro Condicionador

Entrada de Ar de Eletrostático de
Renovação
Temperatura e
umidade

Sala Limpa, Controle de Temperatura, Umidade e

Micropartículas.

Fugas Fugas
Pressão Positiva
Sala Pressurizada

9.1.2 Classificações de Sala Limpa

Salas limpas  são classificadas de acordo com o número e tamanho de partículas

permitidas por volume de ar. Grandes números como “classe 100” ou “classe 1000” refe-
rem-se a FED_STD-209E e denotam o número de partículas de tamanho 0,5 mm ou maior
permitido por pé cúbico de ar. O padrão também permite a interpolação, por isso é possível
descrever, e “classe 2000”.
 Controle de Qualidade 26

Os números pequenos referem-se às normas ISO 14644-1, que especificam o loga-

ritmo decimal do número de partículas 0,1 µm ou maiores permitidas por metro cúbico de
ar. Assim, por exemplo, uma sala limpa classe 5 ISO tem no máximo 105 = 100.000 partí-
culas por m³.
Tanto a FS 209E como a ISO 14644-1 assumem relações log-log entre tamanho de
partícula e concentração de partículas. Por essa razão, não existe concentração de partí-
culas nulas. O ar da sala comum é de aproximadamente 1.000.000 ou ISO 9.
 Partícula: sólido ou líquido, no propósito de classificação de pureza de ar, que
pode se acumular baseada num range de 0,1µm a 5µm.
 A classificação de salas limpas está contida na parte 1 da ISO 14644.
Figura 14. Classificação de Salas Limpas21

Limites máximos de concentração (partículas/m³ de ar) para partículas iguais ou maiores

Número de
que os tamanhos consideradas [Cn= 10N x (0,1/D)2,08] – Tamanho de partículas = D.
Classificação
ISSO (N)
0,1 µm 0,2 µm 0,3 µm 0,5 µm 1 µm 5 µm

ISO Classe 1 10 2

ISO Classe 2 100 24 10 4

ISO Classe 3 1000 237 102 35 8

ISO Classe 4 10000 2370 1020 352 83

ISO Classe 5 100000 23700 10200 3520 832 29

ISO Classe 6 1000000 237000 102000 35200 8320 293

ISO Classe 7 352000 83200 2930

ISO Classe 8 3520000 832000 29300

ISO Classe 9 35200000 8320000 293000

NOTA – Devido às incertezas relacionadas ao processo de medição, na definição da classe de limpeza não são utili-
zados mais que três algarismo significativos nos valores de concentração.
 Controle de Qualidade 27

Concentração de partículas suspensas no ar, Ca+ partículas/m3

Tamanhos de partículas, D (5µm)

9.2 Controle Ambiental

O monitoramento ambiental em áreas classificadas é essencial para o controle de
partículas, de modo a garantir que elas não interfiram na produção. Para cada área de
atua­ção, existe um grau diferente de atenção para o monitoramento.
As áreas de grau A são monitoradas para que não exista a circulação de partículas vi-
áveis, que são capazes de se desenvolver no ambiente, como as bactérias e fungos. Neste
caso, o monitoramento garante um fluxo de ar unidirecional, que não permite a suspensão
de partículas viáveis no ar. A classificação B de área limpa na indústria farmacêutica é di-
recionada aos ambientes que ficam ao lado das salas de grau A. Este espaço necessita de
um alto controle para garantir a esterilidade, para que não haja contaminação pelo fluxo
entre as salas de grau A e B. Por último, os ambientes classificados com os graus C e D
são aqueles que possuem uma maior resistência aos microrganismos. Geralmente, estas
salas são direcionadas a produção de medicamentos não estéreis ou fazem parte da etapa
anterior a elaboração de produtos estéreis.
 Controle de Qualidade 28

10. TESTE DE PIROGÊNIOS IN VITRO

A palavra pirogênio é relacionada a palavra grega pyro, que significa ardente ou fogo,
descrição adequada para compostos que produzem aumento da temperatura corporal. As
substâncias que induzem febre são chamadas pirogênios. Existem duas classes de piro-
gênios: exógenos e endógenos. Os exógenos são aqueles que têm origem extracorporal e
induzem temperaturas elevadas quando injetados em humanos e animais. Os endógenos
são produzidos pelo hospedeiro em resposta ao estímulo provocado por diversos pirogê-
nios exógenos.
Os níveis de pirogênios são fundamentais para a liberação de produtos farmacêuti-
cos. No que diz respeito ao controle de qualidade, medicamentos injetáveis de grande ou
pequeno volume, bem como, acessórios para transfusão, infusão e todos os dispositivos
implantáveis ou descartáveis empregados em terapia parenteral, necessitam oferecer se-
gurança ao paciente, logo não devem conter pirogênio.
As endotoxinas são complexos de alto peso molecular agregados a membrana ex-
terna de bactérias Gram-negativas, e representam a principal fonte de pirogênio para in-
dústria farmacêutica. A maior parte dos mamíferos é afetada pelas endotoxinas. Estudos
demonstraram que a injeção de bactérias Gram-negativas vivas ou mortas provoca diver-
sas reações patofisiológicas que variam de uma leve alteração de temperatura, alteração
na contagem de leucócitos do sangue, coagulação intravascular disseminada, hipotensão,
choque e até mesmo óbito.

Figura 15. Estrutura Lipopolissacarídeo (LPS)22

 Controle de Qualidade 29

A detecção e a eliminação de endotoxina bacteriana em fármacos são de suma im-

portância para os usuários. A endotoxina resiste ao calor, dessecação, pH extremos e vá-
rios tratamentos químicos, por isso a validação do processo de destruição ou remoção da
endotoxina na produção de injetáveis é um fator crítico para o fabricante. O teste de en-
dotoxina bacteriana é realizado na amostra a qual for preconizado pela farmacopeia, para
identificar ou quantificar endotoxinas de bactérias do tipo Gram-negativas. Para executar
o teste é utilizado um extrato aquoso dos amebócitos circulantes de duas espécies de
artrópodes conhecidos como: Limulus polyphemus ou do Tachypleus tridentatus. Através
dessa extração é preparado um reagente, conhecido como Lisado do Amebócito do Limu-
lus (LAL) no qual é utilizado para realizar as análises.

Figura 16. Extração de Lisado do Amebócito de Limulus (LAL) 23

Existem dois métodos de análise com sensibilidades diferentes para execução desse
teste. O método de coagulação em gel e os métodos fotométricos. No método de coagu-
lação em gel, a amostra é inserida em tubos contendo o reagente LAL (F e esses tubos
são incubados em banho maria, a temperatura de 37°C por 1 hora. É realizada a leitura,
inclinando os tubos a 180° e verificando a formação de um coágulo ou gel no fundo do
mesmo. Em caso de positivo, é considerada presença de endotoxina. Esse método é se-
miquantitativo, portanto, não é possível medir a quantidade exata de endotoxina presente
na amostra.
 Controle de Qualidade 30

Figura 17. Método de Coagulação em Gel para Endotoxina24

Já os métodos fotométricos podem ser realizados de duas formas: o método turbidi-

métrico e o método cromogênico. No método turbidimétrico, ocorre o surgimento de uma
turbidez após a quebra de um substrato endógeno. Esse método é realizado em equipa-
mento, no qual as amostras são inseridas em placas de teste apirógenas, com reagente
LAL e essa placa é colocada no equipamento que irá realizar a leitura. No método cro-
mogênico, ocorre um pigmento corado após quebra de um complexo peptídeo sintético
cromógeno. Esse teste também é realizado em equipamento no qual as amostras são
expostas a reagentes e o mesmo faz a leitura. Ambos os métodos fotométricos são quan-
titativos, ou seja, é possível saber a quantidade de endotoxina presente na amostra.

Figura 18. Equipamento utilizado para realizar testes pelo método fotométrico25

Além desses métodos, há também os testes realizados em animais, esses testes são
conhecidos como testes de pirogênio in vivo. Ele é baseado na verificação do aumento da
temperatura corporal em coelhos, após injeção intravenosa da solução estéril que está
sendo analisada
 Controle de Qualidade 31

10.1 Teste De Pirogênios In Vivo

Conforme descrito na Farmacopeia Brasileira1 o teste de pirogênios fundamenta-se
na medida do aumento da temperatura corporal de coelhos, após injeção intravenosa da
solução estéril em análise. Para produtos bem tolerados pelos animais, utilizar uma dose
que não exceda 10 mL/kg, injetada em tempo não superior a 10 minutos. Para os produtos
que necessitem preparação preliminar ou condições especiais de administração, devem-
-se seguir as recomendações estabelecidas.
Para a realização do teste é necessário utilizar três coelhos do mesmo sexo, adultos,
sadios, preferencialmente da mesma raça, pesando, no mínimo, 1,5 kg. Após a seleção,
manter os animais em gaiolas individuais em sala com temperatura uniforme entre 20 e
23ºC livre de perturbações que possam estressá-los.
O resultado deve ser interpretado da seguinte maneira: Se nenhum dos três coelhos
apresentarem aumento individual da temperatura igual ou superior a 0,5ºC, em relação às
suas respectivas temperaturas controle, o produto cumpre com os requisitos do teste de
pirogênios. Se algum coelho apresentar aumento da temperatura igual ou superior a 0,5ºC,
repetir o teste utilizando outros cinco animais. O produto em exame cumpre os requisitos
para ausência de pirogênios se no máximo três dos oito coelhos apresentarem aumentos
individuais de temperatura iguais ou superiores a 0,5ºC, e se a soma dos aumentos indivi-
duais de todos os coelhos não exceder a 3,3ºC.

Figura 19. Teste da Presença de Pirogênios in vivo26

 Controle de Qualidade 32

REFERÊNCIAS
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tação Mestrado em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear Aplicações. IPEN/USP,
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26. revolucaoanimalistasite.wordpress.com/tipos-de-experimentos/
 MATERIAL
COMPLEMENTAR

BONS ESTUDOS!