Pirogênio e Endotoxina

Bacteriana
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Histórico
PIROGÊNIO E
FEBRE

Febre: mecanismo terapêutico ou patofisiológico

Histórico

Injeções intravenosas de
material pútrido
Histórico

VACINAS

Salmonella typhi
 Histórico

Pelletier e Caventou – XIX

Com o isolamento do antipirético quinina, estudos em

animais permitiram conhecer os efeitos de pirexia e
antitérmicos;
 Histórico
Porém, Billbroth foi o primeiro a usar
o termo pyrogen, ou pirogênio, para
descrever o princípio promotor de
febre. Ele foi capaz de produzir a febre
em cachorros injetando água destilada
nestes animais;
Panum

O termo pyrogen e substância pirogênica foi então usado

por outros autores, entre os quais Burdon-Sanderson,
que escreveram sobre o processo da febre originada de
agente exógeno, como a bactéria, ou de origem endógena
da célula do hospedeiro;
 Histórico
Durante a última década do século XIX, Centanni
conduziu estudos significativos quanto aos agentes
responsáveis pela febre;

Entre outros, ele descreveu um procedimento para isolar

a toxina bacteriana responsável pela ação febril;

Mantendo cultura de bactérias Gram (-) sob autólise

durante longos períodos, procedendo a sua filtração
esterilizante e então submetendo-as a fracionamento em
álcool, ele obteve pó branco altamente pirogênico, a partir
de larga variedade de bactérias;
Histórico
Histórico

Pseudomonas aeruginosa

Salmonella sp.
 Histórico

Porém, a eliminação de bactérias por esterilização

térmica ou filtração não eliminava a pirogenicidade
destas preparações;

Primeiro entendimento da febre das injeções – 1912 em

investigações relatadas por Hort e Penfold;
 Histórico
Outros pesquisadores confirmaram as informações e
enfatizaram a importância de evitar contaminação
microbiana em todos os estágios da produção
farmacêutica;

Versus

Esterilidade Pirogenicidade
 Histórico

Estudo colaborativo

Estabelecer um sistema animal que pudesse ser usado

para avaliar a pirogenicidade de soluções;
USP XII
PRIMEIRO TESTE DE PIROGÊNIO OFICIAL, 1942
 Histórico
Em paralelo, continuavam os esforços no sentido de
purificar e caracterizar a endotoxina, tendo sido obtidos
isolados pirogênicos por diferentes pesquisadores;

Shear e Turner isolaram uma preparação de endotoxina

de Serratia marcescens que apresentava tanto toxicidade
quanto pirogenicidade e foram os primeiros a aplicar o
termo lipopolissacarídeo ao extrato de endotoxina;
Histórico

1,0 ng/kg

Respostas Febris
 Histórico
Foram necessários 20 anos de trabalho desses autores, e
outros pesquisadores, para demonstrar que a porção
lipídica do LPS é responsável pelas reações biológicas
induzidas pela endotoxina;
Pirogênio endógeno

Oakley et al., 2011

Pirogênio endógeno
É interessante a presença frequente da febre em doenças
malignas, o que se pode explicar como uma liberação
espontânea de PE por alguns tipos de células tumorais;
Endotoxinas
Constituem-se na mais significativa fonte de pirogênio
para a indústria farmacêutica, quando não purificadas
podem conter lipídeos, carboidratos e proteínas, mas
quando purificadas são denominadas lipopolissacarideos
(LPS);

Apresentam uma região hidrofílica polissacarídea ligada

covalentemente a uma região hidrofóbica, conhecida
como lipídeo A;

A região polissacarídea é altamente variável entre as

espécies de bactérias Gram (-), já o lipídeo A é uma
estrutura bastante conservadora, sendo responsável pela
atividade biológica;
 Atividade Biológica
Muitas atividades biológicas são atribuídas à unidade
lipídeo A da endotoxina: pirogenicidade, toxicidade letal,
leucopenia, seguida de leucocitose, necrose da medula
óssea, reabsorção do osso embrionário, ativação do
complemento, queda de pressão sanguínea, agregação
plaquetária, indução de resistência não específica à
infecção, atividade de macrófagos, indução de síntese de
IgG, indução à produção de interferon, indução à
produção de TNF, gelificação do lisado do amebócito de
Limulus;
O mecanismo de indução da febre envolve a fagocitose
do lipídeo A, sendo produzido pirogênio endógeno, que
então atravessa a barreira hematoencefálica e age no
hipotálamo;
 Atividade Biológica
Diferentemente da maioria dos animais e humanos, os
ratos e camundongos apresentam resposta hipotérmica
após administração parenteral de endotoxina;

Usando o recurso de injeção direta nos ventrículos

cerebrais, foi possível a promoção da febre, permitindo
inferir que o centro termorregulador de ratos é capaz de
responder ao lipídeo A;

Demonstrando também que o lipídeo A, ou o pirogênio

endógeno, injetados intravenosamente não atravessam a
barreira hematoencefálica e a hipotermia decorre do
efeito tóxico do lipídeo A sobre os vasos da pele;
 Níveis Pirogênicos
A questão de níveis pirogênicos torna-se crucial ao
considerar os limites de liberação para os produtos
farmacêuticos;

1980 – 50 pg/mL (0,5 ng/Kg);

Posteriormente – 35 pg/mL;

Sob evidência científica, 100 pg/mL é um limite de

liberação aceitável para parenterais de grande volume e
proporciona um significativo fator de segurança sobre o
teste de pirogênio em coelhos;
 Níveis Pirogênicos

<<<<<<<
10 vezes

Esta diferenciação não implica desmérito no emprego do

teste de pirogênio em coelhos, como preditivo do risco
pirogênico para humanos;
 Níveis Pirogênicos
Mostrou-se que os níveis-limite em ambas as espécies
ficam entre 0,1 e 0,14 ng/Kg para S. typhosa, 1,0 ng/Kg
para E. coli, e de 50 a 70 ng/Kg para Pseudomonas sp;

Vale ressaltar que os limites correspondem a preparações

purificadas, enquanto as endotoxinas que ocorrem na
natureza como contaminantes de produtos farmacêuticos
apresentam comportamentos distintos;

Assim, a pirogenicidade pode depender de qual a

endotoxina estudada, assim como do nível da dose;

0,1 ng/mL permite um considerável fator de segurança

quanto à pirogenicidade em humanos;
Processos de despirogenização

Inativação Remoção

Endotoxinas

A inativação pode ser obtida pela detoxificação da

molécula de lipopolissacarídeo LPS, usando tratamentos
químicos que quebrem partes lábeis ou bloqueiem sítios
necessários à atividade pirogênica, como alternativa pode
ser usada alta temperatura;
Processos de despirogenização

Inativação Remoção

Endotoxinas

A remoção de endotoxinas pode também ocorrer por

diferentes métodos, baseada em características físicas da
endotoxina, como tamanho, peso molecular, carga
eletrostática, ou afinidade da endotoxina com diferentes
superfícies;
Despirogenização por
Inativação da Endotoxina
Hidrólise Ácido-Base;

Oxidação;
Alquilação;

Processo Térmico;

Radiação Ionizante;
Despirogenização por
Remoção de Endotoxinas
Lavagem;

Destilação;
Ultrafiltração;

Osmose Reversa;

Carvão Ativo;
Obtenção de Produtos
Apirogênicos
Após a observação dos métodos despirogenizantes, por
inativação ou remoção, ficam evidentes as limitações
quanto à sua aplicação no produto terminado;

Exceto nos métodos clássicos de obtenção de água

apirogênica, assim como na aplicação de calor seco, em
condições drásticas, a material termoestável (material de
acondicionamento, por exemplo), os demais métodos são
extremamente específicos, ou apenas se justificam em
medicamentos ou produtos biológicos de altíssimo valor
agregado;
Obtenção de Produtos
Apirogênicos
Deve permanecer fortemente sedimentada a importância
de trabalhar, durante todo o processo produtivo, em
condições adequadas de higiene, relativamente a
operadores e ao ambiente, além de empregar matérias-
primas com baixas cargas microbianas, processos
validados, pessoal qualificado e treinado. Em suma
aplicar todos os conceitos de Boas Práticas de
Fabricação, de forma que o produto seja obtido
apirogênico no primeiro processamento, dispensando
preocupações quanto a reprocessos ou tratamentos
adicionais;
Obtenção de Produtos
Apirogênicos
Todas as monitorações de processo, assim como testes
de matérias-primas, com particular atenção às de origem
natural, e do produto terminado, devem empregar
técnicas analíticas validadas, seja com a metodologia
clássica, empregando coelhos, ou diferentes métodos
empregando a técnica in vitro do LAL;
Determinação de Endotoxinas
Lisado do amebócito de Limulus (LAL);
Desde 1885 observou-se que o sangue do L. polyphemus,
o caranguejo em forma de ferradura de cavalo, formava
um coágulo em gel sólido, quando removido do animal;

Vários aspectos dessa coagulação foram estudados, com

particular referência aos amebócitos, a única célula
circulante encontrada no sangue do Limulus;

Em 1956, Bang verificou que bactérias Gram (-) eram

capazes de fazer uma doença fulminante em caranguejos;
Determinação de Endotoxinas
Lisado do amebócito de Limulus (LAL);

Esta doença era caracterizada por extensiva coagulação

intravascular, e consequente morte;

Em 1964, Levin e Bang apresentaram estudos sobre este

mecanismo de reação, demonstrando que os amebócitos
eram necessários para a reação e que os agentes de
coagulação estão somente nos amebócitos;

Assim, descreveram o fenômeno que mais tarde seria a

base para o ensaio LAL;
Determinação de Endotoxinas