Aspectos importantes

de microbiologia:
coleta, preservao de
espcimes e noes de
biologia molecular
Maria Clara Padoveze
Diviso de Infeco Hospitalar

Microbiologia Surtos de
IH
Todo resultado liberado pelo laboratrio de microbiologia
conseqncia da qualidade da amostra recebida.
O material coletado deve ser representativo do processo
infeccioso investigado, devendo ser eleito o melhor stio
da leso, evitando contaminao com as reas
adjacentes.
A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar
falhas no isolamento do agente etiolgico e favorecer o
desenvolvimento da flora contaminante, induzindo a um
resultado inapropriado

Microbiologia Surtos de
IH
procedimentos adequados de coleta devem
ser adotados para evitar o isolamento de um
falso agente etiolgico
Na amostra devem estar identificados:

Nome e registro do paciente

Leito ou ambulatrio e especialidade
Material colhido
Data, hora e quem realizou a coleta

Consideraes gerais da
coleta

Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possvel.

Observar a anti-sepsia na coleta de todos os materiais
clnicos.
Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha
maior probabilidade de ser isolado.
Considerar o estgio da doena na escolha do material.
Patgenos entricos causadores de diarria, esto
presentes em maior quantidade e so mais facilmente
isolados durante a fase aguda ou diarrica do processo
infeccioso intestinal.
Quantidade suficiente de material deve ser coletado
para permitir uma completa anlise microbiolgica.
O pedido do exame deve conter as informaes
necessrias para o perfeito desenvolvimento da anlise
clnica do espcime.

Consideraes de
segurana
Utilizar as barreiras de proteo necessrias a
cada procedimento.
Toda amostra deve ser tratada como
potencialmente patognica.
Usar frascos e meios de transporte apropriados.
No manusear a amostra em trnsito.
No contaminar a superfcie externa do frasco de
coleta e verificar se ele est firmemente vedado.
(caso ocorram respingos ou contaminao na parte
externa do frasco, fazer descontaminao com lcool
70%)

Consideraes de
segurana
No contaminar a requisio mdica que
acompanha o material.
As amostras devero ser transportadas em
sacos plsticos fechados.
Identificar claramente a amostra coletada,
com todos os dados necessrios.
Colocar a identificao no frasco de coleta
e nunca na tampa ou sobre rtulos.
Encaminhar os materiais imediatamente ao
laboratrio.

TRANSPORTE DAS
AMOSTRAS
Transportar as amostras IMEDIATAMENTE ao
laboratrio para:
Assegurar

a sobrevivncia e isolamento do
microrganismo
Evitar o contato prolongado dos
microorganismos com anestsicos utilizados
durante a coleta, pois eles podero exercer
atividade bactericida.
Evitar erros de interpretao nas culturas
quantitativas, principalmente urina e lavado
broncoalveolar.
Consultar o laboratrio para verificar a
disponibilidade dos meios de transporte.

Amostras Inadequadas
Material clnico recebido em soluo de fixao
(formalina).
Ponta de cateter de Foley.
Material conservado inadequadamente com relao a
temperatura
Frascos no estreis.
Presena de vazamentos, frascos quebrados ou sem
tampa, com contaminao na superfcie externa.
Mais de uma amostra de urina, fezes, escarro, ferida
colhida no mesmo dia e da mesma origem.
Swab nico com mltiplas requisies de testes
microbiolgicos.
Swab seco.
Culturas para anaerbios recebidas em condies no
apropriadas.

MANUTENO DAS
CULTURAS
PREPARO DE CULTURAS
Uma vez obtida uma cultura satisfatria, a mesma deve
ser mantida pura e vivel e para isso preciso:
Transferir

periodicamente a cultura em um meio de

cultura adequado;
incubar at que a cultura atinja a fase estacionria
mxima de crescimento;
e estocar em temperatura apropriada para impedir
maior crescimento.

MANUTENO DAS
CULTURAS
PUREZA DAS CULTURAS
Para assegurar a pureza das culturas, estas devem ser
obtidas periodicamente de uma cultura e verificadas
regularmente quanto pureza.
Os mtodos para avaliar a pureza da cultura variam com
o tipo de cultura a ser testada.
VIABILIDADE DA CULTURA
A viabilidade avaliada pela taxa de crescimento e
atividade metablica. A deteriorao das culturas pode
resultar do manuseio incorreto, do cultivo inadequado, de
transferncias freqentes por um longo perodo, meio de
cultura imprprio, mutao e ataque da bactria por um
bacterifago.

MANUTENO DAS
CULTURAS
ESTOQUE DE CULTURAS
O estoque de culturas deve ser
preparado de modo que as culturas
sejam armazenadas e preservadas por
um longo perodo sem transferncia.
Tais culturas tendem a permanecerem
estveis e so utilizadas como fonte de
cultura caso a cultura ativa seja perdida
e/ou deteriorada.

Surtos
Colher material indicado pelo estudo
epidemiolgico
No colher amostras cuja interpretao dos
resultados no ser esclarecedora para o surto
No confundir procedimentos clnicos e
epidemiolgicos com anlise fiscal
O exame microbiolgico um procedimento que
envolve custos e deve ser um recurso utilizado
com racionalidade
Esclarecer o laboratrio clnico quando se tratar de
amostras de investigao de surto e quais as
possveis hipteses

Surtos
Colher amostras clnicas que visem o esclarecimento do
diagnstico:
Confirmar a identificao da espcie ou da
susceptibilidade do microrganismo com um laboratrio de
referncia, se houver necessidade
Ser criterioso na indicao de coletas de profissionais de
sade para no gerar problemas institucionais.
Quando necessria a coleta, esclarecer o profissional
suficientemente
Ter clareza de qual ser o procedimento a ser adotado
em caso de resultado positivo, antes de iniciar a
indicao da coleta (ex.: afastamento, tratamento,etc.)
Manter a confidencialidade.

Surtos
Colher amostras ambientais que possam ser
correlacionadas com o diagnstico estabelecido
Ter em mente a hiptese de que se trata de surto
propagado por pessoa-a-pessoa ou fonte nica
para saber indicar a coleta adequada .
Ter em mente qual o possvel agente e seus
provveis reservatrios e formas de transmisso
(buscar na literatura)
No colher amostras ambientais se o laboratrio
clnico no dispuser de recursos tcnicos para
process-la. Se necessrio contatar um laboratrio
de referncia.

Pseudo-surtos
Mais freqentemente associado a
contaminao durante a execuo do
exame microbiolgico.
Eventualmente pode ser associado com
contaminao sistemtica de coletas
Anti-spticos contaminados
Recipientes contaminados
Profissional de sade

Anlise Fiscal

Fonte:
www.incqs.fiocruz.br/manual.htm

Anlise fiscal
O processo de apreenso de amostra para
anlise fiscal de medicamentos s tem
validade oficial se, tal ao, for
desencadeada pela autoridade sanitria
competente (vigilncias sanitrias estaduais
ou municipais), podendo ser desencadeada
por denncia, embora nem toda denncia
gere uma anlise fiscal, ou indicado pelo
Sistema de Monitorizao de
Medicamentos.

Anlise Fiscal
A anlise fiscal consistir na coleta de amostra representativa
do estoque existente, a qual, dividida em trs partes, ser
tornada inviolvel, para que se assegurem as caractersticas
de conservao e autenticidade.
Uma parte entregue ao detentor ou responsvel, a fim de
servir como contraprova, e as duas outras partes so
imediatamente encaminhadas ao laboratrio oficial do estado
para realizao das anlises indispensveis.
So necessrios materiais suficientes para trs anlises
Tabela de nmero mnimo de itens para anlise fiscal de
medicamentos e produtos: ANVISA, FIOCRUZ
FONTE: Informe SNVS/Anvisa/UFARM n 1, de 7 de maio
de 2004
[www.anvisa.gov.br/farmacovigilncia/informes/2004]

Caracterizao dos
sistemas de tipagem
1. Tipabilidade: habilidade da tcnica em produzir um
resultado de tipagem para cada resultado
2. Reprodutibilidade: capacidade de gerar os os
mesmos resultados quando uma mesma cepa for
testada em repetidos ensaios laboratoriais.
3. Poder discriminatrio: capacidade da tcnica em
diferenciar isolados no relacionados
epidemiologicamente
4. Facilidade de realizao
5. Facilidade de interpretao

Exemplos de tipagem
molecular

Staphylococcus aureus, Unidade de Leito-Dia, HC-UNICAMP, 1998.

Exemplos de tipagem
molecular

Staphylococcus aureus, Unidade de Pesquisa Clnica, UNICAMP, 2004.

Tipagem molecular
A determinao de uma origem clonal para
microrganismos isolados de diversas fontes
(pacientes ou reservatrios) uma etapa
importante na identificao de surtos
hospitalares.
Informaes quanto a origem clonal de
isolados microbianos tambm permite melhor
elucidar a cadeia epidemiolgica e selecionar
as medidas de controle mais objetivas.

Caracterizao de
clones

Mtodos fenotpicos:

Sorotipagem
Perfil de susceptibilidade a antimicrobianos
Susceptibilidade a bacterifagos (fagotipagem)
Apresentam algumas limitaes de
tipabilidade, poder discriminatrio e
reprodutibilidade
Microrganismos de uma mesma origem clonal
podem apresentar diferenas na manifestao
fenotpica de alguns aspectos avaliados

Caracterizao de
clones

Mtodos genotpicos:

Baseado no polimorfismo encontrado no genoma

Particularidades que podem ser acessadas por
clivagem da fita genmica ou amplificao de um
fragmento
Resultado final: padro de bandas especfico para
o clone, cuja aparncia lembra um cdigo de barras
Interpretao envolve a comparao de padres
estabelecendo critrios de similaridade e
diferenciao
Maior tipabilidade, poder discriminatrio e
reprodutibilidade.

Mtodos genotpicos
Mais freqentemente utilizados:
PCR = Polimerase Chain Reaction: baseado
na amplificao de uma seqncia do DNA e
anlise do seu polimorfismo.
Anlise de plasmdeos: baseado na anlise
do DNA extra-cromossmico de bactrias
PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis:
baseado na anlise de diferena entre os
fragmentos produzidos pela clivagem do DNA
com enzimas de restrio.

Mtodos genotpicos
A seleo dos mtodos a serem
utilizados depende de variveis como:
Tipo de microrganismo a ser estudado
Tempo para execuo do ensaio
Disponibilidade dos recursos

Tipagem molecular
A utilizao de recursos de tipagem
molecular no prescinde da necessidade de
um esmerado estudo epidemiolgico do
fenmeno
Nem todos os surtos requerem anlises da
origem clonal para seu esclarecimento
A adequada identificao da espcie e
correta realizao do perfil de
susceptibilidade a antimicrobianos e
condio elementar para anlise dos
aspectos microbiolgicos do surto.

Referncias
Bibliogrficas:

LEVI, CE. Procedimentos Laboratoriais: da Requisio do Exame Anlise

Microbiolgica. IN: ANVISA. Manual de Microbiologia Clnica para o
Controle de Infeco em Servios de Sade. 2004. www.anvisa.gov.br
Manual de Coleta. www.incqs.fiocruz.br/manual.htm
FORTALEZA, CMCB. Aplicao dos sistemas de tipagem molecular
epidemiologia hospitalar de bactrias. Monografia apresentada para
qualificao no Curso de Ps-Graduao em Patologia da Faculdade de
Medicina de Botucatu, Universidade Estadual de So Paulo - UNESP. MAIO,
1999.
BRANCHINI, MLM. Aplicao de Mtodos de Tipagem Molecular na
Investigao de surtos intra-hospitalares. Tese de livre-docncia apresentada
Faculdade de Cincias Mdicas da Universidade Estadual de Campinas
UNICAMP.
PADOVEZE, MC. Estudo da Epidemiologia molecular dos Staphylococcus
aureus Resistentes Oxacilina em Pacientes Portadores de Sndrome de
Imunodeficincia Adquirida. Tese apresentada ao Departamento de
Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biologia da Universidade Estadual
de Campinas para obteno do ttulo de mestre.