VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS: ESTRATGIA E DISCUSSO

NATILENE MESQUITA BRITO * OZELITO POSSIDNIO DE AMARANTE JUNIOR ** LUCIANA POLESE *** MARIA LCIA RIBEIRO ****

Neste trabalho so apresentadas as definies dos parmetros (seletividade, limites de deteco e quantificao, exatido, preciso, linearidade, grfico analtico, sensibilidade e robustez) considerados nos processos de validao de mtodos analticos. A estratgia a ser adotada para a determinao desses parmetros depende do propsito e da natureza do mtodo. Exemplos so apresentados para a avaliao dos parmetros no procedimento de validao.

PALAVRAS-CHAVE: MTODOS ANALTICOS-VALIDAO; CRITRIOS DE VALIDAO.

Mestre em Qumica Analtica pelo Instituto de Qumica, Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho (UNESP), Araraquara, SP (e-mail: natibrit@posgrad.iq.unesp.br). ** Mestre em Qumica Analtica pela Universidade Federal do Maranho (UFMA), Departamento de Tecnologia Qumica, Centro de Cincias Exatas e Tecnologia (CCET), So Lus, MA. *** Doutora em Qumica, Instituto de Qumica, UNESP, Araraquara, SP. **** Professora, Doutora em Qumica Orgnica, Instituto de Qumica, UNESP, Araraquara SP.

Pesticidas: R.Ecotoxicol. e Ambiente, Curitiba, v. 13, p. 129-146, jan./dez. Pesticidas: R.Ecotoxicol. e Meio Meio Ambiente, Curitiba, v. 13, jan./dez. 2003 2003

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1 INTRODUO O desenvolvimento de um mtodo analtico, a adaptao ou implementao de mtodo conhecido, envolve processo de avaliao que estime sua eficincia na rotina do laboratrio. Esse processo costuma ser denominado de validao. Vrias definies esto descritas na literatura para validao, tratando-se portanto de termo no-especfico. Determinado mtodo considerado validado se suas caractersticas estiverem de acordo com os pr-requisitos estabelecidos. Portanto, existe diferena entre a execuo de experimentos que determinam os diversos parmetros (coleta dos dados experimentais) e a validao. Essa deve avaliar a relao entre os resultados experimentais e as questes que o mtodo se prope a responder. O objetivo da validao consiste em demonstrar que o mtodo analtico adequado para o seu propsito (1). A validao deve ser considerada quando se desenvolve ou efetua adaptaes em metodologias j validadas, incluso de novas tcnicas ou uso de diferentes equipamentos. A literatura dispe de vrios trabalhos que relatam a validao de mtodos analticos (2-11) e definem os critrios que devem ser seguidos durante seu desenvolvimento. Dentre esses, muitos so das reas biolgica (2-4), farmacutica (5-7) e qumica (8-11). Tais artigos abordam os critrios de validao de acordo com sua rea especfica, enfatizando a exatido, a preciso e os limites de deteco e quantificao. Este trabalho apresenta a definio dos parmetros requeridos para a validao de mtodos analticos, assim como sugere roteiro para execuo desse processo.

2 CRITRIOS DE VALIDAO Os parmetros de validao de mtodos analticos envolvem Especificidade/Seletividade, Funo da Resposta (grfico analtico), Intervalo de Trabalho, Linearidade, Sensibilidade, Exatido, Preciso (repetitividade, preciso intermediria e reprodutividade), Limite de Deteco (LD), Limite de Quantificao (LQ) e Robustez.

2.1 ESPECIFICIDADE/SELETIVIDADE O termo especificidade, muitas vezes utilizado como sinnimo de seletividade, define a capacidade do mtodo em detectar o analito de interesse na presena de outros componentes da matriz. J a seletividade refere-se capacidade de deteco de substncias (5,12-13). O processo para demonstrar a especificidade do mtodo depende do seu objetivo. Em diversas tcnicas analticas (como nas anlises cromatogrficas, por exemplo) esse parmetro pode ser estabelecido pela comparao do resultado obtido com a combinao de vrios fatores. Como substncias diferentes podem apresentar respostas similares em dadas condies deve-se proceder anlise, seguida por outras tcnicas comprobatrias (como cromatografia ou eletroforese acoplada espectrometria de massas). Outra maneira de avaliar a especificidade envolve a adio de padro analtico (muito empregada em anlises por espectrometria de absoro ou de emisso atmica) ou a comparao com padro externo (5).

2.2 FUNO DA RESPOSTA (GRFICO ANALTICO) O grfico analtico deve apresentar os dados estatsticos de interseco, da equao da regresso linear, o coeficiente de correlao ou de determinao e a concentrao estimada dos calibradores

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(solues-padro). Assim, torna-se necessrio o uso de nmero suficiente de solues-padro para definir adequadamente a relao entre a concentrao e a resposta. O grfico analtico pode ser construdo usando-se, no mnimo, cinco valores de concentrao enquadrados no intervalo definido (5, 8, 13-15). A suposio clssica do grfico de calibrao que a resposta instrumental y est linearmente relacionada com a concentrao do padro y, tal como: y = F(x) + ey Na qual: ey = erro randmico ou indeterminado (distribuio normal); y = sinal analtico (ou resposta instrumental). Geralmente, o erro randmico desprezado na relao, ficando y = F(x): F(x) = B + Sx Na qual: B = mdia das medidas do branco (ou linha de base); S = sensibilidade do mtodo; x = concentrao do analito na amostra. Julga-se satisfatria a linearidade do grfico quando o coeficiente de correlao da reta obtida no estatisticamente diferente da unidade (9). No caso, considera-se: R=1 0,91 < R < 0,99 0,61 < R < 0,91 0,31 < R < 0,60 0,01 < R < 0,30 R = zero Correlao perfeita Correlao fortssima Correlao forte Correlao mdia Correlao fraca Correlao nula

Embora sempre se busque obter relao linear entre a propriedade a ser medida e a concentrao ou quantidade do analito pode-se tambm admitir a relao no-linear (16) (por exemplo, nas anlises eletroqumicas, utilizando eletrodos de on seletivo ou biossensores).

2.3 INTERVALO DE TRABALHO O intervalo do mtodo analtico corresponde faixa do maior ao menor nvel que possa ser determinado com preciso e exatido, usando a linearidade do mtodo (13-15). Geralmente, os analistas seguem o caminho inverso. Primeiro, selecionam o intervalo de trabalho (baseado no nvel de concentrao do analito que desejam estudar) e depois determinam se a relao sinal versus concentrao linear.

2.4 LINEARIDADE A linearidade refere-se capacidade do mtodo de gerar resultados linearmente proporcionais concentrao do analito, enquadrados em faixa analtica especificada. Esse parmetro pode ser demonstrado pelo coeficiente de correlao do grfico analtico (13-17), que no deve ser estatisticamente

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diferente de 1 (avaliado pelo teste t de Student), observando-se que a inclinao da reta seja diferente de zero. Assim, necessrio obter coeficiente de correlao estatisticamente igual a um e coeficiente angular diferente de zero. A linearidade pode ser avaliada por meio da anlise de varincia ponderada (ANOVA ponderada). Considera-se que o grfico analtico satisfaz o critrio de linearidade quando quatro grficos mostrarem resultado positivo para esse teste ou quando trs forem lineares (12, 18) e aquele que no satisfizer as condies no nvel de significncia de 0,05 as satisfaa no nvel de 0,01 (Fa 0,05<Fobtido<Fa 0,01). Outra forma de avaliar a linearidade por meio da relao entre a concentrao recuperada e a de fortificao, que deve ser linear (2). Assim, estima-se a capacidade do mtodo em desviar-se linearmente da recuperao ideal (100%) (16).

2.5 SENSIBILIDADE A sensibilidade a capacidade do mtodo em distinguir, com determinado nvel de confiana, duas concentraes prximas (16). Sob o ponto de vista prtico, a sensibilidade constitui o coeficiente angular do grfico analtico (3, 19) expresso como:

S=

d d

Em mtodos sensveis, uma pequena diferena na concentrao do analito causa grande variao no valor do sinal analtico medido. Esse critrio expressa a capacidade do procedimento analtico gerar variao no valor da propriedade monitorada ou medida, causada por pequeno incremento na concentrao ou quantidade do analito. Entretanto, tornou-se comum o uso errneo desse termo para designar mtodo com baixo limite de deteco (LD) (16).

2.6 EXATIDO A exatido, definida como a concordncia entre o valor real do analito na amostra e o estimado pelo processo analtico (7, 13-16, 20-22), constitui a chave para o propsito da validao. Os quatro mtodos principais, propostos para o estudo da exatido, so baseados no uso de material de referncia certificado (MRC), na comparao do mtodo proposto com um mtodo de referncia, no uso de ensaios de recuperao na matriz e em estudos colaborativos (20). Os MRC (quando disponveis) so os materiais de controle preferidos, pois esto diretamente relacionados com padres internacionais. O processo de avaliao por meio de MRC consiste em analisar nmero suficiente de replicatas desse material e comparar os resultados obtidos com o valor certificado. Entretanto, o alto custo do MRC e a abrangncia limitada de matrizes e analitos restringem seu uso (21). A exatido tambm pode ser estabelecida mediante comparao entre os valores obtidos pelo mtodo proposto com os valores obtidos para as mesmas amostras com outro mtodo validado (mtodo com preciso e exatido avaliadas). Aps anlise de diferentes amostras com ambos os mtodos, as diferenas obtidas para cada amostra so calculadas e comparadas com o valor desejado (nesse caso, zero). Estabelece-se, ento, o nvel de confiana de acordo com o intervalo de concentrao (menores valores de concentrao causam maior disperso dos dados aumentando o limite de confiana) (16). Entretanto, nem sempre se encontra mtodo de referncia preexistente, impossibilitando a utilizao desse tipo de proposta (20). Estudos colaborativos implicam na aceitao de pelo menos oito laboratrios (nmero mnimo) em desenvolver determinado mtodo. Somente quando for impossvel reunir tal nmero de laboratrios, o estudo poder ser conduzido com o mnimo absoluto de cinco participantes (22). A maior dificuldade
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freqentemente encontrada quando se tenta estabelecer a exatido do mtodo por meio de estudos colaborativos envolve a garantia de estabilidade do analito (assegurar que a concentrao do analito, a ser determinada na amostra, permanea estvel durante o decorrer do estudo). Isso torna-se particularmente difcil com compostos lbeis (7, 21). No processo de validao em estudos colaborativos usa-se a anlise de varincia (ANOVA), que determina a existncia de diferenas significativas entre os valores obtidos pelos laboratrios envolvidos (16). O ensaio de recuperao constitui o mtodo mais utilizado para validao de processos analticos. A recuperao est relacionada com a exatido, pois reflete a quantidade de determinado analito, recuperado no processo, em relao quantidade real presente na amostra. A exatido expressa como erro sistemtico percentual, inerente ao processo (12, 20). O erro sistemtico ocorre pela perda da substncia devido baixa recuperao da extrao, medidas volumtricas imprecisas ou substncias interferentes na amostra (entre outros). O estudo da recuperao consiste na "fortificao" da amostra (Figura 1), ou seja, na adio de solues com diferentes concentraes do analito de interesse seguida pela determinao da concentrao do analito adicionado. Calcula-se a quantidade percentual recuperada pelo processo (3) usando a frmula:

Re c % =

[valor

obtido valor real valor real

100

FIGURA 1 - PROCESSO DE FORTIFICAO DAS AMOSTRAS

Maior N vel de Fortifica o

Solu o Estoque

Nvel M de Fortifica o dio

Solu es de Fortifica o

Fortifica o da Amostra

Menor N vel de Fortifica o

FONTE: BRITO, 2001 (13).

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No estudo da recuperao so realizados testes de significncia, utilizando o teste "t" de Student de acordo com a seguinte frmula (23):

t=

(Re c 100) S Re c n 1

Na qual: Rec = a mdia das recuperaes obtidas para n repeties; 100 = a recuperao percentual desejada; n = o nmero de determinaes (trabalha-se com no mnimo 5 repeties); SRec = o desviopadro das recuperaes. Se o valor de t obtido estiver enquadrado no intervalo estabelecido pelo valor tabelado, para n 1 graus de liberdade em dado nvel de significncia, ento o mtodo ser considerado exato (24). Alm de efetuar o teste "t" de Student, existem valores crticos aceitveis de acordo com a concentrao do analito em estudo. Esses valores so estimados considerando-se que anlises de elementos majoritrios costumam apresentar erros sistemticos relativos muito inferiores queles obtidos para analitos em concentraes muito pequenas. Tais valores, sugeridos pelo manual da Association of Official Analytical Chemists (AOAC) so apresentados na Tabela 1.

TABELA 1 - RECUPERAO DO ANALITO EM FUNO DA CONCENTRAO

Concentrao do analito (%) > 10 > 1 > 0,1 > 0,01 > 0,001 - > 0,00001 > 0,000001 > 0,0000001
Fonte: BRITO, 2001 (13).

Intervalo de Recuperao Aceito (%) 98-102 97-103 95-105 90-107 80-110 60-115 40-120

Deve-se ressaltar que o processo de fortificao tenta simular condies reais, no interferindo significativamente nas interaes que ocorrem na prpria amostra. Isso nem sempre possvel, visto que a soluo de fortificao preparada com solventes orgnicos, geralmente no-presentes na matriz. Por essa razo, tenta-se usar volume reduzido de soluo de fortificao e condies que alterem a amostra o mnimo possvel (16, 25).

2.7 PRECISO O parmetro que avalia a proximidade entre vrias medidas efetuadas na mesma amostra a preciso do processo analtico. Usualmente, expressa como o desvio-padro, varincia ou coeficiente de variao (CV) de diversas medidas (2, 17). O CV dado pela seguinte equao:

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CV % =

s 100 M

Na qual: s = desvio-padro das recuperaes e M = mdia das recuperaes. Para anlise de resduos (26) de pesticidas, por exemplo, consideram-se aceitveis coeficientes de variao de at 20%. Segundo WOOD (27), o coeficiente de variao (ou desvio-padro relativo) est relacionado com o nvel de concentrao do analito na amostra, definido pela equao: CV(%) = 2(1-0,5logC), na qual C a concentrao do analito. Desse modo, substituindo-se os nveis de concentrao nessa equao obtm-se os valores CV apresentados na Tabela 2. TABELA 2 - COEFICIENTES DE VARIAO EM FUNO DO NVEL DE CONCENTRAO DO ANALITO

Concentrao do analito (%) 1 (100%) 10-1 10-2 (1%) 10-3 10-4 10-5 10-6 (ppm) 10-7 10-8 10-9 (ppb)
Fonte: WOOD, 1999 (27).

Coeficiente de Variao (%)

2 2,8 4 5,6 8 11 16 23 32 45

A preciso pode ser considerada no nvel de repetitividade, de preciso intermediria e de reprodutividade (2, 3, 13-15, 22). A repetitividade expressa a preciso nas mesmas condies de operao (equipamento, analista, reagentes, dia e mesmas condies ambientais) em pequeno espao de tempo. Repetitividade, tambm conhecida como preciso intra-ensaios (13-15), pode ser avaliada com no mnimo nove determinaes dentro do intervalo de trs diferentes concentraes e trs replicatas cada, ou com no mnimo seis determinaes para uma nica concentrao-teste (14). A preciso intermediria expressa as variaes no mesmo laboratrio que envolvem diferentes dias, diferentes analistas e diferentes equipamentos, entre outros (13, 14). Tal termo tem sido pouco empregado e esses testes no so comumente citados na literatura. A reprodutividade expressa a preciso entre laboratrios, mediante estudos colaborativos usualmente aplicados para padronizao de metodologias (14, 15). O mtodo ser considerado preciso quando apresentar nveis de variaes dentro do aceitvel para cada nvel de concentrao conforme apresentado na Tabela 2.
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2.8 LIMITE DE DETECO A menor concentrao do analito que pode ser detectada, mas no necessariamente quantificada, sob condies experimentais estabelecidas constitui o limite de deteco (13-15, 18, 28-31). Analistas, quando desenvolvem mtodos novos ou modificados para anlise de traos, freqentemente definem Limites de Deteco (LD) em termos do desvio-padro de medidas do branco. Entretanto, sendo o branco constitudo de todos os reagentes, com exceo da amostra e do analito, no reproduz as mesmas condies a que o analito estar sujeito durante a anlise (16, 25, 28). O LD determinado dessa forma pode avaliar mudanas ocorridas durante o desenvolvimento do mtodo, ou para comparao de instrumentos. Entretanto, em relao anlise prtica, esses valores so extremamente baixos e no representam a realidade (16, 25, 28). O limite de deteco pode ser determinado mediante o sinal/rudo, o desvio-padro da resposta e do coeficiente angular e por processos estatsticos. O sinal/rudo pode ser aplicado somente para processos analticos que exibem linha de base. A determinao da razo sinal/rudo realizada por meio da comparao dos sinais medidos da amostra com baixas concentraes conhecidas do analito com as do branco, estabelecendo-se a concentrao mnima na qual o analito pode ser detectado. A razo sinal/rudo com valor 3 geralmente considerada aceitvel para estimar o limite de deteco (13-15, 31). O limite de deteco pode ser expresso pela equao abaixo (13-15, 28-31):

LD =

3 s S

Na qual: s = desvio-padro da resposta; S = o coeficiente angular do grfico de calibrao (sensibilidade do aparelho). No caso dos processos estatsticos, utiliza-se o "teste de hiptese" para estimar o LD com valores obtidos de vrias medidas do branco pela seguinte equao (16, 25, 26):

LD =

2 tn,95% sB S

Na qual: tn, 95% = valor tabelado em funo de n (nmero de anlises); sB = desvio-padro do branco; S = sensibilidade do aparelho. Quando se obtm poucos valores de medidas do branco ou quando tais valores se apresentam como linha de base, esse tipo de estimativa pode no ser adequado. O LD pode ser estimado pelos experimentos de recuperao (26) mediante o desvio-padro (sA) do menor nvel de fortificao, calculando-se scom a partir de sA e sB :

s com =

(m 1)s A 2 + (n 1)s B 2
m+n2

Na qual: m = o nmero de determinaes do menor nvel de fortificao; n = o nmero de determinaes do branco; SA = desvio-padro da amostra do menor nvel de fortificao; SB = desvio-padro do branco. A partir desse valor estima-se o limite de deteco pela equao (26):

LD =
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2 t n ,95% s com S

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No processo estatstico so considerados todos os efeitos a que o mtodo est sujeito (variaes do branco e variaes da amostra fortificada no menor nvel).

2.9 LIMITE DE QUANTIFICAO O limite de quantificao definido como a menor concentrao do analito, que pode ser quantificada na amostra, com exatido e preciso aceitveis, sob as condies experimentais adotadas (13-15, 18, 28-31). Pode ser estimado por meio do sinal/rudo, do desvio-padro e por processos estatsticos. O procedimento sinal/rudo pode ser aplicado somente para processos analticos que exibem linha de base. Efetua-se a determinao da razo sinal/rudo por meio da comparao dos sinais medidos da amostra com baixas concentraes conhecidas do analito com as do branco, estabelecendo-se a concentrao mnima na qual o analito pode ser quantificado (13-15, 31). Exemplo de razo sinal/rudo tpica 10:1. O limite de quantificao (LQ) pode ser expresso pela equao abaixo (13-15, 18, 28-31):

LQ =

10 s S

Na qual: s = desvio-padro da resposta; S = o coeficiente angular do grfico de calibrao (sensibilidade do mtodo). De acordo com o procedimento estatstico utilizado para anlise de resduos de pesticidas, o LQ corresponde ao menor nvel de fortificao estudado (16, 25, 26). A recuperao pode variar entre 70 e 120%, com coeficiente de variao de at 20%.

2.10 ROBUSTEZ Segundo a International Conference on Harmonisation (ICH), a robustez do mtodo a medida da sua capacidade de permanecer inalterado sob pequenas, mas estudadas variaes nos parmetros do mtodo e prover indicao da sua dependncia durante o uso normal (24, 32, 33). A avaliao da robustez pode ser considerada durante a fase de desenvolvimento e depende do tipo de processo em estudo. Nos testes de robustez so aplicados experimentos estatsticos que examinam, simultaneamente, os efeitos de alteraes em diferentes variveis do mtodo. No caso de mtodos cromatogrficos, as variaes referem-se a diferentes tipos de colunas, temperatura e fluxo, entre outras (32). Os testes de robustez, em geral, servem para indicar os fatores que podem influenciar, significantemente, a resposta do mtodo estudado. Tal fato fornece a dimenso do problema que ocorre quando o mtodo repetido em diferentes condies ou transferido, por exemplo, para outro laboratrio (33).

3 ESTRATGIA DE VALIDAO EM FUNO DA NATUREZA E DO PROPSITO DO MTODO A estratgia a ser seguida na validao do mtodo analtico apresenta natureza cclica, semelhante a uma corrente de decises, aes e procedimentos (34), como mostrado esquematicamente na Figura 2.

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Caso o ltimo passo da validao (interpretao dos resultados da anlise) no fornea resposta satisfatria, o ciclo da anlise poder ser refeito depois da adaptao de um ou mais passos. Para que os resultados sejam confiveis imperioso que as variaes analticas sejam mantidas dentro de limites preestabelecidos por critrios baseados na finalidade de anlise, sistemas analticos e estudos estatsticos (12). Os critrios a serem aplicados para validao de determinado mtodo depende da sua natureza e propsito. Usa-se a distino entre mtodo "novo", "padro" e "modificado" para caraterizar sua natureza. Mtodo padro, nessa definio, o mtodo completamente validado (com todos os parmetros estabelecidos). Por outro lado, os mtodos so tambm classificados de acordo com o seu propsito, por exemplo, qualitativo/quantitativo ou anlise traos versus componente majoritrio (34). A validao requerida para tais mtodos est resumida na Figura 3.

FIGURA 2 - ANLISE QUMICA COMO UM PROCESSO CCLICO

Interpreta o dos resultados

Defini o do problema Defini o da an lise do problema

Processamento dos resultados Defini o do objeto da amostra An lise (separa o e detec o) Tratamento da amostra

Estrat de gia amostragem e t cnicas

Fonte: Brito, 2001 (13).

Os parmetros exatido e preciso constituem a chave para o processo de validao. So requeridos para todos os estudos de validao de mtodos, exceto para aqueles com propsito qualitativo, que se destinam apenas a acusar a presena de um analito. Para a anlise quantitativa de elementos traos necessrio validar os limites de deteco e de quantificao. J para anlises qualitativas obrigatrio validar apenas o limite de deteco. A avaliao do parmetro da linearidade obrigatria para mtodos novos e anlises qualitativas de componentes majoritrios.

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FIGURA 3 - DEFINIO DOS CRITRIOS A SEREM EMPREGADOS DE ACORDO COM O MTODO EM ESTUDO
Sempre Se relevante N o necess rio
Limite de Detec o Exatid o Precis o M todos Novo Padr o Modificado

Especificidade

Linearidade
Limite de Quantifica o

Sempre N o necess rio

Limite de Quantifica o Limite de Detec o Exatid o Precis o M todos
Qualitativo (identifica o, confirma o) Quantitativo ( componente majorit rio) Quantitativo ( an de tra os) lise

Especificidade Linearidade

Fonte: Brito, 2001 (13).

4 ESTUDO DE CASO: ANLISE DE HERBICIDAS EM AMOSTRAS DE SOLO Para avaliao dos parmetros tratados, o trabalho de POLESE et al. sobre anlise de resduos de pesticidas foi selecionado na literatura (35) e submetido aos critrios aplicveis. 4.1 FUNO DA RESPOSTA (GRFICO ANALTICO), INTERVALO DE TRABALHO E SENSIBILIDADE No estudo escolhido no foi investigada a linearidade do mtodo, que seria a busca pelo intervalo de concentraes para obter relao linear entre a concentrao e o sinal de resposta (altura do pico). Os autores selecionaram a faixa de concentrao de trabalho indicada aos nveis de concentrao que almejavam investigar e verificaram se este intervalo apresentava a relao linear desejada. Nesse procedimento, o intervalo de trabalho foi definido pelo analista em funo da resposta (ou grfico analtico) para obter a sensibilidade do mtodo (Tabela 3).
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Observou-se que o intervalo de trabalho escolhido guarda excelente relao linear com o sinal analtico, denotado pelos valores de coeficiente de correlao extremamente prximos de 1. Do mesmo modo, o mtodo apresentou grande sensibilidade, pois os coeficientes angulares das retas apresentaram valores elevados. Isso significa que com pequenas variaes na concentrao obtm-se grandes variaes nos sinais medidos, garantindo a diferenciao entre duas concentraes bastante prximas. TABELA 3 - EQUAES DO GRFICO ANALTICO, COEFICIENTES DE CORRELAO E INTERVALO DE TRABALHO

Pesticidas Diisopropilatrazina Dietilatrazina Trifluralina Simazina Atrazina Metribuzina Metolaclor

Intervalo de trabalho (mg/L)

0,2 a 5,2 0,2 a 4,7 0,5 a 10,2 0,2 a 5,0 0,3 a 5,3 0,3 a 5,3 0,5 a 10,0

Equa es

Coeficientes de correla o
0,9992 0,9995 0,9999 0,9994 0,9997 1,0000 0,9998

y = 4355,7x - 839,83 y = 5496x - 804,23 y = 1742,5x - 322,52 y = 7829,9x - 1189,2 y = 6671x - 804,78 y = 2852,7x - 234,72 y = 1358,4x - 24,886

4.2 EXATIDO E PRECISO O clculo da recuperao para amostras fortificadas pode ser realizado computando-se as recuperaes individuais para cada nvel de fortificao do analito(i), avaliando-se a recuperao por meio de sua mdia (ii), ou analisando a regresso linear da concentrao obtida e a concentrao de fortificao (iii) (21). Para ilustrar as diferentes formas de avaliao foram utilizados os resultados de POLESE et al. (35) referentes anlise de sete herbicidas por Cromatografia em Fase Gasosa com Detector Terminico Especfico (CG-DTE) em amostras de solo.

4.3 AVALIAO DA EXATIDO PELO ESTUDO DAS RECUPERAES INDIVIDUAIS Para avaliar a abrangncia da exatido foram estudados trs nveis de fortificao e, para cada nvel, efetuadas quatro determinaes (35). Os valores de recuperao obtidos para os pesticidas so apresentados na Tabela 4. Usou-se o teste de hiptese para confirmar a exatido do mtodo, sendo estabelecida como hiptese nula (H0): Rec. = 100% e como hiptese alternativa (H1): Rec. 100% (teste bilateral). O teste t aplicado, com 95% de confiana e n-1 graus de liberdade, apresentou valores calculados entre os intervalos estabelecidos pelo valor tabelado (4,17), com exceo dos resultados obtidos para Diisopropilatrazina (1,0 e 2,0 mg kg-1), Trifluralina (4,0 mg kg-1), Simazina (2,0 mg kg-1), Atrazina (2,0 mg kg-1), Metribuzina (1,0 e 2,0 mg kg-1) e Metolaclor (4,0 mg kg-1). Para estes compostos, nos nveis de fortificao citados, pode-se afirmar que existem diferenas significativas entre as recuperaes obtidas e o valor esperado (100%), com 95% de confiana e 3 graus de liberdade.
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TABELA 4 - RECUPERAES PERCENTUAIS E CV DOS COMPOSTOS ANALISADOS POR CG

P e s tic id a s D iis o p ro p ila tra z in a D ie tila tra z in a T riflu ra lin a S im a z in a A tra z in a M e trib u z in a M e to la c lo r N vel m g k g -1
0 ,1 1 ,0 2 ,0 0 ,1 1 ,0 2 ,0 0 ,2 2 ,0 4 ,0 0 ,1 1 ,0 2 ,0 0 ,1 1 ,0 2 ,0 0 ,1 1 ,0 2 ,0 0 ,2 2 ,0 4 ,0

R e c u p e ra o M d ia (% )
84 81 83 95 103 92 109 103 115 93 102 95 105 102 108 98 109 113 104 95 112

CV %
1 2 ,0 3 ,6 3 ,6 8 ,4 1 1 ,0 6 ,8 1 0 ,5 8 ,0 3 ,6 8 ,0 5 ,8 2 ,0 5 ,5 3 ,0 1 ,2 1 2 ,7 3 ,8 1 ,3 2 ,1 5 ,3 2 ,6

t c alc u lad o
-2 ,7 5 -1 1 ,2 9 -9 ,8 5 -1 ,0 8 0 ,4 6 -2 ,2 1 1 ,3 6 0 ,6 3 6 ,2 7 -1 ,6 3 0 ,5 8 4 ,5 6 1 ,5 0 1 ,1 3 1 0 ,6 9 -0 ,2 8 3 ,7 6 1 5 ,3 2 3 ,1 7 -1 ,7 2 7 ,1 4

n = 4; CV = Coeficiente de Variao.

Fonte: POLESE et al., 2002 (35).

Para o teste t com 99% de confiana (teste menos restritivo) tem-se o valor tabelado de t igual a 7,45. Os compostos Diisopropilatrazina (1,0 e 2,0 mg kg-1), Atrazina (2,0 mg kg-1) e Metribuzina (1,0 e 2,0 mg kg-1) apresentaram diferenas significativas entre os valores obtidos e o esperado (100%). Embora no satisfaa esse teste, o mtodo foi considerando suficientemente exato, pois as recuperaes esto compreendidas na faixa entre 70 e 120%, estabelecida pela literatura na rea de anlise de resduos de pesticidas (13, 25, 26, 35). Apesar dos valores de recuperao encontrados serem significativamente diferentes de 100% so aceitveis por se repetirem em todas as amostras, evidenciando a consistncia do mtodo. Fato comprovado pelo estudo da preciso. Para o estudo da preciso, os coeficientes de variao (obtidos a partir dos valores referentes ao ensaio de recuperao) foram considerados adequados (iguais ou inferiores a 20%) conforme recomendado por THIER e ZEUMER (13, 25, 26, 35). Como todos os valores de CV mostraram-se inferiores ao estabelecido, o mtodo proposto foi considerado preciso.

4.4 AVALIAO DA EXATIDO PELO ESTUDO DAS MDIAS DAS RECUPERAES Para avaliar a exatido pode-se calcular as mdias dos trs nveis de fortificao. Os valores calculados para os resultados obtidos por POLESE et al. (35), apresentados na Tabela 5, permaneceram enquadrados na faixa estabelecida para a anlise de resduos de pesticidas (entre 70 e 120%) descritos na literatura (13, 25, 26, 35). Os valores foram submetidos ao teste de hiptese, sendo estabelecida como hiptese nula (H0): Rec. = 100% e como hiptese alternativa (H1): Rec. 100% (teste bilateral). Obteve-se a aceitao da hiptese nula para todos os compostos com exceo dos valores observados para Diisopropilatrazina, tanto com 95% quanto com 99% de confiana. Os valores de CV indicaram que o mtodo mostrou-se suficientemente preciso de acordo com o estabelecido na literatura (13, 25, 26, 35). Cabe ressaltar que esse mtodo de avaliao fornece viso muito geral dos valores de recuperao obtidos, deixando de esclarecer quais nveis de fortificao no se enquadraro no intervalo de linearidade do mtodo (ao contrrio do procedimento anterior).
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TABELA 5 - MDIAS DAS RECUPERAES E CV DOS COMPOSTOS ANALISADOS POR CG

N vel mg kg -1
0,1-2,0 0,1-2,0 0,2-4,0 0,1-2,0 0,1-2,0 0,1-2,0 0,2-4,0

Pesticidas Diisopropilatrazina Dietilatrazina Trifluralina Simazina Atrazina Metribuzina Metolaclor

n = 4; CV = Coeficiente de Variao. Fonte: POLESE et al., 2002 (35).

Recupera o Mdia (%)

83 97 109 97 105 107 104

CV %
1,8 5,9 5,5 4,9 2,9 7,3 8,2

t calculado
-16,05 -0,83 2,12 -1,00 2,36 1,21 0,61

4.5 AVALIAO DA EXATIDO PELO ESTUDO DA REGRESSO LINEAR Pelo estudo da regresso linear pode-se verificar se as recuperaes apresentam distribuio linear com relao aos nveis de fortificao (os coeficientes de correlao fornecem a informao relativa a esse aumento proporcional). Cabe ressaltar que os parmetros mais importantes nesse estudo so os coeficientes angulares e lineares das retas. Considerando que se pretende comprovar que so obtidas recuperaes numericamente iguais s concentraes de fortificao, o coeficiente linear deve ser o mais prximo possvel de zero e o coeficiente angular igual a 1. As retas construdas a partir do estudo de POLESE et al. (2002) (Figuras 4 e 5), mostraram excelentes coeficientes de correlao. As equaes dessas retas so apresentadas na Tabela 6. FIGURA 4 - LINEARIDADE DA RELAO ENTRE A CONCENTRAO RECUPERADA E A CONCENTRAO DE FORTIFICAO, COM NVEIS VARIANDO ENTRE 0,1 E 2,0 mg/kg
2,5

Deisopropilatrazina Dietilatrazina Simazina

R 2 = 0,9998 R 2 = 0,9949

R 2 = 0,9979 R 2 = 0,9989

Concentra o recuperada (mg/kg)

Atrazina Metribuzina

R 2 = 0,9997

1,5

Linear (Deisopropilatrazina) Linear (Dietilatrazina) Linear (Simazina)

Linear (Atrazina) Linear (Metribuzina)

0,5

0 0 0,5 1 1,5 2 2,5

Concentra o de fortifica o (mg/kg)

142 Pesticidas: R.Ecotoxicol. e Meio Ambiente, Curitiba, v. 13, jan./dez. 2003

FIGURA 5 - LINEARIDADE DA RELAO ENTRE A CONCENTRAO RECUPERADA E A CONCENTRAO DE FORTIFICAO, COM NVEIS VARIANDO ENTRE 0,2 E 4,0 mg/kg
5 4,5

Trifluralina Metaloclor Linear (Trifluralina) Linear (Metaloclor)

R2 = 0,9962 R2 = 0,9921

concentra o recuperada (mg/kg)

4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 0,5

1,5

2,5

3,5

4,5

Concentra o de fortifica o (mg/kg)

A Simazina e a Atrazina apresentaram os coeficientes angulares mais prximos da unidade e a Diisopropilatrazina o coeficiente linear mais prximo de zero. Como o trabalho estudado no forneceu dados suficientes para o teste t dos valores de a e b das equaes da reta no foi possvel afirmar a existncia de diferenas significativas entre esses valores, a nulidade e a unidade, respectivamente. TABELA 6 - EQUAES DAS REGRESSES LINEARES PARA A RELAO ENTRE AS CONCENTRAES DE FORTIFICAO E AS ADICIONADAS

Princ pio ativo Diisopropilatrazina Dietilatrazina Simazina Atrazina Metribuzina Trifluralina Metaloclor

Equa o y = 0,8299x - 0,0062 y = 0,9164x + 0,0414 y = 0,9497x + 0,0229 y = 1,0827x - 0,0237 y = 1,1385x - 0,0271 y = 1,1553x - 0,095 y = 1,1273x - 0,1337

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4.6 LIMITES DE QUANTIFICAO E DE DETECO De acordo com o mtodo de THIER e ZEUMER (1987), o Limite de Deteco (LD) calculado com base nos resultados para o menor nvel de fortificao. O Limite de Quantificao o menor nvel de concentrao em que se conhecem a exatido e a preciso do mtodo (26, 36). Os valores de LD e LQ esto apresentados na Tabela 7. TABELA 7 - VALORES DE LD E LQ PARA OS SETE COMPOSTOS INVESTIGADOS
P e s tic id a s D iis o p ro p ila tra z in a D ie tila tra z in a T riflu ra lin a S im a z in a A tra z in a M e trib u z in a M e to la c lo r
Fonte: POLESE et al., 2002 (35).

L D (m g k g -1 )
0 ,0 3 0 ,0 2 0 ,0 6 0 ,0 2 0 ,0 2 0 ,0 4 0 ,0 1

L Q (m g k g -1 )
0 ,1 0 ,1 0 ,2 0 ,1 0 ,1 0 ,1 0 ,2

Os valores reportados foram considerados satisfatrios (suficientemente baixos), principalmente, para o propsito do mtodo (a anlise de resduos de herbicidas em amostras de solo). Cabe ressaltar que o procedimento de THIER e ZEUMER indicado para a determinao do limite de deteco por considerar no apenas a capacidade do equipamento em detectar a quantidade de composto que injetada, mas todas as etapas do processo analtico, desde a extrao at a deteco.

5 CONCLUSO A validao essencial para definir se mtodos desenvolvidos esto completamente adequados aos objetivos a que se destinam, a fim de se obter resultados confiveis que possam ser satisfatoriamente interpretados. Desta forma, possibilita o conhecimento das limitaes e da confiabilidade nas medidas realizadas nas anlises. Dependendo do propsito do mtodo, alguns dos parmetros apresentados podem deixar de ser avaliados. A exatido e a preciso do mtodo constituem parmetros sempre estudados, independente do seu propsito, exceto para mtodos com objetivo apenas qualitativo. Deve-se ressaltar que o mtodo pode ser considerado validado, mesmo que alguns parmetros no se enquadrem nos limites estabelecidos na literatura, mas que sejam criteriosamente conhecidos e, portanto, adequados aos objetivos do estudo a ser realizado.

ABSTRACT
ANALYTICAL METHODS VALIDATION: STRATEGY AND DISCUSSION This paper presents the definitions of the parameters (selectivity, limits of detection and quantification, accuracy, precision, linearity, analytical graphic, sensitivity and ruggedness) considered on analytical methods validation procedures. The

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strategy to be adopted for determinations of these parameters depends on the purpose and the nature of the method. Some examples are presented for parameters evaluation in a validation procedure.

KEY-WORDS: ANALYTICAL METHODS-VALIDATION; VALIDATION CRITERIA.

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