APOSTILA DO CURSO: INVESTIGAO DE PATERNIDADE & DNA

ALESSANDRA SIMES BASSINI RESPONSVEL PELO NCLEO DE PERCIAS LABORATORIAIS

VANESSA HELEN KIRALL SANTAELLA CHEFIA DE GABINETE DO IMESC SIDNEY CARVALHO JUNIOR SUPERINTENDENTE DO IMESC VNIA MARIA RUFFINI PENTEADO BALERA COORDENADORA DO CAO CVEL NELSON GONZAGA DE OLIVEIRA DIRETOR DO CEAF/ESMP 2007

CRONOGRAMA Data: 22/05/2007 e 24/05/2007 Horrio: das 19 s 22 h Carga horria: 6 horas Pblico-alvo: membros do Ministrio Pblico, Magistrados, Advogados e Estagirios. Local: sede da Escola Superior do Ministrio Pblico Endereo: Rua Minas Gerais, 316 4 andar.

PROGRAMA 22/05/2007: 19 22 h - Apresentao do curso - Distribuio de apostilas - Apresentao Institucional do IMESC - Laboratrio - Histrico dos Testes de Paternidade - Evoluo das Tcnicas utilizadas - Apresentao da tcnica utilizada atualmente pelo IMESC para coleta, extrao e genotipagem das amostras - Questionamentos e dvidas suscitadas - Agendamento das visitas, aos interessados, para conhecer o IMESC e o laboratrio ]24/05/2007: 19-22 h - Anlises de casos Trios - Estatsticas e clculos do ndice de Paternidade e Probabilidade de Paternidade para os casos Trios - Anlise de casos complexos: duos, paternidade reversa e esplios - Clculos estatsticos e do ndice de Paternidade e Probabilidade de Paternidade em casos complexos - Peculiaridades dos casos analisados - Questionamentos e dvidas suscitadas

1. INTRODUO O IMESC vem realizando percia de Investigao de Paternidade desde a dcada de 80, quando os testes ainda eram realizados pelo sistema de srie vermelha do sangue, que analisavam os sistemas ABO, Rh, Kell-Cellano, MnSs, Duffy e Kidd. Esses testes eram sorolgicos, e avaliavam a ligao de antgenos a seus anticorpos, formando assim uma lgica com relao paternidade. Com o passar dos anos foi associado anlise da srie vermelha o exame de HLA, que tambm um exame sorolgico, porm com pesquisa de antgenos nos glbulos brancos. Algum tempo depois o Instituto automatizou essas tcnicas, o que culminou com o aumento da produo do laboratrio. Porm a associao dos testes de srie vermelha e HLA no eram suficientes para solucionar todos os casos. Com os avanos na rea de biologia molecular e o advento da tcnica de PCR (Reao em Cadeia da Polimerase) houve um salto na qualidade dos exames de paternidade, a possibilidade de armazenamento das amostras por um tempo muito grande (facilitando os casos que necessitavam de contraprova) e resolvendo os casos que antes no eram solucionados pelas tcnicas disponveis. Alguns anos depois, surgiram os seqenciadores automticos, que atualmente so utilizados pela Autarquia, possibilitando uma grande automao na obteno de dados e na sua anlise. A automao dessa etapa to trabalhosa do processo de anlise de DNA aliada ao aumento no nmero de peritos e a melhoria da sua capacitao, resultou num aumento significativo na produo do laboratrio. Hoje o Laboratrio de Percias de Paternidade do IMESC libera mais de 2.000 laudos, diminuindo a fila de espera por resultados e permitindo que se faa um nmero de coletas/ms cada vez maior, reduzindo tambm o tempo de espera para a coleta do exame aps a solicitao judicial.

2. AS TCNICAS Os grupos sangneos so constitudos por antgenos que so a expresso de genes herdados da gerao anterior. Quando um antgeno est presente, isto significa que o indivduo herdou o gene de um ou de ambos os pais, e que este gene poder ser transmitido para a prxima gerao. O gene uma unidade fundamental da hereditariedade, tanto fsica ,quanto funcionalmente. Sistema ABO

H vrios sistemas de grupos sangneos herdados independentemente entre si, entre eles podemos citar os sistemas ABO, Rh, MNSs, Kell, Lewis e outros. O sistema ABO foi descoberto em 1900 por Landsteiner. Fazem parte deste sistema os trs genes A, B e O podendo qualquer um dos trs ocupar o loco ABO em cada elemento do par de cromossomos responsveis por este sistema. O indivduo do grupo AB possuidor de um gene A e de um gene B, tendo sido um herdado da me e o outro do pai. Ele possui nos seus glbulos vermelhos os antgenos A e B, seu gentipo AB (I AIB), e no possuem anticorpos ou aglutininas correspondentes. No caso do grupo O, foi herdado do pai e da me o mesmo gene O, o qual amorfo, isto , no produz antgeno perceptvel. As clulas do grupo O so reconhecidas pela ausncia de antgeno A ou B, com gentipo OO (IOIO) e presena das aglutininas anti-A e anti-B. Quando o gene O herdado ao lado de A, apenas o gene A se manifesta, com produo de antgeno A e aglutinina anti-B, agora o gentipo AO (I AIO); e se herdado ao lado de B apenas o gene B se manifesta, produzindo-se antgeno B e aglutinina anti-A, cujo gentipo BO (I BIO). Em que IA o alelo para antgeno A, IB o alelo para o antgeno B e IO o alelo que no corresponde a nenhum antgeno. No ocorre dominncia entre os dois primeiros, mas somente entre esses e o terceiro. Em testes laboratoriais, no possvel diferenciar os indivduos AO e AA, e nem BO e BB. Os smbolos A e B, quando se refere a grupos, indicam fentipos, enquanto que AA, BO so gentipos. FEN GEN ANT AGLUT TIPO TIPO GENO ININA A AO A anti-B (IAIO) AA A anti-B (IAIA) O OO nenhu Anti-A e (IOIO) m anti-B B BO B anti-A (IBIO) BB B anti-A (IBIB) AB AB AB nenhuma A B (I I ) Um indivduo dito homozigoto quando possuidor de genes iguais (AA, BB, OO) e heterozigoto quando os genes so diferentes (AO, BO, AB). Sistema MNS Em 1927, foram descobertos os antgenos M e N. Mas este caso difere, do anterior, pelo fato de nunca terem sido identificados os anticorpos correspondentes, no sangue humano. Os anti-soros (com os anticorpos respectivos, portanto) so produzidos artificialmente, pela injeo de antgenos em coelhos. Com o auxlio destes anti-soros, chegou-se a concluso de que existem trs tipos de pessoas: as que possuem o antgeno M, as que possuem o N e as que possuem M e N. Os estudos genticos correspondentes levaram concluso de que dois alelos, M e m, mais freqentemente chamado M e N, so responsveis pela produo daqueles antgenos e no ocorre dominncia. Assim: TIPO TIPO M N MN MM NN MN GEN SORO Anti-M + + Anti-N + + REAO COM ANTI-

Mais recentemente, em 1947 e 1951, foram descobertos dois novos anti-soros, o anti-S e o anti-s, que levaram a uma subdiviso dos grupos iniciais. O sangue humano, quanto aos dois novos anti-soros, pertence a trs grupos: os aglutinados somente pelo primeiro, somente pelo segundo, e por ambos. Consequentemente existem agora quatro alelos no loco MNS: MS, Ms, NS, Ns. Fator Rh Um terceiro sistema de grupos sangneos foi descoberto a partir dos experimentos desenvolvidos por Landsteiner e Wiener, em 1940, com sangue de macaco do gnero Rhesus. Esses pesquisadores verificaram que ao se injetar o sangue desse macaco em cobaias, havia produo de anticorpos para combater as hemcias introduzidas. Ao centrifugar o sangue das cobaias obteve-se o soro que continha anticorpos anti-Rh e que poderia aglutinar as hemcias do macaco Rhesus. As concluses da obtidas levariam a descoberta de um antgeno de membrana que foi denominado Rh ( Rhesus), que existia nesta espcie e no em outras como as de cobaia e, portanto, estimulavam a produo anticorpos, denominados anti-Rh. Analisando o sangue de muitos indivduos da espcie humana, Landsteiner verificou que, ao misturar gotas de sangue dos indivduos com o soro contendo anti-Rh, cerca de 85% dos indivduos apresentavam aglutinao e 15% no apresentavam. Definiu-se, assim, o grupo sangneo Rh + (apresentavam o antgeno Rh) e o grupo Rh - (no apresentavam o antgeno Rh). No plasma no ocorre naturalmente o anticorpo anti-Rh, de modo semelhante ao que acontece no sistema Mn. O anticorpo, no entanto, pode ser formado se uma pessoa do grupo Rh -, recebe sangue de uma pessoa do grupo Rh +. Esse problema nas transfuses de sangue no to grave, a no ser que as transfuses ocorram repetidas vezes, como tambm o caso do sistema MN.

Os trs sistemas de grupos sangneos: ABO, MN e Rh, transmitem-se independentemente. Tambm o fator Rh determinado por um loco em que se situam dois genes alternativos: D e d. Sendo D dominante em relao d, os indivduos Rh negativos so representados por homozigotos recessivos, como se v em resumo na tabela:
GENTIP O DD Dd dd Rh positivo Rh negativo FENTIPO

Tambm neste sistema sangneo, os casamentos podem ser de seis tipos conforme o gentipo dos cnjuges. Os indivduos homozigotos recessivos so produzidos pelo cruzamento de dois cnjuges heterozigotos (Dd x Dd), um cnjuge heterozigoto com outro homozigoto recessivo (Dd x dd) ou de cnjuges homozigticos recessivos (dd x dd). O segundo cruzamento (Dd x dd) se torna muito importante quando o cnjuge homozigoto recessivo (Rh negativo) a mulher. Os indivduos Rh negativo, quando recebem sangue de doadores Rh positivos, produzem, como o coelho que recebe o sangue do macaco Rhesus, anticorpos Rh. Durante uma segunda transfuso, esses anticorpos aglutinam as hemcias Rh positivos do doador causando hemlise, isto , destruio das hemcias no receptor que no sendo medicado, pode sucumbir. As mulheres Rh negativas podem produzir fenmeno semelhante em seus filhos Rh positivo. O Sistema FISHER sabido agora que o sistema Rh muito complexo, e o conhecimento atual baseado no sistema Fisher. Existem trs genes determinando o antgeno Rhesus: C, D e E, encontrados no cromossomo 1. Existem dois alelos possveis em cada lcus: c ou C; d ou D e e ou E. Um hapltipo consiste em c/C, d/D, e/E e herdado de cada um dos pais. O tipo resultante Rhesus de um indivduo depende do gentipo herdado. Aos hapltipos so dados cdigos. HAPLTIP O FISHER SISEMA

CDe CDE CDE CDe Cde CdE CdE Cde

R1 R2 Rz Ro r r Ry R

Se um gentipo Rh de um indivduo contm pelo menos um dos antgenos C, D, E eles so Rhesus positivo. Apenas indivduos com o gentipo cde/cde (rr) so Rhesus negativo. O mais comum anticorpo Rh anti-D, mas possvel formar anticorpos para c, C, e e E tambm, e formar combinaes de anticorpos. No existe o anti-d. O Sistema KELL Nesse sistema existem quatro antgenos em dois locos: K (Kell) e k (cellano); Kpa e Kpb. O fentipo Kp(a+) e o fentipo Kp(a-b-) so ambos raros. O Fentipo K- k- Kp(a-b-) associado a doena crnica granulomatus (CGD), um defeito hereditrio na capacidade bacteriana de neutrofilia. Anticorpos do sistema Kell so IgG. Nomeado pela famlia dos produtores de anticorpos Mrs Kellacher. O Sistema DUFFY O sistema Duffy tem tambm um nico loco com dois antgenos Fya e Fyb. O nico fentipo raro Fy(a-b-), que tem uma grande freqncia em pases onde h alta incidncia de plasmodium falciparium, malria. Esse fentipo responsvel por uma queda na imunidade da pessoa em relao doena porque o parasita da malria requer antgenos Duffy para entrar nas hemceas. Anticorpos Duffy so quase exclusivamente IgG. Esse sistema nomeado depois da famlia do produtor de anticorpos, Duffy. O Sistema KIDD (Jk) Outro sistema de loco nico, dois grupos de antgenos (Jka e Jkb). Existem quatro fentipos possveis: Jk(a-b-); Jk(a+b-); Jk(a-b+); Jk(a+b+). Jk(a-b-) um fentipo raro. Anticorpos do antgeno Kidd so quase exclusivamente IgG. Incompatibilidade na transfuso ou na gravidez pode levar a formao de anticorpos para todos esses grupos sanguneos, se o receptor/me no possui o antgeno relevante. possvel detectar todos os anticorpos das hemcias usando um painel de deteco de anticorpos e outras diferentes tcnicas. Se um anticorpo detectado em um soro, as hemcias desse paciente so testadas pela presena de antgenos. Tcnicas de deteco de antgenos tambm variam com a natureza da interao anticorpo- antgeno. A presena de um anticorpo particular exclui o paciente de carregar esse antgeno. O Sistema HLA No sistema HLA so observados conjuntos de genes co-dominantes que esto localizados no cromossomo 6 do homem e que se expressam como molculas de glicoprotenas na superfcie das clulas. Essas molculas so conhecidas como Antgeno Leucocitrio Humano assim pode se entender que temos genes HLA e antgeno HLA. Estes esto classificados em diversos locos (A, B, C, DR, DQ, DP), cada um com vrios alelos.
HLA-A A 1 A2 A203 5 B7 B703 w1 Cw2 Cw3 LA-B LA-C H LA-DR C R1 DR103 DR2 H LA-DQ D Q1 DQ2 DQ3 D H

A210 A3 A9 A10 A11 A19 A23(9) A24(9) A2403 A25(10) A26(10) A28 A29(19) A30(19) A31(19) A32(19) A33(19) A34(10) A36 A43 A66(10) A68(28) A69(28) A74(19)

B8 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B21 B22 B27 B35 B37 B38(16) B39(16) B3901 B3902 B40 B40(05) B41 B42 B44(12) B45(12) B46 B47 B48 B49(21) B50(21) B51(5) B5102 B5103 B52(5) B53 B54(22) B55(22) B56(22) B57(17) B58(17) B59 B60(40) B61(40) B62(15) B63(15) B64(14) B65(14) B67 B70 B71(70) B72(70) B73 B75(15) B76(15) B77(15) B7801 Bw4 Bw6

Cw4 Cw5 Cw6 Cw7 Cw8 Cw9(w3) Cw10(w3) Cw12 Cw13 Cw14 Cw15 Cw16 Cw17

DR3 DR4 DR5 DR6 DR7 DR8 DR9 DR10 DR11(5) DR12(5) DR13(6) DR14(6) DR1403 DR1404 DR15(2) DR16(2) DR17(3) DR18(3)

DQ4 DQ5(1) DQ6(1) DQ7(3) DQ8(3) DQ9(3)

DR51 DR52 DR53

Devido a diploidia (um cromossomo de origem materna e outro de origem paterna) de nossos cromossomos, com certeza teremos genes e antgenos HLA em dose dupla: dois alelos HLA do loco A, dois do loco B e assim por diante.

O conjunto de alelos no mesmo cromossomo chamado hapltipo e representa o material gentico herdado em bloco do pai ou da me. Com isso temos um hapltipo paterno e outro materno, ficando fcil, pois s encontrar no filho o hapltipo materno sendo que o outro ser de origem paterna; agora a presena no filho de um hapltipo no existente na me e no possvel pai caracteriza a excluso da paternidade.

Herana HLA em uma famlia. O filho n 5 recebeu o conjunto A23, B39 de sua me e o A24, B27 de seu pai biolgico, no estando presente no possvel pai acima. Sorologia HLA O estudo sorolgico do HLA feito por intermdio da analise dos antgenos na superfcie dos linfcitos do sangue dos participantes, usando anticorpos HLA. Estes anticorpos so de origem humana, ou produzidos pela tecnologia monoclonal, mas podem apresentar forte reao cruzada entre os alelos, necessitado de vrios reagentes para classificao correta dos antgenos da me, filho, e possvel pai. Portanto este mtodo possui algumas desvantagens como: - necessidade de estudarmos as clulas do sangue logo aps a coleta (precisam estar vivas) - obrigatoriedade de se trabalhar com painel de anticorpos especficos e que identifiquem com certeza todos os antgenos do sistema HLA - a presena de reaes cruzadas podem ser prejudiciais para analisarmos certas situaes - a existncia de indivduos homozigotos pode limitar a sorologia, pois se fica sem saber se a falta de um alelo no estudo da famlia devido a homozigose ou pela no identificao de um alelo raro o qual o laboratrio no tem reagente. Tipagem Molecular do sistema HLA H pouco tempo foi introduzida uma nova tecnologia, que permite avaliar diretamente todos os genes HLA apresentando vrias vantagens ao estudo da sorologia como: - foi possvel a extrao do DNA de leuccitos do sangue sem a preocupao de que estas clulas estejam vivas - as reaes cruzadas praticamente desapareceram - todas as clulas HLA podem ser analisadas, pois construmos os marcadores dos genes sinteticamente em laboratrio. Essa nova tecnologia para o estudo do HLA baseia-se na possibilidade de amplificao de parte do DNA que se deseja estudar. Para o estudo dos genes dos locos HLA A, B, C, utiliza-se 96 reaes de amplificao do DNA, com 96 primers especficos para cada gene. Assim em alguns dos noventa e seis tubos de ensaio haver a amplificao de alelos do HLA do indivduo estudado observados em forma de bandas no gel e assim chegamos s caractersticas da pessoa analisada sendo esta visualizao perfeita permitindo a identificao molecular do sistema HLA.

Tipagem Molecular dos locos HLA-A e B pela amplificao do DNA alelo especfica (HLA-PCR). Observam-se bandas de DNA especficas e bandas comuns a todos os alelos (controle de ampliao). A avaliao dos sistemas HLA (Human Leucocyte Antigens) permite tambm a investigao de paternidade. Atualmente, a tipagem do HLA realizada pelo mtodo do DNA alelo-especfico, utilizando-se a PCR. A probabilidade de que um indivduo seja pai de uma criana proporcional ao polimorfismo do sistema gentico estudado, alcanando 99,99% para a soma de vrios testes de DNA de locos de mini e/ou microssatlites e 86-99% para o HLA. A probabilidade de excluso de um homem falsamente acusado chega prximo de 100% com os testes de DNA e de 94% para o HLA. DNA - A molcula da vida O cido desoxirribonuclico (DNA) era estudado apenas do ponto de vista bioqumico. A grande conquista do sculo passado acontece em 1953, quando o americano James Watson e o ingls Francis Crick descobrem a estrutura da molcula de DNA, onde se situa o gene, o patrimnio gentico. Seu formato descrito como uma estrutura em dupla hlice, como uma escada em caracol, onde os degraus correspondem s bases nitrogenadas, molculas que apresentam uma estrutura com tomos de carbono e nitrognio. As bases (adenina - A, timina - T, guanina - G e citosina - C) podem ser combinadas entre si, em grupos de trs. Cada uma dessas combinaes determina o cdigo para um aminocido. Os aminocidos iro se juntar e formar as protenas dos seres vivos. Antes de entrarmos no estudo do DNA propriamente dito, faz-se necessria compreenso de alguns conceitos sobre relao entre cromossomos e DNA. Os cromossomos contm os genes que por sua vez so formados por DNA. Estes genes permitem a transmisso das informaes genticas de gerao a gerao. O material responsvel pelo comando e coordenao de toda a atividade celular, pelas divises celulares e transmisses das caractersticas hereditrias est representado nas clulas pelos cromossomos. Cada molcula de DNA contm vrios genes. Cada gene, quando em atividade, transcrito em molculas de outros cidos nuclicos denominados ribonuclicos, que comandaro a sntese de protenas. Replicao do DNA o processo de autoduplicao do material gentico mantendo assim o padro de herana ao longo das geraes. Esta duplicao ocorre de maneira semiconservativa: cada fita do DNA duplicada formando uma fita hbrida, isto , a fita velha pareia com a fita nova formando um novo DNA; de uma molcula de DNA formam-se duas outras iguais a ela. Cada DNA recm formado possui uma das cadeias da molcula me, por isso o nome semiconservativo.

Uma modificao gentica induzida conhecida como mutao. As mutaes podem resultar de uma alterao na seqncia dos nucleotdeos, ou de quebras e mudanas de posio dos fragmentos da molcula de DNA. Portanto so mutaes as alteraes numricas e estruturais dos cromossomos, que persistem atravs das autoduplicaes, transmitindose s clulas-filhas. Existem tambm erros que ocorrem no RNA, no momento das transcries ou das tradues, e afetam somente a prpria clula. 3. PATERNIDADE O DNA A CHAVE PARA A VERIFICAO DA PATERNIDADE O ncleo de cada uma de nossas clulas contm o DNA. Cada indivduo (exceto gmeos univitelinos) possui seqncias de DNA exclusivas, como uma "impresso digital molecular". O DNA nuclear transmitido de gerao a gerao: o filho herda metade do seu DNA da me e metade do pai. A espcie humana, por exemplo, possui 22 tipos de cromossomos autossmicos (1 a 22) e dois

cromossomos sexuais (X e Y). Os cromossomos esto dispostos individualmente nas clulas germinativas (vulos e espermatozides possuem 23 cromossomos), ou em pares nas clulas somticas (as clulas do nosso corpo possuem 46 cromossomos). Nosso corpo possui 46 cromossomos porque somos formados pela juno de um vulo com um espermatozide e esta juno restabelece o nmero diplide (duplo) de cromossomos em cada clula de nosso corpo. Todos os cromossomos so formados de DNA, ou podemos dizer que o cromossomo nada mais do que uma longa fita dupla de DNA, toda enovelada e dobrada sobre si mesma, de vrias formas, at atingir o aspecto de cromossomo. Dizer que um cromossomo feito de DNA o mesmo que dizer que um novelo feito de linha. E gene, o que ? Um gene representa um pequeno fragmento dessa longa fita de DNA capaz de codificar uma protena. Num cromossomo existem milhares de genes diferentes, capazes de produzir um enorme nmero de diferentes protenas. Cromossomos semelhantes so chamados de cromossomos homlogos. Tambm existem nos cromossomos regies de DNA que no produzem protena, que podemos chamar de DNA no codificante. A funo destas seqncias desconhecida. O QUE VNCULO GENTICO DE FILIAO? Todos os seres vivos so constitudos de clulas. Estas contm um ncleo onde se encontra o DNA, o material gentico que caracteriza todos os indivduos: cor dos olhos, pele, cabelo, tipo sanguneo, etc. Em todas as clulas somticas de um indivduo, encontramos 2 cpias desse material gentico em cada par de cromossomos. Uma destas cpias fornecida pelo pai biolgico ao filho, atravs de um espermatozide. Enquanto que a me biolgica fornece a outra cpia atravs de um vulo. A unio do espermatozide do pai com o vulo da me daro origem a uma criana. A criana ter duas cpias dos genes presentes nas molculas de DNA (informaes genticas que a caracterizam) uma originria do pai e a outra da sua me. A investigao de um vnculo gentico atravs da anlise de DNA capaz de determinar se uma pessoa ou no o pai (ou a me) biolgico de outra pessoa. Isto possvel devido ao fato de que todo indivduo caracterizado por um conjunto nico de informaes genticas herdado de seus pais biolgicos. Quase todas as informaes genticas existentes nas duas cpias dos diferentes indivduos da populao humana so idnticas. Por essa razo que todas as pessoas apresentam as mesmas caractersticas fsicas tais como duas pernas, dois braos, cabelos, nariz, rgos sexuais, etc. Todavia, algumas dessas informaes genticas so parecidas, mas no idnticas, fazendo que as pessoas sejam diferentes umas das outras na altura, no tipo de cabelo, na cor da pele, etc. Esta variao de informaes genticas existentes na populao humana e em outras espcies chamada de polimorfismo. atravs do exame destas informaes polimrficas que se pode determinar se h vnculo gentico entre os indivduos (me, pai e filho). Quando se examinam as duas cpias de uma determinada informao gentica presente em uma criana, comparando-as com aquelas presentes em cada um dos pais, ser encontrada no pai biolgico uma das cpias existente no filho, a outra cpia evidentemente estar presente na me. No esquema abaixo pode-se visualizar como isso acontece :

Legenda: Representao de um par de cromossomos de cada um dos progenitores. Neste caso, em uma determinada regio dos cromossomos (loco) esto presentes 4 diferentes alelos (A, B, C e D). As 4 combinaes possveis podero ser herdadas pelos filhos do casal atravs dos gametas (vulos e espermatozides). Qualquer outra combinao (por ex: BB; AA; AB; etc.) caracterizar uma excluso de Paternidade. Para se investigar a paternidade analisa-se vrias informaes genticas (caracterizadas como locos gnicos). Cada uma destas informaes, denominadas de alelos so identificadas na me, filho(a) e no suposto pai. O exame dessas informaes permite concluir com um grau de confiana de 99,9999% se o suposto pai realmente o pai biolgico da criana em questo. Na excluso um alelo encontrado no filho que no esta presente na me, tambm est ausente no pai, portanto permite dizer que o suposto pai no o pai biolgico da criana em questo. Na confirmao da paternidade fica evidente que o mesmo alelo presente no DNA do filho tambm existe no DNA do suposto pai. Esta anlise repetida para

vrios locos gnicos, permitindo uma concluso com total segurana. Quando em vrios locos genticos os alelos do filho, que no foram os herdados da me, esto ausentes no suposto pai, indicam que o pai biolgico deve ser outro e no o homem testado, caracterizando-se assim uma excluso de paternidade. Quando em todos os locos estudados, os alelos presentes no filho, que no foram herdados da me, esto presentes no suposto pai levam concluso que este o pai biolgico da criana em questo. Neste caso caracteriza-se a incluso de paternidade. Para se realizar esses exames extramos o DNA de leuccitos (glbulos brancos) existentes nas amostras de sangue colhido das pessoas em questo. Utilizando-se a tcnica da PCR (Reao em Cadeia de Polimerase) os alelos de cada locos so amplificados e atravs de eletroforese so identificados por comparao com padres especficos, previamente obtidos a partir de molculas de DNA de tamanhos conhecidos. Com base em tabelas de freqncias allicas so feitos os clculos de probabilidade que permitem concluir a respeito de excluso ou no da paternidade em questo. UTILIZAO DOS MARCADORES EM TESTES DE PATERNIDADE Cada indivduo tem seu prprio gentipo (contedo gentico). Do mesmo modo que as impresses digitais, este gentipo o nico para este indivduo, a no ser que tenha um irmo gmeo univitelino. Estabelecer o gentipo (genotipagem) envolve a identificao de seqncias especficas em um fragmento de DNA. O fragmento no necessariamente um gene inteiro ou mesmo parte deste gene; somente uma determinada parte do DNA que foi cortado em pedaos no laboratrio. Em um indivduo, metade do contedo gentico foi herdada do pai e a outra metade da me. Assim, em cada regio do DNA, chamada loco, o indivduo possui dois dos chamados alelos, um proveniente do pai e outro da me. Suponha que, no loco n1, o pai tenha os alelos A e B (portanto, gentipo A/B) e a me os alelos C e D (gentipo C/D). Os filhos ou filhas deste casal tero, ento, o alelo A ou B (vindo do pai, com uma probabilidade igual) e o alelo C ou D (vindo da me). Ento os filhos tero, obrigatoriamente, os gentipo A/C ou A/D ou B/C ou B/D. A chance de 2 irmos terem o mesmo gentipo, em um loco examinado, de 1/4 ou 25%. Esta uma porcentagem muito alta para os processos de identificao; por isto, outras regies do DNA tambm so analisadas para se estabelecer a identidade do indivduo. medida que examinamos um nmero maior de regies e as analisamos em conjunto, esta porcentagem vai diminuindo, at se tomar muito pequena. Deste modo, a possibilidade do resultado do teste ser proveniente de erro extremamente reduzida.

ANLISE DA EXCLUSO Aps a anlise dos fragmentos de DNA, examina-se a eficcia do teste (probabilidade de excluso). A probabilidade de excluso a demonstrao de que um indivduo especfico no pode ter contribudo com o material gentico encontrado em outro indivduo. Assim, quando um determinado indivduo no for o progenitor, diz-se que houve uma excluso. importante salientar que tanto a genotipagem quanto qualquer outro teste de verificao de paternidade no vai, de maneira alguma, provar a paternidade; eles vo verificar se ou no possvel que um acasalamento especfico tenha produzido um produto especfico. Quanto mais poderoso for o teste para excluir uma identidade (incorreta), maior a probabilidade de excluso. Em outras palavras, a probabilidade de excluso pode ser to alta que torna praticamente impossvel que outro indivduo, que no o pai real, possa ser apontado como progenitor. A tipagem sangnea foi tremendamente efetiva na verificao da paternidade. O teste de DNA atualmente utilizado tem uma eficcia ainda maior, pois seu poder de resoluo superior; como se fosse usado um microscpio mais poderoso . Como resultado, a genotipagem pode produzir uma excluso que a tipagem sangnea no pde detectar. Por outro lado, se o parentesco de um indivduo foi excludo pela tipagem sangnea, no h chance da genotipagem produzir um resultado diferente.

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O EXAME DO DNA PARA INVESTIGAO DO VNCULO GENTICO Nos casos em que a paternidade de uma criana est sendo investigada, testes de vnculo gentico so utilizados para identificar marcadores genticos presentes na criana, no sangue materno e no suposto pai. Metade dos cromossomos presentes em um indivduo foi transmitida pela me (atravs do vulo) e a outra metade pelo pai biolgico (atravs do espermatozide). Em um teste de paternidade mediante a anlise do DNA, vrias regies so analisadas em diferentes cromossomos. Essas regies so especificamente selecionadas por possurem grandes diversidades de tamanho dentro de uma populao (marcadores genticos). Algumas vezes, fragmentos de at 100 tamanhos diferentes podem ser encontrados em uma dessas regies, ao ser estudada a populao geral. Vrios mtodos podem ser utilizados para que se proceda anlise do vnculo gentico mediante o DNA. Cada um destes mtodos possui caractersticas particulares. Dependendo da quantidade de material disponvel, origem do material, finalidade da anlise (investigao de paternidade ou identificao) utiliza-se um ou vrios mtodos disponveis. Grande parte dos casos de investigao de paternidade no encontra limitao da qualidade ou quantidade de material disponvel sendo que, portanto, o poder de excluso o principal fator determinante do mtodo de escolha. VTR (MLP) - SINNIMOS: DNA FINGERPRINTING, O "MULTI-LOCUS PROBE" Em alguns cromossomos humanos, existem certas regies em que uma pequena seqncia de DNA repetida vrias vezes. Essas regies, que foram, inicialmente, caracterizadas, na dcada de 80, por Alec Jeffreys, se constituem em diferentes marcadores genticos e possuem segregao mendeliana. Esses marcadores possuem determinadas seqncias que se repetem (tandem repeats) at centenas de vezes e so denominadas Variable Number of Tandem Repeats ou VNTR. Habitualmente, essas regies esto localizadas entre stios de corte de enzimas de restrio, sendo, pois, possvel "cortar" essa seqncia para anlise.

Na figura acima, quatro exemplos de VNTR esto representados. Sendo eles caracterizados por tamanhos diferentes, ao serem separados mediante eletroforese, em gel de agarose, colocam-se de acordo com seus respectivos tamanhos. Assim, como se representa na poro inferior da foto, podem-se comparar as bandas de maneira a determinar-se o vnculo gentico entre pessoas. A figura abaixo esquematiza a tcnica empregada. O DNA inicialmente extrado das clulas digerido por enzimas de restrio. HaeIII uma das enzimas comumente utilizadas (corta o DNA ao identificar seqncias 5'-GGCC-3'). Assim, vrias bandas so produzidas. Nem todas as bandas produzidas oferecem interesse, pois, muitas delas no so polimrficas. Para identificao dos marcadores polimrficos que carregam VNTRs so utilizadas sondas ("probes" em ingls). Essas sondas hibridizam vrios loci gnicos e so, portanto, denominadas sondas multilocais (da o nome em ingls Multi Locus Probe).

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Como esta sonda hibridiza vrios locos, ao mesmo tempo, o resultado um nmero muito grande de bandas, todas possuindo VNTRs. Por exemplo, considerando-se, somente, 3 alelos, possvel encontrar 3 pessoas heterozigotas e 3 homozigotas para um mesmo loci. Para diferentes nmeros de alelos existem (n)(n+1)/2 gentipos possveis.

A figura acima representa um resultado tpico de investigao de vnculo gentico utilizando-se a anlise de VNTR. Como se pode notar, o nmero de bandas muito grande, podendo-se habitualmente identificar entre 8 e 30 bandas, por pessoa, fazendo com que a combinao genotpica seja enorme. Portanto, o poder de resoluo desta tcnica muito alto, sendo o poder de excluso, igualmente, muito alto. Em determinados casos, a probabilidade de se encontrar um outro indivduo com o mesmo genotipo chega a 1:3.000.000.000, sendo, portanto, quase impossvel encontrar uma outra pessoa com o mesmo padro de bandas. Por isso esse exame tambm conhecido como DNA Fingerprinting (impresso digital do DNA). RFLP (SLP) - SINNIMOS: "SINGLE-LOCUS PROBE" Em um teste de paternidade mediante a anlise do DNA, vrias regies so analisadas em diferentes cromossomos. Essas regies so especificamente selecionadas por possuirem grande diversidade de tamanho dentro de uma populao (marcadores genticos). Algumas vezes, fragmentos de at 100 tamanhos diferentes podem ser encontrados em uma dessas regies, ao ser estudada a populao geral.

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O exemplo acima mostra 6 tamanhos diferentes de um mesmo marcador gentico.Um indivduo carrega 2 marcadores, um em cada cromossomo (paterno e materno). Cada um desses marcadores, em um mesmo indivduo, denominado alelo. Assim, cada indivduo possui 2 alelos e uma populao possui diversos alelos para um mesmo marcador.

Os referidos fragmentos de DNA ocorrem com uma determinada freqncia nos diferentes grupos populacionais. Assim, para saber-se a freqncia de cada alelo, diversos grupos populacionais devem ser estudados. Se um marcador estiver presente em 100% das pessoas, a freqncia ser 1. Se no estiver presente em nenhuma das pessoas, sua freqncia ser zero. Um marcador considerado "utilizvel" quando sua freqncia estiver entre zero e 1. Um "bom" marcador tem sua freqncia entre 0.2 e 0.8. Para isso, bancos de dados so criados contendo informao sobre cada um dos marcadores. importante que essa informao seja coletada e reconhecida cientificamente.

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Analisando-se vrios marcadores e combinando-se a freqncia de cada um, podem-se excluir indivduos que no so pais biolgicos em relao aos alegados filhos, com uma grande margem de certeza. Considera-se, hoje, que um teste de paternidade tem um poder de excluso aceitvel, quando exclui mais do que 99% da populao masculina analisada ao acaso. Se um suposto pai no foi excludo da paternidade que lhe alegada, um nmero pode ser utilizado para indicar quantas vezes mais ele tem probabilidade de ser o pai biolgico que outro indivduo, tomado ao acaso, no grupo populacional em estudo. O nmero referido conhecido como ndice de Paternidade. O resultado do exame de DNA tambm pode ser expresso mediante a Probabilidade de Paternidade. Antes de qualquer anlise, a probabilidade inicial de uma pessoa ser o pai biolgico de 50% (sim ou no). Baseado neste dado e nos resultados da anlise do DNA, a probabilidade posterior pode ser calculada utilizando-se a freqncia de cada marcador (Teorema de Byer), o que pode conduzir a probabilidade de paternidade a nmeros elevados, superiores mesmo a 99.9%. PCR - SINNIMOS: POLYMERASE CHAIN REACTION PCR um mtodo in vitro que sintetiza seqncias especficas de DNA. Esta reao utiliza um DNA que usado como "molde" (template em ingls) e primers, que so oligonucleotdeos (pequenas seqncias que complementam o DNA), que hibridizam com hemi-hlice do molde de DNA para que seja copiada. A copia do template catalizada pela enzima Taq polimerase, extrada de uma bactria que pode sobreviver em altas temperaturas denominada Thermus aquaticus. Uma srie de ciclos repetitivos faz com que o template seja separado em suas hemi-hlices, os primers hibridizem com o template, a polimerase catalise a ligao de nucleotdeos para formar uma nova cpia da regio de interesse do DNA. Como cada cpia produzida em um ciclo pode servir de template no prximo ciclo, a cpia do DNA ocorre de forma exponencial. Em aproximadamente 20 ciclos, a concentrao de DNA aumenta aproximadamente um milho de vezes.

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O conceito de amplificao do DNA pelo PCR simples, mas seu impacto tem sido extraordinrio. A primeira publicao utilizando este mtodo surgiu em 1985. Cada ano subseqente o nmero de publicaes cientficas utilizando o PCR tem crescido exponencialmente. Em 1989, a revista Science elegeu o PCR "o maior desenvolvimento cientfico" e a Taq polimerase a molcula do ano. Em 1993, Kary Mullis, o criador deste mtodo, recebeu o prmio Nobel de Qumica.

TESTE PATERNIDADE POR ANLISE DE DNA A metodologia empregada visa identificao do DNA. O conjunto de molculas de DNA compe os cromossomos, que esto localizados nos ncleos das clulas e arranjados aos pares. A espcie humana possui 46 cromossomos, sendo uma metade deles de origem materna, e a outra, de origem paterna. Cada cromossomo composto por molculas de DNA dispostas em seqncia nica para cada indivduo. O exame de DNA para fins de identificao pessoal e determinao de paternidade considerado o maior avano do sculo na rea forense. Com o exame de DNA, a determinao de paternidade passou a atingir nveis de certeza absoluta. Estatsticas do Registro Civil indicam que cerca- de 30% das crianas nascidas no Brasil no tm pai declarado, o que freqentemente representa um srio problema emocional, econmico e social. grande, portanto, a necessidade de determinar paternidade com absoluta confiabilidade em diversas situaes da vida contempornea. Esta necessidade surge, por exemplo, em casos amigveis de confirmao de paternidade, disputas legais para fins de penso alimentcia e herana, casos criminais envolvendo estupro, rapto, troca ou abandono de crianas e casos-mdicos de diagnstico pr-natal e aconselhamento gentico. O DNA de cada ser humano nico e diferente dos demais, com exceo de gmeos univitelinos. Todo ser humano possui duas formas de cada gene, uma forma recebida de sua me e a outra de seu pai. Embora a maioria dos genes seja essencialmente igual entre as pessoas, algumas seqncias especficas do DNA so extremamente variveis entre indivduos. O local onde uma destas seqncias hiper-variveis encontrada no cromossomo denominado loco. Cada um destes locos pode, portanto, ter vrias formas diferentes denominadas alelos. A anlise de vrios locos hiper-variveis permite individualizar o ser humano (veja figura abaixo)

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 justamente a anlise dos alelos nestes locos hiper-variveis que permite a identificao pessoal precisa e a determinao de vnculo gentico. O exame de paternidade consiste em observar e comparar o DNA de locos hipervariveis da criana e do suposto pai. Em cada exame esta comparao feita em vrios locos ao mesmo tempo, analisando diretamente a variao existente no DNA dos indivduos estudados. O compartilhamento de alelos entre a criana e o suposto pai permite estabelecer paternidade com uma probabilidade maior, menor ou igual a 99,9999%. Por outro lado, quando os alelos no so compartilhados entre a criana e o suposto pai, este excludo categoricamente (100%) da possibilidade de ser o pai biolgico da criana. Os alelos presentes no filho (a) que no esto presentes na me, obrigatoriamente devem estar presentes no pai biolgico. O exame de paternidade pela anlise de DNA , portanto, extremamente poderoso para a determinao de paternidade biolgica. Da mesma forma, o exame um subsdio tcnico definitivo para identificar com absoluta preciso uma pessoa erroneamente apontada como pai biolgico de uma criana. METODOLOGIA A metodologia est fundamentalmente relacionada ao nmero de locos genticos empregados na anlise. O exame pode ser realizado a partir de clulas bucais. ( importante salientar que no existe diferena entre o DNA extrado das clulas da boca e do sangue). Uma vez obtido o DNA, realiza-se o mesmo estudo gentico com os mesmos marcadores. Esta coleta vai ajudar as pessoas que tm medo de agulha ou dificuldade para colher sangue, principalmente os bebs, com a mesma confiabilidade e preciso do exame feito com amostras de sangue. O DNA pode ser extrado ainda a partir de amostras biolgicas como cabelo, smen, etc., mas somente em casos de investigao criminal. Em caso de acusao de paternidade, bem como se uma pessoa deseja verificar se uma criana de fato seu filho(a) biolgico(a), a tipagem de DNA resolve o problema. Naturalmente os exames de tipagem de DNA tambm resolvem disputas de maternidade. A preciso desse teste pode atingir a ndices superiores a 99.9999%, o que o torna uma ferramenta absolutamente slida e confivel. MITOS E VERDADES SOBRE OS TESTES DE PATERNIDADE PELO DNA: O exame de DNA tm de ser feito no sangue". - FALSO - O DNA o componente gentico bsico e est presente em todas as clulas do nosso corpo. E ele absolutamente o mesmo nas clulas brancas do sangue, nas clulas da mucosa bucal, nas clulas da raiz do cabelo, no smen etc. O teste de paternidade pode ser feito com qualquer tecido que contenha DNA. Exame de DNA sempre igual. Vamos fazer o mais barato".

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- FALSO - No se deixe iludir. Qualidade tem preo. O valor do exame est diretamente ligado quantidade de regies do DNA estudadas e ao percentual de confiabilidade do resultado. Cortei o cabelo dele para fazer o teste de DNA". - FALSO - Cabelo cortado no contm DNA. O DNA usado para o teste est na raiz do cabelo arrancado. O uso de drogas e/ou lcool altera o resultado do exame - FALSO - No. Isso no ir interferir no exame de paternidade. Drogas, lcool, medicamentos, alimentao, idade ou comportamento social no ir alterar o DNA do prprio indivduo. O DNA em nenhuma circunstncia mudar. VANTAGENS DE PCR-STR * Menor taxa de mutao; * Facilidade de discriminar alelos diferentes; * Facilidade de montar bancos de dados da populao local; * Procedimento completo sem uso de radioatividade; * Anlise possvel com pouco ou muito DNA, degradado ou intacto; * Facilidade de exame pr-natal, em recm-nascidos e em vestgios de crimes; * Necessidade de pouco sangue, no exigindo flebotomia (DNA da mucosa oral suficiente); * Permite a construo de escadas allicas com todos os alelos possveis; * No necessita definir bins arbitrrios como os RFLPs; * Fcil interpretao dos por no-geneticistas; * Procedimento analtico tecnicamente simples; * Rapidez do resultado; * Fcil padronizao intra e interlaboratorial; *Possvel determinao simultnea do sexo dos indivduos testados, importante para evitar troca de tubos; * Tamanhos pequenos e definidos dos fragmentos permitem mltiplas amplificaes simultneas (multiplex); * Possibilidade de automatizao. ESTATSTICA EM INVESTIGAO DE PATERNIDADE A concluso dos laudos periciais matemtica e depende da pesquisa na populao da freqncia dos alelos dos sistemas estudados. A observao de que o filho recebeu determinadas bandas de DNA da me e que as bandas de origem paterna existentes esto representadas no possvel pai, estimula a pergunta: Quantas vezes este homem investigado tem chance de ser o verdadeiro pai, comparando-se a outro homem ao acaso? Esta indagao conhecida como "ndice de paternidade" e para respond-la deveremos ter estudado um grande nmero de indivduos da populao, no relacionados entre si, construindo-se um banco de dados com a freqncia de cada banda de DNA observada. Para conhecermos cada banda de DNA, deveremos utilizar um marcador de peso molecular padro nos testes executados e procurar traduzir em unidades de peso molecular ou "kb" (kilobases) cada alelo encontrado. Os marcadores de peso molecular utilizados so DNA clivado de bactrias e so analisados em conjunto com o DNA dos participantes de uma percia, possibilitando a identificao de cada alelo por comparao com as bandas de controle de peso conhecido. Em nosso laboratrio utilizamos atualmente tecnologia que permite a anlise do DNA de forma automtica, por intermdio de uma mesa digitalizadora iluminada onde coloca-se a auto-radiografia com os resultados de diversos indivduos. Introduzimos os dados do padro de peso molecular e das bandas de cada indivduo em programa de anlise estatstica desenvolvido para este fim, por intermdio de uma caneta eletrnica aps assinalar cada banda de DNA individualmente. A anlise imediata e permite conhecermos o poder de excluso das sondas utilizadas, o ndice de paternidade, a probabilidade positiva de paternidade para cada sonda e a cumulativa de paternidade para todos os sistemas genticos estudados. O programa permite que seja atualizado o banco de dados com os resultados de cada nova anlise de DNA, assim como permite construirmos grficos e conhecermos a grau de heterozigose ou homozigose para cada sonda. Tendo-se em vista que cada banda de DNA foi digitalizada eletronicamente, os valores em kb representam a exata localizao das bandas na auto-radiografia. Internacionalmente, se aceita como paternidade provvel os resultados de probabilidade positiva entre 90 - 94%, como fortssimo indcio de paternidade entre 95 - 99% e como paternidade praticamente certa acima de 99%. Por que o ndice no chega a 100%? Porque o teste de paternidade trabalha com excluso. Ou seja, quando os padres de DNA do(a) filho(a), provenientes do lado paterno, no so encontrados no homem testado, pode-se afirmar, com certeza absoluta, que ele no

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o pai biolgico. Por outro lado, quando h compatibilidade entre os padres de DNA do(a) filho(a) e do suposto pai, ento calcula-se a probabilidade de o homem ser o pai biolgico. De que maneira essa probabilidade calculada? Cada um dos diferentes padres de DNA ocorre com uma determinada freqncia em diferentes populaes. A distribuio dessa freqncia usada para calcular quantas vezes mais provvel que um homem seja o pai de uma pessoa em relao a qualquer outro indivduo compatvel do sexo masculino, tomado ao acaso, na populao estudada. Para efetuar os clculos com grande exatido, o Fleury realizou uma ampla pesquisa para determinar as freqncias dos padres de DNA em nossa populao. Qual a probabilidade de erro desse teste? Usando-se o DNA para provar paternidade nunca ocorre erro. Mas, como o teste feito por seres humanos, que so falveis, eventualmente pode ocorrer erro por troca de amostra, contaminao do material, etc. O teste de paternidade exclui com 100% de chances o homem que no o pai. E quando no o faz, existe um clculo probabilstico para se saber qual a chance de esse indivduo ser o pai ou se algum outro homem, por coincidncia, tem as mesmas caractersticas genticas nos pontos estudados. De qualquer maneira, essa probabilidade, por se tratar de um clculo matemtico, chega a uma dzima peridica de 99,99...%. Ou seja, na prtica, o teste acaba sempre acertando.

Cadeia de Custdia do IMESC

DA COLETA DO MATERIAL A coleta do material biolgico a ser examinado (sangue perifrico humano) para fins de Investigao de Vnculo Gentico por meio de identificao de polimorfismo de DNA, ser de responsabilidade do IMESC ou da Unidade Regional da Secretaria de Estado da Sade onde a mesma for realizada, de acordo com o processo de descentralizao da coleta. 1. Das Coletas realizadas na sede do IMESC 1.1. Para a realizao da percia, todos os periciandos intimados devero apresentar-se concomitantemente e munidos de documentos de identificao oficial, original e com foto, quando devero assinar a lista de presena e aguardar sua senha para realizar a coleta. 1.2. Nos casos onde uma das partes intimadas no comparece, as que estiverem presentes assinaro a lista de presena e recebero documento informando que a coleta no ser realizada pela ausncia de uma das partes. 1.3. Ao responsvel pela coleta, caber: 1.3.a) o preenchimento das folhas de identificao (parte integrante do laudo), com todas as informaes necessrias dos periciandos, ou seja, nmero de documento, tipo de documento, data de expedio, nome da me, nome do pai, data de nascimento, endereo e telefone, alm do grau de parentesco e se o periciando recebeu transfuso ou transplante de medula nos ltimos seis meses (neste caso tambm dever colher swab bucal do periciando); 1.3.b) aps conferncia dos dados obtidos com os periciandos, duas vias desta ficha devero ser impressas, onde, em local apropriado e na presena das partes, o responsvel pela coleta dever tomar as impresses digitais do polegar direito de cada um, e esta digital dever ser rubricada lateralmente pelas partes contrrias, como forma de reconhecimento mtuo. O responsvel pela coleta dever rubricar a ficha de identificao no final de todo o procedimento; 1.3.c) a emisso de trs etiquetas auto-adesivas, de identificao que sero fixadas no carto de coleta em que ser colocado o material biolgico (sangue), no envelope aluminizado onde o carto ser armazenado e na pasta referente ao caso. Devero constar das etiquetas os seguintes dados: nmero de identificao do IMESC para o caso, nome completo do periciando, data da coleta, nmero de famlia e sigla correspondente ao grau de parentesco. Em seguida, os periciandos devero rubricar o carto de coleta que receber o material biolgico; 1.3.d) o coletor dever identificar os crculos do carto de coleta com a sigla referente ao sangue do periciando que ser pingado nele ou colocar o nmero do crculo na frente da etiqueta que corresponde ao periciando que ter o sangue pingado ali. Deve-se fazer a anti-sepsia da ponta do dedo anular com algodo embebido em etanol 70%, preparar o lancetador com a intensidade necessria para cada indivduo, acoplar a lanceta encostar-se ao dedo anular e apertar a ponta do lancetador. O sangue deste periciando dever ser pingado no crculo correspondente, uma gota sobre a outra; 1.3.e) ao final da coleta, o responsvel dever assinar duas vias da folha n 01 do laudo, onde constar a Autoridade requisitante do processo, o nmero do processo e o nome completo do responsvel pela coleta com seu nmero de inscrio no rgo competente. 1.4. Efetuada a coleta, os cartes devidamente etiquetados e rubricados devero aguardar por 1 (uma) hora para secagem e s aps este tempo serem lacrados e encaminhados ao laboratrio para conferncia dos mesmos com suas respectivas pastas, sendo, em seguida, devidamente acondicionados para aguardar o incio do procedimento tcnico. 2. Das coletas realizadas nas Regionais da Secretaria de Estado da Sade

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2.1. O IMESC remeter s Unidades da Secretaria Estadual da Sade, responsveis pela coleta, com antecedncia mnima de 05 (cinco) dias teis, listas das percias agendadas, bem como todo material necessrio para o procedimento. 2.2. As coletas de material sero realizadas por servidores da Secretaria de Estado da Sade que tenham realizado curso de capacitao e treinamento fornecido pelo IMESC. 2.3. Os servidores das unidades da Secretria de Estado da Sade responsveis pela coleta devero observar os seguintes procedimentos: 2.3.a) o preenchimento das folhas de identificao em duas vias (parte integrante do laudo), com todas as informaes necessrias dos periciandos, ou seja, nmero de famlia, nmero da pasta, nmero do documento apresentado, tipo de documento, data de expedio, nome da me, nome do pai, data de nascimento, endereo e telefone, alm do grau de parentesco (representado por uma sigla), se a primeira vez que o periciando realiza percia de paternidade no IMESC, se recebeu transfuso ou transplante de medula nos ltimos 6 meses (neste caso dever colher tambm swab bucal do periciando); 2.3.b) aps conferncia dos dados obtidos com os periciandos, o coletor dever tomar as impresses digitais do polegar direito de cada periciando, e esta digital dever ser rubricada lateralmente pelas partes contrrias, como forma de reconhecimento mtuo. O responsvel pela coleta dever assinar, carimbar, datar e preencher o nome do coletor nas duas vias da ficha de identificao; 2.3.c) as trs etiquetas auto-adesivas enviadas, contendo o nmero de identificao do IMESC para o caso, o nome completo do periciando, a data da coleta e o nmero de famlia, devero ser conferidas e a sigla correspondente ao grau de parentesco deve ser acrescentada; 2.3.d) uma das etiquetas de identificao dever ser fixada no carto de coleta em que ser colocado o material biolgico (sangue), a outra no envelope aluminizado onde o carto ser armazenado e a terceira no verso da cpia da ficha de identificao. Em seguida, os periciandos devero rubricar o carto de coleta que receber o material biolgico. 2.3.e) o coletor dever identificar os crculos do carto de coleta com a sigla referente ao sangue do periciando que ser pingado nele ou colocar o nmero do crculo na frente da etiqueta que corresponde ao periciando que ter o sangue pingado ali. Deve-se fazer a anti-sepsia da ponta do dedo anular com algodo embebido em etanol 70%, preparar o lancetador com a intensidade necessria para cada indivduo, acoplar a lanceta encostar-se ao dedo anular e apertar a ponta do lancetador. O sangue deste periciando dever ser pingado no crculo correspondente, uma gota sobre a outra; 2.4. Efetuada a coleta e aguardado o tempo necessrio de secagem, que de 1 (uma) hora, os cartes devidamente etiquetados e rubricados pelas partes devero ser colocados nos envelopes, que devero receber uma slica, depois lacrados. Estes envelopes, juntamente com as fichas de identificao, as listagens de portaria e remessas, devero ser armazenadas em local fresco e arejado e ficaro sob a responsabilidade do responsvel pela coleta de cada cidade at o momento do IMESC retirar o malote, o que ocorrer a cada 2 meses. 2.5. Recebidos os malotes contendo os materiais coletados pelas Unidades Regionais da Sade, o responsvel pelo transporte dever direcion-los ao Ncleo de Percias Laboratoriais da Autarquia, para conferncia e anexao nas respectivas pastas, e estes sero finalmente direcionados ao processamento tcnico. 3. Das coletas realizadas externamente Para garantir a incolumidade do resultado, se faz imprescindvel a adoo de TODOS os procedimentos abaixo em seus exatos termos. 3.1. Identificao civil do perito nomeado pelo juiz em forma de carimbo legvel (com seu nome completo, seu nmero de registro no conselho de classe), alm da sua assinatura nas duas vias da ficha de identificao. 3.2. Identificao civil do periciando, mediante apresentao de RG ou documento oficial, original e com foto, cujos dados (nmero do documento, tipo do documento, data de expedio, nome da me, nome do pai, data de nascimento) devero ser anotados pelo perito judicial nas duas vias da ficha de identificao. 3.3. Tomada da impresso datiloscpica do polegar direito do periciando e aposio da respectiva assinatura nas duas vias. 3.4. Indivduos transfundidos com sangue total ou seus derivados ou que receberam transplante de medula ssea nos ltimos seis meses anteriores a coleta, devem ter seu exame feito por coleta de sangue e tambm swab bucal, para que se evite que o laudo seja inconclusivo por situao de quimerismo. 3.5. Segue anexo o envelope e o carto de coleta que dever ser identificado com o nmero de processo e o nome do periciando, no qual aps a anti-sepsia da ponta do dedo anular com algodo embebido em etanol 70%, devero ser pingadas 03 (trs) gotas de sangue (uma sobre a outra) dentro de um dos crculos identificado com a sigla de grau de parentesco, conforme exemplo abaixo: M me do filho interrogado; F - filho interrogado; SP - suposto pai; PR - pai de registro; PSP - pai do suposto pai falecido; MSP - me do suposto pai falecido; ISP - irmo do suposto pai falecido; FB - filho biolgico do suposto pai falecido; MFB - me do filho biolgico do suposto pai falecido; SM - suposta me. Nos casos de mais de um indivduo de mesma sigla, identific-los com a sigla e nmero 1, 2, 3, etc. Por exemplo, dois irmos do suposto pai sero identificados como ISP1 e ISP2. 3.5.a) deixar o carto aberto secando por 1 (uma) hora em temperatura ambiente;

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3.5.b) decorrida esta uma hora, fechar o carto e coloc-lo dentro do envelope forrado com alumnio, retirar a fita adesiva e lacrlo; 3.5.c) colocar o envelope lacrado dentro do envelope de papel, juntamente com a(s) folha(s) de identificao, devidamente preenchidas e assinadas, datadas e carimbadas pelo perito; 3.5.d) o material colhido para o exame dever ser transportado temperatura ambiente, evitando a exposio ao sol por longo perodo. Em virtude da rotina deste laboratrio, informamos que o material dever ser entregue em no mximo quatro dias aps a realizao da coleta e at s 15:00 horas; 3.5.e) o transporte do material ao IMESC pode ser feito por pessoa indicada pelo Juzo, ou a seu critrio, mas de forma que garanta a sua inviolabilidade. 3.6. O modelo da ficha de identificao a ser preenchida em duas vias pelo perito judicial em relao ao periciando segue em anexo, com um exemplo de preenchimento. 4. Das pessoas que devero colher Devero apresentar-se para a coleta todos os intimados pelo MM. Juiz e os menores de idade devero ser acompanhados por seus representantes legais/tutores. Para evitar que o laudo seja inconclusivo sugere-se a presena de: 4.1. Investigao de paternidade tipo Trio: suposto pai (ou mais de um suposto pai se houver), me biolgica e filho questionado (ou mais de um filho questionado se houver); 4.2. Investigao de maternidade: suposta me (ou mais de uma suposta me se houver) e filho questionado (ou mais de um filho questionado se houver); 4.3. Investigao de paternidade tipo Duo: suposto pai (ou mais de um suposto pai se houver) e filho questionado (ou mais de um filho questionado se houver); 4.4. Investigao de paternidade post mortem: filho questionado (ou mais de um filho questionado se houver) com suas mes biolgicas e representantes genticos do suposto pai falecido, seguindo esta ordem de preferncia: 4.4.a) os dois genitores do suposto pai falecido; 4.4.b) um dos genitores do suposto pai falecido mais 2 (dois) irmos de mesma me e mesmo pai do suposto pai falecido; 4.4.c) pelo menos 3 (trs) irmos de mesma me e mesmo pai do suposto pai falecido; 4.4.d) 2 (dois) filhos biolgicos do suposto pai falecido com suas genitoras; 4.4.e) pelo menos 3 (trs) filhos biolgicos do suposto pai falecido de me diferente da do filho questionado, se esta no participar do teste. 4.5. Investigao de maternidade post mortem: filho questionado (ou mais de um filho questionado se houver) com ou sem seu pai de registro e representantes genticos da suposta me falecida, seguindo esta ordem de preferncia: 4.5.a) os dois genitores da suposta me falecida; 4.5.b) um dos genitores da suposta me falecida mais 2 (dois) irmos de mesma me e mesmo pai da suposta me falecida; 4.5.c) pelo menos 3 (trs) irmos de mesma me e mesmo pai da suposta me falecida;

Nos casos de investigao post mortem o IMESC no realiza percia em restos mortais e na impossibilidade do caso se encaixar em um dos itens descritos acima, pede-se para entrar em contato e descrever a peculiaridade da situao para verificao da viabilidade de restar em laudo conclusivo.

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