CAPTULO 7 - INTRODUO AOS MTODOS CROMATOGRFICOS

O PROCESSO DE SEPARAO CROMATOGRFICA

A EXPERINCIA CLSSICA DE TSWETT: CONCEITOS CROMATOGRFICOS BSICOS
Se a soluo de clorofila em ter de petrleo filtrada atravs da coluna de material adsorvente (usei,
na maioria das vezes, carbonato de clcio preso firmemente dentro de um tubo de vidro estreito), os
pigmentos so separados de acordo com a srie de adsoro, de cima para baixo, em diferentes zonas
coloridas (...). Esta separao ser praticamente completa se, depois de depositar a soluo de
pigmento, um fluxo de solvente puro seguir atravs da coluna de adsoro. Como os raios do espectro
de luz, os diferentes componentes da mistura de pigmentos dentro da coluna sero regularmente
separados um do outro e podero ser determinados qualitativamente e quantitativamente. Eu chamo
esta preparao de cromatograma e o mtodo correspondente de mtodo cromatogrfico. Mikhail
Tswett (1872-1919), in Physical chemical studies on chlorophyll adsorptions, revista Berichte der
Deutschen botanischen Gesellschaft, vol. 24, 316-23 (1906). Em traduo da verso em ingls de Henry
M. Leicester, Source Book in chemistry 1900-1950.
Foi assim, h pouco mais de 100 anos, que Tswett nomeou pela primeira vez o mtodo cromatogrfico.
No seu experimento, esto contidos todos os conceitos bsicos da cromatografia (J. Livengood. Studies
in History and Philosophy of Science 40 (2009) 5769).
Num primeiro momento, Tswett preparou uma coluna com
gros de carbonato de clcio, a fase estacionria, e encheu os
interstcios com ter de petrleo uma mistura de
hidrocarbonetos leves e volteis sua fase mvel. Em seguida
aplicou um extrato de pigmentos vegetais coloridos, tambm
dissolvidos em ter de petrleo, no alto da coluna. Aplicando
mais ter de petrleo com todo cuidado, de modo a no
perturbar a mistura de pigmentos, e abrindo o escoamento no
final da coluna, ele promoveu a migrao da mistura de
pigmentos por entre os interstcios dos gros de CaCO3.

Como resultado final, ele observou os pigmentos separados em

bandas, numa separao muito mais simples do que os mtodos
usados at ento. Estas bandas alargavam-se medida que
escoavam ao longo da coluna, de modo que, ao sair a banda, ela
estava mais larga que no incio. E cada banda tambm saa mais
larga que a banda anterior a ltima banda a sair sendo a mais larga
de todas que saam da coluna. (W. Ostrowski. Folia Biologica,
02/1968; 16(4):429-48).

A primeira pergunta que se deve fazer : por que os pigmentos separaram? A resposta bvia seria: por
que migraram com velocidades diferentes ao longo da coluna. O primeiro pigmento a sair foi o que
acompanhou melhor a fase mvel de ter de petrleo. O ltimo pigmento, se chegou a sair, foi o que
mais aderiu fase estacionria de CaCO3.

A segunda pergunta : qual(is) propriedade(s) (so) responsvel(is) por esta diferena de velocidade de
migrao? Para um estudante conhecedor de propriedades bsicas de materiais, no deve ser difcil de
responder que, neste caso, a diferena deve-se polaridade desigual das fases e dos pigmentos. Os
pigmentos mais polares do conjunto devem ter maior interao e aderncia na fase estacionria
altamente polar. Os pigmentos menos polares devem ficar mais tempo na fase mvel apolar e andar
mais rpido que os demais.
Terceira pergunta: por que as bandas alargaram do incio para o fim da coluna? Ora, h dois fatores
principais que podem provocar alargamento: (i) as substncias difundem-se com o tempo, logo, as
bandas alargam-se espontaneamente, quanto mais o tempo passa e (ii) as bandas alargam mais ainda
se houver muita irregularidade na distribuio da fase estacionria e/ou se o fluxo no for constante o
tempo todo.
Outras perguntas que se podem fazer : o que favoreceria mais a separao, gros de CaCO 3
homogneos e esfricos ou gros heterogneos e de formatos diversos? Gros maiores ou gros
menores? Pelo que conclumos h pouco, gros esfricos e homogneos devem dificultar o alargamento
da banda e favorecer a separao. Gros menores aumentariam a interao com a fase estacionria e
tambm devem favorecer a separao.
A banda o que se chama hoje de pico cromatogrfico. Neste caso, a deteco foi visual, mas h
detectores que transformam a passagem do analito em sinal eltrico e no necessitam da deteco
visual para fazer o registro. Nesta cromatografia clssica de Tswett, o escoamento da fase mvel
gravitacional, mas nos equipamentos modernos por bomba (fase mvel lquida) ou por presso
controlada de um cilindro de gs (fase mvel gasosa), embora a tcnica clssica ainda encontre grande
aplicao.
Podemos resumir alguns conceitos bsicos que ficam evidentes neste experimento: fase mvel, fase
estacionria, migrao diferencial (pela diferena na distribuio/partio de cada analito entre fase
estacionria/fase mvel) e alargamento (espontneo ou por irregularidades no sistema de escoamento)
do pico cromatogrfico. Alm disso, conclumos que fases homogneas e de pequeno tamanho
favorecem a separao.
PARTIO, FATOR DE CAPACIDADE E MIGRAO DIFERENCIAL
O processo de separao cromatogrfica , ento, o resultado de repetidos processos de
adsoro/absoro na fase estacionria e dessoro para a fase mvel durante o movimento dos
analitos. A separao ocorre devido s diferenas na distribuio de cada componente entre as duas
fases, isto na partio que se estabelece entre cada fase.
A partio entre duas fases imiscveis (que no se misturam), com o tempo, atinge um equilbrio
dinmico em que, mesmo que as molculas continuem migrando de uma fase para a outra, as
concentraes j no mudam com o tempo. A condio de equilbrio, embora no ocorra na
cromatografia (o movimento da fase mvel impede que as concentraes em cada fase atinjam o
equilbrio), vai determinar a tendncia da distribuio do analito entre cada fase.
Logo, a constante de equilbrio de um sistema de fases uma
medida da tendncia da distribuio, mesmo que o equilbrio
no seja atingido em nenhum momento. Esta constante
chamada de coeficiente de partio, usualmente simbolizada
por K e expressa matematicamente como K = [C]2/[C]1, onde C
concentrao e os ndices 1 e 2 simbolizam cada fase. Em
cromatografia, a equao da constante de equilbrio para cada
substncia (i) na distribuio entre fase estacionria (fe) e fase
mvel (fm) toma a seguinte forma:

Quanto maior Ki, maior a tendncia do analito em permanecer na fase estacionria e maior seu tempo de
reteno, pois o equilbrio cada vez mais deslocado para a fase estacionria e maior o tempo de
residncia das molculas na fase estacionria.
Na equao do coeficiente de partio, podemos substituir concentrao pela definio massa/volume e
desenvolver uma equao que leve em conta a relao entre os volumes de cada fase. Logo:

A relao entre os volumes de fase (Vfe/Vfm) simbolizada por . A relao entre as massas de cada
fase (m(i)fe/m(i)fm) simbolizada por k e chamada de fator de capacidade. A equao do fator de
capacidade assume a forma:

O fator de capacidade tem relao direta com a velocidade do deslocamento das molculas pela coluna,
pois a relao entre as massas tem relao direta com o nmero de molculas em cada fase (o nmero
de molculas proporcional massa de molculas).
Ou seja, quanto maior o ki, menor a velocidade de deslocamento. E esta relao com a velocidade (u)
tambm pode ser deduzida matematicamente de maneira bem simples. A frao do soluto na fase mvel
(f(i)m) tem a velocidade da fase mvel. A frao na fase estacionria (f(i)e) tem velocidade zero. A
velocidade mdia a velocidade de cada frao, multiplicada pelo valor da frao: (i) = f(i)eue+f(i)mum.
Como a frao na fase estacionria tem velocidade zero: (i) = f(i)mum
A frao f(i)m :
Dividindo numerador e denominador por m(i)fm, temos:
Substituindo na equao da velocidade mdia, temos:
Esta ltima equao mostra claramente que o aumento do fator de capacidade provoca o aumento da
reteno na coluna, pela diminuio da velocidade.
A medida operacional do fator de capacidade numa coluna cromatogrfica utiliza a definio bsica de
velocidade mdia, que espao/tempo. Ou seja, (i) = L/tR(i), onde L o comprimento da coluna e tR(i)
o tempo de reteno da substncia na coluna. L/tM , ento, a velocidade da fase mvel, onde tM o
tempo que a fase mvel leva para percorrer a coluna. Substituindo estas velocidades na equao da
velocidade mdia, teremos:

A medida do tempo de reteno da substncia e do tempo morto (tempo que a fase mvel percorre a
coluna) permite calcular o fator de capacidade de uma substncia numa determinada fase mvel e numa
determinada coluna. A ao da temperatura no fator de capacidade e nestes equilbrios ser discutida
adiante. Por ora, deve-se estabelecer temperatura constante no sistema, para poder efetuar a medio.
Conclui-se que a diferena no fator de capacidade que provoca a separao das substncias.
Faltou especificar a ao de , a razo entre volume de fase mvel e volume de fase estacionria, um
fator independente da natureza do analito. O aumento de provoca o aumento linear de todos os ks, o
que favorece a separao, pois aumenta a diferena entre os diferentes ks. Logo, os fabricantes tendem
a favorecer s altos, isto , (i) a diminuio do tamanho das partculas nas colunas de cromatografia
lquida, o que diminui os espaos vazios entre as partculas e diminui o volume da fase mvel, e (ii) a
diminuio do dimetro interno da coluna tubular aberta, usada em cromatografia em fase mvel gasosa
(ou cromatografia gasosa). Estas duas aes provocam o aumento de , de k i, da reteno e da

separao das substncias injetadas na coluna cromatogrfica. E tambm concorda com a observao
qualitativa, agora quantificada, de que a diminuio das partculas favorece o aumento da separao.
ALARGAMENTO DE PICO CROMATOGRFICO
O alargamento do pico cromatogrfico durante a corrida dificulta e diminui a resoluo entre os picos das
diferentes substncias. Podemos listar dois fatores bsicos para explicar o alargamento dos picos: (i) a
difuso espontnea das molculas (que s no espalhariam se no tivessem energia cintica), que
sempre ocorrer num meio solvel (aumento da entropia) e (ii) a difuso forada, que pode ocorrer se o
fluxo de fase mvel for turbulento, se a fase estacionria no homognea e se as conexes do sistema
de injeo (injetor) para a coluna e da coluna para o sistema de deteco (detector) so tambm
causadores de turbulncia no fluxo.
a difuso espontnea (i) que d ao pico o formato
aproximadamente gaussiano, pois um fenmeno aleatrio e
probabilstico. Ou seja, h uma mdia de posicionamento,
caracterstica do conjunto de molculas, mas o espalhamento
ao longo do tempo aumenta o desvio padro em relao
mdia de posio, isto , o pico alarga com o tempo. Se no
alargasse, teramos um pico quadrado o tempo todo. Este
alargamento afetado pela temperatura, por um lado, pois
maior temperatura significa maior energia cintica. Mas, como
o aumento de temperatura, por outro lado, tambm acelera a
sada das molculas (como veremos adiante), mais do que as
espalha, o efeito geral do aumento da temperatura tornar o
pico mais estreito quando sai da coluna. A difuso forada (ii)
torna o pico ainda mais largo quando finalmente sai da coluna.

A formato do pico sem espalhamento. B

formato do pico com espalhamento.

CROMATOGRAMA E RESOLUO ENTRE PICOS CROMATOGRFICOS

O registro cromatogrfico de um ou mais picos
chamado de cromatograma, mas ligeiramente
diferente da figura anterior, pois ele no registra
posio x concentrao, mas, sim, tempo x
concentrao, o que faz com que o pico seja
registrado de forma invertida em relao
posio, pois a posio mais frente a que sai
com menos tempo da coluna. Ou seja, o
cromatograma registra o que j aconteceu dentro
da coluna, depois que a ao cromatogrfica
atuou, pois o registro feito na sada da coluna.

A concentrao em relao posio na coluna. B

concentrao na sada da coluna ao longo do tempo.

A separao entre dois picos cromatogrficos medida pela

distncia em tempo entre os mximos de cada pico. Mas
separao e resoluo no so conceitos equivalentes em
cromatografia. Resoluo mede o inverso do grau de
superposio entre dois picos e depende no somente da
separao, mas tambm da largura de cada pico. Picos podem ter
pouca separao e estarem bem resolvidos, se houver ocorrido
baixo espalhamento, isto , se estiverem finos. Picos podem ter
muita separao e estarem mal resolvidos, se houver ocorrido
muito espalhamento, isto , se estiverem largos, o que facilita a
superposio. A resoluo , ento, diretamente proporcional
separao e inversamente proporcional largura dos picos.

A resoluo (Rs) pode ser expressa matematicamente por uma equao muito simples e plenamente
suportada pelas concluses tericas aqui expostas:

Onde tR tempo de reteno de cada pico consecutivo (1 e 2), medido na mdia, isto , no mximo de
cada pico, e W a largura de cada pico consecutivo (1 e 2), medida na base do pico.
A largura do pico, hoje, fornecida pelo registrador/computador, mas no passado era medida
visualmente. Medir a largura da base muito difcil, pois no fcil determinar onde o pico comea e
termina junto linha de base. Mas bastante fcil determinar onde comea e termina o pico na metade
de sua altura. Por isso, os livros mais antigos fornecem uma equao com a largura meia-altura e
mesmo os programas de computador de hoje calculam a largura da base a partir da largura meiaaltura. Esta equao alternativa usando a meia-altura toma a forma:

Onde W 1/2 a largura medida na meia-altura de cada pico consecutivo (1 e 2).

muito importante ressaltar que a resoluo ideal NO a
maior possvel. A resoluo ideal aquela em que o registro
apenas toca a linha de base antes de comear um novo pico,
isto , no h perda de tempo com registro de linha de base
somente, e o tempo do cromatograma o menor possvel. Este
valor, de Rs = 1,5, considerado ideal.

FALAR SOBRE O MECANISMO DE RESOLUO DENTRO DA COLUNA CONTRAPOSTO AO

REGISTRO FINAL.
PRATOS TERICOS E EQUAO DE VAN DEEMTER
PARMETROS CROMATOGRFICOS
AS DIFERENTES TCNICAS CROMATOGRFICAS (CONTRA CORRENTE, ELETROFORESE,
CAMADA FINA, PAPEL, FLUIDO SUPERCRTICO)