Biologia Molecular Da Célula

Faculdade de Medicina de Lisboa
Mdulo I.I
Biologia Molecular
da Clula
In Cooper 2 Edio
2007/2008
Biologia Molecular da Clula Mod. I.I
ndice
ndice ............................................................................................................................... 2
Capitulo Um (pg. 27 44) Uma Viso Geral das Clulas e Pesquisa Celular ..... 8
Origem e Evoluo ....................................................................................................... 8
Evoluo de Metabolismos ........................................................................................... 9
Procariontes Actuais ..................................................................................................... 9
Clulas Eucariticas ..................................................................................................... 9
Evoluo dos Eucariontes .......................................................................................... 10
Desenvolvimento dos Organismos Multicelulares...................................................... 10
Captulo Um (pg. 52-57) ............................................................................................. 12
Crescimento de Clulas Animais em Cultura ............................................................. 12
Cultura de Clulas Vegetais ....................................................................................... 13
Vrus ........................................................................................................................... 13
Captulo Dois A Qumica das Clulas ..................................................................... 14
A composio Molecular das Clulas ........................................................................ 14
Glcidos ....................................................................................................................... 14
Lpidos ........................................................................................................................ 15
cidos Nucleicos ........................................................................................................ 16
Protenas .................................................................................................................... 17
Enzimas ...................................................................................................................... 18
Mecanismo de Catlise Enzimtica ........................................................................... 18
Coenzimas .................................................................................................................. 19
Regulao da Actividade Enzimtica ......................................................................... 19
Energia Metablica ..................................................................................................... 19
Membranas Celulares ................................................................................................ 19
Transporte Atravs das Membranas Celulares .......................................................... 20
Captulo Trs (pg. 113 138) Fundamentos de Biologia Molecular .................. 22
Hereditariedade, Genes e DNA .................................................................................. 22
Genes e Cromossomas .............................................................................................. 22
Genes e Enzimas ....................................................................................................... 24
Replicao do DNA .................................................................................................... 24
Expresso da Informao Gentica ........................................................................... 24
Funo do RNA Mensageiro ...................................................................................... 24
O Cdigo Gentico ..................................................................................................... 25
Vrus de RNA e Transcrio Reversa ........................................................................ 25
DNA Recombinante .................................................................................................... 25
Endonucleases de Restrio ...................................................................................... 26
2
2007/2008
Electroforese em Gel .................................................................................................. 26

Gerar Molculas de DNA Recombinante ................................................................... 27
Vectores para DNA Recombinante ............................................................................ 28
Sequenciao do DNA ............................................................................................... 28
Expresso dos Genes Clonados ................................................................................ 29
Amplificao de DNA pela Reaco em Cadeia de Polimerase (PCR) ..................... 30
Transferncia de Genes em Plantas e Animais ......................................................... 30
Mutagnese de DNA Clonados .................................................................................. 31
Captulo Quatro A Organizao dos Genomas Celulares ..................................... 32
A complexidade dos Genomas Eucaritas ................................................................ 32
Intres e Exes ........................................................................................................... 32
Famlias Gnicas e Pseudogenes .............................................................................. 32
Sequncias de DNA Repetitivas ................................................................................ 33
Cromossomas e Cromatina ........................................................................................ 33
Cromatina ................................................................................................................... 33
Centrmeros ............................................................................................................... 34
Telmeros ................................................................................................................... 34
O Genoma Humano ................................................................................................... 34
Captulo Cinco Replicao, Manuteno e Rearranjos do DNA Genmico ........ 36
DNA Polimerases ....................................................................................................... 36
A Forquilha de Replicao ......................................................................................... 37
Fidelidade da Replicao ........................................................................................... 38
As Origens e a Iniciao da Replicao ..................................................................... 39
Os Telmeros e a Telomerase ................................................................................... 39
Reparao do DNA .................................................................................................... 40
Reverso Directa de Leses do DNA ........................................................................ 40
Reparao por Exciso .............................................................................................. 41
Reparao Ps-Replicao ........................................................................................ 41
Recombinao entre Sequncias Homlogas de DNA ............................................. 42
Molculas de DNA Recombinam-se por meio de Quebras e Rejunes .................. 42
Modelos de Recombinao Homloga ...................................................................... 42
Enzimas Envolvidas na Recombinao Homloga .................................................... 43
Rearranjos do DNA .................................................................................................... 44
Recombinao Stio-Especifica .................................................................................. 44
Transposio Atravs de Intermedirios de DNA ...................................................... 44
Transposio Atravs de Intermedirios de RNA ...................................................... 45
Amplificao Gnica ................................................................................................... 45
Captulo Seis Sntese e Processamento de RNA ................................................... 46
Transcrio em Procaritas ........................................................................................ 46
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A RNA Polimerase e a Transcrio ............................................................................ 46

Os Repressores e o Controlo Negativo da Transcrio ............................................. 46
Controlo Positivo da Transcrio................................................................................ 47
Atenuao da Transcrio.......................................................................................... 47
As RNA Polimerases Eucaritas e os Factores Gerais de Transcrio .................... 47
As RNA Polimerases Eucaritas ................................................................................ 47
Os Factores Gerais da Transcrio e a Iniciao da Transcrio pela RNA
Polimerase II............................................................................................................................ 48
A Transcrio pelas RNA Polimerase I e III ............................................................... 49
Regulao da Transcrio em Eucaritas ................................................................. 49
Sequncias Regulatrias com Actuao em Cis: Promotores e Enhancers ............. 49
Protenas Regulatrias Transcricionais ...................................................................... 50
Estrutura e Funo dos Activadores Transcricionais ................................................. 50
Repressores Eucaritas ............................................................................................. 51
Relao entre Estrutura da Cromatina e a Transcrio ............................................. 51
Metilao do DNA ....................................................................................................... 51
Processamento e Reciclagem de RNA ...................................................................... 52
Processamento do rRNA e do tRNA .......................................................................... 52
Processamento do mRNA em Eucaritas .................................................................. 52
Mecanismo de splicing ............................................................................................... 53
Splicing Alternativo ..................................................................................................... 54
Edio do RNA ........................................................................................................... 55
Degradao de RNA .................................................................................................. 56
Captulo Sete (pg. 297 325) Sntese, Procesamento e Regulao Proteicos . 57
Traduo do mRNA .................................................................................................... 57
RNAs de Transporte ................................................................................................... 57
O Ribossoma .............................................................................................................. 57
A Organizao de mRNAs e Inicio da Traduo........................................................ 58
O Processo de Traduo ............................................................................................ 58
A Regulao da Traduo .......................................................................................... 59
Dobramento e Processamento Proteicos ................................................................... 59
Chaperonas e Dobramento Proteico .......................................................................... 59
Enzimas e Dobramento Proteico ................................................................................ 59
Clivagem Proteica ...................................................................................................... 60
Glicolizao ................................................................................................................ 60
Ligao de Lpidos ..................................................................................................... 60
Captulo Nove Seleco e Transporte de Protenas .............................................. 62
Retculo Endoplasmtico ............................................................................................ 62
O Retculo Endoplasmtico e a Secreo de Protenas ............................................ 62
Direccionando Protenas para o Retculo Endoplasmtico ........................................ 62
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Insero de Protenas na Membrana do Retculo Endoplasmtico ........................... 63

Dobramento de Protenas e Processamento no Retculo Endoplasmtico ............... 63
O Reticulo Endoplasmtico ........................................................................................ 64
Exportao de Protenas e Lpidos do Retculo Endoplasmtico .............................. 64
O Complexo de Golgi ................................................................................................. 64
Organizao do Complexo de Golgi .......................................................................... 64
Distribuio de Protenas e Exportao do Complexo de Golgi ................................ 65
Protenas de Revestimento e de formao de Vesculas .......................................... 65
Fuso Vesicular .......................................................................................................... 65
Lisossomas ................................................................................................................. 66
Hidrolases Lisossomais cidas .................................................................................. 66
Captulo Dez (pg. 411-415) Bioenergtica e Metabolismo: Mitocondrias .......... 67
Mitocndrias ............................................................................................................... 67
Organizao e Funo das Mitocndrias ................................................................... 67
O Sistema Gentico das Mitocndrias ....................................................................... 67
Captulo Dez (pg. 437-441) Bioenergtica e Metabolismo: Peroxissomas ........ 68
Peroxissomas ............................................................................................................. 68
Funes do Peroxissomas ......................................................................................... 68
Captulo Onze O Citoesqueleto e o Movimento Celular ........................................ 69
O Citoesqueleto .......................................................................................................... 69
Microtbulos ............................................................................................................... 69
Constituio dos Microtbulos.................................................................................... 69
Transporte Celular e Protenas Motoras .................................................................... 70
Protenas Associadas aos Microtbulos .................................................................... 70
Drogas que Intreferem com os Microtbulos ............................................................. 71
Filamentos Intermdios .............................................................................................. 71
Diferentes Tipos de Filamentos Intermdios .............................................................. 72
Formao dos Filamentos Intermdios ...................................................................... 72
Filamentos de Actina .................................................................................................. 73
Polimerizao/Despolimerizao ............................................................................... 73
Protenas que Regulam a Polimerizao e Despolimerizao da Actina .................. 73
Drogas que Afectam o Citosqueleto de Actina........................................................... 74
Organizao do Citoesqueleto de Actina ................................................................... 74
Miosina ....................................................................................................................... 75
Contraco Muscular .................................................................................................. 75
Captulo Treze Sinalizao Celular .......................................................................... 76
Sinalizao de Molculas e seus Receptores ............................................................ 76
Modelos de Sinalizao Clula-Clula ....................................................................... 76
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Hormonas Esterides e Superfamlia de Receptores Esterides .............................. 76

Hormonas Peptdeas e Factores de Crescimento ..................................................... 76
Funes dos Receptores de Superfcie Celular ......................................................... 77
Receptores Acoplados Protena G .......................................................................... 77
Receptores de Protena-Tirosina Cinase ................................................................... 77
Vias de Transduo de Sinal Intracelular................................................................... 78
A Via do cAMP: Segundo Mensageiro e Fosforilao de Protenas .......................... 78
GMP Cclico ................................................................................................................ 79
A Via das Ras, Raf e MAP Cinase ............................................................................. 79
Regulao da Morte Celular Programada .................................................................. 79
Caspases e Apoptose ................................................................................................ 80
Receptores de Morte Celular e Activao de Caspases ............................................ 81
Sinalizao de Sobrevivncia Celular ........................................................................ 81
Captulo Catorze (pg. 596-617) O Ciclo Celular .................................................... 83
O Ciclo Celular dos Eucaritas................................................................................... 83
Fases do Ciclo Celular ............................................................................................... 83
Regulao do Ciclo Celular pelo Crescimento Celular e Sinais Extracelulares ........ 84
Pontos de Verificao do Ciclo Celular ...................................................................... 84
Ligao da Fase S para a Fase M ............................................................................. 85
Reguladores do Curso do Ciclo Celular ..................................................................... 85
MPF: Um Dmero de Cdc2 e Ciclina .......................................................................... 85
Famlia das Ciclinas e Cinases Dependentes de Ciclinas ......................................... 85
Factores de Crescimento e Ciclinas do Tipo D .......................................................... 86
Inibidores do Curso do Ciclo Celular .......................................................................... 87
Correlaes Clnicas ............................................................................................. 88

ndice ............................................................................................................................. 89
Vrus e Cancro .............................................................................................................. 90
A Doena .................................................................................................................... 90
Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 90
Preveno e Tratamento ............................................................................................ 90
Fenilcetonria ............................................................................................................... 91
A Doena .................................................................................................................... 91
HIV e SIDA ..................................................................................................................... 92
A Doena .................................................................................................................... 92
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Terapia Gnica para a Deficiencia de Adenosina Desaminase ............................... 93

A Doena .................................................................................................................... 93
Cancro do Clon e Reparao do DNA ...................................................................... 94
A Doena .................................................................................................................... 94
Factor de Transcrio Pit-1 e a Deficincia da Hormona do Crescimento ............ 95
A Doena .................................................................................................................... 95
Antibiticos e Sntese Proteica ................................................................................... 96
A Doena .................................................................................................................... 96
Doena de Gaucher ...................................................................................................... 97
A Doena .................................................................................................................... 97
Doenas das Mitocndrias: Neurapatias pticas Heredittia de Leber ................. 98
A Doena .................................................................................................................... 98
Distrofia Muscular e Citoesqueleto ............................................................................ 99
A Doena .................................................................................................................... 99
Fibrose Cstica ............................................................................................................ 100
A Doena .................................................................................................................. 100
Bases Celulares e Moleculares ................................................................................ 100
Preveno e Tratamento .......................................................................................... 100
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2007/2008
Faculdade de Medicina
edicina de Lisboa
Capitulo Um (pg. 27 44)

Origem e Evoluo
Eucariticas (com ncleo que armazena o DNA)
Clulas
Procariticas
citoplasmticos
icos e citoesqueleto)
(menores,
sem
ncleo,
organitos
Os mecanismos moleculares bsicos que controlam a vida de ambas as

clulas so os mesmo, o que nos sugere a existncia de um ancestral comum.
Em seguida a sequncia de acontecimentos que levaram 1 clula:
Atmosfera
Atmosfera Primitiva
Macromolculas
Polimeros
Capacidade
Capacidade de Auto-Replicarem-se
Auto
Proteinas ou Acidos Nuncleicos ?
Apenas
Apenas os acidos Nucleicos so capazes de controlar a sua autoreplicao
RNA
RNA (Sistema Gentico Inicial)
1 Clula
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2007/2008
A formao da primeira clula apenas foi possvel devido formao de

membranas de fosfolpidos, que permitiram isolar do restante meio ambiente as
molculas com a capacidade de se auto-replicar e assim ter um metabolismo
independete, devido s suas propriedade fsicas e qumicas. Os fosfolpidos
so compostos por uma cabea hidrfila e uma cauda hidrofbica:
Evoluo de Metabolismos
A capacidade de obter alimentos e energia directamente do meio
ambiente um dos factores limitadores para as clulas primordiais, foi assim
necessrio criar mecanismos de desenvolvimento prprio. Houve assim uma
evoluo da gliclise que permitiu a existncia de energia qumica (ATP),
surgiram os primeiros organismos fotossintticos o que levou a um grande
aumento da quantidade de oxignio na atmosfera e desencadeou a evoluo
dos mecanismos oxidativos (Respirao Aerbia).
Procariontes Actuais
Os procariontes actuais podem dividir-se em:
- Arqueobactrias (Bactrias em Ambientes Extremos)
- Eubactrias (Bactrias Actuais)
Os procariontes so constitudos pela membrana celular, alguns por uma
parede celular rgida, pelo nucloide (agregado de DNA) e pelos ribossomas.
Clulas Eucariticas
So mais complexas, possuem ncleo limitado por uma membrana
porosa, vrios organitos citoplasmticos e citoesqueleto.
Complexo de Golgi:
organizao e transporte
de protenas, sintese de
lpidos e alguns
polissacarideos (em
plantas)
Mitocndrias: respirao
aerbia
Retculo
Endoplasmtico:
organizao e
transporte de
proteinas, sintese de
lpidos
Lisossomas e
Peroxissomas: digesto
e reaces oxidativas
Cloroplasto: fotossntese
Clula
Eucaritica
Citoesqueleto: rede de
filamentos proteicos que
se estende pelo
citoplasma
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2007/2008
Faculdade de Medicina
edicina de Lisboa
O citoesqueleto,, apesar de no ser um organito propriamente dito

desempenha uma importante funo, fornece estrutura clula, determina o
seu formato, gera organizao celular, responsvel pelos movimentos,
responsvel pelo transporte
nsporte intracelular e pelo posicionamento dos organitos e
outras estruturas.
Evoluo dos Eucariontes

A Hiptese Endossimbitica a que melhor explica
plica o aparecimento
das clulas eucaritas,
s, e que se baseia na relao endossimbitica entre
bactrias aerbias
bias que vieram a originar as mitocndrias e cianobactrias que
originaram cloroplastos quando ingeridas por outras clulas. Esta hiptese
apoiada pelos seguintes factos:
- Mitocndrias e Cloroplastos so similares a bactrias;
- Estes reproduzem-se
reproduzem
por diviso binrias;
- Contm o seu prprio DNA;
- Tm ribossomas prprios;
- O seu cdigo gentico diferente do usado pelo genoma celular
nuclear;
- Os seus Ribossomas e rRNA so mais prximo do das bactrias do
que dos eucariticas.
Estas relaes endossimbiticas
endossimbiticas foram vantajosas e positivamente
seleccionadas e por isso perduraram,
perduraram permitindo assim que houvesse
evoluo, originando-se
se clulas eucariticas.
Desenvolvimento dos Organismos Multicelulares
Com uma cada

da vez maior necessidade de nutrientes e consequente
aumento da rea de contacto com o exterior, tornou-se
tornou se evidente que o simples
aumento da clula no era eficaz, iniciou-se
iniciou se assim uma srie de associaes
entre clulas de organismos idnticos, de forma a permitir uma maior rea sem
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2007/2008
que para isso aumentassem o seu volume. Desta associao surgiram as

colnias que apesar de serem clulas independentes eram favorecidas pelo
facto de estarem agrupadas. Progressivamente comeou a existir uma
diferenciao e especializao de determinados grupos de clulas e que mais
tarde viriam a originar os seres pluricelulares. Nestes existem grupos de clulas
com diferente funes, mas todos eles interdependentes e fazendo parte do
mesmo organismos.
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2007/2008
Captulo Um (pg. 52-57)

O microscpio electrnico no permite estudar as vrias funes dos
inmeros componentes da clula eucaritica e por isso necessrio isolar os
organelos (por tamanho e densidade) atravs da centrifugao diferencial.
Inicialmente feita a ruptura da membrana plasmtica que pode ser feita
por exposio a ultra-sons, triturao com homogeneizadores mecnicos ou
atravs de liquidificadores; de seguida a suspenso de clulas rompidas,
lisado ou homogenato, sujeita a uma srie de centrifugaes de velocidade
crescente, em cada uma possvel separarmos determinado componente.
Existem outros mtodos para obter de forma isolada os organelos:
- Centrifugao em gradiente de concentrao: separados por
sedimentao atravs de uma substncia densa (ex. sacarose);
- Centrifugao por velocidade: o material colocado no topo do
gradiente de sacarose, partculas de tamanhos diferentes sedimentam atravs
do gradiente em taxas diferentes, permitindo separar organitos com tamanhos
semelhantes;
- Centrifugao de Equilbrio: pode ser usada para separar organitos
com base nas suas densidades de flutuao, independentemente do seu
tamanho ou forma.
Crescimento de Clulas Animais em Cultura

Este processo mais complexo do que em bactrias e leveduras, no
entanto atravs dele que podemos estudar o crescimento e a diferenciao
celular. Permite-nos ainda manipulaes genticas necessrias para a
compreenso da estrutura e funo dos genes.
O processo consiste em retirar uma clula de um tecido, coloca-la num
meio de cultura nutritivo numa placa de cultivo, algumas das clulas aderem e
crescem formando colnias, a placa de cultivo assim preenchida dando
origem a uma cultura primria, desta retirado um conjunto de clulas que so
colocadas noutra placa de cultivo, dando origem a uma cultura secundria, este
processo repete-se at cerca de 50 a 100 vezes, aps isto as clulas perdem a
capacidade de se duplicarem.
frequente o uso de tumores ou clulas de embries como material de
partida, j que contm clulas de crescimento rpido, e no caso dos tumores
no possuem limitaes quanto ao nmero de duplicaes que possvel
realizar. Um dos inconvenientes deste processo que ele muito mais
demorado, cerca de 10x, do que quando realizado em bactrias e leveduras.
Meio de Cultura Nutritivo no caso da cultura de clulas animais
bastante mais complexo do que para as bactrias e leveduras, pois
necessrio incluir factores de crescimento e de regulao, aminocidos
essenciais no sintetizados pelo organismo, e os habituais nutrientes.
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2007/2008
Cultura de Clulas Vegetais

As clulas vegetais podem ser cultivadas desde que no seu Meio de
Cultura Nutritivo sejam adicionados os factores de crescimento adequados.
O processo iniciado com a recolha de uma clula que por divises
mitticas ir originar um conjunto de clula, o calo; contrariamente ao que
ocorre nos animais, as clulas restauram a totipotncia, sendo assim possvel
originar de uma s clula toda uma planta nova.
Vrus
Os vrus no considerados seres-vivos, so parasitas intracelulares que
necessitam de uma clula hospedeira para originarem descendncia, fazendo
uso dos mecanismos dessa mesma clula.
Existem retrovrus cujo material gentico no , como seria de esperar,
o DNA, mas sim o RNA. Este vrus fazem uso da transcriptase reversa para
originarem cDNA que possa ser incorporado no genoma da clula hospedeira,
visto que esta enzima menos eficiente, os vrus tm elevadas taxas de
mutao.
Os bacterifagos so altamente eficientes chegando em apenas 20 a 30
minutos, infectada apenas uma clula, a originarem cerca de 200 novas
partculas virais.
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2007/2008
Captulo Dois
A composio Molecular das Clulas
As clulas so genericamente compostas por gua, ies inorgnicos e
molculas orgnicas, sendo a molcula de gua a mais abundante (cerca de
70% da massa da clula).
A interaco entre a gua e as restantes molculas de elevada
importncia: destaca-se o facto de ser uma molcula polar, podendo formar
pontes de hidrognio e interagir com ies carregados electricamente. Assim
sendo as molculas polares (hidrfilas) so muito solveis em gua, enquanto
as molculas apolares (hidrofbicas) so fracamente solveis em gua.
Devido ao facto de serem fracamente solveis, as molculas apolares
tendem a associar-se entre si de modo a minimizar o contacto com a gua
efeito hidrofo.
Os ies inorgnicos (sdio, potssio, magnsio, clcio, cloro e
bicarbonato) constituem 1% ou menos da massa da clula e esto envolvidos
em vrios aspectos do metabolismo e funes da clula.
As molculas orgnicas podem ser na sua maioria divididas da seguinte
forma:
- Protenas (Aminocidos);
- Glcidos (Oses);
- Lpidos (cidos Gordos);
- cidos Nucleicos (Nucletidos).
So macromolculas formadas por polimerizao dos seus monmeros
e que constituem entre 80% a 90% da massa restante da clula, de seguida
iremos falar individualmente de cada um dos grupos anteriormente referidos.
Glcidos
Os seus monmeros so as oses, a mais conhecida a glicose, e tm
como funo o consumo no organismo, enquanto os polmeros, como o
caso do glicognio, tm uma funo de armazenamento.
Os glcidos associados a outras macromolculas, como exemplo as
protenas, podem funcionar como marcadores em vrios processos de
reconhecimento celular.
Dentro dos glcidos destaca-se a glicose pois a principal fonte
energtica das nossas clulas, esta pode ocorrer na sua forma linear ou na sou
forma cclica. Quando se encontra na sua forma cclica pode encontrar-se em
conformaes diferente ou (respectivamente trans ou cis) que
dependem da conformao do carbono um. Estas diferentes conformaes vo
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2007/2008
ter implicaes ao nvel da sua interaco

nomeadamente nos metabolismos celulares.
com
outras molculas,
Os vrios monossacardeos so unidos por intermdio de uma reaco

de desidratao e ficam unidos por uma ligao glicosdica. Quando o
nmero de monossacardeos unidos reduzido denomina-se oligassacardeos,
se forem cadeias muito longas denominam-se polissacardeos. A ligao
ocorre geralmente entre C1---C4, mas pode ocorrer esporadicamente entre C1--C6; a ligao denomina-se ou dependendo da conformao do carbono
anumrico que intervm na ligao.
Lpidos
As principais funes dos lpidos so:
- Armazenamento de Energia;
- Sinalizao Celular (Hormonas);
- Principais componentes das membranas.
Os lpidos mais simples so os cidos gordos, mais frequentes as
cadeias com 16 ou 18 carbonos, estes podem ser insaturados (uma ou mais
ligaes duplas entre carbonos) ou saturados (sem ligaes duplas entre
carbonos).
A natureza hidrofbica das cadeias de cidos gordos responsvel pelo

comportamento dos lpidos mais complexos, nomeadamente na formao de
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2007/2008
membranas, como o caso das membranas plasmticas formadas por uma

bicamada fosfolipdica.
Os lpidos so armazenados sob a forma de triacilglicerois e constituem
a forma mais eficiente de armazenar energia pois quando degradados, pela
oxidao, originam mais do dobro de energia (ATP) do que os glcidos.
Os fosfolpidos so os principais componentes da membrana, no entanto
encontramos ainda glicolpidos e colesterol.
Ao grupo fosfato de um fosfolpido pode estar ligada outra molcula

polar, como o caso da colina, em cima na imagem, que pode ser um glcido e
funcionar como receptor de membrana ou marcador. Existe ainda uma
excepo em que o fosfolpido no contm glicerol, a esfingomielina.
cidos Nucleicos
Existem dois tipos de cidos nucleicos, o DNA (desoxirribonucleico) e o
RNA (ribonucleico), que diferem entre si apenas no acar (ose), que num caso
a desoxiribose e noutro a ribose, respectivamente.
Existem vrios tipo de RNA:
- mRNA (RNA mensageiro)
- rRNA (RNA ribossmico)
- tRNA (RNA transferncia)
- RNAs envolvidos no processamento e transporte de protenas
Os monmeros dos cidos nucleicos so o nucletidos, que so
constitudos por uma base purina ou pirimidina, um acar (ose) e um fosfato.
As bases purinas so a:
Adenina e a Guanina; e as pirimidinas
a: Citosina e a Timina/Uracilo.
importante referir que a Adenina e a
Timina/Uracilo se ligam por apenas
duas pontes de hidrognio, enquanto
a Guanina e a Citosina se ligam por
trs pontes de hidrognio.
A polimerizao feito por
intermdio de ligaes fosfodister
entre o grupo fosfato no C5 e grupo
hidroxilo no C3 da base que se segue,
no esquecer que este processo
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2007/2008
ocorre sempre no sentido 5 3 e por isso mesmo, por conveno, se escreve

sempre nesse mesmo sentido.
Os nucletidos so importantes para a formao os cidos nucleicos, no
entanto eles intervm noutros processos de elevada importncia, como o
caso do ATP (adenosina 5 trifosfato), usada como energia qumica da
clula, ou do AMPc, que um dos sinalizadores intracelulares.
Protenas
Os cidos nucleicos guardam a informao, as protenas tm como
principal funo executar as tarefas contidas nessa informao, e ainda
funes de estrutura, de transporte e armazenamento de pequenas molculas,
transmisso de informao, defesa e em situaes extremas podem ser
utilizadas para produzir energia.
A principal capacidade das protenas a de agirem como enzimas,
catalisando as reaces nos sistemas
biolgicos.
As protenas so polmeros de
aminocidos, existem cerca de 20
aminocidos, e cada um deles possui
caractersticas
especiais.
Os
aminocidos
podem
ter
diversas
conformaes, dependendo da posio
relativa do grupo amina em relao ao
carbono , como verificamos na imagem
O aminocido cistena importante

pois atravs do seu grupo lateral, mais
especificamente do grupo SH conseguem
com outro resduo do mesmo aminocido
formam pontes dissulfeto.
2007/2008
ao lado. Estando a
cadeia
lateral
localizada inferiormente
e o grupo amina e
hidroxilo no mesmo
plano, se o grupo
amina
estiver
esquerda, temos um L
aminocido, so os
nicos encontrados nas
protenas humanas; se
o grupo amina estiver
direita do carbono ,
temos
um
D
aminocido (ter em
conta
que
este
raciocnio apenas
vivel se o radical se
encontrar representado
inferiormente).
17
Os aminocidos podem ser divididos quanto s suas caractersticas

qumicas, como sendo cidos/bsicos ou polares/apolares, estas esto
dependentes da sua cadeia lateral.
Os aminocidos formam protenas ligando-se entre si por intermdio de
ligaes peptdicas, e so sempre sintetizados no sentido de um grupo amina
para um grupo hidroxilo.
A sequncia de aminocidos apenas o primeiro elemento da estrutura
das protenas, estas adaptam estruturas tridimensionais que so crticas para a
sua funo. Assim sendo existe uma estrutura primria que consiste numa
sequencia linear de aminocidos; a estrutura secundria pode dividir-se em
duas estruturas:
- Folha Pregueada, quando duas cadeias esto lado a lado formamse pontes de hidrognio entre elas, geram-se fitas paralelas ou anti-paralelas;
- Hlice, a cadeia de aminocidos gira em torno de si mesma e o
grupo carboxilo de um resduo de aminocido liga-se por ponte de hidrognio
ao grupo amina do resduo de aminocido localizado 4 posies abaixo na
cadeia.
A associao de estrutura -hlice e -pregueada, conectados pela
cadeia lateral dos seus resduos de aminocidos, leva formao de estruturas
globulares, denominadas de domnios, formando a unidade bsica da
estrutura terciria. Na estrutura terciria os aminocidos hidrofbicos
encontram-se no interior. Por fim temos a estrutura mais complexa,
denominada por estrutura quaternria, que consiste na interaco de cadeias
polipeptdicas de diferentes protenas, originando protenas constitudas por
diversos domnios.
Enzimas
As enzimas catalisam,
aumentam a velocidade, das
reaces que ocorrem no interior
das nossas clulas. Estas
possuem duas caractersticas
que as tornam adequadas para a
sua funo, aumentam a
velocidade da reaco sem se
consumirem e sem alterar o
equilbrio qumico da mesma.
O princpio de funcionamento das enzimas consiste em diminuir a
energia de activao, aumento a velocidade da reaco tanto no sentido
directo como no sentido inverso.
Mecanismo de Catlise Enzimtica

A ligao Enzima + Substrato muito especifica, existindo para explicar
esta especificidade dois modelos:
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2007/2008
- Modelo Chave-Fechadura, onde o substrato encaixa perfeitamente

com o centro activo da enzima que catalisa a reaco;
- Encaixe Induzido, a conformao da enzima e do substrato so
modificados pela ligao do substrato, a conformao de tal forma alterada
que idntica do estado de transio, o que pode facilitar a sua converso
no produto final.
Coenzimas
Para que o complexo enzima e substrato posso estar activo necessria
a ligao de um grupo prosttico enzima, que pode ser uma vitamina ou
ies metlicos. Uma das diferenas das coenzimas que estas so alteradas
durante a reaco, no entanto so recicladas de modo a poderem ser
utilizadas de novo.
Regulao da Actividade Enzimtica

Existem diversos tipos de regulao enzimtica, destacando-se os
seguintes:
- Inibio por retroalimentao, o produto de uma das reaco da via
metablica, geralmente o produto final, vai se ligar enzima que catalisa a
primeira reaco desta via de forma a que esta fique inibida. assim possvel
que haja um controlo dos gastos energticos e de substrato, pois havendo
muito produto no necessrio que haja continuao da produo, podendo o
substrato ser utilizado para outra via;
- Regulao Alostrica, a enzima regulada pela ligao de pequenas
molculas ao seu centro alostrico, inibindo-a ou activando-a, no entanto esta
substncia pode ou no ser um produto da via metablica em questo;
- Fosforilao, a adio de grupos fosfato activa ou inibe a actividade
enzimtica.
Energia Metablica
Este tema referido no nosso programa de bioqumica e por isso no o
vou referir aqui devido sua extenso e no ser muito relevante para a
Biologia Molecular da Clula, mas aqui ficam algumas palavras-chaves centrais
deste tema:
- ATP
- Gliclise
- Respirao Aerbia
- Fotossntese
- Oxidao
- Sntese de Protenas, Glcidos e Lpidos
Membranas Celulares
As membranas so barreiras entre o meio intracelular e o extracelular;
dentro da clula definem os diversos compartimentos existentes. A sua origem
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2007/2008
e estrutura deriva das propriedades dos

lpidos, em grande parte dos fosfolpidos.
Todas as membranas possuem uma
estrutura comum composta por uma
bicamada fosfolipdica e protenas, que
podem desempenhar funo de transporte,
receptoras e de controlo. A percentagem de
lpidos e de protenas aproximadamente
equitativa, dentro dos lpidos destaca-se
ainda a presena de colesterol e de
glicolpidos. Esta estrutura em bicamada
permite que molculas individuais estejam
livres para girarem e se moverem em
direces laterais, pois uma estrutura
fluida.
A fluidez depende da temperatura, mas tambm da composio lipdica
da membrana. As cadeias de cidos gordos insaturados juntamente com
cadeias curtas de cidos curtos contribuem para uma maior fluidez, por sua vez
o colesterol torna-a menos fluida, no entanto permite que a fluidez seja mantida
mesmo a temperaturas baixas.
As protenas de membrana tm um papel diminuto na estrutura da
membrana, sendo a sua actividade executar funes especficas de cada
membrana. Podemos distinguir dois tipos de protenas nas membranas:
- Protenas Transmembranares ou Integrais, que esto includas
dentro da bicamada fosfolipdica;
- Protenas Perifricas, no esto inseridas na membrana, mas
associadas bicamada fosfolipdica perifericamente, geralmente ligadas a
protenas integrais.
As pores que atravessam a bicamada so geralmente de estrutura em
-hlice de 20 a 25 aminocidos no polares e esto geralmente associadas a
glcidos, permitindo a interaco entre clulas. importante referir que existem
ainda estruturas denominadas de Barris , que consistem em vrias protenas
com estrutura de folha -pregueada de forma a formarem um poro na
membrana permitindo a entrada de diversas molculas.
Transporte Atravs das Membranas Celulares

As membranas possuem permeabilidade
selectiva, o que permite clula manter e controlar
a sua composio interna. Apenas as molculas
pequenas e apolares atravessam prontamente a
membrana; as que no o conseguem por si s
fazem-no
por
intermdio
de
protenas
transmembranares especificas que agem como
transportadores, o que origina a permeabilidade
selectiva das membranas.
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As protenas de transporte podem ser divididas em protenas de canal,

consistem em poroso abertos selectivamente, ou em protenas transportadoras,
que se ligam e transportam selectivamente, facilitam a passagem por elas
mudando a sua conformao.
O transporte pode ser feito de forma passiva, a favor do gradiente de
concentrao, ou de forma activa, com gasto energtico e contra o gradiente
de concentrao, permitindo o controlo da composio interno da clula.
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Captulo Trs (pg. 113 138)

Hereditariedade, Genes e DNA
Todos os organismos herdam dos seus progenitores a informao
gentica especificando estrutura e funo das suas clulas. Visto que todas as
clulas so originadas de outras pr-existentes, o material gentico replicado
e passado da clula parental para a descendente em cada diviso.
Genes e Cromossomas
Os princpios bsicos genticos foram deduzidos por Gergor Mendel em
1865:
Alelo cpia de um gene, que especifica uma determinada
caracterstica. Existem dois alelos para cada gene, sendo que um herdado do
pai e outro da me.
Dominante demonstra-se sempre, quer em homozigotia, quer em
heterozigotia.
Recessivo expressa-se apenas quando em homozigotia.
Gentipo constituio de um indivduo em genes.
Fentipo caractersticas fsicas que advm do seu gentipo.
Cromossomas so como que carregadores de genes.
Diploide (2n) existem no organismo duas cpias do genoma, existem
cromossomas homlogos.
Haploides (n) apenas existe uma cpia do genoma.
Existem dois tipos de diviso celular, sendo que uma a mitose e outra
a meiose. Na mitose existe uma conservao numrica do material gentico
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da clula, onde uma clula diploide origina duas igualmente diploides. Na

meiose encontramos duas divises, sendo que a primeira reducional, ou seja,
de uma clula diploide originam-se duas haploides, que por sua vez se iro
dividir, mantendo a quantidade de genoma, originando-se assim quatro clulas
haploides. Apenas na formao dos gmetas existe a diviso meitica, pois
necessrio que estes sejam haploides, para que a quando da fecundao se
possa formar uma clula diploide e por divises mitticas, que conservaro o
nmero de cromossomas, surgir um individuo diploide.
Durante a meiose ocorrer recombinao entre os genes, sendo mais
frequente entre genes distantes do que prximos.
Ao longo da nossa vida ocorrem

alteraes nosso genoma, que podem ser
chamadas num contexto biolgico de
mutaes, no entanto no ponto de vista
clnico apenas as que originam uma
patologia, e se encontram sob uma
presso selectiva negativa e por isso ocorrem numa percentagem menor da
populao, so designadas de mutaes; as restantes e que ocorrem
geralmente numa percentagem entre 1% a 3% da populao, no sendo
prejudiciais, no sofrem uma presso selectiva negativa e por isso so
transmitidas descendncia, designam-se por polimorfismos. Atravs do
estudo dos polimorfismos possvel estudar migraes, e relaes entre
pessoas ao longo de muitas geraes, como identificar corpos ou realizar
testes de paternidade.
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2007/2008
Genes e Enzimas
Atravs de vrias experiencias chegou-se concluso que uma
determinada mutao alterava uma determinada via metablica, logo alterava
uma enzima, e que diferentes mutaes em genes diferentes afectavam
diferentes vias ou diferentes pontos de uma mesma via e dai conclui-se que
cada gene correspondia a uma protena.
Este princpio de que a cada gene corresponde uma protena um
dos grandes pilares da actual gentica.
Replicao do DNA
A descoberta das cadeias duplas de DNA originou uma soluo para a
questo de como o material gentico se replicaria, as duas cadeias poderiam
separar-se e servir de molde para a sntese de uma nova cadeia atravs da
complementaridade de bases hiptese semiconservativa.
A replicao do DNA na clula mediada pela enzima DNA polimerase
e ocorre sempre no sentido de 5 para 3.
Expresso da Informao Gentica

Os genes determinam a estrutura (sequncia de aminocidos) das
protenas, as quais so responsveis por direccionar o metabolismo; estas
actuam como enzimas e tornam as reaces na clula possveis, no sentido
em que aumentam a sua velocidade. As protenas so polmeros de
aminocidos, cuja sequncia determina a sua estrutura e funo.
Funo do RNA Mensageiro

Apesar de ser o DNA que determina a sequencia de aminocidos, no o
faz directamente, o que se prova pelo facto do DNA se localizar no ncleo e a
sntese proteica se realizar no citoplasma, logo preciso uma molcula que
transporte a informao para os ribossomas mRNA.
O RNA similar ao DNA, apenas difere no facto de ser uma cadeia
simples, o seu acar ser a ribose e possuir uracilo no lugar de timina. Apesar
das diferenas possvel sintetizar uma molcula de RNA a partir de um molde
de DNA, logo o RNA mensageiro originado tendo como molde o DNA num
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2007/2008
processo denominado transcrio. A transcrio catalisada pelo RNA

polimerase, no entanto para a sntese proteica ainda importante o RNA
ribossomal e o RNA de transferncia.
O Cdigo Gentico
Como que a sequncia de nucletidos do mRNA traduzida numa
sequncia de aminocidos?
Visto que os aminocidos e nucletidos no so estruturalmente
relacionados, no possvel o emparelhamento directo entre o mRNA e os
aminocidos. Assim sendo o tRNA serve de adaptador, permitindo a relao
entre o mRNA e os aminocidos.
Cada aminocidos ligado a um tRNA especfico, que tem uma
sequncia (anticodo) que emparelha com uma sequncia do mRNA (codo),
permitindo desta forma direccionar correctamente a sntese de protenas.
Atravs da determinao da sequncia de nucletidos que origina
determinado aminocido foi criado o cdigo gentico. Todos os organismos
tm o mesmo cdigo gentico, sendo que os dois primeiros nucletidos
iniciais so mais especficos do que o 3, ou seja, uma alterao no 3
nucletido menos propcia a provocar uma mutao patognica. UAA, UAG e
UCGA so codes de finalizao, indicam ao ribossoma que a traduo deve
terminar. Existem apenas 4 nucletidos, que se agrupam 3 a 3 (tripletos), o que
origina 43 combinaes possveis, temos assim 64 codes possveis. Visto que
apenas existem 20 aminocidos, e temos 64 codes, indica-nos que o cdigo
gentico redundante, sendo um aminocido codificado por mais do que
um codo.
Vrus de RNA e Transcrio Reversa

Apesar do DNA ser o material gentico de eleio para quase todas os
organismos, devido sua maior estabilidade, existem alguns vrus cujo
genoma constitudo apenas por RNA Retrovrus.
Surgiu ento a questo de como poderia este vrus incluir o seu genoma
no da clula, assim sendo, estes vrus possuem uma enzima, a transcriptase
reversa, que faz o inverso da transcrio, sintetizando uma molcula de
DNA tendo como molde uma de RNA.
A transcrio reversa no ocorre apenas nestes vrus, mas tambm nas
nossas clulas e responsvel pela transposio de sequncias de DNA de
uma localizao cromossmica para outra.
Este processo, a transcrio reversa, permite ainda aos investigadores
originar de qualquer molcula de RNA uma de DNA, o que facilita o estudo das
clulas eucariticas.
DNA Recombinante
A tcnica de DNA recombinante permitiu aos cientistas isolar,
sequenciar e manipular os genes individuais de qualquer clula,
revolucionando assim a Biologia Molecular e Celular. Esta tcnica inclui alguns
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2007/2008
conceitos como as endonucleases de restrio, vectores recombinantes,

sequenciamento, entre outras que abordaremos de seguida.
Endonucleases de Restrio
So enzimas que clivam o
DNA em sequencias especificas,
de quatro a oito pares de bases, e
que foram pela primeira vez
identificadas em bactrias, onde
clivam o DNA estranho como modo
de defesa contra vrus.
Existe uma enorme variedade
de endonucleases de restrio, mais
de uma centena, cada um
reconhece apenas uma sequncia
especifica, sendo esta uma das
suas caractersticas.
Aps a clivagem num ponto desta determinada sequencia, no maior
parte dos casos, originam-se extremidades coesivas, que so
complementares; porm existem excepes, em que ao clivarem, estas
enzimas, no originam extremidades com cadeia simples, , que surgem neste
caso, so complementares com qualquer outra extremidade cega, no entanto
mais difcil fazer com que estas se unam.
Electroforese em Gel
O mtodo mais comum em que as
molculas so separadas com base na
razo da sua migrao num campo elctrico,
tendo em conta que se usam gis de
agarose ou de policrilamida. Este gel
colocado num compartimento contendo uma
soluo tampo e elctrodos, a amostra
pipetada em poos abertos no gele o campo
elctrico ligado. Os cidos nucleicos,
carregados negativamente, devido ao grupo
fosfato, migram em direco ao plo
positivo. O gel funciona como que uma
peneira, retardando o movimento das
molculas maiores e facilitando a passagem
de molculas menores, o que permite a sua
separao pelo seu tamanho e peso
molecular.
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Gerar
Molculas
Recombinante
de
DNA
A estratgia bsica da clonagem de

molculas inserir o DNA de interesse num
vector, que consiste numa molcula de DNA
com a capacidade de se auto-replicar,
independentemente
do
DNA
da
clula
hospedeira. Resulta ento uma molcula
recombinante que composta pelo insert de
DNA (molcula de interesse) ligado sequencia
de DNA do vector. Este vector pode ser inserido
numa clula hospedeira e originar inmeras
cpias.
Os fragmentos de DNA usados para

criar
molculas
recombinantes
so
normalmente gerados por digesto com
enzimas
de
restrio,
deixando
extremidade coesivas que podem ligar-se
a outras por complementaridade. O
restabelecer entre estas extremidades
pode ser mediado pelas DNA ligases,
assim sendo dois fragmentos de DNA
clivados pelo mesma enzima de restrio
podem ser unidos, originando uma
molcula de DNA recombinante.
As sequencia de RNA tambm
podem ser clonadas, primeiro atravs da
transcriptase reversa, que origina cDNA
(DNA complementar), podendo assim ser
ligada a um vector como j foi descrito
anteriormente. Este mtodo permite um
melhor estudo da estrutura e funo
gentica dos eucaritas, viste que permite
estudar as sequencias de DNA sem os
seus intres, sequencias no codificantes
e que so removidas na clula por
splicing, visto que originamos cDNA a
partir de mRNAs maduros (j sem os seus
intres).
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Vectores para DNA Recombinante

Existem diversos tipos de vectores, como
o caso dos vectros bacterifagos ,
cosmdeos, cromossomas artificiais de leveduras
(YAC), no entanto os que mais amplamente
utilizados so os plasmdeos. Os plasmdeos
permitem uma mais fcil manipulao, sendo
molculas circulares de DNA com capacidade
de ser auto-replicarem.
Para um vector de clonagem
necessrio:
- Origem de Replicao: local onde se liga a DNA polimerase e que
permite a replicao;
- Gene de Resistncia a Antibiticos: permite seleccionar as clulas
hospedeiras onde foi ou no incorporada o vector;
- Local de Policlonagem: local onde existem sequencias de corte para
vrias enzimas de restrio, o nico local onde estas clivam, e na maior parte
dos casos clivam neste local apenas uma vez;
- Promotor: permite a expresso, pois aqui que se ir ligar a RNA
polimerase, e a sua presena distingue um vector de expresso de um de
clonagem.
Nota: importante ter em conta que a ligao entre o insert de DNA
e o vector de clonagem no um processo muito eficaz, por isso colocase o insert de DNA em excesso. Mesmo que este processo ocorra, e haja
uma recirculao da molcula de DNA, existem trs situao possveis e
apenas uma delas a pretendida: plasmideo no-recombinante,
plasmideo recombinante com o insert na posio correcta (5 3) ou na
posio incorrecta (3 5). Esta situao solucionvel com a anlise
das colnias que se formam, podendo assim determinar qual a que tem o
plasmdeo recombinante com o insert na posio correcta. Esta situao
analisada com a digesto dos plasmideo de vrias colnias, com a
mesma enzima de restrio, e posterior electroforese, que atravs do
tamanho dos fragmentos nos permite saber qual o correcto.
Sequenciao do DNA
A clonagem de DNA permite o isolamento de sequncias de DNA em
quantidades suficientes para a sua caracterizao detalhada, incluindo a
determinao da sua sequencia. O mtodo mais utilizado o baseado na
terminao prematura da sntese de DNA resultante da incluso de
didesoxinucleotdeos (no contm o grupo hidroxilo no carbono 3).
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A sntese de DNA
comea com um primer, pois a
DNA polimerase no capaz
de iniciar a sntese a partir de
uma cadeia simples de DNA,
este primer marcado com um
radioistopo. So feitas quatro
reaces separadas, cada uma
delas
contento
um
didesoxinucleotdeo, alm dos
restantes componentes comuns
(primers, DNA de interesse,
nucleotdeos
e
DNA
polimerase). A incorporao de
um
didesoxinucleotdeo
bloqueia a sntese da restante
cadeia, existem assim em cada
reaco diversos fragmentos
com diversos tamanhos, no entanto todos eles terminam num
didesoxinucleotdeo (A,G,C ou T). Estes fragmento so separados por
electroforese, em gel de policrilamida (que permite uma maior resoluo), o gel
exposto a um filme raio-X. visto que o tamanho de cada fragmento
determinado pelo didesoxinucleotdeo terminal, a sequencia do DNA
corresponde ordem dos fragmentos lidos a partir do gel.
Actualmente a sequenciao em grande escala feito por sistemas
automticos que contendo primers ou didesoxinucleotdeos florescentes, so
submetidos electroforese e ao passarem num laser so excitados e emitem
luz, que detectada por um fotomultiplicador e analisada por um computador,
assim feita a sequencia do DNA (em fluorogramas de sequenciao). Se forem
utilizados didesoxinucleotdeos florescentes, desde que cada um emita uma luz
distinta, a reaco pode ser toda efectuada num mesmo microtubo.
Expresso dos Genes Clonados

A clonagem molecular alm de permitir sequenciar os genes, permite
ainda a obteno de grandes quantidades de protena, tanto para o seu estudo,
como para o uso teraputico.
Para expressar um gene eucaritico em E.Coli, o cDNA de interesse
clonado dentro de um vector plasmidial ou fago que contenha sequncia que
dirijam a transcrio, promotor, o que origina um vector de expresso. Visto
que se trata de uma protena eucariotica til expressa-la num organismo
eucariotico, para que as modificaes ps-traducionais possam ocorrer de
forma normal.
Por norma, nos vectores de expresso, existe uma sequncia de
reguladora, para que a expresso de determinada protena possa ser
controlada, de modo a preservar a clula hospedeira. Podemos ainda adicionar
ao vector determinadas sequncias, como o caso da sequencia de Shine
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2007/2008
Delgarno, onde se liga a RNA polimerase procaritica, de modo a aumentar a

produo de uma determinada protena.
Amplificao
de
DNA
pela
Reaco em Cadeia de Polimerase
(PCR)
Para realizarmos a PCR, que consiste
numa DNA polimerase usada repetidas vezes,
produzindo de forma exponencial; no entanto
necessrio conhecer alguma sequencia da
molcula de DNA que desejamos amplificar.
So usados primers de DNA, de 15 a 20
nucletidos, que flanqueiam a regio em ambos os
lados e que hibridem apenas uma vez na molcula
de DNA presente. A soluo contendo DNA, DNA
polimerase, nucletidos e primers aquecida
(95C) para que haja a separao das cadeias
duplas de DNA. A temperatura diminuda para
permitir a hibridao dos primers, permitindo
assim que a DNA polmeras inicie a sntese de
novas cadeias, o que feito a uma temperatura
ptima (75C). Estes ciclos so repetidos cercas
de 30 vezes e permitem originar de uma nica
molcula de DNA inmeras molculas de DNA,
cerca de 230.
Transferncia
Plantas e Animais
de
Genes
em
Apesar de o estudo em clulas eucaritas

ser complexo possvel, recorrendo
transferncia gnica, estudar os mecanismos de regulao da expresso
genica e processamento proteico.
O DNA introduzido nas clulas animais juntamente com um coprecepitado de fosfato de clcio. Inicialmente o processo era feito atravs de
DNA infecciosos virais e por isso este processo muitas vezes designado
como transfeco. Este DNA absorvido e transportado at ao ncleo onde
transcrito por vrios dias, no entanto numa pequena fraco das clulas o DNA
integrado no seu genoma e transmitido aos seus descendentes. As clulas
que contem este gene podem ser isoladas se este conferir resistncia a
determinados antibiticos, podendo assim ser estudado o efeito destes genes
no comportamento celular.
Existem outros mtodos para a incorporao de DNA em clulas de
mamferos:
- Microinjeco directa de DNA no ncleo;
- Incorporao de DNA em vesculas lipdicas;
30
2007/2008
- Impulso elctrico que abre os poros transientes na membrana

(electroporao);
- Vrus usados como vectores, especialmente retrovrus, pois no seu
ciclo est includa a integrao estvel do DNA viral no genoma das clulas
hospedeiras.
Mutagnese de DNA Clonados

Os genes mutados so detectados porque resultam em mudanas
fenotpicas observveis.
O isolamento de genes pelo DNA recombinante tem aberto novas
fronteiras, agora possvel introduzir qualquer alterao desejada num gene,
clona-lo e determinar o efeito dessa mutao, esta tcnica designa-se por
gentica reversa.
A mutagnese in vitro tem permitido a caracterizao detalhada das
actividades funcionais de sequencias regulatrias e codificantes para protenas
dos genes clonados.
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Captulo Quatro
A complexidade dos Genomas Eucaritas
Os genomas eucaritas so maiores e mais complexos do que os
procaritas, o tamanho pode estar relacionado com uma maior complexidade,
no entanto no parece que assim seja, pois organismos menos complexos
possuem mais DNA que outros mais complexos.
Este paradoxo foi solucionado pela descoberta que no genoma
eucaritico no existe somente genes funcionais, mas sim uma grande
quantidade de sequencias de DNA que no codificam protenas. Apenas cerca
de 3% do DNA codifica protenas. Isto deve-se ao facto de existirem intres e
exes, juntamente com as famlia de genes e as sequencias repetitivas, que
aprofundaremos de seguida.
Intres e Exes
Parte do DNA no-codificante situase entres os genes e denomina-se por
sequncias espaadoras. No entanto
sequencias
no
codificantes
so
encontradas nos genes, assim sendo temos
os exes, que codificam realmente as
protenas, e os intres, que no codificam
as protenas e so removidos do mRNA
aps o seu processamento.
O gene inteiro transcrito, e
seguidamente atravs de splicing os intres
so removidos. Os intres no entanto esto
em grande quantidade, e so geralmente
maiores que os exes, o que ajuda a
manter uma baixa taxa de mutaes; pois
mais provvel que esta ocorra em sequncias no codificantes. Apesar de a
real funo dos intres ainda no ser conhecidos, alguns deles codificam
pequenos RNAs. Em todos os genes existem ainda sequencias que os
flanqueiam, e que so transcritas, no entanto no so traduzidas, as UTR 5 e
3.
Famlias Gnicas e Pseudogenes

Outro factor que contribui para o grande tamanho dos genomas
eucaritas a presena de alguns genes repetidos muitas vezes, a estas
mltiplas cpias de uma mesmo gene chamamos famlias gnicas. Este facto
justificado pela necessidade de grandes quantidades de determinada
protenas ou RNAs, existem ainda diferentes membros da famlia que podem
ser transcritos em clulas diferentes ou em estgios diferentes do
desenvolvimento. O ltimo acontecimento pensa-se que deriva da existncia de
mutaes que surgiram em diferentes membros da famlia, originados por
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2007/2008
duplicao de um gene, que se podem ter tornado optimizados em diferentes

tecidos ou estgios de desenvolvimento. No entanto como era de esperar nem
todas as mutaes melhoram a funo dos genes, outras tornam-nos inactivos,
originando pseudogenes.
Sequncias de DNA Repetitivas

Uma parte substancial do genoma constitudo por sequencias
repetitivas de DNA no-codificante. Sequencias simples de DNA contendo
milhares de cpias de sequencias curtas, de 5 a 20 nucletidos, ordenados em
srie, designam-se por DNAs Satlites e so responsveis por 10% a 20% do
genoma.
Outras sequncias encontram-se espalhadas pelo DNA genmico, em
vez de estarem agrupadas. Se forem elementos curtos dispersos repetidos,
designam-se SINEs e temos como exemplo os elementos Alu; se forem
elementos longos dispersos repetidos, designam-se LINEs.
Cromossomas e Cromatina
O genoma dos eucaritas muito mais complexo do que o dos
procaritas, mas tambm organizado de forma diferente. O genoma dos
procaritas est contido num nico cromossoma e que usualmente circular.
Nos eucaritas o genoma composto por vrios cromossomas, contendo cada
um uma molcula linear de DNA, que se encontra associado a protenas, as
histonas, que o empacotam de modo ordenado.
Cromatina
A cromatina composta
pelo DNA eucaritico juntamente
com as protenas associadas a
este, sendo que estas se
encontram numa proporo de
1:2, existindo na cromatina uma
maior proporo de protenas do
que de DNA. Alm das histonas
existem outras protenas que
contribuem
para
o
empacotamento do DNA nuclear
e ainda as que participam nos
processos de replicao e de expresso do DNA.
A unidade estrutural bsica da cromatina o nucleossoma, cuja parte
central constituda pela cromotossoma e uma histona. Fazem ainda parte do
nucleossoma protenas no histnicas que esto flanqueando a parte central
deste, sendo duas, e que esto separadas por cerca de 200 pb.
Os nucleossomas so empacotados em fibras com cerca de 30 nm, cuja
estrutura ainda no foi determinada, no entanto sabe-se que o grau de
condensao da cromatina varia ao longo do ciclo celular; podemos assim
distinguir a eurocromatina, quando esta se encontra descondensada, e a
heterocromatina, quando esta se encontra condensada.
33
2007/2008
Centrmeros
Os centrmeros so uma regio
especializada do cromossoma que assegura a
distribuio correcta dos cromossomas
duplicados durante a mitose, aqui que se
ligam os microtbulos do fuso acromtico, e
garantem ainda que os cromatdeos esto
unidos.
Os centrmeros so compostos por
sequencias altamente repetitivas e outras no
repetitivas, nos seres humanos composto
por DNA satlites e protenas associadas.
Os centrmeros humanos formam
grande cinetocoros que se ligam entre 30 a 40
microtbulos durante a mitose.
Telmeros
Os telmeros so as sequncias nas extremidades dos cromossomas,
que desempenham um papel crucial na replicao e manuteno do
cromossoma, sendo compostos por repeties de uma nica sequncia do
DNA que contem em uma das cadeias um agrupamento de guanina. Estas
sequncias so repetidas milhares de vezes e terminam com uma extremidade
de cadeia simples.
A DNA polimerase no capaz de iniciar a sua funo numa cadeia
simples, sendo a sequencia dos telmeros replicada usando a actividade de
uma transcriptase reversa, que juntamente com outras protenas constitui um
complexo, a telomerase. Esta enzima apenas se encontra activa na fase
embrionria e inicio da vida
A manuteno dos telmeros importante na determinao do tempo de
vida e capacidade de reproduo das clulas. Pensa-se que, a fim de evitar
que as extremidades dos cromossomas de degradem, a extremidade do
telmero se dobra sobre si mesmo de forma a forma uma estrutura circular.
O Genoma Humano
O genoma humano constitudo por cerca de 3 x 109 pares de bases, e
estima-se que existam cerca de 100.000 genes humanos. Existem 24
cromossomas (2n), sendo que 22 so autossomas e 2 so cromossomas
sexuais. Todos as nossas clulas so diploides, ou sejam possuem 12 pares
de cromossomas, com excepo dos gmetas que apenas possuem 12
cromossomas, so por isso haploides.
No nosso genoma existem polimorfismos, que so sequncias diferente
de individuo para individuo, que se originaram por alterao no DNA, mas que
ocorreram em zonas no codificantes ou no originaram nenhuma patologia.
Existem diversos tipos de polimorfismos:
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2007/2008
- STRs existem a repetio de uma sequencia curta, varia de individuo

para individuo o nmero de repeties que existem;
- VNTRs repetio de uma sequencia de tamanho varivel, mas maior
do que em STRs, e que varia igualmente entre os indivduos;
- SNPs polimorfismos que so originados devido a uma alterao em
um nico nucletido.
Os genes humanos podem ser mapeados por hibridao de clulas
somticas, hibridao in situ fluorescente e anlise de ligao gentica. Tm
sido usados clones de YAC para construir mapas do genoma humano. O
sequenciamento aleatrio de genes de cDNA tem fornecido marcadores para
sequencias presentes nos mRNAs. Marcadores de DNA de mais de 30000
genes humanos tm sido usados para construir um mapa fsico e gentico
integrado do genoma humano.
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2007/2008
Captulo Cinco
DNA Polimerases
A capacidade desta enzima de copiar um molde de DNA prova a base
bioqumica para a hiptese de replicao proposta inicialmente, hiptese semiconservativa. Existem vrias DNA polimerases que desempenham diferentes
papeis na replicao e reparao do DNA. Conclui-se aps vrias experiencias
que a DNA polimerase I e III so necessrias, e de grande importncia, para a
replicao na E.Coli.
As clulas eucaritas contm as DNA polimerases ,,, e .
A DNA polimerase localiza-se na mitocndria e responsvel pela
replicao do seu DNA. As restantes localizam-se no ncleo e so possveis
intervenientes na replicao do genoma nuclear.
As polimerases encontram-se activas tanto em clulas que esto
diviso como em clulas que no esto, o que nos sugere que pode
primariamente estar envolvida em mecanismos de reparao.
O papel das polimerases , e na replicao foi comprovada em
vrias experiencias, como exemplo a replicao do vrus SV40 em clulas
livres, que nos mostrou a importncia a importncia das polimerases e ; e o
facto das , e serem encontradas em leveduras e clulas de mamferos
demonstrou que sem qualquer uma delas no ocorre replicao em leveduras,
mas foi igualmente demonstrado que as polimerases possuem um papel
especifico nas leveduras, concluindo que as polimerases e so as
grandes responsveis pela replicao nas clulas eucaritas em geral.
Todas as polimerases possuem duas caractersticas indispensveis para
a replicao do DNA:
- Sintetizam DNA somente na direco de 5 3, adicionando um dNTP
no grupo hidroxilo da cadeia nascente;
- Apenas conseguem adicionar um novo desoxirribonucleico a uma
cadeia de DNA dupla; assim sendo as DNA polimerases no so capazes de
iniciar, por si s, a replicao sem a existncia prvia de uma cadeia dupla;
um dos aspectos em que difere da RNA polmeras, pois esta consegue ligar-se
a uma cadeia simples e iniciar a sua funo.
Estas caractersticas parecem ser criticas na manuteno da alta
fidelidade da replicao do DNA para a reproduo celular.
Nota: O facto de a DNA polimerase apenas sintetizar no sentido de 5
3 deve-se ao facto de o grupo fosfato que clivado, de modo a fornecer
energia para a formao da ligao do nucletido que se ir juntar de novo.
Se fosse sintetizada no sentido 3 5, o grupo fosfato clivado seria o do
nucletido na extremidade na cadeia que est a ser sintetizado, assim sendo
se houver um erro e for necessrio substituir este nucletido no existe j o
grupo fosfato que permita a formao de uma nova ligao, se a sntese for
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2007/2008
feita no sentido 5 3, a energia para a formao da nova ligao provem do

novo nucletido, o que nos permite a reparao do DNA.
A Forquilha de Replicao
Durante a replicao das molculas circulares de DNA podiam ser
observadas duas forquilhas de replicao, que representam as regies
activas na sntese de DNA e so constitudas por duas cadeias de DNA
parental separadas e duas filhas sendo sintetizadas. Surgiu ento um problema
devido ao facto de as cadeias terem que ser sintetizadas em sentidos opostos,
no entanto a DNA polimerase apenas consegue sintetizar na direco 5 3,
como poderiam duas cadeias ser sintetizadas em simultneo?
Ficou ento demonstrado que apenas uma das cadeias sintetizada de
forma contnua, no sentido da forquilha, a outra cadeia sintetizada de forma
descontinua, sendo composta por fragmentos descontnuos que so
sintetizados no sentido oposto ao da forquilha, permitindo que sejam
sintetizados no sentido de 5 3. Estes fragmentos so denominados por
fragmentos de Okazaki e so posteriormente unidos por uma DNA ligase.
A cadeia que sintetizada no sentido da forquilha designa-se por cadeia
de sntese continua, enquanto que a outra cadeia de sntese descontinua.
Outro dos problemas que surgiu foi: como conseguiria a DNA polimerase
sintetizar os fragmentos de Okazaki, se esta necessita de primers?
Existem pequenos fragmentos de RNA que actuam como primers e so
sintetizados (fragmentos de 3 a 10 nucletidos) por uma enzima especifica
primase.
ento necessrio remover os fragmentos de RNA que existem nos
fragmentos de Okazaki, esta aco realizada pela DNA polimerase I na
E.Coli, que tem o papel de uma exonuclease, nas clulas eucaritas
desempenhada por outras exonucleases e o espao que surge preenchido pela
DNA polimerase .
Funo
Eucaritas
Sntese
de
cadeias
DNA Polimerase
continua e alongamento
da descontinua
Remoo de Primers
Exonucleases
Sntese de pequenos
fragmentos DNA-RNA
Unio dos Fragmentos
de DNA
DNA Polimerase +
Primase
DNA Ligases
Procaritas
DNA Polimerase III
RNase H + DNA
Polimerase I
DNA Polimerase II
DNA Ligases
Alm da DNA polimerase e das primases existem mais protenas

envolvidas na replicao do DNA; um grupo de protenas liga-se DNA
polimerase aumentando a sua actividade e fazendo que permaneam ligados
cadeia de modo a que continuem a sintetizar; existem ento dois tipos de
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2007/2008
protenas acessrias, as de carregamento do grampo (RFC em mamferos) e

as de deslizamento do grampo (PCNA em mamferos):
- RFC, complexo C no eucaritas, reconhecem e ligam-se
especificamente ao DNA no local do primer;
- PCNA, antignio nuclear de clulas em proliferao nos eucaritas,
ligam-se s adjacncias das protenas de carregamento de grampo (RFC),
formando um anel em torno da cadeia molde do DNA, este anel mantm a
associao entre a cadeia de DNA e o complexo da DNA polimerase e as
protenas acessrias, permitindo a sntese ininterrupta de milhares de
nucleotdeos.
Existem ainda as helicases que catalisam o desenrolamento da cadeia
dupla do DNA parental, e as protenas SSB (protenas de ligao ao DNA de
cadeia simples), que estabilizam a cadeia molde desenrolada, mantendo-a
como cadeia simples para que possa ser copiada.
medida que as cadeias vo sendo desenroladas, as regio frente da
forquilha de replicao so obrigada a rodar, o que levaria a um bloqueio da
replicao, devido ao enrolamento excessivo das cadeias. Este problema foi
resolvido por uma enzima, a topoisomerase, que catalisa a reaco reversvel
de quebra e juno de cadeias de DNA; existem dois tipos desta enzima:
- Topoisomerase I, que clivam em apenas uma das cadeias;
- Topoisomerase II, que clivam simultaneamente as duas cadeias.
Estas quebras permitem molcula girar livremente evitando a
supertoro do DNA frente da forquilha de replicao, permitindo que a
replicao prossiga. Apesar de os cromossomas eucaritas serem lineares,
eles tambm requerem a interveno de topoisomerases, de modo a evitar o
continuo girar do cromossoma.
A topoisomerase II est tambm envolvida na condensao do DNA
mittico.
As enzimas envolvidas na replicao actuam de forma coordenada
permitindo a sntese simultnea tanto da cadeia continua, como da
descontinua. Esta simultaneidade conseguida pela formao de dmeros das
DNA polimerases, estando uma envolvida na sntese da cadeia continua e
outra na cadeia descontinua.
Fidelidade da Replicao
A exactido da replicao do DNA crucial para a reproduo celular,
as estimativas indicam que apenas existe uma nica base incorrecta a cada
109 ou 1010 nucleotdeos incorporados. Esta fidelidade nos dada pela simples
complementaridade de bases, no entanto ela to elevada devido s
actividades da DNA polimerase.
A DNA polimerase no catalisa apenas a incorporao de qualquer
nucleotdeo, mas ela evita a incorporao de uma base erra, mal-pareada,
atravs de uma presumvel adaptao conformao da base correcta, este
mecanismo permite aumentar em 100x a fidelidade da replicao. Outro
mecanismo a correco dos erros pela DNA polimerase, que atravs das
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2007/2008
suas funes de exonuclease remove a base mal-pareada e substitui-a pela

correcta. Esta actividade est associada s DNA polimerases e , e
aumenta a fidelidade entre 100 a 1000 vezes. A importncia do mecanismo de
correco explica a existncia de primers e do DNA ser apenas sintetizado no
sentido de 5 3.
As Origens e a Iniciao da Replicao

A replicao tanto em eucaritas como em procaritas inicia-se em uma
sequencia particular, a origem de replicao. Esta consiste numa sequencia
de nucletidos onde se ligam protenas. Inicialmente a protena iniciadora que
recruta as helicases e a SSB (que desenrolam a cadeia dupla e expem a
cadeia molde), seguidamente a primase inicia a sntese da cadeia continuam,
surgem assim duas forquilhas de replicao que se movem em sentidos
opostos.
Nas clulas eucaritas existem milhares de origens de replicao,
contrariamente E.Coli, onde apenas existe uma, de modo a que apesar do
tamanho do genoma e de uma sntese mais lenta, a replicao em eucaritas
seja feita em poucas horas. Estas diversas origens de replicao nos
eucaritas existem em intervalos de 50 a 300 kb.
Nas leveduras encontram-se sequncias que podem sustentar a
replicao de plasmdeos, sem necessidade de incorporao no cromossoma.
Estas sequncias de auto-replicao (ARS), existem igualmente no DNA
cromossomal da levedura, e nelas est contida o complexo da origem de
replicao (ORC), onde se vo ligar as protenas envolvidas na replicao.
Apesar de ainda pouco conhecidas as sequncias de iniciao da
replicao nos eucaritas mais complexos, pensa-se que sejam idnticas s
das presentes nas leveduras.
Os Telmeros e a Telomerase
Visto que a DNA polimerase no capaz de copiar as extremidades dos
cromossomas, visto que apenas sintetiza no sentido 5 3 e com inicio numa
cadeia dupla; por isso necessrio a presena de mecanismos especiais para
replicar as sequncias dos telmeros.
Os telmeros so sequencias repetidas directas, que so sintetizadas
por intermdio da telomerase, que capaz de catalisar a sntese de DNA na
ausncia de um molde de DNA. A telomerase uma transcriptase reversa e
que como tal sintetiza DNA apartir de um molde de RNA, que est contido nela
e complementar s sequencias repetitivas dos telmeros. Este molde permite
que a telomerase estenda a extremidade 3 do DNA cromossomal uma unidade
de comprimento alm do seu tamanho original, podendo assim a cadeia
complementar ser sintetizada pelo complexo DNA polimerase + primase. A
remoo do primer de RNA deixa a extremidade 3 numa cadeia simples, o que
pode levar a formao de laos nos cromossomas eucaritas.
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A telomerase, e os telmeros, permitem que haja a replicao do

material gentico sem perda de sequncias significativas, visto que em cada
replicao existe a perda de uma parte da extremidade da cadeia.
A telomerase no se encontra sempre activa, pensa-se que apenas na
fase embrionria, o que nos leva a pensar que os telmeros determinam o
nmero de vezes que uma clula se pode replicar e desta forma a nossa
longevidade.
Reparao do DNA
O DNA, como qualquer molcula, pode sofrer reaces qumicas, sendo
alterado, o que no deve acontecer pois ela responsvel pelo nosso material
gentico.
As mutaes vo desde a incorporao incorrecta de base durante a
replicao, alteraes qumicas espontneas ou como resultado de
exposio a agentes mutagnicos.
Os mecanismos de reparao do DNA pode dividir-se em dois grandes
grupos: reverso directa da reaco qumica responsvel pelo dano e
remoo de bases alteradas por substituio com DNA recm-sintetizado.
Onde a reparao do DNA falha, desenvolveram-se mecanismos para que a
clula posso lidar com o dano provocado.
Reverso Directa de Leses do DNA

Poucos tipos de leses so reparados por este mecanismo,
particularmente os dmeros de timina devido exposio a UV e os resduos
de guanina alquilados, que foram modificados pela adio de grupos metilo
ou etilo na posio O6 do anel purnico.
A radiao UV das maiores fontes de dano do DNA e na sua maioria
leva formao de dmeros de pirimidinas, estas formaes destorcem a
cadeia de DNA e bloqueiam a transcrio e replicao. A reparao feita de
forma directa por uma reaco de dimerizao, e o processo denomina-se por
fotoreactivao, pois a energia da luz visvel que permite a quebra da
estrutura do anel formado entre dos dois nucleotdeos. de salientar que este
processo no ocorre nos humanos.
Outra forma directa de reparao lida com os danos resultantes da
reaco de agentes alquilantes do DNA, que transferem grupos metilo e etilo
para bases do DNA, temos o caso especifico da O6-metilguanina, que se
emparelha com a timina em vez da citosina. Esta leso pode ser reparada por
uma enzima, que remove o grupo metilo para um resduo de cistena no seu
centro activo.
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Reparao por Exciso

Apesar da reparao directa ser uma forma eficiente de lidar com tipos
particulares de leses no DNA, a forma mais utilizada a reparao por
exciso. Esta pode dividir-se em:
- Reparao por exciso de base: uma nica base lesada,
identificada e removida, sendo depois substituda pela correcta. A exciso do
nucleotdeo catalisada por enzimas especificas, formando um local AP. As
endonucleases AP clivam as regies adjacentes ao sitio AP e a falha
preenchida pela DNA polimerase e pelas DNA ligases.
- Reparao por base de nucleotdeo: as bases lesadas so
removidos como parte de um oligonucleotdeo contendo a leso. Na E.Coli esta
exciso catalisada pelo complexo UvrABC, a UvrA idfentifica a leso e
recruta a UvrB e a UvrC que cliva nas posies 3e 5, respectivamente, o local
lesado, excisando um nucleotdeo com 12 ou 13 bases. Este complexo
geralmente designado por excinucleases. A helicase e a DNA polimerase
completam este processo. Nas clulas eucaritas existe um modelo bsico
para explicar este processo, apesar de este ainda no se encontrar
completamente elucidado. As protenas XPA identificam a leso e recrutam as
protenas XPB e XPD (funcionam como helicases); o complexo XPF/ERCC1 5
e a protena XPG 3, clivam um oligonucleotdeo (com cerca de 30 bases)
contendo a leso. O restante processo e concludo pela DNA polimerase ou
juntamente com as protenas RFC e PCNA.
- Reparao por malpareamento: bases malpareadas durante a
replicao, estes erros so muitas vezes corrigidas pela DNA polimerase.
Existem enzimas que reconhecem na cadeia recm-sintetizada as bases
malpareadas. A reparao iniciada pela MutS, a qual identifica o
malpareamento e recruta a MutL e a MutH, estas direccionam a remoo do
DNA entre a quebra na cadeia e o malpareamento. O reconhecimento da
cadeia recm-sintetizada possvel devido existncia de quebras nesta.
Mutaes nos genes MutS e MutL so responsveis por uma das
formas cancro do clon.
Reparao Ps-Replicao
Os mecanismos de reparao referidos anteriormente ocorrem antes da
replicao ser concluda de forma a que esta possa ocorrer de forma correcta.
A replicao geralmente bloqueada a quando do aparecer de uma
leso, no entanto esta pode recomear logo aps a leso atravs da sntese de
um fragmento de Okazaki. Este tipo de falhas pode ser reparada por dois
processos:
- Reparao por recombinao: necessrio que uma das cadeias
parentais estivesse integra, originando uma cadeia filha normal. A cadeia
parental pode por recombinao entre sequencias homlogas preencher a
regio lesada. A falha localiza-se oposta a uma regio integra, podendo ser
preenchida pela DNA polimerase. A outra cadeia apresenta ainda uma leso,
mas pode ser corrigida por exciso;
- Reparao sujeita a erros: uma falha oposta a uma sitio lesado
preenchido com DNA recm-sintetizado, este DNA foi sintetizado usando uma
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2007/2008
cadeia lesada como molde, o que pode levar a mutaes. usada apenas em
bactrias e em condies extremas.
Recombinao entre Sequncias Homlogas de DNA

importante a exactido da replicao e reparao do DNA de modo a
manter a informao gentica, no entanto igualmente importante a
recombinao de forma a que genes sejam rearranjados de diferentes formas,
contribuindo para uma diversidade gentica das espcies.
Molculas de DNA Recombinam-se por meio de Quebras

e Rejunes
Um dos modelos defende que existe uma escolha de cpia onde uma
molcula teria como molde uma cadeia parental e que a certo momento essa
molcula molde passaria a ser outra cadeia parental.
Outros modelos dizem-nos que existe uma quebra de uma cadeia
parental que depois se junta com outra igualmente quebrada, diferindo no facto
de no existir sntese de novas cpias.
Aps vrios estudos conclui-se que o modelo mais aceite seria o da
quebra e juno.
Modelos de Recombinao Homloga

Um dos problemas do modelo de quebra e juno era como seria
possvel ambas as cadeias serem clivadas no mesmo ponto, de modo a que
no houvesse perdas ou ganhos no ponto de quebra. O alinhamento entre
duas cadeias conseguido por intermdio de pareamento, estas cadeias
simples de DNA que se sobrepem so trocadas entre molculas homlogas,
levando formao de uma regio heteroduplex, onde as duas cadeias da
molcula duplas so oriundas de molculas parentais diferentes. Caso exista
um mal pareamento nesta regio, ele pode ser corrigido pela reparao de
malpareamento.
Aps vrios estudos reformolou-se este modelo, originando-se o modelo
de Holiday, que ainda hoje a base dos pensamentos sobre estes
mecanismos. O modelo de Holiday propunha que os cortes eram feitos
posies idnticas das duas molculas de DNA parental. As cadeias de DNA
cortados sofriam um desenrolamento parcial, e cada uma deles juntava-se
outra por complementaridade com a cadeia no cortada. Originar-se-ia um
intermedirio com cadeias entrecruzadas, conhecido como juno de Holiday.
Para se gerarem molculas recombinantes necessrio que de seguida
a juno de Holiday seja quebrada e depois haja a rejuno das cadeias
entrecruzadas, o que pode ocorrer de duas formas diferentes: no ismero
resultante da troca inicial de cadeias, as cadeias entrecruzadas so as que
foram clivadas no inicio, no entanto com uma rotao desta estrutura gera-se
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2007/2008
um ismero em que as cadeias cruzadas so aquelas que no foram clivadas.

Cada uma destas formas ir ter consequncias genticas diferentes, na
primeira as molculas originadas tm regio heteroduplex, mas o DNA que a
flanqueia no recombinante, na segunda resultam molculas que tm DNA
recombinante flanqueando a regio heteroduplex.
A questo de ambas as cadeias serem cortadas no mesmo local foi
resolvida tendo em conta que inicialmente apenas uma cadeia cortada, esta
deslocada, permitindo que a outra cadeia simples gerada posso parear por
complementaridade com a outra molcula parental. Este processo produz uma
ala deslocada de DNA , a qual pode ser clivada e reunida com outra molcula
parental, originando-se ento a juno de Holiday.
Enzimas Envolvidas na Recombinao Homloga

So necessrias enzimas especificas alm de outras que funcionam em
aspectos mltiplos do metabolismo do DNA. A enzima central no processo de
recombinao homloga a RecA, que promove a troca de cadeias entre
DNAs homlogos, levando formao da regio heteroduplex. Na E.Coli a
aco da RecA pode ser dividida em trs estgios:
- Liga-se ao DNA de cadeia simples, recobrindo-o e formando um
filamento de DNA com protena;
- Visto que a RecA tem dois locais de ligao ao DNA, a enzima j ligada
a uma cadeia simples capaz de se ligar a outra molcula de DNA de cadeia
dupla, formando um complexo entre duas molculas de DNA;
- Segue-se um pareamento especifico, por complementaridade de
bases, da cadeia simples de DNA com o seu complemento. A enzima catalisa a
troca de cadeias de modo a que a cadeia revestida pela RecA desloca a sua
cadeia homloga para formar uma regio heteroduplex.
Em leveduras, uma das protenas relacionada com a RecA, a RADS1
necessria para a recombinao e para a reparao de quebras duplas de
DNA. Protenas relacionadas com a RADS1 foram encontradas em eucaritas
complexos, como o caso do humano.
No entanto existem ainda o complexo RecBCD que responsvel por
fornecer RecA a cadeia simples qual esta se liga. Quando o complexo
RecBCD encontra um sitio chi , actua como um nuclease e cliva uma das duas
cadeias de DNA, de seguida desenrola a dupla hlice, permitindo que a RecA
se ligue cadeia simples.
Aps a aco do complexo RecBCD e da enzima RecA forma-se a
juno de Holiday, sobre a qual iro actuar trs enzimas (RuvA, B e C). RuvA
e B actuam como um complexo que direcciona a migrao do sitio da juno
de Holiday na qual as cadeias se entrecruzam. Por sua vez RuvC actua
clivando as cadeias entrecruzadas, aps a juno das cadeias clivadas so
geradas duas molculas recombinantes.
Em leveduras RAD1 e RAD10 desempenham estas funes, enquanto
que em humanos so as protenas XPF e ERCC1 catalisam o processo, como
de igual modo contribuem para a reparao do DNA.
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2007/2008
Rearranjos do DNA
A recombinao homloga produz rearranjos entre cromossomas
homlogos (crossing-over), no entanto no altera a disposio dos genes ao
longo do genoma. Outro tipo de recombinaes levam a rearranjos do DNA
genmico, estes so importantes para a regulao gnica ou tm um papel
importante na evoluo e contribuem para a biodiversidade.
Recombinao Stio-Especifica
Em contraste com a recombinao homloga, que ocorre em qualquer
regio com ampla homologia entre as sequncias, a recombinao stioespecifica ocorre entre sequncias especificas do DNA, normalmente
homlogas em apenas uma pequena parte do DNA. Esta interaco
mediada por protenas e no por complementaridade de bases. exemplo
desta recombinao stio-especifica a integrao e remoo do DNA viral a
quando a infeco da E.Coli pelo bacterifago .
Esta recombinao ainda importante para os rearranjos programados
que ocorrem nos genomas celulares, como o caso do desenvolvimento do
sistema imune. Os anticorpos so resultado da recombinao stio-especifica
entre os genes para as imunoglobulinas e os receptores de clulas T, o que
lhes permite identificar um grande nmero de antignios.
RAG 1 e RAG 2 esto envolvidos em processos de clivagem e
juno na recombinao stio-especifica para a formao de anticorpos.
Transposio Atravs de Intermedirios de DNA

A transposio envolve o movimento de sequncias atravs do genoma
e no requer homologia entre estas. Os elementos transponveis ou
transposes so aqueles que se movem atravs de transposio e podem ser
de dois tipos: atravs de intermedirios de DNA ou de RNA.
Os transposes mais simples so as sequencias de insero que
consistem em um gene para a enzima envolvida na transposio (a
transposase), flanqueado por curtas sequncias repetias e invertidas, que
correspondem aos locais onde age a transposase.
Os mais complexos so compostos por duas sequncias de insero
flanqueados por outros genes, movendo-se como uma unidade.
As sequncias de insero movem-se de uma localizao cromossomal
a outra sem replicar o seu DNA, a transposase introduz uma quebra
assimtrica na molcula alvo de DNA e cliva nas extremidades das repeties
invertidas do transposo. Aps clivar a transposase junta as extremidades do
DNA alvo com o elemento transponvel. A falha resultante no sitio alvo do DNA
reparado pela sntese de DNA, seguido de ligao outra ligao do
transposo. De ambos os lados do elemento transponvel ficam como marca
uma curta sequncia repetitiva.
44
2007/2008
O mecanismo referido faz com que o transposo se mova de sitio um

cromossomal a outro, no entanto existem outro tipo de transposes que se
movem atravs de mecanismos mais complexos, havendo uma replicao do
transposo em combinao com a sua integrao, ficando uma cpia no stio
original e outra na nova localizao.
Transposio Atravs de Intermedirios de RNA

Muitos transposes em clulas eucaritas movem-se em intermedirios
de RNA em vez de DNA, o seu mecanismo de transposio similar
replicao dos retrovrus.
LTRs sequncias repetidas em vrias centenas de nucleotdeos em
ambas as extremidades do DNA viral.
Retrotransposes classe I so idnticos a retrovrus e possuem LTRs,
enquanto que retrotransposes classe II no possuem LTRs. Nos mamferos
a principal classe desses retrotransposes consiste em elementos longos
dispersos altamente repetitivos LINEs.
Outros elementos que no codificam as suas prprias transcriptases
reversas e que tambm transpem atravs de RNA so os elementos
repetitivos dispersos curtos SINEs. Estes no codificam protenas, logo
representam pseudogenes que surgem atravs de transposio mediado por
RNA. Os pseudogenes processados correspondem a pseudogenes que
surgiram, similarmente, por transcrio reversa de pequenos mRNAs.
Amplificao Gnica
Os rearranjos at agora discutidos alteram a posio de uma dada
sequencia de DNA dentro do genoma, a amplificao gnica modifica a
estrutura do genoma, gerando cpias mltiplas de uma regio. As sequncias
amplificadas do DNA podem ser encontradas como molculas
extracromossomais ou como sries repetidas no cromossoma, ambas
contribuem para uma maior expresso do gene amplificado.
A amplificao genica pode ser benfica ou prejudicial para a clula,
como o caso de uma amplificao dos genes que codificam o ribossoma no
ocito de modo a que posso existir uma resposta necessidade de produzir
grandes quantidades de protena, mas por outro lado pode ocorrer como um
evento anormal em clula cancerosas provocando um aumento da expresso
genica que leva a uma intensa e descontrolada diviso celular.
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2007/2008
Captulo Seis
Transcrio em Procaritas
Os mecanismos de transcrio foram estudados na E.Coli, tal como os
mecanismos de regulao da mesma, que permitem clula responder a
variaes no meio ambiente.
A RNA Polimerase e a Transcrio

A RNA polimerase catalisa a sntese de RNA a partir de um molde de
DNA, esta age de forma idntica DNA polimerase, sintetizando apenas no
sentido 5 3, mas no necessita de primers para iniciar a sntese.
A RNA polimerase inicia o processo num local especifico, que
representa o primeiro ponto onde a transcrio pode ser regulada.
A RNA polimerase constituda por mltiplas cadeias polipeptdicas,
formando as subunidades , , e , sendo que as trs primeiras catalisam
a sntese de RNA e a ltima reconhece os stios especficos onde se liga o
complexo.
A sequncia que marca o inicio da transcrio chamada de promotor,
sendo o primeiro nucleotdeo transcrito denominado de nucletido +1, e a
subunidade liga-se na regio -35 e -10. Na ausncia desta subunidade a
enzima liga-se com baixa afinidade e inespecificamente.
A polimerase medida que vai avanando desenrola a dupla hlice do
DNA e ao fim de 10 nucletidos a subunidade desprende-se e a polimerase
continua o alongamento da cadeia de RNA. Tal como desenrola a dupla hlice
medida que vai avanando enrola o que fica para trs, deixando uma regio
de cerca de 17 pb desenroladas.
A RNA polimerase prossegue at encontrar um sinal que lhe indique
para terminar, que pode ser uma regio repetida e invertida, rica em GC,
seguida de quatro ou mais resduos de A. A transcrio desta regio forma
uma estrutura estvel semelhante a um loop que rompe a associao entre a
RNA polimerase e o seu molde de DNA. Existem outro tipo de sinais que
consistem na ligao de protenas em sequencias especificas do DNA que
terminam a transcrio.
Os Repressores e o Controlo Negativo da Transcrio

Estudos pioneiros na E.Coli demonstraram que o gene que expressa a
-galactosidade, que cliva a lactose, apenas transcrito quando os nveis de
lactose se encontram elevados, o que permite clula na ausncia de lactose
economizar energia.
Os genes que codificam a -galactosidade, a permease e a
transacetilase so expresso como uma unidade, denominada de opero e a
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2007/2008
sua transcrio controlada pelo operador (o) que est adjacente ao stio de
inicio da transcrio. O gene regulador codifica uma protena que regula a
transcrio ligando-se ao operador. O produto normal do gene um repressor
que bloqueia a transcrio quando ligado ao operador (o), por exemplo a
lactose liga-se ao repressor inibidor e impedindo que este se ligue ao operador
e a transcrio posso ocorrer. O operador chamado de elemento de controlo
em cis, porque apenas afecta a expresso de genes ligados fisicamente na
mesma molcula de DNA, enquanto que o repressor apelidado de elemento de
controlo com actuao em trans afecta a transcrio de genes em outros
cromossomas.
Controlo Positivo da Transcrio

O exemplo mais bem estudado de controlo positivo em E.Coli o efeito
da glicose na expresso de genes ligados quebra de outros aucares.
Quando existe glicose, que preferencialmente usada, os genes que codificam
as enzimas envolvidas no catabolismo de outros aucares no so expressos,
ou seja, a glicose reprime o opero lac m na presena do seu indutor lactose.
A represso pela glicose mediada por um sistema positivo de controlo,
que est dependente dos nveis de cAMP. A enzima que converte em ATP em
cAMP activado quando os nveis de glicose esto baixos, o cAMP liga-se a
uma protena reguladora da transcrio, a CAP, que por sua vez se liga sua
sequencia alvo (localizado antes do inicio do opero) e faz com que a
subunidade da RNA polimerase se liga mais facilmente ao promotor.
Atenuao da Transcrio
Os mecanismos atrs referidos interagem, activando ou bloqueando, no
inicio da transcrio, no entanto a atenuao da transcrio age impedindo o
alongamento a partir de determinados stios, que no so mais do que
sequncias especificas.
As RNA Polimerases Eucaritas e os Factores Gerais de

Transcrio
Apesar de a transcrio ocorrer de forma idntica em quase todas as
clulas, ela mais complexa em clulas eucaritas, e tem duas grandes
diferenas:
- Os eucaritas possuem mltiplas RNA polimerases que transcrevem
genes distintos;
- Em vez de se ligarem directamente ao promotor, as RNA polimerases
eucariticas interagem com uma variedade de protenas adicionais de modo a
serem mais especificas.
As RNA Polimerases Eucaritas
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2007/2008
As clulas eucarioticas contm trs RNA polimerases nucleares

distintas:
- RNA polimerase II, transcreve os genes que correspondem a
protenas;
- RNA polimerase I e III, transcreve os RNAs ribossomais e de
transferncia.
Alguns pequenos RNAs, como os envolvidos no splicing e transporte de
protenas, so transcritos pela RNA polimerase III.
As duas maiores subunidades da RNA polimerase eucarita esto
relacionadas com a e a das
procaritas, e existem cinco subunidades
que so comuns s trs, o que faz com
tenham um funcionamento muito similar
entre si. Existem ainda RNA polimerases,
idnticas s das bactrias, nos cloroplastos
e mitocndrias que transcrevem o seu
DNA.
Os Factores Gerais da
Transcrio e a Iniciao da
Transcrio pela RNA Polimerase
II
A RNA polimerase II apenas capaz
de iniciar a transcrio se as protenas
adicionais foram adicionas reaco, estas
protenas designam-se por factores de
transcrio. Existem dois tipos de factores
de transcrio: os esto envolvidos na
transcrio de todos os promotores de RNA
polimerase II e os factores de transcrio
adicionais, que se ligam s sequencias de
DNA que controlam a expresso dos genes
individuais e so, portanto, responsveis
pela regulao da expresso gnica.
Antes do local de inicio de
transcrio existe uma sequencia, a TATA
box, qual se vai ligar um factor geral de
transcrio, o TFIIF, sendo composto por
vrias
subunidades.
Uma
dessas
subunidades a protena de ligao a
TATA, que se liga a TATA box e aos
factores associados da TBP, os ltimos
ligam-se a outro factor geral de transcrio,
o TFIIB. o complexo TBP-TFIIB que
recruta a RNA polimerase II e promove a
sua ligao ao promotor.
Para que se inicie a transcrio
necessria a ligao de dois factores
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2007/2008
adicionais, o TFIIE e o TFIIH. O TFIIH tem duas subunidades, uma com funo
de helicase e outra que fosforila sequencia repetitivas permitindo a quebra de
ligao com o complexo de iniciao e que a RNA polimerase prossiga.
Alm da TATA box, os promotores de vrios genes que so transcritos
pela RNA polimerase II contm uma sequncia que cobre o sitio de inicio da
transcrio, a Inr; no entanto alguns genes apenas possuem a Inr e no
possuem a TATA box.
A Transcrio pelas RNA Polimerase I e III

As RNA polimerases I e III so responsveis pela transcrio de rRNAs
e tRNAs, e precisam igualmente de factores de transcrio adicionais.
A RNA polimerase I responsvel pela transcrio do rRNA e existem
dois factores, o UBF e o SL1, que reconhecem a sequencia promotora e
formam o complexo de iniciao.
Na RNA polimerase III, o promotor encontra-se no meio da sequencia a
transcrever, a transcrio inicia-se com a ligao sequencial de TFIIC, TFIIB e
da RNA polimerase III.
Todas as RNA polimerases referidas precisam da interaco do factor
adicional TBP, que permite a ligao do complexo de iniciao sequencia
sinal.
Regulao da Transcrio em Eucaritas

Embora a regulao seja muito complexa, em eucaritas e procaritas
os mesmos princpios so aplicveis. Em eucaritas a expresso controlada
em termos de iniciao da transcrio, em alguns casos pode se atenuada e
regulada em etapas posteriores.
Este controlo desempenhado primariamente pelas aces combinadas
de mltiplas protenas transcricionais regulatrias diferentes, mas o
empacotamento do DNA na cromatina e a sua modificao por metilao
acrescentam um nvel ainda maior de complexidade ao controlo da expresso
gnica eucarita.
Sequncias Regulatrias
Promotores e Enhancers
com
Actuao
em
Cis:
Tambm nos eucaritas a expresso de determinados genes

controlada pela ligao de protenas sequncia com actuao em cis, que
so adjacente ao gene que controlam, e geralmente antecedem a sequncia
TATA box e Inr. A estas sequncias com actuao em cis ligam-se factores
gerais de transcrio que permitem a regulao da expresso de genes
individuais.
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Existem sequncias regulatrias localizadas mais longe do local de inicio

da transcrio, que funcionam pela ligao de factores transcricionais que
regulam a RNA polimerase, cuja actuao possvel devido formao de
alas no DNA; estes factores designam-se por Enhancers, e o seu
funcionamento igual ao dos factores de controlo da transcrio adjacentes ao
promotor. Um aspecto importante dos Enhancers que eles usualmente
contm sequncias funcionais mltiplas que ligam diferentes protenas
regulatrias transcricionais.
Protenas Regulatrias Transcricionais

O isolamento de protenas regulatrias transcricionais foi baseado na
habilidade destas se ligarem especificamente em sequncias de promotores ou
Enhancers. A ligao de protenas a determinadas sequncias geralmente
analisada por dois processos: footprinting e ensaio de alterao de mobilidade
electrofortica.
Footprinting uma amostra de DNA contendo fragmentos
radioactivamente marcados em uma das extremidades dividida em duas,
sendo uma delas incubada com a protena que se liga a uma sequencia
especifica. Ambas so digeridas com DNase, sendo que esta cliva uma vez por
molcula em mdia e tendo em conta que a regio onde se liga a protena se
encontra protegida, no sendo clivada. Os complexos de DNA-Protena so
desnaturados e aos fragmentos analisados por electroforese. Na amostra
incubada com a protena, os fragmentos correspondentes a essa sequencia
esto ausentes.
Ensaio de alterao de mobilidade electrofortica uma amostra
contendo fragmentos de DNA tratada como no processo anterior, no entanto
no feita a desnaturao do complexo DNA-Protena, mantendo-se este
complexo que migra mais lentamente quando analisado por electroforese.
Estrutura e Funo dos Activadores Transcricionais

Os factores de transcrio so centrais para a regulao da expresso
gnica, os mais bem estudados so os activadores transcricionais.
Geralmente estes activadores, que so protenas, possuem dois domnios: um
que se liga especificamente a uma sequencia de DNA e outro que activa a
transcrio por interaco e recrutamento de outros factores e da maquinaria
de transcrio. Existem domnios, chamados em dedo de zinco, que se ligam
ao DNA, dos quais se destacam os receptores para as hormonas, que regulam
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2007/2008
a transcrio gnica em resposta a hormonas. Outros exemplos de domnios

de ligao ao DNA so o modelo hlice-volta-hlice, o ziper leucina e a hliceala-hlice.
Repressores Eucaritas
A expresso gnica tanto regulado por activadores como por
repressores, que equivale aos inibidores procaritas, inibindo a transcrio.
Alguns repressores intreferem com a ligao de outros factores de transcrio,
outros competem com activadores (alguns apenas diferem deste por no
possurem o domnio que recruta outros complexos) pela ligao com a
sequncia regulatria; existem ainda os repressores activos que inibem a
transcrio atravs de interaco protena-protena, sendo criticas na regulao
do crescimento e diferenciao celular.
Relao entre Estrutura da Cromatina e a Transcrio

O DNA no ncleo encontra-se
empacotado em cromatina, o que tem
consequncias importantes em termos
da sua disponibilidade como molde
para a transcrio. Activadores e
Repressores interagem no s com os
factores transcricionais e maquinaria
de transcrio, mas tambm atravs
da induo de mudanas de estrutura
da cromatina. Estes facto confirmado
pelo descondensar das regies que
so activamente transcritas.
No entanto o descondensar da
cromatina no suficiente para que os genes possam ser transcritos, pois o
DNA continua ligado s histonas. Existem ento protenas adicionais,
designadas factores de remodelamento dos nucleossomas, que facilitam a
ligao de factores transcricionais cromatina por alterao da estrutura dos
nucleossomas.
Outro dos processos a acetilao que reduz a carga liquida positiva
das histonas e diminui a sua afinidade com o DNA, permitindo um mais fcil
acesso ao DNA por parte das protenas de regulao da transcrio. No
entanto importante que para a RNA polimerase a compactao do DNA seja
um obstculo mais facilmente ultrapassado, do que para a DNA polimerase,
mas que igualmente auxiliado pela acetilao e pela interaco de protenas
cromossomais no-histnicas.
Metilao do DNA
A metilao outro mecanismo geral pelo qual o controlo da transcrio
em vertebrados est ligado estrutura da cromatina. O DNA especificamente
metilado nos Cs que precedem Gs na cadeia (dinucleotdeos CpG), o que est
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2007/2008
relacionado com uma reduzida actividade transcricional nos genes que contm
alta frequncia de CpG na vizinhana, pois uma protenas especifica liga-se ao
DNA metilado e inibe a transcrio.
Apesar do seu baixo significado em termos de regulao gnica, a
metilao do DNA, no caso da marcao genmica parece adquirir uma
extrema importncia. Em muitas clulas ambos os alelos de uma gene so
transcritos, mas h alguns poucos genes marcados cuja expresso depende se
foram herdados da me ou do pai. Apesar do papel da metilao do DNA na
marcao ser incerto, parece distinguir entre os alelos maternos e paternos de
genes marcados.
Processamento e Reciclagem de RNA

Embora a transcrio seja o primeiro, e mais altamente regulado, passo
na expresso gnica, preciso uma srie de processos para se produzir um
RNA funcional e maduro.
Os mRNAs bacterianos so uma excepo, pois desde, pois nas clulas
eucaritas desde os rRNAs, aos tRNAs que sofrem processos de alterao
para serem funcionais; o caso especial do mRNA que sofre diversos
processos, como o splicing, at poder servir de molde para a sntese de
protenas.
A regulao de todas as etapas brevemente referidas em cima gera um
elevado controlo sobre a expresso gnica.
Processamento do rRNA e do tRNA

Todos os RNAs ribossomais e de transferncia, excepo do RNA 5S
eucaritico que transcrito de um gene separado, provm de um mesmo prRNA. Este pr-RNA ento processado atravs de sucessivas clivagens e
adio de grupos metilo nas bases e aucares de nucleotdeos especficos.
Sabe-se que o pr-tRNA clivado na sua extremidade 5 pela RNase P.
Na extremidade 3 a RNase uma convencional e existe a adio de uma
sequncia CCA, que corresponde ao local de ligao do aminocido.
Alguns pr-tRNAs, e poucos pr-rRNAs, sofrem splicing, havendo
remoo de intres, e possibilidade de splicing alternativo.
Processamento do mRNA em Eucaritas

O processamento do mRNA tem uma maior distino entre eucaritas e
procaritas. Nos procaritas aps a transcrio o mRNA encontra-se pronto
para ser traduzido, enquanto nos eucaritas o pr-mRNA surge aps a
transcrio e extensamente modificado antes de ser transportado para o
citoplasma e ser traduzido.
O processamento do pr-mRNA d-se atravs de modificaes em
ambas as extremidades e atravs da remoo de intres.
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A extremidade 5 modificada imediatamente aps a sntese pela

adio de uma estrutura chamada de cap 7-metilguanosina. A colocao da
cap iniciada pela adio de GTP, em orientao inverso, no nucleotdeo 5
terminal, e de seguida so adicionados grupos metilo a este resduo de G e s
riboses de um ou dois nucleotdeos da extremidade 5 da cadeia de pr-mRNA.
A extremidade 3 de muitos dos mRNAs no determinada pelo fim da
transcrio, mas sim pela clivagem do transcrito primrio e adio de uma
cauda poli-A, numa reao de processamente chamada de poliadenilao.
Esta reaco permite uma maior estabilidade da molcula.
No entanto a modificao mais
marcante do pr-mRNA a remoo de
intres pelo mecanismo de splicing.
Mecanismo de splicing
O splicing do pr-mRNA ocorre em duas
fases: primeiro o pr-mRNA clivado no sitio
5 de splicing, sendo a extremidade 5 do intro
unida a um nucleotdeo de adenina dentro do
intro; forma-se uma estrutura em lao; de
seguida ocorre em simultneo a clivagem do
sitio 3 de splicing e a ligao dos dois exes.
Existem trs sequncias criticas no prmRNA que esto relacionadas com o splicing:
- Stio 5 de Splicing;
- Stio 3 de Splicing;
- Ponto de Ramificao.
O
splicing
ocorre
em
grandes
complexos denominados spliceossomas,
compostos vrias subunidades, que por sua
vez so complexos de protenas e RNA. Os
RNA que constituem o spliceossoma so
pequenos
RNAs
nucleares
(snRNA)
chamados de U1, U2, U4, U5 e U6; estes
associam-se a pequenas protenas e formam
particulas de ribonucleoproteinas (snRNPs)
que desempenham um papel central no
splicing. Cada snRNP contem apenas uma
molcula de snRNA, excepo dos snRNAs
U4 e U6 que esto associados na mesma
snRNP.
de splicing (SS 5), o

complementaridade de bases.
A primeira etapa do mecanismo de

splicing a ligao do complexo U1 ao stio 5
seu reconhecimento feito atravs de
53
2007/2008
De seguida o complexo U2 liga-se ao ponto de ramificao.

Os complexos U4/U6 e U5 so incorporados no spliceossoma,
dissociando-se U4 e U6, e sendo U1 deslocado do SS 5.
Ser o complexo U5 que ir reconhecer a sequncia do SS 3, havendo
de seguida uma simultaneidade de acontecimentos.
Assim sendo, o complexo U1 e U4 dissociam-se do spliceossoma, sendo
o SS 5 clivado, a extremidade 5 do intro unida ao ponto de ramificao,
formando-se um lao.
Aps a formao de uma estrutura em forma de lao, ocorre a clivagem
do SS 3, e a unio dos exes. Estando assim o processo de splicing concludo.
Visto que a complementaridade entre as sequncias dos snRNAs e os
SS, ou do ponto de ramificao, no completa, o que resulta numa baixa
afinidade, existem protenas auxiliares de splicing. Estas protenas ligam-se
a sequncias perto dos locais SS e recrutam as subunidades do spliceossoma,
o que permite uma regulao do splicing, pois existem protenas que inibem ou
estimulam a ligao a estes locais. O papel central do splicing no
processamento do mRNA possibilita um controlo da expresso gnica
adicional, por aco destas protenas.
A existncia destas protenas veio ainda abrir caminho para o splicing
alternativo, de que iremos tratar de seguida.
Existem alguns RNA com capacidade de catalisar a sua prpria reaco
de splicing, que neste caso se denomina auto-splicing. importante salientar
ainda que os snRNA por si s possuem a capacidade de catalisar a reaco de
splicing, no entanto de modo a torn-la mais eficiente existe a associao de
protenas a estes.
Splicing Alternativo
O pr-mRNA contem mltiplos intres, o que permite atravs de diversas
combinaes entre eles, de um pr-mRNA originar distintas protenas.
importante referir que a ordem dos exes nunca alterada, sendo as
combinaes possveis apenas aquelas que so criadas pela incluso total ou
parcial de determinados exes.
Existem ento as protenas acessrias de splicing que iro permitir estas
diversas combinaes entre os vrios exes. Tanto podemos ter uma protena
que estimule a ligao do spliceossoma ao SS ou uma que o iniba, sendo
assim iremos ter diferentes padres de splicing. da competio destas duas
protenas que ir surgir um determinado padro, pois se estiver a protena
indutora em excesso, o intres poder ser removido, se esta estiver em menor
quantidade, muito possivelmente este ser includo total ou parcialmente. Estas
protenas ligam-se a sequncias e recrutam geralmente a subunidade U1, pois
esta que inicia o mecanismo de splicing, sendo a juno das outras um
mecanismo em cascata. No entanto existem outros que estimulam a ligao
das outras subunidades em outros locais, o que permite assim que o inicio do
intro se mantenha, no entanto este pode terminar precocemente, ou ser
alongado.
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O splicing tem um papel preponderante na maneira como regulada a

expresso especfica de determinadas protenas consoante o tecido em
questo, sendo que em clulas diferentes existem mecanismos de splicing com
padres diferentes.
A existncia de mecanismos de splicing alternativo permitiu originar
soluo para a existncia de to poucos genes comparativamente com o
nmero de protenas existentes no nosso organismo.
Edio do RNA
A edio do RNA consiste num processo de processamento diferente
do splicing, comum em mRNA mitocndrial, mRNA de cloroplastos e alguns
mRNAs nucleares.
um mecanismo onde existe a mudana de uma base simples, como
exemplo a desanimao da citosina em uridina. Este fenmenos, ou um de
substituio, podem originar protenas com sequencias diferentes, ou um
codo de STOP prematuro, o que ir originar protenas diferentes com funes
e estrutura que podem ser idnticas, ou diferentes. exemplo deste
mecanismo a edio do mRNA que codifica uma Apo protena, que no fgado e
expressa por um determinado mRNA, e que nas outras clulas por edio do
RNA surge um codo de STOP prematuro, que origina uma protena truncada,
mas que funcional e mais especifica para a clula onde se encontra.
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2007/2008
Degradao de RNA
A nvel celular a quantidade de RNA mantida atravs de equilbrio
entre a sua sntese e degradao.
Os RNAs ribosomais e de transferncia so bastante estveis e por isso
encontram-se em grande quantidade, em contraste com os mRNAs que so
rapidamente degradados, o que permite clula responder rapidamente s
mudanas no ambiente, podendo sintetizar novos mRNAs que sejam
necessrios.
A degradao dos mRNAs iniciada pelo encurtamento da caude de
poli-A, segue-se a remoo do cap 5 e posterior degradao do restante RNA
por nucleases.
A estabilidade de alguns mRNAs pode ser determinada por factores
exteriores de modo a que a clula pode responder s necessidades consoante
o meio extracelular.
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Captulo Sete (pg. 297 325)

Traduo do mRNA
Todos os mRNAs so lidos de 5 3 e as cadeias polipeptdicas so
sintetizadas da extremidade amina para o carboxilo terminal, sendo cada
aminocido especificado por trs bases, tripleto (codo), no mRNA.
A traduo realizada nos ribossomas, com os tRNAs servindo de
adaptadores entre o molde de RNA e os aminocidos. No entanto a sntese de
uma protena envolve a interaco de muitas outras protenas.
RNAs de Transporte
Os tRNAs possuem aproximadamente 70 a 80 nucleotdeos e tm uma
estrutura de trevo devido ao pareamento de bases complementares em
diferentes regies da molcula.
Os tRNAs tm duas regies distintas, uma sequencia CCA na
extremidade 3, onde os aminocidos se liga covalentemente ribose do A
terminal, e uma sequncia de 3 bases, que ir reconhecer o condo, localizada
na ala, sendo chamada de anticodo.
A ligao entre o aminocido e o tRNA catalisada por um conjunto de
enzimas designadas tRNA aminoacil sintetases. Em caso de existir um
aminocido incorrectamente ligado, existe uma reviso, que hidrolisa em vez
de serem ligados definitivamente no segundo passo deste reaco; este
processo torna o reconhecimento do aminocido altamente fivel.
Os aminocidos so alinhados no molde atravs da complementaridade
entre o codo e o anticodo, no entanto existem tRNAs capazes de reconhecer
mais do que um codo, atravs de um pareamento atpico entre o anticodo e
a terceira posio de alguns codos complementares.
O Ribossoma
Tantos os ribossomas eucaritas, como os procaritas, so compostos
por duas subunidades, uma subunidade grande e outra pequena, que por sua
vez so constitudas por protenas caractersticas e RNAs ribossomais
(rRNAs). Os ribossomas eucaritas e procaritas so similares no seu
funcionamento, a sua grande diferena reside no seu tamanho.
Uma das caractersticas a destacar que estes podem ser formados in
vitro espontaneamente da juno do seu RNA com os constituintes proteicos.
Atravs de sucessivas experiencias, que consistiam na omisso sucessiva de
protenas que constituem o ribossoma, constatou-se que apenas havia um
decrscimo da actividade do ribossoma; conclui-se ento que a reaco
catalisada pelos rRNAs e que as protenas facilitam o dobramento do rRNA e
posicionam-no correctamente.
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2007/2008
A Organizao de mRNAs e Inicio da Traduo

Embora os mecanismos de sntese proteica sejam idnticos em
eucaritas e procaritas, estes diferem principalmente nos sinais que
determinam as posies onde se inicia a traduo.
A traduo no se inicia na extremidade 5, como era de esperar,
existem stios especficos de iniciao, pois na extremidade 5 temos a regio
5 no-traduzida (5 UTR), que existe igualmente na extremidade 3 (3 UTR). O
codo que indica a iniciao o AUG, que codifica uma metionina, que nos
procaritas modificada.
Nos procaritas a sequencial sinal, que determina a ligao do
ribossoma ao mRNA, a sequencia de Shine-Delgarno, enquanto que nos
eucaritas o ribossoma se liga ao cap 7-metilguanosina da extremidade 5.
O Processo de Traduo
A traduo geralmente dividida em trs etapas: iniciao, alongamento
e terminao.
Um iniciador especfico de tRNA metionil e o mRNA ligam-se
subunidade ribossomal pequena. A subunidade grande liga-se ao complexo e o
alongamento prossegue.
A iniciao em eucaritas mais complexa do que em procaritas e
requer no mnimo dez protenas que so designadas de IFs. Os factores de
iniciao eucaritas reconhecem tanto a extremidade 5, como a extremidade
3.
O alongamento similar tanto em eucaritas, como em procaritas,
tendo o ribossoma 3 stios para ligao do tRNA, o sitio iniciador (P), segue-se
o sitio A e o sitio E, este ultimo antecede o P. O alongamento continua at que
um codo STOP seja translocado no sitio A do ribossoma, as clulas no
possuem anticodes complementares para estes codes, t, antes factores de
libertao que terminam a traduo.
Os mRNAs podem ser traduzidos por vrios ribossomas, assim que um
abandona o sitio de iniciao outro pode-se ligar e iniciar a traduo.
Nota: Existe na clula mecanismos que controlam a transcrio de
forma a que, no caso de existir um codo STPO precoce devido a uma
mutao, o mRNA que se forma degradado. este fenmeno que
explica que muitas das vezes no so originados protenas, nem
detectados mRNAs, de genes mutados. Este mecanismo apenas eficaz
de o codo de STOP for originado no inicio da sequencia, pois os que se
localizam no final so mais dificilmente detectados e do geralmente
origem a uma protena truncada.
58
2007/2008
A Regulao da Traduo
Um dos mecanismos de regulao a ligao de protenas repressoras,
que bloqueiam a traduo, em sequncias especficas do mRNA. Outro
mecanismo envolve a modulao da actividade dos factores de iniciao,
particularmente o IF-2, no entanto este processo tem efeitos globais na
actividade de traduo, em vez de ser especifico. Contrariamente a estes
processo, existe um que envolve o factor IF-4E que se vai ligar extremidade
5 dos mRNAs e age como uma protena reguladora da traduo, estimulando
o inicio da traduo, pelo recrutamento da pequena subunidade do ribossoma.
Dobramento e Processamento Proteicos

A traduo completa o fluxo de informao gentica entro da clula, no
entanto temos agora uma sequencia de aminocidos que no corresponde a
uma protena funcional. Para que uma protena seja funcional a cadeia de
aminocidos vai-se dobrar sobre si mesmo e adquirir uma conformao
tridimensional, e possivelmente associar-se a outros polipeptdeos formando
complexos funcionais.
Muitas protenas sofrem ainda outras modificaes ps-traducionais,
como a clivagem, ligaes covalente a lpidos e glcidos, que vo determinar a
sua funo e localizao correcta dentro da clula.
Chaperonas e Dobramento Proteico

Toda a informao necessria para uma protena adaptar a conformao
tridimensional correcta fornecida pela sua sequncia de aminocidos. No
entanto existem protenas que facilitam esse dobramento, denominadas de
chaperonas, que apenas catalisam o dobramento de cadeias, pois a forma
como este feito determinado unicamente pela sequncia de aminocidos.
Na ausncia de chaperonas cadeias polipeptdicas dobradas ou no dobradas
seriam instveis, dobrando-se incorrectamente ou agregando-se em complexos
insolveis.
Existem protenas que funcionam como chaperonas, mas que
inicialmente foram designadas como protenas de choque trmico, pois
encontram-se em organismos que vivem em condies extremas. Estas
protenas, da classe das chaperonas, evitam que em meios extremos de acidez
ou basicidade, altas temperaturas e presena de outros factores desnaturantes,
as protenas destes organismos desnaturem, podendo assim realizar as suas
funes normais.
Enzimas e Dobramento Proteico

A formao de ligaes dissulfeto entre os resduos de cistenas
importante na estabilizao de estruturas dobradas de muitas protenas, a
protena dissulfeto isomerase catalisa a quebra e a formao destas ligaes.
59
2007/2008
As ligaes dissulfeto so restritas a protenas destinadas a serem segregadas

ou incorporadas na membrana, porque o citosol contem agentes redutores que
mantm a cistena na sua forma reduzida, impedindo que se formem pontes
dissulfeto.
A peptidil prolil isomerase, que catalisa a isomerizao entre as formas
cis e trans nas ligaes que precedem resduos de prolina, que de outra forma
dificilmente permitiriam a criao de alterao na conformao desta ligao,
que pode ser fundamental para uma correcta conformao tridimensional e
funo da protena.
Clivagem Proteica
A clivagem proteica da cadeia polipeptdica, designada de protelise,
um passo importante na maturao de muitas protenas. So frequentemente
adicionadas sequncias sinalizadoras, que marcam o destino da protena,
pois preciso clivar essa sequncia para que a protena se torne madura,
exemplo a peptidase sinalizadora.
interessante notar que muitas protenas de vrus tal como hormonas
humanas, derivam da clivagem de precursores maiores. exemplo a insulina,
que sintetizada contendo uma nica cadeia, tendo uma sequncia sinal.
Inicialmente clivada essa sequncia sinal, a restante cadeia estabelece as
ligaes que iro dar origem a sua conformao tridimensional e no sim esta
cadeia cliva em dois pontos, sendo retirado um segmento intermdio,
originando dois domnios diferentes. A presena daquele segmento no para
a funo da protena, mas sim para a sua correcta conformao, permitindo
que as ligaes se formem entre os resduos de aminocidos correctos.
Glicolizao
Muitas protenas so modificadas por adio de glcidos, num processo
denominado de glicolizao, e passam a designar-se glicoproteinas. As
pores de glcidos desempenham um papel importante no dobramento no
reticulo endoplasmtico, na marcao de protenas e como stios de
reconhecimento nas interaces clula-clula.
As glicoproteinas so geralmente segregagas ou incorporadas na
membrana, e o processo de glicolizao ocorre no reticulo endoplasmtico,
geralmente, durante a traduo.
Existe a N ou O glicolizao, dependendo do local onde est ligado o
glcido, e isso faz com que difira o local onde realizada a glicolizao, este
tema ser abordado mais afrente.
Ligao de Lpidos
Algumas protenas so modificadas pela ligao de lpidos cadeia
polipeptdicas, que geralmente marcam e ancoram essas protenas
membrana plasmtica.
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2007/2008
Existem trs tipos gerias de adio de lpidos: N-miristoilao, prenilao

e palmitoilao. Um quarto tipo, a adio de glicolipidos, tem um papel
importante no ancoramento de algumas protenas na face extracelular da
membrana.
Em baixo iremos descrever brevemente os quatro tipos de ligao de
lpidos referenciados anteriormente:
- N-miristoilao um cido gordo ligado amina terminal dos
resduos da cadeia polipeptdica em formao, durante a traduo;
- Prenilao consiste na ligao de lpidos s cadeias laterais dos
resduos de cistena, serina e treinuna; so lpidos especficos (grupos prenil)
que so ligados ao enxofre da cadeia lateral destes resduos de aminocidos;
- Palmitoilao o cido palmtico adicionada ao tomo de enxofre
nas cadeias laterais de resduos internos de cistena;
- Os glicolpidos so ligados ao carbono do grupo carboxilo terminal de
algumas protenas.
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2007/2008
Captulo Nove
O primeiro passa para a distribuio das protenas ocorre ainda durante
a traduo, visto que vrias protenas com destino ao reticulo endoplasmtico,
ao complexo de Golgi, membrana ou aos lisossomas so traduzidas em
ribossomas associados ao reticulo endoplasmtico, dentro ocorre o seu
processamento.
Retculo Endoplasmtico
O retculo endoplasmtico (RE) uma rede de tbulos envolvidos por
uma membrana e vesculas que se estendem desde o membrana nuclear por
todo o citoplasma.
Existem dois tipos de RE, estando cada um envolvido em funes
diferentes:
- Retculo Endoplasmtico Rugoso, possui ribossomas associados e
funciona no processamento das protenas;
- Retculo Endoplasmtico Liso, sem ribossomas associados e est
envolvido no metabolismo de lpidos.
O Retculo Endoplasmtico e a Secreo de Protenas

Atravs de vrias experiencias definiu-se a via secretora de protenas:
RE Rugoso Complexo de Golgi Vesculas Secretoras
Exterior
Esta via no restricta a protenas que sero excretadas, mas
igualmente comum a protenas da membrana plasmtica e lisossomais.
Algumas protenas iniciam esta via secretoras, no entanto nunca chegam a
conclui-la, ficando retidas no RE Rugoso ou no complexo de Golgi.
A entrada de protenas no RE Rugoso representa o ponto principal de
ramificao para o trfego de protenas dentro da clula. Protenas que tm
como destino final a excreo ou incorporao nos organitos so inicialmente
direccionadas para o RE Rugoso ou sintetizadas em ribossomas associados a
este. As protenas restantes so sintetizadas em ribossomas livres e libertadas
no citosol.
Direccionando
Endoplasmtico
Protenas
para
Retculo
As protenas podem ser transportadas para dentro do RE durante a sua

sntese nos ribossomas associados ao RE ou aps a sua traduo em
ribossomas livres ter sido completada. Nos mamferos, a maior parte das
protenas, entram no RE simultaneamente sua traduo.
62
2007/2008
Os ribossomas so levados a associarem-se membrana do RE pela

sequncia de aminocidos que est a ser sintetizados e no pelas
propriedades intrnsecas do ribossoma.
As sequncias sinais no terminal amina da protena que est a ser
sintetizada, so curtas sequncias de aminocidos hidrofbicas que so
clivadas durante a sua transferncia para o lmen do RE. As sequencias
sinais so reconhecidas pela partcula de reconhecimento de sinal (SRP), que
se ligam a esta e ao ribossoma, sendo de seguida, ligado a um complexo
proteico de transporte na membrana do RE e a sequencia sinal inserida num
canal de membrana.
Quando o transporte inicado, aps a traduo, a sequencial sinal
clivada por uma peptidase sinal e o polipptido libertado no lmen do RE. No
caso de protenas que so sintetizadas em ribossomas livres, s depois da
traduo so incorporados no RE, no entanto esta no mediada por SRP,
mas sim por receptores de protenas especficos.
Insero de Protenas na Membrana do Retculo

Endoplasmtico
As protenas destinadas incorporao na membrana plasmtica so
inicialmente incorporadas na membrana do RE e no libertados no lmen.
Seguem a via das restantes protenas secretadas, mas so transportadas
como componentes da membrana e no como protenas solveis.
As protenas podem estar inseridas na membrana de diversas formas,
apenas uma vez ou diversas vezes, podem ter diferentes orientaes, tendo o
seu terminal amina para o lado do citosol ou para o interior, o que
determinado a quando da sua incorporao na membrana do RE.
Visto que o lmen do RE , topologicamente, idntica ao exterior das
clulas, os domnios das protenas que esto expostos no exterior da clula
correspondem aos que so transportados no lmen do RE.
A maneira mais simples de insero de protenas nas membrana do RE
resulta da sntese de protenas transmembranares com o ser terminal carboxilo
exposta para o citosol e a sua sequencia sinal para o lmen, que
posteriormente clivada.
Dobramento de Protenas e Processamento no Retculo

Endoplasmtico
O dobramento de cadeias polipeptdicas nas suas conformaes
tridimensionais, para protenas que entram na via secretora, ocorre durante o
transporte atravs na membrana do RE ou no seu lmen. Na verdade o
principal papel das protenas do lmen do RE catalisar o dobramento e o
processamento das protenas que se encontram a ser transportadas.
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2007/2008
O Reticulo Endoplasmtico
Os lpidos so sintetizados no RE Liso devida s suas caractersticas,
sendo estes hidrofbicos, so sintetizados em associao com as membranas
j existentes e no no citosol; so de seguida transportadas por vesculas ou
protenas para os seus destinos.
Alm do seu papel na sntese dos glicerol fosfolipidos, o RE tambm
serve como principal local de sntese de outros dos lipidos de membrana: o
colesterol e a ceramida. So aqui produzidas igualmente as hormonas
esteroides, a partir do colestrol, so por isso muito desenvolvidos (RE Lisos)
em clulas secretoras de hormonas esteroides.
Para manter a membrana do RE Liso estvel alguns dos lpidos
sintetizados de novo so transferidos para a poro exterior da bicamada, este
processo catalisado pelas flipases.
Exportao
Endoplasmtico
de
Protenas
Lpidos
do
Retculo
As molculas so exportadas do RE em vesculas que derivam deste e

transportam o contedo at ao compartimento intermedirio RE Golgi; e
depois at ao complexo de Golgi. J no complexo de Golgi so transportados
entre diferentes compartimentos do Golgi e do Golgi para lisossomas ou
membranas plasmticas, ou para vesculas excretoras.
O primeiro ponto de ramificao que surge nesta via exportao para
o Golgi versus reteno no RE, surgem outros como exportao para os
lisossomas ou membrana plasmtica versus reteno no Golgi; todos este
pontos de ramificao so regulados por sequencias sinal presentes na cadeia
polipeptdica.
Como exemplo de sequencias que determinam qual o caminho a seguir
pela protena, temos os sinais KDEL ou KKXX que determinam que as
protenas sejam recuperadas do intermedirio RE Golgi de novo para o RE.
O Complexo de Golgi
O complexo de Golgi funciona como uma fbrica na qual as protenas
recebidas do RE so processadas e separadas para que sejam transportadas
para os seus destinos. No entanto neste que ocorre a sntese de alguns
lpidos, como glicolipidos ou esfingomielinas, ou de polissacarideos.
Organizao do Complexo de Golgi

O complexo de Golgi composto por sacos (cisternas) envoltas por
membranas achatadas e vesculas associadas. Possui uma face cis, que
convexo e habitualmente orientado na direco do ncleo, e a outra face trans.
Este encontra-se dividido em quatro regies funcionalmente distintas: a
rede de Golgi cis, pilha de Golgi medial e trans, rede de Golgi trans. As
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2007/2008
protenas entram pela rede Golgi cis, sofrem a maior parte das alteraes na
pilha de Golgi e saiem pela rede de Golgi trans, sendo distribudas e
direccionadas para os seus destinos.
Distribuio de Protenas e Exportao do Complexo de

Golgi
As protenas, assim como os lpidos e os polissacarideos, so
transportados do complexo de Golgi para os seus destinos pela via secretora, o
que envolve a sua incorporao em diferentes tipos de vesculas
transportadoras, que saiem da rede Golgi trans e entregam os seus contedos
nos locais apropriados da clula.
Sinais responsveis pela reteno de algumas protenas dentro do Golgi
formam localizadas pelo seu domnio transmembranares, que retm a protena
dentro do Golgi.
A via secretora constitutiva leva secreo continua e descontrolada de
protenas, no entanto algumas clulas possuem uma via secretora regulada, na
qual protenas especificas so secretadas em resposta a sinais do meio;
seguem o processo normal da via secretora constitutiva, mas so armazenadas
em vesculas especializadas.
Protenas de Revestimento e de formao de Vesculas

O primeiro passo no transporte vesicular a formao de uma vescula
por alteraes na membrana, que revestida por protenas. Existem trs tipos
de vesculas recobertas, que parecem funcionar em diferentes tipos de
transporte vesicular:
- Vesculas recobertas por clatrinas, so responsveis pela captao
de molculas extracelulares da membrana celular por endocitose;
- Vesculas recobertas por COP, que se dividem em COPI, funcionam
na via de recuperao para reter protenas no Golgi ou RE, e em COPII, que
saiem do RE e transportam molculas para o complexo de Golgi.
Fuso Vesicular
A fuso de uma vescula de transporte com o seu alvo envolve dois tipos
de eventos: a vescula transportadora deve reconhecer especificamente a
membrana alvo-correcta; e a vescula e a membrana-alvo devem fundir-se,
libertando assim o contedo para o interior do organito-alvo.
A hiptese de SNARE diz-nos que a fuso vesicular mediada por
interacces entre pares especficos de protenas, designados de SNAREs, na
vescula (v-SNARE) e na membrana alvo (t-SNARE). A interaco entre as vSNARE e a t-SNARE leva fuso das membranas atravs de mecanismos
ainda no conhecidos.
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2007/2008
Existe ainda o complexo NSF/SNAP que actua depois da fuso entre as

membranas para desagrupar o complexo SNARE, para que possa ser
reutilizado.
Lisossomas
So
organitos
envolvidos por membranas
que contm uma variedade
de enzimas capazes de
hidrolizar todos os tipos de
polmeros biolgicos. Servem
para digerir tanto o material
captado do exterior como
componentes
da
clula
absolentos.
Hidrolases
Lisossomais cidas
Os
lisossomas
possuem
cerca
de
50
enzimas,
que
degradam
todos
os
polmeros
biolgicos. Mutaes nos
genes que codificam estas
enzimas so responsveis
por mais de 30 patologias,
que so chamadas de
doenas de armazenamento
dos lisossomas, pois o
material no degradado e
acumula-se nos lisossomas.
Como exemplo temos a
Doena de Gaucher, que
originado pela mutao no
gene que codifica uma
enzima responsvel pela
degradao de glicolpidos.
Todas as enzimas
lisossomas so activas em
pH baixo, que mantido
dentro dos lisossomas, mas inactivas em pH neutro. O que permite evitar uma
digesto descontrolada dos componentes da clula, o pH mantido cido no
interior dos lisossomas por transporte activo de ies H+ para o interior do
lisossoma.
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Captulo Dez (pg. 411-415)

Mitocndrias
A mitocndrias tm um papel crucial na produo de energia metablica
das clulas eucaritas. Estas possuem o seu prprio DNA que codifica tRNAs,
rRNAs e algumas protenas mitocndriais; as restantes so sintetizadas em
ribossomas livres e importadas para o interior do organito por sinais
especficos.
Organizao e Funo das Mitocndrias

As mitocndriais so delimitadas por um sistema de dupla membrana,
composta por uma membrana interna e uma externa, separadas por um
espao intermembranares. A membrana interna apresenta cristas que se
estendem para o interior, que se designa de matriz. nesta que encontramos o
genoma mitocndrial e as enzimas responsveis pelas reaces centrais do
metabolismo oxidativo.
No entanto na membrana interna que se localiza o principal local de
gerao de ATP, que possui caractersticas que tornam este processo mais
eficiente, como exemplo o aumento da sua superfcie devido s cristas e a
sua impermeabilidade maioria dos ies e molculas pequenas.
Contrariamente membrana interna, a externa, permevel a algumas
molculas pequenas, devido a protenas que formam canais, as porinas.
O Sistema Gentico das Mitocndrias

As mitocondrias possuem o seu prprio genoma, distinto do nuclear.
Considera-se que estas evoluram de bactrias que desenvolveram um
relacionamente simbitico com outras clulas.
O genoma mitocndrial constitudo por molculas circulares de DNA,
que esto presentes em mltiplas cpias por organito, o que nos indica que
existe na clula uma muito maior percentagem de genoma mitocndrial do que
nuclear. importante realar que na mitocndria usado um cdigo gentico,
ligeiramente, diferente do cdigo gentico universal.
Tal como o DNA nuclear, o DNA mitocndrial pode sofrer mutaes, no
entanto a mitocndria no possui mecanismos de correco, o que origina uma
elevada taxa de mutao do DNA mitocndrial.
importante destacar o facto de a quando da fecundao todas a
mitocndrias derivam o ocito, o que faz com as doenas mitocndriais
sejam apenas transmitidas por via materna.
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Captulo Dez (pg. 437-441)

Peroxissomas
Os peroxissomas so organitos pequenos delimitados por uma
membrana e que contm enzimas envolvidas em uma grande variedade de
reaces metablicas, incluindo vrios aspectos do metabolismo energtico.
Apesar de serem idnticos aos lisossomas, diferem na sua formao, sendo
este formados apartir de protenas sintetizadas nos ribossomas livres. Apesar
de no possurem genoma so idnticos s mitocndrias e aos cloroplastos,
pois reproduzem-se por diviso.
Funes do Peroxissomas
Os peroxissomas possuem, pelo menos, 50 enzimas diferentes
envolvidas em uma variedade de metabolismos.
Como o perxido de hidrognio txico para as clulas, os
peroxissomas possuem tambm a enzima catalase, que decompe esse
composto, convertendo-o em gua, ou utilizando-o para oxidar outros
compostos orgnicos.
Diversos compostos so degradados nos peroxissomas, um exemplo a
oxidao dos cidos gordos, que representa a principal fonte energtica
metablica.
Os peroxissomas esto ainda envolvidos na biossintese de lpidos, de
cidos biliares. Nas plantas desempenham dois papeis importantes , a
converso dos cidos gordos em glcidos, atravs do ciclo do glioxilato; esto
ainda envolvidos na fotorespirao, que serve para metabolizar produtos
secundrios formados durante a fotossntese.
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2007/2008
Captulo Onze
O Citoesqueleto
Citosqueleto uma rede complexa, dinmica e interdependente de
filamentos proteicos que se estendem ao longo do citoplasma. As suas funes
so:
- Suporte de organitos celulares;
- Sustentao da membrana plasmtica;
- Importante para a mobilidade celular;
- Mantm a forma e confere elasticidade clula;
- Permite o transporte de vesculas.
Existem trs tipos de filamentos proteicos, dos quais iremos falar em
particular de seguida, os microtbulos, os filamentos intermdios e os
microfilamentos ou filamentos de activa. A ordem a cima descrita est por
tamanho decrescente.
Microtbulos
Encontram-se dispersos pelo citoplasma. Podem participar na
constituio de organitos (clios, flagelos e centrolos), que desempenham um
papel importante nalguns tipos de mobilidade celular. Tambm esto presentes
nas dendrites e nos axnios. Os microtbulos desempenham funes de:
- Estabelecem a forma da clula;
- Fornecem fora mecnica;
- Locomoo da clula;
- Trfego intracitoplasmtico de vesculas e organelos durante a
interfase;
- Construo do fuso mittico e movimento dos cromossomas;
- Criao e manuteno de domnios citoplasmticos.
Constituio dos Microtbulos

Constitudos pela polimerizao de um heterodmero de tubulina e
tubulina , originando uma parede de 13 protofilamentos alinhados
longitudinalmente.
Os microtbulos so estruturas com polaridade, sendo que a
extremidade positiva, onde se encontra a tubulina , o local onde ocorre a
associao de novas subunidades; assim sendo nesta extremidade que
ocorre uma polimerizao mais acelerada. Na extremidade oposta, de
polaridade negativa, estando exposta a tubulina , ocorre uma fraca
polimerizao.
Os microtbulos que entram na constituio de clios, flagelos e
centrolos so estveis, j os microtbulos citoplasmticos so estruturas
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2007/2008
dinmicas, que podem formar-se e desmontar-se

polimerizao e despolimerizao.
Os microtbulos citoplasmticos tm um
importante papel na diviso celular, sendo que
nesta fase que a sua instabilidade mais
notvel.
rapidamente
por
Os microtbulos irradiam e crescem a

partir de focos de material denso , situados nas
imediaes dos centrolos. Neles encontra-se
tubulina , esta responsvel pela funo dos
focos de polimerizao.
O processo de polimerizao dos
microtbulos mediado pelo GTP e o GDP,
sendo que um se liga a uma subunidade e
outro a outra. inibida por baixas
temperaturas e ies Ca2+ e favorecida pela
presena de GTP ou GDP e ies Mg2+.
Transporte Celular e Protenas Motoras

Os microtbulos esto no s associados estrutura e aos movimentos
da clulas, mas so igualmente responsveis pelo transporte intracelular.
Existem duas protenas associadas aos microtblos e que desempenham essa
funo de transporte:
Dinenas possibilitam o movimento em direco extremidade
negativa;
Cinesinas possibilitam o movimento em direco extremidade
positiva.
A produo de fora motriz por parte deste sistema tambm se pode
basear na despolimerizao dos microtbulos, sendo um exemplo a
deslocao dos cromossomas durante a anafase.
Protenas Associadas aos Microtbulos

Podem interferir com a ligao dos
microtbulos a outras estruturas celulares, ou
com a dinmica de polimerizao e
despolimerizao, permitindo a modulao das
suas funes.
As MAP baixam a concentrao crtica
de tubulina necessria formao dos MT,
favorecem o seu crescimento e diminuem a
taxa da sua dissociao; como exemplo destas temos as protenas tau.
70
2007/2008
Drogas que Intreferem com os Microtbulos

Existem drogas que intreferem
com a estabilidade, ou os processos
de polimerizao e despolimerizao
dos microtbulos, como exemplo:
Colchicina inibe in vitro a
polimerizao da tubulina e provoca in
vivo a dissociao dos microtbulos
citoplasmticos. As suas molculas
ligam-se com grande afinidade aos
dmeros de tubulina inibindo a sua
polimerizao.
Vinblastina
liga-se
s
molculas de tubulina impedindo a sua
polimerizao, originando a formao
de agregados paracristalinos desta
protena.
Taxol associa-se a polmeros
de tubulina, tendo uma aco
estabilizadora. Baixa a concentrao
crtica de tubulina necessria polimerizao, que promove mesmo em
condies desfavorveis (ausncia de MAP e GTP, baixas temperaturas).
Filamentos Intermdios
Os filamentos intermdios tm um dimetro entre o dos microtbulos e
o dos microfilamentos. Formam uma rede perinuclear, donde se estendem at
membrana celular. Ocorrem sob a forma de pequenos feixes ou constituindo
feixes muito compactos nas clulas epiteliais. Constitudos por protenas
fibrosas, cujo domnio central constitudo por uma hlice , com cerca de 310
a 350 aminocidos e duas pores globulares em ambas as extremidades, de
dimenses e sequncia muito variveis. Podemos assim dividi-a em dois
domnio distintos:
Domnio central responsvel pela idntica organizao estrutural dos
diferentes tipos de filamentos intermdios.
Domnios terminais muito variveis em tamanho e nas sequncias de
aminocidos, conferem-lhes especificidades prprias.
As suas principais funes so:
- Desempenham funes estruturais (papel de suporte):
- Reforam as clulas (resistncia mecnica);
- Participam na organizao das clulas em tecidos;
- Reforam a membrana celular nos locais de contacto com outras
clulas;
- Transporte de macromolculas e vesculas.
71
2007/2008
Diferentes Tipos de Filamentos Intermdios

Os filamentos intermdios so classificados segundo a estrutura
molecular e a organizao dos genes. So agrupados juntamente com as
lminas nucleares numa grande famlia multignica. Consideram-se 5 tipos
diferentes de famlias de protenas que os constituintes:
- Tipo I Citoqueratinas acdicas* epitlios
- Tipo II Citoqueratinas bsicas/neutras* epitlios
- Tipo III:
Vimentina mesnquimas
Desmina msculo
Protena acdica fibrilar glial clulas gliais e astrcitos
Periferina neurnios do SN perifrico
- Tipo IV:
Protenas dos neurofilamentos
NF-L
Tecido nervoso perifrico maduro; associadas
NF-M
aos
MT
neuronais aumentam o tamanho do axnio.
NF-H
Nestina clulas neuroepiteliais
internexina tecido nervoso em crescimento
- Tipo V Lminas nucleares A, B e C constituem o invlucro nuclear,
so exclusivas do ncleo
Formao dos Filamentos Intermdios

A formao dos filamentos pode ser dividida em quatro acontecimentos
sequenciais, que so os seguintes
- Um monmero emparelha com um monmero idntico para formar um
dmero (estrutura entrelaada), que conserva as regies homlogas
emparelhadas paralelamente na forma helicoidal;
- Dois dmeros alinham-se para formar lado a lado um tetrmero, que
contm 4 cadeias polipeptdicas;
- Cada tetrmero constitui um protofilamento de 2 a 3 nm. Quatro
Protofilamentos (tetrmeros) enrolados helicoidalmente formam protofibrilhas
de 4 a 5 nm;
- A associao de 4 protofibrilhas constitui filamentos intermdios de 10
nm.
72
2007/2008
Filamentos de Actina
Os filamentos de Actina tm aproximadamente 7nm de espessura e
alguns m de comprimento, a aparncia da dupla hlice, so polares e
organizam-se em forma de feixes ou de redes.
Polimerizao/Despolimerizao
A actina G ou globular forma estruturas com 3 unidades, a unio destas
estruturas forma a actina F ou filamentosa.
Os monmeros de actina podem ligar-se a ATP, que facilita a
polimerizao e dificulta a despolimerizao, e a ADP, que dificulta a
polimerizao.
Existe um equilbrio entre a actina G e a actina F, assim sendo quando a
concentrao de actina G superior, a polimerizao favorecida, quando
inferior, a despolimerizao favorecida.
Na extremidade positiva existe uma velocidade de polimerizao cerca 5
a 10 vezes superior do que na extremidade negativa, sendo que na positiva se
ligam o monmeros associados a ATP e na negativa os associados ao ADP.
Visto que a polimerizao numa extremidade favorece a
despolimerizao na outra, para que haja uma estabilidade dos filamentos de
actina, existe o efeito treadmilling, que favorece igualmente a adio na
extremidade positiva e a remopo na extremidade negativa.
Protenas
que
Regulam
Despolimerizao da Actina
Polimerizao
Existem protenas que regulam a polimerizao e a despolimerizao da

actina, elas denominam-se por ABPs. Alguns dos exemplos de ABPs so os
seguintes:
- Complexo Arp 2/3 Conduz nucleao de actina, criando ramos nos
filamentos ou aumentando a sua taxa de treadmilling;
- Formina Leva nucleao de actina, determinando onde so
iniciados e para onde elongam os filamentos;
73
2007/2008
- ERM Promovem a polimerizao dos microfilamentos; so

associadas a protenas da membrana;
- Famlia ADF/cofilina Liga-se actina-F-ADP, aumentando a taxa de
despolimerizao na extremidade negativa, mantm a actina-G-ADP formada
nessa forma, impedindo a polimerizao
- Profilina Estimula a passagem de actina-G-ADP para actina-G-ATP,
aumentando a taxa de polimerizao
- Gelsolina Cliva a actina F em partes, pela separao de monmeros
num determinado ponto;
Timosina
4
liga-se
individualmente aos monmeros de actina,
reduzindo a sua concentrao no citosol,
induzindo a despolimerizao de actina F.
Existem ainda protenas que regulam
a polimerizao/despolimerizao formando
um cap numa das extremidades, inibem a
polimerizao ou a despolimerizao
consoante se ligam a extremidade positiva
ou negativa, respectivamente.
Drogas que Afectam o Citosqueleto de Actina

As principais drogas que intreferem com a estabilidade e o equibilibro
entre despolimerizao e polimerizao dos filamentos de actina so:
- Citocalasinas Ligam-se extremidade positiva dos filamentos,
impedindo a sua elongao;
- Lantrunculina Bloqueia a actina-G, impedindo a polimerizao de
actina F;
- Faloidina Liga-se aos filamentos de actina, impedindo a sua
dissociao em monmeros, bloqueando assim os microfilamentos.
Organizao do Citoesqueleto de Actina

Os filamentos de actina podem organizar-se de duas formas distintas:
em rede ou em feixes.
Os feixes de actina podem estar organizados de duas formas distintas:
- Feixes Paralelos, poucos espaos entre os filamentos e a fimbrina
que une os filamentos;
- Feixes Contrcteis, existe um maior espaamento entre os feixes de
actina e a -actina que une as extremidades de cada filamento.
Os filamentos de actina organizados em redes consistem em arranjos
tridimensionais, onde a ligao entre feixes realizada por filamina, que liga
os filamentos numa orientao tridimensional, flexvel no seu arranjo global.
Esta configurao encontra-se junto membrana plasmtica.
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2007/2008
Miosina
A miosina funciona geralmente em
associao com filamentos de actina e
protenas motoras, estando envolvida no
transporte celular e nos movimentos da
clula. A miosina pode ser divida em dois
domnios:
- Cabea, liga-se actina;
- Cauda, liga-se a cargas a transportar ou a outras subunidades de
miosina.
Contraco Muscular
Msculos esquelticos so constitudos por fibras musculares
compostas por clulas alongadas, contendo miofibrilas: filamentos de actina e
filamentos de miosina; que se dividem em sarcmeros, ou seja, unidades
contrcteis responsveis pelo aspecto estriado dos msculos.
As miosinas das clulas musculares so do tipo miosina II. As fibras de
miosina so constitudas pela unio das suas caudas, ficando as suas cabeas,
que se associam a actina, livres para o fazer.
Existem diversas teorias para explicar a contraco muscular, a mais
aceite consiste no seguinte:
- Filamentos de miosina ligados actina;
- Ligao do ATP;
- Filamentos de miosina desligam-se da actina;
- Hidrlise do ATP;
- Mudana de conformao da cabea da miosina, permanncia do ADP
+ P i;
- Ligao da miosina a um novo local do filamento de actina, mais
prximo da extremidade positiva;
- Libertao do ADP e do Pi;
- Retoma da conformao inicial;
- Avano do filamento de miosina em direco extremidade positiva da
actina;
- Contraco Muscular, ou seja diminuio entre as miofribilas.
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2007/2008
Captulo Treze
Sinalizao de Molculas e seus Receptores
Diferentes tipos de molculas transmitem informaes entre clulas de
organismos multicelulares, embora a sua funo seja idntica, a sua estrutura
varivel. Umas transportam sinais a longas distncias, outras para locais
especficos e outras paras as clulas vizinhas.
Certas molculas atravessam a membrana e ligam-se a receptores no
citoplasma ou no ncleo, enquanto a maior parte se liga a receptores
expressos na membrana da clula. Existem diversas formas de sinalizao e
de receptores, cujos mais importantes sero abordados de seguida.
Modelos de Sinalizao Clula-Clula

A sinalizao celular pode resultar tanto da interaco directa de uma
clula com a clula vizinha como da segregao de uma molcula sinalizadora.
Este ultimo caso pode ser divido em trs grandes grupos consoante o seu
destino final:
- Sinalizao Endcrina, as molculas sinalizadoras so secretadas
por clulas endcrinas especializadas e transportadas atravs da circulao
para actuarem em clulas alvo localizadas em rgos distantes;
- Sinalizao Parcrina, uma molcula libertada actua sobre as clulasalvo vizinhas;
- Sinalizao Autcrina, as clulas respondem a sinalizaes que elas
mesmo produzem, como exemplo temos alguns linfcitos T.
Hormonas Esterides e Superfamlia de Receptores

Esterides
Todas as molculas sinalizadoras actuam por meio de ligao a
receptores expressos por clulas-alvo, em grande parte dos casos eles esto
expressos a superfcie celular, no entanto alguns encontram-se no interior do
citoplasma ou ncleo. Visto que as hormonas so pequenas molculas
hidrfobas, capazes de se difundirem atravs da membrana plasmtica,
elas actuam em receptores expressos no citoplasma ou ncleo.
Temos o exemplo da hormona da tireide que sintetizado na
glndula tireide e desempnha um papel importante no desenvolvimento e
regulao do metabolismo; a vitamina D3 regula o metabolimos do Ca+2 e o
crescimento sseo; o cido retiico e composto relacionados, sintetizados
apartir da vitamina A, desempenham um papel importante no desenvolvimento.
Hormonas Peptdeas e Factores de Crescimento

A mais amplas variedade de molculas sinalizadoras nos animais
constituda por pptidos. Existem diversos tipos de pptidos sinalizadores dos
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quais se destacam as hormonas peptdeas, os neuropeptdeos e os factores de

crescimento.
Os factores de crescimento controlam o crescimento e a diferenciao
das clulas, como exemplo no caso especifico do factor de crescimento
derivado de plaquetas (PDGF). Este factor armazenado nas plaquetas e
libertado durante a coagulao sangunea no local do ferimento. Ele estimula a
proliferao dos fibroblastos nos tecidos perifricos leso. Existem ainda os
factores de crescimento ancorados membrana, que permanecem na
membrana da clula e actuam a quando das interaces clula.
Visto que as molculas peptdeas sinalizadoras no so capazes de
atravessar a membrana, logo necessrio que existem receptores nas
membranas para que a clula possa captar os sinais por eles transmitidos.
Funes dos Receptores de Superfcie Celular

Como j foi referido, as molculas sinalizadoras, muitas delas no
conseguem atravessar a membrana e precisam por isso de receptores de
membrana.
A maior parte dos receptores actuam controlando a abertura/fecho de
canais inicos ou atravs da transmisso de sinais intracelulares que iro
interferir com factores de transcrio e regular a transcrio de determinados
genes.
Receptores Acoplados Protena G

A famlia mais ampla de receptores de superfcie celular transmite sinais
para alvos intracelulares por intermdio de protenas de ligao ao nucleotdeo
guanidina, denominadas de protenas G.
Os receptores acoplados protena G so estrutural e funcionalmente
protenas, caracterizados por sete -hlices paralelas atravessando a
membrana.
As protenas G so compostas por trs subunidades, , e . A primeira
est ligada aos nucleotdeos guanidina, que regulam a actividade desta
protena; no seu estado de repouso esta subunidade encontra-se ligado ao
GDO em complexo com a subunidade e .
Quando a hormona se liga ao receptor, este altera a sua conformao e
leva a que o GDP ligado subunidade seja substitudo por GTP. Com a
presena de GTP a subunidade e formam um complexo que ir
desempenhar as suas funes, sendo que todo este ciclo se encerra com a
hidrlise do GTP a GDP, passando a subunidade a estar de novo ligada a
GDP, ou seja, inactiva, e o complexo e junto a esta.
Receptores de Protena-Tirosina Cinase

Contrariamente ao receptores acoplados protena G, existem outros
que se encontram ligados directamente a enzimas intracelulares. A grande
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famlia deste grupo a dos receptores protena-tirosina cinase. Desta famlia

fazem parte os receptores para os factores de crescimento polipeptdeos.
A estrutura destes receptores caracterizada por um domnio N terminal
extracelular de ligao ao ligante, uma nica -hlice transmembranar e um
domnio C no citosol, onde est ligada a enzima com actividade protenatirosina cinase.
A primeira etapa em sinalizao de muitos deste receptores a
dimerizao do receptor induzida pelo ligante. Esta dimerizao leva a uma
autofosforilao do receptor medida que as cadeias polipeptdeas
dimerizadas se fosforilam umas s outras. Este processo de autofosforilao
constitui um importante ponto de regulao e permite que se criem stios
especficos para a ligao de protenas adicionais, que iro transmitir a cadeia
de sinais intracelulares dos receptores activados. Os mais bem conhecidos
destes domnios so os domnios SH2.
Vias de Transduo de Sinal Intracelular

A maioria dos receptores de superfcie celular estimula enzimas-alvo
intracelulares, as quais podem, ou no, estar acopladas aos receptores por
protenas G. essas enzimas so elementos da cascata de sinalizao que
propaga e amplifica o sinal iniciado pela ligao do ligante. Ao conjunto de
reaces que transmitem o sinal desde a superfcie at ao seu alvo chamamos
transduo de sinal intracelular.
A Via do cAMP: Segundo Mensageiro e Fosforilao de

Protenas
Aps vrios estudos conclui-se que a aco de muitas das hormonas era
mediada por um aumento da concentrao de AMP Cclico (cAMP), o que nos
levou a considerar o cAMP como o segundo mensageiro na sinalizao
hormonal.
O cAMP formado apartir do ATP pela aco de adenial ciclase e
degradado a ATP por cAMP fosfodiesterase.
Grande parte dos processos em que o cAMP actua como segundo
mensageiro funcionam de forma a que as protenas que necessitam de ser
acivadas possuem subunidades regulatrias ligadas a elas, que as inibem, e
que so removidas a quando da ligao de cAMP. No caso dos animais este
efeito verifica-se maioritariamente nas protenas cinases dependentes de
cAMP, ou protenas cinase A.
Com este mecanismo possvel uma enorme amplificao do sinal
desde o receptr at ao alvo, pois cada molcula ligante activa um nico
receptor, que por sua vez pode activar mais de uma centena de molcula G,
que estimulam a actividade da adenil cinase, que por sua vez pode catalisar a
sntese de muitas molculas de cAMP.
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2007/2008
Muitas vezes o cAMP vai interferir directamente na regulao da

transcrio de determinados genes, estes possuem uma sequncia regulatria
(CRE), ao qual se ir ligar a protena CREB aps ter sido fosforilada por uma
protenas cinase A.
GMP Cclico
O GMP Cclico igualmente um segundo mensageiro, no entanto no
se encontra to bem estudado como o cAMP. A sua sntese mediada pela
guanilil ciclase e a sua degradao a GMP por uma fosfodiesterase.
Quando existe a ligao do ligante, as guanilil cilcase so estimuladas a
sintetisar cGMP, que por sua vez ir desencadear respostas bio-fisiolgicas.
A Via das Ras, Raf e MAP Cinase

A via da MAP cinase refere-se a uma cascata de protenas cinases que
foram altamente conservadas durante a evoluo e desempenham funes
centrais na transduo de sinal em todas as clulas eucaritas.
As ERK desempenham um papel central na sinalizao da proliferao
celular induzida por factores de crescimento que actuam por meio de
receptores protena-tirosina cinase ou receptores acoplados protena G.
A activao da ERK mediada por duas protenas cinases contracorrente, que so acopladas a receptores de factores de crescimento por uma
protena de ligao ao GTP denominada Ras. Por sua vez a activao da
Ras leva activao da proteina cinase Raf e que vai activar uma outra
protena cinase a MEK. A MEK vai por sua vez activar membros da famlia das
ERK.
Receptor + Ligante Ras Raf MEK ERK Factores de
Transcrio
Regulao da Morte Celular Programada

A morte celular programada uma forma fisiolgica normal de morte
celular que desempenha um papel-chave tanto na manuteno de tecidos
adultos como no desenvolvimento embrionrio.
A morte celular programada permite no s fazer uma renovao dos
tecidos, como evitar que clulas potencialmente perigosas para o organismos
proliferem. Como exemplo disto temos as clulas infectadas por vrus ou com
leses no seu DNA que induzem a sua prpria morte para o bem de todo um
organismo. Esta uma das formas do nosso organismo evitar que clulas que
possam originar um cancro proliferem, por isso um importante mecanismo
celular, apesar de a palavras morte estar quase sem associada a uma aco
negativa.
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A sobrevivncia das clulas assegurada, na sua maioria, pelos

factores de crescimento extracelulares, tambm a morte celular programada
mediada por um conjunto de vrias vias de sinalizao.
Caspases e Apoptose
Em contraste com a morte acidental de clulas,
a morte celular programada um processo activo
caracterizado por mudanas morfolgicas distintas
conhecidas como apoptose.
Durante este processo o DNA cromossomal
normalmente encontra-se muito condensado e
fragmentado. O ncleo fragmenta-se, sendo de
seguida a clula que diminui de tamanho e se
fragmenta; os fragmentos que dai surgem denominamse de corpos apoptticos. Estes fragmentos so
facilmente reconhecidos e digeridos pelos macrfagos,
o que faz com que a apoptose seja muito diferente da
necrose celular, onde no existe uma eficaz remoo
dos fragmentos de clula que se originam.
So as caspases que so responsveis por
desencadear todo este processo a nvel celular, sendo
elas proteases que tm no seu centro activo resduos
de cistena e clivam depois de resduos de acido
asprtico.
Os principais alvos das caspases so: um inibidor de um DNase, que ir
fragmentar o DNA nuclear; as lminas nucleares, o que provoca a alterao da
membrana nuclear; e as protenas do citoesqueleto, levando sua destruio e
fragmentao celular.
As caspases so sintetizadas sob forma inactiva, a sua activao feita
por clivagem proteoltica, o que por sua vez catalisado por outras caspases.
O Apaf-1 um dos activadores das caspases, promovendo a clivagem de
outras caspases e dos substratos alvo; em contraste temos a Bcl-2 que inibe a
activao de caspases. Nos mamferos existe a chamada famlia Bcl-2, onde
se inclui o Bcl-2, no entanto dentro deste grupo existe elementos prapoptticos e anti-apoptticos.
Uma das caspases iniciadoras a Caspase-9, que para ser activada
no basta que existe Apaf-1, ainda preciso que a este complexo se junto o
citocromo c. O que em condies normais no possvel, pois o citocromo c
encontra-se dentro da mitocndria. A quando da estimulao pr-apopttica, ou
na ausncia de factores de crescimento, as clulas induzem danos na
membrana da mitocndria, sendo o citocromo c libertado.
Forma-se ento o complexo caspase-9/Apaf-1/citocromo c que
activo e inicia a clivam de outras caspases, as efectoras, e dos seus alvos.
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Esta situao evitada pelas Bcl-2 que se vo ligar membrana da

mitocndria, mantendo a sua estabilidade, ficando o citocromo c longe da
caspase-9. No entanto existem elementos pr-apoptticos que induzem danos
na membrana de modo a que haja libertao de citocromo c.
Receptores de Morte Celular e Activao de Caspases

Existem polipeptdeos segregados que activam receptores que induzem
a apoptose factores de necrose tumoral (TNF) que iro activar
directamente as caspases.
Neste caso a caspases activa a Caspase-8,que se auto-cliva, e que
por sua vez vai activar a cadeia das caspases. Uma das aces da caspase-8,
alm de clivar outras caspases, clivar um membro das Bcl-2, o Bid, que um
elemento pr-apopttico, e vai induzir a degradao da membrana mitocndrial
e consequente libertao de citocromo c; com a presena de citocromo c a
capase-9 igualmente activa.
Sinalizao de Sobrevivncia Celular

A sinalizao referida anteriormente vai induzir a apoptose, no ento
existem outras vias que inibem a apoptose e promovem a sobrevivncia da
clula. Estas vias so controladas por factores de crescimento factores de
sobrevivncia ou por interaco clula-clula. Na realidade quase todas as
clulas esto programadas para induzirem a apoptose caso haja ausncia e
factores de sobrevivncia.
Uma das principais vias de sinalizao intracelular responsvel por
promover a sobrevivncia celular iniciada pela enzima PI-3 Cinase, que
activada por receptores de membrana. A PI-3 cinase responsvel por activar
a protena Ark que interfere com as protenas reguladoras da apoptose.
Um dos seus alvos uma protena da famlia da Bcl-2, a Bad, que induz
a libertao de citocromo c, a Ark promove a sua inactivao.
Pode ainda fosforilar a capase-9, impedido que esta fique activa,
mesmo na presena de citocromo c e Apaf-1.
Regula a expresso de factores de transcrio importantes para manter
a sobrevivncia celular.
A sobrevivncia celular pode ser assegurada no s pelas PI-3
cinases/Ark, mas igualmente pela via Ras/Raf/MAP.
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Captulo Catorze (pg. 596-617)

O Ciclo Celular dos Eucaritas
O ciclo da diviso da maioria das clulas consiste em quatro processos
coordenados: crescimento celular, replicao do DNA, distribuio dos
cromossomas duplicao s clulas-filhas e diviso celular.
Fases do Ciclo Celular

O ciclo celular pode ser dividido em duas fases principais: mitose e
interfase.
A mitose corresponde separao dos cromatdeos e termina
geralmente a diviso celular, atravs da citocinese.
No entanto grande parte do ciclo compreendido na interfase, tanto o
crescimento celular, como a replicao do DNA, ocorrem de forma ordenada e
estritamente reguladas.
Interfase Mitose Citocinese Mitose
G1 Fase S G2 Mitose Citocinese
A interfase caracterizada pelo
crescimento celular e pela replicao
do DNA; na fase G1 a clula encontrase metabolicamente muito activa e
cresce continuamente; na fase S
ocorre a replicao do DNA, passando
cada
cromossoma
a
ter
dois
cromatdeos; em seguida na fase G2 o
crescimento
continua
e
so
sintetizadas as protenas necessrias
para o inicio da Mitose.
Contrariamente ao que acontece
nas clulas embrionrias, no adulto
algumas
clulas
cessam
completamente a diviso e outras
apenas se dividem quando necessrio.
Estas clulas passam de um estado G2
para G0, no qual permanecem
metabolicamente activas mas no
proliferam, a no ser que recebam
estmulos para tal.
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As diferentes fases do ciclo celular podem ser distinguidas pelo seu

contedo em DNA:
- G1 (2n)
- Fase S (2n-4n)
- G2/M (4n)
Regulao do Ciclo Celular pelo Crescimento Celular e

Sinais Extracelulares
O ponto principal da regulao do ciclo celular ocorre no final de G1 e
controla a passagem de G1 para S START. Uma vez ultrapassado este ponto
as clulas esto destinadas a entrar em fase S e consequente diviso celular, a
sua regulao feita quer por sinais extracelulares, quer pela disponibilidade
de nutrientes no meio. No entanto nas clulas animais o ponto START
regulado quase exclusivamente pelos factores de crescimento extracelulares.
Na ausncia de estmulos para a proliferao as clulas passam de G1 para G0,
onde podem permanecer indefinidamente.
Pontos de Verificao do Ciclo Celular

Na maioria das clulas a coordenao entre as diversas fases do ciclo
celular dependente de um sistema de controlo de pontos de verificao e
retroalimentao que previnem a entrada na prxima fase do ciclo at que
eventos da fase anterior tenham sido completados
A funo de grande parte dos pontos de verificao assegurar que os
cromossomas incompletos ou danificados no se repliquem e sejam passados
para as clulas-filhas. Um dos mais bem marcados pontos de verificao
ocorre em G2, evitando que a clula passe para a Mitose sem que todos os
cromossomas estejam replicados.
A continuao do ciclo celular igualmente bloqueada em G2 caso
existam erros no DNA, quer sejam estes resultantes de agente mutagnicos ou
se erros na replicao, o que previne a passem de DNA mutado para as
clulas-filhas.
Os danos no DNA no bloqueiam apenas o ciclo em G2, mas tambm
diminuem a continuao do ciclo em S e evitam que a clula passe de G1 para
S. Assim sendo a clula pode reparar o DNA antes de prosseguir para a
prxima fase.
Em clulas de mamferos o ponto de bloqueio em G1 mediado pela
aco de uma protenas, a p53, cuja expresso induzida em respostas ao
DNA danificada (uma no replicao dos cromossomas encarada como um
dano do DNA). Este um dos genes que se encontra regularmente mutado em
paciente com cancro, pois permite a proliferao das clulas mesmo que estas
possuem danos no seu genoma.
Outro ponto de verificao ocorre no final da mitose, este assegura-se
que os cromossomas se encontram correctamente posicionados no fuso
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2007/2008
mittico, para que estes sejam distribudo de forma exacta para as clulasfilhas.
Ligao da Fase S para a Fase M

O ponto de verificao em G2 evita a iniciao da mitose antes da
concluso da fase S, assegurando-se que todos os cromossomas so
replicados uma nica vez e de forma integra. A sntese do DNA no ncleo em
G2 bloqueada por um mecanismo que evita nova replicao do genoma at
que ocorra uma mitose.
O mecanismo que regula esta replicao do DNA envolve um conjunto
de protenas designadas MCM que se ligam s origens de replicao.
Reguladores do Curso do Ciclo Celular

Como j nos foi dito anteriormente existem um conjunto de pontos de
verificao, que por sua vez regulam o avano ou o retardo do ciclo celular.
Esta regulao feita por um variado conjunto de protenas que asseguram
que o ciclo ocorra de forma coordenada, que haja uma correcta replicao e
distribuio do DNA; caso isto no se verifique a clula induz a sua prpria
morte, por um proceso de apoptose.
MPF: Um Dmero de Cdc2 e Ciclina

A
caracterizao
molecular de MPF em diversos
laboratrios mostrou ento que
este factor conservado de
regulao do ciclo celular
composto por duas subunidades
Cdc2 e Ciclina B. A actividade
do MPF controlada pela
peridica
acumulao
e
degradao da ciclina B durante
o ciclo celular, e ainda pela
fosforilao e desfosforilao de
Cdc2.
A
regulao
deste
complexo em S e G2
conseguida
por
duas
fosforilaes, sendo que uma
delas a inactiva, e por isso leva a
sua acumulao. Na transio para M causada pela activao do complexo
como resultado da desfosforilao de um resduo de tirosina que outrora
mantinha o complexo inactivo, este processo mediado pela Cdc25.
Famlia das Ciclinas e Cinases Dependentes de Ciclinas
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Nos eucaritas a passagem de G1 para a fase S regulada por Cdk2 e

Cdk4 em associao com as ciclinas D e E. Sendo que a associao de Cdk4
e ciclinas D so necessrias para ultrapassar o ponto STAR, enquanto que a
Cdk2 e ciclinas E so necessrias para a transio para a fase S e o inicio da
replicao do DNA.
Durante a fase S existe uma associao entre a ciclina A e Cdk2,
enquanto que a transio de G2 para M promovida pela associo de Cdc2
com ciclina B.
Factores de Crescimento e Ciclinas do Tipo D

A proliferao das clulas animais regulada por uma variedade de
factores de crescimentos extracelulares que controlam as clulas atravs do
ponto de restrio no ponto de restrio no final de G1. Na ausncia de factores
de crescimento as clulas so incapazes de ultrapassar o ponto STAR e
entram em G0.
A sntese de ciclina D induzida em resposta estimulao dos factores
de crescimento como resultado da sinalizao atravs de Ras/Raf/ERK. As
ciclinas do D so continuamente sintetizadas enquanto existirem factores de
crescimento no meio, no entanto elas degradam-se com facilidade, e na
ausncia de factores de crescimento o seus nveis descem rapidamente.
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A protena Rb actua como um supressor de tumores, pois o complexo

Rb/E2F suprime a transciro do gene que regula E2F. A fosforilao de Rb
pelo complexo Cdk4/Ciclina D resulta numa dissociao de E2F, que activa a
transcrio dos seus genes-alvo (um deles o da ciclina E).
Inibidores do Curso do Ciclo Celular

Agentes que danificam o DNA resultam num bloqueio do ciclo celular,
permitindo assim clula reparar os danos que surgiram. Um bom exemplo
deste processo o bloqueio do progresso do ciclo celular por inibio dos Cdk,
o que mediado pelo p53.
O p53 vai regular a transcrio, estimulando a expresso de p21, que
um inibidor de Cdk. Na presena de p21 muitos dos complexos Cdk/Ciclina no
se conseguem formar, logo existe um bloqueio no ciclo celular.
O p53 alm de bloquear o ciclo celular induz ainda a apoptose,
activando a via das caspases, pois uma forma de assegurar que as mutaes
ou possveis oncogenes no sero transmitidos s clulas descendentes.
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Correlaes
Clnicas
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ndice
ndice ............................................................................................................................. 89
Vrus e Cancro .............................................................................................................. 90
Fenilcetonria ............................................................................................................... 91
HIV e SIDA ..................................................................................................................... 92
Terapia Gnica para a Deficiencia de Adenosina Desaminase ............................... 93
Cancro do Clon e Reparao do DNA ...................................................................... 94
Factor de Transcrio Pit-1 e a Deficincia da Hormona do Cresc. ....................... 95
Antibiotico e Sntese Proteica ..................................................................................... 96
Doena de Gaucher ...................................................................................................... 97
Doenas das Mitocndrias: Neurapatias pticas Heredittia de Leber ................. 98
Distrofia Muscular e Citoesqueleto ............................................................................ 99
Fibrose Cistica ............................................................................................................ 100
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Vrus e Cancro
A Doena
O cancro um grupo de doenas caracterizado pela proliferao
incontrolada de clulas. Em contraste com um crescimento regulado normal, no
cancro as clulas crescem de forma no-regulada, acabando por invadir e
interferir com a funo de tecidos e rgos normais.
O cancro uma das maiores causas de morte nos nossos dias, e por
isso alvo de estudos por parte da Biologia Molecular.
Bases Celulares e Moleculares

Sabe-se que o cancro resulta de mutaes nos genes que normalmente
controlam a proliferao celular, podendo estas inibir mecanismos de controlo
ou estimular a diviso celular, actividando factores envolvidos na regulao do
ciclo celular.
O estudo de vrus que provocam cancro, como o caso do RSV,
permitiram concluir que o cancro uma doena gentica, no entanto ela no
resulta da alterao de um nico gene.
Era pois muito mais fcil estudar o genoma do vrus, do que o de
animais, levando identificao de um gene causador de cancro, um
oncogene.
Encontram-se nas nossas clulas genes semelhantes a este encontrado
no RSV, estes quando vtimas de alteraes, originam ento um oncogene.
Que pode causar o cancro, no ento so necessrias mais alteraes do que
apenas a formao de um nico oncogene.
Preveno e Tratamento
Os cancro humanos que so causados por vrus incluem o cervical e
outros cancros anogenitais, como exemplo o papilomavrus e os vrus da
Hepatite B e C.
Este cancros podem ser prevenidos atravs de uma vacina contra o
vrus responsvel, como o caso da vacina eficaz contra o vrus da Hepatite B.
A maior parte das mutaes que causam cancro so adquiridas durante
a nossa vida e no herdadas.
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Fenilcetonria
A Doena
A fenilcetonria, ou PKU, um erro inato do metabolismo dos
aminocidos com efeitos devastadores. Se no for tratada resulta em um grave
atraso mental, no entanto j possvel o seu diagnstico precoce e o seu
tratamento.

A fenilcetonria causada por uma defeciencia na enzima fenilalanina
hidroxilase que converte fenilalanina em tirosina. Esta deficincia leva ao
acumular de elevados nveis de fenilalanina, que passa por outras reaces
como a converso para fenilpiruvato. Estes produtos txicos para o organismos
so excretados pela urina, devido sua elevada concentrao no sangue.
Embora a causa bioqumica seja desconhecida, o retardo mental causado por
um acumular anormal deste metabolitos anormais de fenilalanina.
A deficincia da enzima no causa nenhum problema enquanto o feto
est dentro do tero, de modo que crianas com fenilcetonria so normais ao
nascimento. Se no tratadas tornam-se gravemente e permanentemente
afectados antes de completarem um ano de vida. Felizmente o diagnostico
pode ser feito por testes de rotina, conhecido por teste do pezinho, no entanto
um diagnostico mais especifico deve ser feito atravs de testes genticos, para
verificar de outras enzimas foram afectadas igualmente.
O tratamento desta doena baseia-se numa alimentao controlada,
com baixa ingesto de fenilalanina, o que permite manter, os nveis desta,
aceitveis, abaixo do limite txico.
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HIV e SIDA
A Doena
A Sindrome da Imunodeficincia Adquirida (SIDA) uma doena
recente, descrita pela primeira vez em 1981. No entanto rapidamente se tornou
numa pandemia mundial, que j provocou vrios milhes de mortes.
As manifestaes clnicas da SIDA resultam, principalmente, da falha do
sistema imune, o que torna o paciente vulnervel a infeces oportunista, que
de outro modo seria facilmente resistente. Existe ainda uma grande incidncia
de cancro nestes pacientes, no entanto a grande causa de morta so as
infeces oportunistas.

A SIDA causada por um retrovrus, o HIV, que infecta
preferencialmente os linfcitos CD4, que necessrio para uma resposta
imune normal. Contrariamente a muitos outros retrovrus, o HIV, no induz as
clulas a tornarem-se cancerosas. Ele destri as clulas que infecta, o que leva
a um reduo drstica do linfcitos CD4 e uma deficiente resposta do sistema
imune, o que permite s infeces oportunistas alojarem-se.
At ao presente a nica forma de prevenir a SIDA evitando a
contaminao pelo HIV. O HIV um vrus que no exterior se perde
rapidamente. O HIV pode ser transmitido por contacto sexual, atravs de
contacto com produtos contaminados com sangues e de me para filho durante
a gravidez ou no aleitamento.
Quanto ao seu tratamento, este pouco eficaz, no entanto actualmente
j possivel prolongar a vida dos pacientes infectados com a combinao de
diversos frmacos. Um dos mais utilizados o AZT, que consiste num
nucleotdeo modificado que no possui na extremidade 5 o grupo OH de modo
a permitir a ligao ao nucleotdeo seguinte, inibindo assim a transcrio do
DNA viral.
92
2007/2008
Terapia Gnica para a Deficiencia

de Adenosina Desaminase
A Doena
A deficincia de adenosina desminase uma das causas de
imunodeficincia grave combinada (SCID), um grupo de doenas hereditrias
nas quais os linfcitos falham ao desenvolver-se. Os indivduos doentes tm
todas as suas funes imunes deficientes, logo defesas quase ausentes.
Devido s inmeras infeces que afectam estes indivduos, as crianas, a
menos que tratadas, no ultrapassam os 2 anos de idade.

Cerca de 20% dos casos de SCID ocorrem por deficincia gentica na
enzima adenosina desaminase, a qual catalisa a desaminao da adenosina e
da desoxiadenosina. Esta deficincia na enzima leva a uma acumulao de
dATP, que em altas concentraes prejudicial para clulas em proliferao,
pois o dATP inibe a ribonucleotdeo redutase, necessria para a sntese dos
desoxirribonucleotdeos trifosfatados. Logo uma elavada concentrao de
dATP inibe a transcrio. Este deficincia afecta mais severamente os linfcitos
pois estes no possuem outras enzimas que degradam o dAMP e evitam desta
forma o acumular de dATP.
Mais concretamente a deficincia de adenosina desaminase intrefere
com a replicao do DNA dos linfcitos, evitando que estes se dividam.
Algumas crianas com deficincia na enzima adenosina transaminase
podem ser curadas pelo transplante de medula ssea. Em outros casos esta
doena por ser tratada pela terapia de reposio enzimtica, na qual a
adenosina transaminase funcional administrada por injeco endovenosa.
Embora este procedimento seja benfico e atenue a patologia, ele no cura a
doena.
Foi ento criada a primeira tentativa clnica de terapia gnica no
tratamento de duas crianas com esta doena. Foram obtidos linfcitos destas
crianas e estimulados a proliferarem; um cDNA de adenosina desaminase
funcional clonado num vector retroviral foi introduzido nesses linfcitos, os
quais, retornaram aos pacientes. Estes tratamentos foram repetidos 11 a 12
vezes num perodo de 2 anos, e verificou-se que o vector era mantido aps o
tratamento e um dos pacientes produziu cerca de 25% do nvel normal de
adenosina transaminase.
Estes resultados so sustento para o sucesso da terapia gnica como
tratamento neste tipo de doenas.
93
2007/2008
Cancro do Clon e Reparao do

DNA
A Doena
Os cancros do clon e recto so um dos tipos de cancro mais comuns
em pases ocidentais, a maioria deles no so hereditrios. No entanto existem
j duas formas de cancro do clon que foram descritas, e so hereditrias. Em
ambos os casos ele resulta do facto de herdar um gene de susceptibilidade ao
cancro, que determina uma elevada probabilidade de contrair cancro. A mais
comum o Cancro do Clon Hereditrio sem Polipose (HNPCC).
A presena destes genes de susceptibilidade ao cancro aumentam
igualmente, mas de forma menos significativa, a probabilidade de contrair
outros cancros.

Assim como outros cancros, o cancro do clon, resulta de mutaes em
genes que regulam a proliferao celular e provocando um crescimento
descontrolado dessas clulas. Esporadicamente estas mutaes ocorrem em
clulas somticas, no entanto, como era de esperar, em cancro hereditrios
elas ocorrem em clulas da linha germinativa.
Foi descoberto que cerca de 50% dos casos de HNPCC resulta de
mutaes num gene que codifica uma enzima responsvel pela correco do
malpareamente de bases durante a transcrio. Este gene em questo
homlogo do MutS da E.Coli, e existem ainda outros que so homlogos do
MutL, estando igualmente ligados reparao do DNA.
Leses nos genes responsveis pela reparao do DNA vo influenciar
o aparecimento de outras mutaes em genes diferentes, e que provavelmete
iro alterar a proliferao celular, podendo dar origem a cancro.
A identificao dos genes responsveis pelo HNPCC permite, atravs de
testes genticos, identificar os indivduos com alto risco. Esta identificao
pode ainda ser til na preveno da doenas em indivduos com maior
predisposio ou para o diagnostico pr-natal, para casais portadores que
pretendam ter filhos.
importante um diagnostico precoce, pois com o avanar do cancro as
hipteses de sobrevivncia diminuem. No entanto existem frmacos que esto
a ser testados, e que podero inibir o desenvolvimento destes cancros.
94
2007/2008
Factor de Transcrio Pit-1 e a

Deficincia
da
Hormona
do
Crescimento
A Doena
A hormona do crescimento uma protena produzida pela glndula
pituitria que necessria para um crescimento e desenvolvimento normal.
Com uma deficiente produo desta hormona as crianas ficam com uma
baixa-estatura. Esta deficincia muitas vezes originada por uma mutao que
afecta a produo desta hormona, e geralmente de outras do mesmo grupo.

As deficientes humanas combinadas de hormonas pituitrias lembram
fentipos de indivduos anes, que no possuem o tipo de clulas responsveis
pela secreo da hormona do crescimento. No entanto foi descoberto que as
deficincias humanas combinadas de hormonas pituitrias resultam de uma
mutao de um gene responsvel por um factor de transcrio, o Pt-1. Aps
novas experiencias verificou-se que este factor no afecta apenas a transcrio
da hormona de crescimento, mas sim de todas as hormonas pituitrias.
Crianas com deficincia em hormonas de crescimentos podem ser
eficazmente tratadas por injeces desta hormona. At muito recentemente
esta hormona apenas era possvel de obter de crebros humanos, no entanto a
partir de 1979 foi possvel expressar com sucesso na E.Coli esta hormona de
crescimento, passando ser usado para fins clnicos a partir de 1985.
Quando esta deficincia em hormonas de crescimento de origem
gentica, importante a existncia de testes genticos para um diagnstico
mais correcto.
95
2007/2008
Antibiticos e Sntese Proteica

A Doena
As bactrias so responsveis por uma ampla variedade de doenas
infecciosas potencialmente letais. At 1940 os mdicos no tinham
medicamentos para combater estas infeces, at ao aparecimento dos
antibiticos, que tornaram curveis muitas doenas at ai letais.

Para ser efectivo clinicamente um antibitico deve matar ou inibir o
crescimento de bactrias sem ser txico para humanos. Ento assim sendo, os
alvos dos antibiticos esto apenas presentes nas bactrias, e no nas clulas
humanas. Por exemplo, a penicilina, inibe a sntese da parede celular
bacteriana. Muitos outros antibiticos inibem outros passos na sntese proteica,
sendo especficos para os ribossomas.
O uso de medicamentos teve um grande impacto na medicina moderna
por permitir curar infeces, que de outra maneira levariam um individuo
morte. No entanto mutaes no genoma bacteriano podem levar a uma
multiresistencia das bactrias aos antibiticos.
Esta situao preocupante pois surgem muitas vezes em hospitais
bactrias deste tipo e que levam os mdicos a no encontrar uma maneira
rpida e eficaz de controlar as infeces por elas causadas.
96
2007/2008
Doena de Gaucher
A Doena
A doena de Gaucher a mais comum das doenas de armazenamento
dos lisossomas, que so causadas por uma falha dos lisossomas em degradar
substancias que eles normalmente degradam. A acumulao de compostos
leva a uma aumento do tamanho e nmero de lisossomas dentro da clula,
resultanto falncia das clulas onde isto acontece.
Existem trs tipos da doena que diferem na gravidade e no
envolvimento do sistema nervoso. A forma mais comum (tipo I), o sistema
nervoso no est envolvido; a doena aparece com o aumento do bao e do
fgado e o desenvolvimento de leses sseas. As formas mais graves da
doena (tipo II e III) so mais raras, sendo a mais devastadora a do tipo II,
onde o envolvimento neurolgico detectado logo na infncia e os indivduos
morrem precocemente. A doena do tipo III intermediria e caracterizada
pelos sintomas neurolgicos por volta dos 10 anos.

A doena de Gaucher causada pela deficincia da enzima lisossomal
glicocerebrosidade que catalisa a hidrlise de glicocerebrosdeo para glicose e
ceramida. Foram identificadas mais de 30 mutaes responsveis por esta
patologia, sendo que a gravidade da doena por ser determinada pela natureza
dessas mutaes.
A doena do tipo II e III pode ter origem na substituio de uma prolina
por uma leucina.
Excepto os tipos II e III, a doena de Gaucher apenas detectado nos
macrofagos, pois estes so responsveis pela hidrlise de muitos
componentes, levando assim a uma grande acumulao de compostos.
Esta patologia pode ser tratada pela terapia de reposio enzimtica, na
qual a administrao exgena da enzima utilizada para corrigir o defeito
enzimtico. Atravs de diversas experincias descobriu-se que os macrfagos
expressam receptores na superfcie celular que ligam resduos de manose em
glicoprotenas extracelulares e depois internalizam estas protenas. assim
possvel dirigir especificamente a glicocerebrosidade para os macrfagos
atravs de modificaes que expusessem os resduos de manose.
97
2007/2008
Doenas
das
Mitocndrias:
Neurapatias pticas Heredittia de
Leber
A Doena
um doena hereditria que causa a cegueira devido degenerao do
nervo ptico. A perda de viso ocorre entre os 15 e os 35 anos, sendo
geralmente o ncio sintoma da doena.
As mulheres so menos afectadas, o que nos poderia sugerir que uma
doena ligada ao sexo, no entanto neste caso os homens nunca transmite a
doena. A doena apenas transmitida por via materna, o que nos leva a
concluir que uma doena de herena citoplasmtica, visto que o citiplasma
resulta quase na sua totalidade do ocito.

Foi identificada nos pacientes com LHON uma mutao no seu DNA
mitocndrial que afecta uma das subunidades do complexo I da cadeia
transportadora de electres. Foram diagnosticadas outras mutaes nos
pacientes com esta doena, no entanto todas elas reduzem a capacidade
mitocndrial de realizar fosforilao oxidativa. Os efeitos desta falncia so
sentidos nos tecidos mais dependentes de fosforilao oxidativa, como o
caso do sistema nervoso, como o caso do nervo ptico.
Esta doena est associada s mitocndrias, o que nos faz ter que
mudar um pouco os parmetros de intrepertao. Nas nossas clulas
possumos diversas mitocndrias com genomas diferentes, por isso possvel
que tenhamos a mutao, mas sendo o nmero de mitocndrias mutadas
diminuto, a doena no se manifesta.
A identificao das mutaes no DNA mitocndrial pode ser decisiva
para o diagnostico precoce de pacientes com historial familiar de LHON. No
entanto a identificao da mutao no genoma mitocndrial pouco
conclusiva, pois no possvel determinar com certeza de o individuo sofre ou
no da patologia, o que contraste com a identificao de mutaes no DNA
nuclear.
Uma das terapias consiste na terapia metablica, ou seja, administrar
substratos ou cofactores da via de fosforilao oxidativa; outra das hipteses
seria a terapia gnica, introduzindo um gene saudvel para a protena em falta
no DNA nuclear, com a particularidade que essa protena possuiria um sinal
que a levaria at mitocndria.
98
2007/2008
Distrofia Muscular e Citoesqueleto

A Doena
As distrofias musculares so um grupo de doenas hereditrias
caracterizadas por uma perda progressiva de clulas musculares. A distrofia
muscular de Duchene (DMD) a mais frequente e grave.
Os sintomas aparecem por volta dos 3 a 5 anos, por volta dos 12 anos
so confinados a uma cadeira de rodas e poucos so os que ultrapassam a
idade adulta dos 20 anos, acabam por morrer com falncia respiratria.

Existe uma maior incidncia em indivduos do sexo masculino, o que nos
indica que se trata de uma doena ligada aos cromossomas sexuais; este facto
foi confirmado por testes genticos que indicaram que o gene responsvel pela
DMD se encontra no cromossoma X.
O gene mutado condifica uma protena denominada de distrofina, esta
encontra-se ligada membrana das clulas musculares, o que lhes permite
resistir ao stress da contraco muscular.
Existem mutaes que levam a uma ausncia completa na expressam
de distrofina, e outras a uma protena mutada, este factor vai condicionar a
gravidade da doena.
A identificao do gene DMD possibilitou o desenvolvimento de testes
diagnsticos sensveis. Mulheres portadoras do alelo mutante para este gene
podem ser identificadas, e as suas geraes monotorizadas a fim de preceber
de houve transmio do alelo mutado.
assim possvel identificar em embries in vitro a presena desta
mutao, antes que estes sejam implantados no tero da me. A combinao
do aconselhamento gentico e o diagnostico pr-natal representa uma medida
potencial de preveno de DMD hereditria.
Infelizmente a eficincia destes procedimentos limitada pelo facto de
que aproximadamente um tero dos doentes de DMD no so hereditrios.
assim necessrio desenvolver terapias para os doentes que se encontram
nestes casos, e para os restantes que sofrem de DMD hereditria; actualmente
existe o esforo para desenvolver uma terapia gentica para restabelecer a
produo de distrofina no musculo.
99
2007/2008
Fibrose Cstica
A Doena
A fibrose cistca uma doena gentica recessiva que afecta crianas e
adultos jovens. a doena hereditria mais comum em brancos, que
caracterizada pela produo de um fino muco por vrios tipos de clulas
epiteliais, incluindo as que envolvem as vias respiratrias e gastrintestinal.
Os primeiros sintomas consistem numa obstruo das vias areas
superiores por acumulao de muco e uma consequente infeco bacteriana.
As glndulas sudorparas apresentam-se igualmente alteradas, sendo
caracterstico uma presena excessiva de sal no suor.
Os procedimentos para esta doena incluem terapia fsica para
promover drenagem bronquial, administrao de antibiticos e reposio de
enzimas pancreticas.

A caracterstica marcante da fibrose cstica um defeito no transporte de
Cl nos epitlios afectados. A sequncia que codifica uma protena da famila
dos transportadores ABC est mutada, denominada CFTR.
Vrios estudos demonstram que a CFTR funciona como um canal de Cle que as mutaes responsveis pelo estabelecimento da fibrose cstica
resultam directamente no transporte deficitrio de Cl-.
-
O isolamento do gene da fibrose cstica possibilitou identificar os
indivduos portadores do alelo mutado; o que juntamente com a compreenso
do funcionamento da CFTR como canal de Cl- tem sugerido novas abordagens
para o tratamento. Uma das possibilidades a utilizao de drogas que
estimulem a abertura dos canais de Cl-; outras das alternativas a terapia
gnica com a reposio do gene da CFTR nas clulas afectadas.
100
2007/2008

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