AULA 1 - Teste de Viabilidade Celular Ensaio de MTT

Nesta aula determinou-se a viabilidade de clulas derivadas de um teratocarcinoma

humano (NT2), que crescem continuamente (tumorais) em monocamada in vitro, aps
exposio a paclitaxel (estabilizador dos microtbulos, utilizado na prtica clnica como
droga anti-tumoral) e colchicina (destabilizador dos microtbulos).
O ensaio de MTT baseia-se na reduo celular de MTT [3-(4,5-dimethylthiazol, 2-yl)2,5-diphenyl-212 tetrazolium bromide] de acordo com (Mosman, 1983). A
quantificao da reduo de MTT constitui um mtodo colorimtrico simples para
avaliar a viabilidade celular. Aps reduo, o MTT forma cristais de formazan, de cor
azul, que ao serem dissolvidos absorvem na regio do visvel, podendo desta forma ser
quantificados por espectrofotometria. A reduo do MTT feita atravs de
desidrogenases celulares, portanto pode-se avaliar a capacidade redutora da clula
atravs deste mtodo.
Neste ensaio, os sobrenadantes das culturas celulares, contendo ou no os agentes
testados, so removidos e as clulas so mantidas numa soluo de MTT (5 mg/ml) em
Meio de Krebs, durante 20 min, a 37C, no escuro.
Aps esta incubao, os cristais de formazan, resultantes da reduo do MTT, so
dissolvidos numa soluo de HCL 0,04 N em isopropanol e o valor de absorvncia
medido a um comprimento de onda de 570 nm.
Os valores de viabilidade celular correspondente a cada condio so expressos em
percentagem relativamente absorvncia determinada nas clulas controlo.

PROTOCOLO Ensaio de MTT

1. Solues
- Meio salino de Krebs (em mM): 132 NaCl, 4 KCl, 1,2 Na2HPO4, 1,4 MgCl2, 6
glicose, 10 Hepes, 1 CaCl2, pH 7,4
- MTT: 0,5 mg/ml em meio salino de Krebs (proteger da luz)
- Isopropanol-cido: 0.04 M HCl em isopropanol (3,3 ml HCl fumante a 37% em 1L
de isopropanol)

2. Procedimento
- Terminada a incubao das clulas, aspirar o meio de incubao e lavar uma vez com
0,5 ml de meio salino de Krebs (no banho a 37C), adicionar 0,5 ml de soluo de MTT
e incubar a 37 C durante 30 minutos, no escuro.
- Aps este tempo de incubao adicionar a cada well 1 ml de isopropanol-cido para
dissolver os cristais de "formazan" formados aps reduo do sal de MTT.
- Colocar cada amostra numa cuvete de 1,5 ml e ler a absorvncia a 570 nm no
espectrofotmetro, usando como branco uma soluo preparada com 0,5 ml de MTT
(0,5 mg/ml) e 1 ml de isopropanol-cido.

Referncias:
Mosmann, Tim (1983). "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays". Journal Of Immunological
Methods 65 (12): 5563.

Cory AH, Owen TC, Barltrop JA, Cory JG (1991). "Use of an aqueous soluble
tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture". Cancer communications
3 (7): 207212..