MANUTENO DE MICRORGANISMOS: CONSERVAO E VIABILIDADE

Marlia Cristina Sola1*; Aline Pedrosa de Oliveira1; Janaina Costa Feistel2; Cntia
Silva Minafra e Rezende3
1

Doutoranda, Programa de Ps-graduao em Cincia Animal, Escola de Veterinria

e Zootecnia, Universidade Federal de Gois - UFG, Goinia, Gois, Brasil
2
Mestranda, Programa de Ps-graduao em Cincia Animal, Escola de Veterinria
e Zootecnia, Universidade Federal de Gois - UFG, Goinia, Gois, Brasil
3
Docente, Doutora, UFG, Escola de Veterinria e Zootecnia, Departamento de
Medicina Veterinria, Universidade Federal de Gois - UFG, Goinia, Gois, Brasil
*Endereo para correspondncia: mcslilla@yahoo.com.br
Recebido em: 04/05/2012 Aprovado em: 15/06/2012 Publicado em: 30/06/2012

RESUMO
Diante da necessidade de desenvolvimento biotecnolgico e cientfico, a
preservao e a manuteno de materiais biolgicos vm ganhando destaque no
cenrio mundial. A garantia de sobrevivncia de culturas bem como a conservao
de suas caractersticas morfolgicas, fisiolgicas e genticas so primordiais na
adequao de mtodos de preservao de clulas humanas, animais e vegetais,
bactrias, vrus, fungos e material gentico (DNA/RNA), porm no existe uma
frmula ideal ou universal para essa conservao. Desta forma a escolha de um
mtodo de manuteno deve ser baseada nas caractersticas do material biolgico
em estudo, assim como nas vantagens e desvantagens de cada tcnica disponvel.
Neste contexto, a preservao ex situ em colees de culturas vem garantindo a
sobrevivncia, a estabilidade e pureza de linhagens durante longos perodos,
empregando diversos mtodos de manuteno e principalmente disponibilizando as
culturas para a comunidade cientfica e tecnolgica de diversos pases.
PALAVRAS-CHAVE: Colees de culturas; Conservao ex situ; Mtodos de
preservao.
MAINTENANCE OF MICROORGANISMS: STORAGE AND VIABILITY
ABSTRACT
The necessity of scientific and biotechnological development, preservation and
maintenance of biological materials have been gaining prominence on the world
stage. Ensuring the survival of cultures and the preservation of their morphological,
physiological and genetic characteristics are paramount in the adequacy of methods
of preservation of human cells, animals and plants, bacteria, viruses, fungi and
genetic material (DNA/RNA), but there is not a formula for that ideal or universal
preservation. Thus, the choice of a maintenance method should be based on
characteristics of the biological material under study, as well as the advantages and
disadvantages of each available technique. In this context, the ex situ preservation of
collections of cultures has ensured the survival, stability and purity of lines for long

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periods, employing different methods of maintenance and cultures primarily available

for scientific and technological communities of several countries.
KEYWORDS: Collections of cultures; Ex situ conservation; Methods of preservation.
1 INTRODUO
A natureza impe em seu curso normal que materiais biolgicos sigam o ciclo
de degenerao e morte, desta forma, algumas caractersticas podem se alterar e se
perder, com o passar do tempo. A inteno de interromper ou pelo menos retardar o
relgio biolgico de organismos tem sido alvo desde os tempos mais remotos, tendo
alcanado hoje, um potencial significativo de estocagem de amostras biolgicas a
curto, mdio e longo-prazo.
Nesse sentido, o incremento de protocolos mais eficientes de conservao de
microrganismos poder assegurar, de certa forma, a continuidade e expanso de
pesquisas nesta rea. Tal ao permite o desenvolvimento de estudos capazes de
superar barreiras cronolgicas e geogrficas e, por conseguinte, elucidar as
particularidades dos diferentes organismos.
A compreenso do papel de microrganismos no meio ambiente fornece
subsdios para o desenvolvimento de aplicaes biotecnolgicas, alm de ser
fundamental no estabelecimento de polticas de biossegurana, visto o carter
patognico de muitos agentes.
A importncia da manuteno e principalmente preservao de
microrganismos caracteriza-se como reflexo da necessidade de utilizao de
organismos ou espcimes a qualquer momento, quer para fins experimentais,
didticos, industriais ou estudos comparativos. Desta forma, conhecer a melhor
maneira de preservar culturas bacterianas e dispor de tcnicas simples e eficientes,
reveste-se de grande valia aos laboratrios de microbiologia.
Para tanto, a sobrevivncia do agente no se constitui o nico objetivo. Tornase necessrio considerar a viabilidade e principalmente a escolha de mtodos que
no promovam em maior ou menor grau a ocorrncia de mutaes ou variabilidades.
Isto posto, com reflexo na patogenicidade, virulncia ou em caractersticas bsicas
da cultura original, atentando-se para a conservao de microrganismos.
No que tange estocagem, conservao e manuteno de amostras
independentes da origem o que inclui clulas humanas, animais e vegetais,
bactrias, vrus, fungos e material gentico (DNA/RNA), h o propsito de
diagnstico e pesquisa, ampliando a aplicao laboratorial. Por consequncia, no
se aplica para a conservao de amostras biolgicas uma frmula singular, ideal ou
universal que determine a eficincia de sua estocagem e preservao por longos
perodos (COSTA et al., 2009).
A escolha do mtodo de manuteno mais adequado deve ser baseada pelas
caractersticas do agente em estudo, assim como pelas vantagens e desvantagens
de cada tcnica disponvel. Para o estudo com clulas, tecidos e microrganismos, h
o anseio pelo desenvolvimento de metodologias mais adequadas sua
conservao, porm, observa-se uma lacuna entre as publicaes cientficas
pertinentes, verificando-se um nmero reduzido de estudos abordando a
problemtica da seleo e validao de protocolos principalmente na manuteno
de bactrias, bem como na avaliao dos desafios e perspectivas da colheita,
processamento, estocagem e manuteno de amostras microbiolgicas.
Diante disso, prope-se com esta reviso, a exposio dos princpios que
norteiam o processo de estocagem e manuteno de material microbiolgico,
tomando como base estudos disponveis na literatura cientfica.
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2 REVISO DE LITERATURA
Os processos de isolamento, identificao, conservao e a utilizao de
microrganismos vem sendo considerados como rotina para o desenvolvimento de
pesquisas e obteno de produtos de interesse econmico (ABREU & TUTUNJI,
2004).
No mbito da cincia, a implantao e manuteno de colees de culturas
permitem a formao de estoques de cepas que podem ser utilizadas
experimentalmente em diferentes momentos (GIRO et al., 2004).
De acordo com OPLUSTIL (2004), estudos com finalidade clnica,
epidemiolgica ou cientfica necessitam a qualquer tempo de cepas de
microrganismos para exames complementares e essa demanda faz com que exista
a necessidade de se manter a viabilidade dos mesmos por perodos variveis.
O alvo de qualquer mtodo de manuteno preservar a viabilidade e
principalmente proporcionar estabilidade gentica do microrganismo ao isolamento,
pelo maior tempo possvel, evitando assim a formao excessiva de mutaes que
alterem suas caractersticas. Alm disso, procura-se adequar a escolha de uma
tcnica de conservao baseando-se nas particularidades do agente, nas
caractersticas do prprio mtodo a ser aplicado, nos custos de manuteno da
tcnica, da importncia do acervo e principalmente na capacidade laboratorial e
disponibilidade de equipamentos (ABREU & TUTUNJI, 2004; GIRO et al., 2004).
Considerando as exigncias dos microrganismos e o manuseio em
laboratrios, a manuteno de estirpes podem ocorrer em curtos perodos (dias ou
meses), onde as culturas bacterianas podem ser mantidas a temperaturas
relativamente baixas (4-10C). Contudo, se a conser vao prolongada apresenta-se
como opo mais vivel, deve-se optar pelo armazenamento em temperaturas ultra
baixas como a criopreservao em freezers a -80C, em nitrognio lquido a -196C
ou o processo de liofilizao que consiste no congelamento e desidratao das
clulas bacterianas, em atmosfera de vcuo (COSTA & FERREIRA, 1991; CEFAR,
2006; COSTA et al., 2009).
Diante da necessidade de preservao de microrganismos, muitas vezes,
busca-se conservar um agente que foi selecionado e melhorado com intuito de
manter sua nova identidade. Ainda assim, o objetivo da manuteno de um
microrganismo no somente conservar seu estado inicial evitando mutaes
indesejveis, mas tambm garantir ao mximo a vitalidade das clulas e a
quantidade de clulas viveis (PAOLI, 2005; OKAFOR, 2007).
Segundo COSTA & FERREIRA (1991), os mtodos de manuteno de
microrganismos podem ser classificados de acordo com tempo mximo de
preservao:
Mtodos de curto prazo: repique contnuo;
Mtodos de mdio prazo: preservao em leo mineral, preservao em gua
esterilizada, congelamento a -20C;
Mtodos de longo prazo: liofilizao, criopreservao.
Todos estes mtodos permitem a elaborao de estudos retrospectivos e
prospectivos, elucidando o estado biolgico, etiologia e aspectos epidemiolgicos.
Entretanto, a escolha adequada de procedimentos de preservao, incluindo a
aplicao de um ou a combinao de mais mtodos, permite uma anlise fenotpica
e genotpica mais satisfatria, quando se pensa na conservao de microrganismos
a longo prazo (GIRO et al., 2004).

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Diversos protocolos de estocagem tm sido desenvolvidos e aplicados,

porm, a maioria no tem se mostrado plenamente eficaz, visto as peculiaridades de
cada agente a ser conservado e at mesmo pelas caractersticas das tcnicas, por
isso, vem se justificando a conjuno de dois ou mais protocolos a fim de se garantir
a melhor recuperao dos microrganismos (GREEN, 2008; COSTA et al., 2009).
As descries de BOZIARIS & ADAMS (2001) e VIEIRA et al. (2007),
revelaram que as bactrias, em especfico, na tentativa de sobrevivncia mediante a
utilizao de mtodos de conservao nos alimentos, so capazes de produzir
mecanismos de respostas, como protenas especializadas para resistncia trmica
(heat-proteins), mudanas estruturais da membrana com alterao na saturao de
cidos graxos visando proteo contra baixas temperaturas e reparo de material
gentico, demonstrando a capacidade de recuperao de clulas injuriadas, quando
em ambiente favorvel, aps um curto perodo de tempo.
Considerando o emprego de mtodos de conservao sobre alimentos, os
microrganismos podem estar presentes em uma amostra sob trs estados:
inviabilizados (apresentando injria letal e impossibilidade de multiplicao), com
injria subletal (apesar de ter sofrido danos em suas estruturas celulares, encontrase hbil para multiplicao sob condies favorveis) e viveis (COSTA &
FERREIRA, 1991; BAATI et al., 2000; VIEIRA et al., 2007). Desta forma, a
capacidade de recuperao de microrganismos viveis norteia a eleio do mtodo
de manuteno.
2.1 MTODO DE MANUTENO A CURTO PRAZO
2.1.1 Repicagem contnua ou peridica
A tcnica de repique contnuo, tambm chamado de subcultivo ou repicagem
peridica, um mtodo simples e tradicional de manuteno de culturas em
laboratrio. Por ser uma das mais antigas tcnicas de conservao, tem sido
bastante utilizada para se obter a viabilidade de microrganismos, principalmente de
bactrias (COSTA & FERREIRA, 1991; ROMEIRO, 2006).
O mtodo consiste na inoculao do microrganismo em meio adequado,
incubao em ambiente favorvel multiplicao e estocagem em baixas
temperaturas, aps sua multiplicao. Nesta situao, aconselhvel o
armazenamento de culturas sob refrigerao (5 a 8C ), em busca da reduo do
metabolismo dos microrganismos e o aumento entre os intervalos de repiques das
culturas, proporcionando a conservao de leveduras em mdia de um a trs meses
e de bactrias em torno de cinco a doze meses (COSTA & FERREIRA, 1991;
GREEN, 2008).
Apesar de alguns autores preconizarem o armazenamento das culturas sob
refrigerao, COSTA & FERREIRA (1991) relataram a possibilidade de incubao
em temperatura ambiente, alertando a necessidade de monitorao, a fim de evitar
a desidratao do meio de cultura e a consequente privao de elementos
essenciais aos microrganismos.
BARKER (2002) e ROMEIRO (2006) mencionaram que a repetio do
processo para novos meios deve ser realizada em intervalos de tempo condizentes
com as necessidades e particularidades de cada microrganismo, avaliando-se as
condies timas e perodo mximo de sobrevivncia entre as diferentes cepas.
Entretanto, aconselhvel que a transferncia de culturas seja realizada antes que
o substrato do meio seja totalmente utilizado pelos microrganismos, ou ento se
desidrate. PASSADOR et al. (2010) sugerem que os mtodos de repicagens
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peridicas para fungos devem ser realizados em intervalos de trs ou quatro meses,
a fim de evitar o consumo total do substrato do meio de cultura e se evite o acmulo
excessivo de metablitos fngicos, j que estes se comportam como agentes
mutagnicos.
MURRAY (2003) sugeriu que para minimizar o efeito da desidratao, os
isolados devem ser conservados em tubos de ensaio com tampa rosquevel ou
selados com parafina, em ambientes protegidos da luz e de variaes de
temperatura, mantendo preferencialmente uma faixa entre 5 e 8C.
COSTA & FERREIRA (1991) descreveram que este mtodo clssico,
apresenta como vantagens a facilidade e o baixo custo, por no provocar estresse
ou injria celular e no necessitar de reativao dos microrganismos. Entretanto,
apresenta maior risco de contaminao em decorrncia da constante manipulao
das culturas devido aos repiques contnuos e peridicos; perdas de caractersticas
genticas decorrentes de mutaes; necessidade de maior espao fsico para
armazenamento das culturas; logstica inconveniente quanto postagem;
variabilidade entre as cepas e consequentemente entre os intervalos de repiques
para cada microrganismo armazenado (ROMEIRO, 2006).
A idade das culturas e, principalmente, a frequncia de repicagens devem ser
avaliadas para o emprego deste mtodo de manuteno, pois, as culturas mais
velhas acabam por gerar culturas-filhas modificadas, levando-se em considerao a
ocorrncia de alteraes tanto de carter morfolgico quanto fisiolgico. Ainda
assim, apesar do risco de comprometimento da estabilidade gentica, a manuteno
por repicagens peridicas traz consigo outro problema considervel, como a perda
da patogenicidade ou virulncia de algumas bactrias, da a necessidade de
verificao peridica das caractersticas de cada isolado (COSTA & FERREIRA,
1991; ROMEIRO, 2006).
COSTA et al. (2009) descreveram que a composio do meio de cultura pode
interferir na resistncia das clulas, no entanto, existem dois conceitos que se
opem sobre qual a composio ideal de meio de cultivo na manuteno de
microrganismos: meios com boa composio de nutrientes ou meios menos
elaborados, do ponto de vista nutricional.
Considerando a manuteno de bolores e leveduras, os meios devem conter
baixa concentrao de acares fermentadores para evitar o crescimento micelial
exagerado e prevenir alteraes. Neste caso, procura-se utilizar meios que
propiciem o mnimo de crescimento micelial acompanhado do mximo
desenvolvimento das frutificaes ou estruturas de propagao e resistncia.
Quanto manuteno de fungos esporulantes, preconiza-se a utilizao de esporos
e no de miclios durante a repicagem, visto que os esporos tendem a manter as
caractersticas genticas originais durante o processo de estocagem (PIMENTEL &
FIGUEIREDO, 1989; PEREIRA et al., 2008; PASSADOR et al., 2010).
2.2 MTODOS DE MANUTENO A MDIO PRAZO
2.2.1 Manuteno em leo mineral
Este mtodo de conservao uma alternativa simples que consiste na
aplicao de uma camada de leo mineral esterilizado sobre uma cultura, a fim de
limitar a quantidade de oxignio disponvel, causando assim uma reduo no
metabolismo e consequemente na taxa de multiplicao do agente (RHODES, 1957;
COSTA & FERREIRA, 1991; ROMEIRO, 2006).

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CANHOS et al. (2004) e COSTA et al. (2009) afirmaram que esta tcnica
proporciona uma maior longevidade s estirpes, quando comparada repicagem
peridica, bem como reduo da velocidade de desidratao do meio de cultura, em
consequncia da diminuio de oxignio. Diversas bactrias e fungos podem ser
conservados por esta tcnica, sendo armazenados com sucesso por dois a trs
anos, visto a reduo na atividade metablica e nas transferncias para outros
meios de cultura. Entretanto, comparando com outros mtodos, apresenta
desvantagens equivalentes tcnica de subcultivo, como a possibilidade de
contaminaes, instabilidade gentica e dificuldades com a utilizao do leo
(esterilizao e manuseio).
A manuteno de microrganismos submersos em leo mineral promove a
reduo do consumo de oxignio em torno de 10% em poucas horas. COSTA &
FERREIRA (1991) e ROMEIRO (2006) afirmaram que camadas de leo superiores a
1 cm no devem ser utilizadas, mediante a reduo da viabilidade dos
microrganismos em condies de total exausto de oxignio. Caso a conservao
de culturas seja feita em tubo inclinado, o leo deve ser adicionado at que todo o
meio esteja recoberto, pois o contato dos microrganismos com o ar promove
desidratao total da cultura pela evaporao da gua.
Considerando o sucesso na manuteno de microrganismos, verifica-se que
os leos utilizados nesta tcnica devem ser de boa qualidade e pureza, apresentar
alta viscosidade, densidade relativa entre 0,8 e 0,9 temperatura de 20C e, alm
disso, no devem conter produtos txicos, sendo a parafina e a vaselina, os mais
recomendados para a manuteno de microrganismos em curto prazo (BARKER,
2002; ROMEIRO, 2006).
Outra preocupao quanto qualidade dos leos utilizados neste mtodo se
recorre ao processo de esterilizao. CEFAR (2006) sugere que para a esterilizao
destes produtos, a autoclavao no a tcnica ideal, preconizando-se o
aquecimento por meio de um forno a 170C por uma a duas horas. Pesquisas
afirmam que neste procedimento, deve-se evitar a formao de umidade a fim de se
eliminar riscos de contaminao e se ter um controle de temperatura, pois sua
elevao pode resultar na formao de produtos txicos aos microrganismos em
estoque. GUERNA (1981) relatou a existncia de dois procedimentos possveis para
a esterilizao do leo mineral: autoclavagem a 1 atm por 30 minutos seguida de
secagem a 150C, ou aquecimento 170C por uma hora. Alternativamente
LELLIOT & STEAD (1987) recomendaram autoclavagem a 121C e 15lb de presso
por 15 minutos, seguida de permanncia em estufa a 100C por uma noite para
remoo de gua.
ROMEIRO (2006) observou que inicialmente, o cultivo dos microrganismos
deve ser em meio inclinado, respeitando-se o tempo de incubao de 18 a 24 horas,
sob temperatura de 25 a 28C. Aps a observao de multiplicao bacteriana no
meio de cultivo, deve-se realizar a adio do leo de forma assptica, limitando uma
altura de um a dois cm acima do ponto mais alto do meio inclinado. Relata tambm
que a temperatura de conservao do meio aps adio do leo pode variar entre
4C e 20C, sofrendo ajustes mediante as necessidades individuais de cada agente.
No tocante, ROMEIRO (2006) afirma ainda que a recuperao dos
microrganismos mantidos sob conservao em leo mineral baseia-se apenas na
transferncia das culturas para outro meio slido ou lquido. Entretanto, PEREIRA et
al. (2008) e PASSADOR et al. (2010) preconizam que na transferncia de culturas
preservadas por este mtodo, seja utilizado o mesmo meio de cultivo utilizado

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durante a manuteno e sugerem que a retirada dos microrganismos deve ser

precedida pela drenagem total da camada de leo.
Neste contexto, observa-se que a alternativa de preservao de
microrganismos em leo mineral possui as mesmas vantagens que o repique
contnuo, diferindo somente na longevidade da cultura, que se apresenta por
maiores intervalos. Pesquisadores relatam que as bactrias podem ser conservadas
por perodos de um a sete anos dependendo da espcie, enquanto fungos
sobrevivem por um a cinco anos, e leveduras at sete anos (COSTA & FERREIRA,
1991; ABREU & TUTUNJI, 2004; COSTA et al., 2009).
2.2.2 Manuteno em gua esterilizada
A preservao em gua destilada esterilizada ou tambm conhecida pelo
mtodo de Castellani consiste no armazenamento de microrganismos em gua
esterilizada ou soluo salina, sendo indicada na preservao de microrganismos
sensveis a baixas presses osmticas de solues hipotnicas (PIMENTEL &
FIGUEIREDO, 1989; COSTA & FERREIRA, 1991; NEUFELD & OLIVEIRA, 2008).
Esta tcnica deve ser utilizada preferencialmente com culturas jovens, com
cerca de 10 a 15 dias, e busca reduo do metabolismo, com consequente latncia
das clulas diante da restrio de fontes nutritivas (COSTA & FERREIRA, 1991;
ABREU & TUTUNJI, 2004).
O mtodo se baseia na transferncia de culturas para frascos contendo uma
soluo de gua esterilizada, com posterior armazenamento sob temperatura
ambiente. PIMENTEL & FIGUEIREDO (1989), COSTA & FERREIRA (1991) e
ROMEIRO (2006) sugerem a utilizao de suspenses bem concentradas de
clulas, a partir de um crescimento em meio slido ou a incluso de blocos de gar
contendo os microrganismos.
Apesar do baixo custo e reprodutibilidade, nota-se os riscos de contaminao
das culturas e um possvel comprometimento na estabilidade gentica de alguns
microrganismos. Quanto utilizao dos blocos de gar em gua, sua aplicao
restrita a microrganismos que tenham grande aderncia ao gar como bolores e
algumas leveduras (COSTA & FERREIRA, 1991; ROMEIRO, 2006).
De uma forma geral, a utilizao de gua destilada esterilizada como meio de
manuteno tem sido proposto com sucesso para bactrias fitopatgenas, esporos
do gnero Bacillus e vrus da hepatite (APARECIDO et al., 2001; NEUFELD &
OLIVEIRA, 2008; PASSADOR et al. 2010).
Considerando bolores e leveduras, resultados satisfatrios tm sido obtidos
no que se refere viabilidade, estabilidade, pureza e patogenicidade. APARECIDO
et al. (2001) afirmaram que este mtodo alm de garantir a preservao das
caractersticas originais da cultura por longos perodos, promove a ausncia de
contaminao por caros, apresenta baixo custo por utilizar somente gua destilada
e revela a necessidade de pequeno espao fsico para acondicionar os frascos, alm
de ser empregado para um grande nmero de gneros e espcies de fungos.
NEUFELD & OLIVEIRA (2008) tambm observaram eficincia na aplicao
desta tcnica, ao avaliarem a manuteno de 15 cepas de dermatfitos por um
longo perodo. Aps 11 anos de conservao destes espcimes, observaram que
93,3% (14 cepas) foram avaliadas como viveis e sem alteraes morfolgicas,
demonstrando assim, a efetividade deste mtodo de conservao sob gua
destilada esterilizada na manuteno de cepas de dermatfitos por longos perodos
de tempo.

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2.2.3 Congelamento comum

O congelamento comum se baseia na conservao de agentes em
temperaturas relativamente baixas entre -4 e -20C. Apresenta-se como um dos
mtodos de manuteno mais simples e baratos, alm de oferecer boa segurana
para o armazenamento de diversos microrganismos por perodos de trs meses a
dois anos, devido a uma reduo significativa no metabolismo celular (COSTA &
FERREIRA, 1991; CEFAR, 2006; TORTORA et al., 2012).
Trata-se de um mtodo simples, menos oneroso, no requer equipamentos
sofisticados, nem mesmo no preparo do material. Como desvantagem, verifica-se
possvel reduo da viabilidade de alguns microrganismos, em funo dos danos
causados s clulas em decorrncia da formao de cristais de gelo e da variao
eletroltica na faixa de temperatura utilizada (ROMEIRO, 2006; VIEIRA et al., 2007;
MEDEIROS, 2008).
SILVA et al. (2008) buscando avaliar a viabilidade dos microrganismos
presentes em uma coleo de cultura, semearam um total de 328 leveduras dos
gneros Candida, Cryptococcuss, Trichosporon, Rodothorulla em caldo crebrocorao contendo glicerol, mantendo-as sob refrigerao por sete dias e posterior
congelamento a -20C, sob trs diferentes perodos de tempo. Aps trs anos de
congelamento, observaram recuperao de 99,0% das leveduras (72 viveis/73
microrganismos congelados). No segundo perodo (trs anos e seis meses)
observaram a viabilidade de 100% das cepas congeladas (96 leveduras congeladas
e viveis aps o descongelamento). No ltimo grupo, aps o congelamento de 159
leveduras por quatro anos, notaram uma reduo da viabilidade das culturas com
90,6% de recuperao (144 leveduras). Diante dos resultados, observaram que o
emprego de baixas temperaturas foi vantajoso por seu baixo custo, fcil execuo,
alm de ter favorecido a conservao de quase totalidade das leveduras por 48
meses.
2.3 MTODOS DE MANUTENO A LONGO PRAZO
2.3.1 Liofilizao
A tcnica de liofilizao caracteriza-se na conservao de microrganismos
por meio da dessecao rpida de culturas que se encontravam em estado de
congelamento. A remoo do vapor de gua presente em amostras biolgicas
viveis em estado de congelamento apresenta-se como alternativa capaz de
retardar o relgio biolgico estabelecido pela natureza. Desta forma, a liofilizao e a
criopreservao so as tcnicas mais empregadas na conservao da
biodiversidade microbiana, sendo uma das chaves para a realizao dos servios de
coleo de culturas microbiolgicas (DAY & MCLELLAN, 1995; MYAMOTOSHINOHARA et al., 2000; PAOLI, 2005; COSTA et al., 2009).
A liofilizao considerada uma das tcnicas mais eficientes para a
manuteno de microrganismos, justamente por garantir a viabilidade dos agentes
por 17 a 20 anos e ser aplicvel para a maioria deles, com exceo de algas e
protozorios (COSTA & FERREIRA, 1991; CANHOS et al., 2004; PASSADOR et al.,
2010).
Uma grande variedade de colees de culturas depende deste processo para
garantir e preservar a diversidade de seus espcimes, por isso, tem sido utilizada
como mtodo de referncia para a preservao a longo prazo (ABREU &
TUNTUNJI, 2004; COSTA et al., 2009).
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A tcnica se baseia na remoo da gua intracelular de materiais biolgicos

congelados, por sublimao, evitando a formao de cristais de gelo, capazes de
provocar danos s estruturas celulares, alm da degradao de enzimas presentes
no citosol, levando a morte dos agentes (COSTA & FERREIRA, 1991; MORGAN et
al., 2006).
Basicamente, a liofilizao pode ser definida como um processo de
desidratao sob condies de vcuo, constitudo por trs etapas: congelamento,
desidratao primria e desidratao secundria. O congelamento promove a inrcia
do material a ser liofilizado, gerando uma interrupo das reaes qumicas e
atividades biolgicas, sendo por isso uma das fases mais crticas. Posteriormente, a
amostra biolgica sofre desidratao por meio de sublimao, seguindo-se com o
emprego de temperaturas de secagem, sob presses reduzidas (PAOLI, 2005;
COSTA et al., 2009).
Apesar da liofilizao ser amplamente empregada na manuteno de
diferentes microrganismos e ser considerada uma tcnica de conservao a longo
prazo, as etapas que compem o processo so capazes de causar injrias ou danos
celulares como alteraes na permeabilidade da membrana celular, o que leva ao
aumento da sensibilidade a alguns agentes seletivos, aumento da fase lag de
multiplicao celular e a necessidade de incremento nutricional (CUNHA et al., 1998;
CANHOS et al., 2004; MORGAN et al., 2006).
Na tentativa de contornar os danos celulares, substncias protetoras podem
ser adicionadas durante o desenvolvimento de microrganismos, antes do
congelamento ou da secagem. Vale destacar que a escolha destas substncias
varia com o microrganismo alvo da liofilizao, porm compostos como o soro
bovino, leite desnatado, glicerol, betana, adonitol, sacarose, glicose, lactose,
trealose e alguns polmeros como dextran e polietilenoglicol podem oferecer
proteo para muitas espcies (HUBLEK, 2003; PAOLI, 2005; COSTA et al.,
2009).
Os procedimentos de estocagem e acondicionamento influenciam
significativamente na vida de prateleira dos materiais liofilizados. Desta forma, os
produtos liofilizados, armazenados em ampolas ou frascos de vidro, devem ser
acondicionados em ambientes com baixa umidade, baixas temperaturas, abrigo de
oxignio, luz e contaminantes (DAY & MCLELLAN., 1995; MORGAN et al., 2006).
Considerando a manuteno de bactrias, verifica-se que a viabilidade
relativa aps a liofilizao decresce entre as bactrias formadoras de esporos, Gram
positivas e Gram negativas, algas e alguns protozorios, fato facilmente explicado
pelas diferenas na morfologia. MIYAMTO-SHINOHARA (2008) ao avaliarem a taxa
de sobrevivncia das bactrias Gram positivas imediatamente aps a execuo da
liofilizao, verificaram maiores ndices, quando comparado s Gram negativas, sob
as mesmas condies, sugerindo desta forma maior resistncia desidratao pelas
Gram positivas, provavelmente pela sua estrutura celular diferenciada. Quanto
avaliao durante o perodo de estocagem, observaram tambm que a taxa de
sobrevivncia de algumas espcies se mantm fixa com o passar do tempo,
enquanto a de outras espcies apresentam um declnio durante os primeiros cinco
anos, tendendo a estabilizar por volta dos 15 anos.
Com relao aos vrus, UHLENHAUT et al. (2005) detectaram uma
considervel infectividade em modelos experimentais de liofilizados tanto entre vrus
envelopados quanto no envelopados. Quanto aos fungos, grande parte das
colees de culturas utilizam a liofilizao como mtodo de conservao de
microrganismos, justamente por atingirem uma manuteno de viabilidade de
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algumas espcies por perodos de 17 a 21 anos. Contudo, fungos no esporulados

ou que possuem esporos excessivamente delicados no suportam o processo de
liofilizao, sendo necessrio o emprego de tcnicas menos impactantes (COSTA et
al., 2009).
MIYAMOTO-SHINOHARA et al. (2000) avaliaram por 10 anos as taxas de
sobrevivncia de 10 espcies de microrganismos aps liofilizao e preservao sob
vcuo a 5C. Observaram que imediatamente aps a li ofilizao, os ndices de
sobrevivncia variaram entre as leveduras, bactrias Gram positivas e Gram
negativas.
A taxa de sobrevivncia da levedura Saccharomyces cerevisiae, foi cerca de
10% imediatamente aps a liofilizao, alm disso, os ndices de sobrevivncia no
diminuiram muito durante o perodo de armazenamento de 10 anos. As bactrias
Gram positivas apresentaram maiores ndices de sobrevivncia que as Gram
negativas, onde as espcies Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum,
Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium gultamicum e Streptococcus
mutans, revelaram em torno de 80% de sobrevivncia, aps o processo de
desidratao. As espcies Brevibacterium e Corynebacterium no reduziram a taxa
de sobrevivncia durante o perodo de armazenamento, enquanto S. mutans
diminuiu para cerca de 20% aps 10 anos. Quanto s bactrias Gram negativas, a
sobrevida de Escherichia coli, Pseudomonas putida, Serratia marcescens e
Alcaligenes faecalis, foi cerca de 50%, onde a reduo ocorreu nos primeiros cinco
anos e posteriormente se estabilizou em cerca de 10% (MIYAMOTO-SHINOHARA et
al., 2000).
Posteriormente, MIYAMOTO-SHINOHARA et al. (2006) avaliaram a
sobrevivncia de uma variedade de espcies de microrganismos liofilizados,
submetidos estocagem por perodos superiores a 20 anos. Os diferentes agentes
foram submetidos liofilizao, selagem a vcuo em ampolas e estocagem em
ambiente escuro a 5C.
Dentre as espcies avaliadas, pelos autores supra mencionados, a levedura
Saccharomyces cerevisiae, aps recuperao da desidratao, apresentou apenas
8% de sobrevivncia. Quando avaliada posteriormente, apresentou os melhores
ndices dentre todos os microrganismos testados, alcanando uma taxa de
sobrevivncia de 97,7% por ano. Quanto s bactrias Gram negativas, na avaliao
feita aps a liofilizao, as espcies Escherichia coli, Pseudomonas putida e
Enterobacter cloacae, apresentaram sobrevida de 42,6%, 33,5% e 50,8%,
respectivamente, revelando ndices maiores que o observado para a S. cerevisiae,
contudo a perda subsequente a estocagem foi superior a encontrada na S.
cerevisiae, com taxas de sobrevivncia anual correspondendo a 91%, 87,5% e
84,5%.
Os mesmos autores observaram que entre as bactrias Gram positivas
avaliadas, as espcies Lactobacillus acidophilus e Enteroccoccus faecium,
apresentaram sobrevida ps-liofilizao de respectivamente 62,5% e 85,2%. A
avaliao subsequente constatou para ambas as espcies, um ndice anual de 96%
de sobrevivncia durante a estocagem, valores estes superiores aos encontrados
entre bactrias Gram negativas. Ainda, como concluso do estudo, destacaram que
a sobrevida das espcies pode ser atribuda ao alto nvel de dessecao e da
vedao das ampolas, sob condies de vcuo.
Considerando a ampla utilizao da tcnica na manuteno de
microrganismos, verifica-se que o mtodo oferece alta estabilidade do material a ser
conservado, baixa taxa de mutao e contaminao; no requer monitoramento nem
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manuteno frequente, alm de ocupar pouco espao no armazenamento. Quanto

ao transporte de culturas de referncia ou at mesmo materiais de rotina, o
liofilizado pode ser transportado a longas distncias em temperatura ambiente, no
havendo necessidade de refrigerao. Como desvantagem verifica-se a
necessidade de equipamentos onerosos para a desidratao do material, alm dos
custos com o preparo das culturas (MORGAN et al., 2006, ZAMORA et al., 2006;
MIYAMOTO-SHINOHARA et al., 2008).
2.3.2 Criopreservao
A criopreservao consiste na manuteno de uma variedade de tipos
celulares sob baixas temperaturas, tendo como principal objetivo a reduo de
injrias aos materiais biolgicos, incluindo clulas animais e vegetais, bactrias,
fungos, vrus e tecidos, durante o processo de congelamento e estocagem a frio
(WOLFE & BRYANT, 2001; COSTA et al., 2009).
Este mtodo compreende a manuteno de materiais a baixas temperaturas
(-20C a -80C em freezers) e ultra baixas temperat uras (-150C a -196 C em
containeres de nitrognio lquido). No que tange a conservao dos microrganismos,
a estocagem a baixas temperaturas, apesar de eficiente, pode comprometer a
qualidade das amostras armazenadas, visto a possibilidade de variaes de
temperatura em freezers. J os sistemas de nitrognio lquido garantem o
armazenamento a temperaturas constantes e por longos perodos (SU et al., 1996;
WOLFE & BRYANT, 2001; PAOLI, 2005).
Embora a eficincia da conservao em temperaturas ultra baixas seja
garantida, VYSEKANTSEV et al., (2005) sugeriram que, alteraes cclicas da
temperatura de -196C at -130C ou -100C resultam na morte dos microrganismos
armazenados, ressaltando desta forma, o cuidado ante a movimentao e transporte
de exemplares criopreservados.
DUMONT et al., (2004) e COSTA et al., (2009) relataram que apesar da
existncia de diversas tcnicas de manuteno de microrganismos, o princpio do
congelamento-descongelamento se manteve entre os mais importantes e viveis
para a preservao celular.
Considerando as altas taxa de sobrevivncia de microrganismos que a
criopreservao proporciona, pesquisadores buscam aprimorar a tcnica quanto a
sua utilizao, principalmente pelo aspecto prtico, visto a recuperao e obteno
de clulas viveis, mas tambm na reduo de possveis mutaes genticas.
Entretanto, faz-se necessrio frisar que os protocolos de criopreservao
necessitam de adequao metodolgica acessvel e aplicvel para a diversidade de
microrganismos existentes (PAOLI, 2005; COSTA et al., 2009).
Diante da importncia do mtodo e sua aplicao na conservao de
materiais biolgicos, necessrio destacar que a criopreservao de
microrganismos dependente de uma srie de fatores como a espcie a qual se
pretende preservar, suas particularidades como tamanho e estrutura celular, a fase e
taxa de desenvolvimento, exigncias como temperatura de incubao, composio
dos meios de cultivo, pH, osmolaridade, tolerncia ao oxignio, teor de gua das
clulas, teor lipdico, composio do meio para congelamento, temperatura e tempo
de estocagem, e condies para recuperao das culturas (DAY & MCLELLAN,
1995; COSTA et al., 2009).
Outro parmetro interferente e de grande relevncia na criopreservao a
taxa de resfriamento. Quando os materiais biolgicos a serem conservados so
submetidos ao resfriamento lento, ocorre uma reduo gradativa da temperatura,
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porm se estabelece uma curva de resfriamento extremamente rpida capaz de

prevenir as injrias celulares, e ao mesmo tempo lenta, o suficiente para permitir um
nvel de desidratao capaz de evitar a formao de gelo intracelular. A vitrificao
compreende a utilizao de taxas de resfriamento extremamente altas, porm a
adio de crioprotetores em altas concentraes promove a reduo de gua antes
do resfriamento, impedindo assim a formao de cristais de gelo e os consequentes
danos estruturais (COSTA et al., 2009; SPUTTEKA & ROWEB, 2011).
Durante o processo de congelamento, o desafio das clulas no se
caracteriza na resistncia sob temperatura de armazenamento de -196C, mas sim
na capacidade de suportar as possveis alteraes decorrentes pela passagem
pelas faixas intermedirias de temperatura (+ 19C a + 8C e -15C a - 60C), tanto
durante o congelamento quanto no descongelamento (MAZUR, 1984; COSTA &
FERREIRA, 1991; OLIVEIRA, 2007).
A metodologia padro para a criopreservao tem incio na refrigerao do
material biolgico, mantendo-o a temperatura de 20C. Nesta etapa, no se
evidencia danos s estruturas celulares, desde que a amostras estejam diludas em
meios adequados (OLIVEIRA, 2007; COSTA et al., 2009). Com a reduo da
temperatura, pode ser determinada uma faixa crtica, entre +19 e +8C, na qual os
microrganismos podero sofrer algum tipo de injria celular. Quando este
resfriamento realizado de uma forma inadequada, o fenmeno determinado como
choque trmico provoca danos irreversveis como alteraes na membrana
plasmtica com consequente aumento da permeabilidade e perda de ons e
molculas intracelulares, alm da reduo do metabolismo (WATSON, 2000).
Quando o processo de reduo de temperatura atinge a faixa de -6C a 15C, verifica-se a cristalizao da gua presente no meio, o aumento da
concentrao de soluto na frao descongelada e a ausncia de formao de
cristais de gelo intracelular pelo controle da membrana plasmtica. Quando o
material atinge a temperatura crtica de -60C veri fica-se a inrcia celular, sendo
possvel realizar a imerso do material em nitrognio lquido, para seu
armazenamento e conservao (WATSON, 2000; OLIVEIRA, 2007).
Diante da forte influncia que a taxa de resfriamento exerce sobre a
viabilidade celular, DUMONT et al., (2004) verificaram em seu estudo a viabilidade
de cinco tipos celulares (Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Escherichia coli,
Lactobacillus plantarum e uma clula humana da linhagem leucocitria K562) frente
a diferentes taxas de resfriamento, durante a criopreservao. Classificaram a
viabilidade celular em trs escalas: alta viabilidade para baixas taxas de resfriamento
(5 a 180C/min), permitindo o efluxo do contedo de gua celular, prevenindo a
cristalizao intracelular; baixa viabilidade para taxas intermedirias de resfriamento
(180 a 5.000C/min), levando a prevalncia do fluxo de calor sobre o efluxo de gua
e a consequente cristalizao (onde o fluxo de gua est em direo ao meio
externo); e alta viabilidade para taxas de resfriamento muito altas, onde h induo
de um rpido fluxo de calor com consequente vitrificao intracelular, antes mesmo
do efluxo de gua.
Os referidos autores verificaram que para todos os tipos celulares
investigados, a viabilidade mostrou-se maior nas taxas de resfriamento baixas e
muito altas, fato este que pode ser explicado pela competio entre o fluxo de calor
e o efluxo de gua na clula, durante o processo de congelamentodescongelamento. Nos casos de taxas mais baixas de resfriamento, o calor latente
de congelamento da gua celular permitiu a sada de gua e preveniu desta forma, a
formao de cristais de gelo no espao intracelular. As taxas intermedirias de
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resfriamento conferiram um retardo na vitrificao intracelular, e se caracterizaram

fator negativo para a viabilidade do espcime, levando a morte celular decorrente
aos danos pela cristalizao durante o efluxo de gua pela membrana plasmtica.
J nas altas taxas de resfriamento, as clulas foram capazes de se congelar, sem
qualquer alterao no volume celular e apresentaram viabilidade considervel aps
descongelamento. Apesar do comportamento geral dos espcimes envolvidos, os
resultados podem ser alterados por influncia do tamanho da clula, presena de
parede celular e permeabilidade gua (DUMONT et al., 2004).
2.3.2.1 Danos decorrentes do processo de criopreservao
A criopreservao requer alguns cuidados para que seja realmente eficiente.
Diversos fatores podem afetar a viabilidade e estabilidade celular, no entanto os
danos celulares so decorrentes principalmente do comportamento da gua sob
condies de baixas temperaturas. A crioinjria ou leso celular causada durante os
processos de congelamento e descongelamento um processo letal relacionado
formao de extensos cristais de gelo intracelular e estes so capazes de alterar as
estruturas da membrana plasmtica, modificando o fluxo de gua para o meio
extracelular (desidratao) e ao aumento da concentrao intracelular de solutos
(WATSON, 2000; OLIVEIRA, 2007; CASTRO et al., 2011).
Durante o congelamento, as clulas esto suscetveis desidratao e
instabilidade osmtica devido alterao das concentraes de sais das clulas. Em
condies normais, a soluo extracelular apresenta-se em maior proporo que a
intracelular, e por isso, o congelamento extracelular tende a ocorrer primeiro. Os
solutos contidos no meio externo se concentram numa pequena frao de gua sob
estado lquido, passando a apresentar uma maior presso osmtica, e promover o
fluxo de gua para fora da clula. Altas concentraes intracelulares inibem a
formao de gelo, entretanto a desidratao decorrente e a elevada concentrao
de ons podem ocasionar danos s clulas (WOLFE & BRYANT, 2001; HUBLEK,
2003).
Diante da complexidade do processo de congelamento, verifica-se que os
mecanismos de efluxo de gua juntamente com a formao de longos e
protuberantes cristais de gelo so os responsveis pelos danos irreversveis que
atingem a membrana plasmtica e que muitas vezes podem ocasionar a morte
celular. A extenso dos danos causados pelo gelo intracelular depende do grau de
formao de gelo e do tamanho dos cristais. Desta forma, algumas alternativas so
muito utilizadas para minimizar estas ocorrncias, como a utilizao de agentes
crioprotetores com vistas a prevenir a cristalizao mediante a reduo da atividade
de gua, adoo de uma taxa de congelamento uniforme (aproximadamente 1C por
minuto) e a prtica de um processo de descongelamento rpido (banho-maria a
37C) (ABREU & TUTUNJI, 2004; COSTA et al., 2009).
2.3.3.2 Agentes conservantes para criopreservao
Considerando a importncia da conservao de microrganismos por longos
perodos, POLGE et al. (1949) na tentativa de preveno ou at mesmo na reduo
dos efeitos adversos dos mtodos de preservao de amostras biolgicas, por uma
descoberta acidental, verificaram a proteo efetiva do glicerol sobre materiais
biolgicos. Posteriormente, a ao protetora de outras substncias foram
descobertas e intensamente utilizadas na rotina laboratorial, como o dimetilsulfxido
(DMSO), o metanol e o etilenoglicol (BAATI et al., 2000; HUBALEK et al., 2003).

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Diante da necessidade de utilizao dos agentes crioprotetores, muitos

estudos tem sido desenvolvidos na busca de otimizar a escolha de diferentes
crioprotetores, diferentes concentraes, relao do tempo e da temperatura para
sua adio durante o processo de congelamento e at mesmo quanto a possvel
toxicidade que estes agentes podem oferecer ao material biolgico a ser conservado
(DAY & MCLELLAN, 1995; COSTA et al., 2009; CASTRO et al., 2011).
Atualmente, crioprotetores como a sacarose, trealose, glicerol e
dimetilsulfxido (DMSO), vem sendo utilizados na criopreservao de
microrganismos, nas concentraes de 10% a 15%, garantindo a viabilidade de
agentes como Escherichia coli, Klebsiella sp., Serratia marcescens, Lactobacillus
sp., Pasteurella multocida, Pseudomonas aeruginosa, entre outras bactrias
(LUDLAM et al., 1989; BAATI et al., 2000). Estudos demonstram que a utilizao de
glicerol ou DMSO em concentraes acima de 20%, apresentam efeitos deletrios
aos microrganismos devido a sua toxicidade, sendo ento um obstculo na
sobrevivncia das estirpes durante o congelamento (FAHY, 1986; ANDREATTI
FILHO et al., 2007; FAHY, 2010; CASTRO et al., 2011).
Os crioprotetores caracterizam-se por molculas de baixo peso molecular,
alta solubilidade em meio aquoso e baixa toxicidade celular, sendo classificados com
relao capacidade de penetrao em materiais biolgicos, como crioprotetores
penetrantes (intracelulares) ou crioprotetores no penetrantes (extracelulares)
(COSTA & FERREIRA, 1991; HUBLEK, 2003; OLIVEIRA, 2007).
Os crioprotetores no penetrantes ou extracelulares so molculas capazes
de induzir o aumento na osmolaridade do meio externo, promovendo a sada de
gua do meio intracelular para o meio extracelular, prevenindo desta forma, a
formao de cristais de gelo intracelular durante o congelamento (HUBLEK, 2003;
FULLER, 2004). So substncias apropriadas para a preservao de
microrganismos, visto a capacidade de recobrir a superfcie celular, formando uma
camada viscosa capaz de estabilizar a parede celular e membrana plasmtica,
minimizando e reparando os possveis danos causados pela manuteno em baixas
temperaturas. Destacam-se nesse grupo: mono, oligo e polissacarideos, manitol,
sorbitol,
dextran,
metilcelulose,
albumina,
gelatina,
polivinilpirolidona,
polietilenoglicol, xido de polietileno, entre outros (HUBLEK, 2003; OLIVEIRA,
2007).
Os crioprotetores penetrantes ou intracelulares atuam nas clulas por meio de
suas propriedades coligativas, levando a reduo do ponto crioscpico. Deste
modo, uma maior quantidade de gua permanece no estado lquido sob baixas
temperaturas, levando a reduo na concentrao intracelular de solutos e
proporcionando um ambiente menos prejudicial aos microrganismos durante o
congelamento (WATSON, 2000).
Estes compostos so capazes de realizar ligaes com as molculas de
gua, levando a uma significativa reduo na formao e no tamanho dos cristais de
gelo, bem como as concentraes de soluto tanto no meio extracelular quanto no
intracelular, destacando-se o etanol, o glicerol, o metanol, o etilenoglicol, o
polietilenoglicol, o propilenoglicol, a acetamida, a dimetilformamida, a metilacetamida
e o dimetilsulfxido (HUBLEK, 2003; OLIVEIRA, 2007; COSTA et al., 2009).
Diante do emprego dos diversos agentes crioprotetores, verifica-se a ampla
utilizao do glicerol, dimetilsulfxido (DMSO), soro sanguneo e a soroalbumina,
leite desnatado, sacarose, extrato de levedura, glicose, metanol, sorbitol, extrato de
malte, dextran e o etilenoglicol (COSTA et al., 2009; CASTRO et al., 2011).
Entretanto, a escolha do agente crioprotetor deve ser baseada tambm nos efeitos
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txicos particulares de cada substncia ou mesmo pela induo de estresse

osmtico, o que aumenta a possibilidade de alterao do perfil morfolgico e/ou
gentico dos espcimes, alm do risco de morte celular (HUBLEK, 2003; FULLER,
2004; OLIVEIRA, 2007).
Alm da classificao em crioprotetores penetrantes (intracelulares) ou no
penetrantes (extracelulares), estas substncias podem ser diferenciadas pela sua
viscosidade. Crioprotetores de alta viscosidade, como o propilenoglicol e os
sacardeos, atuam principalmente em processos onde so aplicadas rpidas taxas
de resfriamento como na conservao de espermatozides, eritrcitos e bactrias.
J os crioprotetores de baixa viscosidade, como o dimetilsulfxido (DMSO) e o
metanol, proporcionam uma proteo inferior, justamente por no provocarem
mudanas estruturais no material biolgico durante os processos de congelamento
com taxas rpidas de resfriamento (MORRIS et al., 2006; COSTA et al., 2009).
Considerando as particularidades dos microrganismos, do mtodo de
manuteno e dos crioprotetores, ANDREATTI FILHO et al. (2007) propuseram
avaliar a capacidade de proteo da microbiota cecal cultivada em aerobiose,
congelada em nitrognio lquido e associada crioprotetores como o glicerol,
DMSO, sacarose e trealose sob pintos de corte desafiados experimentalmente com
Salmonella enterica sorovar Enteritidis. Os pintos de corte de um dia foram tratados
com microbiota cecal cultivada em aerobiose, sob tempos de congelamento
diferenciados (90, 200, 290 e 360 dias) e em conjunto com os crioprotetores usuais.
Posteriormente, os animais foram desafiados com as cepas de Salmonella sp e os
autores puderam determinar a eficcia ou no dos tratamentos empregados,
verificando a quantidade de microrganismos viveis presente na microbiota. No
tempo zero (antes do congelamento), os tratamentos com crioprotetores e o grupo
controle no diferiram entre si, pois todas as aves apresentaram Salmonella sp
(100%). A proporo de microrganismos viveis foi maior aos 90 dias quando os
microrganismos foram congelados com sacarose (10,58 Log10 UFC/ml) e menor
quando tratados com glicerol (7,73 Log10 UFC/ml).
ANDREATTI FILHO et al., (2007) contabilizando 200 dias de congelamento,
constataram que as maiores contagens de UFC foram provenientes dos tratamentos
com sacarose e no grupo controle, seguidos pelo DMSO. Aos 290 dias de
congelamento, a menor quantidade de microrganismos viveis foi no tratamento com
glicerol enquanto os maiores ndices foram com sacarose e no grupo controle. J
nos 360 dias de congelamento, a menor contagem foi ao tratamento com sacarose e
a maior utilizando o glicerol.
Apesar dos resultados, foi possvel concluir no estudo que o efeito benfico
esperado dos crioprotetores no foi to significativo, pois a microbiota cecal
conservada com ou sem crioprotetores, manteve-se adequada, garantindo
efetividade mesmo at 360 dias de congelamento. Alm da viabilidade do agente,
verificou-se uma reduo no nmero de aves infectadas e consequentemente a
colonizao cecal por S. enterica ser. Enteritidis.
Neste contexto, cabe ressaltar que os crioprotetores em altas concentraes
so txicos para as clulas, resultando em baixas taxas de sobrevivncia, e parte
dessa toxicidade decorrente de alteraes na composio bioqumica das
membranas e pelo estresse osmtico (HUBLEK, 2003; CASTRO, 2011).

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2. 4 COLEES DE MICRORGANISMOS (EX SITU)

Diante da diversidade biolgica que o planeta possui e a busca pelo
desenvolvimento tecnolgico e cientfico em que muitos pases se encontram, os
Ncleos ou Servios de Colees de Culturas tornaram-se responsveis por um
amplo trabalho em microbiologia, sendo responsveis na colheita, manuteno e
distribuio de microrganismos vivos e sem variaes genticas (cepas de
referncia), atendendo assim as requisies para diversos fins, incluindo atividades
de ensino e pesquisa, controle de qualidade e biotecnologia (HOLLAND et al., 2003;
ABREU & TUTUNJI, 2004 ).
Atualmente existem vrios centros de colees de culturas, podendo citar os
ncleos com relevncia mundial como a ATCC (American Type Culture Collection),
de Manyland, nos EUA; a DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen) na Alemanha; o IMI (International Mycological Institute), com sede na
Inglaterra; o CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures), em Baar-Delft, Holanda;
o IFO (Institute For Fermentation), em Osaka, Japo; o JCM (Japan Collection of
Microorganisms), em Wako, Japo e a MUCL (Mycotheque De L.Universite
Catholique de Luvaim), localizada em Luvain-le-Neuve, Blgica (CAVALCANTI,
2010).
A World Federation for Culture Collections (WFCC) e a European Culture
Collection Organization (ECCO), atuam como fruns de discusso, agrupando uma
massa crtica de colees e usurios a fim de facilitar o progresso da conservao
gentica ex situ. O WFCC rene em torno de 700 scios, pertencentes a 62 pases e
conta com aproximadamente 470 colees registradas no World Data Center for
Microorganisms (WDCM). Das colees cadastradas no WDCM estima-se a
manuteno de mais de um milho de cepas, onde 44% so fungos, 43% bactrias,
2% vrus, 1% clulas vivas e 10% espcimes como plasmdeos, plantas, clulas
animais e algas (ABREU & TUTUNJI, 2004; COSTA et al., 2009).
No Brasil, o ltimo levantamento nacional identificou a existncia de 43
ncleos de pesquisa registrados no Centro Mundial de Dados de Microrganismos
(WDCM), porm apenas 16 prestavam servio para usurios de outras instituies.
Nas 80 colees que os ncleos abrigam, esto armazenados acervos de
microrganismos associados a enfermidades em humanos, animais e plantas,
destacando a Coleo de Culturas do Instituto Adolfo Lutz So Paulo/SP; a
Coleo de Culturas Tropicais (CCT) da Fundao Tropical de Pesquisas e
Tecnologia Andr Tosello Campinas/SP; Coleo de Culturas IBSBF do Instituto
Biolgico- Campinas/SP; Coleo de Culturas da Fundao Oswaldo Cruz
(FIOCRUZ)- Rio de Janeiro/RJ; o Banco de Clulas do Rio de Janeiro (BCRJ),
localizado no Hospital Universitrio Clementino Fraga Filho, da Universidade Federal
do Rio de Janeiro; o Hospital de Medicina Tropical de So Paulo; a Universidade
Federal de Pernambuco e o Centro Especializado em Micologia Mdica, da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Cear (CEMM) (ABREU &
TUTUNJI, 2004; CANHOS et al., 2004).
Diante da imensa diversidade gentica entre os microrganismos e a
necessidade de conservao destes recursos, verifica-se a importncia da
intercomunicao entre os ncleos de colees de culturas a fim de fortalecer o
desenvolvimento de pesquisas no pas, propiciando novas aplicaes
biotecnolgicas dos microrganismos e possibilitando a abertura de novas linhas de
pesquisa.

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3 CONSIDERAES FINAIS
A manuteno de microrganismos um recurso prtico e cientfico para a
atividade laboratorial, diagnstica e de pesquisa, permitindo ampla explorao
biolgica.
A conservao e viabilidade de culturas, por outro lado, pode ser divergente,
por vezes contraditria, entre grupos de pesquisa e seus objetos de estudo e
explorao. Para tanto, muitas tcnicas tm sido avaliadas.
Pensar em manter, estocar e preservar colees significa assegurar um
patrimnio de culturas e bancos genticos com ateno morfologia, fisiologia,
respostas celulares e teciduais, bem como sua associao patogenia e
infectividade, no caso de agentes patognicos.
A variabilidade das populaes microbianas determina a comparao
experimental quanto ao melhor mtodo, melhor temperatura e perodo de tempo
para condies especficas, ou a combinao de dois ou mais mtodos.
As colees de culturas so ferramentas fundamentais para profissionais,
estreitando o conhecimento e fortalecendo a interao dos grupos, suplantando
fronteiras para a multidisciplinariedade dos segmentos de ensino, pesquisa,
agropecuria, medicina, agronomia, indstrias, biotecnologia e meio ambiente, de
forma atemporal e sem delimitao geogrfica.
Diversos pases tm sugerido a ampliao de colees, com a formalizao
de redes distribudas pelo mundo, incluindo normas padronizadas, harmonizao de
aes, gerenciamento de informao, bem como a transparncia da comunicao.
Tudo isso, para que as colees de culturas passem a ser de propriedade mundial,
com aplicao destinada comunidade, para seu bem estar e segurana.
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