Mtodo para Deteco de Salmonella

A tcnica tradicional de deteco de Salmonella em alimentos um

mtodo de presena/ausncia, desenvolvido com a finalidade de garantir a
deteco em situaes extremamente desfavorveis (clulas injuriadas,
populaes reduzidas ou esteja competindo com outros microrganismos em
maior nmero no alimento.
A metodologia sugerida pela Bacterial Analytical Manual on line da Food and
Drug Administration BAM/FDA (2006), consta das seguintes etapas:
1- Pr enriquecimento (no seletivo) utilizar caldo lactosado para
recuperar clulas injuriadas incubadas a 35C por 24 hs.
2- Enriquecimento seletivo visa elevar o nmero de Salmonellas e
inibir o crescimento da microbiota acompanhante num perodo um
perodo de 18-24 hs. Recomenda-se o uso de dois meios diferentes
porque a resistncia de Salmonella aos agentes seletivos pode variar de
cepa para cepa. Os meios recomendados so: RV (Rappaport Vissiliadis
Modificado) e TT (caldo Tetrationato).
3- Plaqueamento diferencial promove o crescimento preferencial de
colnias de Salmonella, com caractersticas distintas. Recomenda-se o
plaqueamento em diferentes meios: Agar bismuto sulfito - BS, Agar
entrico hectoen HE e Agar xilose lisina XLD.
4- Confirmao (provas bioqumicas)

Procedimento:
1- Pr-enriquecimento - transferir uma poro de 25g ou 25 mL da
amostra para um frasco ou bolsa de homogeneizao estril, adicionar
225 mL de caldo pr-enriquecimento (caldo lactosado) e homegeneizar
a amostra. Fechar bem o frasco e deixar descansar por 60 minutos a
temperatura ambiente. Agitar bem, retirar uma alquota de volume
conhecido e verificar o pH. Ajustar para 6,8 0,2 com NaOH ou HCl 1N,
verificando o volume de cido ou base para adicionar proporcionalmente
a amostra. Incubar a 35C por 24 hs.
2- Enriquecimento seletivo agitar cuidadosamente o frasco com caldo
de pr-enriquecimento e transferir 0,1 mL para 10 mL de caldo
Rappaport-Vassilidis modificado e 1 mL para 10 mL de caldo Tetrationato
(TT). Incubar o RV a 42C por 24 hs (banho-maria) e o TT a 35C (baixa
carga microbiana) ou 43C (alta caraga microbiana) por 24 hs em
banho-maria.
3- Plaqueamento diferencial agitar os tubos de enriquecimento seletivo
em agitador tipo vortex e estriar (por esgotamento) uma alada do caldo
TT em placas de HE, BS (24/48 hs) e XLD. Repetir esse procedimento
com o caldo RV. Incubar a 35C por 24 hs.

Leitura das placas:

gar HE- colnias transparentes, verde-azuladas, com ou sem centro preto.
Cepas fortemente produtoras de H 2S podem produzir colnias com centro
preto grande e brilhante, ou mesmo inteiramente pretas. Colnias de cepas
fermentadoras de lactose ou sacarose so de cor salmo e no
transparentes. Algumas poucas cepas de Salmonella podem apresentar
colnias atpicas, amarelas, com ou sem centro preto.
Agar XLD- colnias de cor rosa escuro, com centro preto e uma zona
avermelhada levemente transparente em redor. Cepas de salmonella H2S
fortemente positivas podem produzir colnias com centro preto grande e
brilhante, ou mesmo inteiramente pretas. Cepas de salmonella H2S
negativas produzem colnias cor de rosa com centro rosa mais escuro, mas
no preto. Cepas de salmonella lactose positivas produzem colnias
amarelas com ou sem o centro preto.
Agar BS colnias castanhas, cinza ou pretas com ou sem brilho metlico.
O meio em redor da colnia muda gradativamente para uma colorao
castanha a preta, com o prolongamento do tempo de incubao. Algumas
cepas de salmonella podem apresentar colnias atpicas, verdes, com
pouco ou nenhum escurecimento do meio em redor. Preparar as placas um
dia antes, pois no dia poder ser toxica as salmonellas. Estocar as placas a
temperatura ambiente antes da inoculao.

Metodologia para isolamento de leveduras

Meio de cultura (g/L):

Extrato de levedura 3,0
Extrato de malte 3,0
Citrato de sdio 5,16
Peptona 5,0
Glicose 10,0
*Ampicilina (1 g/mL)
*cido nalidixico (5g/mL)
pH = 4,0

Preparo:

Pesar os meios de cultura para preparar o meio de enriquecimento em erlemyer

(90 mL). Corrigir o pH para 4,0. Aps autoclavagem colocar os antibiticos quando a
temperatura estiver em torno de 40C. Pesar 10 gramas da amostra (fruta) e macerar
vagarosamente. Acrescentar ao meio de enriquecimento e incubar a 28C por 24 hs.
Para preparo do meio slido, acrescentar Agar bacteriolgico a 2%, autoclavar o meio,
acrescentar o antibitico e fazer o plaqueamento. Inserir 100 L do meio de
enriquecimento no centro da placa e e espalhar com ala Drigalsky e incubar novamente
a 28C por 24.

Compendium of Methods for the Microbiological Examination of foods (APHA,

4 Edio) Apud Silva, N. et al. Manual de Mtodos de Anlise Microbiolgica de
Alimentos. 3 Ed. 2007, So Paulo: Livraria Varela, 2007. 552p.

Metodologia para Bolores Totais

Material:

Diluente: gua peptonada ou gua destilada estril

Amostra: 1:10 (25 g em 225 mL do diluente)
Placas contendo meio BDA (Agar Batata Dextrose)
Pipetadores automticos (calibrado para 100 L e para 1 mL)
Ala de espalhamento Drigalski.
Tubos de ensaio contendo 9mL do diluente
Vortex

Pesar 25 g da amostra e passar para o erlemyer com 225 mL do diluente. Seguir

as diluies nos tubos de ensaio at 10-3 lembrando-se que os 25 em 225, j formam a
diluio de 10-1 . Retirar 1 mL e inocular no segundo tubo, homogenizar a amostra,
novamente, no vortex, e retirar um mL passando para a terceira diluio, homogenizar.
Inocular 100 L da ultima diluio no centro da placa e espalhar com a ala Drigalski.
Inverter a placa e colocar na estufa a 28 C por 72 hs.
Calculo: numero de colnias X 103. 10 UFC/g

Compendium of Methods for the Microbiological Examination of foods (APHA, 4

Edio) Apud Silva, N. et al. Manual de Mtodos de Anlise Microbiolgica de
Alimentos. 3 Ed. 2007, So Paulo: Livraria Varela, 2007. 552p.