Universidade Tecnolgica Federal do Paran Departamento Acadmico de Qumica e Biologia

MUTAGNESE E CARCINOGNESE

Profa. Lucia Regina R. Martins

MUTAES
So alteraes do material gentico, que so transmitidas a outras clulas. somticas: mutaes passam s clulas-filhas germinativas: transmisso aos descendentes

Consequncia do funcionamento normal/interao com o meio: quando deletrias: mecanismos de reparo eliminao vantagens adaptativas so conservadas: seleo natural

MUTAES
Tipos:
1. Microleses: afetam apenas 1 par de bases (pontuais) 2. Macroleses: envolvem grandes extenses do DNA (translocaes, delees, inseres, duplicaes, inverses) em geral associadas carcinognese, na fase de progresso tumoral.

MUTAES PONTUAIS:
Tipos: substituies, perdas, adies de bases.
Substituies: Transio (purinapurina ou pirimidinapirimidina) Transverso (pirimidinapurina ou purinapirimidina)

Efeitos da mutao: 1) substituies de bases: - mis-sense (codifica para outro aa) - non-sense (cdon de finalizao: UAA, UAG, UGA) - silenciosa (cdon sinnimo) 2) adio ou perda: altera o quadro de leitura

Origem: falhas em mecanismos endgenos (replicao e reparo)

modificaes qumicas direta em uma das bases do DNA As modificaes qumicas podem ser espontneas ou induzidas.

MUTAES PONTUAIS:
Modificaes Qumicas Espontneas: despurinaes: quebra de ligao N-glicosdica (A e G) com a desoxirribose causa: variaes trmicas (~10.000 por dia!!) desaminaes: adenina hipoxantina; citosina uracila (reconhecimento e reparo) citosina metilada timina (no reconhece!) h substituio: G A

MUTAES PONTUAIS:
Modificaes Qumicas Espontneas: tautomerismo: ceto-enlico (timina e guanina) e amino-imnico (adenina e citosina) pareamento incorreto das bases

MUTAES PONTUAIS:
Modificaes Qumicas Induzidas:

Agentes qumicos Agentes fsicos

Agentes Mutagnicos: 1. Qumicos: a) metablitos reativos (ex.: EROs oxidaes com alteraes de pareamento, quebras ou ligaes covalentes entre filamentos) b) anlogos de base: semelhana estrutural; incorporadas ao DNA durante replicao pareamento errneo no prximo ciclo ex.: 5-bromouracila ( timina) pareamento incorreto 5BU-A 5BU-G C-G

MUTAES PONTUAIS:
Modificaes Qumicas Induzidas: Agentes Mutagnicos: 1. Qumicos: c) agentes de ao direta: ex.: HNO2 (desaminao oxidativa: adenina, citosina e guanina) transies: G-C A-T

MUTAES PONTUAIS:
Modificaes Qumicas Induzidas: Agentes Mutagnicos: 1. Qumicos: d) agentes alquilantes: espcies muito reativas, adicionam grupos alquila em vrias posies do DNA; Consequncias: pareamento incorreto (substituio) ou perda de bases alquiladas (stios apurnicos ou apirimidnicos) ex.: etil-metanossulfonato, etil-etanosulfonato, nitrosoguanidina, ...

MUTAES PONTUAIS:
Modificaes Qumicas Induzidas: Agentes Mutagnicos: 1. Qumicos: e) agentes intercalantes: promovem distores do DNA, adio ou eliminao de bases (modificam a sequncia de leitura)

benzo(a)pireno

MUTAES PONTUAIS:
Modificaes Qumicas Induzidas: Agentes Mutagnicos: 2. Fsicos: Radiaes ionizantes (raios X, e partculas atmicas): formao de espcies reativas mutaes pontuais, quebras, rearranjos cromossmicos Radiao UV (250 400 nm): transies eletrnicas e formao de dmeros de pirimidinas (efeitos na replicao e transcrio; mutao ocorre durante mecanismo de reparo)

CARCINOGNESE
DANO AO DNA PARADA NO CICLO CELULAR (Gzero) REPARO DA LESO

CONTINUAO DO CICLO

MORTE CELULAR (APOPTOSE)

INSTABILIDADE GENMICA

CARCINOGNESE processo multifatorial (exgenos e endgenos); em geral so necessrias vrias mutaes para seu desenvolvimento e progresso

CARCINOGNESE Fases:
1 Iniciao: induzida por mutao qumica/fsica (radiao): ao genotxica agentes biolgicos (vrus) clula com mutao permanece dormente por tempo varivel 2 Promoo durao varivel fatores epigenticos (ativao da expresso gnica e da atividade mittica) envolve induo da proliferao celular desordenada aumenta nmero de clulas com mutao e incio do dano tecidual substncias promotoras: alcalides do indol, ciclamato, sacarina, TCDD, etc. 3 Progresso tumoral baixa estabilidade gentica mutaes adicionais e seleo perda da diferenciao celular (morfologia e funo) malignidade

CARCINOGNESE

Formao do Tumor: expanso clonal acelerada de 1 clula formao de clone com vantagem proliferativa baixa estabilidade gentica: novas mutaes com elevada frequncia Progresso Tumoral: ciclos de mutao e seleo (alterao do comportamento celular, expanso da massa tumoral, invaso de tecidos adjacentes) progresso final: malignidade (invaso de tecidos e metstases)

Metstase tumoral:

Estgios de progresso do cncer; ex.: colo uterino

Mutaes sucessivas: aparecimento de clulas indiferenciadas

Carcingenos Qumicos:
Genotxicos: agentes mutagnicos iniciadores (espcies reativas) carcingenos primrios: reao direta com DNA (ex.: xido de etileno, perxidos, sulfonas, elementos radioativos ...) carcingenos secundrios: produtos do metabolismo (ex.: aminas aromticas, HAPs, nitrosaminas, corantes, hidrocarbonetos clorados)

Imunossupressores: facilitam a progresso do cncer

Epigenticos (promotores): no se ligam ao DNA; ex.: steres de forbol, hormnios naturais ou sintticos, fibras de amianto.

Carcingenos Qumicos:
Mutaes que levam ao cncer podem ocorrer em: proto-oncogenes (codificam protenas que estimulam o ciclo celular; mutao dominante). genes supressores de tumores (codificam protenas que controlam o ciclo celular; mutao recessiva).

Promoo da carcinognese qumica

CARCINOGNESE QUMICA
desenvolvimento do cncer: processo lento e gradual ex.: 2-naftilamina e cncer de bexiga em operrios de indstria qumica (incidncia dependente do perodo de exposio)

AVALIAO DO POTENCIAL MUTAGNICO DE AGENTES QUMICOS

Testes in vivo:
espcies mais usadas: roedores dificuldades/limitaes: a. testes muito demorados (exposio consequncias) b. custo c. informaes nem sempre vlidos para humanos ( intraespcies) d. equivalncia entre doses de testes e nveis de exposio humana

Epidemiologia:
estimativa de carcinogenicidade baseada na exposio humana fundamenta a extrapolao dos ensaios com animais Estimativa do risco carcinognico ao homem: HERP (Human Exposure/Rodent Potency): exposio humana/potencial carcinognico em roedores

AVALIAO DO POTENCIAL MUTAGNICO DE AGENTES QUMICOS 1. TESTE DE AMES

avaliao in vitro de mutaes devido a genotoxicidade reverso da mutao em cepas de Salmonella typhimurium em relao auxotrofia para histidina variaes: adio de microssomas hepticos de mamferos (ativao metablica) potencial mutagnico: contagem de colnias (comparado com no de revertentes espontneos)

 linhagens: Salmonella typhimurium TA100 e TA102; presena e ausncia de ativao metablica (frao microssomal S9 de homogeneizado de fgado de ratos)

Resultados negativos para atividade mutagnica da talidomida. RM < 2,0

AVALIAO DO POTENCIAL MUTAGNICO DE AGENTES QUMICOS 2. ANLISE CITOGENTICA

anlise de cromossomos e presena de microncleos em linfcitos Efeitos: clastognicos (aberraes devido quebras cromossmicas) ou aneugnicos (nmero alterado de cromossomos)

Microncleo: so ncleos pequenos, separados e adicionais ao ncleo principal das clulas, produzidos durante a telfase da mitose por perda de fragmentos cromossmicos ou cromossomos inteiros.

AVALIAO DO POTENCIAL MUTAGNICO DE AGENTES QUMICOS 2. TESTE DO COMETA

detecta danos cromossmicos em clulas individuais alta sensibilidade, diversas aplicaes eletroforese em microgel e colorao (observao em M.O. fluorescncia) migrao do DNA: formao de cometa tamanho e intensidade de colorao da cauda proporcional ao dano ao DNA

AVALIAO DO POTENCIAL MUTAGNICO DE AGENTES QUMICOS 2. TESTE DO COMETA

Classificao do dano pela forma e tamanho da cauda

Testes de Genotoxicidade Ambiental

poluentes ambientais e a etiologia do cncer: 90% so carcinomas (clulas epiteliais contato com o ambiente) Evidncias: alta incidncia de tumores em funo de exposies ocupacionais ex.: angiosarcoma de fgado operrios de indstrias de cloreto de vinila cncer de pulmo operrios de fbricas de amianto em peixes: maior incidncia de tumores, aberraes cromossmicas, cncer em ambientes contaminados. Apenas 10% dos compostos qumicos sintticos foram avaliados quanto capacidade de causar mutao. No meio ambiente... diversas misturas podem ser formadas (composio complexa) importncia dos testes de genotoxicidade (~200 tipos atualmente)

Testes de Genotoxicidade Ambiental

Testes Microbianos: Teste de Ames o mais usado - padronizaes: USEPA, OECD, ISO; - Brasil: CETESB (norma tcnica L5.620) - em amostras ambientais: resultados expressos em nmero de revertentes por litro ou grama equivalente de amostra e, quanto maior esse nmero, maior a quantidade ou a potncia de compostos mutagnicos na amostra analisada. Efluentes e resduos slidos industriais
Classificao da genotoxicidade Baixa Moderada Alta Extrema Potncia teste de Ames Revertentes/L 100-1000 1.000-100.000 105 107 > 107 Revertentes/mg* 10-100 100-10.000 104 - 106 > 106 Baixa Moderada Alta Extrema

guas superficiais
Classificao da genotoxicidade Potncia teste de Ames Revertentes/L < 500 500 2.500 2.500 5.000 > 5.000

* mg de material orgnico extrado

Alguns compostos orgnicos cancergenos detectados pelo teste de Ames

Composto orgnico
4-Aminobifenila Benzidina 2-Naftilamina Aflatoxina Benzo[a]antraceno Benzo[a[pireno 4-cloro-o-toluidina Dibenzo[a,h]antraceno Metilmetano sulfonato N-nitrosodimetilamina N-etil-N-nitrosouria N-metil-N-nitrosouria N-nitrosodietilamina Benzo[b]fluoranteno 3,3'-Dimetoxibenzidina 4-Cloro-o-fenilenediamina CI Acid Red 114 CI Basic Red 9 Citrus Red N. 2 Disperse Blue 1 3,3'-Dimetilbenzidina HC Blue N. 1 2-Nitrofluoreno 2-Nitroanisole

Classificao de acordo com a IARC (International Agency for Research on Cancer)

Grupo 1 (composto comprovadamente cancergeno para humanos)

Grupo 2A (composto provavelmente cancergeno para humanos)

Grupo 2B (composto provavelmente cancergeno para humanos)

Testes de Genotoxicidade Ambiental

Outros Testes Microbianos: Induteste: induo do fago em Escherichia coli lisognica (WP2) Cromoteste: linhagem de E.coli (PQ37) com mutao no gene lacZ produo de -galactosidase proporcional ao potencial mutagnico da amostra resultados rpidos e complementares ao Teste de Ames

Organismos-sentinela e ambientes aquticos: mexilhes, ourios, animais bentnicos, esponjas, anfbios e peixes anlise citogentica em vrios tipos celulares: contagem de aberraes cromossmicas, trocas de fragmentos, microncleos. monitoramento ambiental: organismos de locais contaminados testes com animais de laboratrio; culturas de clulas in vitro.

Testes de Genotoxicidade Ambiental

Cantareus aspersus: exemplo de organismo-sentinela bioindicador

exposio de moluscos a poluentes atmosfricos em Canoas/RS: perodo: 7, 15 e 30 dias (invervo e vero) mostras analisadas: clulas de pulmo e hemolinfa classificao de danos (tamanho da cauda, n = 100 cls./amostra): 0 400 controle positivo: sangue exposto a radiao UV por 4 s. controle negativo: organismos mantidos no laboratrio durante mesmo perodo

Cantareus aspersus: exemplo de organismo-sentinela bioindicador

Danos em clulas de hemolinfa (inverno) Danos em clulas de hemolinfa (vero)

Danos em clulas de pulmo (inverno)

Danos em clulas de pulmo (vero)

maior sensibilidade de clulas pulmonares poluentes atmosfrico efeito proporcional exposio pouca influncia da estao do ano (temperatura, umidade); IQAr semelhantes

Testes de Genotoxicidade Ambiental

Plantas Superiores como Organismos Indicadores

Tradescantia sp.: organismo bioindicador de genotoxicidade efeitos de radiaes ionizantes poluentes atmosfricos efluentes industriais e amostras de solo contaminadas vantagens: planta de fcil adaptao e cultivo, perene, ampla distribuio Brasil: Tradescantia pallida a espcie mais comum Microncleos: visualizados em clulas-me de gros de plen em estgio de ttrade; deteco de agentes clastognicos (quebra cromossmica)

Plantas Superiores como Organismos Indicadores

plantas cultivadas e mantidas em laboratrio exposio em locais da cidade com trfego intenso n = 20 plantas, exposio por 30 horas inflorescncias colhidas e fixadas (etanol: c. actico, 3:1 v/v) por 24 h preparo das lminas e contagem (300 ttrades por lmina) Resultados: frequncia de microncleos e relao com material particulado (r = 0,94)

Plantas Superiores como Organismos Indicadores

Preparo de lminas de botes florais de Tradescantia pallida para visualizao de microncleos

Plantas Superiores como Organismos Indicadores