Pesquisa

ANIMAIS TRANSGNICOS

Fotos cedidas pelos autores

Gerao de animais geneticamente modificados no Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia (CEDEME) da UNIFESP-EPM

Figura 1. Camundongo Vitor, o primeiro camundongo transgnico gerado pela tcnica de microinjeo pronuclear no Brasil A criao do laboratrio de animais transgnicos da UNIFESP
Joo Bosco Pesquero
Ph.D. Biologia Molecular Departamento de Biofsica e Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia (CEDEME) Universidade Federal de So Paulo So Paulo, SP jbpesq@biofis.epm.br

Luiz Edmundo de Magalhes

Professor Titular de Gentica e Evoluo Departamento de Biologia do Instituto de Biocincias Universidade de So Paulo - USP

Heloisa Allegro Baptista

Ph.D. Biologia Molecular Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia (CEDEME) Universidade Federal de So Paulo So Paulo, SP allegro@biofis.epm.br

Regiane Anglica Sabatini

Departamento de Biofsica e Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia (CEDEME) Universidade Federal de So Paulo So Paulo, SP regiane@biofis.epm.br

A tecnologia para a gerao de animais transgnicos, apesar de j ser rotineiramente empregada em laboratrios comerciais e de pesquisa em muitos pases, desde as duas ltimas dcadas, ainda incipiente no Brasil. Pesquisadores de vrias reas vm utilizando esses animais com maior freqncia a cada dia, fazendo dessa tecnologia uma poderosa ferramenta no desenvolvimento de novas drogas teraputicas, na produo de molculas comercialmente importantes, na elucidao de mecanismos biolgicos, entre muitas outras aplicaes. Assim como no resto do mundo, a tendncia utilizao desses modelos cada vez maior no Brasil, o que aumenta a necessidade de implantarem-se laboratrios que dominem essa tecnologia a fim de fornecer modelos especiais aos pesquisadores nacionais, bem como dispor de biotrios capazes de realizar

a manuteno das linhagens j importadas, eliminando a dependncia de laboratrios do exterior. Com esse objetivo foi que, em 1996, o ento Diretor Tcnico e Coordenador Cientfico do CEDEME, Prof. Luiz Edmundo Magalhes, desenvolveu esforos para congregar pesquisadores e tcnicos interessados na produo de animais transgnicos, procurando criar uma equipe capaz de realizar essa nova e importante tarefa, quela poca ainda completamente indita no Brasil. Assim, os pesquisadores da UNIFESP, Prof. Joo Bosco Pesquero, recm-chegado da Alemanha, onde desenvolveu seu ps-doutoramento na gerao e caracterizao de vrios modelos transgnicos e o Prof. Lus Antnio Travassos, usurio de vrias linhagens transgnicas importadas, mantidas pelo CEDEME, foram convidados a integrar o grupo. A biloga, Dra. Helosa Allegro Baptista, j com experincia nas tcnicas de fertilizao in vitro, integrou-se ao CEDEME, tendo recebido treinamento na rea de gerao de animais transgnicos, na Argentina e na Alemanha. A criao de uma vaga de docente para o CEDEME possibilitou a contratao da Profa. Cllia Rejane Antnio, doutora em Bioqumica pela Universidade de So Paulo. Os alunos de ps-graduao Alberto Navarro e Regiane Sabatini, e os funcionrios do CEDEME, Satiko Okamoto e Gui Mi Ko tambm foram incorporados ao grupo. Em fevereiro de 2000, foi aprovado o projeto multiusurios da FAPESP intitulado Implantao de laboratrios para a produo e manuteno de animais transgnicos, sob a coordenao do Prof. Aron Jurkiewicz. Um ano

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e meio depois, os laboratrios de biologia molecular e de produo de animais transgnicos do CEDEME j estavam instalados, sendo ento gerados os primeiros embries quimricos de camundongo. Finalmente, em dezembro de 2001, Vitor, o primeiro animal transgnico produzido no Brasil pela tcnica de microinjeo pronuclear foi obtido. Esse fato representou um marco na produo nacional de animais transgnicos e iniciou definitivamente o projeto de fornecimento desses modelos pelo CEDEME, para pesquisadores da Universidade Federal de So Paulo, do Brasil e da Amrica Latina. Histrico dos animais transgnicos Antes do aparecimento das tcnicas de biologia molecular aplicadas gentica, os nicos modelos animais para se estudar a regulao e funo de genes e a compreenso dos sistemas biolgicos de mamferos eram os mutantes espontneos. Para se provar a base gentica da mutao, os animais tinham que apresentar um fentipo alterado e transmiti-lo para seus descendentes e posteriormente, tentativas eram feitas com o objetivo e se isolar os defeitos genticos de interesse. Com os avanos das tcnicas de biologia molecular e celular e da engenharia gentica, novas metodologias passaram a ser empregadas e tornouse possvel a manipulao do DNA, bem como a alterao controlada do genoma. Dessa forma, as tcnicas para a gerao de modelos transgnicos representaram uma das mais promissoras biotecnologias tanto para fins comerciais como para diversas reas da pesquisa bsica. Pouco antes da dcada de setenta, o termo transgnico comeou a ser utilizado na literatura cientfica em inmeros estudos mostrando a introduo de fragmentos de DNA in vitro em clulas procariticas e eucariticas e induo da expresso de genes em vrios tipos celulares (Gavrilova, 1967; Loyter e cols., 1975). Mais tarde, os transgnicos foram conceituados como animais ou organismos cujo patrimnio gentico fora manipulado artificialmente pela introduo, modificao Figura 2. Micromanipulador acoplado ao microscpio invertido utilizado na microinjeo de embries (em cima esquerda). Detalhe das agulhas de suco e injeo do sistema de micromanipulao (em cima direita). Fotografia de um oviduto retirado de uma fmea doadora contendo massa de embries no momento da coleta (embaixo esquerda, aumento de 20X). Microinjeo do DNA em um embrio contendo os prnucleos (embaixo direita, aumento de 400X) ou deleo de uma seqncia de DNA no seu genoma, incluindo a linhagem de clulas germinativas, de tal forma que essa alterao fosse transferida aos seus descendentes (Fukamizu, 1993). O termo transgnico, portanto, engloba animais que tiveram genes adicionados (transgnicos por adio), modificados (knockin) ou retirados (knockout). Em 1982, a primeira linhagem de camundongos transgnicos por adio foi produzida e caracterizada por Richard Palmiter, da Universidade da Pensilvnia, Ralph Brinster, da Universidade de Washington e colaboradores. Naquele estudo indito, os pesquisadores construram um DNA que continha uma cpia do gene do hormnio de crescimento de ratos sob o controle do promotor do gene de metalotionena-l capaz de dirigir a expresso do gene para vrios tecidos. Centenas de cpias dessa construo de DNA foram microinjetadas em embries de camundongos posteriormente transferidos para mes de aluguel. Dos vinte e um camundongos nascidos, sete carregavam a construo do gene exgeno, sendo que seis se desenvolveram mais rpido e atingiram um tamanho duas vezes maior que os controles no transgnicos. Esse resultado foi um marco no desenvolvimento de animais transgnicos, despertando grande ateno na mdia em todo o mundo, quando o camundongo gigante ficou famoso na capa da revista cientfica Nature (Palmiter e cols., 1982). O sucesso desse trabalho s foi possvel graas a estudos anteriores de outros pesquisadores que relatavam a introduo direta de material gentico exgeno em embries de camundongo antes mesmo do aparecimento das tcnicas de DNA recombinante. Em 1974, Rudolf Jaenisch e Beatriz Mintz confirmaram a presena de DNA exgeno em diversos tecidos de camundongos aps a microinjeo de DNA do vrus SV40 no interior da cavidade blastocstica de embries (Jaenisch e Mintz, 1974). A integrao de DNA exgeno nas clulas germinativas foi detectada em estudos posteriores aps a exposio de embries de camundongos ao retrovrus da leucemia murina de Moloney (Moloney murine leukemia virus, M-MuLV), que trans53

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rato e camundongo, sendo este ltimo o mais utilizado em pesquisas, por apresentar notveis vantagens como menor tamanho, custo de manuteno reduzido, embries de boa qualidade para manipulao, alm de ser uma das poucas espcies cuja manuteno de clulas-tronco indiferenciadas em cultura vivel, o que possibilita a retirada de genes por recombinao homloga e gerao de modelos knockout (Hammer e cols., 1985; Mullins e cols., 1990; Hammer e cols., 1990; Wall e cols., 1991; Pursel e cols., 1989; Hogan e cols., 1986). Outro fato importante que aponta para o uso cada vez maior dessa espcie o seqenciamento total de seu genoma recentemente finalizado. Aplicaes da tecnologia transgnica As aplicaes da tecnologia transgnica so inmeras e em diferentes campos de atuao. Em pesquisa bsica, no estudo da regulao e funo de seqncias genticas especficas. Em pesquisa biomdica, na criao de modelos animais de doenas humanas, entre elas, doenas cardiovasculares,auto-imuneseneurolgicas,AIDS e cncer. Animais com mutaes que mimetizem as principais caractersticas de uma determinada anomalia so um passo fundamental na pesquisa das doenas genticas. Tais modelos animais permitem o exame detalhado da fisiopatologia da doena, alm de servirem para delinear novas formas de tratamento, desenvolvimento de testes-diagnsticos, agentes teraputicos inovadores e em terapia gnica. Em indstria biotecnolgica, na produo de protenas recombinantes humanas valiosas, como enzimas, hormnios e fatores de crescimento, por animais domsticos que funcionam como biorreatores. Um exemplo bastante utilizado a produo de protenas no leite atravs da expresso dirigida s glndulas mamrias. Finalmente, o aspecto mais controverso do uso dessa tecnologia envolve o melhoramento gentico de animais domsticos de interesse econmico em larga escala, decorrente de modificao da anatomia e de fisiologia do animal, como, por exem-

Figura 3. Esquema da gerao de animais transgnicos pelo mtodo de microinjeo pronuclear

mitiram a alterao aos seus descendentes (Jaenisch, 1976 e 1977). Em 1980, Gordon e cols. Utilizaram, pela primeira vez, a microinjeo pronuclear de uma construo viral em embries recm-fertilizados para a gerao de um camundongo transgnico por adio (Gordon e cols., 1980). Os primeiros animais transgnicos knockout, produzidos pela tcnica de recombinao homloga em clulas54

tronco s foram gerados em 1987, por dois grupos diferentes (Doetschmann e cols, 1987; Thomas e Capecchi, 1987). Esses animais foram produzidos por mutao dirigida do gene da hipoxantina fosforibosil transferase. Desde ento, a aplicao das tcnicas de transferncia de genes tem tornado possvel a produo de animais transgnicos de diferentes espcies como boi, porco, ovelha, coelho,

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Figura 4. Esquema da construo de DNA utilizada para a gerao de animais transgnicos contendo regio promotora, regio codificadora e cauda poli-A. Na parte inferior da figura esto mostrados alguns promotores tecido-especficos. MLC = cadeia leve da miosina; GFAP = protena cida fibrilar glial; GHRH = Receptor do hormnio liberador de gonadotrofina; VEC = Clulas endoteliais vasculares; eNOS = Sintase de xido ntrico endotelial; MT = metalotionena; CMV = citomegalovirus plo, aumento da massa corprea, diminuio de gordura, resistncia a doenas, maior produo de carne, de leite, etc. Tcnicas utilizadas para gerao de animais transgnicos por adio Nos ltimos anos, vrias tcnicas tm sido utilizadas para produzir animais transgnicos por adio, entre elas, infeco de embries por vetores retrovirais (Nagano e cols, 2001), agregao de clulas-tronco embrionrias geneticamente modificadas (Gossler e cols., 1986; Wood e cols.,1993), transferncia de segmentos de cromossomos (Richa e Lo, 1989) e transferncia de DNA mediada por espermatozides (Lavitrano e cols., 1989). Atualmente, o mtodo utilizado pela maioria dos centros produtores de transgnicos a microinjeo pronuclear, a qual permite a introduo de seqncias de at 50 kb de diferentes espcies no genoma de mamferos. Alm disso, pela utilizao dessa tcnica, so geralmente obtidos altos nveis de expresso do transgene (Rulicke e Hubscher, 2000; Niemann e Kues, 2000). Microinjeo Pronuclear A gerao do camundongo Vitor O camundongo Vtor foi o primeiro animal transgnico no Brasil gerado por microinjeo pronuclear (Figura 1). Nessa tcnica, centenas de cpias do DNA exgeno so injetadas diretamente em um dos proncleos (masculino ou feminino) de embries recmfertilizados coletados do oviduto de fmeas doadoras superovuladas. Para tal, utiliza-se um micromanipulador acoplado a um microscpio invertido de alta resoluo (Figura 2). Aps a micromanipulao, os embries so transferidos para uma fmea receptora pseudo-grvida, que levar a termo o nascimento dos animais que sero, posteriormente, genotipados quanto presena do gene exgeno (Figura 3). A construo de DNA injetada composta por um promotor, uma regio codificadora do gene e uma regio 3 no traduzida (Figura 4). A especificidade da expresso do gene integrado obtida mediante o uso de promotores que dirigem a expresso do gene, podendo ser ubquos ou especficos. No primeiro caso, a expresso do gene acontece em uma grande variedade de tecidos e o objetivo estudar o

efeito da superexpresso geral de um gene. Um exemplo bastante utilizado o promotor do gene da metalotionena. No segundo caso, o promotor dirige a expresso do transgene para determinados tecidos ou clulas (Figura 4). Para a gerao do camundongo Vitor, foi utilizado o promotor da cadeia leve de miosina, o qual dirigiu a superexpresso do gene do receptor B2 de cininas de rato especificamente para o tecido cardaco do animal (Figura 5). Esse modelo ser utilizado para o estudo do papel protetor das cininas em patologias cardacas como hipertenso, hipertrofia e infarto, o que possibilitar o desenvolvimento de novas drogas e terapias. Perspectivas do CEDEME O objetivo do laboratrio de produo de animais transgnicos do CEDEME ser um fornecedor de modelos geneticamente modificados para todos os pesquisadores do Brasil e da Amrica Latina, bem como manter as linhagens transgnicas em condies isentas de patgenos especficos (SPF). A prxima etapa a ser conquistada a implantao das tcnicas de cultivo e transfeco de clulas-tronco, as quais possibilitaro a gerao de animais knockin e knockout. Alm disso, estar disponvel em pouco tempo o congelamento de embries, uma ferramenta extremamente importante que possibilita a salvaguarda de todas as linhagens convencionais e transgnicas geradas no prprio Centro ou adquiridas do exterior. Essa tcnica representar ainda uma economia considervel em termos de espao fsico para a manuteno das diferentes cepas de animais presentes no Centro. Referncias bibliogrficas Doetschman, T., Gregg, R.G., Maeda, N., Hooper, M.L., Melton, D.W., Thompson, S., Smithies, O. (1987) Targetted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells. Nature 330(6148):576578. Fukamizu, A. (1993) Transgenic animals in endocrinological investigation. J Endocrinol Invest 16(6):46155

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Figura 5. Esquema da construo de DNA utilizada para a gerao do camundongo Vitor, contendo o promotor da cadeia leve da miosina e o gene do receptor B2 das cininas de rato. Na parte inferior da figura, est mostrado um Southern blot utilizado para a deteco especfica do gene B2 das cininas do rato (BKB2) 473. Gordon, J.W., Scangos, G.A., Plotkin, D.J., Barbosa, J.A., Ruddle, F.H. (1980) Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 77(12):7380-7384. Gossler, A., Doetschman, T., Korn, R., Serfling, E., Kemler, R. (1986) Transgenesis by means of blastocyst-derived embryonic stem cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A 83(23):9065-9069. Gavrilova, T.N. (1967) The contents of labeled DNA in nerve cells of mice of different ages after introduction of H3-thymidine in the period of embryogenesis. Tsitologiia 9(1):68-72. Hammer, R.E., Pursel, V.G., Rexroad, C.E. Jr., Wall, R.J., Bolt, D.J., Ebert, K.M., Palmiter, R.D, Brinster, R.L. (1985) Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature 315(6021):680683. Hammer, R.E., Maika, S.D., Richardson, J.A., Tang, J.P., Taurog, J.D. (1990) Spontaneous inflammatory disease in transgenic rats expressing HLA-B27 and human beta 2m: an animal model of HLA-B27associated human disorders. Cell
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