MANUAL DE AULAS PRÁTICAS EM

BIOTECNOLOGIA

Prof. Guilherme Araújo Lacerda

Biólogo CRBIO 44480/04-D - FUNEDI/UEMG
Mestre em Biotecnologia - UNINCOR
Doutor em Agronomia/Fisiologia Vegetal - UFLA

Montes Claros - MG
2016
L131m Lacerda, Guilherme Araújo
2009
2016 Manual de aulas práticas em bases
Biotecnologia...
celulares.../ /Gui-
Gui-
lherme Araújo Lacerda. – Montes
Divinópolis
Claros
: UNIFENAS,
: SOEBRAS,Fa- Fa-
culdade de
culdades Integradas
Biomedicina,
do Norte
2009.de Minas, 2016.
58 f.: il.; color.
17

1. Análises
1. célula.
ambientais.
2. 2.DNA.
Águas. 3.
3. Práticas.
Eletroforese.
4. Amos- 4.
Amotragem.
tragem. I. Lacerda,
I. Lacerda,
Guilherme
GuilhermeAraújo.
Araújo.
II. II.Universidade
Faculdades
Integradas
José do Rosário
do Norte
Vellano,
de Minas,
Faculdade
Faculdade
de Biomedicina.
de Engenharia
III.
Biomédica.
Título. III. Faculdades de Saúde Ibituruna, Faculdade
de Engenharia de Alimentos.
Título. CDU: 543.3

CDU: 543.3
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SUMÁRIO
NORMAS DE COMPORTAMENTO PARA USO DO LABORATÓRIO .............. 4
ROTEIRO PARA RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS ..................................... 6
Prática 1. Tipagem sanguínea no sistema ABO e Rh ...................................... 11
Prática 2. Extração do DNA genômico a partir de células epiteliais bucais
utilizando acetato de amônio ............................................................................ 13
Prática 3. Eletroforese ...................................................................................... 16

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NORMAS DE COMPORTAMENTO PARA USO DO
LABORATÓRIO

1 - Ao início das aulas práticas:

- Coloque os materiais que não terão utilidade durante a aula nos escaninhos
ou locais nos laboratórios destinados para tal fim;

- Vista o jaleco e apanhe os equipamentos de proteção individuais necessários;

2 - Durante as aulas práticas:

- Mantenha sempre uma postura tranquila, organizada e educada dentro do

laboratório;

- Manipule, cuidadosamente, os instrumentos de trabalho;

- Ao requisitar o auxílio do professor, técnico ou estagiário, espere sua vez com

tranquilidade;

- Esteja atento às Normas de Biossegurança;

3 - Ao final das aulas práticas:

- Organize a sua bancada de trabalho;

- Descarte o resíduo gerado durante a prática em lixeira apropriada;

- Retire o jaleco antes de deixar o laboratório.

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É estritamente PROIBIDO:

- Comer, fumar ou beber dentro do laboratório;

- Assistir aulas sem jaleco;
- Escrever nas mesas, bancadas, paredes, bancos ou qualquer outro lugar não
destinado para tal fim.

EM CASO DE DÚVIDAS OU PROBLEMA, PROCURE SEMPRE SEU

PROFESSOR OU TÉCNICO.

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ROTEIRO PARA RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS

Observações gerais:

- o tempo verbal deve ser padronizado num texto. Uma vez passado, sempre
passado...

- tente usar a terceira pessoa e evitar “no nosso experimento”, “meus

resultados” “pipetamos” etc.... preferir “no experimento realizado .....” , “os
resultados obtidos ....”

- defina os itens do seu relatório com clareza. Agrupe assuntos semelhantes e

separe assuntos não relacionados. Use subitens para organizar melhor os
assuntos;

- sempre procure numerar os itens para facilitar o acompanhamento da

hierarquia dos itens (se a hierarquia for importante, evite marcadores);

- use termos técnicos;

- respeite a grafia corretas de nomes científicos;

- padronize a formatação: tamanhos e tipos de letras, tanto no texto quanto nos

títulos; procure usar parágrafos alinhados pelas duas margens (esquerda e
direita); mantenha sempre a mesma quantidade de espaços entre parágrafos e
títulos, etc;

- não enfeite demais seu relatório. Ele é um texto técnico e deve ter aspecto
profissional. È bom ter uma capa com: Nome da Instituição, nome da disciplina,
nome do professor, título da prática (ou práticas), integrantes do grupo e turma,
cidade/estado e data.

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1. Introdução
Um ou dois parágrafos rápidos para contextualizar o assunto de que
tratou a prática e do qual tratará o relatório. Não é propriamente um resumo
mas uma introdução ao assunto. Apenas informações relevantes ao trabalho
devem ser apresentadas!

2. Objetivo
Descrição do objetivo da prática. Pode haver mais de um objetivo, um
mais geral e outro(s) específicos(s).
Normalmente os objetivos são apresentados como ações “obter”, “extrair”,
“observar”, “analisar”, “caracterizar” etc

Exemplo:
Objetivo geral: “Apresentar diferentes técnicas de extração de DNA”.
Objetivo específico: “Extrair DNA genômico de Escherichia coli”.

3. Material e Métodos
Descrição do material (é material mesmo e não materiais) e dos
procedimentos (que são os métodos) utilizados na aula.
Pode estar subdividido em itens como: “Material”, “Reagentes e
soluções”, “Material”, “Equipamentos”, etc. Ou seja, o material pode estar
descrito num subitem independente ou pode estar incluído na descrição do
procedimento.

Exemplo:
“Ressuspender o pelete em 50 mL de tampão TE (Tris 10mM, EDTA
1mM, pH=8,0) utilizando pipeta automática Gilson modelo P200”
A composição do tampão TE e o modelo de pipeta utilizado poderiam
ser descritos num item anterior à descrição do procedimento.
O tempo verbal utilizado no material e métodos pode ser o passado (o
que foi feito) ou o infinitivo (“ressuspender”, “pipetar”, “adicionar”, etc). A
descrição deve ser sempre no impessoal (ex.: “Foi adiconado” ou “adicionou-
se” ao invés de “Eu adicionei” ou “Adicionamos”)

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4. Resultados e Discussão
Podem estar agrupados em um único item ou não. Em itens separados,
os resultados são primeiro descritos e depois, no item de Discussão, são
analisados.
A apresentação dos resultados é uma das partes mais difíceis do
relatório pois você deve descrever os resultados obtidos sem incluir
necessariamente a interpretação desses resultados. Normalmente os
resultados são apresentados em figuras, esquemas, tabelas, gráficos etc que
apresentam legendas próprias (Por exemplo, Figura 1: Representação
esquemática do resultado do fracionamento de DNA genômico de bactéria E.
coli em gel de agarose 1%. (1) grupo 1; (2) grupo 2 etc etc (a numeração
corresponde aos slots do gel – que devem estar marcados no esquema).
A descrição do que está na figura deve ser apresentada de forma
descritiva no texto, por exemplo: “ Os DNAs genômicos de E. coli cepa tal e tal
foram obtidos pela técnica xyz. Cada grupo realizou seu próprio procedimento
segundo as orientações descritas em material e métodos ( é lá que a descrição
do procedimento deve ficar). Os resultados do fracionamento do DNA
genômico de E. coli estão apresentados na figura 1 e mostraram (ou mostram)
a presença de DNA em todas as amostras analisadas. Três bandas foram
facilmente visualizadas, uma mais próxima aos “slots” e outras duas próximas
uma da outra no final do gel, numa região onde também foi observado uma
espécie de rastro difuso de material.”
Você deve considerar que a pessoa que está lendo o relatório não
conhece o assunto, não fez o procedimento e não tem a menor idéia do que
está sendo apresentado nos resultados. O segredo é ser o mais direto e
sintético possível, sem omitir nenhum tido de informação que ajude a
compreensão dos resultados (QUE CORRESPONDEM A PARTE MAIS
IMPORTANTE DO RELATÓRIO).
Nos trabalhos científicos, a discussão dos resultados é feita
comparando-se os resultados encontrados com outros já obtidos anteriormente
por outros trabalhos. O objetivo da discussão dos resultados é mostrar se estes
foram os esperados ou não, se atenderam ao objetivo inicial do trabalho ou

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não, se trouxeram novas informações ao que já se conhecia ou não, se são
suficientes para definir o assunto de que tratam ou se há necessidade de
trabalhos complementares e quais são eles.
Num relatório de aula prática, a discussão deve ser relacionada aos
problemas encontrados durante a realização da prática e aos seus possíveis
reflexos nos resultados, assim como à providências para minimizar esses
problemas.

5. Conclusão
A conclusão do relatório diz respeito diretamente ao seu objetivo. Em
suma este item deve dizer se o objetivo foi alcançado ou não.

6. Bibliografia
Citar toda a bibliografia consultada de acordo com os modelos abaixo:

Artigo científico com link:

ALENCAR, L. H.; ALMEIDA, A. T.; MOTA, C. M. M. Sistemática proposta para

seleção de fornecedores em gestão de projetos. Gestão & Produção, São
Carlos, v. 14, n. 3, set./dez. 2007. Disponível em:
<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0104-
530X2007000300005&lng=pt&nrm=iso>. Acesso em: 19 set. 2008.
Artigo científico impresso:

OTANI, M.; MACHADO, W. V. A proposta de desenvolvimento de gestão da

manutenção industrial na busca da excelência ou classe mundial. Revista
Gestão Industrial, Ponta Grossa, v. 4, n. 2, p. 1-16, abr./jun. 2008.

Teses, dissertações ou monografias:

ANDUJAR, A. M. Modelo de qualidade de vida dentro dos domínios bio-

psico-social para aposentados. 2006. 206 f. Tese (Doutorado em Engenharia
de Produção) – Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Produção,
Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2006.

Capítulo de livro:

CARVALHO, V. R. Qualidade de vida no trabalho. In: OLIVEIRA, O. J. (Org.).

Gestão da qualidade: tópicos avançados. São Paulo: Thomson, 2004.

Livro:

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KALAKOTA, R.; ROBINSON, M. E-business: estratégias para alcançar o
sucesso no mundo digital. 2. ed. Porto Alegre: Bookman, 2002.

Trabalho (resumo ou completo) em evento científico:

RAMOS, A. S. M.; MIRANDA, A. L. B. Processos de adoção de um sistema

integrado de gestão: uma pesquisa qualitativa com gestores da Unimed/Natal.
In: ENCONTRO NACIONAL DE ENGENHARIA DE PRODUÇÃO, 23., 2003,
Porto Alegre. Anais... Porto Alegre: ABEPRO, 2003.

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Prática 1. Tipagem sanguínea no sistema ABO e Rh

1. INTRODUÇÃO
Você sabe qual é seu tipo sanguíneo? Conhece alguém que já fez uma
transfusão? Até o final elo século passado, ninguém sonharia em fazer
perguntas como estas. Para todos os defeitos, sangue era igual, fosse de gente
ou de bicho. E as transfusões eram experiências arriscadas, às vezes até
mortais. As coisas começaram a mudar em 1901, quando o patologista e
imunologista austríaco Karl Landsteiner (1868-1943) percebeu diferenças nos
glóbulos vermelhos, as hemácias. Elas variavam ele acordo com a presença ou
ausência de certas substâncias na membrana celular, às quais ele chamou de
antígenos A e B. Uma descoberta que lhe valeu o prêmio Nobel de Medicina,
no dia 12 de dezembro de 1930. Aos antígenos correspondiam moléculas de
defesa circulantes no soro, batizadas de anticorpos anti-A e anti-B. Partindo
dessas conclusões, Landsteiner classificou os tipos sanguíneos em grupos A
(com antigenos A e anticorpos anti-B), B (com antígenos B e anticorpos anti-A),
AB (com antígenos A e B e sem anticorpos) e O (sem antígenos e com
anticorpos anti-A e anti-B). Na prática, isso significa que, se uma pessoa com
sangue A recebe tipo B, seus anticorpos destroem as hemácias do doador.
Desse processo resultam produtos tóxicos que alteram o funcionamento do
coração, dos rins e do fígado, causando até a morte. Os revolucionários
achados de Landsteiner melhoraram sensivelmente a segurança das
transfusões, mas reações indesejáveis continuavam ocorrendo em cerca de
15% dos casos. Esse último mistério foi desvendado em 1939, quando se
descobriu que, além dos antígenos A e B, as hemácias apresentam o D,
batizado de fator Rh, que pode ser positivo ou negativo.

2. OBJETIVO
Avaliar as aglutinações em lâmina de vidro a partir de amostras de
sangue classificando-as nos sistemas ABO e Rh.

3. MATERIAL

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 1 Lâmina;
 1 Par de luvas para procedimento (uso pessoal);
 1 lanceta;
 1 alça de plástico;
 Papel toalha;
 Algodão;
 Álcool 70%;
3.1 Reagentes e soluções
 Anticorpos anti-A, anti B e anti-D.

4. MÉTODOS
1) Realizar a coleta de 3 gotas de sangue por punção digital;
2) Gotejar separadamente pela lamínula;
3) Gotejar em seqüências os anticorpos anti-A, anti B e anti-D e tabelar os
resultados de todos os colegas com alguns possíveis genótipos.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

LORETO, E.L.S.; SPEL, L.M.N. Atividades experimentais e didáticas de

Biologia Molecular e Celular. 2ª Ed. São Paulo: Editora da Sociedade
Brasileira de Genética, 2003. 82p.

UNESP. Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Odontologia. Mucosa

Bucal. Disponível em <http://www.foar.unesp.br/Atlas/Res_mucosa_bucal.htm>
Acesso em 07 de Mar de 2010.

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Prática 2. Extração do DNA genômico a partir de

células epiteliais bucais utilizando acetato de amônio

1. INTRODUÇÃO
Células bucais são fontes convenientes de DNA para diagnóstico e
estudos epidemiológicos. A presente metodologia teve como objetivo avaliar
um método simples e prático para obter células epiteliais, através de
bochechos, a fim de serem usadas como fonte de DNA, avaliar a estabilidade
do DNA na solução de bochecho. Os procedimentos usados nesta prática
evitam o uso de solventes orgânicos permitindo uma prática laboratorial mais
segura (MARISI, 2006).

2. OBJETIVO
Extrair o DNA humano a partir de uma amostra das células bucais pelo
protocolo adaptado de Marisi (2006).

3. MATERIAL
 1 copo plástico de café;
 1 luva para procedimento (uso pessoal);
 1 tubo de ensaio com tampa para centrífuga;
 1 Proveta de 10 mL;
 1 Béquer de 50 mL;
 Pipetas automáticas 100-1000 µL;
 Ponteiras 100-1000 µL;
 Centrífuga;
 Banho-maria 55º C;
 Papel toalha;
 Espectrofotômetro;
3.1 Reagentes e soluções
 Solução TNE [17 mM Tris-HCL (pH 8,0), 50 mM NaCl, 7 mM EDTA]
diluído em etanol 66%;

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 Solução de lise [10 mM Tris (pH 8,0), 0,5% Tween, 5 mM EDTA e
proteinase K (20 mg/mL)];
 Solução tampão TE [10 mM Tris (pH 7.8) e 1 mM EDTA]
 Solução de acetato de amônio 8 M
 Solução de 1mM de EDTA;
 Isopropanol;
 Etanol 70% gelado.

4. MÉTODOS
4.1 Extração purificação
1) Coletar o bochecho com 5 mL de dextrose 3% do paciente;
2) Adicionar a amostra 3 mL de solução TNE [17 mM Tris-HCL (pH 8,0), 50 mM
NaCl, 7 mM EDTA] diluído em etanol 66%;
3) As células bucais serão centrifugadas por 10 minutos a 3000 rpm em
temperatura ambiente;
4) O sobrenadante será decantado para evitar perda do pellet;
5) Para segunda lavagem adicionar 1 mL de TNE e centrifugar novamente por
5 minutos a 2000 rpm;
6) Ressuspender em 1,3 mL de solução de lise e agitar por 5 minutos;
7) Incubar a 55ºC durante toda a noite (overnigth) em banho-maria;

Continua...
_______________________________________________________________
Continuação...

8) Depois da incubação transferir 1,4 mL da mistura e adicionar 500 µL de

solução de acetato de amônio 8 M e 500 µL 1mM de EDTA seguida por
centrifugação 1700 g por 10 minutos;
9) Transferir 900 µL de sobrenadante para precipitar o DNA com 500 µL de
isopropanol;
10) Ressuspender o DNA vertendo levemente os tubos cerca de 20 vezes
seguida por centrifugação 1700 g por 5 minutos;
11) O sobrenadante será descartado e cada tubo será vertido sobre o papel
toalha;

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12) Adicionar 2 mL de etanol 70% gelado e ressuspender o DNA vertendo
levemente os tubos cerca de 20 vezes, seguindo-se por centrifugação 1700 g
por 5 minutos;
13) Cada tubo será novamente vertido sobre o papel toalha e seco ao ar (ou
em capela) durante 45-60 minutos;
14) Ressuspender o DNA em 100 µL de solução tampão TE [10 mM Tris (pH
7.8) e 1 mM EDTA].

4.2 Mensuração da concentração do DNA

1) Realizar a leitura em espectrofotômetro no comprimento de 260nm/280nm e
usar a fórmula:
[DNA]ng/mL= 50 mg/mL x CO x FD x A260
sendo:
[DNA]ng/mL= concentração de DNA em ng/mL;
CO = caminho ótico (cm);
FD = fator de diluição;
A260= absorbância a 260 nm.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

MARISI, Aidar. Extração do DNA genômico a partir de células epiteliais

bucais utilizando acetato de amônio. Dissertação de Mestrado. Universidade
Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de PiracicabaPiracicaba, SP
:[s.n.], 2006.

GUIMARÃES, N.C.C. Identificação de variantes somaclonais em

bananeiras ‘Prata Anã’, utilizando técnicas moleculares e citogenéticas.
2005. 50p. Dissertação (Mestrado em Agroquímica e Agrobioquímica) –
Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.

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Prática 3. Eletroforese

1. INTRODUÇÃO
A eletroforese trata-se da separação de macromoléculas em um campo
elétrico (movimento de partículas por uma força elétrica). Primitivamente:
misturas de proteínas dissolvidas eram colocadas em um canal cheio de
tampão e submetidas a corrente elétrica. A resolução era baixa e o aparelho
“imexível”. Com o surgimento das matrizes - os géis - houve um grande
aperfeiçoamento. Ornstein (1964) e Davis (1964) trabalharam com gel de
concentração, com melhora da resolução. Weber e Osborn (1969) e Läemmli
(1970) fazem o uso de géis de poliacrilamida, para controle da separação por
tamanho molecular, e do SDS, para desnaturar proteínas.

2. OBJETIVO
Visualizar a técnica de eletroforese com diferentes cargas de alguns
aminoácidos.

3. MATERIAL
 1 cuba horizontal para eletroforese;
 Papel toalha;
 1 pipeta automática 10 µL;
 ponteiras 20 µL;
 Fonte elétrica;
 Cama para preparo do gel;
 Fita crepe;
 Pente para preparo do gel;
 1 g de Agarose
3.1 Reagentes e soluções
 Solução de Cisteína (polar, não carregado, hidrofílicos);
 Solução de Fenialalanina (não polar, hidrofóbicos);
 Solução de Lisina (polar, positivamente carregado, hidrofílicos);
 1 L de TAE (Tris + ácido acético + EDTA) 5X;

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 Tampão de corrida da amostra;

4. MÉTODOS
4.1 Preparação do gel de agarose
1) Pesar 1 g de agarose e adicionar a 100 mL de TAE 5X, aquecer em
microondas ou chapa aquecedora até o ponto de polimerização;
2) Colocar na cama isolada com a fita crepe e o pente fixado;
3) Aguardar cerca de 15-30 min a polimerização e retirar o pente dentro da
cuba contendo o tampão de corrida (TAE 5X).
4.2 Aplicação das amostras e corrida
1) Pipetar 10 µL de cada amostra (aminoácido) e adicionar 10 µL de tampão da
amostra em um tubo plástico;
2) Pipetar 10 µL do volume em cada canaleta do gel;
3) Cobrir a cuba, ligar os eletrodos em seus devidos polos;
4) Ligar a fonte e anotar os parâmetros como voltagem e amperagem, deixar o
sistema por 10-30 min.;
5) Após a corrida fotografar, anotar e discutir os resultados qualitativos.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

DAVIS, B.J. 1964. Disk electrophoresis. II. Method and Application to human
serum proteins. Annals of the New York Academy of Sciences 121: 404-427.

LAEMMLI, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of

the head of bacteriophage T4. Nature. Aug 15;227(5259):680-5.

ORNSTEIN, L. 1964. Disk electrophoresis. I. Background and theory. Annals of

the New York Academy of Sciences 121: 321-349.

WEBER, K.; OSBORN, M. 1969. The reliability of molecular weight

determinations by Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel electrophoresis. J.
biol. Chem., 244, 4406.

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