PRODUO DE ANTICORPOS POLICLONAIS ANTI-RICINA* Roselayne Ferro Furtado1; Rosa Amlia Fireman Dutra2; Carlucio Roberto Alves3; Maria

Izabel Florindo Guedes3; Mayrla Rocha Lima3; Vitor Paulo Andrade da Silva3 Agroindstria Tropical, roselayne@cnpat.embrapa.br; 2Universidade Estadual de Pernambuco, rfiremandutra@yahoo.com.br; 3Universidade Estadual do Cear, alvescr@yahoo.com, florinfg@terra.com.br, lia-lima@hotmail.com, vitorvolt@hotmail.com
1Embrapa

RESUMO - O trabalho teve o objetivo de produzir anticorpos policlonais anti-ricina e avaliar os mesmos visando uma futura aplicao em mtodos sorolgicos de deteco de ricina presente em torta de mamona submetida a processo de destoxificao. A torta foi preparada em laboratrio e utilizada em procedimentos de extrao e purificao da ricina. Consecutivamente, inoculaes de ricina retiradas de gel de poliacrilamida foram administradas em coelhos para produo dos anticorpos. Ao final, os anticorpos anti-ricina foram analisados quanto sensibilidade e especificidade. Palavras-chave: Ricina, anticorpos policlonais, ensaio sorolgico

INTRODUO A torta da mamona tem elevado valor nutritivo, sendo rica em protenas, fibras, minerais e gordura (BELTRO, 2003). Por apresentar essas caractersticas a torta da mamona apresenta grande potencial para ser utilizada como rao na pecuria. Porm, para ser utilizada como alimento, ela precisa passar por um processo de destoxificao, para eliminao de substncias presentes na semente com propriedades de toxicidade ou alergenicidade. Entre essas substncias pode-se destacar a ricina, uma protena inibidora de ribossomos (RIP) do tipo II, heterodimrica. A ricina constituda de enzima inibidora de ribossomo (aproximadamente 32 kDa, cadeia A ou RTA) ligada por ponte dissulfeto a uma lectina galactose (aproximadamente 34 kDa, cadeia B ou RTB) (LORD et al., 1994). A toxicidade desta protena conhecida no mundo inteiro, sendo cerca de cem vezes maior quando administrada pela rota parenteral. As doses letais mnimas de ricina injetada para camundongos varia entre 5 a 10 g/kg e para cachorros varia entre 1 a 1,75 g/kg (FODSTAD et al., 1979). A ingesto de cerca de cinco sementes de mamona pode ser letal para seres humanos (OLSNES, 2004). Diante deste contexto, embora o processo de destoxificao da torta de mamona seja considerado eficaz, recomenda-se uma anlise rpida quanto presena de ricina que ateste a atoxicidade da torta a cada processamento, visto que o procedimento pode no ter sido satisfatoriamente realizado e quantidades mnimas da protena so suficientes para conduzir animais a bito.

As principais tcnicas de determinao da ricina empregadas se baseiam em mtodos sorolgicos, cromatogrficos e eletroforticos. Os mtodos sorolgicos, isto , mtodos que empregam anticorpos, ganham cada vez mais importncia no meio cientfico por serem bastante sensveis e especficos na deteco de patgenos e contaminantes. Atualmente, sabe-se que anticorpos so capazes de detectar uma molcula de um antgeno protico dentre mais de 108 molculas similares (JANEWAY et al., 2007). Diferentes mtodos sorolgicos podem ser utilizados na deteco de um determinado antgeno (molcula que se liga especificamente a um determinado anticorpo), sendo o imunoenzimtico ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) o mais comumente utilizado. Diferentes kits comerciais, a maioria deles importados, empregam o princpio do ELISA no diagnstico de doenas e deteco de contaminantes. Este trabalho teve o objetivo de produzir e avaliar a sensibilidade e especificidade de anticorpos anti-ricina pelo mtodo de ELISA e tcnica de Western blot, respectivamente.

MATERIAL E MTODOS As sementes de mamona da cultivar Nordestina do Banco de Germoplasma da Embrapa Algodo foram utilizadas para a preparao da torta de mamona e extrao da ricina. A ricina foi extrada segundo metodologia de Funatsu et al. (1971) e Tavares (1998). Os anticorpos foram produzidos em coelho da raa Nova Zelndia com aproximadamente seis meses de idade. Os coelhos foram imunizados via subcutnea com 93 g de ricina, retiradas de gel de poliacrilamida em condies desnaturantes, adicionado do reagente de Freuds. Como controle do ensaio, antes da primeira inoculao, foi feita uma sangria de cerca de 10 mL para a coleta do soro pr-imune. Sangrias do animal foram realizadas a cada sete dias para a coleta do soro, e trs semanas aps a primeira imunizao foi aplicado um reforo com a mesma quantidade de protena da imunizao inicial. A sangria foi realizada at o 42 dia aps a imunizao do animal e os soros obtidos foram armazenados a -4C. Para testar a sensibilidade e especificidade dos anticorpos produzidos realizou-se o mtodo de ELISA indireto (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) e a tcnica de Western blot, respectivamente. Para o ensaio de ELISA, as placas foram sensibilizadas com 0,3 g do antgeno (ricina)/poo e bloqueadas com PBS-BSA (albumina srica bovina) (1%). O estudo do nvel de deteco dos anticorpos policlonais produzidos (ttulo) foi realizado a partir da diluio inicial dos anticorpos na proporo 1:100, calculando-se o cut off do ELISA (mdia das absorbncias negativas para cada ttulo mais trs vezes o desvio padro das mdias).

Para o Western blot foi utilizada a membrana de nitrocelulose e gel de poliacrilamida a 12,5% em condies nativas. Utilizou-se para este ensaio extrato bruto de mamona. A transferncia das protenas do gel para a membrana de nitrocelulose foi realizada por duas horas aplicando 38 mA e 38 V. O bloqueio foi feito com PBS (tampo fosfato de sdio) adicionado de leite desnatado 5% e a diluio dos anticorpos primrios foi de 1:100 em PBS (indicar uma referncia).

RESULTADOS E DISCUSSO A cintica dos anticorpos do animal imunizado inicialmente com 93 g apresentou produo de anticorpos crescente at o 21 dia e aps a aplicao do reforo (mais 93 g), neste mesmo perodo, verificou-se diminuio progressiva na quantidade de anticorpos. Diante disso, verificou-se que a dose de 93 g estimulou satisfatoriamente a produo de anticorpos (Figura 1). O estudo do ttulo dos anticorpos produzidos pelo coelho imunizado mostrou alta sensibilidade para os soros coletados aos 7, 14, 21 e 28 dias, visto que reagiram at a diluio 1:12.800. O soro de 35 dias reagiu at 1:6400 e o de 42 dias at 1:800 (Figura 2). A tcnica de Western blot se baseia no reconhecimento da protena pelos anticorpos contidos no soro aps transferncia para membrana de nitrocelulose. Verificou-se que a partir do 14 dia houve a visualizao de bandas de peso molecular correspondente ao da ricina (cerca de 66 kDa) na membrana de nitrocelulose, indicando a especificidade dos anticorpos produzidos para deteco de ricina frente a outras protenas extradas da torta de mamona (Figura 3).

CONCLUSO A anlise dos anticorpos policlonais produzidos indicou alta sensibilidade e especificidade dos mesmos na deteco de ricina.

Os autores agradecem ao FINEP pelo apoio financeiro.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS BELTRO, N. E. de M. Informaes sobre o biodiesel, em especial feito com o leo de mamona. Campina Grande: Embrapa Algodo, 2003. 3 p. (Embrapa Algodo. Comunicado Tcnico, 177).

FODSTAD, O.; OLSNES, S.; PIHI, A. Toxicity, distribution and elimination of the cancerostatic lectins abrin and ricin after parenteral injection into mice. British Journal of Cancer, v. 34, p. 418-425, 1976.

FUNATSU, M.; FUNATSU, G.; ISHIGURO, M. M.; NANNO, S.; HARA, K. Structure and toxic function of ricin. Proc. Japan. Acad, n. 91, p. 713-717, 1971.

JANEWAY, C. A.; TRAVERS, P.; WALPORT, M.; SHLMCHIK, M. J. Imunobiologia: o sistema Imunolgico na sade e na doena. Porto Alegre: Artmed, 2007. 848 p.

LORD, J. M.; ROBERTS, L. M.; ROBERTUS, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. The FASEB journal, v. 8, p. 201-208. 1994.

OLSNES, S. The history of ricin, abrin, and related toxins. Toxicon, v. 44, p. 361-370, 2004. TAVARES, R. O. Galactomanana de Adenanthera pavonina L.: aplicao para o isolamento de lectinas galactose-especficas. 1998, 85 f. Dissertao (Mestrado em Bioqumica) - Universidade Federal do Cear, Fortaleza.
1,2 1
Absorbncia (492 nm)

0,8 0,6 0,4 0,2 0 Pr-imune 7 dias 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias

Figura 1. Cintica de anticorpos de coelho anti-ricina. Os soros foram diludos 1:100, aps imunizao com 93 g de ricina e reforo com mesma quantidade ao 21 dia.
1,2

Absorbancia (492 nm)

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200* 1/6400* 1/12800* Ttulo dos anticorpos

Pr-imune 7 dias 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias

Figura 2. Determinao do grau de titulao dos anticorpos produzidos por coelho imunizado com 93 g de ricina retirada de gel de poliacrilamida e reforo com mesma quantidade ao 21 dia.

Figura 3. Eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5% desnaturante com protenas totais presentes na torta de mamona (A); Western blot das protenas totais da torta de mamona utilizando o anticorpo policlonal de coelho (B).