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VIROLOGIA VETERINRIA

Eduardo Furtado Flores (ORG.)

VIROLOGIA VETERINRIA

Santa Maria, 2007

Reitor Vice-reitor Diretor da Editora Conselho Editorial

Clovis Silva Lima Felipe Martins Mller Honrio Rosa Nascimento Ademar Michels Daniela Lopes dos Santos Eduardo Furtado Flores Eliane Maria Foleto Maristela Brger Rodrigues Honrio Rosa Nascimento Jorge Luiz da Cunha Marcos Martins Neto Ronai Pires da Rocha Silvia Carneiro Lobato Paraense Maristela Brger Rodrigues Luzia de Lima Santanna Marcio Oliveira Soriano sobre fotograa de microscopia eletrnica de clulas de cultivo infectadas com herpesvrus bovino. Carolina Isabel Gehlen Lase Miolo Morais, Marcio Oliveira Soriano, Eduardo Furtado Flores

Reviso lingstica Normalizao referncias bibliogrcas Capa Projeto grco e diagramao Ilustraes

V819

Virologia veterinria / Eduardo Furtado Flores (organizador). Santa Maria : Ed. da UFSM, 2007. 888 p. ; 30 cm. 1. Medicina veterinria 2. Virologia I. Flores, Eduardo Furtado CDU 619:578

Ficha catalogrca elaborada por Maristela Eckhardt CRB-10/737 Biclioteca Central da UFSM

Direitos reservados : Editora da Universidade Federal de Santa Maria Prdio da Reitoria - Campus Universitrio Camobi - 97119-900 - Santa Maria - RS Fone/Fax: (55) 3220.8610 e-mail: editora@ctlab.ufsm.br www.ufsm.br/editora

COLABORADORES

Alice Aleri, MV, MSc. Doutor Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Estadual de Londrina (UEL) Londrina, PR, Brasil. 86051-970. aleri@uel.br

Cludio Wageck Canal, MV, MSc. Doutor Departamento de Patologia Clnica Veterinria Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Porto Alegre, RS, Brasil. 91540-000 claudio.canal@ufrgs. br

Amauri A. Aleri, MV, MSc.Doutor Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Estadual de Londrina (UEL) Londrina, PR, Brasil. 86051-970. aleri@uel.br

Diego Gustavo Diel, MV, MSc. Laboratrio de Virologia Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 diegodiel@pop.com.br

Ana Cludia Franco, MV, MSc.,PhD Departamento de Microbiologia Instituto de Cincias Bsicas da Sade Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Porto Alegre, RS, Brasil. 90050-170 anafranco@ufrgs.br Elisabete Takiuchi, MV., MSc. Doutor Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Estadual de Londrina (UEL) Londrina, PR, Brasil. 86051-970 elisabete.takiuchi.@gmail.br

Ana Paula Ravazzolo, MV, D.Sc. Faculdade de Veterinria Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Porto Alegre, RS, Brasil. 91540-000 ana.ravazzolo@ufrgs.br

Elizabeth Rieder, PhD. Plum Island Animal Disease Center ARS, USDA PO Box 848 Greenport NY 11944 USA elizrieder@yahoo.com

Clarice Weis Arns, MV, DSc. Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biologia Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) Campinas, SP, Brasil. 13081-970 arns@unicamp.br

Fernanda Silveira Flores Vogel, MV, MSc. Doutor Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 fervogel@smail.ufsm.br

Fernando A. Osorio, MV, MSc. PhD Clarissa Silveira Luiz Vaz, MV, MSc., Embrapa Sunos e Aves (CNPSA) Concrdia, SC, Brasil. 89.700-000, clarissa.vaz@ufrgs. br Department of Veterinary and Biomedical Sciences University of Nebraska/Lincoln Lincoln, Nebraska, USA. 68583-0905 fosorio@unlnotes.unl.edu

Fernando Rosado Spilki, MV, MSc., Doutor Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biologia Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) Campinas, SP, Brasil. 13083-970 fernandospilki@yahoo.com.br

Julia Ridpath. PhD National Animal Disease Center ARS - USDA 2300 Dayton Avenue. P.O. Box 70 Ames, IA, USA. 50010 jridpath@nadc.ars.usda.gov

Letcia Frizzo da Silva, MV, MSc. Gael Kurath, PhD Microbiologist Western Fisheries Research Center 6505 NE 65th St. Seattle, Washington, 98115. USA gael_kurath@usgs.gov Laboratrio de Virologia Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 diegodiel@pop.com.br

Gustavo Delhon, MV, MSc.PhD Department of Pathobiology College of Veterinary Medicine University of Illinois at Urbana-Champaign Urbana, Illinois, USA. gadelhon@uiuc.edu

Luciane Teresinha Lovato, MV, MSc., PhD Departamento de Microbiologia e Parasitologia Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 llovato@smail.ufsm.br

Luiz Carlos Kreutz, MV, MSc., PhD Helena Beatriz de Carvalho R. Batista, MV, MSc. Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Porto Alegre, RS, Brasil. 91540-000 hruthner@yahoo.com.br Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinria Universidade de Passo Fundo (UPF) Passo Fundo, RS, Brasil. 99001-970 lckreutz@upf.tche.br

Hernando Duque Jaramillo, MV, MSc. PhD Plum Island Animal Disease Center USDA-APHIS-VS-NVSL-FADDL Greenport, New York USA. 11944-0848

Luis L. Rodriguez, MV. PhD Foreign Animal Disease Research Unit Plum Island Animal Disease Center ARS, USDA PO Box 848 Greenport NY 11944. USA. lrodriguez@piadc.ars.usda.gov

Janice Reis Ciacci-Zanella, MV, MSc.PhD Embrapa Sunos e Aves (CNPSA) Concrdia, SC, Brasil. 89.700-000, janice@cnpsa.embrapa.br

Marcelo de Lima, MV, MSc. Department of Veterinary and Biomedical Sciences University of Nebraska/Lincoln Lincoln, Nebraska, USA. 68683-0905 mdelima2@unlnotes.unl.edu

John D. Neill, DVM, PhD National Animal Disease Center, USDA, ARS 2300 Dayton Avenue. P.O. Box 70 Ames, Iowa.USA. 50010 jneill@nadc.ars.usda.gov Maria Elisa Piccone, PhD Plum Island Animal Disease Center ARS, USDA PO Box 848 Greenport, NY. 11944. USA maria.piccone@ars.usda.gov

Mariana S e Silva, MV, MSc. Setor de Virologia Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 msaesilva@yahoo.com.br

Renata Servan de Almeida, MV, MSc.Doutor CIRAD - Dpartement Systmes Biologiques UPR 15 Controle ds Maladies Animales Exotiques et Emergentes 34398 Montpellier cedex 5 France renservan@yahoo.com.br

Mrio Celso Speroto Brum, MV, MSc. Setor de Virologia Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 mcsbrum@yahoo.com.br

Rudi Weiblen, MV, MSc., PhD Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 rudi@ccr.ufsm.br

Sheila Wosiacki, MV., MSc. Doutor Mauro Pires Moraes, MV, MSc., Doutor Departamento de Veterinria Universidade Federal de Viosa Viosa, MG, Brasil. 36570-000 mpmoraes@ars.usda.gov Centro de Cincias Agrrias, Universidade Estadual de Maring (UEM) Campus Umuarama Maring, PR, Brasil. 87020-900 wosiacki@yahoo.com.br

Paulo Michel Roehe, MV, MSc.PhD Instituto de Pesquisas Veterinrias Desidrio Finamor FEPAGRO Sade Animal Eldorado do Sul, RS, Brasil. 92 990-000 & Instituto de Cincias Bsicas da Sade Departamento de Microbiologia Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Porto Alegre, RS, Brasil 90 050 -170 proehe@gmail.com

Ubirajara M. da Costa, MV, MSc.Doutor Departamento de Medicina Veterinria Preventiva e Tecnologia Centro de Cincias Agroveterinrias Universidade Estadual de Santa Catarina (UDESC) Lages, SC, Brasil. 88520-000 biravetvirus@yahoo.com.br

Zlia Ins Portela Lobato. MV, PhD. Escola de Veterinria Departamento de Medicina Veterinria Preventiva

Paulo Renato dos Santos Costa, MV, MSc., Doutor Departamento de Veterinria Universidade Federal de Viosa Viosa, MG, Brasil. 36570-000 prenato@ufv. br

Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) Belo Horizonte, MG, Brasil. 34992-101 ziplobat@vet.ufmg.br

Renata Dezengrini, MV, MSc. Setor de Virologia Departamento de Medicina Veterinria Preventiva Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 renatadezengrini@yahoo.com.br

INTRODUO

A presente obra foi concebida para preencher uma lacuna existente na bibliograa dedicada Virologia Veterinria na lngua portuguesa. O crescimento notvel do ensino e pesquisa em Virologia Animal no Brasil, nas ltimas dcadas, infelizmente no foi acompanhado por um aumento equivalente na literatura disponvel. Neste perodo, o acmulo fantstico de conhecimentos acerca da gentica e biologia dos agentes virais, proporcionado pelo desenvolvimento e popularizao das tcnicas moleculares, tem tornado algumas obras clssicas gradativamente desatualizadas e obsoletas. Existem bons livros de Virologia Animal e excelentes tratados de Virologia Geral e Molecular na lngua inglesa. No entanto, esses textos so temporariamente inacessveis a uma parcela considervel dos estudantes de graduao que se interessam e ingressam no mundo fascinante da Virologia. Esta obra, pois, tem por objetivo fornecer aos iniciantes em Virologia, que, porventura, sejam tambm iniciantes na lngua inglesa, um contedo atualizado e abrangente da Virologia Animal, com nfase aos animais de interesse veterinrio. O presente texto direcionado aos iniciantes em Virologia, sejam eles estudantes de graduao, ps-graduao ou mdicos veterinrios; e tem como objetivo fornecer informaes bsicas sobre a estrutura, biologia, patogenia, diagnstico e controle dos principais vrus de interesse veterinrio. Os principais aspectos da biologia molecular e replicao viral so abordados de maneira simples e de fcil compreenso, para embasar o entendimento da patogenia, resposta imunolgica e diagnstico dessas infeces. A omisso de informaes mais detalhadas sobre a biologia molecular dos vrus foi intencional. Tal detalhamento est um pouco alm da informao usualmente buscada por iniciantes em livros-texto. Por outro lado, os estudantes em nveis mais avanados podem recorrer a excelentes livros existentes na lngua inglesa. Um grande desao enfrentado durante a elaborao deste texto foi acompanhar a dinmica das descobertas e constataes na rea da Virologia Molecular. A dinmica do conhecimento gerado nesta rea exigir atividades de reviso e atualizao constantes do contedo, sob a pena de deix-lo obsoleto em poucos anos. Os avanos nas reas de vacinologia e teraputica antiviral tambm se intensicaram neste perodo, permitindo aos autores relatar as mais recentes conquistas cientco-tecnolgicas nessas reas. A dinmica das interaes dos vrus com os seus hospedeiros no ambiente natural tambm representa um desao para a elaborao de textos descritivos. No perodo de elaborao desta obra aproximadamente trs anos surgiram novos vrus e novas doenas; e vrus j conhecidos cruzaram a barreira de espcies e infectaram hospedeiros inusitados. Ou seja, a evoluo natural das infeces vricas no ambiente natural to dinmica que exige uma reviso contnua de conceitos. Este livro encontra-se dividido em duas partes. A parte inicial aborda os aspectos gerais da Virologia Animal, discorrendo sobre a estrutura, classicao e nomenclatura, gentica e evoluo, mtodos de deteco e identicao de vrus, aspectos gerais da replicao viral, replicao de vrus DNA e RNA, patogenia das infeces, epidemiologia, imunidade a vrus, diagnstico laboratorial e vacinas. Embora o enfoque desta parte seja direcionado para a Virologia Animal, os conceitos e aspectos nela tratados so tambm aplicveis a vrus que infectam humanos. Assim, este texto pode til tambm para os demais estudantes das reas biomdicas.

A segunda parte trata individualmente das famlias virais de importncia em medicina veterinria. Os captulos foram elaborados seguindo algumas orientaes com relao organizao e contedo. Dessa forma, cada captulo especco dividido em duas partes: a seo inicial aborda os aspectos gerais da respectiva famlia, a estrutura dos vrions, a estrutura e organizao genmica, expresso gnica, replicao do genoma e o ciclo replicativo. Um dos maiores desaos enfrentados na elaborao deste texto foi obter um equilbrio entre o nvel de aprofundamento nos aspectos biolgicos e moleculares com a nfase necessria nos aspectos epidemiolgicos, clnico-patolgicos e diagnsticos. Os aspectos moleculares da biologia dos vrus foram abordados de maneira simplicada para facilitar o entendimento por iniciantes da rea. Um maior detalhamento nos aspectos biolgicos e moleculares da estrutura e replicao dos vrus pode ser encontrado nos livros especializados. A segunda parte de cada captulo especco dedicada s doenas de importncia veterinria causadas por membros das respectivas famlias. Esta seo discorre acerca das caractersticas do agente, epidemiologia, patogenia, sinais clnicos e patologia, diagnstico, controle e prolaxia das doenas por ele causadas. Algumas famlias possuem vrios vrus associados com doenas animais de importncia sanitria e econmica; enquanto outras possuem poucos patgenos animais. Por isso, a disparidade de contedo e extenso dos diferentes captulos. O ltimo captulo apresenta algumas famlias virais que possuem importncia limitada em medicina veterinria. Algumas dessas famlias abrigam patgenos exclusivamente humanos; outras abrigam vrus que infectam somente animais sem interesse econmico ou afetivo; enquanto outras congregam vrus cujo interesse maior reside nos seus aspectos biolgicos e moleculares.

Os autores

AGRADECIMENTOS

Uma obra deste porte somente poderia ser elaborada com a colaborao de vrias pessoas. E nada mais justo do que agradecer a todos aqueles que tornaram possvel concretiz-la. Aos colegas colaboradores, pela disposio em dedicar uma parte importante do seu tempo na elaborao dos captulos. desnecessrio list-los aqui, pois os seus nomes se encontram nos respectivos captulos ou sees. Aos colegas e amigos de longa data, com quem a elaborao de um livro de Virologia Veterinria foi tema de inumerveis conversas e planos em congressos e reunies cientcas nestes ltimos 15 anos. Janice Ciacci-Zanella, Clarice Arns, Ana Paula Ravazollo, Amauri Aleri, Luciane Lovato, Mauro Moraes, Paulo Roehe, Luiz Carlos Kreutz e Rudi Weiblen, entre outros, o meu agradecimento e a certeza de que este livro representa a concretizao de um sonho de todos ns. O agradecimento aos colegas estrangeiros, que entenderam a importncia de um livro-texto como este e dedicaram parte de seu tempo para auxiliar a elabor-lo: Drs. Julie Ridpath, John Neill, Luis Rodriguez, Gael Kurath, Fernando Osorio, Maria Elisa Piccone, Gustavo Delhon, Elisabeth Rieder e Hernando Duque. Devo um agradecimento especial a trs colegas que contriburam muito alm da elaborao dos respectivos captulos, participando de vrios outros, enviando sugestes, traduzindo, revisando e reformulando os textos submetidos: Dr Luiz Carlos Kreutz, Dra. Fernanda Silveira Flores Vogel e Md. Vet. doutoranda Renata Dezengrini. Gostaria de externar o meu reconhecimento e gratido equipe do Setor de Virologia da UFSM, composta por mestrandos e doutorandos, que participaram ativamente de todo o processo de elaborao, edio e reviso desta obra. Grande parte da qualidade e propriedade deste texto se deve s interminveis discusses e revises de captulos, patrocinadas por um grupo cheio de entusiasmo e motivao. Ao Mrio Celso S. Brum, Diego G. Diel, Evandro Winkelmann, Sabrina R. Almeida, Sandra Arenhart, Andria Henzel, Renata Dezengrini, Mariana S e Silva, Helton dos Santos, Letcia Frizzo da Silva e Marcelo Weiss, com certeza de que vocs possuem parte importante nessa obra. Agradeo tambm aos colegas professores Slvia Hbner (UFPEL) e Valria Lara Carregaro (UFSM) pelas revises e colaborao em captulos especcos. profa. Maristela Brger Rodrigues, pela reviso gramatical; Carolina Gehlen, pela diagramao; Zlide Bayer Zucheto e prof. Honrio Rosa Nascimento, da Editora da UFSM, pelo apoio para que a edio deste livro fosse possvel. Alm do apoio da Editora da UFSM, parte do trabalho grco (elaborao de guras, diagramao, reviso gramatical) e pagamento de direitos autorais foram custeados com recursos da taxa de bancada de Produtividade em Pesquisa do CNPq do Organizador. A arte nal e capa somente foram possveis com o auxlio do Centro de Cincias Rurais, na pessoa do seu Diretor, prof. Dalvan Jos Reinert, e da vice-reitoria, pelo Prof. Felipe Mller, a quem agradecemos. Quero tambm manifestar o meu agradecimento e admirao pelo trabalho grco magnco realizado pelos acadmicos do Curso de Desenho Industrial da UFSM, Lase Miolo Moraes e Mrcio Oliveira Soriano. Eles foram os responsveis diretos por grande parte das ilustraes desta obra; e responsveis indiretos pela parte restante, cuja confeco lhes foi subtrada pelo seu entusiasmado aprendiz. Ao nal do trabalho, tivemos como resultados: um conjunto formidvel de ilustraes; dois

acadmicos de Desenho Industrial com certo conhecimento de Virologia e um virologista accionado pela arte de ilustrar gracamente a biologia dos vrus. E isso s o incio...

Eduardo Furtado Flores, MV. MSc. PhD Professor Associado Departamento de Medicina Veterinria Preventiva (DMVP) Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, RS, Brasil. 97105-900 ores@ccr.ufsm.br

Eduardo Furtado Flores natural de Santa Maria, RS (25/10/61); com graduao (1983) e mestrado (1989) em Medicina Veterinria pela Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). Possui PhD em Virologia Molecular pela Universidade de Nebraska/Lincoln, Estados Unidos (1995). professor do Departamento de Medicina Veterinria Preventiva da UFSM desde 1991, responsvel pelas disciplinas de Epidemiologia Geral Veterinria e Sade Pblica Veterinria na graduao; e pelas disciplinas Epidemiologia Veterinria, Virologia Molecular e Introduo Biologia Molecular na ps-graduao. Faz parte do Conselho Editorial da Editora da UFSM; pesquisador de produtividade em pesquisa (1C) do CNPq desde 1997; e editor adjunto de Virologia da revista Pesquisa Veterinria Brasileira. Divide as suas atividades didticas e editoriais com a rotina de diagnstico virolgico no Setor de Virologia (SV/UFSM) e com a orientao de bolsistas de iniciao cientca, mestrado e doutorado. Coordena pesquisas nas reas de epidemiologia molecular e patogenia das infeces pelos vrus da diarria viral bovina e herpesvrus bovino tipos 1 e 5.

SUMRIO

Parte I - Virologia Geral


1 Estrutura e composio dos vrus
Eduardo Furtado Flores

19

2 Classicao e nomenclatura dos vrus


Luciane Teresinha Lovato

37

3 Deteco, identicao e quanticao de vrus


Mrio Celso S. Brum & Rudi Weiblen

59

4 Gentica e evoluo viral


Mauro Pires Moraes & Hernando Duque Jaramillo

87

5 Replicao viral
Eduardo Furtado Flores & Luiz Carlos Kreutz

107

6 Replicao dos vrus DNA


Gustavo Delhon

137

7 Replicao dos vrus RNA


Maria Elisa Piccone & Eduardo Furtado Flores

165

8 Patogenia das infeces vricas


Eduardo Furtado Flores

189

9 Resposta imunolgica contra vrus


Luiz Carlos Kreutz

237

10 Epidemiologia das infeces vricas


Eduardo Furtado Flores

261

11 Diagnstico laboratorial de infeces vricas


Eduardo Furtado Flores

295

12 Vacinas vricas
Cludio Wageck Canal & Clarissa Silveira Luiz Vaz

327

Parte II - Virologia Especial


13 Circoviridae
Janice R. Ciacci-Zanella

361

14 Parvoviridae
Mauro Pires Moraes e Paulo Renato da Costa

375

15 Papillomaviridae
Amauri Aleri, Alice Aleri & Sheila Wosiacki

397

16 Adenoviridae
Mauro Pires Moraes & Paulo Renato da Costa

413

17 Herpesviridae
Ana Cludia Franco & Paulo Michel Roehe

333

18 Poxviridae
Cludio Wageck Canal

489

19 Asfarviridae
Gustavo Delhon

513

20 Caliciviridae
John Neill

525

21 Picornaviridae
Elisabeth Rieder & Mrio Celso S. Brum

537

22 Flaviviridae
Julia Ridpath & Eduardo Furtado Flores

563

23 Togaviridae
Eduardo Furtado Flores

593

24 Coronaviridae
Luciane Teresinha Lovato & Renata Dezengrini

613

25 Arteriviridae
Marcelo de Lima & Fernando A. Osorio

639

26 Paramyxoviridae
Clarice Weis Arns, Fernando R. Spilki & Renata Servan de Almeida

657

27 Rhabdoviridae
Luis Rodriguez, Helena R. Batista, Paulo Michel Roehe & Gael Kurath

689

28 Orthomyxoviridae
Eduardo Furtado Flores, Luciane T. Lovato, Mariana S e Silva, Renata Dezengrini & Diego G. Diel

721

29 Bunyaviridae
Fernanda Silveira Flores Vogel

755

30 Reoviridae
Amauri Aleri, Alice Aleri, Elisabete Takiuchi & Zlia I. P. Lobato

773

31 Retroviridae
Ana Paula Ravazzollo & Ubirajara da Costa

809

32 Outras famlias virais


Fernanda Silveira Flores Vogel & Eduardo Furtado Flores Abreviaturas e siglas Glossrio

839

861 871

PARTE I VIROLOGIA GERAL

ESTRUTURA E COMPOSIO DOS VRUS


Eduardo Furtado Flores

1
21 21
23 25 28 29

1 Introduo 2 Estrutura das partculas vricas


2.1 O genoma 2.2 O capsdeo 2.3 O envelope 2.4 A matriz

3 Protenas virais 4 Outros componentes dos vrions


4.1 Enzimas 4.2 Outras protenas virais 4.3 Lipdios 4.4 Carboidratos 4.5 cidos nuclicos celulares 4.6 Protenas celulares

30 31
31 31 31 31 31 32

5 Partculas vricas anmalas 6 Propriedades fsico-qumicas 7 Bibliograa consultada

32 33 33

1 Introduo
Os vrus so os microorganismos menores e mais simples que existem. So muito menores do que clulas eucariotas e procariotas e, ao contrrio destas, possuem uma estrutura simples e esttica. Esses agentes no possuem a maquinaria necessria para a produo de energia metablica e para a sntese de protenas e, por isso, necessitam das funes e do metabolismo celular para se multiplicar. Fora de uma clula viva os vrus so estruturas qumicas. A sua atividade biolgica s adquirida no interior de clulas vivas, por isso so parasitas intracelulares obrigatrios. O genoma viral cido ribonuclico (RNA) ou desoxirribonuclico (DNA) codica apenas as informaes necessrias para assegurar a sua multiplicao, empacotamento do genoma e para subverso de funes celulares em benefcio da sua multiplicao. Ao contrrio de clulas eucariotas e procariotas, os vrus no crescem ou se dividem; e sim so produzidos pela associao dos seus componentes pr-formados no interior da clula infectada. A palavra vrus utilizada para designar o agente biolgico, o microorganismo. A estrutura fsica denominada partcula viral, partcula v-

rica ou simplesmente vrion. A nomenclatura utilizada para designar as diversas hierarquias da classicao taxonmica dos vrus (ordem, famlia, subfamlia, gnero, espcie) ser apresentada no Captulo 2. No presente captulo, a terminologia vernacular ser utilizada. Por exemplo: o termo picornavrus ser utilizado para referir-se aos membros da famlia Picornaviridae; os membros da famlia Orthomyxoviridae sero chamados de ortomixovrus.

2 Estrutura das partculas vricas


A unidade fundamental o indivduo dos vrus denominada partcula vrica, partcula viral ou simplesmente vrion. As dimenses, morfologia e complexidade das partculas vricas variam amplamente entre os vrus das diferentes famlias. A grande maioria dos vrions possui dimenses ultramicroscpicas, com dimetro que varia entre 15 e 22 nanmetros (nm) nos circovrus; e entre 200 e 450 nm nos poxvrus; e s pode ser visualizada sob microscopia eletrnica (ME). As excees so alguns poxvrus que so maiores e podem ser visualizados sob microscopia tica (Figura 1.1).

Poxvrus Clulas animais Bactrias Vrus e ribossomos Protenas

10-2 (1cm)

10-3 (1mm)

10-4 (0,1mm)

10-5 (10m)

10-6 (1m)

10-7 (0,1m)

10-8 (10nm)

10-9 (1nm)

10-10 (1A)

Microscopia tica Microscopia eletrnica

Fonte: adaptado de Flint et al.(2000).

Figura 1.1. Escala logartmica mtrica, ilustrando as dimenses dos vrus comparativamente com clulas animais, bactrias e macromolculas. O poder de resoluo das microscopias tica e eletrnica indicado por barras.

22

Captulo 1

De acordo com a estrutura bsica das partculas, dois grupos principais de vrus podem ser reconhecidos: os vrus sem envelope e os vrus com envelope (Figura 1.2). Os vrions mais simples so compostos pelo genoma recoberto por uma camada simples de protena, denominada capsdeo. Os vrus mais complexos possuem genomas longos associados com vrias protenas, recobertos por capsdeos complexos, revestidos externamente por uma membrana lipoprotica de origem celular, denominada envelope. As camadas proticas que envolvem o genoma (capsdeo, envelope) so freqentemente denominadas de envoltrios virais. Os conceitos principais relacionados estrutura e componentes dos vrions esto apresentados no Quadro 1.1.

Genoma

Capsdeo

B
Envelope

condies ambientais que rapidamente inativariam o cido nuclico. Por isso, o capsdeo e o envelope so crticos para a manuteno da integridade e viabilidade do genoma, que contm as informaes essenciais para a multiplicao do vrus. Outras funes importantes dos componentes superciais das partculas vricas so o reconhecimento e interao com estruturas da membrana da clula hospedeira. Essas interaes so essenciais para a penetrao do agente na clula e incio da sua replicao. A arquitetura e modo com que as partculas vricas so construdas devem permitir o desempenho de duas funes fundamentais: a) proteo do genoma durante o transporte entre clulas e entre hospedeiros, e b) liberao do genoma ntegro e vivel aps a penetrao na clula hospedeira. A evoluo fez com que a arquitetura das partculas vricas tenha sido adequada para cumprir essas tarefas. Ou seja, os vrions so resistentes o suciente para proteger o genoma no exterior das clulas e so facilmente desintegrados ao penetrarem na clula hospedeira, para permitir a pronta liberao do genoma no seu interior. Essas duas propriedades, aparentemente opostas, que so particularmente bem evidentes em alguns vrus sem envelope, caracterizam o que se convencionou denominar de estrutura metaestvel.

VRUS - DEFINIES E CONCEITOS


Genoma
- O genoma constitudo por RNA ou DNA. - O capsdeo a camada protica que recobre o genoma. - Os protmeros so as unidades proticas que compe o capsdeo. - Os capsmeros so as unidades morfolgicas do capsdeo.

Capsdeo

Figura 1.2. Estrutura fundamental das partculas vricas e seus componentes. Representao esquemtica de um vrion sem envelope (A) e com envelope (B).

- O nucleocapsdeo a estrutura formada pelo genoma + capsdeo. - O envelope a membrana lipoprotica que recobre o nucleocapsdeo - O vrion a partcula vrica completa, infecciosa.

A funo primordial dos envoltrios virais (capsdeo e envelope) proteger o genoma de danos fsicos, qumicos ou enzimticos durante a transmisso entre clulas e entre hospedeiros. Nessa etapa, os vrions podem ser expostos a

Quadro 1.1. Conceitos e definies fundamentais.

Estrutura e composio dos vrus

23

2.1 O genoma
O genoma dos vrus constitudo por molculas de cido ribonuclico (RNA) ou desoxirribonuclico (DNA), nunca pelos dois. Por isso, esses agentes so comumente denominados de vrus RNA ou vrus DNA. Em geral, os vrus das diversas famlias contm apenas uma cpia do genoma por vrion (so haplides). Uma exceo so os retrovrus, que possuem duas cpias idnticas do genoma (so diplides). A extenso, estrutura, organizao genmica e o nmero de genes contidos no genoma variam amplamente entre os diferentes vrus. Os menores vrus animais (circovrus) possuem uma molcula de DNA com aproximadamente 1.700 nucleotdeos (1,7 quilobases, kb) como genoma; os vrus maiores possuem um genoma DNA com mais de 350 kb (poxvrus). O nmero de genes e conseqentemente o nmero de protenas codicadas tambm varia entre os diferentes vrus. Alguns vrus de plantas codicam apenas uma protena, enquanto o genoma dos poxvrus codica mais de 100. Em geral, o genoma dos vrus muito compacto e codica apenas as protenas essenciais para assegurar a sua replicao e transmisso. Resumidamente, essas funes compreendem: a) assegurar a replicao do genoma (enzimas polimerases de RNA e DNA e protenas acessrias); b) subverter funes celulares em seu benefcio (protease leader no vrus da febre aftosa [foot and mouth disease virus, FMDV]) e c) empacotar o genoma (protenas do capsdeo e envelope). Essas funes so codicadas pelo genoma de, virtualmente, todos os vrus. Alguns vrus mais complexos codicam funes adicionais que, de alguma forma, favorecem a sua multiplicao e disseminao. O tipo e estrutura do genoma de muitos vrus diferem do padro clssico observado nos cidos nuclicos de eucariotas e procariotas. Nesses organismos, o genoma constitudo por molculas de DNA de cadeia dupla (ds, double-stranded); enquanto os RNAs possuem ta simples (ss, single-stranded). Os genomas dos vrus apresentam variaes de tipo e estrutura, que incluem

desde genomas de DNA de ta simples (ssDNA) at RNA de ta dupla (dsRNA) (Tabelas 1.1 e 1.2, em anexo). A maioria dos vrus DNA possui o cido nuclico genmico como uma molcula de ta dupla. As excees so os parvovrus (cadeia simples linear), os circovrus (cadeia simples circular) e os hepadnavrus (cadeia parcialmente dupla). O termo circular refere-se continuidade da cadeia de DNA e no forma geomtrica adotada pela molcula. Ao contrrio dos genomas lineares, que apresentam as extremidades livres, os genomas circulares apresentam a cadeia contnua, sem extremidades. Os poliomavrus e papilomavrus possuem uma molcula de DNA de cadeia dupla circular. Essa molcula apresenta-se enrolada/tensionada sobre o seu eixo longitudinal (do ingls: supercoiled) e est associada com protenas celulares denominadas histonas, tanto nas clulas infectadas como nos vrions. Os parvovrus possuem uma molcula de DNA de cadeia simples, cujas extremidades possuem seqncias complementares invertidas (palindromes). Essa caracterstica permite que as extremidades do genoma se dobrem sobre si mesmas, pareando com a sua regio complementar e formando estruturas semelhantes a grampos de cabelo (hairpins). Os genomas dos adenovrus e herpesvrus so molculas de DNA de cadeia dupla linear. Nos herpesvrus, o genoma linear apenas nos vrions, pois assume a topologia circular (devido ao pareamento complementar nas extremidades) logo aps a entrada no ncleo da clula. O genoma dos hepadnavrus uma molcula de DNA de cadeia parcialmente dupla (aproximadamente 3/4), o restante possui cadeia simples. As extremidades da cadeia completa fazem um pareamento de bases entre si, conferindo molcula a topologia circular (a cadeia de DNA no contnua). Os poxvrus possuem uma molcula de DNA de cadeia dupla linear; porm as duas cadeias so contnuas, ou seja, no h extremidades livres. Uma ilustrao simplicada da morfologia das partculas e da topologia do genoma dos vrus DNA est apresentada na Figura 1.3.

24

Captulo 1

Circoviridae

Parvoviridae

Polyomaviridae Papillomaviridae

Adenoviridae

Herpesviridae

Poxviridae

Hepadnaviridae

Asfarviridae

Fonte: adaptado de Gelderson, H. R. www.gsbs.utmb.edu

Figura 1.3. Ilustrao simplificada da morfologia dos vrions e da topologia do genoma dos vrus DNA.

O cido nuclico genmico de todos os vrus RNA composto por molculas lineares. Em algumas famlias (Orthomyxoviridae e Bunyaviridae), essas molculas circularizam pelo pareamento de seqncias complementares, localizadas nas extremidades, formando estruturas que lembram cabos de panela (panhandles). A maioria dos vrus RNA possui o seu cido nuclico genmico como uma molcula de cadeia simples. As excees so os reovrus e os birnavrus, cujos genomas so formados por segmentos de RNA de cadeia dupla (10 a 12 segmentos nos reovrus, dois nos birnavrus). Os genomas dos vrus RNA de cadeia simples podem ser constitudos por uma nica molcula (no-segmentados) ou por mais de uma molcula (genomas segmentados: sete a oito molculas de RNA nos ortomixovrus, trs nos buniavrus e duas nos arenavrus). O genoma de alguns vrus RNA de cadeia simples possui o mesmo sentido do RNA mensageiro (mRNA) e pode ser diretamente traduzido pelos ribossomos da clula hospedeira. Isso

possvel porque a seqncia de nucleotdeos, que codica os aminocidos constituintes da protena, est alinhada no mesmo sentido da seqncia genmica. Esses mRNA (e os respectivos vrus) so denominados RNA de sentido ou polaridade positiva; ou simplesmente RNA+. A primeira etapa intracelular do ciclo replicativo desses vrus a traduo parcial ou total do RNA genmico, resultando na produo de protenas virais, entre as quais a enzima polimerase de RNA (replicase), que ir replicar o genoma. Outros vrus RNA de cadeia simples possuem genomas que no podem ser diretamente traduzidos, pois possuem o sentido contrrio (antissense) ao mRNA. Esses genomas (e os respectivos vrus) so denominados de RNAs de sentido ou polaridade negativa (RNA-). Esses vrus trazem a enzima polimerase de RNA nos vrions para permitir o incio da replicao do genoma. A etapa inicial da replicao a sntese de uma cpia de RNA de polaridade positiva (mRNA) a partir do RNA genmico. Ou seja, nesses vrus, a sntese protica ocorre pela traduo do mRNA, que possui sentido antigenmico. Os genomas RNA dos buniavrus e arenavrus no so diretamente traduzidos pelos ribossomos, sendo considerados RNA de sentido negativo. Esses RNAs servem de molde para a transcrio e produo de cpias de RNA de sentido positivo (RNA+ ou mRNA) de extenso parcial ou total do genoma. No entanto, em alguns desses vrus, um dos segmentos de RNA codica protenas tanto no sentido do genoma como na molcula de sentido oposto (antigenmico). Essa estratgia de expresso gnica denominada ambissense e uma caracterstica nica dessas famlias. Nos reovrus e birnavrus (genomas RNA segmentados de ta dupla), a cadeia negativa serve de molde para a transcrio e produo de mRNA (RNA- RNA+). A cadeia complementar de RNA genmico (sentido positivo) no traduzida. Essa molcula serve apenas de molde e para parear com a cadeia negativa. A Figura 1.4 apresenta uma ilustrao simplicada da morfologia dos vrions e topologia do genoma dos vrus RNA.

Estrutura e composio dos vrus

25

Picornaviridae

Astroviridae

Caliciviridae

Flaviviridae

Arteriviridae

Togaviridae

Coronaviridae

Retroviridae

Reoviridae

Birnaviridae

Bunyaviridae

Orthomyxoviridae

Arenaviridae

Filoviridae

Rhabdoviridae

Paramyxoviridae

Fonte: adaptado de Gelderson, H. R. www.gsbs.utmb.edu

Figura 1.4. Ilustrao simplificada da morfologia dos vrions e da topologia do genoma dos vrus RNA.

2.2 O capsdeo
O capsdeo (tambm chamado de cpsula) a camada protica que recobre externamente o genoma. Nos vrus que no possuem envelope, o capsdeo representa o nico envoltrio do cido nuclico viral. Alm dessa cobertura protica, o genoma de alguns vrus encontra-se associado com uma ou mais protenas de origem viral (p. ex.: adenovrus e reovrus) ou da clula hospedeira (poliomavrus e papilomavrus). As protenas que esto associadas ao genoma geralmente possuem carter bsico, sendo formadas predominantemente por aminocidos com carga positiva. Essa estrutura, geralmente compacta (genoma + protenas associadas), denominada core ou ncleo. O conjunto formado pelo core + capsdeo comumente denominado nucleocapsdeo. Nos vrus envelopados, o nucleocapsdeo recoberto

externamente pela membrana lipoprotica que constitui o envelope (Figura 1.2). A funo do capsdeo proteger o material gentico e proporcionar a transferncia do vrus entre clulas e entre hospedeiros. Nos vrus sem envelope, a superfcie externa do capsdeo responsvel pelas interaes iniciais dos vrions com a clula hospedeira no processo de penetrao do vrus. Nesses vrus, as protenas localizadas na superfcie do capsdeo tambm interagem com componentes do sistema imunolgico e so alvos importantes para anticorpos com atividade neutralizante. Os capsdeos so formados pela associao de subunidades proticas denominadas protmeros, que se constituem nas suas unidades estruturais. A associao dessas protenas pode formar estruturas tridimensionais bem denidas, geralmente na forma de pequenas salincias visveis na superfcie dos vrions. Essas estruturas consti-

26

Captulo 1

tuem-se nas unidades morfolgicas do capsdeo, tambm denominadas capsmeros. Cada capsmero pode ser formado por uma nica protena, pela associao de molculas de uma mesma protena ou por diferentes protenas (Figura 1.5).

O icosaedro se constitui em uma estrutura quase esfrica com uma cavidade interna. Os capsdeos icosadricos (tambm denominados cbicos) so formados pela associao de 20 unidades triangulares planas idnticas, unidas entre si em 12 vrtices e arranjadas ao redor de uma esfera imaginria (Figura 1.6). Eixos imaginrios traados atravs do icosaedro do origem a trs possveis planos de simetria: bilateral (two-fold), trilateral (three-fold) e pentalateral (ve-fold). O nmero de unidades que compem cada unidade triangular varivel e d origem a variaes estruturais entre os capsdeos de diferentes vrus. O icosaedro representa a otimizao estrutural para a construo de um envoltrio resistente, compacto e com mxima capacidade de armazenamento, podendo ser composto por mltiplas cpias de uma mesma protena.

Assim, o capsdeo pode ser formado por cpias de uma mesma protena (vrus do mosaico, rabdovrus) ou por diferentes tipos de protenas (mais de dez tipos diferentes nos reovrus), e todas se encontram em mltiplas cpias e so codicadas pelo genoma viral. Os capsdeos compostos por cpias mltiplas de uma mesma protena representam um exemplo de ecincia estrutural de armazenamento e economia de espao no genoma, pois um nico gene codica a protena necessria para formar todo o envoltrio viral. Independente do nmero de protenas que compem o capsdeo, a associao entre essas protenas pode resultar em capsdeos com duas simetrias principais: icosadrica e helicoidal (Figura 1.5).

Estrutura e composio dos vrus

27

Os capsdeos helicoidais so formados por mltiplas cpias de uma mesma protena. Essas protenas se associam entre si e com o cido nuclico, revestindo externamente o genoma. Essa associao resulta em uma estrutura espiralada alongada, exvel ou relativamente rgida (Figura 1.7). As dimenses dos nucleocapsdeos helicoidais variam muito, dependendo da extenso do genoma, podendo atingir at 1.800 nm nos lovrus.

A maioria dos vrus animais possui capsdeos icosadricos ou helicoidais, mas alguns (poxvrus, iridovrus e bacterifagos) possuem capsdeos com arquitetura mais complexa, denominados genericamente capsdeos complexos. Com base na arquitetura, simetria e complexidade de arquitetura, os vrions de diferentes famlias podem ser agrupados em cinco grupos estruturais (Figura 1.8):

1. Capsdeo icosadrico

1A

1B

2. Capsdeo helicoidal

2A
Figura 1.7. Ilustrao esquemtica de nucleocapsdeos helicoidais. A. Nucleocapsdeo helicoidal com morfologia definida; B. Nucleocapsdeo helicoidal flexvel.

2B

Os capsdeos helicoidais de alguns vrus de plantas apresentam-se como cilindros exveis ou rgidos, no interior do qual est localizado o genoma. So todos vrus sem envelope. Os vrus animais que possuem nucleocapsdeos helicoidais possuem genoma RNA de sentido negativo e so todos envelopados. O nucleocapsdeo helicoidal desses vrus formado pela associao de cpias mltiplas da protena do capsdeo com o genoma, que adota uma forma espiralada. Nos rabdovrus, o nucleocapsdeo adota uma forma bem denida, semelhante a um projtil de arma de fogo, no interior do qual se aloja o genoma espiralado (Figura 1.7A). Na maioria dos vrus, o nucleocapsdeo helicoidal exvel e enovelase sobre si mesmo e sobre o genoma sem adotar uma forma denida (Figura 1.7 B).

Fonte: adaptada de Carter et al. (2005).

Figura 1.8. Os cinco principais tipos estruturais dos vrus. 1. Vrions com capsdeos icosadricos: 1A. Sem envelope; 1B. Com envelope. 2. Vrions com capsdeos helicoidais: 2A. Sem envelope; 2B. Com envelope. 3. Vrion com simetria complexa.

28

Captulo 1

sem envelope, capsdeo icosadrico: ex: adenovrus, picornavrus; sem envelope, capsdeo helicoidal: ex: vrus do mosaico do tabaco; com envelope, capsdeo isosadrico: ex: togavrus, herpesvrus; com envelope, capsdeo helicoidal: ex: paramixovrus, rabdovrus; complexos: ex: bacterifagos, poxvrus.

2.3 O envelope
Os vrions de vrias famlias possuem os nucleocapsdeos recobertos externamente por uma membrana lipoprotica denominada envelope. O envelope formado por uma camada lipdica dupla, derivada de membranas celulares. Nessas membranas esto inseridas um nmero varivel de protenas codicadas pelo genoma viral. Na maioria dos vrus, o envelope est justaposto externamente ao capsdeo. Nos herpesvrus, entretanto, existe um espao de espessura varivel entre o capsdeo e o envelope, que preenchido por uma substncia protica amorfa, denominada tegumento. A quantidade e a forma adotada pelo tegumento so variveis e, conseqentemente, determinam a variao da morfologia e dimenses da partcula dos herpesvrus. Como o envelope derivado de membranas celulares, e estas so uidas e exveis, a superfcie externa e a morfologia dos vrus envelopados so mais exveis e menos denidas do que nos vrus sem envelope. A estrutura de um vrion com envelope est ilustrada na Figura 1.9.

nucleocapsdeo genoma membrana lipdica envelope glicoprotenas

Adaptado de Reschke, M.; www.biographix.de

Figura 1.9. Ilustrao esquemtica da estrutura de um vrion com envelope. As aberturas no envelope e no capsdeo so meramente ilustrativas, com o fim de permitir a visualizao das estruturas internas.

Os vrions adquirem a membrana lipdica que compe o envelope pela insero/protuso do nucleocapsdeo atravs de membranas celulares, mecanismo denominado brotamento. Os lipdios que constituem o envelope so derivados das membranas da clula hospedeira, e as protenas so codicadas pelo genoma viral. A estrutura lipdica dupla dos envelopes bem semelhante entre os diferentes vrus. No entanto, a espessura e composio dessa camada variam de acordo com a membrana celular que os originou. O envelope, adquirido na membrana plasmtica, contm fosfolipdios e colesterol em determinada proporo, enquanto o envelope originado das membranas celulares internas mais delgado e contm pouco ou nenhum colesterol. Os envelopes virais praticamente no contm protenas celulares. As protenas celulares da membrana so excludas da regio do brotamento por interaes entre as protenas virais que se inserem na camada lipdica. Os envelopes dos vrus podem conter um ou mais tipos de protenas codicadas pelo genoma viral (os herpesvrus possuem entre 10 e 12; os poxvrus possuem um nmero ainda maior). A maioria das protenas do envelope contm oligossacardeos (acares) associados, constituindo-se, portanto, em glicoprotenas. Essas glicoprotenas so produzidas e modicadas no retculo endoplasmtico rugoso (RER) e no aparelho de Golgi, cando inseridas na prpria membrana do RER ou sendo enviadas para a membrana nuclear do Golgi ou para a membrana plasmtica, locais do brotamento. As glicoprotenas do envelope viral possuem dimenses e estruturas variveis e a maioria formada por protenas integrais de membrana (Figura 1.10A). Essas glicoprotenas podem estar presentes na forma de monmeros, homo ou heterodmeros, trmeros e at tetrmeros. Em geral, as glicoprotenas do envelope apresentam trs regies principais em comum: a) uma regio citoplasmtica ou interna (cauda); b) uma regio transmembrana (tm) e c) uma regio externa. A cauda geralmente pequena e interage com a superfcie externa do nucleocapsdeo no processo de morfognese e brotamento. A regio tm est inserida na camada lipdica e serve de sustentao e xao da protena. A extenso dessa re-

Estrutura e composio dos vrus

29

gio varia de acordo com a espessura e origem da camada lipdica: entre 18 (vrus da febre amarela, que brota no retculo endoplasmtico) e 26 aminocidos (vrus da inuenza, que adquire o envelope na membrana plasmtica). A regio tm composta principalmente por aminocidos hidrofbicos. Algumas glicoprotenas do envelope possuem vrias regies tm e, assim, atravessam a membrana duas ou trs vezes. Outras no possuem regio tm e, portanto, no se encontram inseridas na membrana lipdica. Essas glicoprotenas encontram-se associadas ao envelope por interaes covalentes ou no-covalentes com outras glicoprotenas integrais de membrana e, por isso, so ditas protenas perifricas de membrana (Figura 1.10B). Exemplos desse tipo de protena so as glicoprotenas E0 dos pestivrus e a SU dos retrovrus. A regio externa geralmente maior; hidroflica e contm um nmero varivel de oligossacardeos associados. As glicoprotenas do envelope de alguns vrus formam projees na superfcie dos vrions, denominadas peplmeros, que podem ser visualizadas sob ME.

A
E

TM

d) transmisso do vrus entre clulas. Nas etapas nais do ciclo replicativo, algumas glicoprotenas do envelope auxiliam no egresso das partculas recm-formadas, permitindo a sua liberao a partir da membrana celular (neuraminidase nos ortomixovrus). As glicoprotenas do envelope tambm desempenham um importante papel na interao do vrus com o sistema imunolgico e se constituem em alvos importantes para anticorpos neutralizantes. Como as glicoprotenas do envelope mediam as interaes iniciais dos vrions com as clulas, a sua integridade e conformao natural so essenciais para a infectividade do vrus. Algumas substncias qumicas (formalina e detergentes) ou agentes fsicos (calor e radiaes) alteram a conformao dessas protenas e, conseqentemente, reduzem ou eliminam a infectividade do vrus. Solventes lipdicos, como ter e clorofrmio, tambm afetam negativamente a infectividade de vrus envelopados, pois destroem a integridade da camada lipdica que compe o envelope. Os vrions adquirem o envelope por meio de um mecanismo denominado genericamente de brotamento. Nesse processo, o nucleocapsdeo inicialmente interage com as caudas das glicoprotenas previamente inseridas na membrana. Essa interao inicial seguida da protuso/insero do nucleocapsdeo atravs da membrana, resultando na formao de vrions com uma camada lipoprotica que envolve externamente o nucleocapsdeo (Figura 1.11). O local do brotamento varia entre os diferentes vrus e pode ocorrer na membrana nuclear, do RER, do aparelho de Golgi ou na membrana plasmtica.

2.4 A matriz
Figura 1.10. Representao simplificada da estrutura das glicoprotenas do envelope viral. A. Protena integral de membrana com as regies interna (I), transmembrana (TM) e externa (E); M. membrana lipdica; B. Duas protenas associadas: uma integral de membrana (cinza) associada com uma protena perifrica (preto).

As glicoprotenas, principalmente por meio de sua regio extracelular, desempenham vrias funes na biologia do vrus, incluindo: a) ligao aos receptores celulares; b) fuso do envelope com a membrana celular; c) penetrao celular e

Alguns vrus envelopados possuem protenas que recobrem externamente o nucleocapsdeo, mediando a sua associao com a superfcie interna do envelope. Essas protenas, denominadas de matriz, so geralmente glicosiladas e abundantes, podendo corresponder a at 30% da massa total dos vrions (como nos retrovrus). As protenas da matriz so encontradas em vrios vrus envelopados, principalmente nos vrus RNA de polaridade negativa (exemplos: parami-

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Captulo 1

Meio extracelular

3 2

Membrana plasmtica

1
Citoplasma

Figura 1.11. Etapas do brotamento e aquisio do envelope por vrus envelopados. 1. Interao do nucleocapsdeo com as caudas citoplasmticas das glicoprotenas do envelope; 2-3. Insero/protuso do nucleocapsdeo atravs da membrana; 4. Egresso da partcula completa.

xovrus e ortomixovrus). As protenas da matriz desempenham importante funo estrutural e na morfognese das partculas vricas, pois interagem simultaneamente com a superfcie externa do nucleocapsdeo e com as caudas das glicoprotenas, funcionando como adaptadores entre o nucleocapsdeo e o envelope.

PA+PB1+PB2

NP HA

3 Protenas virais
O genoma dos vrus codica duas classes principais de protenas: estruturais e no-estruturais. As protenas estruturais so aquelas que participam da construo e arquitetura da partcula vrica (Figura 1.12), ou seja, esto presentes como componentes estruturais dos vrions. Enquadram-se nessa classe as protenas do nucleocapsdeo e do envelope. As protenas do tegumento (herpesvrus) e as protenas da matriz tambm se constituem em protenas estruturais. As protenas no-estruturais so aquelas codicadas pelo genoma viral e produzidas no interior da clula hospedeira durante o ciclo replicativo, mas que no participam da estrutura das partculas vricas. So geralmente protenas com atividades enzimticas e/ou regulatrias que participam das diversas etapas do ciclo replicativo do vrus e de sua interao com as organelas e macromolculas da clula hospedeira.

NA

M2

Figura 1.12. Ilustrao esquemtica da estrutura de um ortomixovrus (vrus da influenza), indicando a localizao das protenas na partcula vrica. Glicoprotenas do envelope: HA: hemaglutinina; NA: neuraminidase; M2: canal de ons; M: protena da matriz. Componentes do complexo ribonucleoprotena: RNA: recoberto pela NP; NP: nucleoprotena; PA: polimerase cida; PB1: polimerase bsica 1; PB2: polimerase bsica 2.

So exemplos de protenas no-estruturais as enzimas polimerases de DNA (DNA polimerase) e RNA (RNA polimerase), enzimas envolvidas no metabolismo de nucleotdeos (timidina quinase, ribonucleotdeo redutase etc.), fatores de transcrio e regulao da expresso gnica (ICP0 nos herpesvrus, protena E1A dos adenovrus,

Estrutura e composio dos vrus

31

antgeno T dos poliomavrus), entre outras. O nmero de protenas no-estruturais (e tambm estruturais) codicadas pelo genoma varia com a complexidade dos vrus. Os vrus mais simples codicam uma ou poucas protenas noestruturais, enquanto os poxvrus e herpesvrus codicam dezenas de protenas com atividades enzimticas e regulatrias, que desempenham funes diversas no seu ciclo replicativo. Embora estejam presentes nas partculas vricas de vrias famlias, protenas com atividade enzimtica so consideradas protenas no-estruturais.

4.2 Outras protenas


Protenas sem atividade enzimtica, mas que possuem participao no ciclo replicativo, tambm esto presentes nos vrions de algumas famlias. Os herpesvrus possuem, como parte do tegumento, a VP-16 (ou -TIF), que um transativador dos genes iniciais, e a VHS, uma protena que degrada os mRNA da clula hospedeira.

4.3 Lipdios
Os lipdios presentes nos envelopes virais so tipicamente os mesmos das membranas celulares, onde os vrions adquirem o seu envoltrio externo. Os envelopes originados da membrana plasmtica contm principalmente fosfolipdios (50-70%) e colesterol, enquanto os envelopes adquiridos em membranas celulares internas (nuclear, Golgi, RER) possuem pouco ou nenhum colesterol. Os lipdios constituem entre 20 e 35% da massa dos vrus envelopados.

4 Outros componentes dos vrions


4.1 Enzimas
Protenas com atividade enzimtica esto presentes nas partculas vricas de membros de vrias famlias de vrus DNA e RNA. Essas enzimas so necessrias para a sntese do cido nuclico viral e/ou para a biossntese de nucleotdeos e, geralmente, catalisam reaes nicas dos vrus, que no encontram fatores com funes similares nas clulas hospedeiras. Os vrus RNA de sentido negativo, por exemplo, trazem a enzima RNA polimerase (polimerase de RNA dependente de RNA) nos vrions. Os retrovrus trazem, nos vrions, a enzima transcriptase reversa (polimerase de DNA dependente de RNA; tambm polimerase de DNA dependente de DNA). Os hepadnavrus tambm trazem a enzima polimerase (polimerase de DNA dependente de DNA e tambm de RNA) nos vrions. Os poxvrus trazem, em seus vrions, enzimas RNA polimerases (com atividade equivalente s do hospedeiro), alm de enzimas que modicam o mRNA. Essas enzimas so necessrias para a realizao dessas funes no citoplasma, onde ocorre a replicao viral. Endonucleases (ortomixovrus), proteases (vrios vrus), quinases (hepadnavrus), integrase e ribonuclease (retrovrus) so exemplos de atividades enzimticas presentes em partculas virais. Os retrovrus complexos (exemplo: vrus da imunodecincia humana HIV) possuem protenas adicionais nos vrions, VPR e VIF, que so importantes para a replicao eciente em alguns tipos de clulas.

4.4 Carboidratos
Os carboidratos podem estar presentes em vrions como componentes de glicoprotenas, glicolipdios e mucopolissacardeos. Esses carboidratos esto presentes principalmente no envelope, mas os vrus complexos (poxvrus) tambm possuem carboidratos associados com protenas internas e/ou do capsdeo.

4.5 cidos nuclicos celulares


Alguns vrus podem ocasionalmente encapsidar em seus vrions, fragmentos de DNA cromossmico da clula hospedeira (poliomavrus). Os vrions dos retrovrus contm molculas de RNA transportador (tRNA) adquiridos da clula infectada. Esse tRNA desempenha um papel importante no incio do ciclo replicativo do vrus, pois serve de iniciador (primer) para a sntese da cadeia de DNA a partir do RNA genmico viral. Os vrions da famlia Arenaviridae contm ribossomos da clula hospedeira, o que lhes confere uma aparncia granular quando examinados sob

32

Captulo 1

ME (da a denominao da famlia, arena = areia). Os vrions dos ortomixovrus podem conter RNA ribossmico derivado das clulas hospedeiras.

4.6 Protenas celulares


No ncleo da clula hospedeira, o genoma DNA recm-replicado dos poliomavrus e papilomavrus associa-se com protenas celulares denominadas histonas (H), formando estruturas semelhantes cromatina celular. Essas estruturas, chamadas de minicromossomas, que contm o DNA viral, conjugado com as histonas H2A, H2B, H3 e H4, so encapsidadas durante a morfognese das partculas virais. Cabe ressaltar que cada vrion dos papilomavrus e poliomavrus contm uma cpia do genoma, ou seja, um minicromossoma. Os vrions dessas famlias, portanto, contm certa quantidade de protenas celulares.

os picornavrus podem ocasionalmente apresentar capsdeos vazios em razo da degradao do genoma; clulas infectadas com os hepadnavrus (vrus da hepatite B) produzem vrions completos (Dane particles) e tambm duas formas de partculas incompletas (partculas esfricas de 20 nm e partculas lamentosas) (Figura 1.13). As partculas incompletas so formadas por molculas da glicoprotena de superfcie (HbsAg), associadas com segmentos de membranas celulares. Para cada vrion completo, so produzidas entre 10.000 e 1.000.000 partculas esfricas. A abundncia dessas partculas no sangue de pessoas infectadas cronicamente tem sido utilizada como ferramenta para o diagnstico e, durante muitos anos, foi utilizada para a produo de vacinas.

5 Partculas vricas anmalas


Alm de partculas vricas completas e infectivas, a replicao de alguns vrus pode resultar na produo de uma quantidade varivel de partculas vricas anmalas, geralmente no-infecciosas. A freqncia e abundncia dessas partculas em relao aos vrions completos e infecciosos variam amplamente de acordo com o vrus. So muitas as causas da ausncia de infectividade nessas partculas, incluindo: ausncia do genoma viral. Clulas infectadas por poliomavrus podem produzir capsdeos vazios, sem o DNA genmico; outros capsdeos podem conter fragmentos de DNA celular. Essas partculas so denominadas pseudovrions; clulas infectadas por vrus de genoma RNA segmentado (ortomixovrus, por exemplo) podem produzir vrions com o conjunto incompleto dos segmentos genmicos; vrios vrus podem encapsidar genomas com delees em um ou mais genes. Os vrions que contm esses genomas defectivos so denominados partculas defectivas. Esses vrions no replicam autonomamente e somente so capazes de replicar quando ocorre uma co-infeco com um vrus homlogo infeccioso (denominado de vrus helper);

A. Fonte: adaptada de Flint et al. (2000). B. Fonte: Dr. Linda Stannard, www.uct.ac.za.

Figura 1.13. Partculas produzidas por clulas infectadas pelo vrus da hepatite B (hepadnavrus). A. Ilustrao esquemtica e B. fotografia de microscopia eletrnica. As partculas esfricas maiores com parede dupla so as partculas infecciosas (dane particles); as esfricas menores e as filamentosas so partculas defectivas, compostas por protenas de superfcie e pores de membranas celulares.

Estrutura e composio dos vrus

33

6 Propriedades fsico-qumicas
Vrios agentes fsicos e qumicos podem afetar a integridade funcional e infectividade dos vrions, incluindo a temperatura e o pH. A ao deletria da temperatura sobre a viabilidade dos vrus possui importncia durante a manipulao e remessa de material clnico para o diagnstico, como tambm para a preservao de estoques virais na rotina laboratorial. Alm disso, pode ser um fator limitante para a sua disseminao entre hospedeiros. Temperaturas de 55 a 60C desnaturam as protenas de superfcie, sobretudo as do envelope, em poucos minutos, tornando os vrions incapazes de interagir produtivamente com receptores celulares e iniciar a infeco. Temperaturas ambientais altas tambm afetam negativamente a infectividade dos vrus. Os vrus envelopados so geralmente muito mais sensveis ao deletria de altas temperaturas sobre a infectividade. Alguns vrus, como os paramixovrus, so particularmente susceptveis a temperaturas ambientais e tambm perdem a infectividade quando submetidos a congelamento e descongelamento. A conservao de vrus em suspenso lquida por longos perodos deve ser realizada a temperaturas de -70C ou em nitrognio lquido (-196C). Outra forma segura e eciente de armazenar vrus por longos perodos sem perder infectividade por meio de liolizao (dessecao a temperaturas de congelamento) e conservao do material liolizado (p) a 4C ou -20C. Para vrus em suspenso, temperaturas de 4 a 6C so compatveis com a preservao da infectividade apenas por horas ou poucos dias; temperaturas de 4 ou -20C no so indicadas para conservao por longos perodos. A resistncia a diferentes condies de pH varia amplamente; alguns vrus sem envelope (rotavrus, alguns picornavrus) mantm a infectividade mesmo em condies de pH cido e so chamados de cidoresistentes; outros, sobretudo os envelopados, so inativados j em pH um pouco abaixo do neutro (5 a 6) e so chamados de cido-lbeis. Agentes qumicos que possuem ao desnaturante sobre protenas e/ou solventes e detergentes lipdicos possuem ao deletria sobre a infectividade dos

vrus e muitos so utilizados como desinfetantes de materiais, equipamentos e ambientes. Em geral, os vrus sem envelope so muito mais resistentes a agentes qumicos e condies ambientais do que os vrus com envelope.

7 Bibliograa consultada
BAKER, T.S.; JOHNSON, J.E. Principles of virus structure determination. In: CHIU, W.; BURNETT, R.M.; GARCEA, R.L. (ed). Structural biology of viruses. New York, NY: Oxford University Press, 1997. p.38-79. CANN, A.J. Principles of molecular virology. 2. ed. San Diego, CA: Academic Press, 1997. 310p. CASPAR, D.L.D.; KLUG, A. Physical principles in the construction of regular viruses. Cold spring harbor symposium on quantitative biology, v.27, p.1-24, 1962. CHAPMAN, M.S.; GIRANDA, V.L.; ROSSMANN, M.G. The structures of human rhinovirus and mengo virus: relevance to function and drug design. Seminars in virology, v.1, p.413-427, 1990. DULBECCO, R.; GINSBERG, H.S. Microbiologia de Davis: virologia. 2. ed. So Paulo: Harbra, 1980. v.4, 1763p. FLINT, S.J. et al. Principles of virology: molecular biology, pathogenesis and control. Washington, DC: ASM Press, 2000. 804p. GARCEA, R.L.; LIDDINGTON, R.C. Structural biology of polyomaviruses. In: CHIU, W.; BURNETT, R.M.; GARCEA, R.L. (eds). Structural biology of viruses. New York, NY: Oxford University Press, 1997. p.157-187. HARRISON, S.C. Principles of virus structure. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (Eds.). Fields virology. 4. ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.3, p.53-85. HUNTER, E. Virus assembly. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (Eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.8, p.171-197. MURPHY, F.A. et al. Veterinary virology. 3. ed. San Diego, CA: Academic Press, 1999. 629p. MURRAY, P.R. et al. Medical microbiology. 2. ed. St. Louis: Mosby Year Book, 1994, p.573. QUINN, P.J. et al. Clinical microbiology. London: Wolfe, 1994. 648p. RIXON, F.J. Structure and assembly of herpesviruses. Seminars in virology, v.4, p.135-144, 1993. ROSSMANN, M.G. et al. Structure of a human cold virus and structural relationship to other picornaviruses. Nature, v.317, p.145-153, 1985.

34
RYAN, K.J. Sherris medical microbiology: an introduction to infectious diseases. 3. ed. Norwalk, CT: Appleton & Lange, 1994. 890 p. STEWART, P.L.; BURNETT, R.M. The structure of adenovirus. Seminars in virology, v.1, p.477-487, 1990. WHITE, D.O.; FENNER, F. Medical virology. 4. ed. San Diego, CA: Academic Press, 1994. 603 p. WILSON, J.A.T.; SKEHEL, T.S.; WILEY, D.C. Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of inuenza virus at 3A resolution. Nature, v.289, p.366-373, 1981.

Captulo 1

WIMMER, E. Cellular receptors for animal viruses. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994. 526p. WISE, D.J.; CARTER, G.R.; FLORES, E.F. General characteristics, structure and taxonomy of viruses. In: CARTER, G.R., WISE, D. J.; FLORES; E.F. (Eds.). A concise review of veterinary virology. Ithaca, NY: International Veterinary Information Service. Disponvel em: <http://www.ivis.org>. Acesso em: 20 set. 2006.

Anexos
Tabela 1.1. Caractersticas morfolgico-estruturais dos vrions e do genoma dos vrus DNA
Famlia Capsdeo Envelope Dimenses e morfologia do vrions Caractersticas do genoma

FITA SIMPLES

Circoviridae

Icosadrico

No

15-22 nm, esfrico-icosadricos

DNA de cadeia simples, circular, 1.7-2,2kb

Parvoviridae

Icosadrico

No

25nm, icosadricos

DNA de cadeia simples, linear, seqncias complementares nas extremidades, flexionadas sobre si (hairpins), 5 kb DNA de cadeia dupla, circular, superenrolada, 5 kb

Polyomaviridae

Icosadrico

No

45nm, esfrico-icosadricos

Papillomaviridae

Icosadrico

No

55nm, esfrico-icosadricos

DNA de cadeia dupla, circular, superenrolada, 8 kb

Adenoviridae

Icosadrico

No

80-110nm, icosadricos

DNA de cadeia dupla, linear, com uma protena nas extremidades, 30-44 kb

FITA DUPLA

Herpesviridae

Icosadrico

Sim

120-200 nm, pleomrficos ou aproximadamente esfricos

DNA de cadeia dupla, linear, 120-235 kb

Poxviridae

Complexo

Sim

170- 200 x 300-450nm, ovides/retangulares

DNA de cadeia dupla, linear e contnua, 130-375 kb

Iridoviridae/ Asfaviridae

Complexo

Sim

175-215nm, quase esfricos ou com aspecto de prismas hexagonais

DNA de cadeia dupla, linear e contnua, 170-190kb DNA de cadeia parcialmente dupla (3/4), com as extremidades pareando entre si (pseudo-circular), 3.2 kb

Hepadnaviridae

Icosadrico

Sim

40-48nm, esfricos, ocasionalmente pleomrficos, partculas subvirais em excesso

Estrutura e composio dos vrus

35

Tabela 1.2. Caractersticas morfolgico-estruturais dos vrions e do genoma dos vrus RNA
Famlia Capsdeo Envelope Dimenses e morfologia do vrions Caractersticas do genoma
duas cpias idnticas de RNA, cadeia simples (+), linear, 7-11kb RNA de cadeia simples (+), linear, 5'IRES, 3'polyA, 7.2 8.5kb RNA de cadeia simples (+), linear, protena na ext. 5, 3'polyA, 7.4 -7.7kb RNA de cadeia simples (+), linear, 3'polyA, 7.2-7.9kb RNA de cadeia simples (+), linear, 5'cap, 3'polyA, 20-32kb

Retroviridae

Icosadrico

Sim

80-100nm, esfricos

Picornaviridae

Icosadrico

No

28-30nm, esfrico-icosadricos 30-38nm, esfrico-icosadricos

Caliciviridae

Icosadrico

No

POLARIDADE POSITIVA

Astroviridae

Icosadrico

No

28-30nm, esfricos

Coronaviridae

Helicoidal

Sim

80-220nm, pleomrficos ou aproximadamente esfricos

Arteriviridae

Icosadrico

Sim

50-70nm, aproximadamente esfricos

RNA de cadeia simples (+), linear ,5'cap, 3' polyA, 15kb RNA de cadeia simples (+), linear, 5'cap, 3'polyA, 9.711.8kb RNA de cadeia simples (+), linear, 5'cap/IRES, 3'polyA/poliC, 9.5-12.5kb RNA de cadeia simples (-), linear, 15-16kb

Togaviridae

Icosadrico

Sim

70nm, esfricos

Flaviviridae

Icosadrico

Sim

45-60nm, esfrico

FITA SIMPLES

Paramyxoviridae

Helicoidal

Sim

150-300nm, pleomrficos, aproximadamente esfricos, filamentosos

Rhabdoviridae

Helicoidal

Sim

70-85 x 130-380 nm, forma de projtil

RNA de cadeia simples (-), linear, 13-16kb

POLARIDADE NEGATIVA

Filoviridae

Helicoidal

Sim

80 x 780-970nm (at 14.000), pleomrficos (filamentosos, forma de U ou 6

RNA de cadeia simples (-), linear, 19.1kb

Bornaviridae

Sim

90nm, esfricos (?)

RNA de cadeia simples (-), linear, 8.9kb 6 a 8 segmentos de RNA de cadeia simples, (-), lineares, extremidades complementares permitem circularizao, 10-13.6kb 3 segmentos de RNA de cadeia simples (-), lineares, extremidades complementares permitem circularizao, 11-21kb 2 segmentos de RNA de cadeia simples (-), lineares, 10-14kb 2 segmentos de RNA de cadeia dupla, lineares, 5.7-5.9kb 10, 11 ou 12 segmentos de RNA de cadeia dupla, lineares, 16-27kb

Orthomyxoviridae

Helicoidal

Sim

80-120nm, ovides, filamentosos, aproximadamente esfricos, pleomrficos

Bunyaviridae

Helicoidal

Sim

80-120nm, pleomrficos ou esfricos.

Arenaviridae

Helicoidal

Sim

50 x 300nm , esfricos ou pleomrficos

FITA DUPLA

Birnaviridae

Icosadrica

No

60nm, icosadricos

Reoviridae

Icosadrica

No

60-80nm, aproximadamente esfricos

CLASSIFICAO E NOMENCLATURA DOS VRUS


Luciane Teresinha Lovato

2
39 39 41 41 42
42 42 43 44 44 45 46 46 47 47 48 48 49 49 50 50 51 51 52 52 52 53 54

1 Introduo 2 Taxonomia dos vrus 3 Nomenclatura dos vrus 4 Critrios utilizados para a classicao dos vrus 5 Famlias de vrus
5.1 Vrus com genoma DNA 5.1.1 Poxviridae 5.1.2 Asfarviridae 5.1.3 Herpesviridae 5.1.4 Adenoviridae 5.1.5 Papillomaviridae 5.1.6 Polyomaviridae 5.1.7 Parvoviridae 5.1.8 Circoviridae 5.1.9 Hepadnaviridae 5.2 Vrus com genoma RNA de sentido positivo 5.2.1 Picornaviridae 5.2.2 Caliciviridae 5.2.3 Astroviridae 5.2.4 Togaviridae 5.2.5 Flaviviridae 5.2.6 Coronaviridae 5.2.7 Arteriviridae 5.3 Vrus com genoma RNA de sentido negativo no-segmentado 5.3.1 Paramyxoviridae 5.3.2 Rhabdoviridae 5.3.3 Filoviridae 5.3.4 Bornaviridae

5.4 Vrus com genoma RNA de sentido negativo segmentado 5.4.1 Orthomyxoviridae 5.4.2 Bunyaviridae 5.4.3 Arenaviridae 5.5 Vrus com genoma RNA de ta dupla 5.5.1 Reoviridae 5.5.2 Birnaviridae 5.6 Vrus com genoma RNA que realizam transcrio reversa 5.6.1 Retroviridae

54 54 54 55 56 56 56 57 57

6 Bibliograa consultada

57

1 Introduo
Existe um nmero muito grande de vrus circulando nas diferentes espcies de seres vivos, desde vrus que infectam bactrias at aqueles que infectam organismos superiores, como os mamferos e plantas. Dentre estes, existem vrus altamente patognicos e outros que no causam doena nos seus hospedeiros, passando despercebidos. Atualmente, so reconhecidas mais de 1.500 espcies de vrus, que abrangem mais de 30.000 cepas, isoladas ou variantes. A classicao e nomenclatura dos vrus no seguem as regras determinadas para os demais microorganismos. medida que foram sendo identicados, os vrus foram sendo agrupados de forma aleatria, de acordo com os aspectos considerados mais importantes pelos grupos que os identicavam. Nas dcadas de 1950 e 1960, houve um grande avano na Virologia, resultando na identicao de um grande nmero de novos vrus. Com o intuito de determinar regras bsicas para classicar esses vrus, vrios comits foram formados, o que acabou gerando uma grande confuso taxonmica. Durante o Congresso Internacional de Microbiologia, realizado em Moscou, em 1966, foi criado o Comit Internacional para Nomenclatura de Vrus (ICTV). Esse comit teve a incumbncia de desenvolver um sistema nico de classicao e nomenclatura para todos os vrus. At hoje, o ICTV o rgo que determina as regras a serem seguidas para a classicao dos vrus at o nvel de espcie. Esse comit se rene periodicamente, com o m de revisar e atualizar os critrios de classicao, de modo que as novas descobertas biolgicas e moleculares possam ser incorporadas aos critrios taxonmicos j existentes. Com isso, a classicao dos vrus nas diversas hierarquias tornou-se dinmica e pode ser alterada medida que novas informaes biolgicas ou moleculares assim o justiquem. A classicao apresentada neste texto est de acordo com a ltima reviso do ICTV, datada de 07 de julho de 2007.

2 Taxonomia dos vrus


De acordo com os vrios critrios adotados, os vrus so classicados hierarquicamente em ordens, famlias, subfamlias, gneros e espcies. O suxo virales utilizado para designar a ordem. Para a denominao de famlia, utiliza-se o suxo viridae; para subfamlia, utiliza-se virinae; e para gnero, o suxo virus. Por exemplo, o vrus da cinomose canina est classicado na ordem Mononegavirales, famlia Paramyxoviridae, subfamlia Paramyxovirinae, gnero Morbillivirus e, nalmente, espcie, como vrus da cinomose canina (canine distemper virus, CDV). As famlias so os agrupamentos fundamentais dos vrus, agrupando agentes que possuem caractersticas estruturais, morfolgicas, genticas e biolgicas em comum. Algumas famlias a minoria so agrupadas em nveis hierrquicos superiores: as ordens. Da mesma forma, nem todas as famlias so divididas em subfamlias; algumas delas apresentam o gnero como nvel hierrquico imediatamente inferior, ou seja, nem todos os vrus so classicados em todos os nveis hierrquicos possveis, possuindo complexidades de classicao diferentes entre si. Os vrus que apresentam algumas caractersticas biolgicas, estruturais e moleculares em comum so agrupados em uma mesma famlia. Por exemplo, todos os membros da famlia Herpesviridae possuem vrions grandes, com envelope contendo vrias glicoprotenas, capsdeo icosadrico, uma camada protica denominada tegumento entre o capsdeo e o envelope. O genoma composto por uma molcula de DNA de ta dupla linear. Esses vrus so capazes de estabelecer infeces latentes em seus hospedeiros. Os vrus que apresentam essas caractersticas (e que por isso compem a famlia Herpesviridae) podem ser subdivididos em subfamlias, de acordo com algumas caractersticas que possuem em comum e que so diferentes dos outros vrus da famlia. Os membros da subfamlia Alphaherpesvirinae possuem um amplo espectro de hospedeiros, apresentam um ciclo rpido e ltico em clu-

40

Captulo 2

las de cultivo e estabelecem infeces latentes em neurnios sensoriais e autonmicos. Essas caractersticas diferem dos membros das outras subfamlias: Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae. Os vrus de uma famlia ou de uma subfamlia podem ser divididos em gneros, de acordo com propriedades biolgicas, e, principalmente, moleculares, como a estrutura e organizao genmica: a subfamlia Alphaherpesvirinae possui dois gneros, o Simplexvirus e o Varicellovirus. Dentro de cada gnero se encontram as espcies, que so grupos de vrus muito semelhantes entre si (a exemplo de espcies de animais), mas que apresentam algumas diferenas que justicam a sua classicao como vrus diferentes (e tambm diferentes dos vrus do outro gnero). Por exemplo, no gnero Varicellovirus, encontram-se classicados os herpesvrus bovinos tipos 1 e 5 (BoHV-1 e BoHV-5), o herpesvrus suno (SuHV1) ou vrus da doena de Aujeszky (PRV), entre outros. A classicao dos vrus em espcies no consensual entre os virologistas. A denio de espcie aceita pelo ICTV foi estabelecida em 1991 e diz o seguinte: espcie de vrus uma classe polythetic1 de vrus que constitui uma linhagem replicativa e ocupa um nicho ecolgico particular. Uma classe polythetic denida em termos de um amplo grupo de critrios sendo que nenhum dos critrios isoladamente necessrio ou suciente. Dessa forma, cada membro da classe deve possuir um nmero mnimo de caractersticas, mas nenhum dos aspectos necessita ser encontrado em todos os membros de uma classe. Assim, diferentes caractersticas podem ser usadas em diferentes grupos de vrus. A classicao em subespcies, cepas, variantes e isolados no existe de forma ocial, embora seja reconhecida a sua importncia para o diagnstico, para estudos biolgicos e moleculares e tambm para a produo de vacinas. A seguir so apresentadas algumas denies desses termos. O termo isolado (ou amostra) refere-se a um vrus que foi obtido por isolamento de uma determinada fonte de infeco (animal infectado),
A traduo para o termo polythetic no consta em dicionrios ociais; por esta razo o termo foi escrito na sua forma original e a denio colocada logo em seguida no texto.
1

por exemplo: o SV-299/04 um BoHV-5 isolado do crebro de um bovino que desenvolveu meningoencefalite no estado do Rio Grande do Sul. A denominao SV-299/04 foi dada pelo laboratrio que realizou o isolamento do vrus e referese ao nmero do protocolo. Qualquer vrus que tenha sido isolado de material clnico e sobre o qual se conhea pouco, alm de sua identidade, constitui-se em um isolado ou amostra. O termo cepa utilizado para designar amostras de vrus que j foram bem caracterizadas e sobre as quais j se possui certo conhecimento. A denominao cepa tambm pode ser utilizada para se referir a isolados de um vrus que podem apresentar pequenas variaes sem deixar de pertencer s mesmas categorias taxonmicas. Por exemplo, o vrus da doena de Newcastle (NDV) pode apresentar diferentes nveis de virulncia, dependendo da cepa do vrus que est causando a doena. Existem trs cepas desse vrus em ordem crescente de virulncia: as lentognicas, as mesognicas e as velognicas. Assim, aqueles isolados do vrus que apresentam alta virulncia pertencem cepa velognica, os que apresentam virulncia moderada so mesognicos, e os de baixa virulncia so os lentognicos. Cepas de referncia so cepas amplamente caracterizadas e reconhecidas nacional ou internacionalmente, que so utilizadas como referncia para determinado vrus em testes de diagnstico, pesquisa e para a produo de vacinas. Por exemplo, a cepa Cooper do BoHV-1 serve de referncia para comparaes de isolados desse vrus e amplamente utilizada em diagnstico e na produo de vacinas. A terminologia wild-type refere-se cepa original do vrus que circula na natureza. No caso da existncia de mutantes, o wild-type a cepa que deu origem aos mutantes. Em portugus, utilizam-se os termos cepa de campo (ou vrus de campo), no caso dos vrus circulantes na populao; e cepa original ou parental no caso da produo e/ou comparao com mutantes. Variantes ou mutantes so vrus que diferem do wild-type em alguma caracterstica fenotpica, como, por exemplo, o vrus da vacina contra a doena de Aujeszky um mutante de deleo que foi produzido a partir da cepa Bartha do herpesvrus suno tipo 1 (SuHV-1).

Classicao e nomenclatura dos vrus

41

3 Nomenclatura dos vrus


No uso formal, as palavras que designam as famlias, subfamlias e gneros devem iniciar com letra maiscula e devem ser escritas em itlico ou sublinhadas. O nome da espcie do vrus no deve iniciar com letra maiscula (a no ser que este nome corresponda a um nome prprio de regio, cidade etc.) e deve ser escrito com fonte normal, sem itlico. No uso formal, a hierarquia (txon) deve preceder a unidade taxonmica. Exemplo: a famlia Parvoviridae; o gnero Parvovirus. No uso informal (ou vernacular) os termos referentes famlia, subfamlia, gnero e espcie devem ser escritos com letras minsculas, sem itlico ou sublinhado. Neste caso, o suxo formal no includo e o nome do txon segue o termo usado para denir a unidade taxonmica. Escreve-se ento: a famlia dos poxvrus, o gnero parapoxvirus. O uso informal em portugus deve suprimir letras que no existam no alfabeto da lngua portuguesa. Exemplo: para se referir de forma vernacular aos membros da subfamlia Alphaherpesvirinae, deve-se escrever: os alfaherpesvirus. Os membros da famlia Orthomyxoviridae devem ser tratados como os ortomixovrus. No uso informal, o nome do txon , muitas vezes, suprimido, o que pode resultar em confuses. Isto se deve raiz comum das palavras utilizadas para denir as unidades taxonmicas nos diferentes nveis. Dessa forma, dependendo do contexto, a palavra avivrus pode estar sendo usada para referir-se tanto famlia Flaviviridae como ao gnero Flavivirus. Para evitar essa ambigidade, aconselha-se o uso do txon precedendo o termo usado. Exemplo: vrus do gnero Flavivirus. A nomenclatura ocial dos vrus utiliza abreviaturas, que so constitudas pelas iniciais do nome da espcie viral. No presente texto, sero utilizadas as abreviaturas derivadas da nomenclatura na lngua inglesa, por exemplo, herpesvrus bovino tipo 1 (do ingls bovine herpesvirus type 1, BoHV-1). No uso informal, muitos vrus podem ser denominados de duas ou trs formas diferentes,

de acordo com a sua denominao original e com a nomenclatura ocial preconizada pelo ICTV. As recomendaes do ICTV so de que a sua nomenclatura substitua as anteriores, embora alguns deles continuem a ser denominados pela nomenclatura tradicional. Citam-se como exemplos o SuHV-1, que tambm conhecido como vrus da doena de Aujeszky (ADV) ou vrus da pseudoraiva (PRV), e o BoHV-1, que tambm conhecido como vrus da rinotraquete infecciosa bovina (IBRV). Exemplos de nomenclatura de vrus: a) Formal: famlia: Picornaviridae; gnero: Aphtovirus; espcie: vrus da febre aftosa (foot and mouth disease vrus, FMDV); Vernacular: Os aftovrus so sensveis ao pH baixo [...]. b) Formal: famlia: Herpesviridae, subfamlia: Alphaherpesvirinae, gnero: Alphaherpesvirus, espcie: herpesvrus suno tipo 1 (vrus da doena de Aujezsky); Vernacular: O vrus da doena de Aujeszky um alfaherpesvrus [...]. c) Formal: ordem: Mononegavirales; famlia: Paramyxoviridae; subfamlia: Pneumovirinae; gnero: Pneumovirus, espcie: vrus sincicial respiratrio bovino (BRSV); Vernacular: Os pneumovrus causam doena respiratria [...]. d) Formal: famlia: Flaviviridae; gnero: Flavivirus; espcie: vrus da febre amarela (YFV); Vernacular: O vrus da febre amarela um avivrus transmitido por mosquitos.

4 Critrios utilizados para a classicao dos vrus


A evoluo nos mtodos de deteco e caracterizao dos vrus determinou uma evoluo nos critrios utilizados para a sua classicao. A diferenciao entre vrus e os demais microorganismos foi o primeiro passo na classicao dos agentes virais e essa diferena foi determinada, inicialmente, pela ltrabilidade dos vrus. Enquanto as bactrias eram retidas no ltro, os vrus passavam por ele, surgindo a denominao de agentes ltrveis.

42

Captulo 2

No incio, as caractersticas ecolgicas e de transmisso, sinais clnicos da doena e tropismo por determinado rgo ou tecido foram os critrios utilizados na classicao dos vrus. O desenvolvimento da microscopia eletrnica possibilitou a classicao de acordo com a morfologia das partculas virais. Ao longo dessa evoluo, outras caractersticas foram sendo mais conhecidas e consideradas para descrever os vrus. Aspectos como a composio qumica, o tipo de genoma, distribuio geogrca, vetores, estabilidade e antigenicidade dos vrus foram adquirindo importncia. Atualmente as tcnicas de biologia molecular tm sido utilizadas para renar e detalhar a classicao dos vrus, especialmente o seqenciamento e comparao entre seqncias do genoma. Estratgias de expresso gnica, homologia de nucleotdeos entre seqncias correspondentes, estrutura e funes de protenas virais tambm foram incorporadas aos critrios de classicao dos vrus. De acordo com o ICTV, as seguintes caractersticas so atualmente levadas em considerao para classicar os vrus em ordem, famlias, subfamlias e gneros: tipo de cido nuclico e organizao do genoma, estratgia de replicao e estrutura do vrion. A classicao em espcies, embora no regulamentada pelo ICTV, segue os seguintes critrios: a) homologia da seqncia do genoma; b) hospedeiros naturais; c) tropismo de tecido e clulas; d) patogenicidade e citopatologia; e) forma de transmisso; f) propriedades fsico-qumicas; g) propriedades antignicas. Uma outra classicao prtica, no ocial, regularmente usada entre os virologistas. Nesse caso, so levados em considerao os critrios epidemiolgicos e/ou clnico-patolgicos para agrupar os vrus. De acordo com esse critrio, os vrus so classicados em: a) respiratrios: vrus que penetram no hospedeiro por inalao e produzem infeco e doena primariamente no trato respiratrio. Ex: rinovrus, calicivrus;

b) entricos: vrus que penetram pela via oral e replicam no trato intestinal. Ex: coronavrus, rotavrus; c) arbovrus: vrus que replicam e so transmitidos por vetores artrpodos. Ex: vrus da encefalites eqinas leste e oeste; d) vrus oncognicos: vrus com potencial para induzir transformao celular e tumores nos hospedeiros. Ex: retrovrus, papilomavrus.

5 Famlias de vrus
A seguir sero apresentadas as famlias de vrus que contm patgenos de animais (Figuras 2.1 a 2.25). Em cada gnero, sero mencionados os principais vrus que causam doenas em animais de interesse para a medicina veterinria, ou seja, animais de produo e animais de companhia. Tambm sero citados os principais patgenos humanos. Cabe ressaltar, por essa razo, que esta lista no se constitui na relao completa dos vrus de cada famlia.

5.1 Vrus com genoma DNA 5.1.1 Famlia: Poxviridae


Subfamlia: Chordopoxvirinae (infectam vertebrados) Gneros: Orthopoxvirus: vrus da vaccinia (VACV), poxvrus bovino (varola bovina), vrus da ectromelia (camundongos); Parapoxvirus: vrus do ectima contagioso dos ovinos (ORFV), vrus da estomatite papular bovina (BPSV); Avipoxvirus: vrus da bouba aviria (FWPV), poxvrus do canrio (CNPV); Capripoxvirus: poxvrus dos caprinos (GTPV), poxvrus dos ovinos (SPPV), vrus da doena Lumpy Skin (LSDV); Leporipoxvirus: vrus do mixoma de coelhos (MYXV), vrus do broma de coelhos (RFV); Suipoxvirus: poxvrus suno (SWPV); Molluscipoxvirus: vrus do molusco contagioso (MOCV); Yatapoxvirus: vrus Tanapox (TANV) e Yatapox dos macacos (YMTV).

Classicao e nomenclatura dos vrus

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Subfamlia: Entomopoxvirinae (infectam insetos) Gneros: Alphaentomopoxvirus; Betaentomopoxvirus; Gammaentomopoxvirus. Os poxvrus so os maiores vrus de animais. Os vrions possuem uma forma retangular ou ovide, com simetria complexa e, geralmente, possuem envelope lipdico (algumas partculas podem no possuir). As dimenses das partculas virais podem variar de 220 a 450 nm de extenso x 140 a 260 nm de largura x 140 a 260 nm de espessura. O genoma consiste de uma nica molcula de DNA, linear, cadeia dupla, com 130 a 375 kbp. Esses vrus trazem, nos vrions, um nmero considervel de enzimas e fatores auxiliares; e realizam o ciclo replicativo inteiramente no citoplasma das clulas hospedeiras. A maioria das doenas produzidas por esses vrus caracteriza-se pela formao de leses vesiculares e crostosas na pele e/ou mucosas dos animais. O vrus da varola humana (smallpox) o mais importante vrus dessa famlia. Dentre os patgenos de animais domsticos, o mais comum em nosso meio o ORFV, uma doena caracterizada por leses vesiculares e pustulares na regio dos lbios, narinas e cascos.

5.1.2 Famlia: Asfarviridae


Gnero: Asvirus Espcie: vrus da peste suna africana (AFSV).

Fonte: Dra Sharon Brookes, Pirbright, UK (ICTVdB).

Figura 2.2. Fotografia de microscopia eletrnica de um vrion da famlia Asfarviridae(ASFV).

Fonte: Dr Stewart McNulty (web.qub.ac.uk).

Figura 2.1. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Poxviridae.

O ASFV o nico vrus classicado nessa famlia. Os vrions do ASFV possuem envelope lipoprotico e um capsdeo icosadrico formado por 1.892 a 2.172 unidades estruturais. O dimetro das partculas virais varia entre 175 e 215 nm. O genoma consiste de uma molcula de DNA de cadeia dupla linear, com 170 a 190 kb. O vrus replica no citoplasma da clula hospedeira. O ASFV transmitido por carrapatos do gnero Ornithodoros, constituindo-se no nico arbovrus entre os vrus DNA. Esse vrus mantido na natureza em sudeos selvagens e, ocasionalmente, transmitido aos sunos domsticos. O vrus encontrado na frica, mas j foi esporadicamente introduzido na Europa, onde causou doena em sunos de alguns pases. A peste suna africana caracterizada pela produo de hemorragias, principalmente nos rgos linfides. O nico relato da doena no Brasil ocorreu em 1978, no Rio de Janeiro. Atualmente o ASFV considerado extico no Pas.

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Captulo 2

5.1.3 Famlia: Herpesviridae


Subfamlia: Alphaherpesvirinae Gneros: Simplexvirus: herpesvrus bovino tipo 2 (BoHV-2) ou vrus da mamilite herptica (BMH), herpesvrus B (macacos), vrus do herpes simplex humano (HSV-1, HSV-2); Varicellovirus: BoHV-1 ou vrus da rinotraquete (IBRV), BoHV-5, SHV-1 ou PRV, herpesvrus eqino tipos 1, 3 e 4 (EHV-1, EHV-3, EHV-4), herpesvrus canino 1 (CaHV-1), herpesvrus felino tipo 1 (vrus da rinotraquete felina, FeHV-1), herpesvrus caprino tipo 1 (CpHV-1); Mardivirus: vrus da doena de Marek; Iltovirus: vrus da laringotraquete infecciosa das galinhas (ILTV); Subfamlia: Betaherpesvirinae Gneros: Cytomegalovirus: citomegalovrus suno; Muromegalovirus: citomegalovrus do camundongo 1; Roseolovirus: herpesvrus humano 6 (HHV6). Vrios betaherpesvrus animais ainda no foram classicados em gneros. Subfamlia: Gammaherpesvirinae Gneros: Linphocriptovirus: vrus Epstein-Barr (EBV) humano; Rhadinovirus: vrus da febre catarral maligna (MCFV); Ictalurivirus: herpesvrus do catsh de canal. A famlia Herpesviridae abriga um grupo grande e diverso de vrus encontrados em virtualmente todas as espcies de vertebrados. Os vrions contm envelope, capsdeo icosadrico e o dimetro pode variar entre 120 e 300 nm. Entre o capsdeo e o envelope, existe uma camada protica denominada tegumento. O genoma consiste de uma molcula de DNA de cadeia dupla linear, com 120 a 250 kb. Os vrus dessa famlia possuem uma importante propriedade biolgica em comum, que a capacidade de estabelecer infeces latentes nos seus hospedeiros. Embora todos os herpesvrus apresentem algumas caractersticas em comum, os vrus das trs subfamlias apresen-

tam diferenas biolgicas e moleculares. Os vrus da subfamlia Alphaherpesvirinae apresentam um ciclo replicativo rpido e ltico em cultivo celular, estabelecem infeces latentes em neurnios e produzem leses vesiculares em membranas mucosas. Vrios vrus animais so classicados nessa subfamlia, cujo prottipo o HSV-1. Os vrus da subfamlia Betaherpesvirinae apresentam uma replicao lenta em cultivo celular e estabelecem infeces latentes em glndulas secretrias e no tecido linforeticular. O herpesvrus humano tipo 5 (HHV-5) ou citomegalovrus humano (CMV) o prottipo dessa subfamlia. Os vrus da subfamlia Gammaherpesvirinae infectam linfcitos de forma ltica ou latente e alguns deles possuem potencial oncognico. Nesta subfamlia, est classicado apenas um patgeno de animais, o MCFV, uma doena sistmica de bovinos. O EBV, agente de mononucleose e tumores em humanos, o prottipo dessa subfamlia.

Fonte: Dra Linda Stannard (web.uct.ac.za).

Figura 2.3. Fotografia de microscopia eletrnica de um vrion da famlia Herpesviridae (HSV-1).

5.1.4 Famlia: Adenoviridae


Gneros: Mastadenovirus: vrus da hepatite infecciosa canina (CAdV-1), vrus da traqueobronquite infecciosa canina (CAdV-2), adenovrus sunos (SAV-1-9), adenovrus bovinos (BAV-1-9), adenovrus eqino (EAV-1 e 2); Aviadenovirus: vrus da sndrome da queda de postura; Atadenovirus: adenovrus ovino D; Siadenovirus: adenovrus dos perus B.

Classicao e nomenclatura dos vrus

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Fonte: Dra Cornelia Bchen-Osmond (ICTVdB).

Figura 2.4. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Adenoviridae.

Os adenovrus possuem vrions icosadricos grandes (dimetro de 80 a 100 nm), sem envelope e apresentam bras de 9 a 35 nm nos vrtices. O capsdeo envolve uma nica molcula de DNA de cadeia dupla linear, com 36 a 44 kb. Os adenovrus replicam no ncleo das clulas hospedeiras e, como alguns outros vrus DNA, a transcrio dos genes realizada pela maquinaria clula e ocorre de forma ordenada. Alguns produtos dos genes virais interferem com o controle do ciclo celular, e alguns adenovrus possuem potencial oncognico. O vrus tambm codica produtos que antagonizam os mecanismos inatos da resposta imunolgica. Os adenovrus so encontrados em humanos, diversas espcies de mamferos e aves e, em geral, so pouco patognicos. Quando associados com manifestaes clnicas, geralmente esto envolvidos em sinais respiratrios leves em animais e humanos. A doena de maior repercusso causada por esses vrus em animais provavelmente seja a hepatite infecciosa canina. Os adenovrus tm sido intensivamente estudados como vetores para terapia gentica e vacinas.

Deltapapillomavirus: papilomavrus do alce europeu (EEPV), papilomavrus de cervdeos (DPV), papilomavrus bovino (BPV-1 e BPV-2) e papilomavrus ovino (OvPV-1 e OvPV-2); Epsilonpapillomavirus: papilomavrus bovino tipo 5 (BPV-5); Zetapapillomavirus: papilomavrus eqino 1 (EcPV-1); Etapapillomavirus: papilomavrus de aves (FcPV); Thetapapillomavirus: papilomavrus dos psitacdeos (PePV); Iotapapillomavirus: papilomavrus dos Mastomys natalensis (MNPV); Kappapapillomavirus: papilomavrus dos coelhos (CRPV e ROPV); Lambdapapillomavirus: papilomavrus oral canino (COPV), papilomavrus felino (FDPV); Mupapillomavirus: papilomavrus humano (HPV-1 e HPV-63); Nupapillomavirus: papilomavrus humano 41 (HPV-41); Pipapillomavirus: papilomavrus oral do hamster (HaOPV); Xipapillomavirus: papilomavrus bovinos (BPV-3, BPV-4 e BPV-6); Omikronpapillomavirus: papilomavirus dos cetceos (PsPV).

5.1.5 Famlia: Papillomaviridae


Fonte: www.oralcancerfoundation.org

Gneros: Alphapapillomavirus: vrios papilomavrus humanos (prottipo: HPV-32); Betapapillomavirus: vrios papilomavrus humanos (prottipo: HPV-5); Gammapapillomavirus: vrios papilomavrus humanos (prottipo: HPV-4);

Figura 2.5. Fotografia de microscopia eletrnica de um vrion da famlia Papillomaviridae (Papilomavrus humano).

Os papilomavrus so vrus pequenos, sem envelope, com 52 a 55 nm de dimetro e simetria icosadrica. O capsdeo formado por 72 cap-

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Captulo 2

smeros, envolvendo o DNA circular de cadeia dupla de aproximadamente 8 kbp. Os vrus replicam no ncleo de clulas epiteliais do tecido descamativo, e as sucessivas etapas da replicao ocorrem em clulas com estgios diferentes de diferenciao. As etapas nais da replicao ocorrem apenas nas clulas maduras das camadas granulosa e crnea da pele. Os papilomavrus so agentes etiolgicos dos papilomas, tambm denominados verrugas, que consistem em leses nodulares na pele e mucosas de animais e humanos. Alguns desses vrus podem induzir a produo de tumores malignos. Esse problema particularmente importante no caso das verrugas genitais humanas, tambm conhecidas como condilomas. Existem mais de 60 sorotipos diferentes de papilomavrus causando doenas em humanos, e alguns deles so considerados de alto risco para a produo de tumores, como o caso dos HPV 16 e HPV 18, que esto envolvidos no desenvolvimento de cncer de colo de tero em mulheres. As espcies bovina, eqina e canina so as mais freqentemente afetadas por papilomas, no entanto, o desenvolvimento de tumores malignos nessas espcies no comum. A participao de papilomavrus na induo de tumores em animais parece ser limitada ao carcinoma de esfago, induzido pela ingesto de samambaia em bovinos.

vrus prottipos: Pa (papilomavrus de coelhos); po (poliomavrus de camundongos) e va (agente vacuolizante, SV-40). Atualmente, os poliomavrus e o prottipo SV-40 so classicados separadamente, na famlia Polyomaviridae. O interesse maior nesses vrus iniciou-se com a descoberta de que o SV-40 e outros poliomavrus eram capazes de produzir tumores em hamsters (por isso foram denominados pequenos vrus DNA tumorais). Embora estudos extensivos realizados durante dcadas no tenham sido capazes de demonstrar associao entre o SV-40 e tumores humanos, estudos recentes demonstraram a presena de seqncias de DNA e antgenos do SV-40 em certos tumores raros em humanos, renovando o interesse por esse vrus. Os poliomavrus foram muito estudados como modelos para Virologia e biologia molecular. O prottipo da famlia o SV-40, um vrus encontrado como contaminante de vacinas contra a poliomielite nos anos 1950.

5.1.6 Famlia: Polyomaviridae


Gnero: Polyomavirus: vrus smio 40 (SV-40), poliomavrus de camundongos (PoV), vrus BK (humanos), vrus JC (humanos), vrios poliomavrus de mamferos e aves. Os poliomavrus esto entre os menores vrus DNA. Possuem vrions icosadrico-esfricos com 45 nm, sem envelope, e uma molcula de DNA de ta dupla circular como genoma (5 kb). Os vrions so compostos por 72 capsmeros, formados por trs protenas: VP1, VP2 e VP3. O genoma est associado com histonas celulares, formando uma estrutura semelhante cromatina celular. A famlia Polyomaviridae era classicada anteriormente como uma subfamlia da Papovaviridae, cuja denominao derivava dos

Fonte: PHIL Library, CDC.

Figura 2.6. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Polyomaviridae.

5.1.7 Famlia: Parvoviridae


Subfamlia: Parvovirinae Gneros: Parvovirus; Patgenos animais: parvovrus canino tipos 1 e 2 (CPV-1; CPV-2), parvovrus felino (vrus da panleucopenia felina, FPLV), parvovrus suno (PPV), parvovrus bovino (BPV); Erythrovirus: vrus B19 humano;

Classicao e nomenclatura dos vrus

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Dependovirus: vrus adeno-associado 2 (AAV); Amdovirus: Aleutian mink disease virus; Bocavirus: parvovrus bovino, vrus minuto dos ces.

tivas na suinocultura. O parvovrus humano B-16 tem sido associado com abortos em mulheres.

5.1.8 Famlia: Circoviridae


Gneros: Circovirus: circovrus suno tipos 1 e 2 (PCV-1; PCV-2), vrus da doena das penas e bicos dos psitacdeos (BFDV), circovrus dos pombos (PiCV), circovrus dos gansos (GoCV), circovrus do canrio (CaCV); Gyrovirus: vrus da anemia das galinhas (CAV). Os vrus dessa famlia so os menores vrus conhecidos que infectam animais. O dimetro dos vrions, que no possuem envelope, pode variar entre 17 e 22 nm. Esses vrions apresentam uma aparncia esfrica microscopia eletrnica. O ncleo do vrion formado por uma molcula de DNA circular de cadeia simples. A replicao viral ocorre no ncleo da clula hospedeira, na fase S do ciclo celular. Essa famlia possui um nmero pequeno de patgenos animais, entre os quais o agente da CAV e o vrus da doena debilitante dos leites (PCV-2). Circovrus tambm j foram identicados em humanos.

Fonte: Dra Cornelia Bchen-Osmond (ICTVdB).

Figura 2.7. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Parvoviridae.

Subfamlia: Densovirinae Gneros: Densovirus: densovrus da Junonia coenia; Iteravirus: densovrus da Bombyx mori; Brevidensovirus: densovrus do mosquito Aedes aegypti; Pefudensovirus: densovrus da Periplaneta fuliginosa. Os parvovrus so vrus muito pequenos e, at h pouco tempo, eram considerados os menores vrus de animais e/ou humanos. Os vrions possuem um dimetro de 25 nm, no possuem envelope e apresentam uma aparncia esfrica microscopia eletrnica. Os vrus dessa famlia apresentam um DNA de cadeia simples linear de, aproximadamente, 5.2 kb. Alguns membros dessa famlia necessitam de uma co-infeco viral para realizar a sua replicao (Dependovirus), o que no o caso do gnero Parvovirus, no qual esto classicados importantes patgenos de animais e humanos. A replicao ocorre no ncleo de clulas que esto em processo de mitose, mais especicamente na fase S do ciclo celular. Os principais agentes de doena dessa famlia so os parvovrus que causam doenas gastroentricas em caninos e felinos. O parvovrus suno um importante agente etiolgico de perdas reprodu-

Fonte: Dr Stewart McNulty (web.qub.ac.uk).

Figura 2.8. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Circoviridae.

5.1.9 Famlia: Hepadnaviridae


Gneros: Orthohepadnavirus: vrus da hepatite B humana (HBV), vrus do esquilo do solo (GSHV),

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Captulo 2

vrus das marmotas (WHV) e outros recentemente identicados em vrias espcies; Avihepadnavirus: vrus da hepatite B dos marrecos (DHBV).

5.2 Vrus com genoma RNA de sentido positivo 5.2.1 Famlia: Picornaviridae
Gneros: Enterovirus: enterovrus bovinos 1 e 2 (BEV-1, BEV-2), enterovrus suno 1-13 (PEV-113), poliovrus (PV); Rhinovirus: rinovrus bovino 1-3, rhinovrus humanos (HRV-2-100); Hepatovirus: vrus da hepatite A humano (HAV); Cardiovirus: vrus da encefalomiocardite murina Theiler (EMCV); Aphtovirus: vrus da febre aftosa (FMDV); Parechovirus: parechovrus humano; Erbovirus: vrus da rinite eqina B (ERBV); Kobuvirus: Aichi vrus (AiV); Teschovirus: teschovirus suno 1 (PTV).

Fonte: Dra Linda Stannard (web.uct.ac.za).

Figura 2.9. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Hepadnaviridae (vrus da hepatite B).

Os vrus da famlia Hepadnaviridae causam hepatite em humanos e em algumas espcies de animais. Esses vrus freqentemente estabelecem infeco persistente, e a persistncia viral no hospedeiro est associada com cirrose heptica e hepatocarcinoma. As clulas infectadas pelos hepadnavrus produzem trs tipos de partculas vricas: os vrions completos possuem um dimetro de 42-47 nm e so compostos por um nucleocapsdeo icosadrico envolto por um envelope lipoprotico. Partculas esfricas e lamentosas, compostas apenas pelas protenas do envelope e pores da membrana plasmtica, tambm so produzidas pelas clulas infectadas. O genoma viral composto por uma molcula de DNA circular de cadeia parcialmente dupla. O ciclo replicativo dos hepadnavrus ocorre parte no ncleo e parte no citoplasma da clula hospedeira e envolve uma etapa de transcrio reversa. Os hepadnavrus possuem tropismo marcante por clulas hepticas e, freqentemente, produzem infeces hepticas persistentes/crnicas. O HBV o nico patgeno humano classicado nessa famlia. O vrus animal mais conhecido dessa famlia o DHBV, que causa uma doena muito similar hepatite B humana.

Fonte: www.vetsciences.free.fr

Figura 2.10. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Picornaviridae (poliovrus).

Os picornavrus possuem vrions esfricos pequenos, no-envelopados, com 28 a 30 nm de dimetro. O capsdeo icosadrico formado por 60 cpias de cada uma das quatro protenas VP1, VP2, VP3 e VP4. Alm das protenas do capsdeo, cada vrion possui tambm uma protena denominada VPg, associada ao cido nuclico na extremidade 5. O genoma composto de uma cadeia simples de RNA, de sentido positivo de 7.2 a 8.4 kb. A replicao do vrus ocorre inteiramente

Classicao e nomenclatura dos vrus

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no citoplasma, e o RNA traduzido diretamente pelos ribossomas. A infeco geralmente aguda e citoltica, ocorrendo a liberao dos vrions pela lise celular. Essa famlia contm vrios patgenos muito importantes para humanos e animais, como o vrus da poliomielite, o vrus da hepatite A, os rinovrus, os enterovrus, o FMDV, entre outros.

5.2.2 Famlia: Caliciviridae


Gneros: Vesivirus: calicivrus felino (FCV), vrus do exantema vesicular dos sunos (SVEV), vrus dos lees marinhos de San Miguel (SMSV); Lagovirus: vrus da doena hemorrgica dos coelhos (RHDV), vrus da doena hemorrgica das lebres pardas (EBHSV); Norovirus: vrus de Norwalk (humano); Sapovirus: vrus de Sapporo (humano).

ta uma protena (VPg) covalentemente ligada na extremidade 5. Em clulas infectadas, tambm detectado um RNA subgenmico de 2.2 a 2.4 kb. A replicao do vrus ocorre no citoplasma, e os vrus so liberados por lise celular. O patgeno animal mais conhecido dessa famlia o calicivrus felino, associado com doena respiratria em gatos. Um calicivrus (norovrus) tem sido considerado um dos principais agentes de diarria em pessoas de todas as idades.

5.2.3 Famlia: Astroviridae


Gneros: Mamastrovirus: astrovrus humanos e de vrias espcies de animais domsticos; Avastrovirus: astrovrus dos perus. Os astrovrus so pequenos, com 28 a30 nm de dimetro, sem envelope e com capsdeo icosadrico. A superfcie de algumas partculas vricas apresenta estruturas que lembram estrelas de cinco ou seis pontas, o que originou o nome da famlia. A replicao ocorre no citoplasma, e os vrus so liberados por lise celular. Os astrovrus tm sido isolados de casos de gastrenterite de bovinos, sunos, ces, gatos, perus, patos e humanos. Na grande maioria das espcies, a doena se manifesta como uma diarria passageira e raramente h complicaes. Entretanto, em patos, uma hepatite com altos ndices de mortalidade tem sido descrita.

Fonte: www.fli.bund.de

Figura 2.11. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Caliciviridae.

Os calicivrus so vrus pequenos (dimetro entre 30 a 40 nm) sem envelope. O capsdeo formado por 60 cpias de uma nica e grande protena. microscopia eletrnica, o vrus apresenta depresses caractersticas na superfcie, que lembram copos ou clices, o que originou a denominao da famlia. O genoma consiste de um cido nuclico RNA linear de cadeia simples e sentido positivo, com extenso de 7.4 a 7.7 kb. Semelhante aos picornavrus, o RNA dos calicivrus apresen-

Fonte: Dra Cornelia Bchen-Osmond (ICTVdB).

Figura 2.12. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Astroviridae.

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Captulo 2

5.2.4 Famlia: Togaviridae


Gneros: Alfavirus: vrus das encefalites eqinas do leste (EEEV), oeste (WEEV) e venezuelana (VEEV), alm de outros arbovrus zoonticos (Semliki Forest virus, SFV; Ross River virus, RRV; Sindbis, SIN); Rubivirus: vrus da rubola (humano). Os togavrus possuem vrions esfricos, com dimetro aproximado de 70 nm. O capsdeo envolto por um envelope lipdico que apresenta peplmeros formados por duas glicoprotenas. O genoma consiste de uma molcula de RNA linear, de sentido positivo, com extenso de 9,7 a 11.8 kb. As protenas no-estruturais so sintetizadas a partir de uma poliprotena traduzida diretamente do RNA genmico. As protenas noestruturais so produzidas pela traduo de um mRNA subgenmico, sintetizado a partir de uma cpia de RNA de sentido anti-genmico. A replicao ocorre inteiramente no citoplasma e a liberao da prognie viral ocorre por brotamento na membrana plasmtica. Os Alfavirus so transmitidos por insetos e a maioria deles zoontica. Os EEEV, WEEV e VEEV de maior importncia para a Veterinria esto classicados no gnero Alfavirus. O vrus da rubola, tambm classicado nessa famlia, um agente que infecta exclusivamente humanos.

5.2.5 Famlia: Flaviviridae


Gneros: Flavivirus: vrus da febre amarela (YFV, humano e de primatas), vrus da dengue (humano), vrus da encefalite japonesa (JEV), vrus Murray Valley (MVEV), vrus do Nilo Ocidental (WNV), vrus Wesselsbron (WBV), vrus do Louping Ill. Com possvel exceo do vrus da dengue, os demais vrus so zoonticos; Pestivirus: vrus da diarria viral bovina tipos 1 e 2 (BVDV-1; BVDV-2), vrus da peste suna clssica (CSFV), vrus da doena da fronteira (BDV); Hepacivirus: vrus da hepatite C (humano).

Fonte: PHIL Library, CDC.

Figura 2.14. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Flaviviridae (vrus do Nilo Ocidental).

Fonte: Dra Tuli Mukhopadnyay (ICTVdB).

Figura 2.13. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Togaviridae.

Os membros da famlia Flaviviridae possuem vrions envelopados, com capsdeo possivelmente icosadrico e com 45-60 nm de dimetro. Apresentam um genoma RNA linear de sentido positivo (9.5 a 12.5 kb), que traduzido em uma poliprotena, posteriormente clivada nas protenas individuais por enzimas virais e celulares. O genoma organizado de forma semelhante em todos os membros da famlia, com as protenas estruturais codicadas no primeiro tero (extremidade 5) e as no-estruturais nos teros nais (extremidade 3). No gnero Flavivrus, esto classicados vrios agentes de doenas hemorrgicas e encefalites transmitidas por mosquitos, entre elas o YFV, o vrus da dengue e o WNV. Im-

Classicao e nomenclatura dos vrus

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portantes patgenos para a medicina veterinria so classicados no gnero Pestivrus, entre eles o BVDV e o CSFV. O vrus da hepatite C de humanos o nico membro do gnero Hepacivirus.

5.2.6 Famlia: Coronaviridae

capsdeo helicoidal, que possui uma molcula de RNA linear de cadeia simples e sentido positivo. Dentre os vrus RNA, os coronavrus possuem o maior genoma, podendo variar de 27 a 32 kb. A sntese de um grupo de RNAs subgenmicos durante a replicao viral na clula infectada um aspecto comum aos vrus dessa famlia, assim como aos demais vrus da ordem Nidovirales. A replicao ocorre inteiramente no citoplasma. Esses vrus causam importantes doenas entricas em animais, incluindo a gastrenterite transmissvel dos sunos (TGE) e a peritonite infecciosa dos felinos (FIP). Os coronavrus humanos esto associados principalmente com os resfriados comuns. O vrus da SARS, agente de doena respiratria severa na sia entre 2003 e 2004, tambm classicado nessa famlia.

5.2.7 Famlia: Arteriviridae


Fonte: Dra Cornelia Bchen-Osmond (ICTVdB).

Figura 2.15. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Coronaviridae (SARS CoV).

Ordem Nidovirales Gnero: Coronavirus: vrus da bronquite infecciosa das aves (IBV), coronavrus dos perus (TCoV), vrus da gastrenterite transmissvel dos sunos (TGEV), coronavrus felino (FeCoV), vrus da peritonite infecciosa felina (FIPV), coronavrus canino (CCoV), coronavrus bovino (BCoV), coronavrus humano (HuCoV), vrus da pneumonia asitica (SarsCoV humano); Torovirus: torovrus eqino (EToV), torovrus bovino (BToV), torovrus suno (SToV), torovrus humano (HToV), vrus Berne (BeV), vrus Breda (BrV). A morfologia dos vrions, quando observada ao microscpio eletrnico, deu origem ao nome da famlia. Os vrions do gnero Coronavrus possuem dimetro de 80 a 220 nm e forma esfrica; os do gnero Torovrus, de 120 a 140 nm e aparncia bacilar ou na forma de rim. Vrus de ambos os gneros apresentam envelope lipdico com peplmeros que se projetam externamente por at 20 nm, e que do ao vrion o aspecto de coroa. Os coronavrus apresentam um nucleo-

Ordem: Nidovirales Gnero: Arterivirus: vrus da arterite eqina (EVAV), vrus elevador da lactato desidrogenase (LDEV), vrus da sndrome respiratria e reprodutiva dos sunos (PRRSV).

Fonte: Dr D. Robinson, South Dakota State University.

Figura 2.16. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Arteriviridae (PRRSV).

O nome dessa famlia originou-se da patologia induzida por esses vrus em eqinos, a arterite. Os arterivrus apresentam dimetro de 50 a 70 nm e possuem envelope. O genoma consiste de uma molcula de RNA linear de sentido positivo,

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Captulo 2

com extenso entre 13 e 15 kb. De forma similar ao que ocorre com os coronavrus, RNAs subgenmicos so produzidos durante a replicao desses vrus no citoplasma das clulas infectadas. A liberao dos vrus se d por exocitose aps brotamento dentro de vesculas no citoplasma. Alm do vrus da arterite eqina, est tambm classicado nessa famlia o PRRSV. Ambas as doenas so consideradas ocialmente exticas no Brasil. Entretanto, estudos sorolgicos demonstraram a presena de anticorpos contra o EVAV em eqinos de alguns estados brasileiros.

5.3 Vrus com genoma RNA de sentido negativo no-segmentado 5.3.1 Famlia: Paramyxoviridae
Ordem: Mononegavirales Subfamlia: Paramyxovirinae Gneros: Respirovirus: vrus da parainuenza bovina tipo 3 (bPI-3V), vrus Sendai (camundongos); Morbillivirus: vrus da cinomose canina (CDV), vrus da peste bovina (Rinderpest), vrus da peste dos pequenos ruminantes, morbilivrus dos golnhos, morbilivrus de focas (PhDV), vrus do sarampo (humanos); Rubulavirus: vrus da parainuenza canina tipo 2 (cPIV-2), vrus da caxumba (humanos); Henipavirus: vrus Hendra (HeV), vrus Nipah (NiV); Avulavirus: vrus da doena de Newcastle (NDV), paramixovrus das aves 2 a 9 (APMV-29). Subfamlia: Pneumovirinae Gneros: Pneumovirus: vrus sincicial respiratrio bovino (BRSV) e humano (hRSV); Metapneumovirus: metapneumovrus das aves AMPV (vrus da rinotraquete dos perus). Os vrus dessa famlia so grandes, pleomrcos, envelopados, com dimetro variando de 150 a 350 nm. Possuem um genoma RNA linear de sentido negativo, cadeia simples, com 16 a 20 kb. No envelope, so encontradas as glicoprotenas hemaglutinina (HN) e de fuso (F). Em alguns vrus, as glicoprotenas de superfcie

apresentam tambm uma atividade de neuraminidase. A hemaglutinina a protena viral responsvel pela ligao ao receptor celular, e a protena F realiza a fuso do envelope viral com a membrana da clula. A replicao e reunio dos componentes virais ocorrem no citoplasma, e a liberao feita por brotamento da membrana plasmtica. Na partcula viral, tambm so encontradas algumas cpias da enzima polimerase, que necessria para iniciar a replicao do vrus. Esses vrus esto associados principalmente com doenas respiratrias e foram identicados apenas em mamferos e aves. Alguns morbilivrus podem causar infeco persistente. Entre os vrus classicados nessa famlia e que causam doena em animais incluem-se o CDV e o NDV em aves, entre outros. O hRSV, o vrus do sarampo e da caxumba so patgenos importantes de humanos.

Fonte: Dr Samuel Baron (ICTVdB).

Figura 2.17. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Paramyxoviridae (vrus Sendai).

5.3.2 Famlia: Rhabdoviridae


Ordem: Monegavirales Gneros: Vesiculovirus: vrus da estomatite vesicular (VSV), vrios outros vrus isolados de insetos, alguns que infectam mamferos; Lyssavirus: vrus da raiva (RV), lissavrus de morcegos Lagos; Efemerovirus: vrus da febre efmera dos bovinos (BEFV);

Classicao e nomenclatura dos vrus

53

Novirhabdovirus: vrus da necrose hematopoitica infecciosa (HNV); Cytorhabdovirus: vrus da necrose amarela da alface (LNYV); Nucleorhabdovirus: vrus do tomate pequeno amarelo (PYDV).

5.3.3 Famlia: Filoviridae


Ordem: Mononegavirales Gneros: Marburgvirus: vrus de Marburg; Ebolavirus: vrus ebola. Os vrus dessa famlia apresentam formas lamentosas, pleomrcas, com dimetro de 80 nm e extenso que pode atingir at 14.000 nm. Podem ser vistas formas de U, de 6 ou, ainda, formas circulares. O genoma consiste de uma nica molcula de RNA linear, de cadeia simples e sentido negativo, compondo um nucleocapsdeo helicoidal. A replicao ocorre no citoplasma e o vrus liberado por brotamento na membrana plasmtica. Os vrus dessa famlia causam doenas hemorrgicas em humanos. Infeco natural com vrus de Marburg e a cepa Reston do vrus ebola tambm causa doena hemorrgica em macacos. Doena experimental pode ser induzida atravs de inoculao em macacos, cobaias, hamsters e camundongos. A manipulao desses vrus s permitida em laboratrios de nvel 4 de biosegurana. O vrus ebola um dos vrus mais letais j identicados para humanos. A histria natural desses vrus ainda no bem conhecida.

Fonte: Dr. F. Murphy (ICTVdB).

Figura 2.18. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Rhabdoviridae.

Os vrions dessa famlia possuem uma morfologia caracterstica, lembrando um projtil de arma de fogo, com uma das extremidades arredondadas e a outra romba. O dimetro dos vrions varia de 70 a 85 nm, e o comprimento pode variar de 130 a 380 nm. O vrus envelopado e apresenta peplmeros de 8 a 10 nm na superfcie; o nucleocapsdeo helicoidal. O genoma consiste de uma cadeia simples de RNA linear de sentido negativo e extenso de 10 a 13 kb. A replicao ocorre no citoplasma. O RNA genmico de sentido negativo inicialmente transcrito em RNAs subgenmicos, que so traduzidos nas protenas necessrias formao de novas partculas virais. A replicao do genoma ocorre a partir de um intermedirio positivo. O RV, que um dos vrus zoonticos mais importantes, o principal vrus dessa famlia. O VSV outro importante patgeno animal, capaz de infectar vrias espcies. Vrios rabdovrus de peixes e de plantas tambm so agrupados nessa famlia.

Fonte: Dr F. Murphy (ICTVdB).

Figura 2.19. Fotografia de microscopia eletrnica de um vrion da famlia Filoviridae (vrus Ebola).

54

Captulo 2

5.3.4 Famlia: Bornaviridae


Ordem: Mononegavirales Gnero: Bornavirus: vrus da doena de Borna (BDV). Os bornavrus so esfricos e envelopados, com dimetro de 90 nm. Possuem um genoma RNA de cadeia simples, sentido negativo e 8.9 kb. Apesar do genoma RNA, os vrus replicam no ncleo, onde produzem corpsculos de incluso. Esses vrus so agentes etiolgicos reconhecidos de doena neurolgica em ovinos e eqinos, mas j foram isolados tambm de gatos e bovinos. Alm disso, dados sorolgicos e moleculares recentes tm associado os bornavrus com doenas neuropsiquitricas humanas.

genoma ocorre no ncleo das clulas hospedeiras. Posteriormente, o vrus liberado da clula por brotamento na membrana plasmtica. Os vrus do gnero inuenza so os agentes etiolgicos da gripe. O vrus inuenza A causa gripe em humanos, aves, sunos, cavalos, martas, focas e baleias. O vrus inuenza B patgeno somente de humanos, e os de inuenza C, de humanos e sunos. A natureza segmentada do genoma desses vrus facilita a troca dos segmentos genmicos entre vrus das diferentes espcies quando infectam a mesma clula. Esse mecanismo permite, eventualmente, o surgimento de vrus bastante virulentos.

5.4 Vrus com genoma RNA de sentido negativo segmentado 5.4.1 Famlia: Orthomyxoviridae
Gneros: Inuenzavirus A (FluAV): vrus da inuenza A (humanos, aves, eqinos, sunos, recentemente ces e feldeos); Inuenzavirus B (FluBV): vrus da inuenza B (humanos); Inuenzavirus C (FluCV): vrus da inuenza C (humanos, sunos); Thogotovirus: vrus Thogoto de carrapatos (THOV), vrus Dhori (DHOV). Tem sido detectada sorologia positiva em bovinos e camelos; Isavirus: vrus da anemia infecciosa do salmo (ISAV). Os ortomixovrus possuem vrions envelopados pleomrcos, com 80 a 120 nm de dimetro. No envelope, esto inseridas as glicoprotenas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NE) que se extendem externamente por 10 a 14 nm. O genoma consiste de oito (vrus inuenza A), sete (vrus inuenza B) ou seis (vrus inuenza C) segmentos de RNA linear, sentido negativo de cadeia simples, com extenso total de 10 a 13.6 kb. Cada segmento genmico empacotado em um nucleocapsdeo helicoidal. A replicao do

Fonte: Dra Linda Stannard (web.uct.ac.za).

Figura 2.20. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Orthomyxoviridae (influenza A).

5.4.2 Famlia: Bunyaviridae


Gneros: Orthobunyavirus: vrus Bunyamwera (BOTV), vrus La Crosse (LACV), vrus Akabane (AKAV); Hantavirus: vrus Hantaan (hantavrus HTNV) de roedores e humanos; Nairovirus: vrus de Dugbe (DUGV), vrus da febre hemorrgica Crimean Congo (CCHFV), vrus da doena das ovelhas de Nairobi (NSDV); Phlebovirus: vrus da febre do vale Rift (RVFV); Tospovirus: vrios vrus de plantas.

Classicao e nomenclatura dos vrus

55

Fonte: Dra Linda Stannard (web.uct.ac.za).

Figura 2.21. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Bunyaviridae.

Os buniavrus possuem vrions esfricos ou pleomrcos, envelopados, com dimetro entre 80 e 120 nm. O genoma consiste de trs segmentos de RNA de cadeia simples e sentido negativo, organizados em nucleocapsdeos helicoidais. Esses vrus replicam no citoplasma. O ressortimento possvel entre vrus do mesmo gnero devido segmentao do genoma. Existe um grande nmero de vrus classicados nessa famlia, muitos deles no infectam animais domsticos ou seres humanos, apenas insetos. Os vrus patognicos dessa famlia so agentes de doenas respiratrias severas, hepatite, nefrite e encefalite em animais e humanos. Esses vrus so geralmente citopticos quando inoculados em clulas de vertebrados, mas so no-citopticos em clulas dos vetores invertebrados. A grande maioria dos vrus dessa famlia composta de arbovrus isolados ou transmitidos por mosquitos, carrapatos e outros artrpodos. Os vrus do gnero hantavrus so excees, uma vez que so mantidos e transmitidos por roedores. Alguns desses vrus (como o RVFV e o CCMFV) s podem ser manipulados em laboratrio de segurana nvel 4.

rus de roedores e humanos (LASV), vrus Junin (JUNV),vrus Machupo (MACV), vrus sabi (SABV), vrios outros vrus identicados em roedores e/ou causando doena em humanos. So vrus envelopados e pleomrcos, cujo dimetro varia de 100 a 300 nm. Possuem um genoma RNA de cadeia simples, sentido negativo e ambissense, com dois segmentos de extenso de 14 a 16 kb. Os vrus replicam no citoplasma e saem da clula por brotao da membrana plasmtica. Os arenavrus infectam diferentes espcies de roedores nas Amricas, frica e Europa de forma crnica e, na maioria das vezes, assintomtica. Alguns desses vrus causam doenas severas em humanos, algumas delas com aspectos hemorrgicos. Por isso esto entre os agentes mais importantes das febres hemorrgicas. A transmisso ocorre geralmente atravs de aerossis provenientes da urina contaminada desses animais. Entre os arenavrus causadores de doena em humanos est o vrus Lassa, agente etiolgico de febre hemorrgica em algumas regies da frica. No continente americano, j foram descritos o MACV na Bolvia, JUNV na Argentina, Guanarito na Venezuela e SABV no Brasil. Todos esses vrus so agentes de doenas hemorrgicas.

5.4.3 Famlia: Arenaviridae


Gnero: Arenavirus: vrus da coriomeningite linfoctica dos camundongos (LCMV), LassavFonte: Scientific American (ICTVdB).

Figura 2.22. Fotografia de microscopia eletrnica de um vrion da famlia Arenaviridae.

56

Captulo 2

5.5 Vrus com genoma RNA de cadeia dupla 5.5.1 Famlia: Reoviridae

vrus, e 12 segmentos e 27 kb para o Coltivrus. A replicao e montagem dos vrions ocorrem no citoplasma, de onde os vrions so liberados. O ressortimento de segmentos de RNA pode ocorrer quando mais de um vrus do mesmo gnero infectam a mesma clula. O BTV e os rotavrus de vrias espcies de mamferos so exemplos de patgenos importantes em veterinria. Os rotavrus so importantes causadores de diarria, sobretudo em crianas, em pases subdesenvolvidos.

5.5.2 Famlia: Birnaviridae


Gneros: Aquabirnavrus: vrus da necrose pancretica infecciosa (IPNV); Avibirnavrus: vrus da doena de Gumboro (IBDV); Entomobirnavrus: vrus X da drosla.

Fonte: Dra. Bchen-Osmond (ICTVdB)

Figura 2.23. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Reoviridae (rotavrus).

Gneros: Orthoreovirus: orthoreovrus de mamferos (MRV), orthoreovrus de aves (ARV), orthoreovrus de babunos (BRV); Orbivirus: vrus da lngua azul (BTV-1 a 24), vrus da encefalose eqina (EEV-1 a 7), vrus da peste eqina (AHSV-1 a 9); Rotavirus: rotavrus de todas as espcies (A a G); Coltivirus: vrus da febre do carrapato do Colorado (CTFV); Aquareovirus: aquareovrus A (ARV-A a F); Seadornavirus: virus kadipiro (KDV). Existem ainda os gneros de vrus que infectam plantas e insetos: Cypovirus, Idnoreovirus, Fijivirus, Oryzavirus e Phytoreovirus. Os reovrus possuem vrions complexos, sem envelope, compostos por duas ou trs camadas de protenas arranjadas de forma concntrica. O dimetro desses capsdeos pode variar de 60 a 85 nm e possui simetria icosadrica. O genoma consiste de molculas de RNA de cadeia dupla. O nmero e a extenso desses segmentos variam entre os gneros; sendo de 10 segmentos e 23 kb para o Reovrus, 10 segmentos e 18 kb para o Orbivrus, 11 segmentos e 16-21 kb para o Rota-

Fonte: Dr. Stewart McNulty, (www.qub.ac.uk).

Figura 2.24. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Birnaviridae.

Esses vrus possuem um genoma RNA linear de cadeia dupla com dois segmentos, denominados A e B. A extenso total do genoma varia entre 5.7 e 7 kb. Os vrions so formados por um capsdeo icosadrico, sem envelope, e dimetro de 60 nm. Os RNAs mensageiros so sintetizados a partir dos dois segmentos do genoma RNA e uma poliprotena produzida e, posteriormente, clivada. Maiores detalhes da replicao no so conhecidos. O patgeno mais conhecido dessa famlia o IBDV, que afeta galinhas.

Classicao e nomenclatura dos vrus

57

5.6 Vrus com genoma RNA que realizam transcrio reversa 5.6.1 Famlia: Retroviridae
Subfamlia: Orthoretrovirinae Gneros: Alpharetrovirus: vrus da leucose aviria (ALV), vrus do sarcoma Rous (RSV); Betaretrovirus: vrus do tumor mamrio do camundongo (MMTV), retrovrus Jaagsiekte dos ovinos (JSRV); Gammaretrovirus: vrus da leucemia felina (FeLV), vrus da leucemia murina (MuLV); Deltaretrovirus: vrus da leucose bovina (VLB), vrus da leucemia de clulas T humano (HTLV-1 e 2); Epsilonretrovirus: vrus do sarcoma dermal de Walleye (WDSV); Lentivirus: vrus da anemia infecciosa eqina (EIAV), vrus da imunodecincia felina (FIV), vrus da artrite-encefalite caprina (CAEV), vrus Maedi-Visna (MMV), vrus da imunodecincia dos smios (SIV), vrus da imunodecincia humana (HIV-1 e 2); Subfamlia: Spumaretrovirinae Spumavirus: vrus foamy do chimpanz.

ral complexa, incluindo uma etapa de transcrio reversa. Os retrovrus so envelopados e possuem um capsdeo icosadrico. O dimetro dos vrions pode variar entre 80 e 100 nm. O genoma diplide, consistindo de duas cpias de RNA cadeia simples e sentido positivo. A replicao dos retrovrus ocorre em parte no citoplasma e em parte no ncleo. A replicao viral envolve a sntese de uma cpia DNA do RNA genmico (provrus), que integrada no cromossomo celular. A sntese de mRNAs, para a sntese protica e do RNA genmico, ocorre pela transcrio do provrus pela maquinaria celular de transcrio. Pelo fato de integrar o seu provrus ao DNA da clula, os retrovrus infectam o hospedeiro para o resto da vida. Os vrus dessa famlia esto associados principalmente a doenas tumorais e imunossupressivas. O ALV e o EIAV esto entre os vrus de importncia veterinria classicados nessa famlia. O vrus da AIDS (HIV) o retrovrus de maior repercusso em sade humana.

6 Bibliograa consultada
CONDIT, R.C. Principles of Virology. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.2, p.19-51. DE VILLIERS, E.M. et al. Classication of papillomaviruses. Virology, v.324, p.17-27, 2004. FAUQUET, C.M.; FARGETTE, D. International Committee on Taxonomy of Viruses and the 3,142 unassigned species. Virology Journal, v.2, p.64, 2005. ICTVdB - The Universal Virus Database, version 4. BNCHENOSMOND, C. (Ed). New York, USA: Columbia University. KOCI, M.D.; SCHULTZ-CHERRY, S. Avian astroviruses. Avian Pathology, v.31, p.213-227, 2002. MAYO, M.A. Names of viruses and virus species - an editorial note. Archives of Virology, v.147, p.1463-1464, 2002. MURPHY, F. A. Virus Taxonomy. In: FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 3.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 1996. Cap.2, p.15-57. MURPHY, F.A. et al. Veterinary virology. 3.ed. San Diego, CA: Academic Press, 1999. 629p. PRINGLE, C.R. Virus nomenclature. Archives of Virology, v.144, p.1463-1466, 1999. PRINGLE, C.R. Virus taxonomy--1999. The universal system of virus taxonomy, updated to include the new proposals ratied

Fonte: University of Otaga, NZ (ICTVdB).

Figura 2.25. Fotografia de microscopia eletrnica de vrions da famlia Retroviridae (HIV).

Nessa famlia, esto classicados vrios patgenos de interesse na Medicina Veterinria em diversas espcies. Esses vrus apresentam, como principal caracterstica, uma replicao vi-

58
by the International Committee on Taxonomy of Viruses during 1998. Archives of Virology, v.144, p.421-429, 1999. PRINGLE, C.R. Virus taxonomy--San Diego. Archives of Virology, v.143, p.1449-1459, 1998. THIEL, H.J.; KONIG, M. Caliciviruses: an overview. Veterinary Microbiology, v.69, p.55-62, 1999. VAN REGENMORTEL, M.H. Virologists, taxonomy and the demands of logic. Archives of Virology, v.151, p.1251-1255, 2006. VAN REGENMORTEL, M.H.; MAHY, B.M. Emerging issues in virus taxonomy. Emerging Infectious Diseases, v.10, p.8-13, 2004.

Captulo 2

DETECO, IDENTIFICAO E QUANTIFICAO DE VRUS


Mrio Celso S. Brum & Rudi Weiblen

3
61 61
61 63 63 65 65 65 66 67 67 68 68 68 68 69 69 70 70 73 73

1 Introduo 2 Mtodos de deteco e identicao de vrus


2.1 Deteco direta por microscopia eletrnica 2.2 Deteco de propriedades biolgicas dos vrus 2.2.1 Hemaglutinao 2.2.2 Hemadsoro 2.3 Deteco de antgenos 2.3.1 Imunouorescncia 2.3.2 Imunoperoxidase 2.3.3 Ensaio imunoenzimtico 2.3.4 Radioimunoensaio 2.3.5 Imunocromatograa 2.3.6 Aglutinao em ltex 2.3.7 Imunodifuso em gar 2.3.8 Imunoblots 2.4 Deteco/identicao de cidos nuclicos 2.4.1 Tcnicas de hibridizao (Southern, Northern blot) 2.4.2 Hibridizao in situ 2.4.3 Reao de polimerase em cadeia 2.4.4 Anlise de restrio 2.4.5 Eletroforese em gel de poliacrilamida

3 Multiplicao de vrus
3.1 Inoculao em animais susceptveis 3.2 Inoculao em ovos embrionados 3.3 Inoculao em cultivo celular

73
74 74 75

4 Quanticao de vrus
4.1 Diluio limitante 4.2 Ensaio de placa 4.3 Outros mtodos de quanticao

81
81 81 83 84 84 84 85 86

5 Identicao e caracterizao de um isolado


5.1 Sensibilidade a solventes orgnicos 5.2 Concentrao e puricao por ultracentrifugao

6 Biossegurana laboratorial 7 Bibliograa consultada

1 Introduo
Os grandes avanos no entendimento dos mecanismos de replicao, transmisso e patogenia de vrios agentes virais somente foram possveis aps o desenvolvimento de mtodos de propagao e deteco de vrus in vitro. No princpio da Virologia, antes mesmo da classicao dos vrus como agentes ltrveis, as alteraes produzidas nos animais durante as infeces virais j eram observadas e descritas. No entanto, a falta de conhecimentos sobre o agente e de equipamentos adequados fez com que a diferenciao entre as infeces fosse realizada apenas entre as enfermidades com sinais clnicos caractersticos. Inicialmente, o nico mtodo de propagao viral era a inoculao em animais susceptveis. Embora essa forma de amplicao viral tenha sido muito til nos primrdios da Virologia, esse mtodo de amplicao restringiu o estudo dos vrus devido diculdade de manuteno de animais e tambm pela baixa reprodutibilidade da maioria das enfermidades vricas. A maior revoluo na Virologia ocorreu aps o advento dos antibiticos, o que possibilitou o estabelecimento de cultivos celulares livres de contaminantes bacterianos. O uso dos cultivos celulares contribuiu de maneira decisiva para a deteco e multiplicao dos vrus com diversas nalidades, viabilizando o diagnstico, estudos bioqumicos e moleculares e produo de vacinas. Nesse sentido, a citopatologia, produzida por alguns vrus em clulas de cultivo durante a sua replicao, uma caracterstica amplamente utilizada para demonstrar a presena do agente em material clnico, permitindo a realizao do diagnstico. As tcnicas de deteco viral foram desenvolvidas inicialmente com ns diagnstico, ou seja, para pesquisar vrus em amostras clnicas; porm passaram a ser utilizadas para uma ampla gama de nalidades em laboratrios de virologia. A conrmao da presena do vrus em tecidos, secrees ou excrees pode ser realizada pelo uso de tcnicas que demonstrem o agente, o efeito da replicao em cultivo celular, produtos intermedirios do processo replicativo (protenas, corpsculos de incluso) ou o material gentico (DNA ou RNA viral). Muitas vezes recorre-se

realizao de duas ou mais tcnicas para a conrmao denitiva da presena do agente. A escolha de uma determinada tcnica de deteco est diretamente relacionada com a forma de infeco e com o tropismo do vrus por determinados tecidos e rgos. Por outro lado, a disponibilidade de equipamentos, qualidade dos reagentes e de pessoal capacitado para a execuo das tcnicas tambm podem determinar a escolha da tcnica a ser empregada. A simples deteco do agente viral em uma amostra clnica deve ser considerada com cautela, pois a sua presena pode no ser um indicativo seguro da etiologia da doena. Os mtodos de deteco dos agentes virais podem ser divididos em mtodos diretos e indiretos. Os mtodos diretos compreendem as tcnicas em que o agente viral diretamente detectado, ou seja, a partcula viral observada e identicada de maneira precisa. A nica tcnica que se enquadra nesse princpio a microscopia eletrnica. Os mtodos de deteco indireta identicam as propriedades biolgicas ou produtos resultantes da replicao viral, como protenas ou cidos nuclicos. Neste captulo, sero apresentadas e discutidas as tcnicas utilizadas para a deteco de partculas vricas, protenas ou material gentico viral. A aplicao dessas tcnicas, com nalidades diagnsticas, ser abordada no Captulo 11. Alm disso, sero abordadas as maneiras de multiplicao, quanticao e caracterizao viral, bem como alguns aspectos de segurana laboratorial.

2 Mtodos de deteco e identicao de vrus


2.1 Deteco direta por microscopia eletrnica
A maioria dos agentes virais possui partculas vricas com caractersticas morfolgicas e estruturais peculiares s famlias as quais pertencem. Com base nesse aspecto, o mtodo mais simples de deteco e identicao de vrus a visualizao direta das partculas na amostra (Figura 3.1). Exemplos clssicos do uso da microscopia eletrnica (ME) com ns diagnsticos incluem a deteco de partculas vricas em crostas de leses causadas pelo ectima contagioso dos ovinos

62

Captulo 3

e pseudo-varola bovina (parapoxvrus) ou, ainda, a deteco do parvovrus em fezes caninas e


A

rotavrus ou coronavrus em fezes de bezerros com diarria.


B

Figura 3.1. Microscopia eletrnica. (A) Partculas de parapoxvrus em material coletado de leses de ovinos suspeitos de ectima contagioso (50.000x); (B) Partculas tpicas de rotavrus em fezes bovinas diarricas (260.000x); (C) Partculas caractersticas de calicivrus em clulas de cultivo, inoculadas com secreo nasal de um felino com doena respiratria (40.000x); (D) Partculas tpicas de herpesvrus no ncleo de clulas de cultivo, inoculadas com material coletado de um touro com balanopostite (48.000x); (E) Partculas do vrus da parainfluenza bovina 3 (bPI-3), observadas em sobrenadante de cultivo celular (260.000x); (F) Arranjo cristalino de partculas tpicas de picornavrus no citoplasma de clulas de cultivo, inoculadas com material coletado de um bovino com doena gastrentrica e respiratria (315.000x).

Deteco, identicao e quanticao de vrus

63

A ME possuiu grande aplicabilidade na pesquisa e identicao de vrus que no replicam com ecincia em cultivo celular. Essa tcnica permitiu a identicao de vrios agentes entricos de difcil cultivo, tais como: poxvrus, rotavrus, calicivrus, astrovrus, entre outros. Quando as partculas vricas esto presentes em grande quantidade, so facilmente observadas nas fezes de animais com diarria ou em lquidos vesiculares de infeces cutneas. A maior restrio da ME a sua baixa sensibilidade. Amostras clnicas que contenham quantidade inferior a 106-107 partculas vricas por mililitro no so detectadas como positivas por essa tcnica, gerando resultados falso-negativos. Essa quantidade de vrus geralmente encontrada em uidos vesiculares e fezes, o que no ocorre com tanta freqncia em secrees respiratrias. A sensibilidade, no entanto, no o nico limitante dessa tcnica. O custo elevado do equipamento e a exigncia de tcnicos altamente capacitados para a operao e interpretao dos resultados tambm representam limitaes. O perodo necessrio para a obteno dos resultados varia entre 15 minutos, nos casos em que o material observado diretamente no microscpio, at alguns dias quando h necessidade do processamento prvio da amostra para aumentar a possibilidade de deteco. Pode-se tambm realizar a ME em clulas de cultivo previamente inoculadas com o material suspeito. A sensibilidade da ME pode ser aumentada pelo uso de tcnicas que permitam a concentrao e facilitem a visualizao das partculas vricas. A claricao de amostras por centrifugao de baixa rotao empregada para remover partculas e substncias que possam interferir na tcnica. A ultracentrifugao utilizada com o objetivo de concentrar as partculas virais. A aglutinao com soro hiperimune rotineiramente utilizada e denomina-se imunoeletromicroscopia. Nesta metodologia, utiliza-se um soro hiperimune especco contra o agente suspeito, cujos anticorpos iro se ligar e promover a concentrao das partculas, facilitando a visualizao. Anticorpos marcados com micropartculas de ouro (tcnica de imunogold) tambm so utilizados para au-

mentar a sensibilidade do teste. Aps o processo de claricao e concentrao, a amostra corada negativamente, geralmente com tungstnio, e examinada sob ME. Alm do seu uso em diagnstico, a ME tem sido utilizada para o estudo da morfologia e ultra-estrutura de partculas vricas e tambm em estudos de patogenia. As caractersticas observadas para a identicao e caracterizao do agente so: o dimetro dos vrions, morfologia do nucleocapsdeo, presena ou no de envelope, presena de projees na superfcie das partculas, organizao dos agregados de partculas e a localizao celular dos vrions.

2.2 Deteco de propriedades biolgicas dos vrus 2.2.1 Hemaglutinao


Vrios vrus possuem protenas de superfcie que se ligam a eritrcitos, provocando a sua agregao e aglutinao, fenmeno denominado hemaglutinao (HA) (Tabela 3.1). A propriedade de aglutinar eritrcitos restrita a algumas famlias de vrus (exemplos: ortomixovrus e paramixovrus) e, para cada um desses vrus, a HA ocorre apenas com eritrcitos de determinadas espcies animais. Nos vrus da inuenza, por exemplo, a ligao entre a protena do envelope viral (hemaglutinina ou HA) com o cido N-acetilneuramnico da membrana dos eritrcitos de galinha a responsvel pela aglutinao. Baseando-se nesse princpio, a tcnica de HA pode ser utilizada para a deteco dos vrus que possuem essa propriedade biolgica. O teste realizado pela incubao de uma suspenso de eritrcitos com o material suspeito (puro ou em diluies) em microplacas com fundo em V ou U. Aps o perodo de incubao, a presena do agente hemaglutinante ser indicada pela formao de uma rede difusa de eritrcitos no poo. Em amostras negativas (ausncia do agente hemaglutinante), as hemcias no sero aglutinadas, iro rolar e se acumular no fundo da cavidade, formando um boto bem denido (Figura 3.2). Esse teste de fcil execuo, porm falha em detectar quan-

64

Captulo 3

Tabela 3.1. Vrus com atividade hemaglutinante sobre eritrcitos animais Vrus
BOVINOS
Adenovrus bovino (BAdV) Coronavrus bovino (BoCV) Parainfluenza 3 bovino (bPI-3) Encefalomielite eqina (EEEV, WEEV)

Fonte de vrus
Sobrenadante de cultivo celular Amostras fecais e sobrenadante de cultivo celular Sobrenadante de cultivo celular Macerado de crebro de camundongo Sobrenadante de cultivo celular ou lquido amnitico Sobrenadante de cultivo celular Suspenso de crebro de camundongo Sobrenadante de cultivo celular Sobrenadante de cultivo celular Fluido alantide Extratos de tecidos fetais ou sobrenadante de cultivo celular Sobrenadante de cultivo celular Amostras fecais ou sobrenadante de cultivo Amostras fecais ou sobrenadante de cultivo Fluido alantide Fluido alantide Fludo corioalantide

Eritrcitos (espcie)
Rato, bovino ou macacos rhesus Camundongo, hamster e rato Bovino e cobaia Ganso ou pinto de 1 dia Galinha e cobaia Rato ou macaco rhesus Ganso ou pinto de 1 dia Suno Galinha, rato, camundongo e hamster Galinha Humano, macaco, camundongo, cobaia, gato, galinha e rato Rato, macaco rhesus, humano e aves Suno ou macaco rhesus Suno ou macaco rhesus Mamferos e aves Galinha Galinha

EQINOS

Influenza eqina Adenovrus eqino (EAdV) Encefalite japonesa (JEV) Peste suna africana (ASFV)

SUNOS

Encefalomielite hemaglutinante dos sunos Influenza suna (SIV) Parvovrus suno (PPV)

CANINOS e FELINOS AVES LEPORINO

Adenovrus canino (CAdV) Parvovrus canino (CPV) Panleucopenia felina (FPLV) Influenza aviria (AIV) Doena de Newcastle (NDV) Bronquite infecciosa aviria (IBV)

Doena hemorrgica dos coelhos (RHDV)

Suspenso de tecidos e sobrenadante de cultivo

Humano do tipo O

tidades pequenas de vrus. Outra restrio que a atividade hemaglutinante uma propriedade restrita a algumas famlias de vrus, ou seja, a tcnica no possui aplicao universal. A atividade hemaglutinante pode ser inibida pela presena de anticorpos anti-hemaglutininas especcos. Os anticorpos especcos iro ligar-se protena hemaglutinante do vrus, impedindo a ligao desta com os eritrcitos. Dessa maneira, um mtodo para se detectar e quanticar anticor-

pos antivirais no soro de animais foi desenvolvido e denomina-se inibio da hemaglutinao (HI). A tcnica de HI pode ser utilizada tanto para a deteco de anticorpos antivirais como para a identicao de vrus hemaglutinantes. Aps a deteco da atividade HA, a tcnica de HI realizada, utilizando-se um anti-soro especco contra o vrus suspeito para conrmar o diagnstico. A aplicao desse mtodo em diagnstico ser abordada com detalhes no Captulo 11.

Deteco, identicao e quanticao de vrus

65

para a deteco de ortomixovrus, paramixovrus e asfarvrus.

+
Amostra suspeita Eritrcitos Incubao 1 hora

2.3 Deteco de antgenos virais 2.3.1 Imunouorescncia


A imunouorescncia (IFA) uma tcnica de deteco de antgenos e baseia-se na reao de anticorpos especcos com o antgeno presente no material suspeito. Os anticorpos so conjugados com uma substncia que emite luminosidade uorescente (uorescena) quando exposta luz ultravioleta (UV). A presena do antgeno no material revelada pela emisso de luminosidade uorescente. Essa metodologia pode ser aplicada em monocamada de clulas, em esfregaos celulares, em tecidos frescos, congelados ou includos em parana. Geralmente, o material deve ser previamente xado em etanol, metanol ou acetona. Aps a xao, incuba-se o material com o anticorpo especco marcado com o uorocromo (FITC isotiocianato de uorescena ou Texas Red). Posteriormente, sucessivas lavagens so realizadas para a remoo do anticorpo no-ligado. O material , ento, examinado ao microscpio de luz UV. A colorao verde-ma ou vermelha (para anticorpos marcados com FITC e Texas Red, respectivamente), visualizada contra um fundo escuro, indica a presena de antgenos virais na amostra. A emisso de uorescncia resulta da excitao do uorocromo conjugado ao anticorpo quando exposto luz UV. O resultado nal a observao de uma regio ou de toda a clula corada, pois as protenas virais esto dispersas no seu interior (Figura 3.3). Existem basicamente duas variantes da tcnica: a imunouorescncia direta (IFD) e a indireta (IFI). Na IFD, o anticorpo primrio (monoclonal ou policlonal) especco para o agente marcado com o uorocromo e adicionado diretamente sobre a amostra. No caso da IFI, a tcnica realizada em duas etapas. A primeira incubao realizada com o anticorpo primrio especco para os antgenos virais e, aps a remoo dos anticorpos que no se ligaram aos antgenos, por sucessivas lavagens, adiciona-se o anticorpo secundrio, marcado com o uorocromo. O anti-

Amostra positiva

Amostra negativa

Figura 3.2. Teste de hemaglutinao (HA) para a pesquisa de vrus. A amostra suspeita de conter o vrus misturada com uma suspenso de eritrcitos e incubada a 37 C por 1 hora. (A). A presena do vrus indicada pela aglutinao dos eritrcitos e formao de uma rede fina difusa no fundo da cavidade; (B). Na ausncia do vrus, os eritrcitos rolam para o fundo da cavidade, formando um boto de contorno bem definido.

2.2.2 Hemadsoro
Durante o ciclo replicativo de alguns vrus em cultivo celular, determinadas protenas virais so expostas na superfcie das clulas infectadas. Algumas dessas protenas possuem a capacidade de se ligar a eritrcitos quando esses so adicionados ao meio de cultivo. Esse processo denominado hemadsoro (HAD), e restrito interao de alguns vrus com eritrcitos de certas espcies de mamferos e aves. A HAD um indicativo da presena desses vrus no material suspeito. Essa tcnica de simples execuo, sendo empregada

66

Captulo 3

corpo secundrio (especco para a espcie animal na qual foi produzido o anticorpo primrio) reconhece e se liga ao anticorpo primrio. A IFA uma tcnica simples e se constitui em uma das tcnicas mais utilizadas em Virologia, possuindo diversas aplicaes, incluindo o diagnstico de infeces vricas. A aplicao dessa tcnica em diagnstico ser abordada no Captulo 11. Como desvantagens, incluem-se a necessidade de um microscpio de luz UV e a possibilidade de alguns tecidos ou clulas emitirem uorescncia natural, o que pode dicultar a interpretao do resultado.
A
Imunofluorescncia direta

B
Imunofluorescncia indireta

Clula infectada Antgenos virais Anticorpo antivrus-FITC

Anticorpo antivrus Anticorpo anti-IgG-FITC

ou peroxidase) ou a fosfatase alcalina (AP). O termo IPX tem sido utilizado quase como sinnimo, embora deva ser ressaltado que essa no a nica enzima utilizada na tcnica. Essa tcnica pode ser aplicada em monocamadas celulares, esfregaos ou diretamente em tecidos, sendo denominada de imunocitoqumica (ICQ) ou imunoistoqumica (IHC), respectivamente. A metodologia semelhante IFA, existindo tambm a IPX direta e indireta. Na IPX direta, o material xado incubado com o anticorpo antiviral marcado com a enzima, seguido da lavagem e adio do substrato. A presena do antgeno no material revelada pela ao da enzima no substrato. Utilizam-se substratos cromognicos (aminoetilcarbazol AEC; diaminobenzidina DAB; ou 4-cloronaftol) que produzem uma colorao marrom ou marrom-carmim pela ao da enzima e formam um precipitado na clula positiva (Figura 3.4). A IPX indireta utiliza o anticorpo primrio especco para o antgeno, e o anticorpo secundrio marcado com a enzima. Essa variao da
A Imunoperoxidase direta B Imunoperoxidase indireta

Clula infectada Antgenos virais Anticorpo antivrus HRPO

Anticorpo antivrus Anticorpo anti-IgG-HRPO


Substrato

Figura 3.3. Ilustrao demonstrativa da tcnica de imunofluorescncia para a deteco de antgenos virais em clulas. (A) Imunofluorescncia direta (IFD); (B) Imunofluorescncia indireta (IFI).

2.3.2 Imunoperoxidase
A tcnica de imunoperoxidase (IPX) baseiase no mesmo princpio da IFA, com a diferena que os anticorpos so marcados com uma enzima, que pode ser a horseradish peroxidase (HRPO
Figura 3.4. Ilustrao demonstrativa da tcnica de imunoperoxidase (IPX) para a deteco de antgenos virais em clulas. (A). Imunoperoxidase direta; (B) Imunoperoxidase indireta.

Deteco, identicao e quanticao de vrus

67

tcnica apresenta maior sensibilidade devido amplicao do sinal. A tcnica de IPX possui as mesmas aplicaes da IFA, porm apresenta a vantagem de no necessitar do microscpio de luz UV, j que as reaes podem ser visualizadas sob microscopia tica comum.

2.3.3 Ensaio imunoenzimtico


O teste imunoenzimtico (ELISA) pode ser utilizado para a deteco de antgenos virais e tambm de anticorpos. uma tcnica que apresenta vantagens, tais como: a boa sensibilidade, especicidade, baixo custo, repetibilidade e versatilidade. Em alguns casos, o uso da tcnica permite a deteco de at 1 ng (nanograma) de antgeno por grama de tecido coletado diretamente do animal. Os testes podem ser executados em amostras individuais, como recurso diagnstico em clnicas ou consultrios; ou em grande escala, como realizado em laboratrios totalmente automatizados. A tcnica permite uma variao de formas e aplicaes, dependendo do objetivo e da disponibilidade de reagentes. Basicamente, os testes de ELISA podem ser classicados em diretos, indiretos ou de competio. A tcnica baseia-se na imobilizao da reao antgeno-anticorpo em um suporte slido (placas de poliestireno), seguida de uma reao colorimtrica. Por se tratar de uma tcnica que apresenta inmeras variaes, neste captulo ser apresentado apenas o fundamento geral da tcnica. Para um detalhamento maior, recomenda-se a literatura especca. Um exemplo simplicado para facilitar o entendimento da tcnica ser brevemente descrito. No ELISA de captura direto (Figura 3.5) para deteco de antgenos virais, placas de 96 cavidades so recobertas com anticorpos especcos para um determinado agente. A amostra suspeita da presena viral (sangue, secrees ou leite) adicionada e incubada por um determinado tempo. Nesse perodo, ocorre a captura do antgeno (amostras positivas) pelo anticorpo xado na placa. Aps essa etapa, so realizadas lavagens para a remoo de substncias inespeccas. A seguir adiciona-se um segundo anticorpo, especco

para o vrus, conjugado com a enzima (HRPO ou AP). Novamente os anticorpos que no se ligaram so removidos por lavagens. A conrmao da presena do antgeno viral evidenciada pela adio de substrato e desenvolvimento da colorao especca nas amostras negativas. A leitura realizada pela inspeo visual ou pelo uso de fotocolormetro.
A
Anticorpos antivirais Incubao da amostra suspeita

Lavagem

Antgenos na amostra suspeita Anticorpo antivrus Lavagem

Anticorpos marcados Adio do substrato Mudana de cor Positivo Negativo

Figura 3.5. Ilustrao demonstrativa do ensaio imunoenzimtico (ELISA) para a deteco de antgenos. (A) Amostra positiva; (B) Amostra negativa.

2.3.4 Radioimunoensaio
O mtodo de radioimunoensaio (RIA) de deteco de antgenos foi muito utilizado antes do surgimento dos testes de ELISA. A diferena bsica entre os dois mtodos reside no tipo de marcao utilizada. Na RIA, utiliza-se um istopo radioativo em vez de enzima. O mtodo muito sensvel e pode ser automatizado, porm os equipamentos requeridos so caros. A principal restrio do teste refere-se ao uso de substncias radioativas e ao descarte dos reagentes. Dessa forma, a tcnica encontra-se em desuso progressivo.

68

Captulo 3

2.3.5 Imunocromatograa
A imunocromatograa uma tcnica de visualizao simples, geralmente realizada em dispositivos plsticos, podendo ser executada em clnicas e ambulatrios. A prova baseada na reao antgeno-anticorpo, em que a amostra suspeita (vrus ou antgenos virais) passada atravs de um ltro e, ento, impregnada em uma membrana, onde reagir com o anticorpo especco previamente imobilizado. A presena do antgeno revelada pelo aparecimento de focos ou bandas coloridas, pois os reagentes so conjugados com substncias cromgenas. O resultado depende essencialmente da qualidade dos reagentes. Um dos problemas do teste o seu custo elevado. Vrios testes diagnsticos so baseados nesse princpio (Captulo 11).

matriz de gar. As amostras difundem-se radialmente pelo gel e, ao se encontrarem, proporcionam a reao antgeno-anticorpo, seguida da insolubilizao e precipitao. A precipitao deste complexo forma linhas opacas no gel (linhas de precipitao), que podem ser visualizadas a olho nu, com o auxlio de uma fonte de luz (ver Figura 11.9, no Captulo 11). A IDGA uma tcnica bastante difundida para a deteco de anticorpos, porm sem muita aplicabilidade para a deteco de antgenos ou partculas vricas.

2.3.8 Imunoblots
O princpio dos imunoblots semelhante ao da IPX. Os antgenos virais so detectados pelo uso de anticorpos marcados com enzimas, que agem no substrato, provocando mudana de cor. A diferena fundamental entre a IPX e os imunoblots que o material suspeito deve ser previamente solubilizado e imobilizado em um suporte slido, geralmente membranas de nitrocelulose ou nylon. A membrana , ento, incubada com o anticorpo antiviral no-marcado (anticorpo primrio), seguido de lavagem e incubao com um anticorpo antiespcie do anticorpo primrio (anticorpo secundrio) conjugado a uma enzima. A presena do antgeno pesquisado revelada pela adio do substrato, que muda de colorao pela ao da enzima. Substratos que emitem luminosidade capturvel em lmes de raios X tambm tm sido utilizados e aumentam a sensibilidade da tcnica (Figura 3.6). Existem duas variaes principais dos imunoblots: os dot/slot blots e o Western blot (WB). No dot/slot blot, o homogenado de protenas diretamente imobilizado na membrana, em pontos (dots) ou fendas (slots), seguida pela deteco com os anticorpos. Essa variao da tcnica mais simples e rpida, porm no fornece informaes acerca da massa da protena detectada. No WB, as protenas solubilizadas so separadas por eletroforese em um gel de poliacrilamida (SDSPAGE), transferidas para a membrana e, ento, submetidas deteco com os anticorpos marcados. Essa tcnica permite a deteco da protena e tambm a determinao de sua massa molecular, pelo padro de migrao no gel.

2.3.6 Aglutinao em ltex


O ensaio de aglutinao em ltex provavelmente seja o mtodo mais simples de deteco de antgenos virais. O princpio da tcnica baseia-se na mistura do material suspeito com anticorpos previamente adsorvidos a partculas de ltex. A presena do antgeno resultar na sua ligao aos anticorpos e na aglutinao das partculas. A leitura da reao visual e pode ser realizada imediatamente aps a sua execuo. Esta tcnica tem aceitao por pequenos laboratrios e entre tcnicos de campo. As suas principais restries referem-se baixa sensibilidade e especicidade. Por isso, resultados falso-negativos so freqentes, a no ser que grandes quantidades de antgenos estejam presentes no material suspeito. A resoluo dos problemas de sensibilidade e especicidade pode aumentar a sua aplicabilidade.

2.3.7 Imunodifuso em gar


O teste de IDGA foi desenvolvido para a deteco de antgenos, porm tem sido mais utilizado para a deteco de anticorpos. A prova baseada na precipitao de complexos antgenoanticorpos em gel de gar. O ensaio realizado pela adio da amostra suspeita e do soro controle em orifcios em posies opostas em uma

Deteco, identicao e quanticao de vrus

69

Amostra positiva

Substrato Anticorpo anti-IgG-HRPO Anticorpo antivrus (IgG) Antgeno viral Membrana

Amostra negativa

Removidos pelas lavagens

Membrana

- + -

nsticos, deve ser realizada com cautela. O resultado positivo pode no signicar necessariamente a associao do agente suspeito com a doena em questo. O material gentico de agentes que produzem infeces latentes, como os herpesvrus, pode ser detectado sem que os agentes estejam, necessariamente, associados com a enfermidade em questo. A deteco de cidos nuclicos possui aplicao especial para os vrus de difcil adaptao ao cultivo celular; casos em que o material suspeito contenha pequenas quantidades do agente, que esteja com viabilidade comprometida por problemas de conservao e em estudos retrospectivos. Essas tcnicas tambm possuem aplicaes importantes na deteco de infeces latentes, quando o nico indicador da infeco a presena do genoma do agente.

Figura 3.6. Western blot para a deteco de protenas virais. Os antgenos so separados por eletroforese em gel de poliacrilamida, transferidos e imobilizados em uma membrana de nitrocelulose. A membrana incubada com o anticorpo primrio (anti-antgeno) e subseqentemente com o anticorpo secundrio conjugado com a enzima peroxidase. A presena do antgeno revelada pela ao da enzima no substrato que resulta na marcao do filme de raios X no local correspondente migrao da protena-alvo.

2.4.1 Tcnicas de hibridizao (Southern/Northern blot)


A deteco de cidos nuclicos virais pelo uso de sondas marcadas com istopos radioativos ou com enzimas tem sido muito utilizada em Virologia, tanto em diagnstico como em pesquisa. A tcnica baseia-se na complementaridade das molculas de DNA ou RNA. Inicialmente, escolhe-se a regio-alvo do genoma a ser detectado, que deve ser um segmento conservado entre isolados de campo. A sonda deve ser sintetizada com base na seqncia de nucleotdeos da regio-alvo e deve ser exatamente complementar a esta. Essa sonda pode ser um oligonucleotdeo sinttico, um segmento de DNA inserido em um plasmdeo ou um produto de PCR. A sonda , ento, conjugada com um istopo radioativo ou com uma enzima, para possibilitar a sua deteco. O material suspeito imobilizado em uma membrana, seguido pela incubao com a sonda marcada e de lavagens para remover as sondas no-ligadas. Na presena do cido nuclico do vrus suspeito, a sonda ir hibridizar com a seqncia-alvo. A presena da sonda revela-se pela exposio da membrana a um lme de raios X ou pela adio de substrato (Figura 3.7).

2.4 Deteco/identicao de cidos nuclicos


As seqncias nicas de nucleotdeos do genoma dos vrus, associadas com tcnicas de amplicao e hibridizao de cidos nuclicos, proporcionaram o desenvolvimento de metodologias para a deteco e identicao de agentes virais em uma variedade de amostras. As tcnicas de hibridizao e a reao em cadeia da polimerase (PCR) tornaram-se muito teis para a deteco e identicao de agentes virais e impulsionaram os estudos da biologia molecular desses agentes. A disponibilidade das seqncias genmicas dos vrus em bancos de dados possibilitou a identicao de regies conservadas, viabilizando a sntese de primers e de sondas, utilizadas nas tcnicas de PCR e hibridizao, respectivamente. A interpretao dos resultados dessas tcnicas, principalmente quando utilizadas com ns diag-

70

Captulo 3

Filme de raios X
Amostra positiva Radioatividade
C CAT GACA ' ''' '' A T C G 'G' T A C 'T'G T T A T T
C CA TG A CA

Amostra negativa Removidas pelas lavagens


C C A T

Sonda marcada DNA/RNA viral

Membrana

Membrana

Figura 3.7. Tcnica de hibridizao de cidos nuclicos (dot blot). O material gentico do vrus extrado de tecidos e imobilizado em reas de uma membrana. Posteriormente a membrana incubada com uma sonda com seqncia de nucleotdeos complementar ao DNA do vrus, marcada com uma substncia radioativa. A presena do DNA viral revelada pela marcao do filme de raios X pela emisso radioativa da sonda.

A tcnica de hibridizao possuiu variaes de acordo com o cido nuclico a ser detectado e com a forma como o material imobilizado na membrana. Quando o cido nuclico (DNA, RNA) imobilizado diretamente na membrana, a tcnica denominada dot ou slot blot. A presena do cido nuclico ser demonstrada pelo aparecimento de uma marca ou borro no local onde foi aplicado o material. Porm, se o material for previamente submetido eletroforese, para a separao das molculas de cido nuclico de acordo com o tamanho, e ento transferido para a membrana, a tcnica denomina-se Southern blot (para DNA) ou Northern blot (para RNA). A reao positiva aparece na forma de bandas marcadas na membrana, correspondentes migrao do cido nuclico durante a eletroforese. Em razo da necessidade da eletroforese e transferncia para a membrana, as tcnicas de Southern e Northern blot so mais trabalhosas e demoradas, porm os resultados so mais informativos. As tcnicas de hibridizao possuem boa sensibilidade e especicidade, e, quando implementadas na rotina do laboratrio, permitem a obteno dos resultados em poucos dias. Outra vantagem que podem ser aplicadas a qualquer agente infeccioso, necessitando-se apenas de uma sonda especca. As restries dessas tcnicas referem-se necessidade de pessoal especializado e disponibilidade de reagentes.

Essa metodologia tem sido amplamente utilizada para a localizao espacial e temporal da presena e expresso de determinados genes. Tambm utilizada na identicao de agentes causadores de tumores. O princpio da tcnica o mesmo da anterior, porm o cido nuclico detectado diretamente nos cortes de tecido. A reao revelada pelo uso de sondas marcadas com substncias radioativas ou com protenas que so, posteriormente, detectadas com o auxlio de anticorpos. As reaes positivas podem ser visualizadas pela exposio a lmes radiogrcos lquidos ou com uso de substncias cromgenas, permitindo a localizao e identicao das clulas infectadas. Devido ao fato de ser trabalhosa e demorada, a ISH no utilizada na rotina laboratorial, sendo empregada em casos especcos, principalmente em estudos de patogenia.

2.4.3 Reao da polimerase em cadeia


A reao da polimerase em cadeia (PCR) uma tcnica altamente especca e sensvel, que consiste na sntese in vitro de uma grande quantidade de cpias de um segmento de DNA existente na amostra. Ou seja, consiste em amplicar o nmero de molculas a partir de uma molcula-alvo original, denominada template ou molde. Essa amplicao pode ser realizada a partir de uma quantidade mnima do cido nuclico-alvo; uma PCR bem padronizada, teoricamente, capaz de detectar e amplicar at uma nica cpia do molde existente na amostra. A regio-alvo a ser amplicada delimitada por primers, que so oligonucleotdeos sintticos de aproximadamente 20 nucleotdeos. Esses pri-

2.4.2 Hibridizao in situ


A hibridizao in situ (ISH) detecta a presena do material gentico do agente (DNA ou RNA) diretamente em cortes histolgicos de tecidos.

Deteco, identicao e quanticao de vrus

71

mers hibridizam com suas regies complementares, que se localizam nas cadeias opostas do DNA, nas regies anqueadoras da seqnciaalvo. Os primers so sintetizados de acordo com a seqncia a ser amplicada, e a sua especicidade depende do seu grau de conservao e complementaridade com a seqncia-alvo. A reao de PCR envolve a realizao de vrios ciclos (entre 30 e 40) de desnaturao (separao da ta dupla), hibridizao dos primers e polimerizao da cadeia de DNA a partir dos primers, pela enzima DNA polimerase. A cada ciclo o nmero de mo-

lculas correspondentes seqncia-alvo duplica e, no nal da reao, acumulam-se milhes de cpias idnticas correspondentes seqncia-alvo inicial. Essas molculas, denominadas genericamente de produtos de PCR (ou amplicons), podem, ento, ser detectadas visualmente em gis de agarose, corados com brometo de etdio, sob luz UV (Figura 3.8). Os produtos de PCR podem tambm ter a sua identidade conrmada por hibridizao com sondas especcas. Essa tcnica tem tido inmeros usos nos diversos campos da Biologia e Medicina.

Seqncia-alvo Molcula de DNA 270pb Denaturao (95C)


'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' Primer 2 ''''''''' ''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''

Reduz a temperatura 1 ciclo 50-60C

Primer 1 ''''''''' ''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''

Eleva a temperatura 72C

'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' ''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''

Eleva a temperatura

Anelamento dos primers

Polimerizao

'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' '''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' '''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' ''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''

30 ciclos

'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' '''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' ''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''

O nmero de cpias duplica a cada ciclo

Gel de agarose

250pb

Figura 3.8. Ilustrao demonstrativa da tcnica de reao em cadeia da polimerase (PCR). A partir da molcula molde original (genoma viral), um segmento especfico amplificado por sucessivas etapas de sntese de DNA. O produto da amplificao pode ser visualizado sob luz UV em um gel de agarose corado com brometo de etdio, aps migrao por eletroforese. O tamanho dos produtos pode ser comparado com um marcador molecular de massa conhecida. (M) marcador molecular, (1) controle negativo, (2) controle positivo, (3, 4 e 5) amostras teste.

72

Captulo 3

A grande difuso da PCR somente foi possvel aps a identicao de uma enzima polimerase de DNA resistente ao calor (Taq Thermophilis aquatics), o que levou simplicao da tcnica associado com o desenvolvimento de equipamentos cada vez mais acessveis. Essas novas tecnologias proporcionaram um domnio maior da tcnica e o desenvolvimento de variaes, como a nested-PCR, multiplex-PCR, RT-PCR e real-time PCR. A nested-PCR realizada em duas etapas. Na primeira etapa, um determinado segmento amplicado pelo mtodo tradicional. Uma segunda etapa , ento, realizada, utilizando-se o produto da primeira reao como molde e um outro conjunto de primers, complementares s seqncias localizadas internamente no produto da primeira reao. Com isso, uma seqncia interna do primeiro produto reamplicada (Figura 3.9).
Seqncia-alvo 1 DNA molde
''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''

Primer 1

Primer 2

''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''

Primeira reao

30 ciclos

''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''

''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''

Produtos da primeira '''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' reao

Seqncia-alvo 2 DNA molde


''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''

Primer 3

Primer 4

''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''

Segunda reao

30 ciclos

''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''

''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''

Produtos da segunda ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' reao

Figura 3.9. A reao de PCR-nested realizada em duas etapas. Na primeira etapa, utilizado um par de primers externos (1 e 2), que permitem a amplificao de um segmento do genoma viral (seqncia-alvo 1). A segunda etapa utiliza o produto da primeira reao como molde. Esta utiliza um par de primers internos (3 e 4), que permitem a amplificao de um segmento interno seqncia inicial (seqncia-alvo 2). O PCR- nested utilizado para aumentar a sensibilidade e especificidade da amplificao.

Em relao PCR tradicional, a nested-PCR possui as vantagens de maior sensibilidade (duas etapas de amplicao) e especicidade. Uma variao dessa tcnica o semi-nested PCR, em que, na segunda reao, utiliza-se um primer interno e em conjunto com um dos primers da primeira reao. O mtodo da multiplex-PCR baseia-se na utilizao de dois ou mais pares de primers na mesma reao. Cada conjunto de primer especco para uma regio do agente ou de diferentes agentes. Devido a sua versatilidade, essa tcnica utilizada para a busca de variantes do mesmo vrus ou no diagnstico de enfermidades que podem ser causadas por diferentes agentes. Um exemplo o diagnstico de aborto em bovinos, quando realizada uma reao com diferentes pares de primers, cada conjunto sendo especco para um dos agentes suspeitos. A tcnica de RT-PCR (reverse transcriptase PCR) consiste na amplicao de segmentos de RNA. Atravs da transcrio reversa, realizada pela ao da enzima transcriptase reversa, uma cpia de DNA complementar (cDNA) sintetizada a partir da RNA viral (genoma ou produto intermedirio do processo de replicao). Essa nova molcula sintetizada ser usada como template (molde) para a reao de PCR convencional. O desenvolvimento desta tcnica proporcionou um grande avano no estudo e diagnstico dos vrus RNA. O PCR em tempo real (real time PCR) uma variao do PCR, com a capacidade de se detectar e quanticar a amplicao do produto medida que vai sendo sintetizado. Essa tcnica utiliza, alm dos primers, uma sonda marcada com um uorocromo. A sonda complementar a uma regio interna do produto e marcada com uma substncia uorognica. A cada ciclo de sntese, o uorocromo liberado da sonda e essa liberao captada e medida na forma de intensidade luminosa. Esta tcnica tem grande aplicabilidade quando a quanticao do cido nuclico presente na amostra necessria. Tambm possui aplicabilidade em diagnstico de viroses de importncia sanitria estratgica (exemplos: febre aftosa e peste suna clssica), pois permite a obteno dos resultados em poucas horas.

Deteco, identicao e quanticao de vrus

73

2.4.5 Anlise de restrio


Diferentes isolados de vrus podem ser identicados e distinguidos entre si pela anlise dos fragmentos gerados pela clivagem de seus genomas por enzimas de restrio (endonucleases, Figura 3.10). Essas enzimas clivam o DNA em seqncias especcas, compostas por quatro a oito bases; a alterao em uma dessas bases alGenoma BoHV - 1 135.301bp Genoma BoHV - 5 138.390bp

Stios de clivagem da enzima BamHI

tera o stio e resulta em falha de clivagem. Assim, o genoma de um determinado vrus DNA clivado com um conjunto de enzimas, produzindo um conjunto de fragmentos de determinados tamanhos. Outros isolados do vrus que possuam diferenas em quaisquer dos stios de clivagem iro gerar padres de clivagem distintos, podendo-se, assim, fazer a diferenciao entre isolados. A anlise por restrio enzimtica (REA) foi muito utilizada na classicao e caracterizao de isolados de campo. Atualmente, o advento e difuso do seqenciamento de DNA substituiu, com algumas vantagens, essa tcnica, que se encontra restrita a alguns vrus ou em desuso.

2.4.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida


9 locais de clivagem 16 locais de clivagem

DNA viral genmico Enzima de restrio BamHI = Digesto do genoma em fragmentos

Eletroforese em agarose

A tcnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), alm de ser usada para separao de protenas nos passos iniciais do WB, tambm utilizada para a deteco do genoma e em estudos epidemiolgicos de rotavrus, cujo genoma composto por vrios segmentos de RNA. Uma caracterstica dos rotavrus a presena de sorogrupos (ver Captulo 30), que so correlacionados com diferenas na extenso desses segmentos. Essas diferenas iro produzir um padro de migrao na eletroforese, e isso ser utilizado para a identicao do agente e classicao em sorogrupos. A metodologia consiste na extrao do RNA a partir de fezes, separao dos fragmentos por SDS-PAGE e colorao do gel com nitrato de prata. Aps a realizao desse procedimento, as bandas correspondentes aos segmentos genmicos so analisadas, e os padres de migrao dos segmentos so comparados. O SDS-PAGE possui boa sensibilidade e especicidade quando comparado com outras tcnicas de deteco dos rotavrus.

BoHV - 1

Figura 3.10. Ilustrao demonstrativa da anlise de restrio do genoma do herpesvrus bovino. A enzima BamHI reconhece e cliva o genoma do herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1) em nove stios (A) e o genoma do BoHV-5 em 16 locais (B). Os produtos da digesto so separados por eletroforese em agarose e visualizados sob luz UV. Os diferentes padres de clivagem resultam em fragmentos de tamanho diferentes, cuja anlise comparativa permite a identificao dos respectivos genomas. No exemplo acima, os locais de clivagem e o tamanho dos fragmentos so meramente ilustrativos.

BoHV - 5

3 Multiplicao de vrus
A obteno de vrus em grandes quantidades essencial para diversos procedimentos virolgicos. Aps o seu isolamento, o vrus deve ser identicado e caracterizado. Para isso, deve ser amplicado a partir da amostra original. Quantidades considerveis de vrus so necessrias

74

Captulo 3

para a realizao de testes sorolgicos (soro-neutralizao SN, HI), produo de antgenos para a imunizao de animais (obteno de anti-soros ou anticorpos monoclonais) ou para uso como imungenos em vacinas. A reproduo da manifestao clnica de uma enfermidade, sob condies experimentais, tambm requer altos ttulos do vrus. Em resumo, a rotina de um laboratrio de virologia envolve necessariamente etapas repetidas e contnuas de multiplicao de vrus com nalidades diversas. Como os vrus necessitam clulas vivas para se multiplicar, sistemas biolgicos so utilizados com esse propsito. Trs sistemas biolgicos tm sido classicamente utilizados para a multiplicao de vrus: animais susceptveis, ovos embrionados de galinha (OE) e cultivos celulares.

dongos lactentes ocasionalmente utilizada para o diagnstico do FMDV. Para alguns vrus que no replicam ecientemente em cultivo celular, como o vrus da peste suna africana (ASFV), a inoculao de animais, para se obter altos ttulos do vrus, empregada.

3.2 Inoculao em ovos embrionados


Vrios vrus de aves e alguns de mamferos replicam com ecincia em tecidos de embrio de galinha. A habilidade desses vrus em se multiplicar nesse sistema biolgico tem sido utilizada para a multiplicao de vrus em laboratrio, seja para a deteco de vrus em material clnico, seja para a amplicao de vrus. Essa metodologia teve grande difuso antes do desenvolvimento e estabelecimento dos cultivos celulares, porm, nos dias atuais, est limitada a poucos vrus, principalmente queles que no replicam em cultivos. O material pode ser inoculado por vrias vias, dependendo do agente suspeito (Figura 3.11). A presena do agente pode ser evidenciada pelo desenvolvimento de leses macro e microscpicas caractersticas no embrio e/ou nas membranas vitelnicas (Tabela 3.2). Tambm se pode observar retardo no desenvolvimento e morte do embrio. A presena do agente e a sua quanticao tambm pode ser detectada pela pesquisa da atividade biolgica do agente (HA), de antgenos (IFI) ou de cidos nuclicos virais (hibridizao, PCR).
Cavidade amnitica
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3.1 Inoculao em animais susceptveis


Durante muitos anos, a reproduo da doena em animais se constituiu na forma mais objetiva de deteco de vrus em material suspeito. A inoculao de animais tambm serviu para a amplicao do agente para diversos ns, entre eles a produo de vacinas. Os fatores limitantes para esse procedimento incluem o custo elevado de manuteno, a imunidade prvia dos animais ao agente e a baixa reprodutibilidade da enfermidade. Nos ltimos anos, questes ticas referentes ao uso experimental de animais somaram-se a essas restries. No princpio do sculo, os bovinos eram inoculados com o vrus da febre aftosa (FMDV) no epitlio lingual. Aps o desenvolvimento de vesculas, o uido era coletado, inativado e utilizado para a produo de vacinas. A utilizao de extratos de crebro de camundongos infectados com o vrus da raiva (RabV), para a produo de vacinas, outro exemplo da inoculao em animais. Com o desenvolvimento dos cultivos celulares, essa metodologia deixou de ser utilizada. Atualmente, a multiplicao de vrus pela inoculao de animais possui uso muito restrito, dentre os quais se destacam a prova biolgica para o diagnstico da raiva em camundongos lactentes (Captulo 11). A inoculao de camun-

Casca

Embrio

Albumina

Saco da gema

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Membrana crio-alantide

Figura 3.11. Vias de inoculao de vrus em ovos embrionados.

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Cavidade alantide

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Deteco, identicao e quanticao de vrus

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Tabela 3.2. Vrus animais que replicam em embries de pinto e efeitos da replicao Vrus
Varola bovina

Idade do embrio
10-11 dias 7 dias 7 dias 10-11 dias 10-11 dias

Via de inoculao
Membrana corioalantide Membrana corioalantide ou cavidade alantide Membrana corioalantide Cavidade alantide Qualquer via

Leso/conseqncia
Focos esbranquiados (pocks) na membrana, morte do embrio Morte do embrio Pocks na membrana crio -alantide. Morte do embrio

BOVINO

Vrus da estomatite vesicular (VSV) Lumpy skin vrus (LSDV)

EQINO

Influenza eqina Encefalomielite eqina (EEE, WEE e VEE) Vrus da lngua azul (BTV)

OVINOS

9-11 dias

Intravenosa

Morte do embrio

Vrus da doena de Aujeszky (PRV)

10 dias

Membrana corioalantide

Leses na membrana corioalantide, invaso do sistema nervoso central, e protuso cerebral do embrio, morte do embrio. Retardo do crescimento, distrofia muscular, encefalomalcia

CANINOS e FELINOS

SUNO

Raiva (RabV)

7 dias

Gema

AVES

Newcastle (NDV) Influenza aviria (AIV)

9-11 dias 9-11 dias

Membrana corioalantide ou cavidade alantide Cavidade alantide

Morte do embrio Morte do embrio

3.3 Inoculao em cultivo celular


A deteco e identicao de vrus em amostras clnicas, aps a sua multiplicao em cultivo celular, constituram-se em uma das primeiras formas de deteco viral. O advento dos antibiticos contribuiu de forma decisiva para o desenvolvimento da Virologia, pois somente a partir da foi possvel estabelecer cultivos celulares em grande escala. A propagao do agente em cultivo celular permite que quantidades mnimas de partculas vricas viveis sejam detectadas, amplicadas e, posteriormente, caracterizadas. Para os vrus que replicam bem em clulas de cultivo, esse sistema biolgico possui aplicaes virtualmente ilimitadas, incluindo: a) isolamento e identicao com ns diagnsticos; b) obteno de estoques virais para caracterizao biolgica e molecular; c) uso em testes sorolgicos; d) produo de estoques virais para estudos de patogenia; e) produo de antgeno para a imunizao de animais (produo de anti-soro ou anticorpos monoclonais); f) produo de vacinas, entre outros.

O isolamento em cultivo celular considerado a prova ouro (golden standard) em diagnstico virolgico, sendo utilizada como padro de comparao com qualquer outro mtodo. Esse mtodo tambm capaz de detectar amostras ocasionais de vrus em material clnico. Vrios agentes virais conhecidos resultaram de achados acidentais em cultivo de clulas, entre estes o circovrus suno (PCV-1) e o vrus smio 40 (SV-40). Os cultivos celulares ainda se constituem na forma mais simples e econmica de obteno de grandes quantidades de vrus vivel para a pesquisa e produo de vacinas. Devido ao fato de nenhuma linhagem celular ser susceptvel a todos os vrus, muitos laboratrios mantm cultivos celulares susceptveis a diferentes agentes. A escolha de um tipo celular para o isolamento ou multiplicao do vrus est, muitas vezes, associada com a espcie de origem do material e com o histrico clnico da enfermidade. Geralmente, so utilizadas clulas originrias da espcie animal de origem do vrus. No entanto, isso no regra, pois existem vrios vrus que replicam em clulas de cultivos de ou-

76

Captulo 3

tras espcies. Por exemplo, o FMDV cultivado em clulas de rim de hamster (BHK-21); o vrus da sndrome reprodutiva e respiratria dos sunos (PRRSV) cultivado em clulas de rim de macacos (MA-104); e o herpesvrus eqino (EHV) cultivado em clulas de rim de coelhos (RK-13) ou em clulas de rim de macaco-verde africano (Vero). Basicamente existem dois tipos principais de cultivos celulares: cultivos primrios e as linhagens contnuas. Cada um desses tipos apresenta vantagens e restries. Os cultivos primrios originam-se da remoo de um rgo fresco de um embrio ou feto recm-sacricado. O rgo removido submetido a um processo mecnico e enzimtico para fracionamento do tecido e individualizao das clulas. As clulas individualizadas so cultivadas em frascos ou garrafas, onde iro aderir e formar uma monocamada. O cultivo realizado com meio nutritivo e promotores de crescimento, a temperatura de incubao de 37C. Nesse processo, a diviso celular bastante restrita, com uma propagao lenta e limitada, podendo-se dizer que ocorre uma diviso celular a cada 24 horas. Assim, necessria a realizao de subcultivos peridicos, e isso realizado atravs da individualizao da monocamada pela ao enzimtica, ressuspenso e semeadura em novos frascos de cultivo. Nesses novos cultivos, o nmero celular ir duplicar ou quadruplicar em poucos dias. Aps um nmero varivel de subcultivos (10 a 30 passagens, dependendo do tipo celular), as clulas comeam a apresentar taxas reduzidas de multiplicao e, eventualmente, cessam a multiplicao. Os cultivos primrios so os preferidos para a realizao da multiplicao viral, pois possuem caractersticas morfolgicas e siolgicas bastante semelhante s clulas dos rgos originais. Sendo assim, possuem uma maior sensibilidade para a infeco viral. A restrio que esse tipo de cultivo apresenta o nmero limitado de subcultivos, gerando necessidade de preparao contnua nos laboratrios com alta demanda celular. As linhagens celulares ou linhagens contnuas so derivadas de clulas tumorais ou de tecidos normais que sofreram transformao in vitro. Esses tipos de cultivos celulares so cultivados de maneira semelhante aos cultivos primrios e pos-

suem capacidade de multiplicao quase indenida. Por estarem bem adaptadas s condies do cultivo, so de fcil manipulao e propagao. A maioria dos laboratrios d preferncia a esse tipo de cultivo celular devido sua uniformidade, estabilidade e facilidade de manuseio. Por causa dessa alta taxa de propagao em laboratrio, as linhas celulares podem sofrer alteraes morfolgicas e siolgicas que alteram a sensibilidade infeco viral. No entanto, a sensibilidade infeco com alguns vrus pode ser inferior nas linhagens celulares em comparao com os cultivos primrios, mas as vantagens citadas acima compensam este aspecto. Linhagens celulares podem ser obtidas pela transferncia entre laboratrios ou pela aquisio junto a bancos depositrios. Diversas linhagens celulares so utilizadas rotineiramente em laboratrios de virologia em atividades de diagnstico e pesquisa. O nome dessas linhagens geralmente est relacionado com o rgo de origem e freqentemente contm as letras iniciais do nome do descobridor ou outra caracterstica marcante. Alguns exemplos de linhagens celulares comumente utilizadas em Virologia Veterinria so: MDBK (Madin-Darby bovine kidney), MDCK (Madin-Darby canine kidney), CRFK (Crandell feline kidney), CRIB (cell resistant to infection with bovine viral diarrhea vrus), RK13 (rabbit kidney), PK15 (porcine kidney 15), SK6 (swine kidney), BHK-21 (baby hamster kidney clone 21), IBRS2 (Instituto Biolgico rim de suno clone 2), clulas Vero, entre outras. Existem ainda cultivos de clulas que se multiplicam em suspenso, ou seja, no necessitam de uma superfcie de contato para adeso e multiplicao. Uma grande vantagem desse tipo de cultivo a concentrao do nmero de clulas, reduzindo a relao do nmero de clulas, tamanho do frasco e volume de meio utilizado. Essa uma caracterstica desejvel e amplamente utilizada para a produo de vacinas. Clulas BHK-21 que se multiplicam em suspenso so utilizadas para a multiplicao e produo de estoques do RabV e o FMDV para uso em vacinas. Alguns vrus no replicam ecientemente em clulas de cultivo, assim, a sua amplicao requer o uso de outro sistema biolgico, como animais susceptveis (animais de laboratrio ou os hospedeiros naturais) ou ovos embrionados.

Deteco, identicao e quanticao de vrus

77

Outros vrus no replicam em quaisquer dos sistemas biolgicos utilizados atualmente, como os papilomavrus, vrus da hepatite C de humanos e os vrus causador da hepatite B (famlia Hepadnaviridae). O processamento de amostras que potencialmente contenham vrus deve ser realizado rapidamente e seguir algumas regras para aumentar a probabilidade de deteco e multiplicao do agente. Para o diagnstico, as amostras devem ser inoculadas em cultivos celulares o mais brevemente possvel. A inoculao consiste na deposio do material suspeito sobre as monocamadas, seguido de incubao por 1 a 2 horas (perodo de adsoro). Posteriormente, o incu-

lo desprezado, e a monocamada lavada para remover ou reduzir a presena de substncias txicas e/ou contaminao bacteriana e fngica. Aps, o meio de cultivo reposto, e as clulas so incubadas a 37C, com uma atmosfera de 5% de CO2. As monocamadas devem ser observadas diariamente para a presena de alteraes morfolgicas celulares associadas com a replicao viral (Figura 3.12). Essas alteraes, conseqncias do processo replicativo dos vrus, so denominadas genericamente de efeito citoptico (ECP cytopathic effect). Uma grande parcela dos vrus produz alteraes morfolgicas nos cultivos celulares, que, muitas vezes, so caractersticas de um determinado agente ou grupo de vrus. As altera-

Figura 3.12. Efeito citoptico produzido pela replicao viral em clulas de cultivo. Clulas de linhagem de rim bovino no-infectadas (A) ou inoculadas com o BoHV-1 (B); BVDV (C); BoHV-2 (D); enterovrus bovino (E); e PI-3v (F). Pode-se observar diferentes tipos de efeito citoptico. Para descrio detalhada ver tabela 3.3.

78

Captulo 3

es freqentemente produzidas pelos vrus so vacuolizao citoplasmtica, formao de clulas gigantes multinucleadas (sinccios) e arredondamento celular entre outros. Na Tabela 3.3, esto

descritos os efeitos citopticos produzidos pelos principais vrus de interesse veterinrio. A visualizao dessas alteraes ao microscpio ptico apenas um indicativo da presena

Tabela 3.3. Principais vrus animais, clulas susceptveis para replicao in vitro e efeito citoptico

Vrus
Adenovrus bovino (BAdV) Vrus da diarria viral bovina (BVDV) Herpevrus bovino tipos 1 e 5 (BoHV 1 e 5)

Tipo celular
Clulas de origem renal ou primrias de testculos de bovinos.

Efeito citoptico
Arredondamento e desprendimento celular, formao de focos infecciosos como cachos de uva. Corpsculos intranucleares.
Vacuolizao citoplasmtica, degenerao celular, enrugamento do tapete, desprendimento e lise celular (somente as amostras citopatognicas).
Desorganizao nuclear, arredondamento e desprendimento celular; formao de focos infecciosos com o aspecto de cachos de uva, lise. Corpsculos intranucleares.
Arredondamento, citomegalia e refringncia celular, formao de grandes sinccios, desprendimento das clulas. Corpsculos intracitoplasmticos.

MDBK, SK-6, PK15, BT, cultivos primrios de pulmo, corneto nasal, rim e testculo de bovino. MDBK, CRIB, HeLA, BT, EBTr e cultivos primrios de pulmo, corneto nasal, rim e testculo de bovino. MDBK, BT, HELA e cultivos primrios de corneto nasal e de rim de bovino. MDBK, BT, cultivos primrios de clulas do trato respiratrio de bovinos.

Parainfluenza bovina tipo 3 (bPI-3) Vrus respiratrio sincicial bovino (BRSV) Rotavrus bovino (BRV) Coronavrus bovino (BCoV) Parvovrus bovino (BPV) Virus da mamilite herptica (BoHV-2) Vrus da leucose bovina (BLV)

Arredondamento e refringncia celular, formao de pequenos sinccios e desprendimento das clulas. Corpsculos acidoflicos intracitoplasmticos. Vacuolizao citoplasmtica, degenerao e desprendimento celular. Corpsculos intracitoplasmticos.
Formao de sinccios.
Citomegalia e refringncia celular, arredondamento e desprendimento.

CV-1, VERO, MA-104, BSC-1, Aubek, MDBK VERO, HRT-18, cultivos primrios de rim de bovino. MDBK, EBTr, BT e cultivos primrios de rim de feto bovino. MDBK, CRIB e cultivos primrios de origem bovina.
Cultivo primrio de bao e pulmo bovino e clulas embrionrias diplides de humanos. BHK-21, IB-RS-2 cultivos primrios de tireide bovina, cultivos primrios de rim de suno, bovino ou cordeiro.

Bovinos

Arredondamento celular, sinccios multinucleares. Corpsculos eosinoflicos intranucleares.


Formao de sinccios.

Vrus da febre aftosa (FMDV) Vrus da estomatite vesicular (VSV) Vrus da estomatite papular (BPSV) Vrus da varola e pseudovarola bovina Rinderpest (RPV)

Condensao nuclear, arredondamento, desprendimento e lise celular.

VERO, BHK-21 ou IB-RS2. BT, cultivo de rim de fetos bovinos.


Cultivos primrios de clulas de testculo bovino. VERO ou cultivos primrios de rim de terneiros.

Arredondamento, retrao e desprendimento celular, lise.


Arredondamento, agregao, lise celular. Corspsculos intracitoplasmticos. Formao de sinccios. Corpsculos intracitoplasmticos.

Arredondamento e refringncia celular, seguido de retrao com alongamentos citoplasmticos pontes e formao de sncicios. Corpsculos intracitoplasmticos.

Vrus da doena Lumpy Skin LT ou cultivos primrios de origem (LSDV) bovina, caprina ou ovina (preferencialmente de raas lanferas). Vrus da febre do vale Rift (RVFV) Vrus da febre catarral maligna (MCFV)

Arredondamento e retrao da membrana celular e marginalizao da cromatina nuclear. Corpsculos intracitoplasmticos. Arredondamento e rpida lise celular.

VERO, BHK-21, CER e cultivos primrios de rim de terneiro e cordeiro.

Cultivos primrios de clulas de rim, bao, tireide, pulmo, testculo e plexo coride de fetos ovinos ou bovinos.

Sinccios grandes, contrao, arredondamento e desprendimento celular da monocamada. Corpsculos intranucleares.

Deteco, identicao e quanticao de vrus

79

Tabela 3.3. Continuao.

Vrus
Lngua azul (BTV) Ectima contagioso (ORFV)

Tipo celular
BHK-21, VERO

Efeito citoptico
Arredondamento celular, fuso.
Arredondamento celular, aglomerao e desprendimento celular. Corpsculos de incluso intracitoplasmticos eosinoflicos.

Ovinos e caprinos

HeLa, VERO, cultivos primrios de rim e testculo ovino e bovino; fibroblastos de galinhas e patos. Clulas da membrana sinovial de fetos caprinos e cultivos primrios de testculos de caprinos. Cultivos de pulmo fetal, de clulas do plexo coride de ovino ou de leuccitos sangneos perifricos. Cultivos primrios de testculo de cordeiro.

Artrite e encefalite caprina (CAEV) Pneumonia progressiva dos ovinos Maedi-Visna (OPPV) Poxvrus ovino e caprino

Formao de sinccios.

Formao de sinccios e degenerao celular.

Vacuolizao nuclear. Corpsculos intracitoplasmticos eosinoflicos. Arredondamento, agregao celular e formao de sncicio com o ncleo na forma circular. Vacuolizao de algumas clulas. Corpsculo de incluso intracitoplasmticos e intranucleares.

Peste dos pequenos ruminantes (PPRV)

VERO e cultivo primrio de rim de cordeiro

Herpesvrus eqino (EHV 1, 2, 3 e 4)

VERO, ED, RK-13, MDBK, BHK-21 e cultivos primrios de rim eqino e fibroblastos da derme eqina.

Desorganizao nuclear, arredondamento e desprendimento celular; formao de focos com o aspecto de cachos de uva. Corpsculos intranucleares.
Formao de sinccios somente em leuccitos.
Lise celular

Eqinos

Anemia infecciosa eqina (EIAV) Encefalomielite eqina (EEE, WEE e VEE) Arterite viral eqina (EAV)

ED, PBMC eqino, fibroblastos de derme eqina. VERO, RK-13, BHK-21 e cultivos de fibroblastos de embrio de galinhas e patos. RK-13, VERO, LLC-MK2 e cultivos primrios de clulas de macaco, coelho e eqino. MDCK

Desprendimento celular do tapete, lise

Influenza eqina (EIV)

Arredondamento, desprendimento celular

Doena de Aujeszky (PRV ou SuHV-1)

PK-15, SK6, MDBK, cultivos primrios de origem suna.

Desorganizao nuclear, arredondamento e desprendimento celular e formao de focos com o aspecto de cachos de uva. Corpsculos intranucleares.
Citomegalia e arredondamento celular, desprendimento das clulas da monocamada. Copsculos intranucleares.
A . maioria dos isolados no causa citopatologia

Adenovrus suno

Cultivos primrios de rim suno, PK-15 e SK6.

Sunos

Peste suna clssica (CSFV) Sndrome respiratria e reprodutiva suna (PRRSV) Enterovrus suno (PEV)

SK6, PK-15. MARC-145, MA-104 e clulas de origem de smios.

Aumento de tamanho, arredondamento e agregao celular, lise.

PK-15, IB-RS-2, SST e cultivos de clulas de rim e testculos de sunos.


Cultivos primrios de rim suno, ST, PK-15 e SK6.

Lise e desprendimento celular, destruio da monocamada.

Parvovrus suno (PPV)

Arredondamento celular e picnose. Corpsculos intranucleares.

80

Captulo 3

Tabela 3.3. Continuao.

Vrus
Parvovrus canino (CPV) Coronavrus canino (CCoV) Rotavrus canino Herpesvrus canino (CaHV)

Tipo celular
CRFK, MDCK, A-72 e cultivos primrios de clulas de rim e pulmo de canino e felino.

Efeito citoptico
Aumento do ncleo, enrugamento da membrana celular, arredondamento das clulas, lise.
Formao de sinccios.

CRFK, A-72 e cultivos de rim, timo e sinvia de canino. MA-104, A-72, CRFK e cultivos primrios de rim de canino. MDCK e cultivos primrios de rim de canino.

Vacuolizao citoplasmtica, degenerao e desprendimento celular. Corpsculos intracitoplasmticos. Desorganizao nuclear, arredondamento e desprendimento celular e formao de focos com o aspecto de cachos de uva. Corpsculos intranucleares.
Formao de sinccios, desprendimento celular do tapete, incluses intracitoplasmticas.

Caninos e Felinos

Vrus da cinomose (CDV) Adenovrus canino (CAdV) Vrus da raiva (RabV) Calicivrus felino (FCV) Vrus da rinotraquete felina (FeHV)

VERO, MDCK e PBMC de caninos e furo.

MDCK, cultivos primrios de testculo ou rim de canino e felino.


CV-1, BHK-21, VERO, HeLa e cultivos de fibroblastos de embrio de galinhas.

Arredondamento e desprendimento celular, lise e destruio do tapete. Corpsculos intranucleares. Arredondamento e desprendimento celular. Corpsculos intracitoplasmticos. Arredondamento e desprendimento celular, lise e destruio do tapete. Desorganizao nuclear, arredondamento, desprendimento celular e formao de focos com o aspecto de cachos de uva. Corpsculos intranucleares. Arredondamento e desprendimento celular.

CRFK, FCWF-4, Fe3TG, VERO e fibroblastos felinos.


CRFK e cultivos primrios de pulmo, rim e testculo de felino.

Vrus da peritonite infecciosa felina (FeCoV) Vrus da panleucopnia felina (FPLV) Vrus da imunodeficincia felina (FIV)

CRFK, A-72, FeWF e cultivos primrios de tecidos fetais de felinos. CRFK e Fe3TG. PBMC felino.

Arredondamento e aumento da refringncia das clulas. Formao de sinccios.

Galinhas e Outras Aves

Doena de Newcastle (NDV) Doena de Gumboro (IBDV)

Cultivos primrios de rim de embrio de galinhas, cultivos primrios de fibroblastos de galinhas e BHK-21.

Formao de sinccios, morte celular.

Cultivos primrios de clulas da bursa, rim e fibroblastos de embrio de galinha. CEK e cultivos de rim, fgado e pulmo de galinhas. MDCC-MSB1. CK e fibroblastos de embrio de galinhas ou patos. QT-35, cultivos primrios de rim ou derme de embrio de galinha.

. Efeito pouco discernvel

Vrus da laringotraquete aviria (ILTV) Vrus da anemia aviria (CAV) Vrus da doena de Marek (MDV) Poxvrus avirio

Citomegalia, formao de sinccios.

Citomegalia, lise celular. Desorganizao nuclear, arredondamento e desprendimento celular. Corpsculos intranucleares. Arrendondamento, refringncia celular e desprendimento.

de um agente viral na amostra suspeita. Alguns vrus possuem a capacidade de infectar cultivos celulares de diversas origens, como o vrus da lngua azul (BTV), que infecta clulas de mamferos e insetos e variaes do efeito citoptico po-

dem ser observadas. No entanto, a ausncia de alteraes no indica necessariamente a ausncia de vrus. Alguns vrus infectam as clulas sem causar ECP e so denominados de no-citopticos, como o caso do circovrus suno (PCV-2).

Deteco, identicao e quanticao de vrus

81

Outro exemplo o vrus da diarria viral bovina (BVDV), que possui amostras citopatognicas e no-citopatognicas (Captulo 22). A conrmao e identicao do agente so, geralmente, realizadas por mtodos que detectam alguma atividade biolgica (HA ou HAD), antgenos (IFA ou IPX) ou cidos nuclicos virais (PCR, hibridizao). A neutralizao com anti-soro especco tambm pode ser usada para a identicao do agente causador do ECP nos cultivos. Colorao direta, como Giemsa ou hematoxilina e eosina (para corpsculos de incluso), tambm podem ser utilizadas para a conrmao da presena de alguns agentes.

4 Quanticao de vrus
A realizao de vrias tcnicas virolgicas requer o conhecimento da quantidade aproximada de partculas vricas presente no material. O procedimento de quanticao denominado titulao, e o valor obtido dito ttulo viral. Existem tcnicas diretas e indiretas para a quanticao das partculas vricas. As tcnicas diretas baseiam-se na contagem das partculas presentes em uma amostra e observadas ao microscpio eletrnico. Esse mtodo capaz de informar o nmero preciso de partculas, porm no diferencia partculas infecciosas de no-infecciosas. Devido a essas particularidades, o mtodo direto de quanticao viral no utilizado na rotina laboratorial. As tcnicas indiretas possuem como base a infectividade do vrus, que medida por meio de um indicador biolgico. A quanticao da infectividade de uma determinada suspenso viral requer necessariamente o uso de sistemas biolgicos para a replicao do agente (cultivos celulares, OE ou animais). Como j mencionado, os cultivos celulares so muito utilizados com esse propsito. Para os vrus que no replicam em cultivo, pode-se recorrer aos OE ou animais.

mero determinado de cultivos celulares. Quanto maior o nmero de rplicas, mais preciso ser o resultado. Essa tcnica geralmente realizada em placas de microtitulao de 96 cavidades, e cada diluio do material inoculada em oito rplicas. Aps um determinado perodo de incubao (varia entre 48 h e vrios dias, dependendo do vrus), os cultivos so monitorados em relao ao aparecimento do ECP (ou submetidos IFA ou IPX para deteco de antgenos virais), que so os indicadores da presena de infectividade na respectiva diluio. O ttulo viral geralmente expresso como a recproca da maior diluio capaz de provocar reao especca (ECP ou antgenos virais) em 50% dos cultivos e a unidade ser TCID50 (tissue culture infection dose). Quando a titulao realizada em animais ou em OE, e o indicador a morte, a unidade usada dose letal 50% (LD50). Quando o resultado da infectividade medido de outra forma que no a morte (ex.: paralisia, presena de leses de pele, prurido), a unidade empregada dose infectiva 50% (ID50). Para os vrus com capacidade hemaglutinante, aplica-se o teste de HA, ento a unidade de expresso ser unidade hemaglutinante (UH). Os valores obtidos nos ensaios de titulao so submetidos anlise matemtica, que converte os dados de infectividade em valores numricos com uma acurcia aceitvel. Alguns mtodos de clculo so utilizados, no entanto, o mtodo de Reed e Muench o mais difundido para o clculo de ttulo viral (Quadro 3.1). Os mtodos de Spearman e Krber; e Seligman e Mickey so menos populares. Esses mtodos, apesar de diferirem na metodologia aplicada, baseiam-se na observao da infectividade, portanto, somente consideram as partculas infecciosas.

4.2 Ensaio de placa


Outro mtodo muito utilizado para a quanticao de vrus o ensaio de placa, descrito inicialmente por Dulbecco, em 1952. Diluies seriadas da suspenso viral so inoculadas em tapetes celulares pr-formados, geralmente em placas poliestireno de seis cavidades. Aps a adsoro e a remoo do inculo, os tapetes so recobertos

4.1 Diluio limitante


Os testes que utilizam a diluio limitante foram os primeiros desenvolvidos e so muito utilizados pela sua simplicidade. O material inicialmente submetido diluio seriada, e cada diluio serve como inculo para um n-

82

Captulo 3

Testes de infectividade so rotineiramente utilizados para o clculo do ttulo viral (nmero de unidades infecciosas por unidade de volume), que comumente expresso por TCID50/mL ou PFU/mL. Uma unidade infecciosa definida como a menor quantidade do vrus capaz de produzir um efeito biolgico detectvel (efeito citoptico, ECP) em clulas de cultivo in vitro, ou doena clnica, ou morte em animais. No caso de cultivos celulares, uma unidade infecciosa equivaleria a uma

partcula viral vivel capaz de infectar e replicar em uma clula susceptvel. 1.TCID50 definida como a diluio de um determinado vrus necessria para infectar 50% dos cultivos celulares inoculados. Esse tipo de teste consiste na produo e deteco de ECP nas clulas infectadas. O clculo da TCID50 em uma suspenso inicial de vrus pode ser feito pelos mtodos de Reed & Muench ou Spearman-Krber.

Cultivos celulares Diluio


No-infectados
10 10
-1

ndices acumulados
Noinfectados
0 0 0 0 2 7 15 23

Infectados
8 8 8 8 6 3 0 0

Infectados
41 33 25 17 9 3 0 0

Noinfectados + infectados
41 33 25 17 11 11 15 23

Porcentagem (%) = [Infectados/(infectados + no-infectados)] X


41/41 =100% 33/33 =100% 25/25 =100% 17/17 =100% 9/11 =81% 3/11 =27% 0/15 =0% 0/23 =0%

0 0 0 0 2 5 8 8

-2

10-3 10
-4

10-5 10
-6

10-7 10
-8

Para o clculo dos ndices acumulados dos cultivos noinfectados (isto , onde no se observou ECP), soma-se os valores dos cultivos no-infectados, iniciando-se a partir da -8 menor diluio (10 ). J o clculo do ndice dos cultivos infectados, realizado pelo somatrio das culturas infectadas -1 (onde o ECP foi visualizado) a partir da maior diluio (10 ). Assim, a diluio apresentada no Quadro 3.1 necessria para a infeco de 50% dos cultivos celulares, obviamente estar entre -6 -5 as diluies 10 (27% infectados) e (10 ) (81% infectados). A distncia proporcional entre essas duas diluies calculada da seguinte forma: (% positivo acima de 50%) - 50 ------------------------------------------------------------------------ = (% positivo acima de 50%) - (% positivo abaixo de 50%) Assim, tem-se: 81-50 81-27 = 0,57

Este ndice ou distncia proporcional utilizado para o clculo do ttulo viral pelo uso da equao: (fator da diluio onde se observou ECP em mais de 50% das culturas de clulas) + (ndice ou distncia proporcional multiplicado pelo logaritmo do fator de diluio). Assim, tem-se (-5) + (0,57 x 1) = -5,57. Desse modo, a diluio limitante da suspenso inicial do vrus capaz de infectar -5,57 50% dos cultivos celulares ser de 10 . A recproca deste nmero ser o ttulo viral por unidade de volume empregado para -5,57 a realizao da prova, ou seja, 10 TCID50 em 50L. Rotineiramente, o ttulo viral expresso em mililitros (mL). Para isso, basta multiplicar o valor obtido por 20 (1 mL contm 20 vezes o volume de 50L utilizado para a realizao da prova). -5,57 6,57 6,87 Finalmente, tem-se 10 que equivalente a 2 x 10 ou 10 TCID50/mL.

Quadro 3.1. Quantificao de vrus por diluio limitante

com uma camada de meio semi-slido base de gar ou carboximetilcelulose, e incubados por 24 a 72 horas, variando conforme o agente. As partculas virais que penetraram nas clulas durante a adsoro iro replicar e produzir prognie viral. A cobertura semi-slida, no entanto, impede que as partculas vricas produzidas se disseminem

distncia. A transmisso do vrus a partir das clulas inicialmente infectadas ocorre apenas para as clulas vizinhas, pela transmisso direta entre clulas. Aps alguns dias, so observados focos de destruio celular nos tapetes, denominados placas. Cada placa representa um determinado nmero de clulas infectadas e destrudas a par-

Deteco, identicao e quanticao de vrus

83

tir de uma clula originalmente infectada. O nmero de placas produzidas no tapete, portanto, corresponde ao nmero aproximado de unidades infecciosas presentes na diluio inoculada. Para uma melhor visualizao e contagem das placas, os tapetes so corados com cristal violeta (Figura 3.13). Nessa tcnica, a quanticao expressa como unidade formadora de placas por mililitro (PFU/mL). Para o clculo nal do ttulo, leva-se em considerao o nmero de placas produzidas em cada diluio e o volume utilizado para inoculao. Um exemplo de titulao, usando essa tcnica, est descrito no Quadro 3.2. Os ensaios em placa so utilizados principalmente para a quanticao de vrios vrus citopatognicos (ou citopticos), mas podem tambm ser utilizados para vrus que no induzem citopatologia. Nesses casos, os focos (e no placas) de replicao viral podem ser detectados e contados aps a realizao da tcnica de IPX. Alm de quanticao viral, os ensaios de placa so tambm utilizados com outras nalidades, incluindo: a) clonagem biolgica e puricao de vrus; b) anlise de fentipo de variantes virais; c) ensaios de neutralizao viral por anticorpos monoclonais ou policlonais; d) testes de

atividade antiviral de compostos qumicos; e) estudos de cintica e replicao viral, entre outras.

Figura 3.13. Ensaio de placa. Tapetes de clulas BHK-21 foram infectados com diferentes diluies do vrus da estomatite vesicular (VSV) e, 48 horas aps, foram corados com cristal violeta. Linha superior: a ausncia de placas indicativa da ausncia de vrus; Linha inferior: observa-se inmeros focos infecciosos, indicando a replicao viral e lise celular.

4.3 Outros mtodos de quanticao


Mtodos mais modernos que utilizam a biologia molecular tm sido empregados para a quanticao de vrus, principalmente em medi-

O ttulo de uma suspenso viral do VSV foi calculado pelo mtodo de ensaio de placa. Para isso, trs placas de seis cavidades, contendo uma monocamada prformada de clulas BHK-21 foram inoculadas. A partir da suspenso original, realizou-se oito diluies seriadas na base 10, que serviram como inculo. Cada diluio foi inoculada em duplicada e, para isso, foram

utilizados 200L/cavidade. Aps o perodo de adsoro, o inculo foi removido e meio de cultivo contendo carboximetilcelulose foi adicionado. Aps 24 horas de incubao, os tapetes celulares foram corados por cristal violeta. Os nmeros da contagem das placas esto apresentados abaixo.

Nmero de placas
Diluio 10-1 incontveis Rplicas incontveis Mdia incontveis 10-2 incontveis 10
-3

10-4 96 89 92,5

10-5 35 27 31

10-6 0 0 0

10-7 0 0 0

10-8 0 0 0

Controle 0 0 0

168 150 159

Para a obteno do ttulo, utiliza-se o nmero mdio de placas presentes na maior diluio em que foi possvel observar a replicao do vrus. Dessa maneira, tem-se: 31 5 6 x 10 PFU/200L, que o equivalente a 3,1x10 PFU/200L.

Normalmente o ttulo expresso em mililitro (mL), nesse caso, o volume inoculado foi de 200L e, para realizar a transformao, deve-se multiplicar por 5. Tem-se, ento, 6 7 15,5 x 10 PFU/mL ou 1,55 x 10 PFU/ml.

Quadro 3.2. Quantificao de vrus por ensaio de placa

84

Captulo 3

cina humana. Essas tcnicas mensuram a carga viral (ou quantidade de vrus) pela anlise quantitativa do material gentico viral presente em uma amostra clnica. A quantidade de vrus presente nas secrees e excrees de animais infectados com o FMDV pode ser estimada atravs da tcnica de real time PCR. Essa mesma metodologia tambm pode ser aplicada para os vrus da peste suna clssica (CSFV) e AFSV, entre outros. Imunoensaios quantitativos e outros procedimentos imunolgicos que fornecem a titulao e que avaliam a presena do vrus em cada diluio so amplamente usados. Esses mtodos apresentam a vantagem de permitir realizar diluies, adio de reagentes e leituras colorimtricas automatizadas. Os dados da leitura crua so posteriormente analisados por mtodos matemticos que permitem a identicao correta e precisam das unidades infectantes presentes no material testado. No entanto, esses mtodos possuem aplicabilidade restrita em medicina veterinria e dicilmente sero substitudos pelos mtodos tradicionais.

A caracterizao de uma amostra viral uma etapa posterior sua deteco e identicao. Essa etapa geralmente envolve a caracterizao antignica ou sorolgica, que pode ser denida como o perl dos antgenos de um vrus. A obteno deste perl realizada pelo uso de testes que detectam e identicam os determinantes antignicos presentes nas protenas virais. Vrias tcnicas so utilizadas com essa nalidade, incluindo a IFA com anticorpos monoclonais, soroneutralizao, xao do complemento, ELISA, alm de outras tcnicas sorolgicas. A forma de caracterizao a ser utilizada depende das particularidades de cada famlia de vrus e da disponibilidade de tcnicas e reagentes do laboratrio. A identicao de seqncias especcas pode ser realizada pelo uso de tcnicas como o PCR, anlise de restrio ou seqenciamento do genoma viral.

5.1 Sensibilidade a solventes lipdicos


Existe uma correlao entre presena do envelope e susceptibilidade dos vrus aos solventes lipdicos. Durante muito tempo, uma forma de identicao e caracterizao da presena de vrus envelopados foi o tratamento com solventes lipdicos previamente inoculao em cultivo celular ou ovo embrionado. No envelope viral, encontram-se inseridas glicoprotenas, que so responsveis pelas interaes iniciais vrus-clula. A remoo do envelope dos vrus resulta em perda de infectividade e inativao da partcula. A maioria dos vrus envelopados sensvel ao ter e/ou clorofrmio, que so os solventes normalmente utilizados (paramixovrus, herpesvrus, mixovrus entre outros); no entanto, alguns vrus, como os poxvrus, apresentam variaes de sensibilidade ao ter.

5 Identicao e caracterizao de um isolado


Os termos isolado ou amostra de vrus referem-se a um vrus que foi detectado e identicado, mas que ainda no foi completamente caracterizado. O termo cepa designa um vrus cujas principais caractersticas genotpicas e fenotpicas j foram estudadas e so conhecidas. As cepas so geralmente utilizadas como referncia em testes de diagnstico, em pesquisas e para a produo de reagentes. A primeira etapa aps a deteco de um agente viral a partir de amostras clnicas a sua identicao. Isso pode ser realizado preliminarmente pelas caractersticas do ECP produzido nos cultivos ou pelas alteraes produzidas no embrio de galinha. A ME pode ser utilizada para a identicao inicial do agente, de acordo com as suas caractersticas morfolgico-estruturais. A conrmao da identidade do agente, no entanto, depende do uso de anticorpos especcos (IFA, IPX), de anti-soro especco (SN ou HI) ou de mtodos de deteco e identicao de cidos nuclicos (hibridizao, PCR).

5.2 Concentrao e puricao por ultracentrifugao


Estudos estruturais e ultra-estruturais, produo de antgenos para imunizaes ou mtodos de deteco, entre outros, requerem solues contendo altas concentraes de vrus e com elevado grau de pureza. A obteno de solues com es-

Deteco, identicao e quanticao de vrus

85

sas caractersticas pode ser feita de vrias maneiras, das quais se destacam a ultracentrifugao. A ultracentrifugao um mtodo relativamente fcil, rpido e prtico, em que o material de alta qualidade obtido. Seu princpio baseia-se na taxa de sedimentao do vrus, que, por sua vez, dependente do tamanho, densidade, morfologia da partcula, bem como da natureza do meio e da fora de centrifugao. A maior restrio o custo do equipamento, que difere das centrfugas por atingir velocidades que variam entre 20.000 e 100.000 rotaes por minuto (RPM).

6 Biossegurana laboratorial
A manipulao em laboratrios de agentes infecciosos, como os vrus, pode representar risco

de infeces inadvertidas ou disseminao de enfermidades entre humanos e animais. Isso pode ser observado em vrias descries do passado. O FMDV, devido a sua alta infecciosidade, talvez tenha produzido os exemplos mais conhecidos. A infeco de pesquisadores pelo vrus Marburg, em um laboratrio da Alemanha na dcada de 1970, outro exemplo. No princpio, uma alternativa para evitar acidentes, como a disseminao do vrus febre aftosa ou introduo de agentes exticos no rebanho de um pas, foi a construo de laboratrios em ilhas, o caso mais conhecido de Plum Island Animal Disease Center, nos Estados Unidos. Posteriormente outros laboratrios de segurana elevada e acesso restrito, para manipulao de agentes virais e animais infectados, foram estabelecidos, tais como: o Australian Ani-

Tabela 3.4. Nveis de biossegurana para manipulao de agentes virais Nvel


BSL-1 BSL-2 BSL-3 BSL-4

Vrus no-zoonticos.

Associados com infeces em humanos, risco de auto-inoculao, ingesto ou exposio da pele e mucosas.

Agentes exticos ou selvagens, com potencial de transmisso por aerossol e de produzir doena severa ou letal. Normas do BSL-2, com acesso restrito e controlado, coleta de soro do trabalhadores, descontaminao de todo o lixo e resduos e esterilizao das roupas antes da lavagem.

Agentes altamente perigosos ou exticos, com risco de vida para humanos, transmitidos por aerossis, ou agentes de periculosidade desconhecida. Normas do BSL-3, com mudanas de roupas ao ingressar na rea contaminada. Requerimento de banho para sada, descontaminao de todo o material antes da remoo do laboratrio. BSL-3, utilizao de cabine de fluxo laminar tipo III ou cabines tipo I e II em ambiente com presso positiva, macaces de corpos inteiro com respiradores para todos os procedimentos.

Procedimentos

Vrus

Normas bsicas de prtica laboratorial.

BSL-1, com acesso limitado, identificao das reas de manipulao, primeiros socorros e descontaminao do lixo e resduos.

Equipamentos de proteo

Nenhum requerido.

Aventais, luvas, culos, conforme a necessidade. Manipulao de material que produz aerossol em cabine de fluxo laminar do tipo I ou II.

Requerimentos do BSL-1 e toda manipulao em cabine de fluxo laminar do tipo I ou II. Uso de luvas, aventais, respiradores, conforme a necessidade.

Equipamento de segurana

Bancada laboratorial.

BSL-1 com autoclave.

BSL-2 acrescido de separao fsica para corredores e reas de circulao, porta duplas, presso negativa nos laboratrios, sistema de filtrao do ar.

BSL-3, rea ou prdio isolado com suprimento de ar e exausto, vcuo e sistema de descontaminao.

BoHV, BVDV, BLV, BTV, PRV, CDV, outros.

Adenovrus humano, citomegalovrus, influenza A, B e C, rubola, poliovrus, parainfluenza, vrus da raiva.

Herpesvrus dos smios (vrus B), vrus da encefalite japonesa, hantavrus, febre amarela, encefalite eqina venezuelana, vrus do Nilo Ocidental.

Exemplos

Vrus Ebola, Marburg, sabi, febre do vale Rift, entre outros.

Adaptada de Murphy et al., 1999.

86

Captulo 3

mal Health Laboratory na Austrlia, o Onderstepoort Veterinary Institute na frica do Sul, o Institute for Animal Health na Inglaterra, o Center for Disease Control (CDC) em Atlanta e, mais recentemente, o Canadian Science Center for Human and Animal Health, em Winnipeg, no Cnada. A manipulao de amostras infectadas para pesquisa ou diagnstico deve seguir as normas da boa prtica laboratorial. Dessa maneira, contaminaes inadvertidas de amostras ou disseminaes da infeco entre humanos ou animais so evitadas. Conforme a infra-estrutura do laboratrio e o risco dos agentes manipulados, os laboratrios de virologia so classicados em Nveis de Segurana (BSL) 1, 2, 3 ou 4 (Tabela 3.4). O uso de tcnicas asspticas, roupas adequadas (avental, mscaras, luvas e culos) e desinfetantes apropriados so cuidados bsicos e necessrios em todo trabalho laboratorial, independente do nvel de segurana. O uso de equipamentos, tais como: cabines de uxo laminar, sistema de ltrao do ar, tratamento e esterilizao de dejetos, descarte e incinerao dos dejetos so requisitos necessrios para laboratrios que manipulem agentes com risco mdio a elevado, conforme o caso.

RICHMOND, J.Y.; McKINNEY, R.W. (Eds). Biosafety in microbiological and biomedical laboratory. 4.ed. Washington, DC: U.S. Government Printing Ofce, 1999. 265p. ROVOZZO, G.C.; BURKE, C.N. A manual of basic virological techniques. Englewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall, 1973. 287p. STORCH, G.A. Diagnostic Virology. In: KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M. (eds). Fields virology. 4.ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Cap.18, p.493-531. STRAW, B.E. et al. (eds). Diseases of swine. 8.ed. Ames, IA: Iowa State University Press, 2002. 1209p. SWAYNE, D.E. et al. A Laboratory manual for the isolation and identication of avian pathogens. 4.ed. Tallahasse, FL: Rose Printing, 1998. 311p. TIMONEY, J.F. et al. Hagan and Bruners microbiology and infectious diseases of domestic animals. 8.ed. Ithaca, NY: Comstock Publishing Associates, 1988. 951p. VERSTEEG, J. A colour atlas of virology. Weert, Netherlands: Wolfe Medical Publications, 1985. 240p.

7 Bibliograa consultada
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GENTICA E EVOLUO VIRAL


Mauro Pires Moraes & Hernando Duque Jaramillo1

4
89
90 92 93 93 94 95 95 97 97 97 98 98

1 Gentica viral
1.1 Conceitos e denies 1.2 Mutao 1.3 Classicao genotpica 1.4 Classicao fenotpica 1.5 Taxa de mutao 1.6 Interaes genticas entre vrus 1.6.1 Recombinao 1.6.2 Ressortimento 1.7 Outras interaes virais 1.7.1 Complementao 1.7.2 Mistura fenotpica 1.7.3 Poliploidia 2 Evoluo viral 2.1 Origem dos vrus 2.2 Quando se originaram os vrus 2.3 Como os vrus ampliaram o seu repertrio protico 2.4 Capacidade de mutao viral 2.5 Estudos laboratoriais de evoluo 2.6 Exemplos de evoluo viral 2.6.1 Vrus da estomatite vesicular: tempo versus fatores ambientais 2.6.2 Mixomatose na Austrlia 2.6.3 Vrus da inuenza 2.6.4 Parvovrus canino 2.7 Concluses 3 Bibliograa consultada

99
99 100 100 100 102 102 102 103 104 105 105

106

Responsvel pela seo de Evoluo Viral.

1 Gentica viral
As populaes virais, principalmente aquelas de vrus RNA, so excelentes modelos para estudos de evoluo gentica. Devido ao ciclo replicativo dos vrus ser extremamente rpido, tanto em infeces naturais como em cultivo celular, os processos de seleo e evoluo podem ser observados em um curto espao de tempo. Assim, a gentica de populaes virais pode ser considerada uma viso minimalista e simplista da evoluo das espcies. Ao longo de sua histria natural que pode remeter h milhes de anos os vrus vm realizando um nmero incontvel de ciclos replicativos em seus hospedeiros, sendo constantemente transmitidos entre hospedeiros. Alguns necessitam utilizar diferentes espcies de hospedeiros mesmo invertebrados para assegurar a sua manuteno na natureza. As infeces naturais resultam em presso de seleo constante, que acaba moldando o perl gentico e fenotpico dos vrus, pois favorece e permite a sobrevivncia das variantes que melhor se adaptam ao hospedeiro e que so mais ecientemente transmitidas. Dentre as propriedades que favorecem a sobrevivncia e evoluo dos vrus destacam-se: a) capacidade de replicar e ser excretado em altos ttulos; b) capacidade de se adaptar a novos tecidos, rgos e/ou hospedeiros; c) capacidade de ser excretado por longo tempo; d) capacidade de se reproduzir e ser excretado sem produzir doena severa na maioria de seus hospedeiros; e) capacidade de escapar dos mecanismos imunolgicos do hospedeiro; f) capacidade de resistir no meio ambiente, tanto fora de clulas vivas como em animais vertebrados ou invertebrados, assegurando a sua sobrevivncia at alcanar um novo hospedeiro; g) habilidade de ser transmitido verticalmente entre hospedeiros. Dentre as caractersticas que apresentam relevncia na gentica das populaes virais e facilitam a compreenso da sua evoluo, destacam-se a grande quantidade de prognie viral produzida a partir da infeco de uma nica clula e o curto perodo de tempo de gerao. Para se ter uma idia desta dinmica, a infeco de uma clula, com uma nica partcula infecciosa,

pode produzir uma prognie de mais de 100.000 novos vrions em pouco mais de 10 horas. Isso corresponde a uma cpia do genoma produzida a cada meio segundo. Considerando-se infeces de hospedeiros multicelulares ou mesmo cultivos celulares as geraes se sucedem em magnitude (nmero de indivduos produzidos) e velocidade inimaginveis. Um ingrediente adicional nesta complexidade a potencial variao gentica da prognie. Nos vrus RNA, geralmente ocorre uma mutao para cada 10.000 nucleotdeos incorporados aos novos genomas, ou seja, cada novo genoma potencialmente contm, pelo menos, uma mutao e, em alguns casos, a grande maioria da prognie pode ser distinta do vrus parental. Esses eventos, em conjunto, proporcionam uma grande capacidade de adaptao dessas populaes, resultando em novas geraes de vrus com propriedades distintas das parentais, de acordo com o ambiente em que replicam. A gentica dos vrus possui implicaes em todos os aspectos de sua biologia, incluindo a evoluo e seleo de variantes adaptados ao meio, distribuio espacial e temporal, espectro de hospedeiros, patogenicidade e virulncia, interaes com o sistema imunolgico do hospedeiro, entre outros. O estudo da gentica viral tem como objetivos conhecer a composio gentica do genoma e como as informaes genticas nele contidas se reetem no fentipo do vrus. Assim, o conhecimento da gentica viral pode ter um amplo espectro de aplicaes, que vo desde a sua utilizao para otimizar o manejo sanitrio de um rebanho at a produo de recombinantes atenuados para uso em vacinas. A gentica viral clssica era baseada no isolamento e anlise fenotpica de um grande nmero de mutantes naturais, estudos de complementao, recombinao natural, determinao da ordem e posio dos genes no genoma e, nalmente, na anlise fenotpica dos mutantes para determinar a funo dos genes. Notveis avanos foram obtidos com o desenvolvimento dos cultivos celulares na dcada de 1950 e com o advento das tcnicas moleculares a partir do nal dos anos 1970. Essas tcnicas permitiram a anlise detalhada da seqncia, estrutura e funo de cidos e protenas virais e inauguraram uma nova etapa

90

Captulo 4

no estudo da gentica dos seres vivos. Embora alguns procedimentos genticos clssicos continuem em uso, grande parte foi substituda por mtodos modernos que permitem uma anlise mais detalhada e aproximada das relaes entre gentipo e fentipo. A seqncia completa do genoma de virtualmente todos os vrus de interesse humano e animal j foi determinada e, atualmente, encontra-se disponvel em bancos de dados de acesso pblico. As funes de grande parte das protenas virais tambm j foram estabelecidas, tanto por mtodos diretos como por inferncia a partir de seqncias de aminocidos e estrutura de outras protenas semelhantes. De especial relevncia para a Virologia o conjunto de procedimentos denominados genericamente de gentica reversa, que realizam a anlise fenotpica a partir da composio gentica, ao contrrio da gentica clssica. Assim, o conhecimento da gentica e a disponibilidade das tcnicas moleculares tm permitido a manipulao do genoma dos vrus, a produo de recombinantes com mutaes em genes especcos e o estudo do impacto dessas mutaes no fentipo viral. Essas tcnicas e conhecimentos adquiridos tm proporcionado um progresso notvel na Virologia, permitindo a identicao e manipulao de genes envolvidos em virulncia e nas interaes com o sistema imune, como, por exemplo, para a produo de vacinas mais ecientes e seguras. A seqncia completa de nucleotdeos do genoma dos vrus pode ser determinada por tcnicas de seqenciamento de DNA. Em se tratando de vrus RNA, a anlise e manipulao dos genomas so facilitadas pela sua converso em molculas de DNA complementar (cDNA) por meio de transcrio reversa. Genomas recombinantes, contendo delees de genes, inseres de genes heterlogos ou mutaes pontuais em nucleotdeos ou seqncias especcas podem ser obtidos pelo uso de tcnicas moleculares de manipulao enzimtica e clonagem de DNA. Vrus contendo genes de outros vrus de interesse podem ser produzidos in vitro para estudos de patogenia, usos em terapia gentica e em vacinas. Protenas virais, para uso teraputico ou vacinal, podem ser expressas em sistemas heterlogos. Essas so

apenas algumas aplicaes da tecnologia de DNA recombinante e tcnicas moleculares em geral no estudo da gentica e biologia dos vrus. Considera-se que os limites da manipulao gentica dos vrus sero impostos apenas pelas restries biolgicas, ou seja, ser possvel modicar tudo e apenas o que a biologia permitir. Este captulo abordar os principais mecanismos genticos e de evoluo das populaes virais. Dentre esses, sero discutidos os mecanismos relacionados diretamente com as caractersticas de replicao do genoma, como as mutaes; aqueles resultantes de interaes entre diferentes vrus, como a recombinao, rearranjo, complementao; algumas interaes entre vrus e hospedeiros, como a integrao; e as interaes no-genticas entre vrus. A seo de evoluo abordar alguns aspectos e hipteses sobre a origem e evoluo dos vrus, e de como esses microorganismos conseguem se perpetuar e evoluir, apesar das constantes restries impostas pelo meio e pelas defesas dos hospedeiros. Ao nal, sero apresentados alguns exemplos de evoluo de vrus humanos e animais e as conseqncias biolgicas nas interaes desses agentes com os seus hospedeiros.

1.1 Conceitos e denies


Os princpios bsicos, conceitos e terminologia utilizados em gentica de vrus so basicamente os mesmos empregados no estudo da gentica de outros organismos. Assim, eventos como mutao, recombinao e seleo possuem signicado semelhante quando aplicados aos vrus. A gentica viral, no entanto, possui algumas particularidades que so derivadas das peculiaridades da biologia desses agentes. A replicao e a conseqente expanso viral, por exemplo, um processo muito mais rpido do que em outros organismos uni- ou multicelulares. Para se ter uma idia dessa dinmica, a infeco de uma clula por uma nica partcula vrica pode resultar na produo de uma prognie de mais de 100.000 vrions em poucas horas. Considerando-se as infeces naturais em hospededeiros multicelulares vertebrados, por exemplo ou mesmo em cultivos celulares, a populao derivada de um

Gentica e evoluo viral

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nico progenitor se expande exponencialmente em uma velocidade impressionante. Como resultado, as geraes de vrus se sucedem a uma velocidade incomparvel com aquela observada em organismos multicelulares. Essa caracterstica faz com que os vrus sejam muito utilizados como modelo para estudos genticos e evolutivos. Assim, quando se estuda os diversos aspectos da biologia e gentica dos vrus, na verdade est se estudando uma populao numerosa de indivduos (vrions), e no um indivduo isolado ou um grupo pequeno (como em estudos genticos em bovinos, por exemplo). Ento, quando se refere a uma cepa ou um mutante viral, a referncia feita ao conjunto de unidades vricas que compe aquela populao de vrus. Quando se refere a um determinado vrus vrus da cinomose (CDV), por exemplo est se referindo a uma espcie viral. Uma espcie viral denida como uma populao de vrus genetica e biologicamente muito semelhantes entre si, derivada de ancestrais comuns. Assim como os demais organismos uni- ou multicelulares, as diferentes espcies virais ou os diferentes vrus so compostos por inumerveis indivduos, que podem ser mais ou menos semelhantes entre si. Ou seja, a similaridade gentica e fenotpica entre os vrus que compem uma espcie variam entre as espcies. Os componentes de uma populao de vrus RNA (vrus da inuenza, por exemplo) so mais variveis entre si do que os vrus DNA. Em outras palavras, as populaes de vrus variam em sua homogeneidade/heterogeneidade, sendo que os vrus RNA so mais variveis. Cabe recordar que uma clula infectada com um nico vrion pode produzir centenas de milhares de novas partculas, no necessariamente idnticas em suas seqncias de nucleotdeos. Assim, uma amostra do vrus da diarria viral bovina (BVDV), isolada no Brasil, provavelmente diferente gentica e antigenicamente de amostras isoladas em outras partes do mundo. Por outro lado, os vrus DNA tendem a ser mais estveis geneticamente e pouca variao encontrada entre os vrus de uma mesma espcie. As diferenas nos nveis de homogeneidade/heterogeneidade entre os vrus DNA e RNA devem-se principalmente s propriedades das enzimas replicativas

desses vrus, que apresentam diferentes taxas de erro ao replicarem os genomas. Em razo da heterogeneidade gentica e fenotpica que pode existir em uma populao de vrus de uma mesma espcie sobretudo em vrus RNA os estudos genticos geralmente so realizados com vrus puricados. Atravs de clonagem biolgica e posterior expanso dos clones obtidos, possvel se obter populaes homogneas de vrus derivados de um nico ancestral. Os vrus puricados (ou clonados) a partir de populaes mistas so geralmente aqueles mais abundantes e predominantes na populao, sendo, por isso, os seus verdadeiros representantes. medida que esses clones so expandidos, no entanto, a tendncia que a prognie viral se torne gradualmente divergente geneticamente devido gerao contnua de indivduos com mutaes. Por isso, quando se deseja trabalhar continuamente com populaes homogneas de vrus, essas populaes devem ser periodicamente clonadas. Alm dos conceitos acima, algumas denies so tambm necessrias para o entendimento dos princpios de gentica viral, embora a sua aceitao e terminologia nem sempre sejam universais. Cabe ressaltar que as denies a seguir como j denido , referem-se aos vrus como populaes, colhidas diretamente dos hospedeiros ou de cultivos celulares onde so multiplicados: Vrus de campo (wild-type): o vrus original ou parental, a partir do qual se realiza estudos biolgicos, genticos ou moleculares. Esta populao de vrus serve de base para as comparaes genotpicas e fenotpicas feitas com populaes derivadas dela ou com outras populaes da mesma espcie viral, porm de outra origem. Embora a denominao remeta ao vrus original que foi obtido de animais infectados, os vrus de campo, utilizados em estudos biolgicos e genticos, nem sempre so exatamente iguais queles originalmente isolados. Isto porque a obteno de ttulos virais compatveis com vrios estudos requer a sua multiplicao, s vezes, por passagens sucessivas em cultivos celulares ou em ovos embrionados. Esses ciclos sucessivos de replicao podem resultar em alteraes genticas e fenot-

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Captulo 4

picas no vrus. De forma ideal, os vrus de campo utilizados em quaisquer experimentos devem ter sido cultivados o menor nmero de vezes possvel. O termo selvagem tambm tem sido utilizado para designar os vrus de campo; Mutante: o vrus que difere do vrus parental na seqncia de nucleotdeos de seu genoma, ou seja, apresenta alteraes de bases e/ou de segmentos genmicos em comparao com o vrus de campo. Algumas mutaes no se reetem em alteraes fenotpicas e, por isso, so chamadas de mutaes silenciosas (silent mutations). Nesses casos, o fentipo do vrus mutante indistinguvel do parental e a sua identicao depende de anlise da seqncia do genoma. Por outro lado, as mutaes que resultam em alteraes fenotpicas podem ser detectadas pela observao e anlise das caractersticas fenotpicas alteradas. Vrus temperatura-sensveis (TS), por exemplo, so mutantes que no replicam bem temperatura corporal (37-38C), ao contrrio do vrus parental. Os vrus TS geralmente necessitam uma temperatura mais baixa (30-34C) para replicarem com ecincia. Mutantes de placa pequena (small plaque mutants) so vrus que se disseminam decientemente em cultivo celular, produzindo focos menores de destruio celular do que os produzidos pelo vrus parental. Esse fentipo est geralmente associado com uma capacidade reduzida de transmisso direta entre clulas. Mutantes de gama de hospedeiros (host range mutants) so vrus que diferem dos vrus parentais em relao ao espectro de hospedeiros que infectam in vivo, ou em relao aos tipos celulares que podem infectar in vitro. O termo variante usado para designar um determinado vrus (uma populao de vrus) que apresenta alguma diferena fenotpica em relao ao vrus de campo, ou seja, uma denio essencialmente fenotpica. As diferenas fenotpicas entre os vrus parentais e os seus variantes certamente so reexos de mutaes no genoma; Cepa (ou estirpe): um vrus cujas caractersticas biolgicas e/ou moleculares so razoavelmente conhecidas. Em contraste, uma amostra (ou isolado) um vrus isolado de animais sobre o qual no se tem um maior conhecimento. Amostras (ou isolados) podem se tornar cepas

a partir da sua caracterizao laboratorial. Em outras palavras, as cepas so alguns isolados ou amostras de um determinado vrus que sofreram caracterizao aps o seu isolamento. No entanto, essas denies no possuem utilizao universal, e o termo cepa , muitas vezes, utilizado para designar isolados no-caracterizados e vrus de campo. O termo cepa de referncia utilizado para designar cepas virais conhecidas que so utilizadas por diferentes laboratrios com ns diagnsticos e/ou produo de reagentes, vacinas e mesmo para estudos de patogenia.

1.2 Mutao
O termo mutao utilizado para designar alteraes na seqncia de nucleotdeos no cido nuclico genmico de um determinado organismo comparando-o com o seu parental. As mutaes surgem naturalmente como resultado da indelidade das polimerases principalmente as polimerases de RNA que incorporam nucleotdeos incorretos durante a replicao do genoma. Mutaes tambm podem ser induzidas por mtodos qumicos (hipoxantina, bromodeoxiuridina) ou fsicos (raios X, ultravioleta e gama). Acredita-se que muitas mutaes que ocorrem naturalmente resultam na produo de vrus inviveis, ou seja, constituem-se em mutaes letais. Esses tipos de mutaes no so percebidas e no possuem impacto na adaptao e evoluo viral, pois os genomas mutantes so incapazes de replicar. Logo, quando se faz referncia a mutantes, cepas, tipos ou variantes virais, sempre so consideradas as mutaes no-letais, que permitem diferenciar o indivduo e a sua prognie do vrus parental. Como foi mencionado, as mutaes podem ser espontneas (resultados de erros durante a replicao) ou induzidas (resultados de danos ao cido nuclico por agentes qumicos ou fsicos). As mutaes naturais so mais freqentes nos vrus RNA (um nucleotdeo incorreto entre 103 a 104 nucleotdeos inseridos) do que nos vrus DNA (um erro a cada 108 a 1011 nucleotdeos incorporados). A maior taxa de mutao observada nos vrus RNA deve-se menor delidade da

Gentica e evoluo viral

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polimerase de RNA, que incorpora nucleotdeos incorretos com maior freqncia, alm da incapacidade de corrigir os erros cometidos. As polimerases de DNA, por sua vez, cometem menos erros e, ainda assim, so capazes de corrigi-los, substituindo os nucleotdeos incorretos incorporados s cadeias nascentes. Os mutantes gerados durante a replicao viral, quando apresentam uma vantagem seletiva em comparao com os parentais, sero amplicados com maior ecincia e rapidamente tornam-se predominantes na populao viral. Por outro lado, mutantes que no apresentam vantagem seletiva tendem a permanecer em proporo pequena e ocasionalmente desaparecem da populao, caso repliquem com menor ecincia do que os demais indivduos. Ou seja, a evoluo de uma determinada populao viral depende da taxa de mutao e da seleo a qual os vrus gerados so submetidos.

1.3 Classicao genotpica


Um dos critrios usados para a classicao de mutantes baseia-se nas caractersticas genotpicas da mutao. Mutaes causadas por simples substituies de nucleotdeos so chamadas de mutaes pontuais. As mutaes pontuais podem ser do tipo transio, quando h substituio de uma purina por outra purina (A ou G) ou pirimidina por outra pirimidina (C ou T); ou transverso, quando ocorre a substituio de uma pirimidina por uma purina ou vice-versa. Outras mutaes envolvem delees ou inseres de segmentos de tamanhos variveis de cido nuclico. Outra forma de classicao das mutaes pontuais considera as suas conseqncias na codicao de aminocidos, quando a mutao ocorre em seqncias codicantes do genoma. Assim, as mutaes podem ser silenciosas (silent mutations) quando a troca do nucleotdeo no resulta na codicao de outro aminocido. A protena sintetizada permanece a mesma e no ocorre mudana no fentipo do vrus. Mutaes de sentido trocado (missense) so aquelas em que a troca de nucleotdeos resulta na codicao de outro aminocido. As conseqncias dessas mutaes so variveis, dependendo do novo

aminocido incorporado protena e da possvel alterao da conformao e/ou funo protica. Mutaes missense podem ser absolutamente incuas (se o aminocido incorporado no alterar a funo da protena) ou mesmo letais (se o novo aminocido alterar drasticamente a funo da protena codicada). Mutaes sem sentido (nonsense) resultam na produo de um cdon de terminao da traduo (stop codon) em uma seqncia aberta de leitura (ORF). Com isso, ocorre a produo de uma protena truncada, cuja funcionalidade pode variar amplamente, dependendo do local onde a mutao introduzida. Essas mutaes so classicadas como mbar (amber = UAG), ocre (ochre = UAA) ou opala (opal = UGA). As conseqncias de mutaes nonsense tambm variam amplamente, e muitas delas so provavelmente letais ou, pelo menos, deletrias para a viabilidade do vrus. Embora as mutaes e suas conseqncias sejam mais estudadas em seqncias codicantes de protenas, certamente tambm so importantes em regies regulatrias de transcrio e replicao (promotores, enhancers, origens de replicao etc.), e em seqncias nucleotdicas envolvidas na encapsidao dos genomas recm-formados.

1.4 Classicao fenotpica


Os mutantes virais tambm podem ser classicados quanto s conseqncias fenotpicas de suas mutaes. Vrias caractersticas fenotpicas podem ser consideradas nesta classicao, e os mutantes podem ser selecionados pela sua habilidade em produzir placas de lise celular; por exemplo. Alguns mutantes de adenovrus podem egressar precocemente da clula infectada, em comparao com os seus parentais, e, conseqentemente, produzem maiores placas de destruio celular in vitro. Essa caracterstica pode estar relacionada com alteraes da virulncia do vrus, ou seja, mutantes virais que produzem placas maiores in vitro podem possuir maior virulncia em hospedeiros susceptveis in vivo. Este fenmeno j foi observado em diversos vrus, incluindo o vrus da peste suna clssica (CSFV). Em outros casos, pode no existir uma correlao entre tamanho de placa in vitro e virulncia in vivo. Nes-

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Captulo 4

ses casos, o fentipo serve apenas como um parmetro para a seleo de mutantes com diferentes habilidades replicativas in vitro. Outro fentipo observado para a seleo de mutantes a capacidade de replicao a diferentes temperaturas. Como j mencionado, os mutantes TS replicam bem a temperaturas de 30-34C (denominada temperatura permissiva) e no replicam com ecincia a 37C (temperatura no-permissiva). Mutantes adaptados ao frio (cold adapted) replicam melhor sob temperaturas baixas, mas retm alguma capacidade de replicar a 37C. Freqentemente, essa caracterstica atribuda a alteraes conformacionais de determinadas protenas, especialmente as polimerases virais, dependendo da temperatura. Ou seja, pela mudana na sua seqncia de aminocidos em determinada temperatura, essa protena no manteria sua conformao secundria ou terciria e perderia a sua funo. Esses mutantes podem ser utilizados em vacinas atenuadas, pois replicam apenas em reas superciais do corpo, sem se disseminar sistemicamente no organismo. A alterao da gama de hospedeiros outra caracterstica fenotpica utilizada na classicao de mutantes. Alguns mutantes podem no replicar com a mesma ecincia nos mesmos hospedeiros que os vrus de campo, reduzindo, assim, a sua abrangncia. Um exemplo tpico um mutante do vrus da febre aftosa (FMDV) que surgiu, em 1997, na Tailndia. Esse mutante natural no possua a habilidade de infectar bovinos principal espcie hospedeira do vrus infectando apenas sunos. Uma forma importante de seleo de mutantes a resistncia a determinadas drogas. A presso de seleo exercida pelas drogas antivirais permite o seu uso para a seleo e pesquisa desses mutantes. Anticorpos neutralizantes tambm podem ser utilizados para a seleo de vrus resistentes neutralizao. Para isso, os vrus so cultivados in vitro na presena de anticorpos neutralizantes. Os mutantes originados que eventualmente no forem reconhecidos pelos anticorpos por alteraes nas protenas de superfcie so rapidamente amplicados e se

tornam predominantes na populao. Esses vrus so chamados de mutantes de escape antignico. A gerao natural de mutantes de escape uma estratgia utilizada por vrus que produzem infeces persistentes, sobretudo os retrovrus, pois podem seguir replicando no hospedeiro mesmo na presena de anticorpos. Mutantes decientes em atividade enzimtica so aqueles que apresentam mutaes nos genes que codicam determinadas enzimas, como a timidina quinase dos herpesvrus. Esses mutantes apresentam capacidade de replicao semelhante a dos vrus parentais in vitro, mas a sua virulncia atenuada quando so inoculados em animais susceptveis. A exemplo dos mutantes TS, esses vrus tambm podem ser utilizados para a produo de vacinas. Os mutantes que apresentam atenuao da virulncia, sem que necessariamente se conhea a causa, so conhecidos como mutantes atenuados.

1.5 Taxa de mutao


As taxas de mutao natural dependem basicamente da delidade da enzima polimerase e da sua capacidade de corrigir eventuais erros cometidos durante a polimerizao das novas cadeias de cido nuclico. As polimerases de DNA, que utilizam molculas de DNA como molde para a sntese de novas molculas, geralmente apresentam um sistema de correo (proofreading) para aqueles nucleotdeos incorporados erroneamente. Esse processo envolve seqncias funcionais especcas (motivos) com atividade exonuclease, que so capazes de remover os nucleotdeos incorretos e substitu-los pelos corretos. Em contraste, as enzimas que polimerizam RNA a partir de RNA no possuem a capacidade de proofreading. Como conseqncia, as polimerases de DNA apresentam uma taxa de um erro para cada 1010 a 1011 nucleotdeos incorporados, enquanto as polimerases de RNA apresentam um erro a cada 103 a 104 nucleotdeos. Isso signica que a taxa de erros cometida durante a replicao dos vrus RNA pode ser at um milho de vezes maior do que aquela resultante da replicao dos vrus DNA. A diferena nas taxas de mutao se constitui na principal causa da grande variabi-

Gentica e evoluo viral

95

lidade gentica e antignica dos vrus RNA em comparao com os vrus DNA. Os erros de incorporao so essencialmente randmicos, mas a sua deteco em mutantes naturais indica que podem existir regies onde h uma maior concentrao de erros, conhecidos como pontos quentes (hot spots). Essas diferenas esto relacionadas com a habilidade dos mutantes sobreviverem com essas mudanas. Regies mais conservadas so aquelas em que as mutaes eventualmente introduzidas no se perpetuam na populao por provocarem efeitos deletrios aos novos gentipos.

enzimas e fatores auxiliares do hospedeiro. Em tese, a recombinao homloga pode ocorrer entre o genoma do vrus e da clula e entre dois genomas virais. As conseqncias da recombinao entre dois genomas virais variam de acordo com a similaridade das seqncias recombinadas e com o seu impacto no fentipo viral. Cabe ressaltar que a recombinao entre dois vrus geralmente ocorre entre vrus da mesma espcie e depende de uma infeco concomitante por esses vrus.

Genoma A

1.6 Interaes genticas entre vrus 1.6.1 Recombinao


Classicamente, o termo recombinao utilizado para designar um intercmbio de seqncias genticas entre dois genomas. Esse processo muito estudado em molculas de DNA e ocorre, com grande freqncia, na maioria das clulas eucariotas e procariotas. Alguns mecanismos de reparo do DNA, por exemplo, baseiam-se em eventos de recombinao gentica entre os cromossomos homlogos. Mecanismos semelhantes so observados em vrus DNA e parecem fazer parte do seu processo evolutivo. Esse processo envolve o alinhamento de duas molculas com seqncias semelhantes, a clivagem da cadeia contnua do DNA, o intercmbio de uma regio do genoma e a religao da cadeia de DNA, originando molculas hbridas ou recombinantes (Figura 4.1). Por causa da necessidade do alinhamento de seqncias entre molculas semelhantes, este processo denominado recombinao homloga. Na biologia dos vrus, recombinaes podem ocorrer entre dois vrus de uma mesma espcie viral ou, ocasionalmente, entre o genoma viral e o DNA da clula hospedeira. A recombinao homloga parece ser comum entre os vrus DNA e aqueles que apresentam molculas de DNA intermedirias de sua replicao, como os retrovrus. Em clulas infectadas, esse processo realizado com o auxlio de
Pareamento e troca de um segmento

Genoma B

Genomas recombinantes A/B

Figura 4.1. Ilustrao simplificada da recombinao homloga entre duas molculas de DNA.

Nos vrus RNA clssicos, esse evento mais raro e, provavelmente, no utiliza enzimas celulares. Os picornavrus e provavelmente outros vrus RNA de genoma no-segmentado apresentam uma forma de recombinao pouco eciente e diferente da recombinao homloga. A recombinao genmica desses vrus envolve o mecanismo de escolha do molde (copy-choice). Nesses casos, a polimerase de RNA inicia a sntese da cadeia lha utilizando uma molcula de RNA como molde, mas troca de molde durante a polimerizao, resultando em molculas hbridas de RNA, com seqncias mistas derivadas de mais de uma molcula molde (Figura 4.2).

96

Captulo 4

Genoma A
A polimerase troca de molde

Genoma B

Genoma recombinante A/B

Figura 4.2. Ilustrao simplificada do modelo de recombinao de RNA pelo mecanismo de copy choice.

Alguns exemplos de recombinao de vrus RNA na natureza servem para ilustrar as suas possveis conseqncias. Um exemplo clssico

a recombinao entre RNA viral e seqncias celulares (provavelmente de RNAs mensageiros), alm de recombinaes intramoleculares, que ocorrem durante infeces persistentes com o vrus da diarria viral bovina (BVDV). Nesses casos, o vrus que produz a infeco persistente no-citoptico e replica continuamente no animal, muitas vezes sem conseqncias clnico-patolgicas. No entanto, eventos de recombinao e/ou rearranjos genmicos, envolvendo o genoma viral e seqncias celulares, ocasionalmente resultam na gerao de mutantes citopticos. A gerao desses mutantes no animal persistentemente infectado seguida do desenvolvimento de doena fatal, denominada doena das mucosas. Os mutantes citopticos podem conter uma variedade de mutaes, inseres e rearranjos genmicos (Figura 4.3.). Casos de recombinao

A
5
N
pro

Rns

E1

E2

NS2-3

NS4-A NS4-B

NS5A

NS5B

B
5
N
pro

Insero
C E
Rns

E1

E2

Ns2

Ns3

NS4-A NS4-B

NS5A

NS5B

C
5
N
pro

Insero Duplicao
C E
Rns

E1

E2

NS2-3

Ns3

NS4-A NS4-B

NS5A

NS5B

D
5
N
pro

Duplicaes
C E
Rns

E1

E2

NS2-3

pro

Ns3

NS4-A NS4-B

NS5A

NS5B

E
5
N
pro

Ns3

NS4-A

NS4-B

NS5A

NS5B

Rns

E1

E2

Ns2

Deleo

Figura 4.3. Ilustrao de genomas do vrus da diarria viral bovina (BVDV) contendo alteraes genticas. A) Genoma do vrus de campo no-citoptico; B-E) Genomas de mutantes citopticos gerados por recombinao gentica; B) Genoma contendo uma insero de seqncia celular; C) Genoma contendo uma insero de gene celular e duplicao do gene na protena NS3; D) Genoma contendo duplicaes dos genes Npro e NS3; E) Genoma defectivo contendo uma deleo que abrange os genes das protenas estruturais e a NS2.

Gentica e evoluo viral

97

de amostras de campo e cepas vacinais do BVDV, com conseqncias diversas, tambm j foram relatadas. Eventos de recombinao tambm tm sido descritos nos togavrus e coronavrus, com conseqncias que incluem o surgimento de novos vrus, apresentando espectro de hospedeiros e virulncia alterados. No entanto, esses processos ainda no esto totalmente elucidados. Provavelmente, h uma correlao direta com a estratgia de replicao utilizada por esses vrus. At o momento, no h evidncia desse tipo de recombinao em vrus com genoma RNA de sentido negativo. O mecanismo natural de recombinao tem sido explorado em laboratrio, para a produo de vrus recombinantes, com caractersticas determinadas para usos diversos, incluindo estudos genticos de virulncia e produo de vacinas.

Vrus parental A

Vrus parental B

Prognie A

Prognie A/B

Prognie B

1.6.2 Ressortimento
Esse mecanismo exclusivo dos vrus que possuem o genoma RNA segmentado (ortomixovrus, buniavrus, arenavrus, reovrus e birnavrus) e pode ocorrer quando h uma infeco concomitante por duas cepas do mesmo vrus. Nesses casos, os segmentos genmicos recmreplicados so redistribudos de maneira irregular na prognie viral, resultando em vrions que contm uma mistura de segmentos dos dois vrus parentais. Esse mecanismo tem sido bem documentado nos vrus da inuenza e tem sido responsabilizado pelo surgimento de cepas altamente patognicas resultantes do ressortimento entre vrus avirios e de mamferos (Figura 4.4). Esses eventos ocorrem com maior freqncia em sunos, que podem ser infectados tanto por vrus avirios como por vrus de mamferos. De fato, vrias cepas do vrus da inuenza que causaram surtos em humanos e sunos podem ter resultado de ressortimento entre vrus previamente existentes. Do ponto de vista evolutivo, o ressortimento representa um importante evento para o vrus, pois resulta em uma alterao gentica e fenotpica muito rpida.

Figura 4.4. Ilustrao do mecanismo de ressortimento entre dois vrus da influenza resultante de uma coinfeco em sunos.

1.7 Outras interaes virais 1.7.1 Complementao


Esta interao puramente fenotpica e funcional e no resulta de modicao do genoma viral. Por exemplo, se dois mutantes TS, determinados por mutaes em genes distintos, infectarem concomitantemente uma clula, a caracterstica fenotpica pode ser revertida e ambos os vrus podem replicar a 37C, porm as caractersticas genotpicas permanecem as mesmas. Esse tipo de complementao do tipo intergnica ou no-allica (nonallelic). Quando as mutaes determinantes dos TS ocorrem no mesmo gene, mesmo que com modicaes diferentes, pouco provvel que ocorra complementao. Com menor freqncia, a complementao pode ser intragnica ou allica (allelic). Essa complementao pode ocorrer quando o produto do gene mutante origina uma protena com mltiplas subunidades, e as subunidades que so funcionais podem complementar a decincia do complexo nal.

98

Captulo 4

O processo de complementao tambm ocorre em determinadas populaes de vrus que so submetidas a vrias passagens in vitro. Durante esse processo, so gerados genomas defectivos contendo delees em um ou mais genes. Esses genomas defectivos no so capazes de replicar autonomamente, pois no contm genes que codicam protenas essenciais para a replicao. A presena concomitante de um genoma ntegro nas clulas infectadas, no entanto, permite a complementao das funes ausentes nos genomas defectivos e, assim, esses genomas so continuamente replicados. Embora esse evento seja bem caracterizado na biologia de vrios vrus in vitro, a sua ocorrncia e signicado biolgico in vivo permanecem incertos.

Vrus parental A

Vrus parental B

Co-infeco de um hospedeiro

Prognie

1.7.2 Mistura fenotpica


Essa alterao caracterizada pela interao entre dois vrus com a produo de prognie distinta dos vrus parentais. Os vrus resultantes so caracterizados pela presena de diferentes determinantes antignicos e as partculas virais possuem componentes de ambos os vrus parentais (Figura 4.5). Como a complementao, a mistura fenotpica no envolve mudanas genticas na prognie. Ou seja, os vrions resultantes possuem componentes estruturais oriundos dos dois vrus parentais, porm os seus genomas so idnticos aos dos vrus parentais. A mistura fenotpica pode ocorrer entre vrus da mesma famlia ou de famlias diferentes. Um exemplo de mistura fenotpica entre famlias distintas ocorre entre membros da Rhabdoviridae e Paramyxoviridae. Os vrus dessas duas famlias possuem protenas distintas no envelope, porm com funes semelhantes e, quando co-infectam uma determinada clula, podem realizar a mistura fenotpica. H tambm a possibilidade de produo de pseudovrions, quando o nucleocapsdeo pertence a um vrus e o envelope a outro (exemplo: nucleocapsdeo de retrovrus e envelope de um rabdovrus). Nesse caso, o tropismo dos vrus resultantes ser o mesmo dos rabdovrus, enquanto a prognie formada ser de retrovrus.

Fentipo misto Sem alteraes no genoma Possvel: Host range alterado Resistentes neutralizao

Figura 4.5. Ilustrao da mistura fenotpica resultante da co-infeco de uma clula por dois vrus diferentes. A prognie viral pode conter vrus com fentipos mistos, porm com o genoma de um dos dois vrus parentais.

1.7.3 Poliploidia
A grande maioria dos vrus animais haplide, ou seja, possui apenas uma cpia do genoma nos vrions. Os retrovrus se constituem em excees, pois os vrions contm duas cpias idnticas do genoma (so diplides). Porm, os paramixovrus podem, ocasionalmente, apresentar mltiplas cpias de seu genoma encapsidados em mltiplos nucleocapsdeos em uma nica partcula vrica, fenmeno denominado poliploidia. Existem descries de isolados do vrus do sarampo que, ecientemente, produzem vrions com, pelo menos, duas cpias do genoma. Essas duas molculas de RNA so complementares e possuem mutaes diferentes, existindo a necessidade da presena das duas tas para ocorrer a replicao.

Gentica e evoluo viral

99

2 Evoluo viral
Quando se fala em evoluo, geralmente se relaciona esse termo com um processo longo, que ocorre durante milhes de anos. No entanto, mesmo para os vrus muito antigos (alguns com indcios de existncia por mais de 220 milhes de anos), o processo de evoluo ocorre rapidamente e permanente, em razo do grande nmero de geraes produzidas em um curto espao de tempo. As mudanas evolutivas dos vrus se produzem em questes de dias, e possvel avaliar as suas conseqncias no fentipo viral em nvel laboratorial. Essa capacidade de mudana possui implicaes importantes na emergncia de novos patgenos, como tem sido testemunhado durante as ltimas dcadas, com a emergncia de vrus como o da imunodecincia humana (HIV), o parvovrus canino (CPV) e as mudanas peridicas que capacitam os vrus da inuenza a iniciar novas pandemias. A evoluo viral tem sido tema de estudos intensos nos ltimos anos e, conseqentemente, tem permitido a compreenso dos seus mecanismos e efeitos. Esta seo no pretende ser um tratado exaustivo de um tema to complexo, apenas se trata de um resumo geral, que inclui algumas das teorias recentes sobre a origem dos vrus, sua rpida capacidade de mudana, a maneira como se estuda a evoluo em laboratrio e no campo, as implicaes da evoluo viral na patognese e aparecimento ou emergncia de novas enfermidades. O conhecimento acerca dos mecanismos utilizados pelos vrus para alterar as suas propriedades genticas e fenotpicas pode permitir a utilizao de manejos mais adequados dos surtos e o planejamento mais efetivo de programas sanitrios para o controle de infeces virais. Todos os seres vivos evoluem com o decorrer do tempo, mas a rapidez de evoluo dos vrus RNA situa-se vrias ordens de magnitude acima da velocidade de evoluo dos organismos cujo genoma formado por DNA. Essa caracterstica pode ser explicada pela indelidade e incapacidade de correo das polimerases de RNA, o que resulta em um nmero maior de erros durante a replicao do genoma.

2.1 Origem dos vrus


O estudo da origem e evoluo dos vrus realizado principalmente por alinhamento e comparao de seqncias de cidos nuclicos e protenas, anlises logenticas e por estudos das estruturas tridimensionais das enzimas e protenas estruturais. Ainda que no exista uma evidncia inequvoca que permita determinar quando se originaram e com que rapidez evoluram, podese armar que os diferentes vrus no possuem uma origem comum e que vrios grupos deles surgiram independentemente. Atravs dos anos, tm-se proposto vrias teorias sobre a origem desses agentes. A teoria regressiva prope que os vrus evoluram por simplicao ou regresso de parasitos intracelulares que perderam os genes requeridos para a replicao independente. A teoria de origem celular defende que os vrus surgiram de componentes celulares que adquiriram a habilidade de replicar de forma autnoma dentro da clula hospedeira. A teoria da co-evoluo com as clulas muito favorecida na atualidade, mas de difcil comprovao prope que tanto os vrus RNA como os vrus DNA se originaram de plasmdeos (cromossomos acessrios que replicam independentemente do DNA celular). Estes plasmdeos poderiam ter adquirido, provavelmente por recombinao com o genoma das clulas hospedeiras, genes que permitiam a sua transformao em elementos genticos com as trs caractersticas bsicas dos vrus. Essas caractersticas so: a) codicar mecanismos que permitam a replicao intracelular; b) capacidade de empacotar o cido nuclico em partculas vricas, que so biologicamente inativas e relativamente resistentes no meio extracelular; e c) capacidade de ser transmitido entre clulas. Pode-se deduzir, portanto, que antes de se converter em vrus, esses plasmdeos j continham as funes necessrias para a sua replicao independente e que alguns deles comearam a desenvolver parte da maquinaria protica (polimerases) que permite a replicao do seu material gentico. Posteriormente, teriam adquirido os genes que codicam as protenas necessrias para empacotar o seu genoma e transport-lo entre clulas. Teriam ad-

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quirido tambm um variado repertrio de protenas, para uma melhor manipulao das funes celulares, do sistema imunolgico do hospedeiro e para a produo de uma prognie mais abundante.

2.2 Quando se originaram os vrus


A dependncia de uma clula hospedeira para a ocorrncia da replicao poderia implicar que os vrus se originaram depois das clulas eucariotas. No entanto, alguns elementos que compem os vrus podem ter se originado antes da evoluo celular. O genoma dos vrus RNA, por exemplo, pode ter surgido nos primrdios da vida, em um mundo constitudo por RNA e que consistiria de molculas de RNA catalticas e auto-replicativas. Aparentemente, todos os vrus RNA se originaram de um nico ancestral ou desenvolveram solues comuns para problemas similares. A anlise comparativa das seqncias de aminocidos das polimerases dos vrus RNA (enzimas que sintetizam cpias do genoma RNA) favorece a hiptese de que o seu gene seja codicado por vrus de procariotas e de eucariotas. Essa observao indica que a molcula ancestral das polimerases de RNA provavelmente se originou antes da divergncia evolutiva em procariotas e eucariotas. Outras superfamlias de enzimas comuns a todos os vrus RNA e que, como as polimerases, apresentam um alto grau de similaridade, tambm reforam a hiptese de uma origem muito antiga e monologentica dos vrus RNA. Essas superfamlias so as helicases e algumas proteases semelhantes a quimiotripsinas.

genoma viral com o cido nuclico de outros vrus ou das clulas hospedeiras. A recombinao do genoma pode ocorrer entre vrus diferentes, inclusive entre vrus que pertenam a famlias distintas. Os vrus so muito ativos na obteno de seqncias genmicas por recombinao com outros vrus durante a sua evoluo, e essa caracterstica tem dicultado a construo de rvores logenticas nicas, que facilitem uma classicao lgica e nica. Como resultado dessas recombinaes, vrus de grupos muito distintos podem possuir genes relacionados e seqncias homlogas. A recombinao pode ocorrer entre regies do prprio genoma viral (recombinao intramolecular), resultando em duplicao de genes, delees e inseres, com a transformao em novos genes. Assim, uma determinada seqncia de nucleotdeos pode duplicar-se vrias vezes e, dessa maneira, originar famlias de genes, como ocorre nos poxvrus e no vrus da peste suna africana (ASFV). Os vrus tambm podem obter novos genes mediante a sntese de uma nova seqncia de nucleotdeos ou pelo uso de seqncias abertas de leitura (ORFs; open reading frame) alternativas. Combinaes desses mecanismos j foram descritas, como a duplicao de um gene acompanhada de mudana de ORF. Esses processos de recombinao seguem ocorrendo e podem ter conseqncias diversas na biologia dos vrus, incluindo alteraes na especicidade de hospedeiro, tropismo tecidual, patogenicidade e virulncia, como tambm podem resultar na emergncia de novos vrus.

2.3 Como os vrus ampliaram o seu repertrio protico


Aps a aquisio dos genes bsicos que permitiam a replicao e construo do capsdeo viral contendo o genoma, os vrus continuaram evoluindo e ampliando o nmero de genes do seu genoma, para codicar novas protenas, e, conseqentemente, adquirir novas funes e propriedades evolutivas. Um dos mecanismos utilizados para a aquisio de novas seqncias a recombinao do

2.4 Capacidade de mutao viral


O estudo das enzimas que catalisam a replicao dos cidos nuclicos as polimerases tem demonstrado que as polimerases de DNA celulares possuem uma alta delidade. Isto se deve, em parte, capacidade dessas enzimas de remover nucleotdeos inseridos equivocadamente. A taxa de erro dessas polimerases tem sido calculada em 10-8 a 10-11 nucleotdeos por replicao. Isso signica que, em uma molcula de DNA de um bilho de nucleotdeos polimerizados, apenas um nucleotdeo errado ser incorporado. A taxa de

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erro das polimerases virais de DNA 20 a 100 vezes maior. Em contraste, as polimerases dependentes de RNA no possuem mecanismos de correo, e, por isso, a sua taxa de erro muito alta: entre 10-3 a 10-4 nucleotdeos/replicao. Portanto, cada novo genoma RNA viral com 10.000 nt contm uma mdia de trs mutaes pontuais (trs nucleotdeos diferentes do genoma parental). Algumas dessas mutaes podem ser prejudiciais aos vrus, enquanto outras so neutras e no possuem nenhum efeito. provvel tambm que algumas mutaes introduzidas durante a replicao resultem em benefcios para a replicao viral, conferindo vantagens evolutivas aos vrus mutantes. Uma mesma mutao pode ter efeitos diferentes para um vrus, dependendo do meio em que se encontre. Por exemplo, uma determinada mutao pode conferir vantagens para a replicao do vrus em sunos, porm pode ser adversa para a sua replicao em bovinos. Essas mutaes, que ocorrem ao acaso, so mantidas ou descartadas por meio dos processos de seleo natural por conferir maior aptido biolgica. O conhecimento das conseqncias dessas mutaes pode ser til para a manipulao viral, pois possibilita o desenvolvimento de vacinas baseadas em variantes virais atenuadas ou adaptadas a outras espcies. Como cada novo genoma de RNA viral sintetizado possui pelo menos trs mutaes, as seqncias genmicas e os vrus individuais produzidos continuamente so diferentes entre si. Essa distribuio de indivduos no idnticos, porm muito semelhantes, foi denominada por Manfred Eigen como quasispecies. Portanto, os indivduos que compem uma quasispecie apresentam pequenas variaes nas seqncias genmicas, porm aqueles indivduos que apresentam uma maior aptido biolgica e ecincia de replicao tornam-se predominantes sobre os demais e so produzidos em maior abundncia. Apesar do polimorsmo existir em virtualmente todos os seres vivos, o termo quasispecie viral utilizado para enfatizar a grande variao que os vrus componentes de uma mesma populao exibem. Esse termo utilizado para os vrus RNA pela sua grande variabilidade gentica. Assim mesmo, os diferentes vrus RNA apresentam nveis variveis de variabilidade gentica.

A caracterstica das polimerases de introduzir mutaes muito favorvel para os vrus, permitindo a produo de mutantes que, eventualmente, possam se adaptar ao hospedeiro ou a diferentes condies do meio. Em alguns casos especcos, os vrus que possuem polimerases com maior delidade apresentam decincias em sua aptido biolgica. Isso sugere que a evoluo tende a conservar esta capacidade de erro das polimerases, mas mantendo-as abaixo de um limite denominado nvel de erro limite (threshold error). Acima desse nvel no seria possvel a sobrevivncia dos vrus como espcie. Os vrus constituem a combinao da grande diversidade de indivduos, com seqncias diferentes e que possuem a propriedade de produzir prognie abundante. Como exemplo, o vrus da poliomielite (um picornavrus) produz uma descendncia de 10.000 indivduos em uma nica clula infectada. A populao viral sofrer, ento, um processo de seleo natural cada vez que as condies do meio se alterem. Assim, os indivduos com maior aptido para sobreviver a essas novas condies se tornaro tambm os mais abundantes. A alta taxa de alteraes produzidas no genoma dos vrus RNA o motor que permite a explorao rpida de novos espaos evolutivos. Em outras palavras, as mutaes no genoma podem reetir em mudanas de aminocidos e essas novas combinaes de aminocidos podem gerar novas estruturas proticas com propriedades e funes inditas. Essas propriedades e funes podem ser importantes para a adaptao do vrus a novos hospedeiros ou para escapar da vigilncia do sistema imune, por exemplo. importante tambm observar que a seleo natural faz parte do processo evolutivo. O processo de seleo faz com que os indivduos que contenham mutaes que favoream a sua replicao em determinado meio produzam maior descendncia e predominem na populao. Por exemplo, uma mutao nas protenas do capsdeo pode fazer com que um vrus escape da neutralizao por anticorpos. Esses vrus que escapam da neutralizao sofrem um processo de seleo quando infectam animais vacinados e, com o tempo, passam a predominar e substituir a populao viral original.

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2.5 Estudos laboratoriais de evoluo


O estudo da dinmica de evoluo dos vrus RNA in vitro tem sido realizado principalmente em bacterifagos e no vrus da estomatite vesicular (VSV). A freqncia de recombinao do VSV muito baixa e no detectvel. Esse fenmeno permite que se utilizem duas populaes virais competindo em clulas, sem que haja intercmbio gentico entre elas. Caso se consiga uma caracterstica ou marcador que identique e diferencie essas populaes, possvel saber as propores de cada populao ao longo de passagens seriadas em cultivos de clulas e avaliar a aptido biolgica relativa de cada populao. Uma caracterstica fenotpica utilizada nesses estudos a resistncia (ou escape) neutralizao por anticorpos, presente em uma das populaes, devido a mutaes introduzidas pela polimerase. Dessa maneira, foram isolados mutantes cujas seqncias consenso diferiam da seqncia da cepa progenitora somente em um aminocido, sendo resistentes neutralizao por um anticorpo monoclonal especco. Quando a cepa progenitora e a cepa resistente neutralizao so misturadas, possvel determinar a proporo de placas produzidas por cada uma das cepas cultivadas na presena ou ausncia do anticorpo monoclonal. No cultivo com a presena do anticorpo, somente so amplicados os vrus da cepa resistente neutralizao, enquanto no cultivo sem anticorpos so produzidas placas produzidas por vrus das duas cepas. Dessa forma, possvel quanticar a proporo de placas formadas por componentes de cada cepa e determinar qual cepa apresentou maior aptido biolgica. Esses experimentos podem ser relacionados com muitas observaes epidemiolgicas realizadas em populaes animais. As altas densidades animais nas criaes intensivas requerem programas sanitrios especiais, pois, aps a introduo de um patgeno, a aglomerao de animais favorece os ciclos de infeco iniciados com grandes populaes de vrus, e a evoluo viral contribuiria para uma maior aptido biolgica. Em contraposio, as baixas densidades de animais na populao produzem indiretamente um gargalo gentico e, como conseqncia, os vrus so

mais benignos, alguns animais no adoecem e podem desenvolver imunidade natural por contato com o vrus de baixa aptido biolgica.

2.6 Exemplos de evoluo viral


Mesmo que a capacidade terica de mutao e explorao do espao evolutivo por parte dos vrus parea ilimitada, a estrutura e funes das diferentes protenas e cidos nuclicos desses agentes, assim como as interaes com os hospedeiros, j sofreram um processo intenso e prolongado de otimizao da aptido biolgica. Portanto, provavelmente h restries que limitem a capacidade real de mudana. Por essa razo, possvel que vrus isolados de uma mesma regio com um grande intervalo de tempo sejam virtualmente idnticos. Ou seja, j teriam atingido um gentipo/fentipo equilibrado e sucientemente evoludo ou, por outro lado, j teriam esgotado a sua capacidade de evoluo. Quando se analisa a evoluo viral, podese observar como os diferentes vrus utilizam distintas estratgias evolutivas. Em seguida, so apresentados alguns exemplos que ilustram essas mudanas evolutivas que conduzem aquisio de uma maior aptido biolgica, isto , produo de prognie viral mais bem adaptada e mais numerosa. Existem vrus cujas mutaes facilitam a sua adaptao ao meio e outros cujas alteraes genticas alteram a sua virulncia. Existem tambm aqueles que alteram as suas propriedades antignicas para garantir seus ciclos contnuos de transmisso e alguns que usam estratgias que ampliam seu tropismo para outras espcies e/ou tecidos. Todas essas alteraes ocorrem com o objetivo nico de garantir a sobrevivncia e manuteno desses agentes na natureza.

2.6.1 Vrus da estomatite vesicular: tempo versus fatores ambientais


O vrus da estomatite vesicular (VSV) um vesiculovrus pertencente famlia Rhabdoviridae. O VSV infecta uma grande variedade de ruminantes e sudeos domsticos e silvestres, causando uma doena clinicamente semelhante febre

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aftosa, caracterizada por febre e leses vesiculares na boca, focinho, patas e em regies do corpo com abrases ou leses mecnicas. As anlises logenticas de isolados do VSV de vrias regies da Amrica Central e do Norte tm demonstrado que as seqncias de cepas de uma mesma regio geogrca apresentam um alto grau de conservao, mesmo quando isoladas a grandes intervalos de tempo (at 30 anos). Essa caracterstica no observada para os vrus isolados na mesma poca em diferentes regies. A distribuio logentica mostra um melhor agrupamento dos vrus por regies geogrcas. A evoluo desse vrus depende de presses de seleo relacionadas com fatores ecolgicos, como os vetores que transmitem o vrus e os animais reservatrios que o mantm. Para esse vrus, no foi detectada a evoluo por presso imunolgica seletiva, que muito evidente para o vrus da inuenza, por exemplo.

2.6.2 Mixomatose na Austrlia


Muitos estudos clssicos demonstram a evoluo dos vrus nas populaes humanas e animais. Em um deles, observou-se como o vrus da mixomatose dos coelhos evoluiu aps a sua introduo na Austrlia. A mixomatose uma doena produzida por um poxvrus, cujos hospedeiros naturais so os coelhos americanos do gnero Sylvilagus. Essa enfermidade conhecida desde 1896, e a transmisso ocorre mecanicamente por insetos. Nos hospedeiros naturais, a infeco produz bromas localizados e benignos. Porm, ao contrrio da enfermidade branda produzida nos coelhos americanos, o vrus do mixoma produz uma infeco letal nos coelhos europeus do gnero Oryctolagus. Nas primeiras dcadas do sculo passado, coelhos europeus foram introduzidos da Austrlia propositalmente e, como no existiam predadores naturais, esses animais se reproduziram rapidamente, tornando-se uma praga para a agricultura e pecuria. Assim, em 1950, um programa de controle biolgico dos coelhos com o vrus da mixomatose foi aplicado naquele pas com o objetivo de solucionar o problema da superpopulao.

A cepa viral utilizada era oriunda do Brasil, isolada pelo Instituto Oswaldo Cruz em 1911. Inicialmente, a disseminao do vrus no foi ampla e permaneceu restrita aos habitats onde era introduzido, sem disseminao para ecossistemas vizinhos. Porm, observaram-se, posteriormente, centenas de coelhos doentes em locais muito distantes dos locais originais de introduo do vrus. A doena se distribuiu principalmente pelas margens dos grandes rios, onde os mosquitos eram mais abundantes. O vero seguinte foi mido, e a enfermidade se disseminou rapidamente, resultando em mortalidade de at 99%. No entanto, no ano seguinte, observou-se que uma variante menos virulenta do vrus estava gradativamente substituindo a cepa original de alta virulncia. A virulncia da cepa original e das cepas de campo isoladas na Austrlia foi determinada em coelhos de laboratrio e a cada isolado se atribuiu um grau de virulncia entre I e V. A cepa original foi 100% letal em 11 a 13 dias aps a inoculao (virulncia grau I). Algumas das cepas de campo produziram uma letalidade entre 70-95%, com mdia de sobrevivncia de 17 a 20 dias (virulncia grau III). Outras cepas matavam menos de 50% dos coelhos infectados e produziam uma doena mais benigna (virulncia grau IV). Aps dois anos, todos os vrus de campo recuperados na Austrlia possuam grau III. A seleo de cepas menos letais ocorreu em conseqncia da transmisso do vrus para os mosquitos, que foi prolongada para os vrus com virulncia de grau III pela maior sobrevivncia dos coelhos. Como conseqncia, os animais infectados produziam vrus por mais tempo, dando maior oportunidade aos mosquitos de se contaminar e transmitir a doena. Por outro lado, os coelhos infectados com a cepa original de grau I morriam rapidamente, e o ciclo de transmisso era interrompido. A populao de coelhos na Austrlia tambm sofreu uma seleo para a resistncia mixomatose. A nova gerao de coelhos descendeu dos 10% da populao original que sobreviveu doena. Durante sete anos, antes de comearem os surtos de mixomatose na primavera, coelhos jovens eram capturados nas reas endmicas e mantidos em cativeiro at atingirem a idade

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adulta e os nveis de anticorpos maternos desaparecerem. Esses coelhos foram desaados com uma cepa de virulncia grau III. A mortalidade foi superior a 90% no primeiro ano e somente 30% no stimo ano. Embora a mixomatose tenha sido introduzida deliberadamente na Austrlia, pode-se considerar que esse foi um caso de enfermidade emergente. Humanos infectaram coelhos europeus com o vrus da mixomatose, uma espcie na qual o vrus produz uma doena muito mais severa. A emergncia de uma enfermidade pode estar relacionada com uma mudana evolutiva no agente causal, porm a enfermidade pode emergir mesmo na ausncia de mutaes virais. No caso da mixomatose na Austrlia, o vrus evoluiu, reduzindo a sua virulncia. No entanto, no h um consenso de que todos os vrus evoluem no sentido da atenuao. muito comum se considerar que os vrus evoluem para uma forma inofensiva para o seu hospedeiro, o que, provavelmente, poderia ser melhor para o futuro da populao viral. Aos parasitas interessa no produzir muitos danos na populao hospedeira, para que esses sobrevivam e permitam a sua amplicao e transmisso. Contudo, o xito evolutivo de uma espcie depende essencialmente da gerao de uma descendncia numerosa, e isso no est necessariamente associado com atenuao da doena nos hospedeiros.

2.6.3 Vrus da inuenza


Os vrus da inuenza tm utilizado uma srie de estratgias e alteraes evolutivas que permitem a sua contnua circulao mesmo em populaes com certo grau de imunidade. Existem razes evidentes pelas quais se estuda muito esses vrus: ocorreram quatro pandemias de inuenza em um sculo e, na pandemia de 1918, morreram entre 20 e 50 milhes de pessoas. O vrus da inuenza um ortomixovrus, possui envelope e seu genoma composto por oito segmentos de RNA de sentido negativo, a maioria dos quais codica somente uma protena. O envelope viral possui duas glicoprotenas: a hemaglutinina (16 tipos) e a neuraminidase (nove tipos), e as cepas so designadas conforme

a composio da superfcie viral por estas protenas (H3N2, H5N1, H3N8). A hemaglutinina (HA) a protena que se liga a molculas da superfcie celular que possuem cido silico, que servem como receptores para o vrus. A HA tambm a protena que induz a produo de anticorpos neutralizantes e protetores pelo hospedeiro. A neuraminidase (NA) atua durante o egresso do vrus, clivando o cido silico dos glicoconjugados e permitindo, dessa maneira, que a prognie viral seja liberada da clula. Os vrus da inuenza so mestres nas mudanas genticas e antignicas. Ao se estudar os diferentes isolados, so observadas variaes antignicas pontuais e progressivas na HA. Essas pequenas variaes denominam-se drift antignico (pode ser traduzido como substituio gentica, principalmente por mutaes em ponto) e permitem ao vrus reinfectar uma populao parcialmente imune, que ainda possui anticorpos produzidos por uma infeco recente, mantendo o vrus circulante na populao. Contrastando com essas variaes pequenas, as alteraes radicais na HA e NA denominam-se shift (troca), e ocorrem pelo intercmbio dos respectivos genes entre dois vrus da inuenza quando estes co-infectam um mesmo hospedeiro. Esses shifts antignicos foram responsveis pelas pandemias de 1957 e 1968, e acredita-se que so produzidos periodicamente pela criao conjunta de aves e sunos. Ao contrrio, os segmentos genticos do vrus que causou a pandemia de 1918 se originaram completamente de um ancestral avirio. Alm do drift e shift, so detectadas inseres de seqncias e outros mecanismos que permitem o processamento proteoltico da HA, alterando o tropismo tecidual e a patogenicidade. Assim, os vrus da inuenza evoluem por meio de dois mecanismos principais: mutaes em ponto, que conferem pequenas alteraes antignicas; e ressortimento, que proporciona grandes alteraes antignicas e/ou de virulncia. A espcie animal que geralmente abriga os eventos de ressortimento a suna, que pode ser infectada tanto por vrus avirios como por vrus humanos ou sunos. Em 2005, foi publicado um artigo que descreve como o vrus que ocasionou a pandemia de

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1918 foi recriado em laboratrio. O mais marcante deste fato que esta pandemia ocorreu muito antes da identicao do vrus da inuenza, que somente foi isolado no princpio dos anos 1930. Os segmentos genmicos de RNA do vrus foram recuperados de amostras de pulmo xadas em formalina, que estavam guardadas, e tambm de tecidos de uma vtima da pandemia de 1918 que havia sido enterrada na permafrost (terra permanentemente congelada, no Alasca). Por meio de metodologia de gentica reversa, foi possvel recriar o vrus em laboratrio e estudar algumas de suas caractersticas. As seqncias dos genes do vrus de 1918 so relacionadas com o vrus H1N1 avirio, mais do que com qualquer outro isolado H1N1 de mamfero. Esses achados aumentaram a preocupao atual com os casos de inuenza de origem aviria pelo vrus H5N1, que pode infectar humanos. At o momento, no h evidncias de que este vrus possua a habilidade de ser transmitido entre humanos, pois a replicao viral connada ao trato respiratrio inferior e provoca a morte de pessoas em poucos dias. Porm, medida que o nmero de pessoas infectadas aumente, a probabilidade de mutaes que permitam a transmisso entre humanos tambm aumentar. Os trs tipos de alteraes evolutivas descritas, drift e shift antignico e inseres na hemaglutinina conferem ao vrus da inuenza uma maior aptido biolgica, uma vez que podem reinfectar uma populao parcialmente imune ou ampliar o tropismo tecidual, produzindo uma prognie mais abundante.

Estudos das mutaes responsveis pelo cruzamento da barreira entre espcies indicam que mudanas em apenas dois cdons (posies 93 e 323) da VP2 do FPLV possibilitaram ao vrus infectar ces e linhagens celulares de origem canina. Posteriormente foi demonstrado que as mesmas substituies desses cdons no CPV pelos correspondentes do FLPV eliminam a predileo do vrus pela espcie canina. Como a populao canina no possua anticorpos contra o novo agente, os primeiros seis meses aps o surgimento do CPV foram seguidos de uma pandemia mundial, que produziu gastrenterite hemorrgica grave com altos ndices de mortalidade em ces. Esse agente foi denominado CPV-2 e, nos anos seguintes, sofreu algumas alteraes que permitiram uma adaptao maior aos hospedeiros caninos, originando os bitipos CPV-2a e CPV-2b. Um terceiro bitipo, o CPV-2c, tem sido descrito na populao canina nos ltimos anos. Acredita-se que o CPV no perdeu a sua capacidade inicial de infectar felinos, pois a infeco natural tem sido demonstrada em gatos domsticos. Os CPVs que existem atualmente circulando na populao canina so menos virulentos do que os originais, provavelmente reetindo uma evoluo do vrus no sentido de se adaptar aos novos hospedeiros.

2.7 Concluses
Os vrus so os mestres das mudanas e evoluo gentica. importante conhecer as estratgias que esses agentes utilizam para melhor reconhecer enfermidades produzidas por vrus emergentes e por vrus conhecidos que produzam doenas atpicas. medida que se intensica a explorao pecuria e se aumenta a densidade dos animais, torna-se necessria a implementao de programas sanitrios especiais que reduzam a possibilidade de introduo de novos patgenos nas criaes. importante considerar tambm que todos os vrus so importantes, mesmo os que aparentemente no produzem enfermidades no homem ou em animais, pois esses agentes podem alterar a sua gama de hospedeiros e produzir enfermidades devastadoras. Exemplos recentes incluem a infeco de humanos, ces e

2.6.4 Parvovrus canino


O parvovrus canino (CPV) surgiu subitamente como causa de enfermidade de ces na dcada de 1970 e, em 1978, foi diagnosticado simultaneamente em vrios pases, causando enfermidade grave na populao canina. Este vrus se originou a partir de um parvovrus j conhecido anteriormente, o vrus da panleucopenia felina (FPLV), por mutaes em ponto na protena VP2 do capsdeo, stio de ligao do vrion aos receptores celulares. Assim, o novo vrus foi capaz de infectar e, posteriormente, se adaptar a uma nova espcie hospedeira.

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felinos com novos subtipos do vrus da inuenza, o surgimento do SARS-CoV, que matou centenas de pessoas na sia e a inusitada infeco de mamferos marinhos com variantes do CDV, causando alta mortalidade no mar Mediterrneo. Assim, tendo em vista a sua plasticidade e capacidade de adaptao e evoluo, nenhum vrus pode ser considerado sem importncia.

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REPLICAO VIRAL
Eduardo Furtado Flores & Luiz Carlos Kreutz

5
109 109 110
111 114 114 114 117 118 118 118 119 119 121 122 126 131 131 132

1 Introduo 2 Conceitos bsicos: infeco, susceptibilidade, permissividade 3 Etapas da replicao


3.1 Adsoro 3.2 Penetrao 3.2.1 Penetrao por fuso na superfcie celular 3.2.2 Penetrao aps endocitose 3.2.3 Outros mecanismos de penetrao 3.3 Etapas aps a penetrao 3.3.1 Desnudamento 3.3.2 Movimentao intracelular 3.3.3 Penetrao nuclear 3.4 Expresso gnica 3.5 Replicao do genoma 3.5.1 Replicao dos vrus DNA 3.5.2 Replicao dos vrus RNA 3.6 Morfognese, maturao e egresso 3.6.1 Maturao intracelular (citoplasmtica ou nuclear) 3.6.2 Maturao por brotamento em membranas celulares

4 Bibliograa consultada

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1 Introduo
A produo de prognie gentica e fenotipicamente semelhante ao vrus parental se constitui no evento central da existncia e perpetuao dos vrus na natureza. Por isso, por uma viso evolutiva simplista, a multiplicao dos vrus possui uma nalidade nica e objetiva: produzir prognie vivel. As alteraes da siologia celular, associadas com as infeces virais que podem resultar em doena e at em morte do hospedeiro , so meras conseqncias das interaes do vrus com as clulas; interaes que so absolutamente necessrias para o agente atingir esse objetivo. Os vrus so os organismos mais simples que existem: os mais simples so compostos por uma molcula de cido nuclico envolta por uma camada protica. Quando esto fora de clulas vivas, os vrus so estruturas qumicas, desprovidas de qualquer atividade biolgica. No possuem metabolismo prprio, no so capazes de produzir autonomamente nem os componentes mnimos para a sua multiplicao. Por isso, necessitam utilizar as organelas e o metabolismo celular para replicar o seu genoma e produzir as protenas necessrias para a construo de novas partculas vricas. Esses agentes s adquirem atividade biolgica dentro de clulas vivas. Mesmo os vrus mais complexos e evoludos so dependentes de processos biolgicos celulares para a sua multiplicao. Por isso, os vrus so, tradicionalmente, classicados como parasitas intracelulares obrigatrios. O termo replicao que em sua origem signica a sntese de molculas de cidos nuclicos a partir de um molde tem sido universalmente utilizado para designar o processo de multiplicao dos vrus como um todo e assim ser utilizado neste texto. Este captulo abordar os aspectos gerais da replicao dos vrus; os aspectos peculiares de cada famlia sero abordados nos captulos especcos.

2 Conceitos bsicos: infeco, susceptibilidade e permissividade


A palavra infeco deriva do latim infere, que signica inserir, penetrar, introduzir. No entanto,

embora a penetrao (ou infeco, no signicado estrito da palavra) seja uma etapa indispensvel replicao viral, por permitir a introduo do material gentico na clula, o termo infeco possui um signicado mais amplo em Virologia. A penetrao do vrus na clula, por si s, no assegura a produo de prognie viral, pois outras etapas intracelulares so necessrias. Por isso, o termo infeco tem sido utilizado para denir o processo replicativo do agente como um todo, incluindo a penetrao e as etapas subseqentes da replicao. A srie de etapas que inicia com a penetrao e culmina com a liberao de prognie viral tambm denominada ciclo replicativo. Se todas as etapas da infeco forem completadas e resultarem na produo de prognie viral vivel, a infeco dita produtiva. Se, aps a penetrao, o ciclo replicativo for interrompido em alguma etapa, a infeco dita abortiva. Susceptibilidade e permissividade so propriedades complementares que denem a capacidade das clulas de suportar as etapas da replicao viral. Susceptibilidade refere-se capacidade das clulas de serem infectadas naturalmente pelo vrus, enquanto permissividade refere-se s condies intracelulares para a ocorrncia da multiplicao viral. Assim, as clulas que suportam o ciclo replicativo completo, aps a infeco natural, so simultaneamente susceptveis (permitem a penetrao) e permissivas (permitem a ocorrncia das etapas intracelulares). Essas duas propriedades, no entanto, nem sempre ocorrem concomitantemente em uma clula. Em algumas situaes, clulas permissivas podem ser no susceptveis infeco, devido falta de receptores para a adsoro e penetrao do vrus. Essas clulas somente podero ser alvo de uma replicao produtiva se o material gentico viral for introduzido articialmente (i.e., por transfeco). Por outro lado, clulas susceptveis infeco natural podem apresentar um bloqueio intracelular em alguma etapa da replicao, sendo denominadas no-permissivas. Se esse bloqueio ocorrer aps algumas etapas do ciclo, essas clulas so ditas semipermissivas. Para simplicar, neste texto, o termo susceptibilidade ser utilizado para denir a capacidade das clulas de suportar todas as etapas da replicao viral aps a infeco natural.

110

Captulo 5

A susceptibilidade determinada pela interao de mltiplos fatores virais e celulares. Em razo da complexidade dessas interaes, as espcies animais (e tambm as clulas de cultivo) apresentam uma ampla variao de susceptibilidade a diferentes vrus. O termo espectro de hospedeiros (host range) utilizado para denir o conjunto de espcies animais (host range in vivo) ou de diferentes clulas (host range in vitro) que podem ser infectados naturalmente por um determinado vrus. O termo tropismo refere-se predileo do vrus por determinadas clulas, tecidos ou rgos do hospedeiro para se multiplicar. O principal fator celular mas no o nico determinante da susceptibilidade e do tropismo a presena de molculas especcas na superfcie celular, denominadas genericamente de receptores virais. Os receptores virais so molculas da membrana plasmtica que desempenham funes diversas na biologia das clulas, das quais os vrus se utilizam para se ligar e iniciar a infeco.

las e iniciam a infeco. A coleta e quanticao do vrus presente no sobrenadante dos cultivos a diferentes intervalos, aps a inoculao, permite a identicao de trs fases: eclipse, maturao e inativao (Figura 5.2).

9 1

Citoplasma 4

7 6

Ncleo

3 Etapas da replicao
A multiplicao dos diferentes vrus apresenta vrias etapas em comum, apesar da diversidade estrutural, do tipo e da organizao genmica e das diferentes estratgias de replicao. Essas etapas ocorrem de forma ordenada e seqencial e envolvem interaes complexas entre as protenas e o genoma viral com organelas e macromolculas celulares. O ciclo replicativo de todos os vrus inclui necessariamente as etapas de adsoro, penetrao, desnudamento, expresso gnica (transcrio e traduo), replicao do genoma, morfognese/maturao e egresso. Essas etapas esto ilustradas esquematicamente na Figura 5.1. A maior parte dos conhecimentos sobre os mecanismos biolgicos e moleculares da multiplicao dos vrus somente foi obtida a partir do estabelecimento dos cultivos celulares. Aps a inoculao do vrus em clulas cultivadas in vitro, os cultivos so deixados em repouso para que as partculas vricas iniciem gradativamente a entrar em contato com a superfcie celular. Essa etapa denominada adsoro. Imediatamente aps a adsoro, os vrions penetram nas clu-

Figura 5.1. Representao esquemtica do ciclo replicativo de um vrus DNA. 1) Adsoro; 2) Penetrao; 3) Desnudamento; 4) Transcrio dos genes virais; 5) Traduo dos RNA mensageiros (mRNA) e produo das protenas virais; 6) Replicao do genoma; 7) Morfognese; 8-9) Egresso.

Aps a remoo do material que foi inoculado e durante um perodo varivel, apenas uma pequena quantidade de infectividade pode ser detectada no sobrenadante. Esse perodo em que o vrus virtualmente desaparece denominado eclipse e coincide com as fases iniciais da infeco. A durao da fase de eclipse depende do ciclo replicativo de cada vrus, que varia entre quatro a seis horas nos picornavrus e mais de 40 horas em alguns herpesvrus. A fase de eclipse seguida por um perodo em que a prognie viral vai sendo produzida e gradativamente liberada pelas clulas, acumulando-se no sobrenadante (Figura 5.2). Essa fase denominada maturao. Nos vrus que produzem lise celular, a quantidade de vrus no sobrenadante aumenta at atingir um plat, que coincide com a perda da integridade funcional e estrutural das clulas. A partir da, o ttulo viral no sobrenadante tende a decrescer gradativamente dependendo do vrus devido ina-

Replicao viral

111

tivao da infectividade das partculas vricas e perda da viabilidade das clulas. Essa fase denominada inativao. Em infeces por vrus nolticos, as clulas podem produzir prognie viral indenidamente, mas o balano entre a produo e a inativao no permite que o ttulo viral no sobrenadante aumente indenidamente.

Eclipse

Maturao

Inativao

Inoculao

Horas

Figura 5.2. Fases da infeco por vrus lticos em cultivo celular: eclipse, maturao e inativao.

3.1 Adsoro
A primeira etapa da replicao a ligao especca das partculas vricas na superfcie das clulas hospedeiras evento denominado adsoro . Essa ligao mediada por protenas da superfcie dos vrions (viral attachment proteins, VAPs) que interagem com os receptores na superfcie das clulas. Nos vrus sem envelope, a funo de ligao exercida pelas protenas do capsdeo; nos vrus envelopados, pelas glicoprotenas do envelope. Os receptores celulares para os vrus so geralmente protenas (glicoprotenas) ou carboidratos (presentes em glicoprotenas ou em glicolipdios da membrana). Em comparao com os receptores proticos, os carboidratos so menos especcos, pois podem estar presentes em uma variedade de molculas de membrana. Alguns vrus so estritamente dependentes de um receptor especco (exemplos: rinovrus, poliov-

rus, vrus da febre aftosa [FMDV]) enquanto outros podem utilizar receptores alternativos para iniciar a infeco (exemplo: herpesvrus, alguns togavrus). A capacidade de utilizar mais de um receptor para iniciar a infeco pode representar uma vantagem evolutiva, pois oferece a esses vrus a possibilidade de infectar diferentes tipos de clulas e/ou hospedeiros. Os receptores celulares para vrus so molculas de membrana que desempenham funes diversas na biologia celular e que, ocasionalmente, servem para os vrus se ligarem e iniciarem a infeco. Os receptores celulares para vrios vrus animais j foram identicados (Tabela 5.1). Na maioria dos casos, a presena dos receptores determina o espectro de hospedeiros e o tropismo do vrus. Conseqentemente, a presena e distribuio dos receptores tambm so determinantes fundamentais da patogenia da infeco. O nmero de receptores na superfcie de uma clula parece ser extremamente varivel. Essas molculas podem ser raras e especcas de algumas clulas ou abundantes e amplamente distribudas em vrias clulas. Em alguns casos, as interaes entre as VAPs e os receptores no so sucientes para permitir o incio da infeco. Nesses casos, a interao dos vrions com protenas adicionais da membrana celular, denominadas co-receptores, necessria para que ocorra a penetrao. Por exemplo, a interao inicial dos adenovrus com a clula hospedeira envolve a ligao da protena ber com um receptor celular. Essa interao no suciente para assegurar a penetrao, mas necessria para que a protena viral penton interaja com uma segunda molcula da membrana celular a vitronectina e resulte em penetrao. O vrus da imunodecincia humana (HIV-1) liga-se ao receptor CD4 e utiliza como co-receptor um receptor de citocina. A interao inicial do vrus do herpes simplex humano (HSV-1) com as clulas mediada pela interao da glicoprotena gC (ou gB) com o sulfato de heparina na superfcie celular. A fuso e penetrao, no entanto, dependem de interaes secundrias entre a gD (e tambm a gH) com outras molculas da membrana.

Ttulo viral no sobrenadante

112

Captulo 5

Tabela 5.1. Receptores celulares e mecanismos de penetrao dos principais vrus animais .
Famlia Vrus Receptor Viral
Sulfato de heparina/receptor homlogo ao fator de necrose tumoral (TNF) e fator de crescimentonNeuronal (NGF)

Forma/local de Penetrao
Fuso na membrana plasmtica

Herpesviridae

Herpes simplex

Pseudoraiva

Sulfato de heparan (HS), proteoglicanos (HSPG) e coreceptores


Receptor para adenovrus e vrus Coxsackie B (CAR)

Fuso na membrana plasmtica

Adenoviridae

Adenovrus 2

Endocitose dependente de clatrina


Membrana plasmtica e/ou macropinossomo

Vrus DNA

Poxviridae

Vaccinia

Fator de crescimento epidermal (EGF)

Polyomaviridae

SV-40

Molculas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) classe I


Integrina a-6 e molculas semelhantes ao heparan

Endocitose caveolar e/ou retculo endoplasmtico

Papillomaviridae

Papilomavrus bovino
Parvovrus canino

Endocitose dependente de clatrina


Endossomos

Parvoviridae

Receptor da transferrina

Asfarviridae

Peste suna africana


Vrus elevador da desidrogenase lctica Vrus da Hepatite dos Murinos Coronavrus humano 229E

nd

Endossomos

Arteriviridae

Molculas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) classe II

Endossomos

Coronaviridae

Glicoprotena biliar dos murinos/ antgeno carcinoembriognico CD13 (Aminopeptidase) cido silico CD46 Molculas do MHC classe II CD46 bovino Receptor da neurotropina (p75NTR) Receptor folato a(FR-a) CD4 e receptor de citocinas Integrinas (b3) Integrinas (av) nd cido silico e molcula 1 de adeso jjuncional (JAM 1) Integrinas aVb3 e protenas cognatas do choque trmico (hscp70)

Endossomos

Membrana plasmtica Endocitose dependente de clatrina Membrana plasmtica Endocitose dependente de clatrina

Orthomyxoviridae Paramyxoviridae Togaviridae

Vrus da influenza Vrus do sarampo Semliki Forest Vrus da diarria viral bovina Vrus da raiva Vrus Ebola e Marburg HIV-1 Vrus Hantaan Vrus da febre aftosa nd Reovrus

Vrus RNA

Flaviviridae Rhabdoviridae Filoviridae Retroviridae Bunyaviridae Picornaviridae Caliciviridae Reoviridae

Endossomos Endocitose dependente de clatrina Caveola Membrana plasmtica Endocitose dependente de clatrina Endocitose Endossomos Endossomos

Rotavrus

Membrana citoplasmtica (lipid rafts)

* Adaptado de Klasse et al. (1998); de Pelkmans e Helenius (2003) e referncias selecionadas. CAR: receptor de virus b coxsackie B e adenovirus. no determinado.

Replicao viral

113

Em cultivo celular e provavelmente tambm in vivo o contato de um vrion com uma clula um evento que ocorre ao acaso. Ou seja, a clula hospedeira no atrai a partcula vrica a distncia. Uma vez em contato com a superfcie da clula, componentes externos dos vrions interagem quimicamente (interaes eletrostticas, pontes de hidrognio etc.) com molculas da membrana plasmtica, podendo resultar ou no em penetrao e incio da infeco. O processo de adsoro independente de energia e do metabolismo celular e ocorre com a mesma ecincia temperatura corporal ou a 4C. Embora seja de alta especicidade, a interao de uma molcula de VAP com o receptor de fraca intensidade e, isoladamente, no seria suciente para proporcionar a ocorrncia das etapas seguintes da penetrao. Para isso, necessria a ocorrncia simultnea de dezenas ou centenas dessas interaes. Ou seja, a adsoro viral na superfcie celular um processo cooperativo, resultante de mltiplas interaes entre protenas da superfcie dos vrions com os seus respectivos receptores. Embora a adsoro dos vrions superfcie celular seja a etapa inicial e indispensvel para o incio da replicao, esse evento nem sempre resulta em infeco produtiva. provvel que um nmero muito grande de interaes entre vrions e clulas no resulte em penetrao, seja pela ausncia de receptores especcos para o vrus, seja pela debilidade dessas interaes. Partculas vricas podem se ligar superfcie da clula e no serem internalizadas. Outro cenrio possvel a ligao, porm com internalizao e liberao do nucleocapsdeo em compartimentos inadequados para a replicao (p. ex.: lisossomos). possvel tambm que vrions sejam internalizados em clulas que no possuam os componentes necessrios continuao do ciclo. Resumindo, a ligao dos vrions a molculas da membrana celular uma etapa absolutamente necessria, porm nem sempre suciente para garantir a continuidade do ciclo replicativo. Alm de proporcionar o contato inicial com a clula, as interaes dos vrions com os receptores tambm podem desencadear alteraes es-

truturais nas protenas de superfcie dos vrions. Para alguns vrus (p. ex.: poliovrus), essas alteraes so absolutamente necessrias para a penetrao, desnudamento e continuao do ciclo. Por isso, alm de servir para a ligao inicial, os receptores, para alguns vrus, podem ser necessrios para a desestabilizao das partculas vricas e conseqente liberao do genoma no interior da clula. Nos vrus envelopados, a ligao ao receptor pode induzir alteraes conformacionais nas VAPs, que promovem a fuso do envelope com a membrana celular. No caso do HIV-1, a ligao do vrion ao receptor CD4 necessria para estimular a capacidade fusognica da glicoprotena TM. Em alguns casos, a ligao dos vrions aos receptores tambm pode induzir sinais qumicos intracelulares, que podem estar envolvidos na facilitao da endocitose, no transporte intracelular dos nucleocapsdeos e at mesmo na sobrevivncia da clula. Por outro lado, a penetrao e a posterior replicao viral ativam mecanismos imunolgicos de defesa, como a produo de interferon do tipo I (IFN-I). A distribuio dos receptores na superfcie apical das clulas parece ser aproximadamente uniforme. A penetrao dos vrions, no entanto, parece ocorrer preferencialmente em alguns locais. Isso ocorre porque a ligao das partculas vricas aos receptores acompanhada de movimentos laterais dessas molculas, resultando na aglomerao dos receptores em determinados locais. Esses locais so facilmente observveis sob microscopia eletrnica (ME) e aparecem como espessamentos da membrana plasmtica. Esses espessamentos so decorrentes do acmulo de uma protena denominada clatrina, envolvida em sistemas de transporte intracelular por vesculas. A aglomerao dos vrus que penetram por endocitose mediada por receptores, em determinados locais, precede e promove a invaginao da membrana, com a conseqente formao da vescula endoctica contendo os vrions em seu interior. A endocitose mediada por receptores um processo siolgico utilizado pelas clulas para internalizar diversas molculas, das quais os vrus tiram proveito para iniciar a infeco.

114

Captulo 5

3.2 Penetrao
A penetrao a etapa subseqente adsoro e envolve a transposio da membrana plasmtica, permitindo a introduo do nucleocapsdeo (genoma viral + protenas) no interior da clula, local onde ocorrero a expresso gnica e a replicao do genoma. A transposio da membrana pode ocorrer na superfcie celular ou j no interior do citoplasma, a partir de vesculas produzidas por endocitose, fagocitose ou macropinocitose. Dependendo da biologia do vrus, a penetrao pode ocorrer sem prvia internalizao (se ocorrer na superfcie celular) ou aps internalizao (se ocorrer a partir de vesculas intracitoplasmticas). No entanto, a internalizao de vrions em vesculas endocticas no assegura a ocorrncia de penetrao. A internalizao em vesculas ou a penetrao direta so processos que ocorrem imediatamente aps a ligao dos vrions aos receptores da membrana plasmtica. Ao contrrio da adsoro, a internalizao e penetrao so processos dependentes de energia e no ocorrem ecientemente a 4C. Uma forma de sincronizar o incio da infeco viral in vitro realizar adsoro a 4C durante uma hora (ocorre adsoro sem penetrao) e, a seguir, transferir o cultivo para 37C, quando ocorrer a penetrao simultnea das partculas vricas adsorvidas. As etapas iniciais da infeco viral tm sido estudadas com o recurso da ME e com a utilizao de qumicos que inibam a internalizao e/ ou a acidicao de vesculas intracelulares (i.e., endossomos). Dessa forma, quando a infeco por um vrus prevenida por substncias inibidoras da endocitose, deduz-se que a sua penetrao dependa de prvia internalizao; quando a infeco inibida por agentes que previnam a acidicao dos endossomos, conclui-se que o pH cido dessas organelas seja necessrio para a penetrao. Em geral, os vrus penetram nas clulas utilizando um (ou alternativamente mais de um) dos seguintes mecanismos: a) penetrao por fuso na superfcie celular; b) penetrao aps endocitose (mediada por clatrina, caveolina ou agrupamentos de lipdios); c) fagocitose. Esses mecanismos esto ilustrados na Figura 5.3.

3.2.1 Penetrao por fuso na superfcie celular


Alguns vrus com envelope (p. ex.: retrovrus, paramixovrus e herpesvrus) penetram na clula aps fuso do envelope com a membrana plasmtica, evento que ocorre na superfcie celular (Figura 5.3A). A fuso resulta em um canal entre o interior da partcula e o compartimento citoplasmtico, atravs do qual o nucleocapsdeo penetra no citoplasma. A fuso entre as membranas do envelope e a plasmtica requer a ao de protenas de fuso presentes no envelope dos vrions (p. ex.: glicoprotena TM nos retrovrus e F nos paramixovrus). Nesses vrus, o mecanismo de fuso ocorre sob pH neutro, ou seja, independe de acidicao, e, por isso, esses vrus so denominados pH-independentes. A membrana plasmtica no a nica barreira que o nucleocapsdeo viral deve ultrapassar para ter acesso aos locais intracelulares apropriados para a replicao. Algumas clulas possuem um citoesqueleto cortical espesso logo abaixo da membrana plasmtica, o que impede o acesso de ribossomos e outras organelas rea imediatamente adjacente membrana. Essas estruturas tambm dicultam a progresso dos nucleocapsdeos at as regies mais internas da clula. No obstante, os vrus que penetram por fuso na superfcie celular desenvolveram estratgias para superar esses obstculos e conseguir liberar os seus nucleocapsdeos nos locais adequados.

3.2.2 Penetrao aps endocitose


Esse mecanismo caracterstico da penetrao de vrios vrus envelopados (p. ex.: avivrus e ortomixovrus) e de alguns vrus sem envelope (p. ex.: adenovrus, picornavrus e reovrus). A via endoctica parece ser o caminho mais adequado para a internalizao dos vrus, pelos seguintes aspectos: a) a endocitose um processo siolgico comum maioria das clulas; b) somente ocorre em clulas com transporte de membrana ativo, evitando a penetrao em eritrcitos e plaquetas, onde a infeco seria improdutiva; c) os vrions podem se ligar em qualquer local da superfcie celular para serem internalizados; d) a endocito-

Replicao viral

115

se assegura a internalizao e o transporte dos vrions aos locais de expresso gnica e replicao; e) a penetrao a partir dos endossomos reduz os riscos de deteco pelo sistema imunolgico, pois no deixa protenas virais expostas na superfcie celular; e f) o ambiente endossomal se acidica gradativamente, o que auxilia na ativao dos mecanismos de fuso e penetrao.

3.2.2.1 Endocitose mediada por clatrina


Os endossomos recobertos por clatrina so vesculas de aproximadamente 100 nm de dimetro e se formam pela invaginao de pequenas regies da membrana plasmtica revestidas internamente por molculas de clatrina (clatrin-coated pits). Quando examinadas sob ME, essas regies

Microtbulos

H+

H+ H+

H+

H+

H+

Retculo endo

plasmtico

Ncleo

? ?
E

Meio extracelular

Citoplasma

Figura 5.3. Principais mecanismos de penetrao dos vrus nas clulas hospedeiras. A) Penetrao na superfcie celular, por fuso com a membrana plasmtica; B) Penetrao por fuso aps endocitose mediada por clatrina; C) Penetrao por fuso aps endocitose mediada por caveolina; D-E) Penetrao aps endocitose mediada por agrupamentos de lipdios.

116

Captulo 5

aparecem como espessamentos da membrana, adjacentes aos locais de ligao dos vrions. Aps a invaginao, o revestimento de clatrina removido e as vesculas trafegam em direo ao interior da clula. Nesse trajeto, o ambiente endossomal gradativamente acidicado por meio de ATPases associadas membrana, que bombeiam prtons H+ para o seu interior. Nos endossomos tardios e lisossomos, o pH pode atingir 5,0 a 5,5. Dessa forma, os vrions internalizados por essa via so submetidos reduo gradativa do pH. Essa forma de penetrao a mais estudada e, provavelmente, a mais importante entre os vrus animais, sendo tratada com mais detalhes a seguir (Figura 5.3B). Ao contrrio da fuso e penetrao dos vrus pH independentes, a fuso do envelope de muitos vrus com a membrana celular s ocorre sob pH baixo (5,5-6,5). Esses vrus so denominados pH-dependentes e no conseguem fusionar e penetrar na superfcie celular sob pH neutro. A acidicao progressiva dos endossomos proporciona condies para a fuso do envelope com a membrana endossomal, resultando na liberao do nucleocapsdeo no citoplasma. Embora vrios vrus penetrem dessa forma, esse um mecanismo particularmente bem caracterizado nos vrus da inuenza. A protena de fuso desses vrus (hemaglutinina, HA) tambm a protena responsvel pela ligao aos receptores (cido silico). Aps a ligao nos receptores, os vrions so internalizados por endocitose. A acidicao dos endossomos induz alteraes conformacionais na HA que resultam na fuso do envelope com a membrana do endossomo. O pH baixo nos endossomos tambm facilita a dissociao dos nucleocapsdeos do restante do envelope, resultando na sua liberao no citoplasma. Nos vrus pH-dependentes, a penetrao deve ocorrer no momento apropriado, pois a acidicao excessiva que ocorre aps a fuso dos endossomos com os lisossomos pode inativar o vrus. Drogas que inibem a endocitose (xido de fenilarsina) ou impedem a acidicao dos endossomos (monensina, cloroquina e cloreto de amnia) previnem a penetrao de vrus pH-dependentes. Os vrus sem envelope transpem a membrana pela formao de canais proteinceos na

membrana endossomal (picornavrus) ou por lise/perturbao da integridade dessa membrana (adenovrus e reovrus). A acidicao progressiva dos endossomos e as interaes com a membrana provocam alteraes estruturais e desorganizao do capsdeo, podendo ocorrer a dissociao de algumas protenas. Nos picornavrus, o rearranjamento das protenas do capsdeo induzido pelo pH baixo, leva formao de aberturas atravs das quais o genoma translocado para o interior do citoplasma. As partculas vricas do reovrus, internalizados por endocitose, sofrem alteraes estruturais e algumas protenas do capsdeo so ativadas, tornando-se capazes de lisar ou permeabilizar a membrana do endossomo. Dessa forma, permitem a penetrao dos capsdeos semidesintegrados. Nos adenovrus, o capsdeo sofre alteraes estruturais pela exposio ao pH progressivamente baixo, resultando na desorganizao da partcula e na ativao das protenas bra e penton. Essas protenas participam da lise ou da permeabilizao da membrana endossomal, permitindo a penetrao do complexo nucleoprotena no compartimento intracelular.

3.2.2.2 Endocitose mediada por caveolina


As caveolas so pequenas invaginaes em forma de cantil, que so formadas na membrana plasmtica de diversos tipos de clulas. As caveolas podem ser internalizadas com auxlio da actina e, at o presente momento, no h evidncias de que o seu contedo seja entregue via endoctica, ou seja, constituem um mecanismo independente de internalizao. As caveolas internalizadas so transportadas at a regio perinuclear, prximaao retculo endoplasmtico (RE). Recentemente, evidenciou-se que o vrus smio 40 (SV-40) utiliza essa via para a internalizao e penetrao (Figura 5.3C). Aps a ligao aos receptores, os vrions se deslocam lateralmente na superfcie celular at serem capturados por caveolas. As caveolas so, ento, circundadas parcialmente por bras de actina, conferindo vescula uma aparncia de cantil. Posteriormente, a vescula caveolar, contendo os vrions, entregue aos caveossomos,

Replicao viral

117

que so organelas de pH neutro preexistentes no citoplasma, ricas em caveolina e colesterol. Aps algumas horas da infeco, os caveossomos liberam tbulos membranosos repletos de vrions, que trafegam ao longo dos microtbulos at o RE. Posteriormente, as partculas virais deixam essa organela, entram no citosol e penetram no ncleo atravs dos poros nucleares. Essa via de penetrao parece no ser exclusiva do SV-40. Estudos recentes com o vrus ebola (lovrus), poliomavrus e echovrus (picornavrus) tm sugerido um mecanismo semelhante de penetrao.

acidicados, potencializando a capacidade de fuso e penetrao dos vrions pH-dependentes.

3.3.3.2 Macropinocitose
A macropinocitose um processo celular no especco (pode ocorrer na ausncia de ligantes aos receptores) de internalizao de volumes grandes de uidos e de regies de membrana. Substncias internalizadas por essa via tambm so direcionadas aos endossomos e lisossomos. O vrus da vaccinia (poxvrus) pode penetrar por essa via, uma vez que os seus vrions so muito grandes para serem internalizados por endocitose mediada por clatrina. O vrus HIV tambm parece utilizar essa via para infectar macrfagos.

3.2.2.3 Endocitose mediada por agrupamento de lipdeos


Esngolipdeos e/ou glicoesngolipdeos e molculas de colesterol podem se associar lateralmente e formar microdomnios na membrana celular, denominados de lipid rafts (o termo raft denota as toras de madeira utilizadas na construo de jangadas). Esses microdomnios contm protenas especcas e participam de funes celulares, como o transporte de membrana, morfognese e sinalizao celular. A internalizao dessas estruturas independente do revestimento por clatrina e caveolina. Os vrions internalizados por essa via so direcionados aos endossomos, a partir dos quais ocorre penetrao no compartimento citoplasmtico. Essa via de penetrao tem sido sugerida para o SV-40, em clulas que no contm caveolina, e tambm para alguns picornavrus, papilomavrus e retrovrus (Figuras 5.3D e 5.3E).

3.2.3.3 Translocao atravs da membrana plasmtica


Esse um mecanismo pouco conhecido, provavelmente raro entre os vrus animais e parece ocorrer somente com os vrus sem envelope.

3.2.3.4 Transferncia direta entre clulas


Alm dos mecanismos especcos de penetrao, alguns vrus podem ser transmitidos diretamente entre clulas, sem a necessidade de egresso e infeco de uma nova clula. Essa transmisso possvel pela insero de protenas virais na membrana lateral da clula. As protenas virais produzem fuso entre as clulas vizinhas e transferncia do material gentico do vrus para a nova clula. Esse mecanismo de transferncia direta (observada nos paramixovrus e poxvrus, entre outros) permite ao vrus infectar novas clulas sem se expor ao sistema imunolgico. Como j mencionado, a simples internalizao da partcula vrica no assegura que a replicao ir ocorrer. O desnudamento e a entrega do material gentico aos locais apropriados so necessrios para o prosseguimento do ciclo. Alm disso, a clula deve apresentar as condies intracelulares necessrias para a expresso gnica e replicao do genoma. Sob ME, freqente a

3.2.3. Outros mecanismos de penetrao 3.3.3.1 Fagocitose


O papel da fagocitose na penetrao dos vrus nas clulas hospedeiras ainda no est esclarecido. No entanto, partculas do vrus da inuenza j foram observadas em vesculas fagocticas, e os poxvrus possivelmente utilizam essa via para a internalizao e posterior penetrao celular. Aps a sua formao, os fagossomos se fusionam com os endossomos e lisossomos e so

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Captulo 5

visualizao de vrions internalizados em clulas, porm localizados em stios inapropriados para o prosseguimento da replicao. Alguns desses vrions podem ser eventualmente reciclados e liberados na superfcie celular, podendo infectar produtivamente outras clulas. A maioria, porm, parece estar destinada inativao por processos catablicos celulares.

3.3 Etapas aps a penetrao 3.3.1 Desnudamento


O termo desnudamento (do ingls uncoating) refere-se serie de eventos que ocorrem imediatamente aps a penetrao, em que os componentes do nucleocapsdeo so parcial ou totalmente removidos, resultando na exposio parcial ou completa do genoma viral. A remoo das protenas do nucleocapsdeo necessria para a exposio do genoma s enzimas e fatores responsveis pela transcrio (vrus DNA e RNA de cadeia negativa) ou traduo (vrus RNA de cadeia positiva). No ciclo replicativo de alguns vrus, a replicao do genoma ocorre aps o desnudamento completo do genoma (poliovrus e avivrus). Em outros vrus, a remoo parcial das protenas do nucleocapsdeo j suciente para a ocorrncia das etapas seguintes do ciclo (paramixovrus, rabdovrus, ortomixovrus e reovrus). Portanto, o desnudamento parece ter uma denio mais funcional do que estrutural. A estrutura e complexidade de cada nucleocapsdeo que determina os passos subseqentes na replicao. O produto do desnudamento depende da estrutura do nucleocapsdeo. Nos picornavrus, o resultado a liberao do RNA genmico totalmente desnudo, com uma protena de 23 aminocidos (VPg) ligada covalentemente sua extremidade 5. Em alguns vrus (paramixovrus, rabdovrus, arenavrus e ortomixovrus), o genoma nunca totalmente desnudo. Os processos de transcrio e replicao ocorrem com o genoma recoberto por protenas (ribonucleoprotena). Nos reovrus e poxvrus, a transcrio e a replicao do genoma ocorrem no interior de capsdeos parcialmente desintegrados.

Nos vrus que penetram por fuso com a membrana plasmtica, a remoo do envelope, que ocorre pela fuso faz parte do desnudamento. Em alguns vrus RNA de cadeia positiva (togavrus), a remoo das protenas do nucleocapsdeo ocorre logo aps a penetrao, pela sua interao com o RNA dos ribossomos. Nos vrus pH dependentes, a acidicao dos endossomos desencadeia a fuso e tambm pode facilitar a dissociao das protenas do genoma. Isso resulta na liberao do nucleocapsdeo ou do genoma desprovido de protenas diretamente no citoplasma. Nos herpesvrus, adenovrus e papovavrus, o capsdeo permanece parcialmente ntegro aps a penetrao, sendo transportado at as proximidades do ncleo associado aos tbulos do citoesqueleto. O desnudamento e a penetrao do nucleocapsdeo no ncleo ocorre prximo aos poros nucleares. Nos picornavrus, a acidicao dos endossomos provoca alteraes conformacionais no capsdeo que proporcionam interaes de suas protenas com a membrana, resultando na formao de aberturas atravs das quais o genoma liberado no citoplasma. O desnudamento torna o genoma acessvel s enzimas e a outros fatores celulares responsveis pelas etapas subseqentes da replicao. Dependendo do tipo de genoma, as etapas que se seguem ao desnudamento diferem entre os vrus.

3.3.2 Movimentao intracelular


Aps a penetrao, o genoma viral precisa ser transportado at o local onde ocorrero a expresso gnica e a replicao. A movimentao dos vrions no citoplasma ocorre inicialmente de forma passiva, no interior de vesculas endocticas. Aps a penetrao, os nucleocapsdeos podem interagir com os componentes do citoesqueleto ou com protenas transportadoras. Os paramixovrus (que penetram na clula por fuso direta do envelope com a membrana celular) e os picornavrus (que penetram atravs de poros na membrana endossomal) no necessitam de transporte intracelular antes de iniciar a sntese de protenas, pois os ribossomos podem estar

Replicao viral

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prximos ao local de penetrao. Outros vrus penetram na clula em vesculas endocticas, que se movimentam entre a densa cadeia de microlamentos e entregam a sua carga aos locais apropriados. Os herpesvrus e retrovrus penetram na clula por fuso do envelope com a membrana plasmtica, e o genoma viral deve ser transportado at o ncleo para a replicao. Para iniciar a transcrio reversa de seu material gentico, os retrovrus interagem com lamentos de actina, necessitam funes relacionadas miosina e dos microtbulos. O HSV ultrapassa o crtex celular (composto basicamente de actina) por mecanismos ainda desconhecidos, e os nucleocapsdeos so transportados at o ncleo associados com os microtbulos. Os adenovrus e parvovrus tambm so transportados por microtbulos at o ncleo da clula hospedeira.

DNA viral atravs do poro nuclear. O adenovrus tipo 2 transportado ao longo dos microtbulos at as proximidades do ncleo e liga-se a lamentos dos poros nucleares. Aps, com o auxlio das importinas, e pela ligao com histonas, ocorre a desmontagem do vrion e o DNA viral translocado para o interior do ncleo.

3.4 Expresso gnica


A sntese de protenas virais pela maquinaria celular o evento central da multiplicao dos vrus. O genoma viral codica diferentes protenas que devem desempenhar pelo menos trs funes bsicas: a) assegurar a replicao do genoma; b) subverter funes celulares em seu benefcio e c) empacotar os genomas recmreplicados em novas partculas vricas. Os vrus no possuem metabolismo prprio e so inteiramente dependentes da maquinaria celular para a produo de suas protenas. Ou seja, as informaes genticas contidas no genoma dos vrus so decodicadas em protenas virais pelo aparato de sntese protica da clula hospedeira. Para utilizar esse aparato para a produo de suas protenas, os vrus tiveram que evoluir de forma a satisfazer algumas restries impostas pelas clulas hospedeiras. O ponto-chave desse processo a sntese (ou apresentao) de mRNAs que sejam adequadamente reconhecidos e traduzidos pelos ribossomos. Dependendo da estrutura e organizao genmica, os vrus de diferentes famlias convergem para a produo de mRNA por diferentes vias (Figura 5.4). O aparato celular de transcrio (RNA polimerase II e fatores de transcrio) e de processamento dos transcritos se localiza no ncleo das clulas hospedeiras. A maioria dos vrus DNA replica no ncleo e, assim, pode utilizar esses mecanismos. Os genes desses vrus contm regies regulatrias (promotores, enhancers) que so reconhecidas pela RNA polimerase II (RNApolII) e pelos fatores de transcrio celulares. Os transcritos (mRNA) produzidos contm a estrutura cap, so poliadenilados e alguns so submetidos a splicing antes de serem exportados para o citoplasma. Embora sejam vrus DNA, os poxvrus e asfarvrus replicam no citoplasma e so independentes da maquinaria nuclear de sntese

3.3.3 Penetrao nuclear


O ncleo o local de replicao da maioria dos vrus DNA e tambm dos ortomixovrus. No entanto, a presena da membrana nuclear representa uma barreira adicional progresso dos vrions ou dos nucleocapsdeos, pois os poros nucleares permitem a passagem somente de partculas com at 39 nm de dimetro. Conseqentemente, o transporte dos nucleocapsdeos ou do genoma at o interior do ncleo depende de interaes especcas com componentes celulares. Vrions pequenos, como os parvovrus (18-24 nm) e os capsdeos do vrus da hepatite B (36 nm), podem ser transportados intactos (ou semi-ntegros), por meio de mecanismos citoplasmticos especializados (microtbulos, microlamentos e protenas motoras), e, posteriormente, translocados atravs dos poros nucleares por protenas especializadas. Os vrions ou capsdeos maiores necessitam ser previamente desintegrados ou deformados para permitirem a introduo do genoma viral pelos poros nucleares. O nucleocapsdeo do HSV, por exemplo, transportado do crtex celular at o ncleo ao longo dos microtbulos e liga-se, na face citoplasmtica da membrana nuclear, por meio de uma molcula denominada de importina. Posteriormente ocorre uma abertura parcial de um dos vrtices do capsdeo e a liberao do

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Captulo 5

Vrus DNA
Poxviridae Adenoviridae Herpesviridae Polyomaviridae Papillomaviridae (Classe I) Circoviridae Parvoviridae (Classe II) Vrus que realizam transcrio reversa Hepadnaviridae (Classe VII) Retroviridae (Classe VI)

Vrus RNA
Reoviridae Birnaviridae (Classe III) Paramyxoviridae Orthomyxoviridae Arenaviridae Rabdoviridae Bunyaviridae Filoviridae (Classe V) Picornaviridae Flaviviridae Caliciviridae Astroviridae Coronaviridae Arteriviridae Togaviridae (Classe IV)

dsDNA

ssDNA

pdsDNA

ssRNA (+)

dsRNA (+ / -)

ssRNA (-)

ssRNA (+)

ssDNA

.dsDNA

.dsDNA

4
dsDNA

mRNA
Traduo

Protena

Fonte: adaptado de Baltimore (1971).

Figura 5.4. Estratgias de produo de RNA mensageiros (mRNA) e expresso gnica das diferentes classes de vrus. Nos vrus da classe I, os promotores virais so reconhecidos por fatores celulares, e os genes so transcritos pela RNApolII celular, resultando em mRNAs traduzveis pelos ribossomos (1). Nos vrus da classe II, o genoma DNA de fita simples linear (parvovrus) ou circular (circovrus) , inicialmente, convertido em fita dupla e transcrito pela RNApolII (2). Apenas as cadeias negativas dos vrus da classe III (genoma RNA de fita dupla) so transcritas pela polimerase viral, originando os mRNA (5). O genoma dos vrus da classe IV (RNA fita simples de polaridade positiva) pode ser diretamente traduzido, em toda a sua extenso (flavivrus, picornavrus) ou parcialmente (outros) (7). Nestes, o restante dos mRNA so produzidos pela transcrio do RNA intermedirio pela polimerase viral. Nos vrus da classe V, o genoma RNA de polaridade negativa transcrito pela polimerase presente nos vrions (6). Nos hepadnavrus (classe VII), os mRNA so produzidos pela transcrio do DNA viral pela RNApolII e fatores celulares (3). Nos retrovrus (classe VI), os mRNA so produzidos pela transcrio do provrus DNA (uma cpia do RNA genmico) pela RNApolII e fatores celulares, aps a integrao do provrus ao genoma celular (4).

e processamento de DNA e RNA. Isso s possvel porque esses vrus trazem, nos vrions, as enzimas e fatores auxiliares para a transcrio e processamento dos seus mRNA. Os vrus RNA, com exceo dos retrovrus, no dependem da maquinaria celular de transcri-

o e convergem para a produo de mRNA por vias diferentes. Os retrovrus utilizam a maquinaria celular para a transcrio dos seus genes, aps a integrao de uma cpia DNA do genoma (provrus) nos cromossomos celulares. A transcrio resulta na produo de mRNA para a sntese

Replicao viral

121

protica e tambm de cpias de RNA genmico que sero encapsidadas. Os vrus RNA convergem para a apresentao de mRNA traduzveis de duas formas: a) o prprio genoma dos vrus RNA de sentido positivo serve de mRNA e parcial ou integralmente traduzido pelos ribossomos. Nos vrus cujo genoma parcialmente traduzido, os mRNAs, para a sntese das protenas estruturais, so produzidos pela transcrio do RNA de sentido antigenmico, que produzido pela replicao do genoma; b) os vrus RNA de sentido negativo trazem a sua prpria RNA polimerase nos vrions. Assim, no incio da infeco, essa enzima se encarrega de transcrever o genoma viral, produzindo os mRNA para a sntese protica. Nos vrus RNA de cadeia dupla, a RNA polimerase trazida nos vrions transcreve as cadeias genmicas negativas em mRNA. A maquinaria de sntese protica das clulas eucariotas (ribossomos e fatores auxiliares) se localiza no citoplasma; somente traduz mRNA monocistrnicos e que possuam a estrutura cap na extremidade 5. Os mRNA dos vrus DNA que replicam no ncleo so produzidos, processados e exportados para o citoplasma pela maquinaria da clula e, como tal, assemelham-se aos mRNA celulares. Os mRNA do vrus DNA que replicam no citoplasma (poxvrus, asfarvrus) so produzidos e modicados no prprio citoplasma por enzimas virais, tambm semelhana dos mRNA celulares. Para serem traduzidos diretamente, os genomas dos vrus RNA de sentido positivo possuem cap 5 (alguns avivrus, coronavrus, arterivrus e togavrus) ou uma estrutura secundria que permite o reconhecimento pelos ribossomos e o incio da traduo. Essa estrutura denominada IRES (internal ribosomal entry site) e est presente prxima extremidade 5 do genoma dos picornavrus e de alguns membros da famlia Flaviviridae (pestivrus). Nos vrus RNA de sentido negativo e RNA de cadeia dupla, a RNA polimerase viral produz mRNAs com cap e cauda poliA. A maquinaria de traduo das clulas eucariotas no capaz de traduzir mRNAs policistrnicos, ou seja, mRNAs que contenham mais de uma ORF. A traduo de ORFs internas no

mRNA exige o reconhecimento de seqncias especcas localizadas prximas ao cdon de iniciao, mecanismo ainda no identicado em eucariotas. Por isso, os vrus desenvolveram diferentes estratgias de codicao de suas protenas: produo de mRNA monocistrnicos (contendo uma ORF = um gene) ou produo de mRNA policistrnicos. Os mRNAs policistrnicos contm uma nica e longa ORF que codica uma longa poliprotena. medida que vai sendo traduzida, essa poliprotena clivada por proteases celulares e/ou virais, dando origem s protenas virais individuais. Do ponto de vista da traduo, os mRNA que contm uma nica ORF, que traduzida em poliprotena, comportam-se como mRNAs monocistrnicos, pois a traduo se inicia no primeiro cdon de iniciao e termina no cdon de terminao. As protenas individuais so geradas aps este processo, pela clivagem enzimtica. Alm de superar essas restries, os vrus tiveram que desenvolver estratgias que os permitam utilizar a maquinaria celular de traduo em seu benefcio. Isso porque os mRNA celulares esto presentes em muito maior quantidade e competem com grande vantagem em relao aos mRNA virais. Dentre as estratgias virais utilizadas pelos vrus para competir pelo aparato celular de traduo destacam-se: a) inibio da transcrio celular (vrus da estomatite vesicular, VSV); b) inibio do processamento e/ou maturao e exportao de mRNA celulares do ncleo (adenovrus, HIV); c) degradao de mRNA celulares no ncleo (ortomixovrus, HSV) ou no citoplasma (buniavrus); d) inibio seletiva da traduo de mRNA celulares (poliovrus, FMDV); e) facilitao do processamento, transporte e traduo de mRNA virais (HIV); g) alterao da especicidade de reconhecimento de mRNA para a traduo: a traduo de mRNA que possuem cap inibida e as clulas infectadas passam a traduzir mRNA virais, que so reconhecidos pelos ribossomos atravs da estrutura IRES (picornavrus).

3.5 Replicao do genoma


Dependendo do tipo e organizao genmica, os vrus podem utilizar diferentes estratgias

122

Captulo 5

para cumprir as etapas de expresso gnica e replicao do seu genoma. Baltimore (1971) props a classicao dos vrus em seis grupos, de acordo com o tipo de genoma, local e estratgia de replicao. Essa classicao foi posteriormente ampliada para contemplar novos vrus e estratgias identicadas, resultando em sete grupos ou classes (Tabela 5.2). A seguir sero abordados os principais aspectos da replicao de cada um desses grupos. Os detalhes da replicao dos vrus de cada famlia sero abordados nos captulos especcos.

3.5.1 Replicao dos vrus DNA


A replicao dos vrus DNA realizada pela ao orquestrada da maquinaria da clula hospedeira associada com fatores codicados pelo v-

rus. A contribuio dos fatores virais na replicao desses vrus, no entanto, varia muito entre as diferentes famlias. Em geral, os vrus DNA mais simples (circovrus, parvovrus e poliomavrus) utilizam extensivamente a maquinaria celular, pois os seus genomas codicam poucos produtos associados com funes replicativas. Por outro lado, os vrus DNA complexos (herpesvrus e poxvrus) codicam muitas enzimas e fatores envolvidos na replicao. Esses ltimos seriam, teoricamente, menos dependentes da maquinaria celular para a replicao de seus genomas e a conseqente produo da prognie viral. A replicao da maioria dos vrus DNA ocorre no ncleo da clula hospedeira. O genoma desses vrus contm regies regulatrias que so reconhecidas pela maquinaria celular de transcrio e, assim, podem utiliz-la para a produo

Tabela 5.2 Classificao dos vrus de acordo com o tipo de genoma, local de replicao e estratgia utilizada para produzir os mRNAs.
Classe Genoma Local de replicao Famlias Polyomaviridae Papillomaviridae Adenoviridae Herpesviridae Poxviridae Asfarviridae Parvoviridae Circoviridae Reoviridae Birnaviridae IVa.Traduo integral do genoma IV RNA de cadeia simples, sentido positivo Citoplasma IVb.Traduo parcial do genoma; mRNAs subgenmicos Astroviridae Caliciviridae Togaviridae Coronaviridae Arteriviridae Orthomyxoviridae Bornaviridae Bunyaviridae Arenaviridae Rabdoviridae Paramyxoviridae Filoviridae Retroviridae Hepadnaviridae Flaviviridae Picornaviridae

Ia. Ncleo I DNA de cadeia dupla Ib. Citoplasma DNA cadeia simples

II III

Ncleo Citoplasma

RNA de cadeia dupla

Va. Ncleo V RNA de cadeia simples, sentido negativo Vb. Citoplasma

VI

RNA de cadeia simples e intermedirio DNA DNA de cadeia parcialmente dupla e intermedirio RNA

Citoplasma/ncleo

VII

Ncleo/citoplasma

Fonte: adaptado de Baltimore (1971).

Replicao viral

123

dos mRNA necessrios sntese de suas protenas. Em diferentes graus, esses vrus tambm utilizam enzimas e fatores celulares para o metabolismo de nucleotdeos, para a sntese de DNA e replicao do genoma. Os poxvrus e asfarvrus se constituem em excees, pois trazem, nos vrions, as enzimas e fatores necessrios para a transcrio e modicao dos mRNA e codicam as enzimas e fatores requeridos para a replicao do genoma. Mesmo assim, so dependentes da maquinaria celular de sntese protica. A replicao desses vrus ocorre inteiramente no citoplasma. O mecanismo de replicao do genoma tambm apresenta diferenas entre as famlias, devido a peculiaridades de estrutura, topologia e organizao genmica. A replicao do genoma circular de ta dupla dos poliomavrus, por exemplo, realizada quase que exclusivamente por enzimas e fatores celulares. A sntese das novas cadeias utiliza um primer de RNA e ocorre de forma bidirecional e semidescontnua, a exemplo da replicao do DNA celular. A replicao dos genomas DNA de ta simples (circovrus e parvovrus) tambm envolve a participao predomi-

nante de fatores celulares e se inicia com a sntese da ta complementar. Nos parvovrus, a prpria extremidade 3 do genoma serve de primer para o incio da replicao. A replicao do genoma linear de ta dupla dos adenovrus se inicia com um primer de protena, ocorre de forma contnua e em duas etapas. Apenas uma das cadeias replicada em cada etapa. A replicao do genoma dos herpesvrus e poxvrus mais complexa e envolve a participao de vrios fatores codicados pelo genoma viral. Os herpesvrus parecem replicar o seu genoma por um mecanismo de crculo rolante, no qual a replicao inicia-se aps a circularizao do genoma e resulta na produo de multmeros, que so posteriormente clivados em unidades genmicas. A replicao do genoma dos hepadnavrus inclui uma etapa de transcrio reversa, na qual um RNA produzido a partir do DNA genmico convertido em DNA de ta simples e, posteriormente, em DNA de ta dupla. As etapas do ciclo replicativo dos diferentes grupos de vrus DNA esto ilustradas esquematicamente nas Figuras 5.5 a 5.8 (a forma de apresentao das etapas de replicao foi adaptada de ROIZMAN e PALESE, 1996).

Genoma dsDNA

3 Replicao

DNA Prognie

Transcrio genes iniciais

Transcrio genes tardios

Morfognese

mRNA

mRNA

Vrions

Egresso

Traduo

Traduo 6 Morfognese

Protenas iniciais (NS)

Protenas tardias (estruturais)

Figura 5.5. Ciclo replicativo dos vrus da classe Ia (Adenoviridae, Herpesviridae, Polyomaviridae e Papillomaviridae). Os genes iniciais so transcritos antes da replicao do genoma (1) e geralmente codificam protenas no-estruturais (NS) envolvidas nas etapas seguintes da replicao (2). Essas protenas, isoladamente ou em conjunto com fatores celulares, atuam na replicao do genoma (3). Os genes tardios so transcritos aps a replicao do genoma (4) e codificam protenas estruturais em sua maioria (5). As protenas estruturais so importadas para o ncleo, onde ocorre a morfognese (6).

124

Captulo 5

3.5.1.1 Vrus da classe Ia


Os genes desses vrus so transcritos pela maquinaria celular de transcrio, pois possuem as regies regulatrias (promotores, enhancers), que so reconhecidas pela RNApolII e pelos fatores de transcrio da clula hospedeira. Os genes so classicados em duas ou mais classes e so transcritos seqencialmente sob regulao temporal restrita. Os genes iniciais (immediate-early e early nos herpesvrus; early nas demais famlias) so transcritos logo aps a penetrao na clula e, geralmente, codicam protenas no-estruturais que possuem funes regulatrias sobre outros genes e tambm enzimas e fatores envolvidos na replicao do genoma. A replicao do genoma dos poliomavrus e papilomavrus realizada quase que exclusivamente por fatores e enzimas celulares; j os herpesvrus e adenovrus codicam vrias protenas com funes replicativas (DNA polimerase, protena de ligao no DNA, helicase e quinases de nucleotdeos). Os genes tardios so transcritos aps a replicao do genoma e codicam principalmente protenas estruturais e/ou protenas envolvidas na morfognese. Algumas protenas no-estruturais (NS), que so necessrias nos estgios iniciais do prximo ciclo

de infeco, tambm so produzidas nessa etapa e incorporadas na prognie viral (Figura 5.5).

3.5.1.2 Vrus da classe Ib


Os poxvrus e asfarvrus realizam o seu ciclo replicativo inteiramente no citoplasma. Para isso, trazem, nos vrions, as enzimas e fatores necessrios para a transcrio dos seus genes e processamento dos transcritos. O genoma desses vrus codica vrios produtos que atuam no metabolismo de nucleotdeos e na replicao do genoma (DNA polimerase, helicase, protena de ligao no DNA e quinase de timidina), que, portanto, realizada predominantemente por enzimas e fatores virais. A expresso gnica ocorre em trs etapas principais: inicial, intermediria e tardia. Os genes iniciais so os primeiros a ser expressos, e os seus produtos possuem funes diversas, incluindo a concluso do desnudamento, a replicao do genoma e ativao da transcrio dos genes intermedirios. As protenas intermedirias atuam principalmente na ativao da transcrio dos genes tardios, cujos produtos so predominantemente protenas estruturais e/ou que participam da morfognese da prognie viral (Figura 5.6). Esses vrus codicam vrios produ-

Genoma DNA (encapsidado)

DNA livre

4 Replicao 5

DNA prognie

Transcrio inicial

Transcrio 7

Transcrio

Morfognese

mRNA iniciais

mRNA intermedirios

mRNA tardios

Vrions

Egresso

Traduo

6 Traduo

Traduo 9 Morfognese

Protenas iniciais (NS)

Protenas intermedirias

Protenas tardias

Figura 5.6. Ciclo replicativo dos vrus da classe Ib (Poxviridae e Asfarviridae). Os genes iniciais so transcritos pela RNA polimerase viral ainda com o DNA parcialmente encapsidado, resultando nos mRNAs (1) que so traduzidos nas protenas iniciais (2). Essas protenas participam do desnudamento completo do genoma (3), na sua replicao (4) e na transcrio (5) dos genes que codificam as protenas intermedirias (6). Estas protenas esto envolvidas na transcrio dos genes tardios (7), que codificam principalmente protenas estruturais (8). Estas protenas participam da morfognese dos vrions, juntamente com o DNA recm-replicado (9).

Replicao viral

125

tos que interferem com a resposta do hospedeiro infeco, dicultando o reconhecimento das clulas infectadas pelo sistema imunolgico do hospedeiro.

Os parvovrus encapsidam predominantemente cpias de DNA de sentido negativo (aquelas que sero transcritas), mas algumas espcies podem encapsidar tambm cpias positivas e, ocasionalmente, uma mistura das duas (Figura 5.7).

3.5.1.3 Vrus da classe II 3.5.1.4 Vrus da classe VII


A replicao do genoma dos parvovrus e circovrus realizada predominantemente por enzimas e fatores da clula hospedeira. A primeira etapa da replicao a sntese da cadeia complementar de DNA. O DNA de ta dupla (linear nos parvovrus, circular nos circovrus) , ento, transcrito pela RNA polII celular, originando os mRNAs para a sntese de protenas virais. A replicao dos parvovrus est intimamente associada com a fase S do ciclo celular, demonstrando a dependncia de fatores celulares presentes nesta fase. O genoma dos parvovrus replicado de forma contnua, a partir de uma 3-OH localizada na extremidade do hairpin, formado pelo pareamento das regies complementares terminais. A sntese da nova cadeia seguida pelo deslocamento da cadeia original, originando concatmeros, que sero posteriormente clivados para originar os monmeros de extenso genmica. A replicao do genoma dos hepadnavrus envolve uma etapa de transcrio reversa e ocorre parte no ncleo e parte no citoplasma. No ncleo, o genoma de cadeia dupla parcial convertido em um crculo covalentemente fechado (ccc) por fatores celulares e virais e, subseqentemente, transcrito pela RNApolII celular. Alm dos mRNA para a produo das protenas virais, a transcrio produz RNAs com a extenso do genoma (pgRNA). Esses pgRNAs serviro de molde para a transcrio reversa, que realizada pela polimerase viral, e ocorre no interior de capsdeos pr-formados no citoplasma. A sntese da cadeia complementar de DNA inicia em seguida, mas interrompida por ocasio do egresso dos vrions. Com isso, as partculas vricas contm uma molcula de DNA de ta parcialmente dupla (Figura 5.8).

1 Genoma DNA (cadeia simples) DNA fita dupla DNA ss (-)

Transcrio 4

Morfognese 5

mRNA

DNA ss (+)

Vrions

Egresso

Traduo Morfognese 5

Protenas estruturais e No-estruturais (NS)

Figura 5.7. Ciclo replicativo dos vrus da classe II (Parvoviridae e Circoviridae). O genoma DNA de cadeia simples , inicialmente, convertido em DNA de cadeia dupla por polimerases e fatores auxiliares da clula hospedeira (1). Apenas uma das cadeias (DNA de sentido negativo) transcrita pela RNA polimerase II celular, originando os mRNAs (2), que so processados e exportados para o citoplasma, onde so traduzidos (3). A replicao do genoma depende da interao entre fatores celulares e virais e resulta na sntese de cpias de DNA de cadeia simples de sentido positivo (4) e negativo (5). As molculas de DNA recm-replicadas so ento includas nos vrions, atravs de interaes especficas com as protenas do capsdeo (6).

126

Captulo 5

Genoma DNA (Parcialmente ds) 1 A cadeia dupla completada Egresso 7

2 DNAccc Transcrio parcial mRNA

3
Traduo

Protenas estruturais e polimerase

8 Vrions DNApds

Sntese da cadeia complementar

4 Transcrio completa

PgRNA

5 Transcrio reversa

CDNA

Figura 5.8. Ciclo replicativo dos vrus da classe VII (Hepadnaviridae). O DNA genmico , inicialmente, convertido em uma molcula circular de cadeia dupla completa ccc (1). Essa molcula transcrita pela RNA pol II celular, originando inicialmente mRNAs (2), que so processados e exportados para o citoplasma, onde sero traduzidos em protenas estruturais e no-estruturais (3). RNAs com a extenso integral do genoma (pgRNA) so, ento, produzidos (4) e exportados para o citoplasma. A polimerase viral recm-produzida realiza a transcrio reversa do pgRNAs, resultando em cDNA (5), que convertido em DNA de cadeia dupla (6). Capsdeos contendo o DNA de cadeia parcialmente dupla podem voltar ao ncleo e reiniciar o ciclo (7) ou participar da morfognese das partculas vricas (8).

3.5.2 Replicao dos vrus RNA


A replicao dos vrus RNA enfrenta algumas diculdades adicionais, impostas por peculiaridades dos processos biossintticos das clulas hospedeiras. A replicao do genoma desses vrus envolve a sntese de molculas de RNA de sentido antigenmico, que servem de molde para a subseqente sntese de RNAs de sentido genmico. Essas reaes so realizadas por polimerases especcas, que produzem molculas de RNA a partir de moldes RNA (polimerases de RNA dependentes de RNA). No entanto, as clulas eucariotas no possuem tais enzimas e, por isso, no so capazes de replicar o genoma desses vrus. Assim, para replicar o genoma, os vrus RNA devem codicar as suas prprias enzimas replicativas. As polimerases de RNA virais, cuja funo produzir cpias do genoma, so denominadas genericamente transcriptases ou replicases. Os vrus RNA de polaridade positiva solucionaram esse problema pela prpria natureza do genoma: a enzima replicase codicada pelo genoma e produzida pela traduo direta do

genoma logo no incio da infeco. Uma vez produzida, essa enzima se encarrega de replicar o genoma, produzindo cpias de RNA de sentido antigenmico, que servem de molde para a sntese de mais cpias de sentido genmico. Por isso, o genoma desses vrus dito infeccioso, ou seja, a sua introduo por mtodos articiais em clulas permissivas (transfeco) resulta na ocorrncia de todas as etapas do ciclo replicativo e na produo de prognie viral. Por outro lado, o genoma dos vrus RNA de polaridade negativa no pode ser traduzido, pois possui o sentido complementar ao mRNA. Esses vrus solucionaram esse problema de forma diferente: trazem associado ao material gentico algumas molculas da polimerase de RNA (replicase). Uma vez no interior da clula, a replicase sintetiza cpias de RNA de sentido antigenmico que servem de mRNA para a sntese das protenas virais. Esses RNAs tambm servem de molde para a sntese de mais cpias de RNA de sentido genmico. O genoma dos vrus RNA de polaridade negativa no infeccioso, ou seja, a sua introduo (desprovido de protenas) em clulas permissivas no resulta na ocorrncia das etapas

Replicao viral

127

seguintes da replicao. Em resumo, a necessidade da polimerase de RNA para replicar o genoma foi suprida, de formas diferentes, tanto pelos vrus RNA de sentido positivo como pelos vrus RNA de sentido negativo. A replicao do genoma dos vrus RNA ocorre em duas etapas. A primeira etapa envolve a sntese de um RNA de sentido antigenmico, tambm denominado replicativo intermedirio (RI). Nos vrus RNA de polaridade positiva, o RI possui polaridade negativa; nos vrus RNA de polaridade negativa, o RI possui polaridade positiva. A segunda etapa envolve a sntese de RNA de sentido genmico, utilizando o RI como molde. Em alguns vrus RNA de sentido positivo (Classe IVb), o RI tambm serve de molde para a sntese de mRNAs. Embora essas duas etapas faam parte do processo replicativo, s vezes, recebem denominaes diferentes: a sntese de RNAs de polaridade positiva denominada transcrio; a sntese da cpia negativa de RNA denominada replicao. Essas duas etapas so realizadas pelas replicases virais, pois as clulas eucariotas no possuem enzimas e funes para replicar o RNA. Alm das replicases, esses vrus codicam outras protenas no-estruturais (NS) com funes diversas e que auxiliam, de algum modo, na replicao do genoma. Atividades de helicase, protease, ligao no RNA, ATPase, ribonuclease,
4 RNA anti-genmico (-) Replicao 3

entre outras, j foram identicadas entre as protenas NS dos vrus RNA. Como os vrus RNA independem da maquinaria nuclear para a sntese e modicao de cidos nuclicos, o seu ciclo replicativo pode ocorrer inteiramente no citoplasma. Os ortomixovrus constituem as excees, pois dependem de segmentos dos mRNA celulares para a produo e funcionalidade de seus mRNAs e, por isso, replicam no ncleo da clula hospedeira. Os retrovrus apresentam um mecanismo de replicao que difere dos demais vrus RNA. Embora possua polaridade positiva, o RNA genmico no traduzido pelos ribossomos, e sim convertido em uma molcula de DNA de ta dupla pela enzima transcriptase reversa (RT) presente nos vrions. Essa molcula de DNA, denominada provrus, integrada ao genoma da clula hospedeira e, posteriormente, transcrita pela RNApolII. A transcrio resulta em mRNAs para a sntese de protenas estruturais e da enzima RT, e em cpias do RNA genmico, que ento includo nas novas partculas vricas. As etapas do ciclo replicativo dos diferentes grupos de vrus RNA esto ilustradas esquematicamente nas Figuras 5.9 a 5.13 (a forma de apresentao das etapas de replicao foi adaptada de ROIZMAN E PALESE, 1996).

Genoma RNA (+)

7 1,6 Traduo

Morfognese

Poliprotena

Vrions

Egresso

Clivagem 7 Morfognese

Protenas no-estruturais Protenas estruturais

Figura 5.9. Ciclo replicativo dos vrus da classe IVa (Picornaviridae e Flaviviridae). A ORF nica do genoma traduzida em toda a sua extenso logo aps o desnudamento, resultando da produo de uma longa poliprotena (1). medida que vai sendo produzida, essa poliprotena vai sendo clivada por proteases celulares e/ou virais dando origem s protenas individuais, entre as quais a RNA polimerase viral (2). A RNA polimerase responsvel pela replicao do genoma, que ocorre via produo de um intermedirio RNA de sentido negativo (3, 4). As novas cpias de RNA de sentido positivo so, ento, utilizadas em novos ciclos de traduo (6), replicao (3,4) e/ou participam da morfognese da prognie viral (7).

128

Captulo 5

3.5.2.1 Vrus da classe IVa


O genoma desses vrus contm uma ORF nica e longa, anqueada por duas regies no traduzidas (5UTR; 3UTR). Os genes das protenas estruturais ocupam o tero 5 do genoma; o restante da ORF contm os genes das protenas no-estruturais (NS). Essa ORF traduzida em toda a sua extenso logo aps o desnudamento, originando uma poliprotena longa, que clivada em protenas individuais medida que vai sendo produzida (Figura 5.9). As protenas NS recm-produzidas incluindo a replicase viral realizam a replicao do genoma, que envolve a sntese de um RNA de sentido antigenmico (de polaridade negativa); que serve, ento, de molde para a sntese de cpias de RNA de sentido genmico. As regies 5UTR e 3UTR do genoma contm seqncias importantes para a transcrio e replicao. O genoma dos vrus do gnero Flavivirus possui a estrutura cap na extremidade 3; os demais membros da famlia Flaviviridae e os picornavrus possuem estruturas secundrias (internal ribosomal entry site, IRES) na regio 5UTR, que so reconhecidas pelos ribossomos para o incio da traduo.

3.5.2.2 Vrus da classe IVb


O genoma desses vrus constitudo por uma molcula de RNA de polaridade positiva,
6 Genoma RNA (+) Replicao 3 Traduo parcial 1 4

mas a organizao genmica e a estratgia de expresso gnica diferem do grupo anterior. Os genes que codicam as protenas NS ocupam os dois teros iniciais do genoma; o tero restante contm os genes das protenas estruturais. No incio da infeco, o RNA genmico traduzido parcialmente, resultando na produo de uma poliprotena que abrange a regio das protenas NS. A clivagem dessa poliprotena resulta nas protenas NS, incluindo a replicase viral. Utilizando o RNA genmico como molde, a replicase sintetiza uma cpia de RNA de sentido antigenmico (polaridade negativa) com a extenso completa do genoma. Esse RNA antigenmico serve de molde para a sntese de vrios mRNAs de extenses variveis (denominados mRNAs subgenmicos), que sero traduzidos nas protenas estruturais. O RNA antigenmico tambm serve de molde para a transcrio completa e produo de RNAs de sentido e extenso genmica. Resumindo, embora o genoma desses vrus possua polaridade positiva, apenas a regio da ORF, que corresponde s protenas NS, traduzida pelos ribossomos. As protenas estruturais so produzidas pela traduo de mRNAs subgenmicos, que, por sua vez, so produzidos pela transcrio do RNA antigenmico. Uma caracterstica marcante dessas famlias e que difere do grupo anterior a produo de mRNAs subgenmicos (Figura 5.10).
6 Replicao 7 Morfognese

RNA anti-genmico (-)

Genoma RNA (+)

Transcrio

Poliprotena regio 5 Clivagem

mRNA subgenmicos

Vrions

Egresso

Traduo 7 Morfognese

Protenas no-estruturais

Protenas estruturais

Figura 5.10. Ciclo replicativo dos vrus da classe IVb (Coronaviridae, Togaviridae, Arteriviridae, Caliciviridae e Astroviridae). O RNA genmico de sentido positivo traduzido parcialmente, resultando em uma poliprotena (1) que clivada em protenas no-estruturais, incluindo a replicase (2). A replicase recm-produzida replica o genoma em toda a sua extenso, produzindo uma molcula de RNA de sentido antigenmico (3). O RNA anti-genmico serve de molde para a transcrio e produo de vrios RNAm subgenmicos de extenses variveis (4), cuja traduo resulta nas protenas estruturais (5). Posteriormente tambm so produzidas cpias inteiras do genoma RNA de sentido positivo (6), que serviro de molde para ciclos adicionais de replicao (3) e sero oportunamente encapsidadas (7).

Replicao viral

129

3.5.2.3 Vrus da classe V


Esses vrus possuem um genoma RNA de sentido negativo, no-segmentado (paramixovrus, rabdovrus e lovrus) ou segmentado (ortomixovrus, buniavrus e arenavrus) e trazem a replicase viral nos vrions. Nos vrus com o genoma no-segmentado, os genes so transcritos individualmente, originando mRNAs que so traduzidos nas protenas estruturais e NS (Figura 5.11). Nos vrus com o genoma segmentado, cada segmento contm um (ou dois) gene(s), que tambm so transcritos individualmente. Nas etapas iniciais da infeco, a transcrio direcionada para a sntese de mRNAs para a produo de protenas virais. Em fases tardias do ciclo, o modo de transcrio deve ser alterado, de modo a produzir os RNAs intermedirios de replicao (RI) de sentido antigenmico. Nos vrus com o genoma no-segmentado, esses RI possuem a extenso inteira do genoma e servem de molde para a sntese de molculas de RNA de sentido genmico. Dois tipos de RNAs de sentido positivo so, ento, produzidos: os mRNA com a extenso dos genes individuais (para a traduo); e o RNA RI, com a extenso inteira do genoma (para a replicao).
4 RNA antigenmico (-) Replicao 3 1, 5

Nos vrus com o genoma segmentado, a transcrio dos segmentos genmicos de RNA tambm resulta em dois tipos de RNAs, com funes diferentes (mRNAs para a traduo; RI RNAs para a replicao). Os mRNAs e RIs, derivados de cada segmento, no entanto, possuem tamanhos aproximados. Os mRNAs possuem alguns nucleotdeos a mais e a estrutura cap na extremidade 5 e uma cauda poliA na extremidade 3. Os RNAs RI, sem cap ou poliA so produzidos tardiamente na infeco e servem exclusivamente de molde para a replicao e produo de segmentos de RNA genmicos. Todas as etapas de transcrio e replicao desses vrus ocorrem com o genoma intimamente associado com protenas, principalmente a nucleoprotena (NP), formando o complexo ribonucleoprotena (RNP). Os arenavrus e os vrus do gnero Phlebovirus (Bunyaviridae) apresentam uma estratgia peculiar de expresso de alguns de seus genes. Os RNA genmicos possuem polaridade negativa e a maioria dos genes expressa pela estratgia descrita acima. No entanto, um dos segmentos genmicos contm seqncias codicantes de protena tanto no sentido do genoma (sentido negativo) como no sentido antigenmico. Essa es-

Genoma RNA (-)

Transcrio

Morfognese

mRNA 2 Traduo

Vrions

Egresso

6 Protenas estruturais No-estruturais + NP

Morfognese

Figura 5.11. Ciclo replicativo dos vrus da classe V (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridade, Orthomyxoviridae e Bunyaviridade). Os genes individuais so transcritos pela RNA polimerase presente nos vrions, produzindo mRNAs correspondentes a cada gene (1). A traduo desses mRNA resulta em protenas estruturais e NS (2). As protenas NS, incluindo a replicase, participam da replicao do genoma. A replicao ocorre via sntese de RNAs de sentido antigenmico (3), que servem de molde para a sntese de RNAs de sentido genmico (4). As molculas de RNA de sentido genmico servem de molde para novos ciclos de transcrio (5), replicao (3, 4) e sero posteriormente encapsidadas (6).

130

Captulo 5

tratgia denominada ambissense e nica dessas famlias.

3.5.2.4 Vrus da classe III


O genoma desses vrus composto por 10 a 12 segmentos (reovrus) ou dois segmentos (birnavrus de animais) de RNA de ta dupla. Nos reovrus, a maioria dos segmentos codica apenas uma protena; poucos segmentos contm dois genes. Logo aps a penetrao e ainda em capsdeos semi-ntegros, a polimerase viral presente nos vrions realiza a transcrio primria de cada segmento. Os mRNA resultantes possuem duas funes: so traduzidos em protenas e, j associados com as protenas estruturais recmproduzidas, servem de molde para a replicao (sntese de RNAs de sentido negativo). Dentro de capsdeos pr-formados, os segmentos de RNA de polaridade negativa recm-produzidos so transcritos (transcrio secundria). Os transcritos resultantes so utilizados predominantemente para a produo de protenas nas fases tardias do ciclo. Os eventos que ocorrem nas fases nais do ciclo no esto esclarecidos, mas parecem envolver a associao das protenas externas do capsReplicao 4

deo com os complexos pr-formados entre o genoma e outras protenas estruturais. A liberao dos vrions maduros ocorre de forma ineciente aps a lise celular. As molculas de RNA genmico possuem funes distintas: as molculas de RNA de polaridade negativa servem apenas de molde para a transcrio. A funo aparente das molculas genmicas de RNA positivo apenas parear com as cadeias negativas. J as molculas de RNAs de sentido positivo, produzidas durante a infeco, possuem duas funes: podem ser traduzidas em protenas (mRNAs) e/ou servem de molde para a sntese das cadeias negativas (Figura 5.12).

3.5.2.5 Vrus da classe VI


A replicao do genoma dos retrovrus inclui etapas que ocorrem no citoplasma (logo aps a penetrao do nucleocapsdeo na clula hospedeira) e no ncleo (aps a integrao do material gentico viral no genoma da clula). O genoma desses vrus composto por duas molculas idnticas de RNA de sentido positivo que, no entanto, no so traduzidas pelos ribossomos. No inico da infeco, a molcula de RNA genmico con-

Pr-capsdeos + mRNA

Genoma RNA (cadeia dupla)

1,6

Transcrio primria e secundria

Morfognese

3 mRNA Vrions

Egresso

Morfognese inicial

Traduo 6 Morfognese

Protena no-estruturais Protenas estruturais

Figura 5.12. Ciclo replicativo dos vrus da classe III (Reoviridae e Birnaviridae). A replicase viral trazida nos vrions realiza a transcrio primria, produzindo mRNAs (1), que so traduzidos em protenas estruturais e no-estruturais (2). Esses mRNAs formam complexos com as protenas estruturais recm-produzidas (3) e, no interior desses complexos, servem de molde para a sntese de RNAs de sentido negativo, com a participao das protenas NS (4). As molculas de RNA de cadeia dupla, resultantes da replicao (4), servem de molde para a transcrio secundria (5) e para etapas adicionais de replicao (4). Essas molculas, j conjugadas com algumas protenas estruturais, eventualmente participam da morfognese pela associao com as demais protenas do capsdeo (6).

Replicao viral

131

vertida em uma molcula de cDNA pela enzima viral transcriptase reversa (RT, DNA polimerase dependente de RNA), que, em seguida, convertida em uma molcula de DNA de ta dupla. Essa molcula, denominada provrus, ingressa no ncleo e integrada no genoma da clula hospedeira, pela atividade integrase da polimerase viral. A integrao do provrus no genoma celular assegura a perpetuao das informaes genticas do vrus no hospedeiro, e absolutamente necessria para a continuao do ciclo replicativo. A prxima etapa a transcrio dos genes virais pela RNApolII e fatores de transcrio celulares. A transcrio parcial do genoma produz mRNAs que sero processados por splicing e sero traduzidos nas glicoprotenas do envelope. A transcrio completa do genoma origina mRNAs com duas nalidades: servirem de molde para a traduo em protenas (RT, protena da matriz, do capsdeo) ou constiturem o RNA genmico para a morfognese da prognie viral. Considerandose que a transcrio do provrus que produz o RNA genmico realizada pela maquinaria celular de transcrio, sem a participao de nenhum

fator viral, o genoma dos retrovrus o nico genoma viral a ser sintetizado exclusivamente por enzimas e fatores celulares (Figura 5.13).

3.6 Morfognese, maturao e egresso


Os vrus das diversas famlias apresentam uma ampla diversidade estrutural, que vai desde partculas formadas pelo genoma e uma camada simples de protenas at vrions altamente complexos. No entanto, independente da sua complexidade estrutural, uma srie de interaes entre os seus constituintes so necessrias para a montagem das partculas vricas e a concluso do processo de replicao. Essas interaes incluem: a) formao das unidades estruturais do capsdeo pela interao entre as respectivas protenas; b) incorporao do genoma ao capsdeo pr-formado ou em formao; e c) liberao da prognie viral da clula infectada. No caso dos vrus envelopados, a formao no nucleocapsdeo seguida pela aquisio do envelope a partir de membranas celulares, nas quais as protenas virais foram previamente inseridas.

ssDNA

Transcrio reversa 1 Genoma RNA (+)

Sntese da cpia complementar 7

Morfognese

dsDNA (provrus) 3 Integrao

Traduo 5

Pol+In Protenas do capsdeo

Vrions

Egresso

Morfognese

Provrus DNA Integrado

Transcrio RNAs de extenso genmica 4

Splicing +Traduo 6

Glicoprotenas do envelope

Figura 5.13. Ciclo replicativo dos vrus da classe V (Retroviridae). Logo aps o desnudamento, a enzima viral transcriptase reversa (RT) sintetiza uma molcula de DNA complementar ao RNA genmico (1) que, em seguida, convertida em DNA de cadeia dupla (dsDNA), tambm pela ao da RT (2). Esta molcula de dsDNA, denominada provrus, penetra no ncleo e integrada no genoma da clula hospedeira pela atividade viral integrase (3). Os genes presentes no provrus so, ento, transcritos pela RNA polII celular, originando mRNAs de extenso subgenmica (4) para a traduo nas protenas do envelope (5). A transcrio do provrus em toda a sua extenso resulta em mRNAs de extenso genmica (6), que podem ser traduzidos nas outras protenas estruturais e polimerase viral (7) ou participam da morfognese das partculas virais (8).

132

Captulo 5

Diferentemente de clulas eucariotas e procariotas, que se multiplicam por sso binria, os vrions so formados pela associao de componentes pr-formados (genoma + protenas). O processo de montagem das partculas vricas, que ocorre ao nal do ciclo replicativo, denominado genericamente de morfognese ou reunio. A aquisio da capacidade infectiva pelas partculas vricas recm-formadas que ocorre prvia ou concomitantemente com o seu egresso da clula denomina-se maturao. Como, para muitos vrus, esses processos ocorrem simultaneamente, sero aqui abordados conjuntamente. As diferentes etapas da formao da partcula vrica no ocorrem ao acaso. As associaes entre os componentes so direcionadas e favorecidas por interaes qumicas especcas entre as unidades proticas estruturais e entre estas e o cido nuclico. Dependendo da estrutura e complexidade da partcula vrica, da estratgia e local de replicao, os vrus desenvolvem diferentes estratgias de morfognese e maturao/egresso de sua prognie.

fognese das partculas (e a conseqente maturao) integralmente no citoplasma (vrus RNA) ou no ncleo (vrus DNA). Dessa forma, a prognie viral infecciosa pode ser encontrada nesses compartimentos, mesmo com a clula ainda ntegra, ou seja, a maturao ocorre previamente ao egresso. Esses vrus geralmente so liberados quando ocorre a destruio das clulas infectadas (Figura 5.14). Os vrus no-envelopados das famlias Polyomaviridae, Papillomaviridae, Adenoviridae e Picornaviridae e tambm os membros da Poxviridae e Asfarviridae (com envelope), enquadram-se nessa categoria.

3.6.2 Maturao por brotamento em membranas celulares


No ciclo replicativo dos vrus envelopados, as glicoprotenas do envelope recm-sintetizadas so inseridas em membranas celulares, isto , na membrana do retculo endoplasmtico rugoso (RER), no aparelho de Golgi ou na membrana plasmtica. Os nucleocapsdeos recm-formados interagem com a protena da matriz e/ou com extremidades citoplasmticas dessas glicoprotenas e inserem-se (ou projetam-se) atravs da membrana, incorporando o envoltrio. Esse envoltrio (envelope) composto pela membrana lipdica dupla, contendo as glicoprotenas virais

3.6.1 Maturao intracelular


(citoplasmtica ou nuclear)
Alguns vrus (principalmente os desprovidos de envelope) completam o processo de mor-

Meio extracelular

Membrana plasmtica

2 Citoplasma

Figura 5.14. Maturao intracelular e egresso dos vrus sem envelope. Os componentes do capsdeo interagem entre si e com o genoma (1), resultando na formao de partculas vricas infecciosas (2), que so liberadas por lise celular (3).

Replicao viral

133

inseridas. O processo de aquisio do envelope denominado brotamento, pois o nucleocapsdeo literalmente brota para o interior do RER (Figura 5.15), do Golgi ou para o exterior da clula (Figura 5.16). Os vrus que realizam brotamento em membranas celulares, como forma de adquirir o

envelope e completar a sua morfognese/maturao, podem ser liberados por exocitose sem induzir necessariamente lise da clula. Os vrus RNA de sentido negativo, alguns vrus RNA de sentido positivo (togavrus) e os retrovrus completam a morfognese e a maturao

Meio extracelular

Membrana plasmtica

Citoplasma

Figura 5.15. Maturao intracitoplasmtica de vrus envelopados por brotamento em membranas celulares internas. Interao dos nucleocapsdeos com as caudas das glicoprotenas do envelope (1), brotamento e transporte no interior de vesculas (2), liberao por exocitose (3).

Meio extracelular
4

Membrana plasmtica

2 1 Citoplasma

Figura 5.16. Brotamento e maturao de vrus envelopados na membrana plasmtica. Interao do nucleocapsdeo com a protena matriz e/ou caudas citoplasmticas das glicoprotenas do envelope (1), brotamento atravs da membrana plasmtica e aquisio do envelope (2, 3), egresso de partculas infecciosas (4).

134

Captulo 5

somente no momento da liberao dos vrions na superfcie da clula. Nesses casos, no possvel detectar prognie viral infecciosa no interior das clulas. Os vrions de outras famlias (Flaviviridae, Coronaviridae, Arteriviridae, Bunyaviridae, Poxviridae) realizam o brotamento no RER e/ou no aparelho de Golgi. Vrions infecciosos podem ser encontrados em vesculas citoplasmticas derivadas desses compartimentos, nas quais so transportados at a membrana plasmtica, onde so liberados por exocitose. Os herpesvrus apresentam uma estratgia particular de morfognese, maturao e egresso. A replicao do genoma e a montagem dos nucleocapsdeos ocorrem no ncleo, para onde as protenas estruturais so importadas aps a sua sntese no citoplasma. Os nucleocapsdeos podem adquirir o envelope pelo brotamento na membrana nuclear interna vrions completos envelopados podem ser observados no espao entre as membranas nucleares . Esses nucleocapsdeos podem perder o envelope ao sair desse compartimento e readquir o envelope pelo brotamento na membrana do RER. Nesses casos, so transportados em vesculas e liberados ao exterior por exocitose. Outros nucleocapsdeos podem ser transportados atravs do citoplasma at a membrana plasmtica, onde adquirem o envelope por brotamento. Ao contrrio de alguns vrus envelopados, que no so lticos, a replicao dos herpesvrus inevitavelmente leva lise e destruio celular. Os efeitos da replicao viral na clula hospedeira so muito variveis e vo desde infeces que no provocam alteraes detectveis at a morte e lise celular. As conseqncias da replicao viral em nvel celular possuem importncia na patogenia das doenas vricas. Esses temas sero abordados no Captulo 8.

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Replicao viral

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REPLICAO DOS VRUS DNA


Gustavo Delhon1

6
139 140
140 142 142 144 145 146 146

1 Introduo 2 Poliomavrus
2.1 O ciclo replicativo 2.2 O genoma dos PoVs 2.3 Expresso dos genes iniciais 2.4 Replicao do DNA 2.5 Expresso dos genes tardios 2.6 Morfognese e egresso 2.7 Concluses

3 Papilomavrus
3.1 O ciclo replicativo 3.2 O genoma dos PpVs 3.3 Expresso dos genes iniciais 3.4 Replicao do DNA e interferncia com o ciclo celular 3.5 Expresso dos genes tardios 3.6 Concluses

147
147 147 148 148 150 151

4 Adenovrus
4.1 O ciclo replicativo 4.2 O genoma dos AdVs 4.3.Expresso dos genes iniciais 4.4 Replicao do DNA viral 4.5 Expresso dos genes tardios 4.6 Concluses

151
151 151 153 154 154 156

5 Herpesvrus
5.1 O ciclo replicativo 5.2 O genoma dos HVs 5.3 Os genes virais 5.4 Expresso gnica 5.5 Replicao do DNA viral 5.6 Expresso gnica durante a infeco latente
1

156
156 156 157 158 159 160

Traduzido por Fernanda S.F.Vogel.

5.7 Concluses

160

6 Poxvrus
6.1 O ciclo replicativo 6.2 O genoma dos PoxVs 6.3 Expresso gnica 6.4 Replicao do DNA 6.5 Concluses

160
160 160 161 162 163

7 Bibliograa consultada

163

1 Introduo
A replicao dos vrus DNA realizada pela ao orquestrada da maquinaria da clula hospedeira, associada com fatores codicados pelo vrus. A contribuio relativa dos fatores virais na replicao desses vrus, no entanto, varia muito entre as diferentes famlias. Em geral, os vrus DNA pequenos (parvovrus e poliomavrus) utilizam extensivamente a maquinaria celular, ou seja, os seus genomas codicam poucos produtos associados com funes replicativas. Por outro lado, os vrus DNA grandes (herpesvrus e poxvrus) codicam muitas enzimas e fatores envolvidos na replicao. Esses ltimos seriam, teoricamente, menos dependentes da maquinaria celular para a replicao de seus genomas e a conseqente produo da prognie viral. Dessa forma, qual seria a estratgia mais eciente para a manuteno desses vrus na natureza? Na verdade, ambas, pois tanto os vrus DNA pequenos como os grandes tm conseguido se perpetuar, sugerindo que uma perfeita adaptao a um nicho tecidual mais importante do que a complexidade do genoma e a estratgia de replicao.

Os mecanismos de replicao do genoma tambm variam entre os vrus DNA, de acordo com a estrutura e topologia do genoma e tambm com a participao relativa de fatores celulares e/ou virais (Figura 6.1). O genoma circular de cadeia dupla dos poliomavrus (e provavelmente dos papilomavrus), por exemplo, replicado de forma bidirecional e semidescontnua, a partir de uma origem nica. O complexo replicativo utiliza um primer de RNA para iniciar a sntese, e o mecanismo de replicao semelhante ao utilizado pelas clulas eucariotas para replicar o DNA cromossmico. O genoma linear de ta dupla dos adenovrus possui uma origem em cada extremidade. A replicao ocorre em duas etapas, e cada cadeia parental replicada em uma dessas etapas. O complexo replicativo utiliza uma oxidrila (OH) ligada a uma protena viral (pTP), que est ligada em cada extremidade do genoma como iniciador da sntese de DNA (protein priming). A replicao dos genomas dos herpesvrus e poxvrus mais complexa. O genoma dos herpesvrus possui trs origens e parece ser replicado por um mecanismo de crculo rolante, no qual multmeros lineares so produzidos e, posteriormente, clivados

Ou

Poliomavrus Papilomavrus

Adenovrus

Parvovrus

Herpesvrus

Poxvrus

Fonte: adaptada de Dulbecco e Ginsberg (1980).

Figura 6.1. Ilustrao da replicao do genoma dos principais vrus DNA. Os estgios intermedirios foram propostos a partir de estudos fsico-qumicos e, microscopia eletrnica, realizados a diferentes intervalos aps a infeco.

140

Captulo 6

em unidades genmicas. A replicao do genoma DNA linear de ta dupla dos poxvrus parece se iniciar com a clivagem de uma das cadeias prxima a ala terminal do genoma, seguida de elongao a partir da extremidade 3, gerada pela clivagem. A replicao do genoma DNA linear de ta simples dos parvovrus no abordada neste captulo inicia-se com a elongao da extremidade 3 livre, que se encontra exionada, e prossegue continuamente. Uma ilustrao esquemtica da replicao do genoma de diferentes vrus DNA est apresentada na Figura 6.1. O objetivo fundamental da replicao viral produzir prognie viral vivel e abundante, que assegure a propagao do vrus e a conseqente transmisso a novos hospedeiros. A produo de prognie depende da sntese de milhares de cpias do genoma viral e das protenas componentes do vrion, associado com a montagem correta e liberao eciente das partculas vricas. Esse processo envolve uma srie de etapas reguladas temporal e espacialmente, que incluem a expresso de genes virais e a induo e/ou represso de alguns genes do hospedeiro. Muitas vezes, a replicao viral est associada com alterao da siologia celular, o que pode determinar diferentes graus de patologia e at a morte da clula hospedeira. Embora a grande maioria dos vrus DNA replique no ncleo, alguns deles desenvolveram estratgias especiais que permitem a sua replicao no citoplasma da clula hospedeira. No decorrer deste captulo, sero abordados os aspectos replicativos das principais famlias de vrus DNA e a estratgia de replicao dos prottipos de cada famlia, enfatizando-se os aspectos moleculares e biolgicos da expresso gnica, a interferncia com funes celulares, para assegurar a replicao (entre elas a induo do ciclo celular), e a replicao do genoma propriamente dita. A replicao dos circovrus e parvovrus ser abordada nos Captulos 13 e 14, respectivamente. A replicao dos hepadnavrus ser tratada, resumidamente, no captulo destinado s famlias de interesse limitado em medicina veterinria. Inicialmente, ser descrita a replicao dos vrus da famlia Polyomaviridae, vrus relativamente simples, cuja estratgia de replicao tem

sido amplamente estudada. De fato, a replicao dos vrus DNA grandes pode ser considerada como uma evoluo progressiva de complexidade quando comparada com os esquemas relativamente simples de replicao dos poliomavrus. A seguir, sero apresentados os principais aspectos da expresso gnica, replicao do genoma e interao com funes celulares dos papilomavrus, adenovrus, herpesvrus e poxvrus, respectivamente.

2 Poliomavrus
A famlia Polyomaviridae contm um nico gnero, Polyomavirus, que inclui o prottipo da famlia, o vrus smio 40 (SV-40), e os vrus JC e BK, que tm sido, esporadicamente, associados com tumores em humanos. Os poliomavrus (PoVs) so vrus DNA pequenos, sem envelope, de simetria icosadrica, que infectam um amplo espectro de hospedeiros desde pssaros at humanos . As infeces pelos PoVs so geralmente subclnicas. No entanto, a infeco de clulas que no suportam uma replicao produtiva freqentemente resulta em transformao neoplsica. Por isso, os PoVs so tambm conhecidos como os pequenos vrus DNA tumorais. Apesar de sua pequena importncia clnica, os PoVs foram alvo de intensivos estudos biolgicos e moleculares, principalmente devido s suas propriedades tumorignicas. As pesquisas com os PoVs elucidaram importantes aspectos da biologia celular. Dentre as maiores descobertas resultantes do estudo dos poliomavrus destacam-se: a) estrutura do DNA superenrolado, b) estrutura e funo da origem da replicao do DNA, c) estrutura e funo dos promotores, d) descoberta dos enhancers e o seu papel na expresso gnica, e) descoberta do mecanismo de splicing alternativo dos transcritos (RNA mensageiros, mRNA) e f) replicao do DNA cromossmico.

2.1 O ciclo replicativo


O mecanismo de penetrao dos PoVs nas clulas hospedeiras ainda no est completamente esclarecido. Embora estudos recentes tenham demonstrado o envolvimento de molculas do

Replicao dos vrus DNA

141

complexo maior de histocompatibilidade do tipo I (MHC-I) como receptores para o SV-40, ainda no h evidncias conclusivas nesse sentido. Aps a ligao aos receptores, os vrions so internalizados por endocitose caveolar e transportados ao longo dos microtbulos at o retculo endoplasmtico. O mecanismo de transporte para o citoplasma e da para o ncleo no est esclarecido, porm, sabe-se que o desnudamento do genoma ocorre no interior do ncleo. Aps a sua liberao no nucleoplasma, o genoma transcrito pela RNA polimerase II celular e, subseqentemente, repli-

cado. Os mRNA virais produzidos so processados por splicing e exportados para o citoplasma, onde so traduzidos. As protenas virais recmproduzidas so transportadas de volta ao ncleo, onde participam da replicao do genoma e, posteriormente, da montagem das partculas vricas. Durante esse processo, os mRNA e as protenas virais necessitam interagir com componentes da maquinaria celular responsvel pela exportao e importao nuclear de macromolculas. A morfognese das partculas virais ocorre no ncleo. As partculas recm-formadas so transportadas

A
1 4 7

B
1 4

3 2 5

x
8 5a

Ncleo

Transformao celular

Citoplasma 9

Clula permissiva

Clula no-permissiva

Fonte: adaptado de Cole e Conzen (2001).

Figura 6.2. Ciclo replicativo dos poliomavrus em clulas permissivas (A) e no-permissivas (B). A) Aps a penetrao do vrion (1), o genoma desnudo no interior do ncleo (2), onde os genes iniciais so transcritos pela maquinaria celular de transcrio (3). Os mRNAs so traduzidos nas protenas iniciais, ou seja, os antgenos T (4). Os antgenos T ingressam no ncleo e interagem com o DNA viral e com fatores da clula hospedeira, resultando na replicao do genoma (5). Aps a replicao, os genes tardios so transcritos (6) e a traduo dos mRNAs origina as protenas estruturais (7) que ingressam no ncleo e interagem com o genoma para formar as novas partculas vricas (8). Os vrions se acumulam no ncleo, so exportados em vesculas para o citoplasma e liberados por lise celular ou por exocitose (9). Em clulas no-permissivas (B), as etapas 1 a 4 ocorrem normalmente. No entanto, o antgeno T falha em interagir com os fatores celulares, no ocorrendo a replicao do DNA viral, nem a transcrio e expresso dos genes tardios. O DNA viral persiste no ncleo da clula (5a) e os genes dos antgenos T continuam sendo expressos (3, 4), podendo levar imortalizao e transformao celular. No h replicao do genoma e nem produo de prognie viral.

142

Captulo 6

at a superfcie celular, no interior de vesculas, e liberadas por exocitose ou por lise celular, dependendo do tipo de clula. A infeco de clulas permissivas resulta na ocorrncia de todas essas etapas e na conseqente produo de prognie viral infecciosa. Por outro lado, a infeco de clulas semipermissivas (geralmente de espcies heterlogas) resulta em replicao abortiva, na qual ocorre apenas a expresso dos genes iniciais, sem a replicao do genoma ou produo das protenas tardias (protenas estruturais). A persistncia do genoma viral nessas clulas, associada com a expresso contnua dos antgenos T, pode levar imortalizao e transformao celular. As etapas do ciclo replicativo dos PoVs em clulas permissivas e no-permissivas esto representadas esquematicamente na Figura 6.2.

dos vrions, pois interage com a VP1. Os PoVs de roedores codicam uma terceira protena T, o antgeno T mdio (mT), e no codicam a protena agno. Em vez de possurem regies codicantes com seqncias regulatrias individuais, os PoVs solucionaram o problema do genoma pequeno realizando splicing alternativo em alguns transcritos, resultando, assim, na traduo em protenas diferentes parcialmente homlogas. Alm disso, o genoma apresenta uma concentrao das seqncias regulatrias para a transcrio e replicao do DNA em uma pequena regio, o que contribui para a compactao gentica (Figura 6.3).

2.3 Expresso dos genes iniciais


Aps o desnudamento do genoma no interior do ncleo, o minicromossoma do SV-40 transcrito pelos complexos de transcrio da clula hospedeira (RNA pol II e fatores de transcrio). O primeiro gene a ser transcrito o do antgeno T, e a sua transcrio contnua resulta em um acmulo gradual do mRNA especco durante as primeiras 10 a 12 horas de infeco. Como os mRNA do antgeno T so os primeiros a serem transcritos e detectados, so denominados transcritos iniciais (E = early). Os transcritos primrios do gene do antgeno T sofrem splicing alternativo para originar mRNAs, que sero traduzidos em duas protenas: o antgeno T grande (lT) e pequeno (sT). Com isso, as protenas lT e sT possuem parte de sua seqncia de aminocidos em comum; sendo que o lT possui uma regio adicional no presente no sT. A transcrio dos genes iniciais controlada por uma regio regulatria de 250 pb, localizada imediatamente na direo 5 do stio inicial de transcrio do gene do antgeno T (Figura 6.3). Essa regio regulatria apresenta pequenas seqncias de nucleotdeos, dispostas em la, ou motivos (motifs) que, juntos, constituem o promotor inicial do SV-40. Esses motivos atuam como stios de ancoragem e ligao de componentes do aparato de transcrio celular, incluindo a RNA pol II e os fatores de transcrio. Logo acima do promotor (na direo 5), existem duas cpias re-

2.2 O genoma dos PoVs


O genoma dos PoVs constitudo por uma molcula de DNA de ta dupla circular, com aproximadamente 5.000 pares de bases (bp), que, na maioria dos PoVs, est associado com protenas. O genoma desses vrus encontra-se associado com histonas celulares, formando estruturas semelhantes aos nucleossomas e assumindo uma congurao helicoidal semelhante cromatina celular. Por essas razes, os seus genomas so geralmente denominados minicromossomos virais. A replicao do genoma do SV-40 realizada basicamente por fatores e enzimas da clula hospedeira, com a participao de apenas uma protena viral, o antgeno T. Por isso, a replicao do DNA do SV-40 tem sido utilizada como modelo para se estudar a replicao bidirecional semidescontnua do DNA cromossmico celular. A organizao do genoma do SV-40 est representada na Figura 6.3. Cerca de 90% da extenso do genoma codicante, e os 10% restantes representam regies no-traduzidas que possuem funes regulatrias. O genoma do SV-40 codica seis protenas, sendo trs delas componentes da estrutura do capsdeo (VP1, VP2 e VP3) e trs protenas no-estruturais, denominadas antgeno T pequeno (sT) e grande (lT), e a protena agno. A protena agno parece participar na morfognese

Replicao dos vrus DNA

143

m RNA tardios

m RNA iniciais

Enhancer

72

72

21 21 22

TATA

Promoter inicial

III ORI Origem da replicao bidirecional Aux-2

II Core

I
Aux-1

320

240

160

80

0/5243

5163 bp

PL Ori PE VP2

Organizao genmica do SV-40

ST

VP3 LT 17kT VP1

Fonte: adaptado de Cole e Conzen (2001).

Figura 6.3. Estrutura e organizao do genoma do SV-40 (inferior) e organizao das regies regulatrias da transcrio e replicao (superior). ORI: origem de replicao; PE: promotor dos genes iniciais; PL: promotor dos genes tardios; lT: mRNA do gene do antgeno T grande; sT: mRNA do gene do antgeno T pequeno; VP1, VP2 e VP3: mRNA das protenas estruturais. >>: stios de ligao do antgeno; I: stio de regulao negativa da transcrio dos mRNA iniciais; II: stios de ligao e separao do DNA para o incio da replicao; III: stios de regulao positiva da transcrio dos genes tardios.

petidas de 72 pb que atuam como enhancers do promotor. Essas seqncias de 72 pb so responsveis pela ligao especca de fatores de transcrio, ou transativadores, cuja funo se ligar ao DNA e aumentar a ecincia da transcrio a partir do complexo basal de transcrio. Alguns motivos presentes nos promotores e enhancers virais so encontrados tambm nas regies regulatrias de certos genes das clulas

hospedeiras. Esse aspecto molecular crucial para o parasitismo do vrus. Possuindo regies regulatrias semelhantes s da clula hospedeira, o vrus pode seqestrar os componentes da maquinaria celular de transcrio para sintetizar os seus mRNA. Alm disso, a regio regulatria do SV-40 contm vrias seqncias repetidas que servem de stios de ligao para o antgeno lT, o que in-

144

Captulo 6

dica que esta protena regula a sua prpria expresso. Quando a quantidade de antgeno lT, na clula infectada, atinge nveis altos, a ocupao desses stios pelo prprio antgeno lT regula negativamente a transcrio do seu gene. A prxima etapa do ciclo replicativo a replicao do genoma viral. Como o genoma dos PoVs no codica os produtos necessrios sua prpria replicao, esses vrus dependem integralmente de enzimas e fatores celulares para replicar o seu DNA. No entanto, apenas um pequeno nmero de clulas no organismo encontra-se na fase S do ciclo celular, fase em que a clula expressa os fatores necessrios para a replicao do DNA nuclear. A maioria das clulas do organismo j so diferenciadas ou so clulas que necessitam estmulos externos (fatores de crescimento, hormnios ou outros estmulos mitognicos) para iniciar o ciclo celular. Os PoVs, assim como outros vrus DNA, solucionaram esse problema ao desenvolverem mecanismos para estimular as clulas a entrarem em fase S e, assim, produzirem os fatores necessrios replicao do seu genoma. Dessa maneira, o SV-40 capaz de infectar de forma persistente clulas renais diferenciadas e que no esto em diviso de seu hospedeiro natural. A replicao do DNA cromossmico das clulas ocorre durante a fase S do ciclo celular, mas a sntese e o acmulo dos fatores necessrios replicao do DNA iniciam na fase anterior (G1). A transio entre as fases G1 e S controlada parcialmente pela protena do retinoblastoma (pRb) e pelas protenas relacionadas p107 e p130. Em clulas que no esto em diviso, as protenas da famlia Rb impedem o incio da fase S pelo seqestro de fatores de transcrio que ativam os genes das enzimas relacionadas com a replicao do DNA, incluindo a DNA polimerase . Aps o estmulo mitognico, a ciclina D liga-se nas cdk 4 e cdk 6, ativando-as, o que leva hiperfosforilao da protenas Rb e resulta na liberao dos fatores de transcrio (E2F) e incio da fase S. Outros fatores tambm esto envolvidos no controle da transio entre as fases G1 e S. O fator de transcrio p53 pode prevenir a sntese noprogramada de DNA e bloquear o incio da fase S quando so detectadas leses no DNA celular.

Dependendo do estgio siolgico da clula, a p53 pode retardar o progresso do ciclo celular ou induzir apoptose. Pelo seu papel na transio G-S1, tanto a pRb como a p53 podem ser consideradas guardis que evitam a diviso celular extempornea e a transformao maligna das clulas. Por isso, so conhecidas como protenas antioncognicas. Apesar desses mecanismos de controle do ciclo celular, os PoVs conseguem induzir o incio da fase S em clulas quiescentes porque o antgeno lT dos PoVs exerce um importante papel, alterando o controle do ciclo celular por interagir diretamente com a protena Rb e, em alguns PoVs, tambm com a p53. Um pequeno domnio prximo a regio N-terminal do antgeno lT se liga especicamente s protenas da famlia Rb, enquanto seqncias prximas regio C-terminal so requeridas para a associao com a p53 (Figura 6.4). As conseqncias dessas interaes so a inibio da funo da pRb e p53 e a conseqente expresso dos produtos necessrios replicao do DNA viral e tambm celular. Alm do efeito da ligao nas pRbs, o antgeno lT capaz de estimular diretamente os promotores dos genes envolvidos no controle do ciclo celular, incluindo os genes que codicam as ciclinas. Dessa forma, o antgeno lT utiliza dois mecanismos para assegurar que a clula infectada entre em fase S e, assim, propicie um ambiente favorvel replicao viral. A funo exata do antgeno T pequeno (sT) durante a infeco produtiva ainda no est completamente esclarecida, porm sabe-se que esta protena capaz de interagir com a fosfatase 2, uma enzima reguladora do ciclo celular. Assim, o sT poderia colaborar com o lT na induo da fase S em clulas infectadas.

2.4 Replicao do DNA


A replicao do DNA circular dos PoVs envolve o relaxamento e a separao das cadeias do DNA, a sntese da cadeias lhas de DNA e a resoluo e a separao das molculas replicadas. O multifuncional antgeno lT exerce um papel fundamental no incio da replicao do DNA viral ao se ligar em seqncias regulatrias, localiza-

Replicao dos vrus DNA

145

Antgeno T
L X C X E

Domnio J

N L Liga na ORI S

ATPase Zn Liga na p53 Liga na p53 HR

Hsc70

pRB

p53 p300

p107 p130

Fonte: adaptado de Cole e Conzen (2001).

Figura 6.4. Estrutura funcional do antgeno T do SV-40. Nessa representao, esto indicados os motivos funcionais do lT. Domnio J: stio de ligao da protena Hsc70; LXCXE: stio de ligao das protenas da famlia pRb; NLS: sinal para localizao nuclear; stio de ligao na ORI; stio de ligao de Zn+; stio com atividade ATPase; stios de ligao nas protenas p53; HR: stio envolvido na determinao do host range.

das nas proximidades do promotor/enhancer do genoma do SV-40. Essa regio, conhecida por origem da replicao (ori), consiste de uma seqncia central de 64 nucleotdeos, anqueada por seqncias auxiliares (Figura 6.3). Como outras protenas que se ligam ao DNA, o antgeno lT oligomeriza ao interagir com os stios especcos na ori. Hexmeros do lT formam um anel duplo ao redor da ori e promovem a separao das cadeias do DNA viral nesse local. Esse processo dependente de energia, que fornecida pela hidrlise de ATP catalisada por uma atividade ATPase do prprio antgeno T (Figura 6.4). As regies de ta simples do DNA associamse, ento, com a protena replicativa A (RPA), que uma protena celular que se liga e mantm as regies de ta simples separadas. Isso permite a separao bidirecional das cadeias mediada pelo antgeno lT, expondo regies de cadeia simples para a processividade da replicao. O recrutamento da DNA polimerase (primase) e da topoisomerase I resulta na formao do complexo de iniciao. A etapa de elongao envolve a sntese bidirecional do DNA, que precedida pela atividade helicase do antgeno lT, que se move frente do complexo replicativo (Figura 6.1A). Os fatores do hospedeiro (PCNA e a DNA polimerase ) participam da sntese das cadeias leading

(contnua) e lagging (descontnua). A exonuclease e ligase I da clula hospedeira so necessrias para a remoo dos primers e ligao dos fragmentos de Okazaki, produzidos pela replicao descontnua de uma das cadeias. Como as cadeias parental e recm-replicada de DNA, so circulares e permanecem entrelaadas. A prxima etapa envolve a separao dessas molculas pela ao da enzima celular topoisomerase II (Figura 6.1). As histonas acumuladas no ncleo celular durante a fase S se associam com os genomas virais recm-replicados, formando, assim, uma prognie de minicromossomos. As clulas infectadas contm mais de 200.000 cpias de DNA viral e, aproximadamente, 50% destes so encapsidados para formar a prognie viral. Em resumo, a replicao do DNA do SV-40 compartilha vrias etapas e componentes essenciais envolvidos na replicao do DNA da clula hospedeira.

2.5 Expresso dos genes tardios


A replicao do DNA viral provoca uma alterao no padro de expresso gnica, favorecendo a transcrio e expresso dos genes tardios (L = late), que codicam as protenas do capsdeo. O mecanismo de transio, passando da expresso dos genes iniciais para a expresso

146

Captulo 6

dos tardios no bem conhecido. A redistribuio dos nucleossomos nas regies regulatrias do genoma possivelmente desempenhe alguma funo nesse processo, pois resulta na exposio dos stios regulatrios dos genes tardios para o reconhecimento pelo aparato celular de transcrio. O promotor que direciona a expresso dos mRNA tardios possui alguns motivos presentes tambm nos stios regulatrios dos genes iniciais, incluindo as seqncias para a ligao do antgeno lT. Dois mRNA tardios principais so transcritos na direo oposta aos mRNA iniciais e sofrem splicing alternativo. Os mRNA pequenos so traduzidos na protena VP1 do capsdeo, e os transcritos grandes originam a VP2 e VP3. Como a seqncia que codica a VP3 est contida na seqncia da VP2, a VP3 poderia ser produzida pela clivagem da protena VP2. No entanto, tem sido demonstrado que a traduo e sntese da VP3 e VP2 so independentes. A quantidade de mRNA tardios nas clulas infectadas muito superior a dos mRNA iniciais. Isso se explica pelo fato de que uma nica partcula vrica contm 360 molculas de VP1. Portanto, para uma prognie viral de 105 vrions por clula, so necessrias 3.6 x 107-8 molculas de VP1. Assumindo que cada molcula de mRNA pode originar de 5.000 a 10.000 molculas de VP1, mais de 30.000 molculas de mRNA da VP1 seriam necessrias para a produo de protena suciente para encapsidar a prognie viral. O acmulo da prognie de minicromossomos durante a replicao do DNA viral, com a conseqente amplicao dos moldes DNA e a ativao da transcrio pelo antgeno lT, so os responsveis pelos nveis altos de mRNA tardios nas clulas infectadas. Recentemente, foi relatado que microRNAs (miRNAs) so transcritos do genoma do SV-40 em fases tardias da infeco. Os miRNAs so pequenos (aproximadamente 20 nt) e desempenham funes regulatrias na expresso gnica de eucariotas. A hibridizao desses miRNAs com determinados mRNA-alvos resulta no silenciamento dos genes correspondentes. Esse silenciamento pode ocorrer por interferncia com a traduo ou pela degradao dos mRNA. Assim,

dois mecanismos atuam para reduzir a expresso do antgeno lT em fases tardias da infeco: a represso da transcrio pelo prprio antgeno lT e a interferncia pelos miRNAs. Surpreendentemente, clulas infectadas com isolados de campo do SV-40 so menos susceptveis lise por linfcitos T citotxicos do que clulas infectadas com cepas mutantes que no induzem a sntese de miRNAs. Provavelmente, a capacidade de sntese de miRNA se constitua em um mecanismo de evoluo viral, permitindo a esses vrus escaparem da vigilncia do sistema imunolgico.

2.6 Morfognese e egresso


Aps a sntese no citoplasma, as protenas virais VP1, VP2 e VP3 so transportadas para o interior do ncleo para a montagem dos vrions. Esse transporte mediado por sinais de localizao nuclear (NLS, seqncias especcas de aminocidos) presentes nessas protenas. Essas seqncias so responsveis pela interao das protenas virais com o aparato de importao nuclear. O mecanismo de montagem das partculas virais (morfognese) dos poliomavrus no conhecido. Capsdeos vazios podem ser inicialmente pr-formados, seguidos da incorporao dos genomas (como minicromossomos). Alternativamente, os capsmeros individuais formados pelos pentmeros da VP1, associados com a VP2 e com a VP3, podem interagir como o minicromossomo para a montagem dos capsdeos. A protena agno, uma protena altamente bsica, codicada pela regio lder dos mRNA tardios de alguns PoVs, facilita a morfognese por interagir com a VP1. Nos PoVs de humanos, a agnoprotena atua tambm na transcrio e replicao do DNA.

2.7 Concluses
A importncia crtica de uma nica protena o antgeno lT em vrias etapas do ciclo replicativo, como a transcrio, induo da fase S e replicao do DNA, constitui-se em um aspecto nico da famlia Polyomaviridae. O antgeno lT o protagonista principal e possui vrias atividades

Replicao dos vrus DNA

147

biolgicas. Atua como regulador da transcrio viral, como protena ligante de DNA, possui atividade helicase e ATPase e de chaperone, alm de interagir com vrias protenas da clula hospedeira. A atividade do antgeno lT regulada por vrias modicaes ps-traduo, como fosforilao, glicosilao, acetilao e adenilao. Os PoVs so tambm conhecidos como pequenos vrus DNA tumorais, por causa de sua capacidade de induzir a formao de tumores. A infeco de clulas no-permissivas pode resultar em replicao abortiva. No entanto, a integrao freqente do genoma viral nos cromossomos da clula hospedeira pode resultar em expresso contnua das protenas iniciais. O antgeno T possui um papel decisivo nos processos de imortalizao, transformao celular e oncognese, provavelmente por suas interaes com mltiplos fatores celulares e pela interferncia com a regulao do ciclo celular.

3 Papilomavrus
A famlia Papillomaviridae possui apenas o gnero Papillomavirus, que inclui vrios vrus de mamferos e de aves. Esses vrus esto freqentemente associados com leses proliferativas na epiderme e nas mucosas (papilomas ou verrugas). Alm de clulas epiteliais, alguns papilomavrus (PpVs) tambm infectam clulas do tecido conjuntivo, causando bropapilomas (p. ex.: papilomavrus bovino-1, BPV-1). As leses causadas pelos PpVs so geralmente benignas, mas alguns desses vrus esto associados com a produo de neoplasias malignas. Os vrions dos PpVs so icosadricos, sem envelope e possuem aproximadamente 55 nm de dimetro. O genoma consiste de uma molcula de DNA de ta dupla circular, com 6.800 a 8.400 pb que, a exemplo dos poliomavrus, est associada com histonas da clula hospedeira, formando um complexo semelhante cromatina celular (minicromossomo).

dos queratincitos (ou das clulas equivalentes em superfcies no-cutneas). Na epiderme, os queratincitos representam cerca de 90% das clulas e encontram-se em diferentes fases de diferenciao. As clulas menos diferenciadas esto localizadas no compartimento basal (estrato germinativo), e as mais diferenciadas localizam-se no compartimento apical (estrato crneo). As clulas em estgios intermedirios de diferenciao esto localizadas nos estratos granuloso e espinhoso. As clulas-tronco do compartimento basal se multiplicam de forma assimtrica, originando outras clulas-tronco e tambm clulas de transio para a posterior diferenciao. Essas ltimas deixam o estrato basal e penetram no estrato espinhoso, onde iniciam o processo de diferenciao celular. O ritmo de multiplicao das clulas basais assegura uma substituio contnua das clulas escamosas da superfcie apical que vo sendo desfoliadas. A infeco de animais e pessoas pelos PpVs provavelmente ocorre por meio de microleses, que expem o compartimento basal, permitindo a penetrao e incio da replicao viral. A ligao dos vrus s clulas mediada pelo sulfato de heparina. No entanto, no se conhecem os receptores especcos que mediam a ligao e penetrao do vrus nas clulas e tampouco o mecanismo de desnudamento. A infeco das clulas basais no produtiva, ou seja, no resulta na produo de prognie viral. O ciclo replicativo inicia nessas clulas com a expresso limitada de genes virais (genes iniciais) e replicao do DNA. No entanto, a replicao s completada nas clulas diferenciadas, onde ocorre a amplicao do DNA viral, a expresso dos genes tardios, a morfognese e egresso da prognie viral. Embora as clulas basais representem a fonte de fatores de replicao, a infeco viral necessita de fatores que somente esto presentes em clulas que esto na fase S, para assegurar a expresso temporal dos genes e a replicao do genoma.

3.1 O ciclo replicativo


O ciclo replicativo dos PpVs est estreitamente associado com o processo de diferenciao

3.2 O genoma dos PpVs


A Figura 6.5 apresenta a organizao do genoma do papilomavrus bovino tipo 1 (BPV-1).

148

Captulo 6

Os genes do PpVs so classicados em iniciais (E) ou tardios (T) e, ao contrrio dos PoVs, so codicados em apenas uma das tas do DNA genmico. Assim, a transcrio do DNA viral realizada em apenas uma direo. Uma regio no-traduzida, conhecida como regio longa de controle (LCR), contm as seqncias regulatrias, incluindo a origem da replicao do DNA e enhancers para a transcrio. Seis diferentes promotores foram identicados no genoma do BPV-1. Entre os diferentes PpVs, existe uma variabilidade muito grande dos promotores, provavelmente reetindo os aspectos peculiares de regulao em diferentes espcies ou em diferentes stios de replicao.

E6 LCR
P7185 PL
CE

E7
P7940 P89

E8
7946/1 1000

AL

P890

L1

7000

E1
6000

BPV-1

2000

P2443
5000 3000

L2
4000

P3080

AE

E3 E5 E4 E2

Fonte: adaptado de Fowley e Lowy (2001).

Figura 6.5. Estrutura e organizao do genoma do papilomavrus bovino tipo 1 (BPV-1). LCR: regio longa de controle (contm a origem de replicao); CE: enhancer constitutivo; P: promoters (os nmeros indicam a posio no genoma); AE: stio de poliadenilao dos transcritos iniciais; AL: stio de poliadenilao dos transcritos tardios; E1 a E8: mRNAs dos genes iniciais; L1 e L2: mRNAs dos genes tardios.

o diferencial de mRNAs em diferentes clulas. Os mRNA dos PpVs so policistrnicos, ou seja, contm mais de uma seqncia codicante (open reading frame, ORF). No entanto, apenas uma dessas ORFs traduzida de cada mRNA. Nos PpVs de humanos e de bovinos, os primeiros genes a serem expressos so o E1 e E2, pela RNA pol II, com o auxlio de fatores de transcrio especcos de queratincitos. A protena E2 desempenha um papel fundamental na transcrio e na replicao do DNA. Essa protena contm uma regio para a ligao no DNA e outra com funo de ativao da transcrio. A E2 se liga especicamente em determinados promotores no LCR e controla positiva e negativamente a expresso dos genes iniciais, dependendo da sua concentrao e das interaes de suas regies regulatrias com o DNA. Essa regulao ainda mais complexa devido presena de diferentes isoformas da E2, que, provavelmente, possuam diferentes propriedades regulatrias. Por outro lado, a nica e importante funo da E2 na replicao do genoma estimular a ligao da E1 ao DNA, principalmente no incio da infeco, quando a concentrao da E1 ainda baixa. A E1 a maior e mais conservada protena dos PpV. a nica protena viral diretamente envolvida na replicao do DNA viral. Essa protena apresenta atividade ATPase/helicase e forma hexmeros simples e duplos ao redor do DNA viral. Alm disso, a E1 forma complexos com protenas do hospedeiro que esto envolvidas com a replicao do DNA, incluindo as subunidades da DNA polimerase , a RPA e chaperone Hsp40. Portanto, a E1 dos PpV semelhante ao antgeno lT dos poliomavrus com relao atividade enzimtica, capacidade de recrutar fatores celulares e no papel fundamental na iniciao da replicao do genoma viral.

3.4 Replicao do DNA e interferncia com o ciclo celular


O resultado da atividade conjunta da E1 e E2 a formao do complexo de iniciao que se liga na origem de replicao do DNA. Esse evento precede e permite a elongao da cadeia, resul-

3.3 Expresso dos genes iniciais


A expresso dos genes dos PpVs complexa, em razo da presena de mltiplos promotores, de stios de splicing alternativo e pela produ-

Replicao dos vrus DNA

149

tando na produo das cpias de DNA a serem encapsidadas na prognie viral. importante salientar que todas as fases da replicao do DNA viral ocorrem em sincronia com a replicao dos cromossomos da clula hospedeira. A replicao do DNA viral no compartimento basal produz entre 20 e 100 cpias do genoma, que so mantidos como DNAs extracromossmicos no ncleo da clula hospedeira. Os genomas virais so elmente distribudos entre as clulaslhas, e o processo de replicao s reiniciado nos queratincitos em estgios avanados de diferenciao (Figura 6.6). A amplicao dos genomas virais que ocorre em queratincitos diferenciados, denomi-

nada replicao vegetativa do DNA, representa um desao para o vrus, pois essas clulas encontram-se na fase G0 do ciclo celular. Acredita-se que duas pequenas protenas virais, a E6 e a E7, sejam responsveis pela criao de um ambiente favorvel para a replicao vegetativa. Essas protenas tambm desempenham um papel central na transformao celular e na induo de neoplasias, especialmente nos PpVs humanos de alto risco. De fato, sabe-se muito mais sobre o papel dessas protenas na transformao celular do que em infeces produtivas. Por isso, deve-se analisar com cautela as informaes a respeito do provvel papel da E6 e da E7 na infeco produtiva no contexto da replicao vegetativa do DNA.

Vrus introduzido por microleses

Diferenciao dos queratincitos


Estrato crneo Camadas granulares

Replicao dos papilomavrus


Liberao de vrions maduros Vrions maduros

Camadas espinhosas superiores

Morfognese dos vrions Produo das protenas tardias Amplificao vegetativa do DNA Nveis altos de protenas iniciais (E4)

Camadas espinhosas inferiores Clulas amplificadores em trnsito (mitticas) Clulas basais e de reserva
(substituem as amplificadoras)

Protenas dependentes da diferenciao E6 e E7 Protenas iniciais E1, E2, E3 e E4 Possvel stio alternativo de infeco Protenas iniciais E1 e E2 Infeco primria Estabelecimento da replicao Protenas iniciais E1 e E2

Membrana basal Derme (tecido conjuntivo, fibroblastos, endotlio vascular)

Fonte: daptado de Chow e Broker (1997).

Figura 6.6. Diferenciao do epitlio cutneo e etapas da replicao dos papilomavrus em infeces benignas (notumorais). As fases de diferenciao celular esto apresentadas esquerda da figura; e as etapas do ciclo replicativo esto apresentadas direita.

150

Captulo 6

De forma semelhante ao antgeno lT dos PoVs, as E6 e E7 dos PpVs interagem com as protenas celulares pRb e p53, que so protenas antioncognicas envolvidas no controle do ciclo celular. Quando a E6 expressa em camundongos transgnicos, ocorre a hiperproliferao do epitlio e o desenvolvimento de tumores epiteliais. Esses efeitos dependem parcialmente da habilidade da E6 de se ligar p53 e recrutar uma ligase celular, que adiciona uma ubiquitina, a p53, direcionando-a a degradao. A E6, ento, ao remover a p53, que envolvida no controle do ciclo celular, estimularia a clula a entrar em fase S e retardaria a apoptose. Estudos recentes sugerem que, alm dos efeitos mediados pela interao com a p53, a E6 pode interferir com o ciclo e na sobrevivncia celular por outros mecanismos. A E6 induz a hiperfosforilao e inativao da pRb, o que importante para entrada da clula na fase S. Tambm induz a expresso da telomerase, uma enzima que replica as extremidades do DNA e impede o encurtamento dos cromossomos aps a diviso celular. A inativao da pRb e a expresso da telomerase so importantes no processo de imortalizao de clulas pelos PpVs. Alm disso, a E6 pode interagir com a BAK, que uma protena pr-apoptose, que expressa em altos nveis na camada apical do epitlio estraticado. Assim como a p53, a interao da E6 com a BAK resulta na ubiquitinao e posterior degradao da BAK. Por induzir a degradao da p53 e BAK, a E6 impede ou reduz a probabilidade da clula infectada sofrer apoptose em resposta infeco, aumentando o tempo para o vrus completar o seu ciclo replicativo. A E7 interage com vrias protenas celulares envolvidas no controle do ciclo e na diferenciao celular, incluindo os membros da famlia das protenas pRb, as deacetilases de histonas, as ciclinas, cdks e fatores de transcrio da famlia dos AP-1. Embora o signicado de vrias dessas interaes permanea incerto, sabe-se que a ligao da E7 com a pRb resulta na degradao da pRb e na conseqente liberao do fator de transcrio E2F. A interao da E7 com fatores de transcrio AP-1 est associada com a modulao da transcrio de genes envolvidos com resposta inicial a sinais mitognicos.

Em resumo, a E6 e a E7 atuam sobre reguladores importantes do ciclo celular e da sobrevivncia das clulas infectadas, com o objetivo de proporcionar tempo suciente para assegurar a replicao e produo de prognie viral em clulas diferenciadas. A progresso do ciclo e a diferenciao celular so eventos mutuamente excludentes. De fato, a progresso no-programada do ciclo celular em clulas diferenciadas geralmente leva morte celular. Assim, a E6 e a E7, ao inuenciarem simultaneamente o ciclo celular e o mecanismo de sobrevivncia, so capazes de resolver o impasse que levaria morte celular. Alm do papel da E6 e E7, experimentos in vitro tm demonstrado que a E5 do BPV-1 ativa o receptor para o fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), uma protena que se liga ao PDGF e proporciona o sinal mitognico. Assim, por mimetizar o PDGF, a E5 capaz de criar sinais adicionais para criar um ambiente de fase S propcio replicao viral.

3.5 Expresso dos genes tardios


A transcrio dos genes tardios controlada por um promotor, que estimulado por fatores de transcrio presentes somente em queratincitos em fase nal de diferenciao. Isso pode explicar porque a sntese das protenas estruturais e a morfognese das partculas virais ocorrem apenas em clulas diferenciadas. No entanto, evidncias indicam que a expresso dos genes tardios em queratincitos menos diferenciados reprimida por fatores do hospedeiro. Isso indica que a regulao dos genes tardios e a conseqente continuao do ciclo podem estar sujeitas tanto a regulao positiva como negativa, ambas dependentes de condies e fatores associados com o estgio de diferenciao celular. O mesmo promotor tardio direciona a sntese de mRNAs que codicam a E4, uma das protenas menos conservadas dos PpV. Dessa forma, embora o gene da E4 esteja localizado na regio dos genes iniciais, expresso em fases tardias. O gene da E4 completamente sobreposto ao gene da E2. No entanto, a sua seqncia de aminocidos codicada por uma ORF diferente, fazendo com que as seqncias de aminocidos da E2 e

Replicao dos vrus DNA

151

da E4 sejam completamente diferentes. A E4 se associa com a queratina e, quando expressa em altos nveis, pode induzir o colapso da cadeia de queratina. Com base nessas observaes, provvel que a E4 participe da replicao, facilitando o egresso das partculas vricas.

3.6 Concluses
Os PpVs dependem da diferenciao do epitlio para completar o seu ciclo de replicao, e a expresso dos seus genes regulada medida que as clulas basais migram em direo superfcie do epitlio. Os produtos virais no apenas controlam a expresso gnica dos genes virais e a replicao do DNA viral como tambm modulam o ciclo celular e os programas de apoptose para assegurar a produo de prognie viral. Em algumas circunstncias, infeces abortivas, sem a realizao completa do ciclo replicativo viral, podem ocorrer. A exemplo de outros vrus DNA pequenos, essas infeces abortivas podem resultar em transformaes neoplsicas.

4 Adenovrus
A Adenoviridae uma famlia de vrus DNA grandes, no-envelopados, que infectam vertebrados e produzem enfermidade leve no trato respiratrio, gastrintestinal e genitourinrio. Os adenovrus (AdVs) possuem a capacidade de infectar uma grande variedade de clulas que no esto em diviso. Por isso, tm sido muito utilizados como vetores para a transferncia de genes e tambm para vacinas vetoriais. Por essas razes, a biologia molecular dos AdVs conhecida com detalhes.

de mediar a importao do genoma viral para o ncleo da clula hospedeira. A expresso gnica do AdVs divide-se em fases inicial e tardia. As protenas iniciais so necessrias para a transcrio dos genes virais e para a replicao do DNA. Tambm esto envolvidas com a interferncia com os mecanismos inamatrios e de apoptose desencadeados pelo hospedeiro. Aps a replicao do DNA, ocorre a expresso dos genes tardios, cujos produtos so, em sua maioria, componentes estruturais das partculas vricas. O ciclo replicativo se completa em 20 a 24 horas e resulta na produo de aproximadamente 104 partculas vricas por clula infectada. Embora a diviso da expresso gnica em fases inicial e tardia seja conveniente do ponto de vista didtico, o limite exato entre essas fases no claro. Por exemplo, alguns genes iniciais continuam a ser expressos em fases tardias da infeco; e baixos nveis de expresso de genes tardios podem ser detectados j no incio da infeco. Essa sobreposio da expresso gnica inicial/ tardia tambm observada durante a replicao de outros vrus DNA.

4.2 O genoma dos AdVs


Os genomas dos AdVs de mamferos so constitudos por molculas lineares de DNA de ta dupla, com aproximadamente 35 kb. Seqncias repetidas invertidas (ITRs) com 36 a 200 pb so encontradas nas regies terminais do genoma. O genoma encontra-se associado com quatro protenas virais (V, VII, X and TP) para formar o ncleo (ou core) da partcula viral. A protena V provavelmente medeia as interaes entre o ncleo e o capsdeo. Maiores detalhes da estrutura das partculas vricas dos adenovrus esto apresentados no Captulo 16. Embora a organizao genmica seja conservada dentro dos gneros, diferenas importantes podem ser observadas entre vrus de gneros diferentes. A maioria dos genes gnero-especcos se localiza prxima s extremidades do genoma, enquanto os genes conservados na famlia tendem a se concentrar na regio central. Essa caracterstica tambm observada em outros vrus

4.1 O ciclo replicativo


Aproximadamente aps 40 minutos da penetrao na clula, os vrions podem ser observados prximos ao ncleo. A internalizao parece ativar a protease viral L3, que inicia o desmonte da partcula vrica. A protena terminal (TP), que uma protena que est associada de forma covalente na extremidade 5 do genoma, contm sinais de localizao nuclear, que so encarregados

152

Captulo 6

DNA de ta dupla lineares, como os poxvrus e herpesvrus. Nessas famlias, vrios genes gnero-especcos esto envolvidos nas interaes do vrus com o hospedeiro, provavelmente para favorecer a sua sobrevivncia em determinados nichos biolgicos. Alguns desses genes parecem ter sido capturados do hospedeiro em um passado remoto. O genoma dos AdVs codica aproximadamente 45 protenas, das quais apenas 12 so encontradas nos vrions. Os genes virais so organizados em unidades de transcrio, cuja expresso regulada temporalmente. Cinco unidades E1A, E1B, E2, E3 e E4 so expressas em fases iniciais e uma (L) expressa tardiamente na

infeco. Duas pequenas unidades (IX e Iva2) so expressas em fases intermedirias. O genoma do AdV humano pode ser descrito como um bloco central de genes com orientao para a direita, interrompidos por genes iniciais da regio E3 na mesma cadeia, e por genes E2 na cadeia oposta. A regio terminal direita ocupada pelos genes E4, e, esquerda, pelos genes E1A and E1B e dois genes intermedirios (Figura 6.7). Vrios mRNA so produzidos a partir de cada unidade transcripcional. Com poucas excees, os transcritos primrios das vrias unidades so processados por splicing. De fato, uma das mais importantes contribuies dos AdVs para a

Leader:

2 i

3 x y z

L5

L4 ML L3

L2 E3 (tardio)

L1 IX E1B VA E1A

E3 L1 (iniciais)

10

20

30

40

50

60

70

80 E2A

90

100

E2B IV a2 E4

Fonte: adaptado de Shenk (2001).

Figura 6.7 Estrutura do genoma e mapa de transcrio dos adenovrus. A linha dupla representa o genoma. Os nmeros abaixo representam as unidades genmicas. Os transcritos iniciais (E: early) so representados por setas finas; os transcritos tardios (L: late) so representados por setas espessas. A extenso das setas corresponde regio codificante dos mRNAs. A maioria dos transcritos tardios inicia na regio prxima unidade 16 do mapa e contm uma regio lder composta por trs seqncias (1, 2 e 3). As regies entre as seqncias lder e as respectivas setas so removidas por splicing (representam os ntrons).

Replicao dos vrus DNA

153

Biologia foi a descoberta do splicing de RNA realizada durante estudos de expresso gnica. A maioria das unidades de transcrio codica uma srie de polipeptdeos com funes relacionadas. Por exemplo, a unidade E1A codica duas protenas que ativam a transcrio e induzem a clula hospedeira a entrar na fase S, enquanto a E2 codica trs protenas que atuam na replicao do DNA viral.

4.3 Expresso dos genes iniciais


A regio da E1A, a primeira unidade transcripcional a ser expressa, resulta em um transcrito primrio nico, que processado por splicing diferencial em dois mRNAs. Os seus produtos, as protenas 12S e 13S (em razo de diferenas no coeciente de sedimentao dos mRNA), so idnticas, com exceo de 46 aminocidos adicionais presentes na E1A 13S. Uma funo importante das protenas E1A estimular a transcrio generalizada de genes virais. Essa funo depende da habilidade das protenas E1A de se ligarem em uma variedade de fatores regulatrios da transcrio celular, como as protenas CREB, AP1 e fatores basais de transcrio como a protena ligante do TATA (TBP). A ligao da E1A nesses fatores mediada pelos domnios conservados CR1 e CR2 (12S e 13S) e CR3 (somente na 13S). Uma interao crtica ocorre entre o CR3 e a subunidade mediadora MED23, que estimula a montagem do complexo de pr-iniciao nos promotores dos genes iniciais e, provavelmente, tambm aumente a taxa de incio da transcrio desses genes. As protenas E1A tambm desempenham um papel importante de induo do ciclo celular. A exemplo dos poliomavrus, as protenas iniciais dos AdVs focalizam a sua ao nos reguladores principais do ciclo celular, a pRb e p53. A interao entre as E1A e a pRb resulta na dissociao dos complexos E2F-pRb e ativao da transcrio de genes cujos produtos promovem a entrada na fase S. Interessantemente, a E2F tambm se liga e ativa os promotores da E1 e E2. Isso provavelmente represente um mecanismo para coordenar a progresso do ciclo celular com a expresso gnica e replicao do DNA viral.

As protenas E1A inibem a p300/CBP, uma protena que modica a estrutura da cromatina para facilitar a atividade de fatores de transcrio, como a p53. Ao se ligar na p300/CBP, as protenas E1A antagonizam a ao da p53, liberando o bloqueio para a progresso do ciclo celular. Alm disso, a E1B de certos AdVs pode se ligar diretamente e bloquear a p53. A razo por que os AdVs (e tambm os polioma e papilomavrus) utilizam dois mecanismos para estimular o ciclo celular desconhecida. Uma possibilidade que, in vivo, podem existir clulas nas quais um dos mecanismos mais eciente do que o outro. Uma anlise mutacional demonstrou que, embora a ligao da E1A nas protenas pRb ou p300/CBP possa induzir a sntese de DNA em clulas quiescentes, ambas as regies so necessrias para induzir a fase M, sugerindo que eventos tardios do ciclo celular so, provavelmente, requeridos para assegurar uma replicao viral eciente. Funes virais que induzem a progresso do ciclo celular esto envolvidas na transformao de clulas de cultivo por alguns sorotipos dos AdVs. No entanto, nenhum AdV tem sido associado com tumores em seu hospedeiro natural. Os AdVs induzem apoptose na clula hospedeira em fases iniciais da infeco, principalmente atravs de efeitos indiretos da E1A. Por outro lado, vrias protenas virais, incluindo as E1B/55 kDa, E1B/19 kDa e E4orf6, atuam bloqueando a apoptose por vrios mecanismos. A E1B e E4orf6 bloqueiam o mecanismo pr-apopttico dependente da p53, ligando-se e inativando essa protena. A E1B/19 kDa semelhante protena celular antiapopttica Bcl-2, que se localiza na membrana mitocondrial e impede a ativao da caspase9, uma efetora da apoptose. Mutantes do AdVs defectivos na E1B/19 kDa induzem morte celular rpida, resultando em produo de prognie viral em quantidade reduzida quando comparada com o vrus de campo. A sobrevivncia das clulas infectadas tambm depende da interferncia com sinais de morte celular induzidos pela resposta imune. A E3 19 kDa uma glicoprotena transmembrana que ca retida no retculo endoplasmtico (RE) e cujo domnio luminal se liga em molculas do MHCI, provocando a sua reteno no RE. A E3 19 kDa

154

Captulo 6

tambm se liga no complexo TAP e o impede de transferir peptdeos ao MHC-I. O efeito dessas atividades a proteo das clulas infectadas do reconhecimento e lise mediada por linfcitos T citotxicos (CTLs). Os CTLs tambm podem induzir lise celular, desencadeando sinais atravs do receptor de Fas expresso nas clulas-alvo. O complexo viral E3 14.4-kDa/E3 10.4-kDa interfere com a apoptose mediada pelo Fas, induzindo a degradao do seu receptor. Alm disso, esse complexo tambm inibe a lise celular pelo fator de necrose tumoral alfa (TNF), uma citoquina antiviral potente. Provavelmente, as atividades imunomodulatrias das protenas E3 dos AdVs desempenhem importantes funes durante e replicao viral in vivo. Uma das respostas mais precoces contra infeces vricas aquela mediada pelos interferons (IFNs) e , que agem de forma autcrina e parcrina, induzindo um estado de resistncia antiviral nas clulas. Os IFNs atuam por meio de seu receptor, provocando a ativao da transcrio de genes cujos produtos possuem aes antivirais. Elementos-chave nesse mecanismo so as quinases citoplasmticas denominadas STATs, que, uma vez ativadas, so translocadas para o ncleo, onde se ligam e ativam os promotores responsivos ao IFN. As protenas E1A dos AdVs atuam diretamente nos mecanismos mediados pelos IFNs, ligando-se e inativando a STAT1 e, assim, bloqueando a ativao dos genes responsivos aos IFNs. Em resumo, as protenas iniciais dos AdVs atuam para assegurar uma expresso gnica adequada, progresso do ciclo celular e modulao das respostas do hospedeiro, at que o ciclo replicativo seja concludo. Indiretamente, essas atividades contribuem para a disseminao do vrus no organismo do hospedeiro. Estudos de infeces pelos AdVs in vivo tm demonstrado que esses vrus no so inerentemente inamatrios, indicando que conseguem moderar a resposta inamatria do hospedeiro.

51 bp, localizadas nas regies terminais repetidas, servem de origem de replicao (ori). Duas protenas virais codicadas pela regio E2, a protena pr-terminal (pTP) e a polimerase de DNA, se ligam nas primeiras 20 bases da ori. Uma terceira protena da E2, a protena ligante do DNA (DBP), juntamente com fatores celulares, ligamse um pouco abaixo (na direo 3) e interagem com o complexo pTP/polimerase. A principal funo da pTP servir de primer para a iniciao da replicao do DNA viral. Essa protena , posteriormente, clivada para originar a TP, que permanece ligada s extremidades 5 do genoma. A DBP forma multmeros em uma das cadeias do DNA, provocando a separao das cadeias, evento que necessrio para a elongao das cadeias-lhas. A sntese de DNA se inicia na extremidade de uma das cadeias e se prolonga at a outra extremidade, resultando em uma molcula de cadeia dupla recm-replicada e uma molcula parental de cadeia simples. No segundo estgio, a cadeia simples deslocada na reao inicial serve de molde para a sntese da cadeia complementar. Em clulas de cultivo, a replicao do DNA viral se inicia 5 a 10 horas aps a infeco e continua at a morte celular. Uma ilustrao simplicada da replicao do genoma dos AdVs est apresentada na Figura 6.8. Maiores detalhes sobre este mecanismo esto apresentados no Captulo 16.

4.5 Expresso dos genes tardios


O promotor principal tardio exibe um nvel baixo de atividade durante as fases iniciais da infeco e direciona a expresso da protena L1 52/55-kDa. Esta protena se associa com o genoma e o empacota em etapas avanadas do ciclo. medida que a replicao do DNA progride, a atividade do promotor tardio aumenta e se torna centenas de vezes mais ativo em fases tardias da infeco. Esse promotor fortemente ativado pelas protenas E1A, mas as razes de sua ativao tardia so desconhecidas. A transcrio da regio tardia do genoma resulta em um transcrito primrio longo, que processado por poliadenilao em diferentes stios,

4.4 Replicao do DNA viral


A maioria das funes necessrias para a replicao do DNA dos AdVs so codicadas pela regio E2 do genoma. Seqncias especcas de

Replicao dos vrus DNA

155

Primeira etapa
3 5 Tp .pTp
-OH

Segunda etapa
Tp 5 3
OH

.pTp 3
OH

5
-OH

Lineariza

3 5

3 5

5 3

+
5 3

Circulariza

5 3 3 5

3 5

Fonte: adaptada de Flint et al. (2000).

Figura 6.8. Ilustrao esquemtica da replicao do genoma dos adenovrus. Na primeira etapa, apenas uma das cadeias replicada de maneira contnua, a partir de uma das extremidades. A cadeia no-replicada circulariza ento para a formao de uma nova origem de replicao. A replicao desta cadeia inicia na extremidade e prossegue ao longo da cadeia, que, em seguida, assume a topologia linear. Ao final das duas etapas, as duas cadeias de DNA esto replicadas.

e por splicing para gerar vrios mRNA tardios. O acmulo citoplasmtico dos mRNA tardios favorecido por duas protenas virais, a E1B 55 kDa e E4 34 kDa, que facilitam o movimento desses transcritos do ncleo para o citoplasma. Concomitantemente, o transporte de mRNA celulares para o citoplasma inibido. A natureza dessa discriminao (mRNA virais versus mRNA celulares) no completamente conhecida, mas pode envolver a relocalizao de fatores celulares requeridos para o transporte de mRNA nos centros de transcrio virais. Alm disso, os mRNA virais so preferencialmente traduzidos em etapas tardias da infeco, por causa de vrios mecanismos regulatrios

virais. Um desses mecanismos a inativao do fator de iniciao da traduo eIF-4F, que, normalmente, se liga aos mRNA para facilitar a traduo. As extremidades 5 dos mRNA virais tardios contm uma regio no-codicante de 200 nt, que permite a esses mRNA serem traduzidos na ausncia de eIF-4F ativo. Em contraste, os mRNA celulares no so mais traduzidos na ausncia do eIF-4F. A maioria das protenas tardias dos AdVs so componentes estruturais dos vrions e fatores envolvidos na morfognese que, juntamente com a replicao do DNA, produzem o cenrio para a morfognese e egresso da prognie viral.

156

Captulo 6

4.6 Concluses
Os adenovrus codicam uma srie de produtos envolvidos na interferncia com os mecanismos de regulao do ciclo celular. As protenas E1A so ativadores promscuos de vrios genes virais e tambm induzem a clula a entrar em fase S. Por outro lado, os efeitos indiretos dessa ativao podem levar a clula infectada apoptose. Por isso, os AdV codicam tambm produtos com atividade antiapopttica. Com isso, o vrus tem tempo suciente para completar o seu ciclo replicativo. No hospedeiro, os AdVs interferem com o reconhecimento de clulas infectadas pelo sistema imunolgico, tambm com o objetivo de preservar a integridade das clulas infectadas pelo tempo necessrio para a concluso do ciclo. Os AdVs tm sido intensivamente estudados como potenciais vetores para terapia gentica e vacinas contra vrus.

5 Herpesvrus
Os herpesvrus (HVs) so vrus grandes (120-200 nm de dimetro), com envelope, que possuem uma molcula de DNA de cadeia dupla linear como genoma. A famlia Herpesviridae dividida em trs subfamlias, de acordo com aspectos biolgicos e moleculares em comum: Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae. Todos os herpesvrus possuem a capacidade de estabelecer infeces latentes em seus hospedeiros. Os herpesvrus so encontrados em praticamente todas as espcies de vertebrados.

gnie viral infecciosa. A infeco produtiva com produo de prognie incompatvel com a sobrevivncia das clulas e resulta inevitavelmente em lise. Esse ciclo ltico pode ser facilmente reproduzido in vitro pela inoculao de HVs em clulas de cultivo. Aps a replicao ltica inicial, os HVs podem permanecer em determinadas clulas do hospedeiro em um estado no-replicativo durante um longo perodo, provavelmente por toda a vida do indivduo, sem que este apresente sinais da infeco. Essa forma no-produtiva de infeco, que ocorre sem a expresso de genes virais ou produo de prognie viral, denominada infeco latente. No entanto, estmulos especcos muitos deles relacionados ao estresse podem induzir o vrus em latncia a retomar a replicao ativa e, assim, iniciar um novo ciclo de infeco produtiva que culmina com a produo da prognie viral. Essa retomada da replicao ativa denominada reativao. Grande parte dos conhecimentos sobre a replicao produtiva dos HVs foram obtidos a partir de estudos da replicao in vitro pelo herpesvrus humano tipo 1 (vrus do herpes simplex, HSV-1), que o prottipo da famlia Herpesviridae. Em contraste, muito menos se conhece sobre a infeco latente pelos HVs pela diculdade de sua reproduo in vitro.

5.2 O genoma dos HVs


O genoma dos herpesvrus consiste de uma ta dupla linear de DNA com 125 a 240 kb. Os genomas dos HVs so classicados em seis classes (A-F), com base na organizao do genoma presena, nmero e localizao de regies repetidas e terminais (Figura 6.9). Por exemplo, nos genomas da classe E (p. ex.: HSV-1), as seqncias terminais so repetidas em uma orientao invertida e justapostas internamente, dividindo o genoma em uma regio curta (S) e outra longa (L), onde cada regio anqueada por regies repetidas e invertidas. O genoma do herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1) um genoma do tipo D, no qual apenas a regio curta (US) anqueada pelas regies repetidas invertidas (Figura 6.9). Em ambos os casos, os componentes nicos podem estar na mesma orientao ou invertidos em relao ao

5.1 O ciclo replicativo


Os HVs replicam o seu genoma no ncleo da clula hospedeira e utilizam fatores virais e celulares no processo de replicao. Dependendo da expresso de determinados genes e das interaes com a clula hospedeira, os HVs podem apresentar dois tipos distintos de ciclo replicativo. O primeiro ocorre nas clulas epiteliais ou do tegumento durante a infeco aguda inicial, logo aps a penetrao no hospedeiro. A infeco dessas clulas resulta na expresso do conjunto completo de genes virais e na produo de pro-

Replicao dos vrus DNA

157

outro. O DNA extrado dos vrions consiste em populaes equimolares que diferem apenas na orientao relativa dos dois componentes. Os genes presentes nas regies repetidas obviamente se encontram em mais de uma cpia no genoma.

Epstein-Barr (EBV), so sintetizados microRNAs que apresentam potencial para silenciar a expresso de genes celulares e/ou virais.

5.3 Os genes virais


Aproximadamente 30 genes dos HV (denominados centrais ou core genes) so conservados entre os membros da famlia Herpesviridae, ou seja, esto presentes nos genomas de todos os HV examinados at o momento. Os produtos desses genes so responsveis pelo metabolismo dos nucleotdeos, pela replicao do DNA e pela morfognese e estrutura dos vrions. Outros genes so conservados apenas entre membros de uma determinada subfamlia. Por exemplo, os alfaherpesvrus codicam transcritos associados latncia, uma protena do tegumento que ativa a transcrio dos genes iniciais e um regulador da transcrio relacionado ao ICP4 dos HSV-1. Alm desses, vrios outros genes so peculiares a algumas espcies de vrus. Os HVs da subfamlia Gammaherpervirinae, principalmente, codicam genes de origem do hospedeiro, provavelmente adquiridos por retrotransposio de cDNAs. Em alguns casos, os genes virais codicam funes similares as dos correspondentes celulares. Em outros casos, esses genes foram alterados para modicar a sua funo. Por exemplo, o homlogo da ciclina tipo D (no herpesvrus humano tipo 8 [HHV-8]) no responde a sinais que atuariam sobre a verso celular do gene, fazendo com que a ciclina tipo D viral permanea constantemente ativada e capaz de promover transformao celular. Na seo 5.4, ser visto que a aquisio de genes do hospedeiro uma caracterstica marcante dos poxvrus. Cerca de 50% dos genes do HSV-1 no so necessrios para a replicao viral em cultivo celulares, por isso so ditos no-essenciais (NE). No entanto, esses genes so importantes para a replicao e patogenia durante a infeco natural. Vrios genes NE atuam antagonizando os mecanismos de defesa antiviral do hospedeiro e, assim, favorecendo a replicao do vrus. Os HVs so capazes de alterar o ambiente celular para favorecer a sua replicao, provocando a inibio ou induo da sntese de macromo-

A B
R4 R3 UL UL Us Us R2 R1

C D E F

Fonte: adaptado de Roizman e Pellet (2001).

Figura 6.9. Estrutura e organizao dos genomas dos herpesvrus. As linhas representam seqncias nicas; os blocos representam seqncias repetidas. Representantes de cada grupo: A) Herpesvrus do catfish de canal; B) Herpesvrus Saimiri; C) Vrus Epstein-Barr; D) Vrus da varicella-zoster; E) Vrus do herpes simplex; F) Herpesvrus Tupaia. Note que somente os genomas do tipo F no apresentam seqncias repetidas. Os alfaherpesvrus de maior importncia veterinria (herpesvrus bovino tipo 1 [BoHV-1] e vrus da doena de Aujeszky [PRV]) possuem genomas do tipo D.

O genoma dos HVs contm entre 70 e 200 genes, e a maioria destes so monocistrnicos, portanto, codicam apenas uma protena. Os genes esto presentes e so transcritos a partir de ambas as cadeias de DNA. A expresso gnica controlada por promotores com TATA box e a transcrio realizada pela RNA polimerase II celular. Quando os genes so sobrepostos, as suas regies regulatrias esto localizadas na regio codicante do gene adjacente. Uma caracterstica comum dos genomas dos HV a existncia de grupos de transcritos co-terminais da extremidade 3, cada um expressando uma ORF diferente. Ao contrrio dos adenovrus, a grande maioria dos transcritos dos HVs no sofrem splicing. Alguns transcritos de genes dos HV parecem no conter ORFs traduzveis. Um exemplo clssico o transcrito associado com a latncia (LAT) do HSV-1, que o nico RNA viral transcrito durante a latncia desse vrus. No caso do vrus

158

Captulo 6

lculas, induo ou inibio da sntese de DNA celular e, ainda, podem induzir a imortalizao da clula hospedeira. Os HVs podem bloquear a induo de apoptose, ativar os mecanismos mediados pelo interferon e a apresentao de antgenos e mimetizar determinadas funes imunomodulatrias. Uma conseqncia geral dessas atividades o retardamento na erradicao da infeco das clulas hospedeiras, por um perodo suciente para permitir a replicao viral completa ou o estabelecimento da infeco latente.

tras classes de genes virais. Alm do stio para a ligao do complexo VP16/HCF/Oct-1, esses promotores contm stios especcos para a ligao de uma variedade de fatores de transcrio do hospedeiro (Figura 6.10).

Classe do gene IE (ICP4)


- 300

Promotor
TATAA TIF SP1 SP1 SP1 ICP4 SP1 TIF SP1 ICP4

5.4 Expresso gnica


E (TK)

+1

A cintica da expresso dos genes dos HVss durante a infeco aguda produtiva tem sido estudada detalhadamente em cultivo celular, mas acredita-se que variaes possam ocorrer in vivo e tambm entre tipos celulares diferentes. Como na maioria dos vrus DNA, os genes dos HV so expressos sob regulao temporal estrita. Os genes alfa ou de transcrio imediata (IE) so os primeiros a serem expressos, seguidos pelos genes beta ou iniciais (E), gama 1 (parcialmente tardios) e pelos genes gama 2 ou tardios (L). Embora os genes virais sejam transcritos pela RNA polII celular com o auxlio de fatores celulares de transcrio, protenas virais so necessrias e auxiliam em cada etapa de transcrio. Aps a penetrao do vrus, o nucleocapsdeo envolto pelo tegumento transportado para as proximidades dos poros nucleares, de onde o DNA viral translocado para o interior do ncleo e rapidamente circularizado. No HSV-1, a protena VP16 do tegumento liga-se a duas protenas celulares, HGF e oct-1, formando um complexo que se liga especicamente aos promotores dos genes IE, ativando a sua transcrio. A ativao da transcrio dependente da regio C-terminal da VP16, que atua facilitando a reunio dos fatores de transcrio celulares responsveis pela maquinaria de transcrio basal. A dependncia da VP16 parece ser maior em clulas quiescentes e diferenciadas encontradas in vivo. Seis produtos IE so codicados pelo HSV1: os polipeptdeos ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 e 47 e a protena Us1.5. Os promotores desses genes geralmente so mais complexos do que os de ou-

CCATT, SP1 SP1

TATA +1

TATAA Inr

DAS +20

L (UL38)

-30

+1

Fonte: adaptado de Roizman e Knipe (2001).

Figura 6.10. Organizao dos promoters dos genes de transcrio imediata (IE), iniciais (early) e tardios (late) do vrus do herpes simplex (HSV-1). Cada classe representada pelo promotor de um determinado gene. Os retngulos indicam os stios de ligao dos fatores de transcrio/ transativadores. As setas indicam o incio e direo da transcrio. IE: stios para a ligao do complexo VP16/HCF/oct-1 (TIF), do fator de transcrio celular SP1 e do produto do gene ICP4; TATAA (TATA box). Inr: iniciador; DAS.

As protenas IE ICP4, ICP27 e ICP22 regulam a expresso dos outros genes virais e, portanto, so indispensveis para a continuao do ciclo replicativo. A deleo experimental do gene do ICP4, o mais importante transativador viral, resulta em um vrus incapaz de replicar. Outras funes dos genes IE incluem a inibio de splicing de mRNA (ICP27), a modulao do sistema de degradao das protenas celulares (ICP0) e a reduo da expresso das ciclinas indutoras da fase S (ICP22/Us1.5). A expresso das protenas IE alcana o pico mximo em 2 a 4 horas aps a infeco. Como o ICP4 capaz de reprimir a sua prpria expresso, acredita-se que contribua para a supresso dos genes IE, que observada nas fases tardias da infeco.

Replicao dos vrus DNA

159

As protenas codicadas pelos genes E (beta) atingem o pico mximo de sntese cerca de 5 a 7 horas aps a infeco, embora alguns produtos (p. ex.: a subunidade maior da ribonucleotdeo redutase, RR) sejam sintetizados com cintica semelhante aos genes IE. As protenas E apresentam diferentes funes, relacionadas com o metabolismo de nucleotdeos e com a replicao do DNA viral. O seu acmulo nas clulas infectadas prenuncia o incio da replicao do DNA. Os produtos dos genes E envolvidos no metabolismo de nucleotdeos (timidina quinase TK, dUTPase, RR) e aqueles envolvidos na modicao e reparo do DNA (uracil-N-glicosilase e nuclease alcalina) no so essenciais para a replicao viral em clulas de cultivo. Isto se deve ao fato de as clulas em multiplicao expressarem enzimas prprias com atividades semelhantes. No entanto, as protenas E so importantes in vivo e mutaes nos seus genes resultam em vrus que apresentam replicao deciente. Isso faz sentido principalmente nos alfaherpervrus HSV-1 e BoHV-1, que so capazes de infectar diferentes tipos celulares, inclusive neurnios. Os neurnios so clulas diferenciadas que no se dividem e no expressam protenas envolvidas no ciclo celular, incluindo vrias protenas envolvidas no metabolismo de nucleotdeos e na replicao do DNA. Por isso, essas e outras protenas virais podem ser cruciais para possibilitar a infeco de determinados tipos celulares. A expresso dos genes gama 1 inicia em nveis baixos aps o incio da replicao do DNA, mas o seu nvel de expresso aumenta com o avano do processo replicativo. Os genes gama 2 (L) comeam a ser expressos aps a sntese e replicao do DNA viral. A transcrio dos genes tardios ocorre a partir de genomas recm-replicados, localizados em compartimentos de replicao nuclear, nos quais a ICP4 e a RNA polimerase II se localizam. Os promotores dos genes tardios consistem de seqncias regulatrias localizadas a certa distncia dos genes, como tambm de seqncias localizadas na regio 5no-traduzida (Figura 6.10). Alm da ICP4, a transcrio dos genes tardios exige a presena da ICP27, uma protena multifuncional que estimula a transcrio das prote-

nas virais envolvidas na replicao do DNA viral. A ICP27 movimenta-se entre o ncleo e o citoplasma das clulas infectadas, com funes nos dois compartimentos. Evidncias indicam que a ICP27 participa no recrutamento da enzima RNA polimerase II celular para a transcrio dos genes tardios; auxilia na exportao dos transcritos tardios para o citoplasma e estimula a traduo desses mRNA nos poliribossomos.

5.5 Replicao do DNA viral


No incio da expresso dos genes iniciais, as protenas UL9 (protena viral que se liga na origem de replicao), UL29 (protena que se liga em DNA de ta simples) e UL5, UL8 e UL52 (complexo helicase-primase) se dirigem ao ncleo e se associam ao DNA viral, formando estruturas focais chamadas de stios pr-replicativos. Aps o recrutamento do complexo viral de replicao de DNA (UL30/UL42), uma frao dos stios prreplicativos maturam para formar os compartimentos virais de replicao. As funes mais importantes da protena UL9 so a de ligao especca na origem de replicao (ori) e a separao das cadeias de DNA neste stio. Acredita-se que isso favorea a montagem do complexo de iniciao, incluindo a associao da DNA polimerase viral. A sntese da cadeia contnua envolve a separao das cadeias do DNA e a sntese de um primer pelo complexo helicase-primase, a partir do qual a cadeia nascente pode ser sintetizada de forma contnua pela DNA polimerase. A sntese da cadeia descontnua mais complexa e envolve mltiplos ciclos de sntese do primer, extenso, remoo dos primers e ligao dos fragmentos de Okazaki adjacentes. A sntese de DNA viral ocorre pelo mecanismo de crculo rolante (rolling circle), que resulta em molculas longas, contendo vrias unidades do genoma unidas linearmente entre si. Essas molculas contm as quatro possveis formas isomricas do genoma (no caso do HSV-1), que so, ento, clivadas em unidades genmicas, que so encapsidadas nos nucleocapsdeos (Figura 6.1). Os fatores celulares induzidos na fase inicial da infeco, incluindo vrios componentes da maquinaria de reparo do DNA, acumulam-se nos

160

Captulo 6

centros de replicao viral. Esses fatores parecem ser importantes para os centros de replicao do HSV-1 se tornarem funcionais, sugerindo que um estresse celular pode ser necessrio para a replicao eciente dos HVs.

permitir a permanncia do vrus no hospedeiro. A reativao ocasional dessas infeces permite ao vrus ser transmitido e infectar novos hospedeiros, perpetuando-se, assim, na natureza.

5.6 Expresso gnica durante a infeco latente


A expresso de genes virais durante a infeco latente muito restrita e apenas um ou poucos genes virais so transcritos. Por exemplo, durante a latncia em neurnios de gnglios sensoriais, o HSV-1 e o BoHV-1 sintetizam uma srie de transcritos a partir de uma regio bem determinada do genoma (regio associada latncia, LRT; transcrito associado latncia, LAT). As demais regies do genoma permanecem inativas em relao transcrio. A razo dessa restrio da transcrio desconhecida, mas o ambiente neuronal e sinais derivados de clulas do sistema imunolgico tm sido implicados. Vrus recombinantes que possuem mutaes na regio do LAT/LRT so capazes de estabelecerem infeces latentes, mas so defectivos na reativao, o que sugere um papel para esses transcritos na reativao da infeco.

6 Poxvrus
6.1 O ciclo replicativo
Os poxvrus (PoxV) so vrus DNA que realizam o seu ciclo replicativo incluindo a replicao do genoma integralmente no citoplasma, uma propriedade que comum tambm ao vrus da peste suna africana (ASFV), nico membro da famlia Asfarviridae. Como as enzimas celulares que participam da sntese de RNA e DNA esto localizadas no ncleo, os PoxV devem trazer nos vrions as suas prprias enzimas e fatores auxiliares. Esse cenrio ilustra o nvel de independncia relativa que esses vrus conseguiram atingir em relao clula hospedeira. No entanto, embora codiquem grande parte das enzimas e fatores de transcrio, os PoxV ainda so dependentes de vrios fatores auxiliares da clula hospedeira. O ciclo replicativo dos PoxV foi estudado in vitro, utilizando-se o vrus da vaccinia (VV) como modelo. Apesar da sua complexidade, o ciclo replicativo do VV relativamente rpido, e a prognie viral pode ser detectada j oito horas ps-infeco (pi).

5.7 Concluses
Os herpesvrus possuem um genoma mais complexo e codicam vrias protenas envolvidas nos processos replicativos. Com isso, esses vrus so capazes de replicar em uma variedade de clulas, independente do seu estado de diviso ou diferenciao. Ao contrrio do que ocorre com os vrus DNA pequenos (polioma, papiloma e adeno), os HV no necessitam induzir as clulas a entrarem na fase S, pois codicam e/ou trazem nos vrions grande parte dos fatores necessrios replicao de seu genoma. No entanto, dependem da maquinaria celular de transcrio e processamento dos mRNAs. A replicao dos HVs geralmente induz uma supresso da sntese de macromolculas das clulas, geralmente levando a alteraes metablicas incompatveis com a vida celular. O estabelecimento de infeco latente se constitui em uma estratgia muito eciente para

6.2 O genoma dos PoxVs


Mais de 50 seqncias genmicas completas, representando vrios gneros, espcies e isolados de campo dos PoxV j foram obtidas, permitindo uma descrio detalhada da estrutura, organizao genmica e dos genes individuais. O genoma dos PoxV consiste de uma molcula de DNA linear de ta dupla com 130-390 kbp, contendo seqncias repetidas invertidas do tipo hairpin (ITRs) de 0.1 a 12.4 kb nas extremidades (Figura 6.11). Nos Chordopoxvirus (ChPVs), o nmero de genes de aproximadamente 150, embora mais de 300 genes j tenham sido deduzidos no genoma do PoxV do canrio (canaripox). A densidade gnica alta, com uma mdia de um gene por kb.

Replicao dos vrus DNA

161

Repetio invertida
10 kbp

Seqncias nicas
160 kbp

Repetio invertida
10 kbp

Seqncias repetidas 0,9 kbp 1,3 kbp

Seqncias repetidas 1,3 kbp 0,9 kbp

Fonte: adaptado de Murphy et al. (1999).

Figura 6.11. Estrutura do genoma dos poxvrus. O genoma consiste de uma molcula contnua de DNA de fita dupla, sem extremidades livres. Nas duas extremidades, situam-se regies repetidas invertidas de aproximadamente 10 kb cada. As seqncias nicas abrangem o restante do genoma.

Aproximadamente 90 dos 150 genes so conservados no genoma de todos os ChPVs seqenciados at o presente, e codicam produtos que participam da replicao do DNA, da transcrio, da morfognese e da estrutura das partculas virais. Nesses genes, tanto as regies codicantes quanto os promotores so altamente conservados. Em geral, grande parte dos genes conservados esto localizados na regio central do genoma. Os genes localizados entre a regio central e as extremidades do genoma tendem a ser espcie-especcos e codicam protenas cujas funes antagonizam a resposta imune do hospedeiro. Esses genes so chamados coletivamente de genes de virulncia. Esto includos nesse grupo os genes que codicam produtos homlogos s citocinas e quimioquinas do hospedeiro, e genes de receptores de citocinas e quimioquinas que foram adquiridos do hospedeiro e modicados durante a evoluo. Ao contrrio dos genes centrais conservados, vrios genes de virulncia so dispensveis para a replicao viral em cultivo celular.

6.3 Expresso gnica


Como os outros vrus DNA, os PoxVs coordenam os processos de replicao genmica e morfognese por meio de uma regulao temporal da expresso de grupos de genes. A transcri-

o dos genes do VV pode ser dividida em trs etapas: inicial, intermediria e tardia. A transcrio de vrios genes, no entanto, parece no obedecer a essa regulao estrita, ocorrendo continuamente ao longo do ciclo replicativo. Os fatores de transcrio e enzimas necessrias para a transcrio dos genes iniciais esto presentes nas partculas vricas infectantes. Assim, a transcrio desses genes inicia poucos minutos aps a penetrao viral, ainda no interior de partculas parcialmente ntegras e, portanto, antes do desnudamento ser completado. A transcrio inicial resulta na produo de aproximadamente 100 mRNA diferentes, que so exportados do interior dos vrions para o citoplasma para serem traduzidos. Entre as protenas dos genes iniciais esto aquelas envolvidas nos mecanismos de evaso do sistema imunolgico, no desnudamento completo do genoma, na sntese de DNA viral e na regulao da expresso dos genes intermedirios. Os produtos dos genes intermedirios so principalmente fatores de transcrio utilizados para a expresso dos genes tardios. As protenas tardias, por sua vez, esto envolvidas na morfognese, fazem parte da estrutura das partculas vricas e tambm incluem as enzimas e fatores de transcrio que sero includos na prognie viral para o prximo ciclo de replicao. Os genes dos PoxVs so transcritos pela RNA polimerase viral, que composta por nove

162

Captulo 6

subunidades. As duas subunidades maiores apresentam um alto grau de similaridade nos aminocidos, com as subunidades maiores das RNA polimerases de eucariotas e procariotas, mas as duas subunidades menores no apresentam similaridade signicativa com as suas correspondentes. Aproximadamente a metade dos genes do VV pertence ao grupo dos genes iniciais. Os promotores desses genes possuem um resduo de guanina (G) extremamente conservado na posio 21, anqueado por uma regio varivel rica em A-T. A transcrio dos genes iniciais requer a RNA polimerase viral, o fator de transcrio inicial (ou ETF, a nica protena de ligao ao DNA codicada pelos PoxV) e ATP. No modelo atual, o ETF se liga nos promotores iniciais e recruta o complexo da RNA polimerase. A hidrlise de ATP pelo ETF e a sua subseqente liberao do complexo permite a RNA polimerase iniciar a transcrio. Estudos recentes sugerem que vrios fatores de transcrio dos genes iniciais formam complexos que se ligam aos promotores durante a morfognese das partculas virais. Com isso, parte dos fatores necessrios para a transcrio inicial j estaria posicionada nos promotores, permitindo o rpido incio da transcrio, logo aps a penetrao na clula hospedeira. As enzimas virais guanilyl-transferase (capping enzyme), polimerase poly-A e um fator de terminao da transcrio tambm so importantes para a transcrio inicial. A transcrio desses genes termina logo aps o nal das ORFs, em resposta a uma seqncia TTTTTNT (onde N qualquer nucleotdeo), localizada na cadeia de DNA oposta (codicante). At o presente, nenhuma funo da clula hospedeira foi identicada como necessria para a iniciao e terminao da transcrio inicial. Aps o desnudamento completo do genoma, seguem-se as etapas de transcrio dos genes intermedirios, a replicao do DNA e a transcrio dos genes tardios. Os promotores dos genes intermedirios so bipartidos, possuindo um elemento iniciador no stio de iniciao da transcrio e uma seqncia rica em A-T, localizada prxima (na direo 5). A transcrio desses genes requer fatores virais recm-sintetizados, como a

RNA polimerase, fatores ITF-A (helicase), ITF-B (enzima que coloca o cap), VITF-2 (fator derivado do hospedeiro) e B1R (protena quinase viral). Os promotores dos genes tardios tambm so bipartidos e contm um elemento iniciador e uma regio rica em A-T logo acima. Alm da RNA polimerase, trs produtos de genes intermedirios e um produto inicial so necessrios para a transcrio dos genes tardios, embora as funes desses produtos sejam desconhecidas. Um fator de transcrio do hospedeiro tambm parece estar envolvido na transcrio dos genes tardios. A terminao da transcrio dos genes tardios diferente daquela dos genes iniciais, mas tambm requer a participao de produtos virais.

6.4 Replicao do DNA


A replicao citoplasmtica do genoma se constitui em um aspecto nico do ciclo replicativo dos PoxV e ASFV. A replicao do DNA do VV ocorre em fbricas virais, que so reas citoplasmticas totalmente envolvidas por membranas derivadas do retculo endoplasmtico rugoso (RER). O envolvimento dessas reas pelas membranas do RER um processo que se completa em, aproximadamente, 45 minutos a partir do incio da infeco e parece ser inuenciado por protenas virais de membrana. Em etapas tardias da infeco, quando se inicia a morfognese, esses envelopes membranosos do RER no so mais visveis na estrutura celular. Alguns PoxVs codicam enzimas envolvidas na sntese de deoxiribonucleotdeos (dNTPs), para favorecer a sntese e replicao do DNA em clulas que na esto em diviso. No caso do VV, a replicao do DNA ocorre entre 3 e 12 horas psinfeco e resulta na produo de aproximadamente 10.000 cpias por clula, metade das quais sero includas nos vrions. Acredita-se que a replicao do DNA dos PoxV se inicie com uma clivagem em uma das cadeias nas proximidades dos hairpins, seguida de polimerizao seqencial a partir da extremidade 3, deslocamento da cadeia complementar e resoluo por concatmeros (Figura 6.1). A regio terminal de 200 pb do genoma provavelmente serve

Replicao dos vrus DNA

163
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de origem de replicao. A resoluo/separao dos genomas individuais requer uma protena viral tardia, a resolvase. Partculas vricas imaturas, em associao com estruturas membranosas, acabam envolvendo o DNA e amadurecem na forma de vrions de formato retangular. Vrios produtos virais desempenham funes importantes da replicao do genoma do VV, incluindo a polimerase de DNA e um fator de processividade associado; a trifosfatase de nucleosdeos, a protena de ligao em DNA de ta simples, a topoisomerase I, protena quinase e glicosilase de uracil. Mutaes em qualquer desses genes so deletrias para a capacidade dos vrus replicar o seu genoma.

6.5 Concluses
Os PoxVs esto entre os vrus mais complexos de animais e trazem nos vrions e/ou codicam um nmero grande de enzimas e fatores necessrios transcrio, processamento de seus mRNAs e replicao do genoma. Por isso, independem da maquinaria celular de sntese de RNA e DNA e realizam o ciclo replicativo inteiramente no citoplasma da clula hospedeira. Os PoxVs tambm codicam uma srie de produtos que antagonizam a resposta imunolgica do hospedeiro, permitindo, assim, que o ciclo replicativo seja completado com a mnima interferncia dos mecanismos anti-virais. A facilidade da manipulao do genoma, assim como a sua extenso e capacidade de suportar a insero de grandes segmentos de DNA, tm feito dos PoxV vrus adequados para a construo de vetores vacinais.

7 Bibliograa consultada
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REPLICAO DOS VRUS RNA


Maria Elisa Piccone1 & Eduardo Furtado Flores

7
167
167 169 169 169

1 Introduo 1.1 Diversidade de estrutura, organizao e funcionalidade dos genomas


1.2 Stios de replicao 1.3 Indelidade das replicases e diversidade gentica 1.4 Outras protenas virais envolvidas na replicao

2 Vrus com genoma RNA de sentido positivo


2.1 Genomas com uma nica ORF, sem produo de mRNA subgenmicos 2.1.1 Estrutura e organizao do genoma 2.1.2 Traduo e replicao do genoma 2.2 Genomas com mais de uma ORF e produo de mRNAs subgenmicos 2.2.1 Estrutura e organizao genmica 2.2.2 Expresso gnica e replicao do genoma

169
171 171 172 174 174 174

3 Vrus com genoma RNA de sentido negativo


3.1 Vrus com o genoma no-segmentado 3.1.1 Estrutura e organizao do genoma 3.1.2 Transcrio 3.1.3 Replicao do genoma 3.2 Vrus com o genoma segmentado 3.3 Vrus com o genoma ambissense

176
176 177 178 179 180 181

4 Vrus com RNA de ta dupla


4.1 Estrutura e organizao do genoma 4.2 Transcrio 4.3 Replicao do genoma

182
182 183 184

5 Retrovrus 6 Bibliograa consultada

184 185

Responsvel pela seo de vrus RNA de sentido positivo.

1 Introduo
Os vrus RNA compem um grupo amplo e diverso de vrus que infectam desde insetos e plantas at vertebrados superiores. So os nicos organismos que possuem RNA como genoma, e, por isso, precisaram se adaptar a certas condies impostas pelas clulas hospedeiras para poder se multiplicar. As clulas eucariotas no possuem enzimas e reaes para a sntese de RNA a partir de moldes RNA, etapa necessria para a replicao do genoma desses vrus. No entanto, a evoluo viral solucionou este impasse, pois o genoma de um vrus RNA codica a sua prpria enzima replicativa (RNA polimerase dependente de RNA ou replicase). Em alguns vrus RNA, a replicase e os fatores auxiliares para a replicao do genoma so produzidos pela traduo direta do genoma, logo no incio do ciclo replicativo. Em outros vrus RNA, o genoma no traduzido diretamente e os vrions carreiam a enzima replicase e os fatores necessrios para a replicao do genoma. A replicao do genoma dos vrus RNA (com exceo dos retrovrus) ocorre em duas etapas e envolve a sntese de molculas intermedirias (RNA complementar ou antigenmico). O RNA antigenmico serve, ento, de molde para a sntese de RNA de sentido genmico. A sntese de RNA com sentido de mensageiro (mRNA ou sentido positivo) denomina-se transcrio, e a sntese de RNA genmico denomina-se replicao. Na verdade, transcrio e replicao so termos equivalentes utilizados para designar a sntese de molculas de RNA a partir de moldes. A mesma enzima replicase, possivelmente assistida por uma combinao diferente de fatores auxiliares ou submetida a modicaes qumicas, responsvel tanto pela transcrio como pela replicao. O complexo enzimtico envolvido na transcrio geralmente chamado de transcriptase; e o complexo responsvel pela replicao denominado replicase. Os retrovrus apresentam uma estratgia de replicao nica, que difere dos demais vrus RNA. Esses vrus possuem um genoma RNA com sentido positivo, mas que no traduzido diretamente. A replicao do genoma ocorre pela

produo de uma molcula de DNA complementar (provrus) que integrada aos cromossomos celulares. A transcrio desse provrus pela RNA polimerase II celular (RNApol II) resulta na produo do RNA para ser includo como genoma nas partculas vricas. A natureza do seu genoma resultou em algumas conseqncias biolgicas e evolutivas para os vrus RNA: a) a maioria deles realiza o seu ciclo replicativo inteiramente no citoplasma das clulas hospedeiras, b) poucos deles utilizam o processamento de RNA (splicing) para a gerao de diversidade de protenas; c) a alta taxa de erro das replicases virais, associada com a ausncia de autocorreo, resulta em uma alta freqncia de mutaes, o que contribui para a grande variabilidade gentica e antignica desses vrus.

1.1 Diversidade de estrutura, organizao e funcionalidade dos genomas


Os genomas dos vrus RNA de animais so todos compostos por molculas lineares, porm, apresentam diferenas quanto funcionalidade, estrutura e organizao (Tabela 7.1). A distino inicial se refere funcionalidade do genoma, ou seja, existem vrus com genoma RNA de sentido (ou polaridade) positivo e negativo. Os vrus RNA de sentido positivo possuem as seqncias codicantes de protenas (open reading frames, ORFs) no mesmo sentido do genoma, ou seja, o seu genoma pode ser diretamente traduzido em protenas pelos ribossomos. Dentre estes, duas propriedades principais so reconhecidas: alguns vrus possuem uma nica ORF no genoma e outros genomas possuem mais de uma ORF e produzem RNAs mensageiros subgenmicos (mRNAsg). Os RNAs genmicos dos vrus RNA de sentido negativo no apresentam as ORFs na mesma orientao do genoma, assim, no podem ser diretamente traduzidos em protenas. As ORFs esto presentes no RNA complementar, de sentido antigenmico. Ento, a produo de suas protenas depende inicialmente da sntese de mRNAs pela polimerase viral trazida nos vrions. Dentre esses vrus, existem alguns cujo genoma composto por uma molcula contnua de RNA

168

Captulo 7

e outros cujo genoma dividido em dois ou mais segmentos. Dentre os vrus com o genoma segmentado, existem alguns que possuem o genoma ambissense, ou seja, codicam as suas protenas por ORFs existentes tanto no RNA de sentido genmico quanto no RNA complementar. Todos os genomas dos vrus RNA (sentido positivo e negativo, segmentados ou no) so compostos por molculas de RNA de ta simples (ssRNA). Um terceiro grupo formado por vrus que possuem ta de RNA de cadeia dupla (dsRNA) segmentada como genoma. Estes vrus tambm trazem a enzima polimerase nos vrions, que necessria para a transcrio e replicao dos segmentos genmicos.

Os retrovrus representam uma exceo entre os vrus RNA. O seu genoma possui polaridade positiva, porm no traduzido diretamente pelos ribossomos. A replicao dos retrovrus envolve a transcrio reversa (sntese de DNA a partir de RNA), integrao do DNA proviral nos cromossomos da clula hospedeira e transcrio do provrus pelo aparato celular de transcrio. Apesar dessa diversidade, praticamente todos esses vrus convergem para um evento central comum: a produo de mRNA reconhecveis e traduzveis pela maquinaria celular de traduo. A nica exceo composta pelos genes que codicam protenas no-estruturais (e estruturais em alguns casos) entre os vrus RNA de sentido positivo, que podem ser traduzidos diretamente do genoma.

Tabela 7.1. Classificao dos vrus RNA de acordo com a estrutura, organizao e polaridade do genoma e local intracelular de replicao

RNA genmico
Famlia
Picornaviridae Flaviviridae Caliciviridae Astroviridae Togaviridae Coronaviridae Arteriviridae Retroviridae Birnaviridae Reoviridae Rhabdoviridae Filoviridae Bornaviridae Paramyxoviridae Orthomyxoviridae Bunyaviridae Arenaviridae

Replicao
Segmentos
1 1 1 1 1 1 1 2 (idnticos) 2 10-12 1 1 1 1 7-8 3 2

ss/ds
ss ss ss ss ss ss ss ss ds ds ss ss ss ss ss ss ss

Polaridade
Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva Ambas Ambas Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa ou ambissense Ambissense

Topologia
Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear Linear

Local intracelular
Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Ncleo/citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Ncleo Citoplasma Ncleo Citoplasma Citoplasma

Replicao dos vrus RNA

169

1.2 Stios de replicao


Com exceo dos vrus das famlias Orthomyxoviridae e Bornaviridae, cuja replicao do genoma ocorre no ncleo; e dos retrovrus, em que o ciclo replicativo ocorre parte no citoplasma e parte no ncleo, os demais vrus RNA realizam o seu ciclo replicativo inteiramente no citoplasma da clula hospedeira. Esses vrus so, portanto, independentes da maquinaria nuclear de sntese e processamento de RNAs. Os ortomixovrus replicam o genoma no ncleo e so dependentes de oligonucleotdeos com cap, que so subtrados dos mRNA celulares. Estes vrus, alm dos retrovrus, dependem ainda da maquinaria de processamento de mRNAs celulares (splicing) para o processamento de alguns de seus transcritos. Alguns vrus RNA que replicam no citoplasma (paramixovrus) utilizam mecanismos alternativos para modicar os seus transcritos e produzir diferentes protenas a partir de um mesmo gene.

rus possui implicaes importantes na epidemiologia, patogenia, diagnstico e para a produo de vacinas.

1.4 Outras protenas virais envolvidas na replicao


Alm das replicases, outras protenas que participam da sntese de RNA so codicadas por esses vrus. As funes exercidas por essas protenas so diversas e incluem: a) direcionamento da polimerase e/ou do genoma aos locais da clula onde ocorre a replicao; b) facilitao do reconhecimento do stio de iniciao da sntese de RNA pela polimerase; c) encapsidao do genoma RNA para a transcrio e replicao; d) aumento da anidade da polimerase pelo RNA; e) aumento da atividade da polimerase; f) separao das cadeias de RNA para a polimerizao (atividade de helicase); g) alterao da especicidade da polimerase pelo molde RNA (troca de transcrio para replicao). Ou seja, esses vrus codicam uma srie de protenas, algumas com atividades enzimticas, que atuam como co-fatores no processo de sntese de RNA e replicao do genoma. Alm de protenas, a sntese de RNAs virais envolve a participao de componentes celulares, denominados genericamente fatores do hospedeiro. A especicidade, as etapas de participao e a dependncia relativa de fatores do hospedeiro para a sntese de RNA viral variam entre os vrus.

1.3 Indelidade das replicases e diversidade gentica


As replicases dos vrus RNA (RNAs polimerases dependentes de RNA) apresentam uma taxa de erro aproximadamente 1.000 a 10.000 vezes superior s polimerases de DNA. Alm disso, essas enzimas no possuem a atividade de proofreading (correo de nucleotdeos incorretos adicionados durante a sntese). O resultado disso que pelo menos uma mutao em ponto pode ser introduzida a cada replicao do genoma, o que tem uma grande implicao para a diversidade e evoluo desses vrus. Como conseqncia, uma populao de vrus RNA no constituda por uma prognie clonal homognea, e sim por uma mistura de variantes agrupados em torno de uma seqncia predominante e mais abundante. Essa populao heterognea de vrus que compe uma espcie viral denominada quasi-species. A gerao contnua dessa populao heterognea se constitui em uma grande vantagem evolutiva para os vrus RNA, pois permite que variantes geradas ao acaso possam apresentar vantagem evolutiva e rapidamente se sobressair na populao quando submetidos determinada presso de seleo. A rpida taxa de evoluo desses v-

2 Vrus com genoma RNA de sentido positivo


Por denio, esses vrus codicam as suas protenas no sentido do RNA genmico, ou seja, as seqncias abertas de leitura (ORFs) que codicam as protenas virais esto presentes na mesma orientao do genoma. Por isso, o RNA genmico pode ser usado como mRNA e ser diretamente traduzido pelos ribossomos. Os vrus desse grupo possuem algumas caractersticas em comum: a) replicam no citoplasma da clula hospedeira; b) o RNA genmico serve de mRNA e pode ser traduzido; c) o RNA genmico desprovido de protenas infeccioso quando introduzido

170

Captulo 7

nas clulas; d) as protenas virais so sintetizadas como poliprotenas precursoras. Essas poliprotenas so imediatamente clivadas em protenas individuais por proteases virais e/ou celulares; e) os vrions no contm enzimas. As infeces por vrus RNA de sentido positivo no so exclusivas dos animais, e um grande nmero desses agentes pode infectar tambm bactrias ou plantas, constituindo gneros que so classicados dentro dessas famlias de vrus. Sete famlias de vrus animais possuem genoma RNA de sentido positivo, e todos possuem

o genoma no-segmentado: 1) Picornaviridae, 2) Flaviviridae, 3) Caliciviridae, 4) Astroviridae, 5) Togaviridae, 6) Arteriviridae e 7) Coronaviridae. A replicao do genoma desses vrus envolve a ao conjunta de vrios componentes, que incluem protenas virais, seqncias especcas no RNA viral e, provavelmente, vrios componentes celulares, como protenas e membranas. Uma diferena fundamental entre grupos de vrus RNA de sentido positivo se refere existncia de uma ou mais ORFs no genoma e a produo ou no de mRNAs subgenmicos (Figura 7.1; Tabela 7.2).

Picornaviridae (FMDV)
5' VPg

7 - 8.5kb ORF nica

VP4

VP2

VP3

VP1

2A

2B

2C

3A 3B

3C

3D

polyA 3'

Flaviviridae (gnero Pestivirus, BVDV) 12,3kb


ORF nica
5'
N
pro

ms

E1

E2

NS2-3

NS4-A

NS4-B

NS5A

NS5B

poliC3'

Caliciviridae 7.3 - 8.3kb


5' VPg

ORF1

p32

NTPase

P30

VpG

P76 (Pro - pol)

ORF2 capsdeo

ORF3
poliA3

mRNA subgenmico

Astroviridae
5' VPg

6.8kb ORF1a
Pro

ORF1b
Pol

ORF2
Capsdeo
poliA3'

mRNA subgenmico

Togaviridae 9.7 - 11.8kb


ORF1
Cap 5'

ORF2
NsP4 C E3 E2 E1
poliA3'

NsP1

NsP2

NsP3

mRNA subgenmico

Arteriviridae 13 - 15kb
5 Cap
L L L

ORFs2-7 ORF 1a ORF 1b


a 2b 3 4 5 6 7
3 poliA

mRNA subgenmicos

Coronaviridae
5' Cap
L

27 - 32kb ORF1a

Pol

ORF1b
2 HE

5-7 ORFs
3

poliA

mRNA subgenmicos

Figura 7.1. Estrutura e organizao do genoma dos vrus RNA de sentido positivo. As linhas contnuas representam o RNA genmico; os retngulos representam os genes. A localizao das ORFs e dos mRNA subgenmicos tambm est indicada.

Replicao dos vrus RNA

171

Tabela 7.2. Principais caractersticas do genoma dos vrus RNA de polaridade positiva Genoma (kb) Famlia Extenso (kb) 7,2 - 8,5 9,6 - 12,3 6,8 7,3 - 8,3 13 - 15 9,7 - 11,8 27 - 32 5' Extremidades 3' RNA subgenmicos no no sim (1) sim (1) sim (6) sim (1) sim (5-7)

Picornaviridae Flaviviridae Astroviridae Caliciviridae Arteriviridae Togaviridae Coronaviridae


** Apenas os vrus do gnero Flavivirus. *** Pestivrus, hepacivrus. **** Pestivrus (BVDV).

VPG*, IRES cap**,IRES*** VPG VPG cap cap cap

poliA poliC**** poliA poliA poliA poliA poliA

* Protena terminal associada extremidade 5' do genoma.

Nos vrus que possuem uma nica ORF no genoma, todas as protenas so produzidas pela traduo direta do RNA genmico, originando uma longa poliprotena. Esta poliprotena clivada por proteases celulares e/ou virais, originando as protenas individuais. A clivagem ocorre medida que a traduo vai se desenvolvendo, de modo que a poliprotena inteira nunca detectada nas clulas infectadas. Nesses vrus, os genes que codicam as protenas estruturais esto localizados no tero 5 do genoma; enquanto as protenas no-estruturais inclusive a polimerase viral so codicadas pelo restante do genoma (Figura 7.1). Entre os vrus em que o genoma possui mais de uma ORF, as protenas no-estruturais (e a polimerase) so codicadas na regio prxima extremidade 5 do genoma (dois teros do genoma). Apenas a ORF localizada na regio prxima extremidade 5 traduzida diretamente do RNA genmico, resultando na sntese das protenas no-estruturais, inclusive a polimerase viral. A(s) outra(s) ORF(s) embora estejam presentes no sentido do RNA genmico so expressas a partir de RNAs subgenmicos (mRNAsg), que so produzidos a partir da transcrio das molculas de RNA complementar (antigenmicos), ou seja, esses vrus produzem uma parte de suas protenas (no-estruturais) pela traduo direta

do genoma e outra parte pela traduo de mRNAs subgenmicos (Figura 7.1). Nesta seo, sero apresentados alguns aspectos das principais estratgias utilizadas pelos vrus RNA de sentido positivo para expressar os seus genes e replicar o seu genoma, utilizando exemplos de diferentes famlias.

2.1 Genomas com uma nica ORF, sem produo de mRNA subgenmicos
Importantes vrus animais e de humanos esto includos neste grupo, que composto por membros das famlias Picornaviridae e Flaviviridae. Dentre os patgenos humanos, esto o poliovrus, os rinovrus, os vrus da dengue e febre amarela, e o vrus da hepatite C. Os principais vrus animais deste grupo so: o vrus da febre aftosa (FMDV, um picornavrus), que possui um impacto sanitrio e econmico notvel na bovinocultura e na economia de vrios pases; e os pestivrus (famlia Flaviviridae) vrus da diarria viral bovina (BVDV) e vrus da peste suna clssica (CSFV).

2.1.1 Estrutura e organizao do genoma


O genoma desses vrus contm uma ORF nica e longa, que abrange quase toda a extenso

172

Captulo 7

do genoma (Figura 7.1). Essa ORF anqueada por duas regies no-traduzidas (5UTR, 3UTR), que possuem extenses variveis, de acordo com o vrus (podem atingir at 1.100 nt em alguns picornavrus). A extremidade 5 do genoma possui estruturas especializadas que so importantes para o direcionamento do genoma para o local da replicao (5VPg), para o incio da traduo (cap ou IRES) e replicao. A extremidade 3 poliadenilada ou possui uma seqncia de citosinas, como no caso dos pestivrus (Figura 7.1; Tabela 7.2). A regio 3 UTR geralmente menor e possui seqncias importantes para a replicao do genoma.

2.1.2 Traduo e replicao do genoma


A primeira etapa na replicao desses vrus a traduo do genoma em uma nica poliprotena, que a precursora de todas as protenas virais

(Figura 7.2). Essa poliprotena clivada seqencialmente, medida que produzida, originando os precursores intermedirios e, nalmente, as protenas virais maduras. Nos picornavrus, as clivagens so realizadas essencialmente por proteases virais; nos membros da famlia Flaviviridae, essas clivagens so realizadas por proteases virais e celulares. Uma das protenas maduras produzidas pela traduo do genoma a replicase viral (polimerase de RNA dependente de RNA), que se encarrega de replicar o genoma. A replicao ocorre em duas etapas: a) sntese de uma molcula de RNA complementar (com a extenso do genoma) e b) sntese de cpias de RNA de sentido genmico a partir do RNA complementar. As molculas de RNA de sentido genmico possuem trs funes: a) servem de mRNA para a produo da poliprotena; b) servem de molde para a sntese de RNA complementar; e c) so encapsidadas

ORF nica
5'
VPg

VP4

VP2

VP3

VP1

2A

2B

2C

3A 3B

3C

3D

3'

IRES 5'-3'

Poliprotena
Clivagem

P1

P2

P3

Clivagem Protenas estruturais


L VP4 VP2 VP3 VP1 2A 2B 2C

Protenas no-estruturais
3A 3B

3C

3D

Figura 7.2. Organizao do genoma e expresso gnica de um picornavrus (vrus da febre aftosa, FMDV). A estrutura IRES, reconhecida pelos ribossomos, est demonstrada na regio 5' no-traduzida. A ORF nica e longa traduzida pelos ribossomos em uma longa poliprotena, que vai sendo clivada por proteases celulares medida que produzida. As clivagens seqenciais originam precursores intermedirios e, finalmente, as protenas virais maduras.

Replicao dos vrus RNA

173

como genoma nas novas partculas virais (Figura 7.3). Aps a morfognese dos vrions, ocorre lise celular e a prognie viral liberada. A cintica de replicao dos picornavrus rpida e o ciclo completado em cinco a dez horas. O RNA viral (vRNA) traduzido diretamente pelos polirribossomos, mas, aproximadamente 30 minutos aps a infeco, a sntese de protenas celulares reduzida drasticamente. Essa supresso da sntese protica a causa primria das alteraes morfolgicas celulares que acompanham a infeco, genericamente denominadas como efeito citoptico (ECP). A supresso parece ocorrer pela clivagem de fatores de traduo celulares envolvidos no reconhecimento e ligao s estruturas cap dos mRNAs celulares, evento necessrio para o incio da traduo. Essa clivagem atribuda protease 2A dos rinovrus e enterovrus, e protease L do FMDV. Alguns vrus deste grupo (a maioria dos isolados dos pestivrus) so excees e no so citolticos. Embora o genoma desses vrus se comporte como mRNA e possa ser traduzido em protenas, a sua estrutura diferente dos mRNA celulares. Alm de codicar as protenas virais, esta molcula possui importantes seqncias conservadas e estruturas secundrias na regio 5 no-traduzida (UTR). Entre as estruturas funcionais mais im-

portantes desta regio, destaca-se uma estrutura secundria altamente complexa denominada Internal Ribosomal Entry Site (IRES). Esta estrutura direciona os ribossomos ao cdon de iniciao da traduo, sobrepondo-se ao mecanismo usual de iniciao da traduo dos mRNAs celulares. Estruturas IRES j foram identicadas nos genomas dos poliovrus, vrus da encefalomiocardite (EMCV), FMDV, vrus da hepatite A e em alguns membros da famlia Flaviviridae (vrus da hepatite C [HCV] e BVDV). O mecanismo pelo qual o aparato de traduo celular reconhece o IRES permanece desconhecido, mas a participao de vrios fatores de iniciao, alm de outros fatores celulares, tem sido proposta. Ao contrrio dos poliovrus e dos pestivrus, o genoma dos vrus do gnero Flavivirus possui uma estrutura cap na extremidade 5, mas parece ser traduzido por um novo mecanismo que no depende do cap. A regio 5 UTR do genoma dos vrus RNA de sentido positivo tambm contm sinais para a replicao do genoma. O balano entre traduo e replicao parece ser mediado pela interao dessa regio com protenas virais e celulares. Outra estrutura essencial para a replicao, conhecida como sinal cis-acting de replicao (cre), tem sido identicado no genoma de vrios vrus. Essas

RNA genmico (+)

5'-

-3'

Traduo (1)

Encapsidamento (4)

2
Replicao Protenas
3'-

-5'

RNA antigenmico (-)

Figura 7.3. Ilustrao simplificada das etapas de replicao dos vrus das famlias Picornaviridae e Flaviviridae. O genoma RNA , inicialmente, traduzido em protenas (1). A RNA polimerase produzida nesta etapa sintetiza o RNA complementar (2) e, a seguir, cpias de sentido genmico (3). Alm de ser traduzido em protenas, o RNA de sentido genmico serve de molde para a sntese do RNA complementar e, posteriormente, encapsidado nas novas partculas vricas (4).

174

Captulo 7

estruturas, embora aparentemente responsveis pela mesma funo, esto localizadas em regies diferentes dos genomas. A regio 3 UTR do genoma contm estruturas secundrias e tercirias que so importantes durante a replicao do genoma. Acredita-se que ocorre uma interao direta entre as duas UTRs (5 e 3) durante a traduo e replicao, mediada por complexos do RNA com protenas. Existem ainda evidncias de circularizao do genoma do vrus da dengue (um avivrus) atravs de interao fsica entre as UTRs 5 e 3. Durante a sua replicao, os picornavrus induzem a proliferao de estruturas membranosas envolvidas na replicao viral. Essas membranas podem fornecer fatores celulares necessrios para a replicao do RNA. Vrias protenas celulares que interagem com o RNA genmico tm sido identicadas e, em alguns casos, tm sido associadas funcionalmente com a replicao.

poliadenilada. Os genes que codicam as protenas no-estruturais esto localizadas nos dois teros prximos extremidade 5, e os genes das protenas estruturais ocupam o tero restante do genoma. Uma caracterstica comum a todos esses vrus a produo de mRNA subgenmicos (mRNAsg), em nmero e extenso variveis, que so traduzidos nas protenas estruturais.

2.2.2 Expresso gnica e replicao do genoma


A expresso gnica e a replicao do genoma desses vrus apresentam algumas semelhanas com o grupo anterior: a) o genoma serve de mRNA e traduzido diretamente pelos ribossomos; b) a traduo resulta na produo de poliprotenas, que so posteriormente clivadas nas protenas individuais; e c) a replicao do genoma ocorre via produo de um RNA de sentido antigenmico. As principais diferenas se referem organizao do genoma (posio dos genes das protenas estruturais versus no-estruturais), nmero de ORFs e produo de mRNAsg. Dentre esses vrus, os mais estudados so os coronavrus e os togavrus. A seguir, ser descrita a expresso gnica e replicao do vrus Sindbis, um togavrus responsvel por encefalomielite aguda em camundongos e extensivamente estudado como modelo para diversos aspectos da Virologia. O genoma desse vrus contm duas ORFs, cada uma codicando quatro protenas (Figura 7.4). Inicialmente, a ORF situada prxima extremidade 5 do genoma traduzida, resultando na produo de uma poliprotena. Esta poliprotena clivada medida que vai sendo produzida, originando as protenas no-estruturais, incluindo a replicase viral. Esta polimerase sintetiza, ento, uma cpia de RNA de sentido negativo (complementar ou antigenmica) com a extenso completa do genoma. A molcula de RNA complementar serve para dois propsitos: a) molde para a sntese de RNAs de sentido e extenso genmicos que so encapsidados na prognie viral e b) molde para a sntese de mRNAs subgenmicos. Esses mRNAsg so traduzidos em uma poliprotena que origina, por clivagem, as protenas

2.2 Genomas com mais de uma ORF e produo de mRNAs subgenmicos


Vrios patgenos animais e humanos utilizam esta estratgia de expresso gnica e replicao do genoma. Incluem-se entre eles os togavrus Sindbis e vrus das encefalites eqinas (EEEV, VEEV e WEEV), os calicivrus (calicivrus felino, FCV), os coronavrus (vrios patgenos animais e humanos), os arterivrus (PRRSV, vrus da arterite eqina) e os astrovrus. Pela sua organizao genmica e estratgia de expresso similares, os membros das famlias Coronaviridae e Arteriviridae so agrupados na ordem Nidovirales. Os vrus deste grupo de famlias apresentam vrias similaridades de estrutura, organizao genmica e expresso gnica com o grupo anterior, porm tambm apresentam importantes diferenas.

2.2.1 Estrutura e organizao genmica


Os vrus deste grupo possuem molculas de RNA de polaridade positiva como genoma, com extenso entre 6.8 kb (astrovrus) a 32 kb (coronavrus). Dependendo da famlia, a extremidade 5 possui uma protena ligada (VPg) ou uma estrutura cap, enquanto a extremidade 3

Replicao dos vrus RNA

175

Cap

5'

NsP1

NsP2

NsP3 Traduo

NsP4

E3

E2

E1

3'

A(n)

Poliprotena Clivagem
NSP1 NSP2 NSP3
NSP4

Replicao

Protenas noestruturais 3

Transcrio 5

RNA antigenmico (negativo)

Transcrio
Cap

m RNA subgenmico

A (n)

Traduo
Poliprotena

Clivagem
C E3 E2 E1

Protenas estruturais

Figura 7.4. Ilustrao esquemtica da expresso gnica e replicao dos togavrus (vrus Sindbis).

do capsdeo e envelope. Os nucleocapsdeos se formam no citosol, pela associao de mltiplas cpias da protena do capsdeo com o genoma RNA. As glicoprotenas do envelope so inseridas em membranas de organelas celulares, e os vrions maturam por brotamento na membrana plasmtica. A transcrio dos mRNAs (uma nica espcie, no caso dos togavrus) ocorre por iniciao em um stio ou promotor interno. Uma vez sintetizados, esses mRNAsg no so reconhecidos como molde pela polimerase viral e apenas servem para a traduo nas protenas estruturais. Essa estratgia permite a separao temporal da sntese de protenas regulatrias (iniciais) e estruturais (tardias). A replicao desses vrus um pouco mais complexa do que a dos picornavrus, e a clula deve manter a sua integridade para permitir o brotamento contnuo das novas partculas vricas. De fato, a reduo da sntese protica celular muito menos dramtica at mesmo em fases tardias da infeco. A replicao dos calicivrus e astrovrus no tem sido to caracterizada como os togavrus, pois alguns desses vrus no replicam com eci-

ncia em cultivo celular. No entanto, os vrus de ambas as famlias tambm produzem mRNAsg durante a sua replicao. Os coronavrus e arterivrus replicam fazendo uso de um mecanismo similar. Nos coronavrus, uma srie de 5 a 7 mRNAsg sobrepostos so produzidos pela transcrio do RNA antigenmico (Figura 7.1). Cada mRNAsg inicia com uma regio lder 5 idntica (com cap), o que indica um mecanismo mais complexo de iniciao do que o simples reconhecimento de um promotor interno. Todos os mRNAsg possuem a mesma extremidade 3 e so traduzidos em vrias protenas estruturais. A exemplo dos outros vrus RNA de sentido positivo, a replicao desse grupo de vrus ocorre em complexos replicativos associados com membranas intracelulares. As estruturas formadas e a origem das membranas envolvidas, no entanto, variam entre os vrus. Por exemplo, os complexos replicativos de vrios picornavrus e avivrus so associados com o retculo endoplasmtico, enquanto os togavrus utilizam tambm as membranas dos endossomos e lisossomos como stios de replicao.

176

Captulo 7

3 Vrus com genoma RNA de sentido negativo


Os vrus com genoma RNA de sentido negativo apresentam uma maior diversidade do que o grupo anterior. Esses vrus possuem o genoma geralmente mais extenso e codicam um nmero maior de protenas. Essa complexidade pode dever-se s diculdades adicionais da sua expresso gnica e replicao, o que faz com que necessitem codicar mais protenas e com funes diversas. Os genomas dos vrus RNA de sentido negativo no so traduzidos diretamente em protenas, pois no possuem as ORFs no sentido genmico. Ao contrrio, as ORFs esto presentes na ta de RNA complementar (RNA antigenmico). A sntese das protenas virais, portanto, requer a prvia produo de mRNAs. Estes mRNAs so transcritos pela transcriptase/replicase viral, usando o RNA genmico como molde. Como o RNA genmico no traduzido diretamente e assim a polimerase no produzida no incio do ciclo, como no grupo anterior esses vrus necessitam trazer, nos vrions, as enzimas necessrias para a sntese de RNA antigenmico e mRNA. Os vrus RNA de sentido negativo compartilham algumas caractersticas, tais como: a) os vrions contm cpias da enzima replicase; b) o RNA genmico desprovido de protenas no infeccioso; c) so produzidos mRNAs individuais para cada gene, ou seja, so RNAs monocistrnicos; d) os mRNAs possuem 5cap e so poliadenilados (existem excees); e) o genoma permanece associado com protenas durante a transcrio e replicao; f) o RNA genmico de vrios desses vrus forma estruturas semelhantes a cabos de panela (panhandles), pela associao de seqncias complementares presentes nas extremidades. Neste grupo so encontrados vrus com dois tipos de organizao genmica: os vrus com o genoma no-segmentado, ou seja, uma molcula nica de RNA; e os vrus com o genoma dividido em vrios segmentos. A estratgia de expresso gnica e replicao do genoma dos vrus RNA de sentido negativo muito similar. Cada gene origina um mRNA que codica uma protena, ou seja, so mRNAs monocistrnicos. A replicao do genoma ocorre

por meio da produo de uma molcula de RNA complementar (antigenmico), que serve de molde para a sntese de RNA genmico. Nos vrus com o genoma no-segmentado, so produzidos vrios mRNAs de extenso curta, cada um correspondendo a um nico gene. medida que os mRNAs so transcritos, ocorre a atenuao da transcrio, sendo produzida uma quantidade maior de mensageiros dos genes localizados na extremidade 3 do genoma. Esses mRNAs sero traduzidos em protenas. A produo do RNA complementar (intermedirio na replicao do genoma) envolve a transcrio completa do genoma. Para isso, a replicase ignora os sinais de terminao de cada gene e prossegue transcrevendo at a extremidade 5 da molcula molde. Nos vrus com o genoma segmentado, cada segmento genmico codica um ou ocasionalmente dois produtos. Cada mRNA corresponde aproximadamente extenso completa do respectivo segmento genmico. Esses mRNAs possuem 5 cap e so poliadenilados na extremidade 3. Os RNAs antigenmicos que serviro de molde para a sntese de cpias de RNA genmico possuem uma extenso semelhante, mas no possuem cap na extremidade 5 e nem poliA na extremidade 3.

3.1 Vrus com o genoma no-segmentado


Os membros de quatro famlias de vrus possuem genoma RNA negativo no-segmentado (Tabela 7.1). As famlias Paramyxoviridae, Filoviridae, Bornaviridae e Rhabdoviridae compem a ordem Mononegavirales, pelas semelhanas na estrutura e organizao genmica, estratgia de expresso gnica e replicao do genoma e por semelhanas estruturais e funcionais das protenas. Uma caracterstica marcante da replicao desses vrus a grande estabilidade do complexo ribonucleoprotena (genoma + nucleoprotena, RNP). Esse complexo nunca desfeito durante as diferentes etapas do ciclo replicativo, ou seja, a transcrio e a replicao ocorrem utilizando, como substrato (ou molde), um RNA fortemente recoberto por mltiplas cpias da nucleoprotena (N ou NP). Esses vrus apresentam tambm um mecanismo interessante de regulao na trans-

Replicao dos vrus RNA

177

crio dos diferentes genes, chamado de atenuao da transcrio, o que resulta na produo de quantidades de protenas de acordo com a necessidade do vrus. Os bornavrus apresentam alguns aspectos nicos, como a transcrio e replicao nuclear, splicing alternativo dos transcritos primrios policistrnicos, uso diferencial de sinais de incio e trmino de transcrio. Esses aspectos os distinguem dos paramixovrus, lovrus e rabdovrus. As seguir, sero abordados os principais aspectos da expresso gnica e replicao do vrus da estomatite vesicular (VSV), um membro da famlia Rhabdoviridae. Grande parte das informaes se aplica tambm aos outros membros da ordem Mononegavirales.

3.1.1 Estrutura e organizao do genoma


A estrutura e organizao do genoma de vrus representativos das trs famlias que compem a ordem Mononegavirales esto apresenta-

dos na Figura 7.5. Variaes na extenso do genoma, no nmero de genes e na extenso das regies intergnicas (IR) so encontradas nos vrus das diferentes famlias. Porm, todos eles possuem um grupo principal de genes em comum e a organizao genmica muito semelhante. O genoma do VSV formado por uma molcula de RNA linear de ta simples, com aproximadamente 11 kb. Os rabdovrus, em geral, codicam um mnimo de cinco genes, na ordem 3 N P M G L 5, e o VSV codica outras duas pequenas protenas (C e C) em outra fase de leitura do gene P. Nos paramixovrus, vrias protenas so produzidas a partir do gene P, pela utilizao de diferentes cdons de iniciao, traduo de diferentes ORFs e por um mecanismo de edio. Neste mecanismo, so adicionadas uma, duas ou trs guaninas (G) em um determinado ponto do mRNA, resultando em mudana de fase de leitura a partir deste local. Prximo extremidade 3, existe uma regio no-codicante, que transcrita em um polinucleotdeo denominado lder. A seqncia lder possui 47 nt (no

A
Rhabdoviridae (VSV)
(11-15kb) N 3 P M G L 5

B
Paramyxoviridae
(15-16kb) N 3 P/C/V M F H L 5'

C
Filoviridae
(19kb)
NP VP35 VP40 GP VP30 VP24 L

Figura 7.5. Estrutura e organizao do genoma de trs vrus representativos das famlias que compem a ordem Mononegavirales. A) Rhabdoviridae (vrus da estomatite vesicular, VSV); B) Paramyxoviridae (vrus da cinomose, CDV); C) Filoviridae (vrus Ebola). O genoma consiste de uma molcula linear de RNA de polaridade negativa, representada pelo trao contnuo. Os blocos representam os genes, com regies intergnicas (IRs) entre eles. N ou NP): nucleoprotena; P: fosfoprotena (C e V, produtos secundrios do gene P); M (VP40): protena da matriz; G: glicoprotena do envelope; F: protena de fuso; H: protena de ligao aos receptores, hemaglutinina; L: polimerase viral. VP35: cofator para a transcrio e replicao; VP35: cofator para a transcrio e replicao; VP30: nucleoprotena menor; VP24: protena do envelope. O nmero de genes pode variar entre os vrus de cada famlia.

178

Captulo 7

VSV), no possui cap, no poliadenilado e no traduzido em protena. Logo aps, existe um sinal para o incio da transcrio do primeiro gene, que seguida da adio de 5 cap no mRNA resultante. Entre os genes, existem as regies intergnicas (IR), sendo que cada uma possui um sinal para a terminao da transcrio do gene anterior, uma pequena regio interveniente e um sinal para a iniciao da transcrio do gene subseqente (Figura 7.6). Prximo extremidade 5, existe uma regio no-traduzida, denominada trailer. Em todas as etapas da replicao, o genoma permanece fortemente associado com mltiplas cpias da nucleoprotena N, formando o complexo ribonucleoprotena (RNP).

3.1.2 Transcrio
Aps a penetrao e perda do envelope, o nucleocapsdeo (RNA + protena) serve de molde

para a transcrio, que realizada pela replicase viral. O complexo replicase formado pelas protenas L e P. A transcrio se inicia na extremidade 3, a partir de onde a transcriptase sintetiza a seqncia lder de 47 nt. Segue-se, ento, a transcrio individual e seqencial de cada gene, resultando em mRNAs individuais que possuem a estrutura cap na extremidade 5 e so poliadenilados na extremidade 3. A cada regio intergnica, a transcriptase faz uma pausa de aproximadamente 1 a 2 minutos e prossegue transcrevendo o gene seguinte. No entanto, apenas 70 a 80% das replicases prosseguem transcrevendo o prximo gene. As demais se dissociam do genoma e cessam a transcrio. Esse mecanismo de transcrio seqencial, acompanhado de reduo do nmero de transcriptases que prosseguem a sntese de RNA aps cada IR, gera um gradiente de transcrio que importante para a regulao da quantidade de mRNA produzido de cada gene. Assim,

Regio intergnica IR
Terminao
Iniciao
AUACUUUUUUUGAUUGUC UAUG AA

AA

m7

AACAG G

Lder = 47nt

IR

IR

IR

IR

N = 1333
3
AA AA

P = 821

M = 838

G = 1672

L = 6380
5

AA
A

AA

AA A

AA

AA A

AA

AA A

AA

AA

AA

AA

AA A

AA

AA A

AA

AA

AA

AA

AA A

AA

AA

AA

N mRNA

AA

P AA mRNA

AA

M mRNA

AA

G mRNA

AA

L mRNA

AA

Figura 7.6. Organizao do genoma e estratgia de transcrio do vrus da estomatite vesicular (VSV) da famlia Rhabdoviridae. O genoma representado pela linha contnua (as extremidades 3' e 5' e a seqncia lder esto indicados). Os blocos representam os genes, com o nmero respectivo de nucleotdeos. Acima do genoma est apresentada a seqncia comum das regies intergnicas (IR), com os sinais para a terminao e incio da transcrio dos genes subseqentes. Abaixo do genoma, esto representados os mRNAs produzidos pela transcrio seqencial dos genes. O nmero relativo de mRNAs decresce medida que a transcrio se distancia do seu incio. N) nucleoprotena; P) fosfoprotena; M) protena da matriz; G) glicoprotena do envelope; L) polimerase.

Replicao dos vrus RNA

179

cada gene localizado na direo 5 do genoma transcrito por um nmero progressivamente menor de transcriptases, resultando em quantidades decrescentes de mRNAs. Esse mecanismo denominado atenuao da transcrio (transcription attenuation). (Figura 7.6).

3.1.3 Replicao do genoma


A replicao do genoma inicia em um determinado momento do ciclo, aps a sntese de quantidade suciente de protenas virais, principalmente de nucleoprotena. A replicao do genoma desses vrus ocorre em duas etapas e envolve a sntese de uma molcula de RNA complementar com a extenso total do genoma. A replicase no interrompe a transcrio a cada IR, ignorando os sinais de terminao da transcrio at a extremidade 5. Os mecanismos responsveis pela transio entre transcrio descontnua (sntese de mRNAs) e transcrio contnua (sntese de RNA complementar) no so completamente conhecidos, mas parecem ser dependentes do acmulo da protena N (e provavelmente a P) nas
N
mRNA
AA AA A

etapas iniciais do ciclo. Mltiplas cpias da protena N se conjugariam fortemente com o transcrito lder, provocando um sinal de antiterminao, que interferiria com a capacidade da replicase de reconhecer os sinais de terminao presentes no nal de cada gene, resultando na sntese de uma molcula de RNA complementar com a extenso do genoma (Figura 7.7). Outro modelo para a troca do modo de transcrio descontnua para a replicao sugere que dois complexos enzimticos diferentes seriam responsveis por cada um desses mecanismos. A fosforilao da protena P, que faz parte do complexo, converteria o complexo transcriptase (que realiza a transcrio descontnua) em complexo replicase (que realiza a transcrio contnua). O RNA antigenmico serve de molde para a sntese das cpias genmicas. Esse processo facilitado pela inexistncia de sinais de terminao da transcrio neste sentido do RNA. Tanto a sntese de RNA antigenmico como a de RNA genmico so seguidas pela imediata encapsidao dos RNAs recm-produzidos pela protena N. As etapas de transcrio e replicao do genoma do VSV esto ilustradas na Figura 7.7.
L
mRNA
AA AA AA A AA A

P
mRNA
AA AA A

M
mRNA
AA AA A

G
mRNA

RNA pol

Transcrio (1)
RNA genmico (-) 5 RNA pol RNA antigenmico (+)

5 5

Replicao (2)

Replicao (3)
RNA genmico (-) 3

Figura 7.7. Etapas da transcrio e replicao do genoma do vrus da estomatite vesicular (VSV). A linha contnua representa a molcula de RNA genmico, recoberta por mltiplas cpias da nucleoprotena. No incio do ciclo replicativo, a transcrio descontnua resulta em mRNAs individuais de cada gene (1). Em uma determinada etapa, com o acmulo da nucleoprotena (N), o complexo replicase realiza a sntese da molcula de RNA complementar (2), que serve de molde para a sntese de molculas de RNA genmico (3). Note que tanto o RNA genmico (-) quanto o RNA antigenmico ou complementar (+) permanecem recobertos por molculas da protena N (ou NP) durante os processos de transcrio e replicao. As etapas ilustradas acima so comuns aos vrus da ordem Mononegavirales.

180

Captulo 7

3.2 Vrus com o genoma segmentado


Vrus de trs famlias possuem este tipo de genoma: Orthomyxoviridae (7 ou 8 segmentos); Bunyaviridae (trs segmentos) e Arenaviridae (dois segmentos). Os ortomixovrus e a maioria dos buniavrus possuem o genoma inteiramente de sentido negativo, ou seja, as ORFs esto presentes no RNA complementar. O genoma dos arenavrus e de alguns buniavrus possui sentido ambissense, ou seja, contm algumas ORFs no sentido do RNA genmico e outras no sentido do RNA complementar. O genoma no traduzido diretamente, e esses vrus necessitam trazer a sua replicase nos vrions. Por isso so classicados como vrus RNA de sentido negativo. Os ortomixovrus possuem o genoma segmentado (inuenza A e B = oito segmentos; inuenza C = 7 segmentos) e replicam o genoma no ncleo da clula hospedeira. A replicao no ncleo faz desses vrus excees entre os vrus

RNA, juntamente com os bornavrus. A descrio a seguir abordar o vrus da inuenza A. O genoma do vrus da inuenza A constitui-se por oito segmentos de RNA de polaridade negativa, numerados de 1 a 8. Os segmentos 1 a 6 codicam uma protena cada; os segmentos 7 e 8 codicam duas protenas cada. Todos os segmentos genmicos apresentam a mesma organizao geral: possuem um gene (ou mais) na regio central, anqueada por seqncias altamente conservadas nas extremidades 3 (12 nt) e 5 (13 nt) (Figura 7.8). As regies terminais possuem sinais para o incio da transcrio e replicao. Cada segmento genmico encontra-se recoberto (encapsidado) por mltiplas cpias da protena NP e est associado com algumas protenas que formam o complexo polimerase-replicase. Esse complexo formado por trs protenas principais: PB1 (polimerase bsica 1); PB2 (polimerase bsica 2) e PA (polimerase cida). O complexo RNA + protenas associadas se denomina ribonucleoprotena (RNP) e permanece estvel durante a replicao.

Traduo

B. mRNA Cap-5---------GAGCGAAAGCAGG
8-13nt

AAA(n)-3
15-22nt Transcrio (1)

Cap-5---------GA 3-UCGCUUUCGUCC A. RNA genmico (-)

8-13nt

GGAACAAAGAUGA-5

Replicao

5-AGCGAAAGCAGG C. RNA antigenmico (+)

CCUUGUUUCUACU-3

Figura 7.8. Estrutura dos RNAs produzidos durante a replicao do vrus da influenza. A) RNA genmico (vRNA); B) mRNA; C) RNA antigenmico. A transcrio para a sntese de mRNA utiliza nucleotdeos com cap subtrados dos mRNA celulares (1). Os mRNA apresentam uma extenso de 8-13 nt (com cap) em relao ao vRNA e os 15-22 nucleotdeos terminais so substitudos por uma cauda poliA. A primeira etapa da replicao do genoma envolve a sntese do RNA de sentido antigenmico que exatamente complementar ao vRNA (2). A segunda etapa da replicao envolve a sntese do vRNA ou genmico a partir do RNA antigenmico (3). Note que os mRNAs diferem dos RNA antigenmicos, pela presena de 8-13 nt adicionais com cap e cauda poliA.

Replicao dos vrus RNA

181

Cada segmento genmico transcrito individualmente pelo complexo transcriptase. O processo se inicia pela subtrao de seqncias de 8 a 13 nt, com cap na extremidade 5, de mRNAs celulares. Essa atividade atribuda PB1, ou seja, essa enzima literalmente furta os segmentos iniciais de mRNAs celulares. Esses nucleotdeos servem de primer para o incio da transcrio, alm de possurem a estrutura cap, que necessria para a traduo dos mRNA virais. A transcrio termina 15 a 22 nt antes da extremidade 5 de cada segmento, e seguida pela adio de uma cauda de poliA. Os mRNAs virais no so, portanto, exatamente complementares aos RNAs genmicos: possuem uma extenso de 8 a 13 nt em sua regio 5 e no possuem os 15-22 nt terminais, sendo substitudos por uma cauda poliA. A replicao dos RNA genmicos (vRNA) ocorre em duas etapas: sntese do RNA antigenmico (complementar) e sntese de RNA genmico (vRNA), utilizando o RNA antigenmico como molde. A sntese do RNA antigenmico no envolve a subtrao de nucleotdeos com cap de mRNA celulares; inicia-se exatamente na extremidade 3 do genoma e termina exatamente na extremidade 5. Dessa forma, o RNA antigenmico exatamente complementar ao RNA genmico. A transio entre a transcrio iniciada por primer + cap para a transcrio independente de primer + cap parece envolver complexos transcriptase/replicase diferentes. O acmulo da protena NP e alteraes especcas na composio do complexo polimerase seriam responsveis pela transio entre transcrio e replicao. A Figura 7.8 apresenta a estrutura dos vRNA, mRNA e RNAs antigenmicos produzidos durante a replicao dos vrus da inuenza A.

3.3 Vrus com o genoma ambissense


Os arenavrus e alguns buniavrus possuem genoma ambissense, ou seja, alguns genes so codicados no sentido do RNA complementar, enquanto outros so codicados no sentido do genoma, aps a sntese de mRNA, a partir da cpia complementar de RNA. Em outras palavras, as ORFs de alguns genes esto presentes no RNA

genmico (sentido positivo) e outras esto presentes no RNA complementar (sentido negativo). As ORFs que esto no sentido do genoma ocupam a metade 3 do genoma e no so traduzidas diretamente. Como o genoma no traduzido diretamente pelos ribossomos, esses vrus necessitam trazer, nos vrions, a sua enzima transcriptase/replicase e, por isso, so classicados juntamente com os vrus RNA de sentido negativo. Os arenavrus possuem dois segmentos de RNA como genoma: um segmento grande (large = L) e outro segmento pequeno (small = S). Cada um desses segmentos contm dois genes (Figura 7.9A). No segmento grande, o gene L possui polaridade negativa, ou seja, a sua ORF est presente no RNA complementar. Para que a protena seja expressa, esse gene transcrito pela polimerase viral, originando um mRNA, que , ento, traduzido (Figura 7.9B). Por outro lado, o gene Z possui polaridade positiva (a ORF est presente no RNA genmico do segmento L). No entanto, este gene no expresso pela traduo direta do genoma. A sua expresso somente ocorre aps a sntese do RNA complementar, a partir do qual o mRNA , ento, produzido (Figura 7.9B). A expresso deste gene segue o mesmo padro dos genes expressos atravs de mRNA subgenmicos, caractersticos de algumas famlias de vrus RNA. No segmento S, o gene NP possui polaridade negativa e a sua expresso depende da sntese de mRNA. O gene GP possui polaridade positiva e a sua expresso segue o mesmo padro do gene Z do segmento L: sntese do RNA complementar e transcrio do seu mRNA. A estratgia ambissense de codicao de protenas encontrada ainda em vrus de alguns gneros da famlia Bunyaviridae (Tospovrus e Phlebovrus). A replicao do genoma segue o padro dos outros vrus RNA e ocorre por intermdio de um RNA complementar de sentido antigenmico. A diferena que o RNA complementar serve de molde para a sntese do RNA genmico e tambm para a sntese do mRNA de um dos genes. Em resumo, os genomas ambissense possuem genes que so expressos de maneira semelhante aos genomas RNA de sentido negativo (as ORFs esto presentes no RNA complementar); e genes

182

Captulo 7

que so expressos como nos vrus RNA de sentido positivo (as ORFs esto presentes no sentido genmico, embora no sejam traduzidas diretamente).

4 Vrus com RNA de ta dupla


So conhecidas atualmente seis famlias de vrus que possuem RNA de ta dupla (ds RNA) como genoma, e apenas duas abrigam vrus que infectam vertebrados (Reoviridae e Birnaviridae); destas, apenas a primeira possui patgenos de mamferos. A famlia Reoviridae a maior e mais diversa dessas famlias, contendo importantes patgenos animais. O genoma desses vrus composto por 10, 11 ou 12 segmentos de dsRNA, dependendo do gnero. A maioria dos segmentos codica apenas uma protena, mas alguns podem codicar duas. Nos segmentos duplos de RNA, apenas uma das tas contm as ORFs codicantes de protenas. O complexo replicase trazido nos vrions, associado aos segmentos, e a sntese dos mRNA virais ocorre no interior dos capsdeos semi-ntegros.

A
L
3' -

Z
- 5'

Segmento grande (L) NP


3' -

GP
- 5'

Segmento pequeno (S) Protena Z

Traduo

3'Transcrio (3)

mRNA -5'

L
5' - 3'

4.1 Estrutura e organizao do genoma


Z

RNA complementar

Replicao (2) L
3' -

Z
- 5'

RNA genmico Transcrio (1) mRNA


5' - 3'

Traduo Protena L

Figura 7.9. Estrutura e expresso do genoma ambissense dos arenavrus. A) Organizao dos segmentos genmicos L (grande) e S (pequeno) com os respectivos genes; B) Estratgia de expresso gnica do segmento grande. O gene L possui sentido negativo e a sua expresso depende inicialmente da transcrio e sntese de mRNA (1). O gene Z possui sentido positivo, mas no expresso pela traduo direta do genoma. A sua expresso ocorre somente aps a sntese do RNA complementar (2). Este serve de molde para a transcrio e produo do mRNA correspondente (3). Os genes NP e GP do segmento S seguem os mesmos padres de expresso dos genes L e Z, respectivamente.

Os vrus do gnero Orthoreovirus possuem os prottipos da famlia Reoviridae, os reovrus no-fusognicos de mamferos. O genoma desses vrus composto por dez segmentos de dsRNA. Os segmentos genmicos so denominados de acordo com a sua migrao em gis de poliacrilamida (SDS-PAGE): L = grandes (L1, L2, L3); M = mdios (M1, M2 e M3) e S = pequenos (S1, S2, S3 e S4). Somente os segmentos S1 e M3 originam duas protenas, o restante codica apenas uma. Os dez segmentos dos orthoreovrus so lineares e possuem as extremidades livres. Embora se constituam em segmentos separados, algumas evidncias indicam que os segmentos genmicos encontram-se associados atravs de suas extremidades nas partculas vricas. Cada segmento de polaridade positiva possui uma estrutura cap (7-M-guanina) na extremidade 5, que provavelmente adicionado por enzimas virais no interior dos capsdeos. As extremidades 5 dos segmentos de polaridade negativa possuem um nucleotdeo difosfato. A cadeia codicante (e os mRNAs) possuem uma regio no-traduzida de

Replicao dos vrus RNA

183

Gene (nt)
Cadeia (+) 5' 3'
L1=3854

Protena (aa)
3' 3 (1267) 5' pp Cadeia (-)

L2=3916 2 (1269) L3=3901 1 (1275) M1=2304 2 (736) M2=2203 1 (708) M3=2241 NS (721) + NSC (681) S1=1416 1 (455) + 1s (120) S2=1331 2 (418) S3=1198 NS (366) S4=1196 3 (365)

Figura 7.10. Organizao do genoma dos vrus do gnero Orthoreovirus da famlia Reoviridae. O genoma composto por 10 segmentos de RNA de fita dupla, sendo que apenas uma das cadeias codificante (sentido positivo). No segmento L1, so mostradas as duas cadeias, os demais mostram apenas a cadeia codificante. Os diferentes segmentos apresentam uma organizao semelhante, possuindo uma ORF central flanqueada por pequenas regies notraduzidas nas extremidades 5' e 3'. A nomenclatura e nmero de aminocidos de cada protena esto apresentados direita. Note que oito segmentos codificam apenas uma protena cada; os segmentos M3 e S1 codificam dois produtos cada.

12 a 32 nt prxima extremidade 5 e outra regio no-traduzida de 35 a 73 nt na extremidade 3, intercaladas por ORFs que possuem entre 365 e 1.289 nt (Figura 7.10). Essas regies no-codicantes possuem stios regulatrios da transcrio e traduo.

4.2 Transcrio
A transcrio inicial ocorre ainda no interior dos capsdeos, logo aps a penetrao dos vrions no citoplasma da clula hospedeira, e apenas as cadeias negativas so transcritas. Os mRNAs in-

dividuais so exatamente complementares aos RNA moldes: possuem 5 cap e no so poliadenilados. Por isso servem tanto para a traduo como de molde para a sntese do RNA complementar (Figura 7.11). Os mRNAs tardios, produzidos aps a replicao do genoma, constituem uma exceo por no receberem cap na extremidade 5. Os mRNAs so rapidamente exportados dos capsdeos e ganham acesso ao citoplasma para serem traduzidos. Em fases adiantadas do ciclo, j no interior de capsdeos recm-formados, ocorre um novo ciclo de transcrio com a produo de mais mRNA.

184

Captulo 7

4.3 Replicao do genoma


A segunda etapa da replicao, a sntese das cadeias negativas, ocorre j em capsdeos pr-formados no citoplasma da clula hospedeira, em um local chamado de viroplasma, que constitui uma fbrica de vrus dentro da clula hospedeira. Para que isso ocorra, as protenas que formam os capsdeos j so produzidas em etapas iniciais do ciclo replicativo. Cada segmento de RNA (+) serve de molde para a sntese da cadeia complementar (-), que permanece pareada com o molde, restabelecendo, assim, a molcula genmica dsRNA. A sntese da cadeia negativa se inicia na extremidade 3 da molcula molde e prossegue at a extremidade 5. Por isso, as cadeias positivas e negativas so exatamente complementares (Figura 7.11).

diretamente. A replicao tambm no ocorre por meio de um intermedirio RNA, como nos outros vrus RNA. Ao contrrio, a replicao do genoma ocorre por meio de um intermedirio DNA. Parte das etapas de replicao do genoma ocorre no citoplasma e parte ocorre no ncleo da clula hospedeira. Resumindo, as principais peculiaridades do genoma e da replicao desses vrus so: a) o seu genoma diplide, ou seja, composto por duas molculas idnticas de RNA; b) o RNA genmico possui polaridade positiva, porm no traduzido em protenas; c) a replicao do genoma ocorre por meio da sntese de um intermedirio DNA (provrus), que incor-

Genoma
Cap

U5

.gag

pol

env

U3

AAAA

RNA

Transcrio reversa (1)

Genoma (ds)
RNA (+)
5' 3' 3' 5'

Provrus
.gag pol env

U3

U5

U3

U5 DNA

RNA (-)

Transcrio (1)
mRNA (+)
5' 3'

Integrao (2) Provrus Integrado


DNA celular

DNA
.gag pol env

U3

U5

U3

U5

DNA celular

Traduo (2)
RNA (+)
5' 3'

Replicao (3)
Transcrio (3)
3' 5'

Genoma
Cap

Protena

Genoma (ds)

RNA (-)

U5

.gag

pol

env

U3

AAAA

RNA

Figura 7.11. Etapas da expresso gnica e replicao dos vrus RNA de fita dupla. A fita negativa do genoma transcrita, originando RNAs de sentido positivo exatamente complementares (1). Estes RNAs podem ser traduzidos em protenas (2) e tambm servem de molde para a sntese da molcula de sentido negativo (3), restabelecendo a molcula genmica de dsRNA.

5 Retrovrus
Os retrovrus apresentam uma estratgia peculiar de replicao do genoma que difere dos demais vrus RNA (Figura 7.12). Embora esses vrus codiquem as suas protenas no sentido do genoma (por isso so considerados vrus RNA de sentido positivo), o genoma no traduzido

Figura 7.12. Ilustrao da estrutura e etapas da replicao do genoma dos retrovrus. O genoma constitudo por uma molcula de RNA de fita simples de 7 a 10 kb com 5'cap e poliA. Prximo s extremidades, o genoma possui duas regies repetidas R (5' e 3') e duas regies nicas (U5 e U3). Entre essas regies, localizam-se as seqncias codificantes: genes gag, pol e env. A primeira etapa da replicao sntese do provrus DNA (molcula de DNA de fita dupla correspondente ao genoma) pela enzima viral transcriptase reversa (1). O provrus contm as regies U3 e U5 duplicadas nas extremidades opostas e integrado aos cromossomos celulares pela ao da enzima viral integrase (2). Aps a integrao, o provrus transcrito pela RNA polimerase II celular (3) originando mRNAs idnticos ao genoma. Estes mRNAs servem para a traduo em protenas e tambm constituem o RNA genmico para serem encapsidados na prognie viral.

Replicao dos vrus RNA

185
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porado aos cromossomos celulares; d) o provrus integrado transcrito, originando mRNAs para a sntese protica e para serem incorporados como genoma na prognie viral; e) as etapas iniciais da replicao do genoma ocorrem no citoplasma e so mediadas por enzimas virais (transcritase reversa); f) as etapas seguintes ocorrem no ncleo e so mediadas por enzimas virais (integrao = integrase, IN) e celulares (transcrio = RNA pol II celular); g) o genoma dos retrovrus o nico genoma viral sintetizado exclusivamente por enzimas e fatores celulares. Por isso, a sua estrutura idntica aos mRNA celulares: possui cap na extremidade 5 e poliadenilado na extremidade 3. As principais etapas da replicao do genoma dos retrovrus e a estrutura das molculas intermedirias esto ilustradas na Figura 7.12. Maiores detalhes sobre a expresso gnica e replicao do genoma podem ser encontrados no Captulo 31.

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Replicao dos vrus RNA

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PATOGENIA DAS INFECES VRICAS


Eduardo Furtado Flores1

8
191 191 193
193 196 196

1 Introduo
1.1 Conceitos bsicos

2 Patologia em nvel celular


2.1 Interaes dos vrus com as clulas 2.2 Efeitos da replicao viral nas clulas hospedeiras 2.3 Apoptose por vrus

3 Patogenia em nvel de hospedeiro


3.1 Penetrao e replicao primria 3.1.1 Pele e mucosas superciais 3.1.2 Trato respiratrio 3.1.3 Orofaringe e trato digestivo 3.1.4 Mucosa urogenital 3.2 Infeces localizadas versus infeces disseminadas (ou sistmicas) 3.2.1 Disseminao local 3.2.2 Disseminao hematgena 3.2.3.Disseminao nervosa 3.3 Localizao das infeces 3.3.1 Infeces em rgos e sistemas especcos 3.3.2 Infeces da pele e tegumento 3.3.3 Infeces do trato respiratrio 3.3.4 Infeces do trato digestivo 3.3.5 Infeces do sistema nervoso central 3.3.6 Infeces do sistema linforreticular e hematopoitico 3.3.7 Infeco fetal

197
197 197 199 200 201 202 202 202 207 209 209 211 212 213 215 217 218

4 Padres principais de infeco


4.1 Infeces agudas

220
221

Colaboraram em sees especcas: Janice Ciacci Zanella (Apoptose por vrus); Luiz Carlos Kreutz (Padres principais de infeco) e Mariana S e Silva (Imunopatologia em infeces vricas).
1

4.2 Infeces persistentes (ou crnicas) 4.2.1 Infeces latentes 4.2.2 Infeces persistentes ou crnicas 4.2.3 Infeces persistentes temporrias 4.3 Mecanismos envolvidos na manuteno das infeces persistentes 4.3.1 Restrio do efeito citopatognico 4.3.2 Infeco de clulas semipermissivas 4.3.3 Infeco de um pequeno nmero de clulas 4.3.4 Manuteno do genoma viral nas clulas hospedeiras 4.3.5 Evaso da resposta imune do hospedeiro

212 222 222 223 225 225 225 226 226 226

5 Oncognese por vrus


5.1 Oncognese por retrovrus 5.2 Pequenos vrus DNA tumorignicos

226
226 227

6 Imunopatologia em infeces vricas


6.1 Imunopatologia mediada por imunocomplexos 6.2 Imunopatologia mediada por linfcitos T citotxicos 6.3 Imunopatologia por induo de auto-imunidade

228
229 230 230

7 Imunossupresso por vrus


7.1 Replicao viral em clulas envolvidas na resposta imunolgica 7.2 Imunossupresso associada com a ativao do sistema imune 7.3 Produtos de moncitos e linfcitos ativados 7.4 Protenas virais

230
231 232 232 232

8 Bibliograa consultada

234

1 Introduo
O termo patogenia ou patognese , aplicado s infeces vricas, refere-se ao conjunto de mecanismos pelos quais os vrus produzem doena em seus hospedeiros (pato = doena, gnese = origem, produo). A denio de doena como sendo qualquer manifestao resultante de alteraes da siologia do organismo abrange um leque muito amplo de condies. Manifestaes patolgicas incluem desde aumentos leves da temperatura corporal, alteraes de nimo e apetite, at condies severas que, eventualmente, resultam na morte do hospedeiro. Na maioria das doenas, a patogenia multifatorial, resultante da alterao de fatores endgenos ou exgenos, raramente determinadas por um fator nico. Com as infeces vricas no diferente, pois as conseqncias dependem das interaes entre inmeros fatores do agente e do hospedeiro. Grande parte dos sinais clnicos observados nas doenas vricas conseqncia da resposta do hospedeiro injria celular e tecidual. Por sua vez, essa injria pode resultar de efeitos diretos ou indiretos da replicao viral ou pode, ainda, ser conseqncia da resposta imune do hospedeiro contra as clulas infectadas. De fato, a patogenia de vrias doenas vricas est mais intimamente ligada aos mecanismos imunolgicos do hospedeiro do que s conseqncias diretas da replicao viral nos tecidos. Em resumo, a patogenia das infeces vricas determinada pela combinao entre os efeitos diretos e indiretos da replicao viral e as respostas do hospedeiro infeco. Os mecanismos pelos quais os vrus produzem doenas em seus hospedeiros podem ser examinados em diferentes nveis. As clulas so as unidades fundamentais do organismo, nas quais os vrus se multiplicam. Por isso, as clulas se constituem nos locais de origem dos eventos ligados infeco vrica que podem resultar em doena. A replicao dos vrus, muitas vezes, interfere com mecanismos siolgicos essenciais da clula hospedeira, alterando as suas funes em benefcio da replicao viral. A alterao de processos celulares envolvidos na biossntese de macromolculas e na manuteno da homeostase celular, por exemplo, podem resultar em disfun-

o e at morte celular. Outras vezes, produtos da replicao viral podem ser txicos para a clula hospedeira. Essas alteraes esto freqentemente envolvidas na origem de processos patolgicos observados no organismo. Uma infeco pode resultar em absoluta ausncia de efeitos deletrios sobre as clulas e, conseqentemente, na ausncia de manifestaes clnicas; ou pode resultar em efeitos celulares graves, acompanhados de sinais clnicos severos e morte do hospedeiro. No hospedeiro, a complexidade de interaes que pode ou no resultar em doena muito maior, e ainda acrescida da participao dos componentes celulares e humorais da resposta imunolgica e de outros sistemas encarregados de manter a homeostasia e integridade do organismo. Ao contrrio do que se imagina, a ocorrncia de doena clnica em infeces vricas um evento pouco freqente, considerando-se a totalidade das infeces. Ou seja, a maioria das infeces por vrus no resulta em alteraes orgnicas que se manifestem com sinais perceptveis clinicamente. A ocorrncia ou no de doena em uma determinada infeco vrica depende da interao entre inmeros fatores do agente e do hospedeiro, na qual os mecanismos imunolgicos, destinados a manter a integridade e funcionalidade do organismo, desempenham um papel fundamental. A Figura 8.1 ilustra esquematicamente a relao entre infeco e doena em nvel celular e de hospedeiro, com as conseqncias derivadas da replicao nos diferentes nveis.

1.1 Conceitos bsicos


O termo patogenicidade se refere capacidade de um determinado agente produzir doena no hospedeiro. Vrus altamente patognicos so aqueles capazes de produzir doena em uma grande parcela dos hospedeiros infectados. Como a patogenia das infeces depende tambm das reaes do organismo, a patogenicidade de um vrus modulada por suas interaes com o hospedeiro. O termo virulncia, muitas vezes utilizado como sinnimo de patogenicidade, se refere ao nvel de severidade da doena causada por um agente. Os vrus altamente virulentos causam doena grave; enquanto vrus avirulentos ou pouco virulentos (atenuados) no causam

192

Captulo 8

PERCEPTVEIS VISUALMENTE

Efeito em nvel celular

Efeito no hospedeiro

Lise celular

Morte do hospedeiro

Disfuno celular, efeito citoptico ou transformao celular

Doena clssica e severa

Doena leve ou moderada

Replicao viral sem alteraes celulares visveis, ou danos teciduais restritos Exposio sem infeco

Infeco sem sinais clnicos (assintomtica)

Exposio sem infeco

Conceito iceberg das infeces

Figura 8.1. O conceito iceberg das infeces vricas. Note que a maioria das infeces vricas no resulta em efeitos perceptveis em nvel de hospedeiro. As manifestaes clnicas, quando ocorrem, constituem-se em reflexos da disfuno e patologia em nvel celular e tecidual.

doena, ou causam doena leve, respectivamente. A virulncia de um vrus pode ser medida de vrias formas, incluindo o percentual de animais que adoece ou morre aps inoculao experimental, grau de severidade dos sinais clnicos, nvel e intensidade de alteraes histolgicas, entre outras. A virulncia dos vrus determinada geneticamente e pode variar entre isolados de uma mesma espcie viral. No entanto, fatores do hospedeiro podem interferir com e modular a virulncia desses agentes. Embora em alguns vrus a virulncia possa ser mapeada em um ou poucos genes, para a maioria dos vrus essa uma caracterstica multifatorial. Em geral, os genes virais envolvidos na virulncia podem ser divididos em quatro classes: a) genes cujos produtos afetam a capacidade replicativa do vrus; b) produtos gnicos que inuenciam a capacidade do vrus se disseminar no hospedeiro; c) produtos virais que se contrapem resposta imunolgica do hospedeiro e d) produtos virais txicos para a clula

e/ou hospedeiro. Muitos genes virais podem se enquadrar em mais de uma classe, afetando a virulncia de mais de uma forma. A identicao dos genes envolvidos na determinao da virulncia dos vrus de importncia em sade humana e animal um dos maiores desaos da Virologia, pois pode permitir a manipulao gentica desses agentes com ns vacinais e/ou teraputicos. No entanto, essa nem sempre uma tarefa fcil, pela complexidade das interaes vrus-clula, falta de sistemas apropriados ou modelos animais adequados e pela diculdade de se estudar virulncia em cultivos celulares. O termo susceptibilidade se refere s condies oferecidas pelo hospedeiro para a ocorrncia da infeco e doena. Por outro lado, resistncia a oposio oferecida pelo hospedeiro instalao da infeco. A susceptibilidade e resistncia de um hospedeiro a um vrus so determinadas geneticamente e podem variar entre indivduos de uma mesma espcie, de acordo com fatores como: raa, idade, sexo, condio corporal, estado sio-

INFECO SUBCLNICA

VISUALMENTE IMPERCEPTVEIS

DOENA CLNICA

Patogenia das infeces vricas

193

lgico etc. A resistncia infeco pode ser devida a mecanismos naturais (resistncia natural ou inata) ou adquiridos (resistncia adquirida). O termo imunidade muito utilizado para designar a resistncia, principalmente a resistncia adquirida. O termo refratariedade se refere a um grau de resistncia absoluta a um determinado agente, e uma caracterstica da espcie animal, e no do indivduo. O tropismo a predileo de um vrus por determinadas clulas ou tecidos e pode ser determinado por uma variedade de fatores celulares que so necessrios para a replicao viral. O principal fator determinante do tropismo e que possui inuncia direta no padro de distribuio e localizao das infeces a presena de receptores especcos para o vrus. Maiores detalhes sobre os mecanismos envolvidos com o tropismo celular dos vrus sero abordados ao longo do texto.

nes virais na clula hospedeira ou por alteraes nas funes de genes celulares encarregados do controle do ciclo celular.

2.1 Interaes dos vrus com as clulas


A maioria das alteraes da siologia celular resultantes da replicao viral se deve a efeitos secundrios das interaes entre os produtos virais e componentes celulares; interaes estas que so necessrias para a multiplicao dos vrus. Os efeitos txicos especcos de alguns produtos virais e o acmulo excessivo de protenas e cidos nuclicos virais tambm podem levar injria celular. As interaes que resultam em alterao na siologia celular podem ocorrer em qualquer etapa do ciclo replicativo. A penetrao dos adenovrus em clulas de cultivo acompanhada por despreendimento das clulas da superfcie de contato. Esse evento deve-se ligao da protena penton dos vrions s molculas de integrinas da membrana das clulas. Essa ligao altera as interaes das integrinas com outras protenas da membrana celular, necessrias para a aderncia das clulas superfcie do frasco. A protena M2 dos vrus da inuenza produz canais inicos na membrana dos endossomos durante o processo de internalizao do vrus, atravs dos quais prtons H+ penetram para o interior das vesculas endossmicas, acidicando o pH e facilitando o processo de fuso/penetrao e desnudamento do nucleocapsdeo. No entanto, as possveis conseqncias desse evento, para a siologia celular, so desconhecidas. Alguns vrus interferem com os mecanismos de transcrio, processamento (splicing) e transporte de RNA mensageiros (mRNA) celulares, estratgias que visam a favorecer a traduo dos mRNA virais. Os adenovrus e herpesvrus inibem a maturao e a exportao de mRNA celulares para o citoplasma; os vrus da inuenza provocam a clivagem de mRNA celulares para utilizar a extremidade 5 com cap para os seus mRNA. Produtos dos vrus da inuenza, herpesvrus e poxvrus promovem a degradao de mRNA celulares (Tabela 8.1). Outros vrus alteram a especicidade ou subvertem a maquinaria celular de traduo

2 Patologia em nvel celular


A compreenso da patogenia das doenas vricas depende do conhecimento dos mecanismos envolvidos em diferentes nveis. Os vrus necessitam das macromolculas e de processos biossintticos da clula hospedeira para se multiplicar. As interaes entre o vrus e os componentes celulares so complexas e, muitas vezes, resultam em alteraes da siologia celular, podendo levar injria e at mesmo morte da clula. As patologias celulares associadas com a replicao viral se constituem em um dos principais mecanismos de produo das doenas. Em nvel celular, as infeces vricas podem resultar em uma variedade de condies, a saber: a) infeco no-produtiva, com bloqueio em uma das etapas intracelulares da replicao, seguida ou no de injria e morte celular; b) estabelecimento de infeco latente, com limitada expresso gnica viral e persistncia do genoma viral na clula hospedeira; c) infeco produtiva, com produo de prognie viral infecciosa, acompanhada de patologia ou morte celular; d) infeco produtiva persistente, em que a clula sobrevive e segue produzindo vrus em nveis baixos por longos perodos e, at mesmo, indenidamente; f) oncognese, seja pela incorporao de oncoge-

194

Captulo 8

Tabela 8.1. Protenas virais responsveis por efeitos especficos sobre mecanismos e estruturas das clulas hospedeiras Vrus Protena(s)
2A
pro

Efeito
Inibio da traduo cap-dependente Inibio do trfego protico RER-Golgi Proliferao de vesculas membranosas Alterao do mecanismo da MAP4 Inibio da transcrio Aumento da permeabilidade da membrana plasmtica Fuso entre clulas formao de sinccios Bloqueio na acumulao de mRNAs celulares no citoplasma Inibio da traduo cap-dependente Desmontagem dos polissomas Inibio do transporte e processamento de mRNA celular Despolimerizao do citoesqueleto

Alvo
elF-4G Desconhecido Desconhecido MAP4 Tbp, Complexo Tfflc Na, K-ATPase? Membrana plasmtica Protena celular envolvida no transporte de mRNA elF-4E mRNA celular

2A, 3A Poliovrus 2B, 2C Desconhecida 3C Vrus Sindbis Paramixovrus Desconhecida F E1B-55K, E4-34K Adenovrus Desconhecida Herpesvrus Vrus do herpes simplex Vrios vrus Produto do gene vhs (ribonuclease)

ICP 27 Desconhecida

Desconhecido Filamentos de actina.

Fonte: adaptada de Flint et al. (2000).

para a produo de suas protenas, em detrimento das protenas celulares. A inibio da traduo de mRNA celulares, e no de mRNA virais, uma forma de subverso utilizada pelos vrus para favorecer a sntese de suas protenas. Esses mecanismos so utilizados por vrios vrus, incluindo o vrus da estomatite vesicular (VSV), o poliovrus, o vrus da febre aftosa (FMDV), os adenovrus, entre outros. Essa interferncia pode ter efeitos deletrios para a clula hospedeira, que tem a sua sntese protica reduzida ou mesmo suprimida. A inibio da sntese de DNA celular outro mecanismo utilizado por vrus RNA e DNA durante a sua replicao. Essa inibio pode proporcionar uma disponibilidade maior de precursores (nucleotdeos), protenas e estruturas celulares para a sntese dos cidos nuclicos virais e replicao do genoma. possvel tambm que a inibio da sntese de DNA celular, em alguns casos, seja uma mera conseqncia da inibio da sntese protica da clula hospedeira pelo vrus.

Por outro lado, alguns vrus (poliomavrus, papilomavrus e adenovrus) estimulam as clulas a entrar em fase S, com ativao da sntese de DNA e subseqente diviso celular. Essa estratgia tem por m estimular a clula a fornecer condies e componentes (nucleotdeos, enzimas replicativas e fatores de replicao) necessrios replicao do genoma viral. Como conseqncia, a clula hospedeira passa a oferecer as condies necessrias replicao viral. Essa interferncia com a regulao do ciclo celular, algumas vezes, pode levar transformao tumoral dessas clulas. A apoptose ou morte celular programada um mecanismo de morte celular em resposta a vrios estmulos, inclusive infeces vricas. Tem sido demonstrado que vrios vrus so capazes de desencadear a cascata de reaes que leva apoptose da clula hospedeira. Por outro lado, vrios vrus possuem produtos que inibem ou retardam a apoptose, prolongando, assim, a vida da clula e permitindo a concluso do seu ciclo replicativo.

Patogenia das infeces vricas

195

Protenas virais podem tambm interferir com mecanismos celulares de modicao, localizao e maturao de protenas, podendo resultar em citopatologia. As glicoprotenas do envelope, em especial, so alvos de extensivas modicaes ps-traduo, maturao e transporte por mecanismos celulares, e a sua abundncia pode interferir com os processos celulares de processamento de protenas endgenas. A alterao da estrutura de membranas celulares, resultando em fuso e/ou alterao da permeabilidade, tambm so efeitos da replicao de vrios vrus. Diversos vrus com envelope possuem glicoprotenas que so necessrias para promover a fuso do envelope com a membrana celular, permitindo a sua penetrao na clula hospedeira. A expresso dessas protenas em clulas infectadas pode resultar em fuso entre clulas vizinhas, resultando na formao de massas citoplasmticas multinucleadas denominadas sinccios. A fuso entre clulas vizinhas tambm possvel pela ao direta das glicoprotenas virais no processo de penetrao. A fuso celular uma forma de citopatologia produzida por vrus, mas tambm pode ser considerada uma forma de disseminao do vrus entre clulas. Os produtos de alguns vrus produzem um aumento na permeabilidade da membrana plasmtica da clula infectada. Em decorrncia disso, o aumento da concentrao de ons sdio na clula pode favorecer a traduo de mRNA virais. Ento, para alguns vrus, o aumento da permeabilidade da membrana pode favorecer a sntese preferencial de protenas virais. A infeco por diversos vrus pode provocar a desorganizao ou mesmo a ruptura do citoesqueleto da clula hospedeira. Uma reduo na quantidade de lamentos de actina tem sido observada na infeco por vrios vrus, incluindo o vrus do herpes simplex humano (HSV), vrus da cinomose (CDV) e VSV, entre outros. As conseqncias da desorganizao do citoesqueleto no so bem claras, mas provavelmente possuem relao com algumas alteraes morfolgicas observadas em clulas infectadas. provvel que as alteraes na estrutura e funo do citoesqueleto sejam efeitos secundrios da replicao viral e da interferncia do vrus com outras funes celulares.

A replicao de alguns vrus resulta na formao de estruturas com morfologia mais ou menos denidas no citoplasma ou no ncleo da clula infectada. Essas estruturas so denominadas genericamente corpsculos de incluso e so formadas pelo acmulo de complexos de transcrio e replicao, produtos intermedirios da replicao, protenas estruturais e no-estruturais, capsdeos, nucleocapsdeos e vrions em determinados locais da clula. A localizao dos corpsculos de incluso reete o local de replicao do respectivo vrus. Os corpsculos de Negri so formados no citoplasma de neurnios infectados pelo vrus da raiva; os corpsculos citoplasmticos de Lenz so caractersticos da infeco pelo CDV. A replicao dos reovrus acompanhada da formao de grandes estruturas citoplasmticas denominadas virossomos, que podem ocupar grande parte do citoplasma. Os virossomos so os locais de acmulo de cidos nuclicos e protenas virais e onde ocorrem os mecanismos de replicao do genoma e montagem das partculas vricas. A replicao dos herpesvrus neuropatognicos (herpesvrus bovino tipo 5 [BoHV-5], vrus da doena de Aujeszky [PRV]) resulta na formao de corpsculos nucleares em neurnios do sistema nervoso central (SNC). A presena de corpsculos de incluso tem sido utilizada no diagnstico histopatolgico de algumas viroses, pela facilidade de observao e pelas suas caractersticas tintoriais (podem ser basoflicos ou acidoflicos). Pelo exposto, ca evidente que as interaes entre os produtos virais e os componentes celulares, durante o ciclo replicativo dos vrus, so extremamente complexas e podem resultar em uma variedade de alteraes da siologia celular. Grande parte dessas alteraes foi investigada e caracterizada em clulas de cultivo. Conseqentemente as informaes provenientes desses estudos devem ser analisadas com cautela. No obstante, possvel que grande parte das alteraes observadas in vitro ocorra tambm in vivo. provvel tambm que as interaes entre os vrus e as clulas hospedeiras sejam ainda mais complexas no animal, pela participao de componentes orgnicos ausentes nos frascos de cultivo. Nesse sentido, os componentes celulares e humorais do sistema imunolgico (citocinas e anticorpos) de

196

Captulo 8

outros sistemas de defesa e tambm do sistema endcrino do hospedeiro certamente possuem participao importante nas interaes dos hospedeiros com esses agentes invasores. Exemplos de protenas virais que interferem com mecanismos especcos das clulas hospedeiras esto apresentados na Tabela 8.1.

2.2 Efeitos da replicao viral nas clulas hospedeiras


A replicao dos vrus nas clulas hospedeiras freqentemente resulta em alteraes na siologia celular, tanto pela interferncia com processos metablicos e estruturas celulares quanto pela ao txica de produtos da replicao viral. Em particular, a interferncia com a sntese de macromolculas pode afetar negativamente a siologia celular e, freqentemente, resulta em patologia. Essas alteraes podem ser detectadas visual ou bioquimicamente e tem sido mais caracterizadas em clulas de cultivo. As alteraes morfolgicas, associadas com a replicao de vrus em clulas de cultivo, so denominadas coletivamente de efeito citoptico ou citopatognico (ECP). Como cada grupo de vrus pode afetar funes e mecanismos celulares diferentes, o tipo de ECP produzido tambm caracterstico de cada espcie ou grupo de vrus. A patologia mais extrema a lise ou destruio celular, e os vrus que a induzem so denominados citolticos. A lise celular caracterizada pela morte e desintegrao celular, freqentemente devida absoro excessiva de lquido extracelular. Alguns vrus produzem alteraes morfolgicas, como citomegalia ou arredondamento celular. A citomegalia pode ser devida absoro de lquido, enquanto o arredondamento geralmente conseqncia de alteraes na estrutura e funo das bras do citoesqueleto. Alteraes no citoesqueleto tambm resultam em desprendimento das clulas do substrato, efeito que pode ocorrer em estgios avanados de patologia celular, por mecanismos diversos. Os vrus que possuem glicoprotenas fusognicas no envelope promovem fuso celular, com a formao de clulas gigantes multinuleadas, denominadas sinccios. Clulas fusiona-

das possuem vida curta e eventualmente sofrem lise. A formao de vacolos outro tipo de ECP produzido por vrus que replicam no citoplasma. Corpsculos de incluso citoplasmticos ou nucleares tambm so formados como resultado da replicao de alguns vrus e podem ser observados sob microscopia tica. Embora a lise celular seja o mecanismo mais atraente e fcil para explicar as patologias induzidas pelos vrus nos seus hospedeiros, certamente no se constitui no nico mecanismo responsvel pela produo das doenas. Vrus no citolticos tambm podem causar patologias severas e at a morte do hospedeiro. Nesse sentido, provvel que outras formas de citopatologia que no necessariamente a lise celular tambm possam ser responsveis por patologias observadas em animais doentes. Acredita-se que grande parte das patologias observadas em doenas causadas por vrus no-citopticos sejam conseqncias da resposta imune do hospedeiro.

2.3 Apoptose por vrus


Apoptose ou morte celular programada um processo bioqumico que funciona como uma cascata que leva a morte ou suicdio celular. Esse mecanismo ocorre naturalmente durante o desenvolvimento embrionrio e fetal, manuteno da imunidade e da homeostase em organismos multinucleados. Muitos vrus interferem no processo de apoptose da clula hospedeira, alterando reaes e componentes-chave desse processo. Produtos de diferentes vrus promovem ou inibem a apoptose atravs de diversos mecanismos de ao. bvio que os vrus se beneciam ao evitar a apoptose, pois isso permite a sobrevivncia da clula at que o ciclo replicativo seja concludo. Porm, em alguns casos, a ocorrncia de apoptose vantajosa para o vrus. Em tais casos, a formao de corpos apoptticos, contendo vrus, resulta em fagocitose dessas estruturas e liberao do vrus no uido extracelular, o que favorece a sua disseminao. Os adenovrus, vrus da peste suna africana (ASFV), vrus da anemia infecciosa das galinhas (CAV) e os vrus da peste suna clssica (CSFV)

Patogenia das infeces vricas

197

so exemplos de vrus que produzem protenas indutoras da apoptose. Protenas que inibem a apoptose tambm so produzidas pelos adenovrus e ASFV e pelos vrus da vaccinia, herpesvrus bovino tipo-4 (BoHV-4), herpesvrus eqino (EHV), vrus da doena de Marek, dentre outros.

3.1 Penetrao e replicao primria


O estabelecimento da infeco no hospedeiro depende da penetrao e replicao do vrus em clulas prximas aos locais de entrada. Essa replicao denominada primria necessria para a amplicao do agente, de modo a superar as barreiras impostas pela resposta inata do hospedeiro. A replicao primria geralmente ocorre no prprio local de penetrao, em tecidos prximos ou nos linfonodos regionais. Em geral, os vrus podem utilizar mais de uma via para penetrar nos seus hospedeiros. As principais vias de penetrao de vrus nos animais sero apresentadas a seguir e esto ilustradas na Figura 8.2.

3 Patogenia em nvel de hospedeiro


O resultado de uma infeco vrica de hospedeiro depende de vrios fatores, a saber: a) capacidade de o vrus penetrar em um hospedeiro susceptvel pela via adequada; b) realizar uma replicao primria em tecidos prximos ao local de entrada; c) escapar dos mecanismos naturais de defesa do organismo; d) disseminar-se para os tecidos e rgos-alvo; e) replicar ecientemente nesses tecidos e f) produzir ou no injria tecidual (provocar patologia). Embora os vrus apresentem uma diversidade muito grande e participem de interaes de especicidade e complexidade diferentes com os seus hospedeiros, algumas etapas da patogenia parecem ser comuns maioria das infeces vricas. A seguir, sero abordadas essas etapas.

3.1.1 Pele e mucosas superciais


A pele se constitui em uma importante barreira para a penetrao de vrus, pois a sua camada externa formada por clulas mortas e no suporta a replicao viral. Alm disso, a sua superfcie seca, levemente cida e possui uma ora bacteriana permanente/residente que atua como uma barreira natural. No entanto, solu-

Mucosa conjuntival Pele Mucosa respiratria

Mucosa urogenital Mucosa intestinal

Mucosa orofarngea

Fonte: www.bakerinstitute.vet.cornell.edu.

Figura 8.2. Vias de penetrao de vrus em seus hospedeiros.

198

Captulo 8

es de continuidade mesmo imperceptveis provocadas por abrases, pequenas incises ou puncturas podem permitir a penetrao e instalao de vrios vrus. Dentre os vrus que podem penetrar atravs da pele semi-ntegra incluem-se os papilomavrus, alguns poxvrus e herpesvrus (Tabela 8.2). Esses vrus so geralmente transmitidos por contato direto ou indireto, ou tambm mecanicamente atravs de insetos. Se a penetrao for supercial, a replicao geralmente limitada ao stio de penetrao, pois a epiderme desprovida de vasos sangneos e linfticos que poderiam servir para disseminar a infeco. No entanto, a infeco de camadas mais profundas da derme pode levar disseminao sangnea, pois essa camada altamente vascularizada (Figura 8.3A). Em especial, os vrus que so transmitidos por insetos hematfagos (alfavrus, avi-

vrus, buniavrus, alguns rabdovrus e orbivrus) ou por procedimentos iatrognicos (retrovrus e hepadnavrus) podem alcanar as camadas mais internas e encontrar condies propcias para a sua replicao primria. A abundncia de vasos sangneos e linfticos na derme e em camadas mais internas oferece condies para a disseminao desses agentes a partir do stio primrio de replicao. Aps a replicao primria no tecido drmico ou subdrmico, os vrions podem se disseminar para os linfonodos regionais no interior de clulas fagocticas ou livres na linfa e/ou sangue. Os herpesvrus invadem terminaes nervosas localizadas nesses locais e so transportados ao longo dos axnios ou dentritos at o corpo dos neurnios. O transporte dos herpesvrus por bras nervosas ser abordado na seo 3.2.3.

Tabela 8.2. Vrus animais que penetram no hospedeiro atravs da pele ou de superfcies mucosas Via de penetrao Vrus
Papilomavrus de vrias espcies; Herpesvrus de vrias espcies; Poxvrus de bovinos, sunos e ovinos; vrus da estomatite papular bovina; poxvrus avirios; Vrus da doena vesicular de sunos; Vrus da estomatite vesicular (VSV). Vrios poxvrus (mixomavrus, poxvrus suno, poxvrus avirios); Alguns retrovrus (vrus da anemia infecciosa eqina [EIAV], vrus da leucose bovina [BLV]); VSV. Vrus da peste suna africana (ASFV); Vrus da lngua azul (BTV); VSV, outros rabdovrus; Vrus da febre do vale Rift (RVFV), outros buniavrus; Todos os alfavrus; Vrus do gnero flavivrus. Vrus da imunodeficincia felina (FIV); Vrus da raiva (RabV); Arenavrus (entre roedores); Herpesvrus smio B. Papilomavrus de vrias espcies animais; Retrovrus (BLV, EIAV); Vrus da diarria viral bovina (BVDV), vrus da peste suna clssica (CSFV). Herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1), herpesvrus eqino 1(EHV-1); Adenovrus canino tipos 1 e 2 (CAdV-1, CAdV-2).

Pequenas leses (puncturas, abrases)

Picada de insetos (transmisso mecnica)

Picada de insetos (transmisso biolgica)

Mordeduras de vertebrados

Transmisso iatrognica

Contato com a conjuntiva

Fonte: adaptada de Murphy et al. (1999).

Patogenia das infeces vricas

199

Aparentemente, as membranas mucosas superciais poderiam se constituir em uma barreira menos eciente para impedir a penetrao viral. Ainda assim, so recobertas por uma camada de muco que, pela sua natureza viscosa e pela presena de IgA, pode dicultar a penetrao dos vrus. Os herpesvrus parecem ser capazes de penetrar em mucosas intactas para iniciar a infeco, embora a ocorrncia de leses certamente favorea a instalao da infeco. Determinados vrus so introduzidos atravs da pele diretamente no tecido subcutneo ou mesmo no tecido muscular. O vrus da raiva inoculado profundamente pela mordedura de animais infectados; os arenavrus tambm so transmitidos entre os roedores silvestres atravs de mordidas; o herpesvrus smio B e o vrus da imunodecincia felina (FIV) tambm podem ser transmitidos por mordeduras. Essa inoculao profunda facilita ainda mais a replicao primria e o estabelecimento da infeco.

Alguns vrus penetram no organismo pela mucosa conjuntival e podem estar associados com conjuntivite ou com infeces sistmicas. Os adenovrus caninos tipos 1 e 2 (CAdV-1; CAdV2) podem penetrar por essa via; o herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1) pode causar conjuntivite pela infeco direta da conjuntiva ou por contaminao a partir da cavidade nasal. Os principais vrus de animais que penetram nos seus hospedeiros atravs da pele e mucosas superciais esto apresentados na Tabela 8.2.

3.1.2 Trato respiratrio


A mucosa do trato respiratrio provavelmente se constitui na principal via de penetrao de vrus, por causa de sua grande superfcie e grande quantidade de patgenos potencialmente presentes no ar inspirado. No obstante, o sistema respiratrio apresenta barreiras que limitam ou reduzem as chances dos vrus que penetram

Tabela 8.3. Principais vrus que penetram pelo trato respiratrio para iniciar a infeco do hospedeiro Famlia
Herpesviridae

Vrus
Herpesvrus de vrias espcies. Adenovrus de vrias espcies. Vrus da parainfluenza (PIVs) e vrus respiratrios sinciciais (RSVs). Vrus da influenza suna e eqina. Vrus da bronquite infecciosa das galinhas (IBDV). Vrus da febre aftosa (FMDV); rinovrus de vrias espcies. Calicivrus felino (FCV). Vrus da doena de Aujeszky (PRV), vrus da doena de Marek, vrus da febre catarral maligna (MCFV). Vrus da cinomose (CDV), vrus da peste bovina (rinderpest). Vrus da influenza aviria (AIV). Vrus da diarria viral bovina (BVDV)*; vrus da peste suna clssica (CSFV).

Produzem doena respiratria ou localizada

Adenoviridae Paramyxoviridae Orthomyxoviridae Coronaviridae Picornaviridae Caliciviridae

Produzem doena sistmica

Herpesviridae

Paramyxoviridae Orthomyxoviridae Flaviviridae

* O BVDV pode tambm causar doena respiratria. Fonte: adaptada de Murphy et al. (1999).

200

Captulo 8

pelo ar inspirado conseguirem atingir e penetrar nas clulas epiteliais. As vias areas superiores e inferiores contm um epitlio ciliado recoberto com muco, cuja funo reter e, eventualmente, expulsar as partculas inaladas. Alm de reter as partculas vricas, o muco pode conter IgA especca, que pode neutralizar a infectividade dos vrus. Os alvolos so desprovidos dessas defesas, porm possuem macrfagos residentes encarregados de fagocitar e digerir partculas exgenas. Alm disso, a temperatura nas vias areas superiores aproximadamente 3 a 5C inferior temperatura corporal, o que pode restringir a replicao de alguns vrus. Por isso, os vrus incapazes de replicar temperatura corporal (rinovrus), replicam somente no trato respiratrio superior. J os vrus capazes de replicar sob temperatura corporal, podem causar infeco no trato respiratrio inferior. Os vrus geralmente penetram no trato respiratrio atravs de aerossis produzidos por expectoraes (tosse e espirro) ou pelo contato nasal com fmites contaminados. O hbito investigativo olfatrio de vrias espcies animais se constitui em um fator de risco que favorece as infeces da mucosa nasal e do focinho. A maioria dos vrus que penetra por essa via realiza a replicao primria em clulas epiteliais das vias respiratrias; alguns podem replicar em macrfagos livres no lmen respiratrio ou em espaos subepiteliais. A replicao dos vrus que penetram pelas vias areas pode car restrita ao epitlio respiratrio

ou se disseminar para outros tecidos e rgos. Ou seja, os vrus que penetram pelo trato respiratrio podem produzir infeces localizadas ou disseminadas (Tabela 8.3). Os tecidos subjacentes ao epitlio respiratrio possuem vasos linfticos e sangneos que facilitam a disseminao dos vrus at os rgos linfides secundrios e da para o sangue (Figura 8.3B).

3.1.3 Orofaringe e trato digestivo


A mucosa do trato digestivo, desde a orofaringe at os segmentos nais do intestino, pode se constituir em local de penetrao para vrios vrus, que produzem tanto infeces localizadas como sistmicas. Os vrus adquiridos pela ingesto de alimentos ou gua contaminada, ou pelo contato oral com fmites, podem ser deglutidos e alcanar o estmago e intestinos; ou podem infectar as clulas superciais da orofaringe. Os vrus que replicam na orofaringe podem ser, posteriormente, deglutidos ou podem se disseminar sistemicamente pela via hematgena. Os rotavrus, coronavrus, calicivrus e muitos enterovrus produzem infeces localizadas no intestino delgado; o parvovrus canino penetra na mucosa da orofaringe e, por via hematgena, atinge o epitlio intestinal, onde replica e provoca distrbios celulares que resultam em doena; o vrus da diarria viral bovina (BVDV) pode penetrar na mucosa da orofaringe e se disseminar sistemicamente. Alguns vrus podem penetrar atravs

Patogenia das infeces vricas

201

da mucosa intestinal e causar doena sistmica, como alguns adenovrus de aves e de mamferos e alguns enterovrus. O trato digestivo apresenta vrias barreiras que restringem ou dicultam a infeco por determinados vrus. O pH cido do estmago, a alcalinidade do intestino delgado, as enzimas digestivas presentes na saliva e no suco pancretico, e as enzimas lipolticas presentes na bile restringem o nmero de vrus que capaz de infectar o hospedeiro por essa via. Como regra, os vrus no-envelopados so mais resistentes ao pH cido do estmago. Excees incluem os rinovrus e o FMDV (picornavrus), que so lbeis pH cido e no resistem ao pH do estmago. Para estabelecer a infeco, portanto, esses vrus devem penetrar na mucosa orofarngea ou nasal. Embora sejam sensveis ao pH baixo e ao da bile, os coronavrus de vrias espcies animais resistem s condies do estmago e intestino e podem estabelecer infeces intestinais. Em geral, os vrus que causam infeces intestinais, como os rotavrus, calicivrus e enterovrus, so resistentes ao pH baixo e ao da bile e, por isso, podem penetrar a partir do lmen intestinal. As enzimas proteolticas presentes no lmen intestinal podem tambm favorecer a infeco por alguns vrus, pela clivagem e ativao de protenas da superfcie dos vrions que so envolvidas na penetrao do vrus na clula hospedeira. Como exemplos, citam-se: a tripsina, pancreatina e elastina que aumentam a infectividade dos rotavrus; e outras enzimas que ativam os processos de penetrao dos reovrus e de alguns coronavrus. Enzimas presentes em secrees respiratrias tambm tm sido envolvidas na ativao de protenas de fuso dos paramixovrus. Os vrus associados com gastrenterite podem infectar uma variedade de clulas do trato gastrintestinal. Os adenovrus, rotavrus, calicivrus e coronavrus infectam predominantemente entercitos maduros quiescentes. Outros vrus possuem tropismo por clulas das criptas que esto em diviso (parvovrus) ou por clulas epiteliais especializadas, como as clulas M (poliovrus e reovrus). As clulas M podem tambm capturar vrions no lmen intestinal e transport-

los para clulas mononucleares adjacentes, onde ocorrer a replicao primria (Figura 8.3C). Dentre os vrus animais que penetram pelo trato digestivo e esto associados com diarria esto os parvovrus (canino e felino), os rotavrus de vrias espcies, os coronavrus entricos, os astrovrus e calicivrus. Outros vrus penetram pelo trato digestivo e esto associados com doena disseminada, geralmente sem diarria, como os adenovrus de vrias espcies, os enterovrus, o vrus do exantema vesicular de sunos, entre outros. Estes vrus utilizam o epitlio intestinal para a replicao primria e amplicao, de onde ganham acesso ao sistema linftico e sangneo (Figura 8.3C).

3.1.4 Mucosa urogenital


A mucosa do trato genital da fmea pode servir de local de penetrao tanto para vrus sistmicos, que so excretados no smen, como para vrus que produzem infeces localizadas no trato genital masculino. No primeiro caso, a transmisso pode ser pela monta natural ou pela inseminao articial, j que os vrus encontram condies ideais de sobrevivncia em smen industrializado. Os herpesvrus de vrias espcies animais podem ser transmitidos pelo smen e/ou pela cpula; o vrus da sndrome respiratria e reprodutiva dos sunos (PRRSV) foi amplamente disseminado pela inseminao articial; a monta natural uma importante forma de transmisso do vrus da arterite viral eqina (EAV). Os papilomavrus que causam leses genitais tambm podem ser transmitidos pela cpula, por causa do contato entre as mucosas. Embora o BoHV-1 possa ser excretado pelo smen durante a infeco aguda respiratria, a transmisso venrea desse vrus est mais freqentemente associada com a infeco genital (balanopostite). Os tecidos submucosos so altamente irrigados e fornecem condies propcias para a disseminao dos vrus pela linfa ou pelo sangue para os linfonodos regionais ou para tecidos mais distantes. As terminaes nervosas, localizadas na submucosa, constituem-se em alvos para a pe-

202

Captulo 8

netrao pelos herpesvrus, que so, ento, transportados at gnglios nervosos regionais. Embora com menor freqncia, fmeas que desenvolvem infeces genitais tambm podem transmitir o vrus para o macho durante a cpula, o que favorece a disseminao do agente, pois o macho infectado pode transmitir o agente para outras fmeas.

3.2 Infeces localizadas versus infeces disseminadas (ou sistmicas)


Os padres de distribuio e envolvimento de diferentes rgos e tecidos variam amplamente com os vrus e esto intimamente associados com a biologia do agente, sendo dependentes de suas interaes com o hospedeiro. Alguns vrus produzem infeces localizadas, geralmente limitadas s proximidades dos stios de penetrao e replicao primria. Esse padro de infeco caracterstico dos vrus respiratrios (rinovrus, vrus da inuenza e parainuenza), gastrintestinais (coronavrus e rotavrus) e de alguns vrus que infectam a derme e epiderme (papilomavrus, alguns poxvrus, vrus da mamilite herptica [BoHV-2]). Essas infeces esto geralmente limitadas ao epitlio, mas a penetrao e envolvimento de tecidos subjacentes e disseminao sistmica podem ocasionalmente ocorrer. As infeces que se restringem aos stios de replicao primria e suas proximidades so ditas localizadas. Outros vrus so capazes de se disseminar a longas distncias pelo sangue ou pela linfa e produzir infeces em rgos especcos ou infeces generalizadas. Exemplos incluem o CDV, os parvovrus canino (CPV) e felino (FPLV), o BVDV, os retrovrus, entre outros. As infeces que se estendem alm dos stios de replicao primria so chamadas de disseminadas; e as que atingem vrios rgos ou sistemas so denominadas sistmicas ou generalizadas.

entanto, no permite uma disseminao a longas distncias e essas infeces so geralmente controladas pela resposta imune do hospedeiro. Os vrus que penetram na mucosa respiratria ou digestiva e que so liberados pela superfcie apical de clulas epiteliais podem ser transportados por uidos ou pelo muco e se disseminar rapidamente pelo lmen do rgo. A replicao de muitos desses vrus ca restrita ao epitlio, com nenhuma ou pouca invaso dos tecidos subjacentes. Paralelamente, os vrions podem ser transportados at os linfonodos regionais, livres na linfa ou no interior de clulas fagocticas. Esta geralmente a primeira etapa na disseminao das infeces sistmicas. Em geral, os vrus que so liberados apenas na superfcie apical das clulas epiteliais tendem a car restritos localmente, enquanto aqueles que so liberados tambm pela superfcie basolateral so mais provveis de produzirem infeces sistmicas.

3.2.2 Disseminao hematgena


O transporte pelo sangue oferece aos vrus a oportunidade de atingir virtualmente todos os rgos e tecidos em poucos minutos a partir dos stios de replicao primria. Os vrions podem penetrar no sangue diretamente atravs da parede capilar, aps a infeco de clulas endoteliais ou pela inoculao direta por insetos ou por instrumentos contaminados. A disseminao hematgena se inicia quando os vrions produzidos nos stios primrios de replicao so liberados no lquido extracelular e drenados pelo sistema linftico, cujos capilares so mais permeveis do que os capilares sangneos. Os vrions veiculados pela linfa eventualmente ganham acesso corrente sangnea, seja como partculas livres no plasma, seja no interior de linfcitos ou moncitos/macrfagos infectados durante a sua passagem pelos linfonodos regionais. De fato, a patogenia de vrias infeces vricas est intimamente associada com a infeco de clulas do sistema imunolgico, que ocorre devido ao seu contato com os vrions nos rgos linfides perifricos. Uma vez no sangue, os vrions se disseminam rapidamente pelo organismo. O trajeto

3.2.1 Disseminao local


Aps a replicao primria, muitos vrus se disseminam localmente pela transmisso entre clulas vizinhas. Essa forma de transmisso, no

Patogenia das infeces vricas

203

Superfcie corporal

Seios linfticos revestidos por macrfagos Capilar linftico Tecido linfide Veia

Capilar sangneo

Histicito

Tecido conjuntivo

Vaso linftico aferente

Vaso linftico eferente Linfonodo

Ducto torcico

Fonte: adaptada de Mims e White (1984).

Figura 8.4. Trajeto dos vrus que penetram pela pele ou mucosas superficiais para atingir o sangue e se distribuir sistemicamente.

utilizado pelos vrus que penetram no organismo atravs de superfcies cutneas ou mucosas para atingir a corrente sangnea est ilustrado na Figura 8.4. A presena de vrus no sangue denominada viremia e, dependendo da origem do vrus, pode ser classicada em passiva ou ativa. A viremia passiva resulta da introduo do vrus diretamente no sangue, sem a prvia replicao em tecidos. Esta introduo pode resultar de inoculao direta por insetos hematfagos, por transfuso sangnea ou por outras formas de inoculao de sangue. Essas viremias so geralmente transitrias e no duram mais de 12-24 h, mas podem ser de tal magnitude a ponto de provocar a infeco macia de alguns rgos. As viremias ativas resultam da replicao viral em tecidos e rgos do hospedeiro e geralmente atingem uma maior magnitude e durao. Os vrus presentes no sangue podem ter vrias origens, tais como: a) partculas vricas presentes nos tecidos prximos aos locais de penetrao podem ser capturadas pelo sistema linftico e ter acesso ao sangue; b) vrios vrus replicam em clulas localizadas nos linfonodos, podendo ser liberados e ter acesso ao sangue; c) alguns vrus so capazes de replicar

em clulas endoteliais e so liberados diretamente na circulao; d) vrios vrus replicam em clulas mononucleares do sistema linforreticular (moncitos/macrfagos; linfcitos) e podem ser liberados no sangue. Em vrias infeces vricas, duas etapas de viremia ativa podem ser detectadas. A viremia primria resulta da replicao viral nos stios iniciais, geralmente atinge baixa magnitude, mas permite a disseminao do vrus aos rgos secundrios de replicao, denominados rgos-alvo. A replicao viral nesses tecidos produz uma viremia secundria, caracterizada por uma presena macia de vrus no sangue e disseminao ainda maior da infeco. Os resultados da viremia so variveis e, freqentemente, resultam em infeco de vrios tecidos perifricos, com resultados que dependem do tropismo, da patogenicidade e virulncia do vrus. Uma conseqncia freqente de viremia em animais a transmisso transplacentria do vrus ao feto, podendo resultar em uma variedade de condies que vo desde uma infeco transitria at a morte fetal, seguida de abortamento. As etapas da patogenia das infeces vricas localizadas e disseminadas esto ilustradas na Figura 8.5.

204

Captulo 8

Superfcie corporal

Infeco

Excreo Herpesvrus Influenza Paramixovrus Rotavrus Papilomavrus Coronavrus

Replicao primria

Pele Mucosas Trato respiratrio Trato digestivo

Linfonodos

Sangue

Viremia primria

Replicao secundria

rgos/tecidos

Medula ssea

Msculo

Fgado

Bao

Endotlio vascular

Sangue

Viremia secundria

Transmisso iatrognica ou por vetores

Epitlio respiratrio

Pele

Encfalo

rgos/tecidos

Glndula salivar ou rins

Trato respiratrio (pulmes)

Replicao secundria

CDV Rinderpest

Lumpy skin

CDV, Togavrus Flavivrus

Raiva (g.salivar) Arenavrus

Arenavrus hantavrus

Excreo

Fonte: adaptada de Mims e White (1984).

Figura 8.5. Etapas da patogenia das infeces vricas localizadas e sistmicas: papel da viremia na disseminao das infeces.

Patogenia das infeces vricas

205

No sangue, os vrions podem ser transportados livres no plasma, no interior de leuccitos ou aderidos membrana de leuccitos, eritrcitos ou plaquetas. Os avivrus, togavrus, enterovrus e parvovrus circulam livres no plasma e produzem a chamada viremia plasmtica. A concentrao de partculas vricas no sangue depende de um equilbrio entre a sua produo nos tecidos infectados e a taxa de remoo ou inativao no sangue. A tarefa de remover vrions circulantes cabe s clulas fagocticas do sistema retculo-endotelial, principalmente s clulas de Kpfer no fgado e, em menor proporo, aos macrfagos dos pulmes, bao e linfonodos. Os vrus que circulam livres no plasma podem entrar em contato e infectar uma grande variedade de clulas, mas dois tipos celulares desempenham um papel importante para a continuidade da infeco: as clulas endoteliais e os macrfagos adjacentes aos vasos. As interaes entre os vrions circulantes e as clulas de Kpfer no fgado podem resultar em: a) internalizao e inativao dos vrions; b) internalizao, transporte transcitoplasmtico e liberao dos vrions na bile; c) infeco dessas clulas e liberao da prognie viral de volta ao sangue, incrementando a viremia; d) infeco celular e liberao dos vrions recm-produzidos pela superfcie basal, resultando na infeco macia de hepatcitos. A infeco das clulas endoteliais pode favorecer a invaso viral nos tecidos a partir do sangue. Em etapas mais avanadas da infeco, os anticorpos produzidos so capazes de se ligar e neutralizar as partculas vricas livres no plasma sangneo. A ligao dos anticorpos aos vrions tambm facilita a fagocitose dos complexos anticorpo-vrions por macrfagos adjacentes aos vasos sangneos teciduais. Esses macrfagos se ligam aos complexos imunes por meio de receptores para a poro Fc das imunoglobulinas. A maioria das viremias plasmticas possui durao limitada e o seu trmino coincide com o aparecimento de anticorpos neutralizantes no soro. Vrios vrus replicam em clulas sangneas, particularmente moncitos e linfcitos B e T, e a sua presena no sangue est predominantemente associada com essas clulas. As viremias associadas a clulas apresentam algumas caractersticas

que as distinguem das viremias plasmticas, tais como: a) no interior das clulas os vrus esto protegidos dos anticorpos neutralizantes e podem se propagar a grandes distncias; b) os ttulos virais so geralmente baixos; c) o isolamento do vrus do sangue geralmente difcil e pode requerer o co-cultivo de leuccitos com clulas de cultivo. Essa diculdade de isolamento pode ser devida aos baixos nveis de replicao do vrus e/ou presena de anticorpos neutralizantes; d) em algumas infeces, a viremia persiste por toda a vida do animal e no termina com o aparecimento dos anticorpos neutralizantes. Exemplos desse tipo de viremia so encontrados nas infeces por retrovrus animais, como o FIV, o vrus maedi-visna (MVV), o vrus da leucose bovina (BLV) e o vrus da anemia infecciosa eqina (EIAV). Em algumas dessas infeces, a contnua evoluo gentica da populao viral produz variantes que escapam da neutralizao por anticorpos e que podem ser isolados do plasma. Esses vrus, no entanto, parecem representar uma pequena parcela do total de vrus que produzido e que neutralizado e capturado nos complexos imunes. O vrus da lngua azul (BTV) produz viremia persistente e os vrions encontram-se aderidos membrana dos eritrcitos. Embora mais estudada em infeces persistentes, a viremia associada a clulas tambm observada em infeces agudas, como a infeco de ces pelo CDV, entre outras. O BVDV pode ser encontrado em linfcitos e moncitos, mas viremia plasmtica tambm pode ser detectada em animais persistentemente infectados. Esses animais so imunotolerantes a antgenos virais e, por isso, no produzem anticorpos contra o vrus. Com isso, o vrus infeccioso pode ser continuamente isolado do plasma desses animais.

3.2.1.1 Penetrao dos vrus nos tecidos


Os vrus que se disseminam pela via hematgena devem ultrapassar a parede vascular para invadir e replicar nos tecidos e rgos-alvo. Embora seja uma etapa fundamental na patogenia das infeces por virtualmente todos os vrus patognicos que produzem viremia, poucos detalhes so conhecidos sobre a penetrao dos vrus

206

Captulo 8

nos tecidos. O mecanismo de penetrao utilizado pelos vrus depende da sua biologia e tambm da estrutura e relaes do endotlio vascular, que varia muito entre os diferentes tecidos. Os possveis mecanismos utilizados, j demonstrados para alguns vrus, esto ilustrados na Figura 8.6 e descritos a seguir: 1) Penetrao passiva pelo espao entre as clulas endoteliais. Esse mecanismo possvel em alguns endotlios que apresentam fenestras entre as clulas endoteliais, como o plexo coride no SNC. Aps atravessar esta barreira, os vrus podem infectar as clulas epiteliais do plexo coride e ganhar acesso ao uido crebro-espinhal e, assim, disseminar-se pelos espaos ocupados por esse uido. Exemplos de vrus que provavelmente utilizam essa via de invaso incluem o vrus da coriomeningite linfoctica (LCMV) e o retrovrus (MVV). Os vasos dos tbulos renais, pncreas, clon e leo tambm apresentam fenestras que podem servir para a penetrao dos vrus nos tecidos a partir do sangue; 2) Os vrions podem ser transportados atravs do endotlio vascular por endocitose, seguida de transporte vesicular intracitoplasmtico e exocitose na face oposta da clula endotelial. Para que essas duas formas de invaso possam ocorrer, a concentrao de vrions no sangue deve ser alta e contnua, e o uxo sangneo no local deve ser lento, para permitir o contato e aderncia das partculas vricas ao endotlio e/ou penetrao pelos espaos interendoteliais; 3) Alguns vrus podem infectar as clulas endoteliais e/ou clulas adjacentes e completar o seu ciclo replicativo nessas clulas. Assim, a sua prognie pode ser liberada atravs da superfcie basal ou basolateral dessas clulas e infectar clulas teciduais subjacentes. Essa forma de invaso tecidual j foi demonstrada para os picornavrus, retrovrus, alfavrus e parvovrus. As clulas de Kpfer, que esto localizadas entre as clulas endoteliais dos sinusides hepticos, servem de porta de entrada para vrus que so veiculados no sangue. Os vrus podem ser transportados passivamente ou replicarem ativamente nessas clulas; 4) Os vrus que produzem viremia associada a clulas, em moncitos ou linfcitos, podem ser transportados atravs da parede vascular no in-

terior das clulas infectadas. As clulas mononucleares do sangue esto freqentemente atravessando a parede vascular e penetrando nos tecidos em resposta a estmulos inamatrios e podem funcionar como verdadeiros cavalos de Tria, transportando os vrus para os tecidos. O movimento de clulas atravs do endotlio em direo aos tecidos denominado diapedese. Essa forma de invaso tem sido demonstrada para o CDV, vrus da febre amarela (YFV) e tambm para explicar a penetrao do vrus da imunodecincia humana adquirida (HIV) no encfalo.

2 1 3

Lmen do vaso

Tecido

Figura 8.6. Mecanismos de penetrao de vrus nos tecidos a partir do sangue. 1) Penetrao pelos espaos existentes entre as clulas endoteliais; 2) Transporte ativo atravs das clulas endoteliais; 3) Infeco das clulas endoteliais com posterior egresso da prognie viral na face oposta do endotlio; 4) Transporte atravs do endotlio no interior de moncitos/linfcitos.

3.2.1.2 Infeco celular mediada por anticorpos (antibody-dependent enhancement


of viral infection, ADE)
A ADE um mecanismo utilizado por alguns vrus para penetrar produtivamente e replicar em clulas que expressam receptores para a

Patogenia das infeces vricas

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poro Fc das imunoglobulinas, principalmente os moncitos e macrfagos. Nessas clulas, os receptores de Fc so importantes para a captura e inativao de complexos imunes formados nos uidos e tecidos corporais. O fenmeno de ADE ocorre quando os vrions so recobertos por anticorpos sem atividade neutralizante ou quando os nveis de anticorpos especcos so baixos. Assim, a ligao dos anticorpos no neutraliza a infectividade dos vrions. No entanto, as clulas que expressam receptores para a regio Fc se ligam aos complexos anticorpos-vrions atravs da regio Fc. Essa ligao seguida pela internalizao dos complexos nas clulas, aps a qual os vrions podem ser liberados no citoplasma e iniciar a replicao. Ou seja, alm de no neutralizar a infectividade dos vrions, os anticorpos auxiliam a sua penetrao nas clulas que possuem receptores de Fc. Esse mecanismo somente ocorre para vrus que infectam naturalmente clulas que expressam esses receptores. Embora a ADE j tenha sido demonstrada para vrios vrus in vitro, o seu papel na patogenia das infeces vricas in vivo ainda controverso e parece se restringir a poucos vrus, como o vrus da dengue em humanos e o vrus da peritonite infecciosa felina (FIPV, um coronavrus). Nesses casos, a presena de anticorpos em nveis baixos contra um determinado sorotipo do vrus resulta em um aumento da severidade da doena por ocasio de uma reinfeco com um sorotipo heterlogo. De fato, tem sido demonstrado que a peritonite infecciosa dos gatos mais severa em animais previamente vacinados, reforando a possibilidade de que a ADE contribua na patogenia da doena.

3.2.3 Disseminao nervosa


Vrios vrus se disseminam a partir dos stios de replicao primria no interior de bras nervosas cujas terminaes se distribuem nesses locais. Essa forma de transporte utilizada por vrus essencialmente neuropatognicos (vrus da raiva e vrios alfaherpesvrus) e tambm por vrus cuja invaso do sistema nervoso representa uma circunstncia da sua replicao e disseminao hematgena (reovrus e poliovrus). Alguns vrus, como o CDV e o vrus da artrite e encefa-

lite caprina (CAEV), replicam no SNC e produzem doena neurolgica, porm parecem atingir o encfalo pela via hematgena. Dentre os vrus animais que utilizam a via nervosa para invadir o encfalo e causar doena neurolgica se incluem o BoHV-5, o PRV, o EHV, o vrus da raiva, o vrus da encefalite eqina venezuelana (VEEV) e o vrus da doena de Borna (BDV). Em modelos animais, o VEEV parece tambm utilizar a via hematgena para invadir o encfalo e produzir encefalite. Embora os vrus que se disseminam pela via nervosa e replicam no sistema nervoso sejam denominados classicamente vrus neurotrpicos, esses agentes so capazes de infectar uma variedade de clulas. De fato, a replicao inicial desses vrus ocorre geralmente no epitlio e em tecidos adjacentes aos locais de penetrao, aps a qual os vrions penetram nas terminaes nervosas. O mecanismo de penetrao dos vrus em neurnios parece ser similar ao utilizado para iniciar a infeco de outras clulas. Aps a penetrao e desnudamento, o nucleocapsdeo transportado passivamente ao longo dos processos neuronais (dentritos e axnios) por transporte axoplsmico rpido. O vrus pode ocasionalmente replicar nos axnios ou dendritos, mas este um processo lento e no requerido para a disseminao. Drogas que inibem o transporte axonal (p. ex.: colchicina) tambm bloqueiam a progresso dos vrus o longo dos axnios. Essa forma de disseminao tem sido estudada com detalhes nos alfaherpesvrus, em que o transporte neural at os gnglios sensoriais e autonmicos essencial para o estabelecimento de infeco latente, que, por sua vez, crtica para a manuteno desses vrus na natureza (Figura 8.7). Aps a replicao na mucosa nasal ou genital, os vrions penetram em terminaes dos nervos que se distribuem nas camadas subjacentes. Os vrions ntegros ou partculas subvirais so transportados em vesculas ao longo dos microtbulos dos axnios ou dendritos at os corpos neuronais que se localizam nos gnglios nervosos regionais (gnglio trigmeo, no caso de infeco oronasal; gnglios sacrais, no caso de infeco genital). O transporte axonal de substncias das terminaes nervosas em direo ao corpo neuronal deno-

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Transporte retrgrado Latncia

Crebro
Reativao Transporte antergrado

Mucosa nasal

Gnglio trigmeo

Figura 8.7. Disseminao neural dos alfaherpesvrus animais do epitlio respiratrio para os gnglios sensoriais durante a infeco aguda (transporte retrgrado) e do corpo dos neurnios para o epitlio nasal durante a reativao da infeco latente (transporte antergrado). Durante a infeco aguda (e menos freqentemente durante a reativao), pode ocorrer transporte antergrado em direo ao SNC, com invaso e replicao viral no encfalo.

minado retrgrado. Ao alcanar os corpos neuronais, os alfaherpesvrus replicam ativamente de forma ltica ou estabelecem infeco latente. A infeco latente caracterizada pela presena do genoma viral inativo no ncleo dos neurnios, sem expresso gnica ou produo de prognie viral. Em determinadas circunstncias, geralmente associadas com estresse, ocorre a reativao da infeco, a retomada da expresso gnica e a produo de partculas vricas infecciosas. Essas partculas so transportadas de volta aos locais de replicao primria pelas mesmas vias nervosas que haviam servido de acesso para os vrons aos corpos neuronais. O transporte de vesculas e substncias do corpo neuronal em direo s terminaes nervosas denomina-se antergrado e permite a prognie viral alcanar os tecidos perifricos, replicar e ser excretada. Em alguns vrus (BoHV-5 e PRV), a replicao nos corpos neuronais durante a infeco aguda (e provavelmente tambm durante a reativao da infeco latente) tambm pode ser seguida pelo transporte antergrado da prognie viral ao longo das bras nervosas em direo ao encfalo. Esses vrus so capazes de se transmitir atravs de sinapses nervosas e se disseminar ao longo de circuitos neuronais sinapticamente

ligados, resultando em invaso e replicao no encfalo. As infeces neurolgicas acompanhadas de meningoencefalite severa so freqentes em bovinos infectados pelo BoHV-5 e em sunos jovens infectados pelo PRV. Alguns alfaherpesvrus que causam meningoencencefalite (BoHV-5, por exemplo), parecem invadir o encfalo principalmente pela via olfatria que, provavelmente, se constitui em uma via mais eciente e rpida de transporte do que a via trigeminal. Outros (PRV e BoHV-1) parecem atingir o sistema nervoso, principalmente pelos ramos sensoriais do nervo trigmeo. O transporte neural permite a propagao do vrus aos rgos-alvo sem exposio ao sistema imunolgico. Embora as vias hematgena e neural sejam freqentemente consideradas como vias excludentes (alternativas) de disseminao viral, a patogenia de alguns vrus parece envolver a participao de ambas. A invaso dos vrus das encefalites eqinas do leste (EEEV), oeste (WEEV) e venezuelana (VEEV) no encfalo de animais infectados experimentalmente, por exemplo, j foi demonstrado que pode ocorrer por ambas as vias, embora uma delas provavelmente desempenhe um papel preponderante em infeces naturais.

Patogenia das infeces vricas

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3.3 Localizao das infeces 3.3.1 Infeces em rgos e sistemas especcos


O padro de doena sistmica produzida durante uma infeco depende dos rgos e tecidos-alvo do vrus, das populaes de clulas desses rgos que so infectadas e tambm do tipo de alteraes produzidas pela replicao viral nessas clulas. Felizmente, nenhum vrus capaz de infectar todos os tecidos e clulas do hospedeiro. Na verdade, devido a sua dependncia de processos bioqumicos e moleculares especcos, a maioria dos vrus infecta um nmero limitado de tipos celulares no hospedeiro. As Figuras 8.8 a 8.12 apresentam alguns padres peculiares de disseminao, distribuio e localizao de infeces vricas em ces. O termo tropismo utilizado para designar a predileo dos vrus por determinadas clulas, tecidos ou rgos. Assim, o tropismo um dos principais determinantes da patogenia das infeces vricas. O tropismo celular ou tecidual de um vrus determinado pela interao entre mltiplos fatores virais e celulares, e pode ser inuenciado em diferentes nveis. A constituio e siologia da membrana plasmtica (presena de receptores, co-receptores, atividade endoctica, espessura do citoesqueleto cortical etc.) podem afetar as etapas iniciais da infeco (adsoro, penetrao, desnudamento e transporte intracelular dos vrions). A presena de fatores de transcrio, de transativadores ou inibidores e de enzimas polimerases pode afetar a expresso dos genes virais. Proteases e nucleases celulares podem ativar ou inativar fatores virais. Os mecanismos celulares de transporte e distribuio de macromolculas podem afetar a replicao, distribuio, morfognese e liberao da prognie viral, ou seja, o tropismo de um vrus pode ser determinado por fatores que atuam em qualquer etapa do ciclo replicativo, desde o seu incio at a etapa de egresso das partculas vricas. A presena de receptores especcos na membrana da clula hospedeira o principal fator determinante do tropismo para a maioria dos vrus. Em geral, os receptores virais so restritos

a determinados tipos celulares ou tecidos, e apenas estes podem ser infectados naturalmente. Por isso, a distribuio de receptores nos tecidos e rgos um determinante importante da patogenia dos vrus. Existem vrios exemplos de mutaes naturais ou induzidas nas protenas virais de ligao nos receptores que resultam em alterao no tropismo e/ou na virulncia do vrus mutante. Esses exemplos ilustram a importncia das interaes vrion-receptores como determinantes do tropismo e da patogenia das infeces vricas.

Fonte: www.bakerinstitute.vet.cornell.edu.

Figura 8.8. Patogenia da parvovirose canina. O CPV penetra pela via oronasal e replica inicialmente na orofaringe e nas tonsilas. Aps a replicao primria, o vrus atinge a corrente sangnea e transportado sistemicamente pelo sangue. Os stios de predileo para a replicao secundria so as clulas das criptas do intestino delgado, que expressam o receptor para o vrus e esto em multiplicao ativa. A replicao viral acompanhada de destruio dessas clulas e reposio deficiente das clulas absortivas das vilosidades intestinais. Os ces com gastrenterite pelo CPV apresentam dificuldade de absoro de nutrientes, diarria hemorrgica e desidratao. A infeco pelo CPV em filhotes caninos com menos de seis semanas de idade pode ser caracterizada por miocardite, pois nessa fase as clulas do miocrdio esto em constante mitose.

Embora aparentemente seja o principal determinante do tropismo, a presena dos receptores no o nico fator que determina a capacidade do vrus infectar um determinado tipo celular. Para alguns vrus DNA e retrovrus, a transcrio dos genes virais pode ser inuenciada pela presena de fatores de transcrio e/ou inibidores celulares. A penetrao em clulas que no

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apresentem tais fatores pode resultar em infeco abortiva, pois os genes virais no so expressos ou so expressos em quantidades insucientes

vrions, que ocorre com ecincia diferente conforme o tipo celular. Assim, o tropismo desses vrus parcialmente determinado pela capacidade de determinadas clulas de clivar a protena viral de fuso. Esses exemplos ilustram a variedade de fatores celulares que podem ser determinantes do tropismo dos vrus por determinados tipos celulares.

Fonte: www.bakerinstitute.vet.cornell.edu.

Figura 8.9. Patogenia da coronavirose canina. O coronavrus canino (CCoV) penetra pela via oral pela ingesto de gua ou alimentos contaminados. O vrus atinge o intestino pela passagem direta pelo trato digestivo, pois resiste ao pH cido do estmago. No intestino, o vrus infecta inicialmente as clulas das vilosidades do duodeno e posteriormente se dissemina at o leo. A replicao nas clulas absortivas das vilosidades provoca uma enterite, que resulta em reduo da absoro de nutrientes, diarria e desidratao. O vrus excretado nas fezes um a dois dias aps a infeco. O CCoV pode, ainda, disseminar-se aos linfonodos mesentricos e, ocasionalmente, replicar no bao e fgado.

Fonte: www.bakerinstitute.vet.cornell.edu.

Os parvovrus dependem da atividade da DNA polimerase celular e fatores associados para a replicao do seu genoma; por isso esses vrus apresentam tropismo marcante por clulas em diviso. Os papilomavrus dependem de clulas cuja sntese e transporte de nucleotdeos para o ncleo estejam ativos, alm da atividade da DNA polimerase celular. O transporte de nucleocapsdeos at as proximidades dos poros nucleares uma atividade requerida para a replicao dos adenovrus. A integrao do provrus DNA de alguns retrovrus somente ocorre em clulas em atividade mittica. A replicao dos papilomavrus est estritamente associada com o estgio de diferenciao dos queratincitos e dos fatores celulares expressos por essas clulas. A capacidade infectiva dos coronavrus e paramixovrus inuenciada pela clivagem e maturao da protena envolvida na fuso e penetrao dos

Figura 8.10. Patogenia da hepatite infecciosa canina. A infeco pelo adenovrus canino tipo 1 (CAdV-1) pode ocorrer pela via oral, nasofaringeal e/ou conjuntival, seguida de replicao primria nas tonsilas e placas de Peyer. Durante a viremia primria, o vrus se dissemina no organismo e infecta as clulas endoteliais dos vasos e as clulas parenquimais de vrios tecidos. A replicao no parnquima heptico resulta em hepatite, com a ocorrncia de hemorragia e necrose no rgo. Tambm so encontradas leses na crnea e glomerulonefrite, resultantes da deposio de imunocomplexos. O epitlio tubular renal um stio de acesso limitado do sistema imune, permitindo a persistncia do CAdV-1 nesse local por vrios meses.

A distribuio dos vrus nos tecidos e rgos do organismo depende de um balano entre o padro de disseminao e o seu tropismo celular e tecidual. Os vrus que se disseminam pela via hematgena podem ter acesso a virtualmente todos os tecidos do organismo. No entanto, a maioria desses vrus infecta apenas alguns tecidos ou rgos ou podem ainda infectar apenas algumas clulas especcas nesses rgos. Em resumo, a disseminao hematgena permite ao vrus atingir virtualmente todos os tecidos, mas no assegura que a replicao ir ocorrer em todos os tecidos potencialmente atingidos. Por outro lado, a disseminao neural predominantemente dire-

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cional, pois o vrus se dissemina ao longo de circuitos neuronais sinapticamente ligados e infecta as populaes de neurnios que recebem bras dos neurnios previamente infectados. Durante a transmisso transinptica, alguns vrions podem se disseminar localmente e infectar clulas vizinhas, mas esta infeco ca geralmente limitada. O egresso de vrions dos corpos neuronais no SNC, por outro lado, pode resultar em disseminao local e infeco de outros neurnios e tambm de clulas da glia.

ciam a sua disseminao e localizao no organismo. Cada vrus, em particular, produz um ou mais padres caractersticos de disseminao e localizao de suas infeces. importante ressaltar que cepas ou isolados de um mesmo vrus podem apresentar padres diferentes de disseminao e distribuio, podendo resultar em manifestaes clnico-patolgicas distintas. A seguir sero abordadas sucintamente as caractersticas das infeces nos principais rgos ou sistemas do organismo. Detalhes da patogenia de cada infeco vrica sero abordados nos captulos especcos.

Fonte: www.bakerinstitute.vet.cornell.edu.

Figura 8.11. Patogenia da traqueobronquite infecciosa canina. Essa enfermidade pode ser causada por vrios agentes virais e bacterianos, incluindo o vrus da parainfluenza canina (CPIV-2) e o adenovrus canino tipo 2 (CAdV-2). Os agentes penetram pela via respiratria e replicam inicialmente no epitlio da nasofaringe. Posteriormente a infeco se dissemina para o epitlio pseudo-estratificado ciliado da traquia. A injria epitelial pela replicao viral e o processo inflamatrio resultam em perda da funo ciliar, aumento da produo de muco, com a ocorrncia de tosse seca, engasgos e aumento da secreo nasal. A progresso da infeco para o trato respiratrio inferior depende da infeco concomitante com bactrias e o quadro clnico-patolgico pode evoluir para pneumonia, com tosse produtiva e febre. As infeces pelo CPIV-2 e pelo CAdV-2 so geralmente restritas ao sistema respiratrio, no causando viremia ou disseminao sistmica.

Fonte: www.bakerinstitute.vet.cornell.edu.

A localizao especca das infeces, isto , a distribuio do vrus em rgos, tecidos e em grupos de clulas especcas determinada por vrios fatores, que incluem a via de penetrao e replicao primria, a via de disseminao, o tropismo tecidual e celular do vrus. Alm desses fatores, as interaes do vrus com os mecanismos imunolgicos do hospedeiro tambm inuen-

Figura 8.12. Patogenia da cinomose canina. O CDV penetra geralmente pela via oronasal e replica inicialmente nos epitlios e em macrfagos das vias areas superiores, faringe e tonsilas. A replicao primria seguida de viremia que permite a disseminao sistmica do vrus e infeco de uma variedade de linfonodos e acmulos linfides, levando a um quadro de imunossupresso. Em ces que no conseguem montar uma resposta imune eficiente, o vrus produz uma viremia secundria, dissemina-se e replica em uma variedade de tecidos, incluindo clulas epiteliais da pele, dos tratos digestivo, respiratrio e urinrio, no sistema nervoso central e no sistema retculo-endotelial. Esses animais podem apresentar uma variedade de manifestaes clnicas, que possuem correlao com os rgos/ tecidos afetados. A incapacidade de erradicar o vrus pode resultar em persistncia viral no SNC.

3.3.2 Infeces da pele e tegumento


As clulas da epiderme e derme se constituem em alvos de replicao de vrios vrus. Esses tecidos podem se constituir nos stios de replicao primria aps transmisso por contato,

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abrases, vetores mecnicos (alguns poxvrus e herpesvrus, papilomavrus) ou se constituir em stios de replicao secundria aps uma disseminao hematgena (alguns poxvrus, CDV). Por outro lado, os vrus que replicam na pele ou na transio muco-cutnea oronasal e genital podem produzir infeces localizadas (papilomavrus) ou se disseminar para outros rgos a distncia pela via sangnea (vrios poxvrus e alguns herpesvrus) ou neural (vrios herpesvrus). O tecido drmico e subdrmico so ricos em clulas e capilares sangneos e linfticos, a partir dos quais os vrus podem se disseminar pelo organismo (ver Figuras 8.3A e 8.4). Os efeitos da replicao viral nesses locais so mais pronunciados e visveis em reas desprovidas de plos, como as extremidades das orelhas, a transio muco-cutnea do focinho, da vulva, bere e tetas, prepcio e escroto. As infeces por contato freqentemente resultam em leses delimitadas, com o desenvolvimento de eritema e edema localizados, mculas, ppulas, formao e ruptura de vesculas, pstulas e eroses. As eroses e a contnua exsudao podem levar ao acmulo de brina, formando membranas nas que recobrem as leses e, posteriormente, dessecam e formam crostas. A contaminao bacteriana das vesculas pode levar formao de pstulas. Na infeco por alguns vrus (p. ex.: vrus do ectima contagioso dos ovinos), as crostas que se desprendem das leses contm o vrus e podem mant-lo vivel durante meses no meio ambiente, servindo de fonte de infeco para outros animais. Algumas infeces sistmicas podem resultar na formao de eritema, petquias e sufuses na pele e/ou mucosas, sem estarem necessariamente associadas com a replicao viral nesses locais. Nesses casos, essas patologias esto associadas com alteraes/leses no endotlio vasculares e/ou com decincias sistmicas na coagulao sangnea (p. ex.: trombocitopenia). Embora vrios vrus produzam infeces cutneas e, assim, esto presentes nas leses, nem todos utilizam esta via de excreo para serem transmitidos. Excees so os herpesvrus, alguns poxvrus e os papilomavrus, que podem ser transmitidos de forma mecnica por vetores

ou por contato a partir das leses superciais (ver Figura 8.5).

3.3.3 Infeces do trato respiratrio


Estima-se que aproximadamente 90% das infeces respiratrias de animais possuam etiologia viral, isoladamente ou em infeces mistas. A anatomia e siologia do trato respiratrio favorecem o estabelecimento de infeces veiculadas por aerossis, poeiras ou transmitidas por contato direto ou indireto. Dentre os fatores que favorecem as infeces respiratrias podese mencionar: a) a inalao contnua de grande quantidade de ar potencialmente contaminado; b) o hbito investigativo olfatrio de vrias espcies animais; c) a grande superfcie das vias respiratrias, que se estendem desde as fossas nasais at os alvolos pulmonares; d) a diversidade do epitlio que reveste os diferentes segmentos do trato respiratrio; e) o gradiente de temperatura entre as fossas nasais (33C) e os alvolos (temperatura corporal), que favorece a replicao de alguns vrus; f) alm dos aspectos que favorecem a replicao viral no epitlio respiratrio ou em tecidos anexos, a abundncia e acessibilidade do tecido linfide e a irrigao presente nos tecidos subjacentes facilita a disseminao sistmica desses vrus (ver Figura 8.3B). Da mesma forma, a anatomia especca do epitlio olfatrio fornece uma conexo direta com o SNC, o que favorece a invaso do encfalo por vrios vrus (ex. BoHV5). Por isso, apesar dos mecanismos naturais de defesa (muco e epitlio ciliar), o epitlio do trato respiratrio um importante local de replicao para vrios vrus. Os vrus que replicam no trato respiratrio podem produzir infeces localizadas (p. ex.: vrus da inuenza, vrus da parainuenza, vrus sinciciais respiratrios) ou se disseminar a partir desse local e infectar outros rgos e sistemas (CDV, BoHV-1 e 5 e BVDV) (ver Tabela 8.3). Alguns vrus tendem a replicar nas vias areas superiores, causando rinite ou rinotraquete (rinovrus e BoHV-1), outros replicam em segmentos intermedirios, provocando traquete ou bronquite (vrus da inuenza), enquanto outros atingem regies mais internas e podem estar as-

Patogenia das infeces vricas

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sociados com bronquiolite e pneumonia (vrus sincicial respiratrio bovino, BRSV). A replicao viral no epitlio respiratrio acompanhada de edema e inamao, resultando em interrupo da atividade ciliar, perda da integridade da camada de muco e destruio focal ou multifocal de clulas epiteliais. A destruio do epitlio e a perda da atividade ciliar contribuem para a colonizao bacteriana secundria. O auxo de clulas inamatrias e acmulo de transudato resultam no aumento da rea desprovida de muco e na exposio da superfcie celular. A infeco pode induzir a produo local de citocinas, que exacerbam o processo inamatrio e contribuem para a manifestao de sinais clnicos. Em estgios avanados, o edema da mucosa associado com o acmulo de transudato, inltrado inamatrio e restos celulares necrticos podem levar reduo importante do lmen e conseqente diculdade respiratria. Contaminaes bacterianas secundrias so freqentes em vrias infeces vricas e, muitas vezes, so as responsveis pela severidade do quadro clnico. Alm dos vrus que produzem infeces localizadas pela sua replicao no epitlio respiratrio, outros vrus utilizam esse epitlio como porta de entrada para a replicao primria e infeco de outros rgos (ver Tabela 8.3). O BoHV-1 replica no trato respiratrio e produz rinotraquete, mas tambm pode se disseminar sistemicamente e infectar o feto. O BoHV-5 e o PRV replicam no epitlio nasal e invadem o SNC, onde replicam maciamente e provocam meningoencefalite. O BVDV pode penetrar e replicar na mucosa nasofarngea, a partir da qual se dissemina sistemicamente e pode infectar o feto, podendo causar aborto ou malformaes. O CDV tambm pode utilizar a replicao respiratria como etapa inicial de uma disseminao sistmica. Os parvovrus podem atingir o epitlio intestinal ou o feto aps replicao primria e disseminao a partir da mucosa orofarngea. Nos vrus que atingem os rgos-alvo por viremia, a replicao secundria ocorre no tecido linfide adjacente mucosa respiratria e tambm nos linfonodos regionais. Os vrus que replicam no trato respiratrio, produzindo infeces respiratrias ou sistmicas, so excretados no muco nasal e/ou na saliva e

podem ser expelidos pela tosse, espirro, expectoraes ou durante a ingesto de gua e alimentos. Esses agentes so transmitidos por contato direto ou indireto e alguns podem ser veiculados por aerossis a distncias relativamente grandes.

3.3.4 Infeces do trato digestivo


As infeces vricas do trato gastrintestinal (TGI) so muito comuns, sendo superadas em freqncia somente pelas infeces respiratrias. A anatomia e siologia dos rgos que compem o TGI tambm oferecem condies favorveis para a instalao de infeces virais. Dentre estas se destacam a exposio a uma grande quantidade de agentes ingeridos com a gua e alimentos, a grande rea de superfcie e a existncia de diferentes tipos de epitlio nos vrios segmentos do TGI. As infeces intestinais ocorrem de forma direta, pela ingesto de partculas vricas (coronavrus, rotavrus e calicivrus), ou de forma indireta, por via hematgena aps a replicao viral na orofaringe (parvovrus). Os vrus que atingem o intestino aps a ingesto devem ser capazes de resistir ao pH cido do estmago e aos sais biliares do intestino delgado para estabelecer a infeco. Aps resistir a essas adversidades, o vrus deve ultrapassar a camada de muco e penetrar nas clulas epiteliais para iniciar a infeco. De acordo com a sua biologia, os vrus associados com infeco do TGI podem ser divididos em trs grupos principais: a) os vrus associados primariamente com replicao no TGI e que causam gastrenterite (parvovrus, calicivrus, astrovrus, coronavrus e rotavrus); b) os vrus excretados nas fezes, mas que no so enteropatognicos (vrios enterovrus, picornavrus, alguns adenovrus; vrus que causam hepatites); e c) vrus sistmicos que replicam no TGI e em outros rgos, podendo estar associados com gastrenterite (exemplo: BVDV). Infelizmente, a biologia de muitos vrus associados primariamente com gastrenterite muito pouco conhecida, pois muitos deles no replicam bem em cultivo celular, o que diculta o seu estudo e a produo de reagentes para o diagnstico.

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Vrus de vrias famlias replicam no TGI e esto primariamente associados com doena entrica e diarria. Embora esses agentes estejam freqentemente associados com enterite com caractersticas clnicas semelhantes, a sua patogenia apresenta algumas diferenas importantes. A maioria desses vrus atinge o intestino pela via oral e replica nos entercitos maduros das regies mais altas das vilosidades do intestino delgado (ID) (Figura 8.13). Os vrus que replicam e destroem essas clulas provocam a reduo da capacidade digestiva e absortiva do rgo, resultando em reteno de material parcialmente ou no-digerido no lmen intestinal. Isso leva reteno de gua, aumento de volume e fermentao excessiva nos segmentos terminais do ID e no intestino grosso, exacerbando o efeito osmtico que atrai gua para o lmen intestinal. Essa condio conhecida como sndrome da m-absoro primria. Os parvovrus atingem o intestino delgado pela via sangnea, aps a replicao na orofaringe. Esses vrus infectam as clulas das criptas intestinais, que so imaturas e se constituem nas clulas progenitoras dos entercitos das vilosidades (Figura 8.13). As clulas das criptas so os alvos principais de replicao do CPV e FPLV, pelo fato de apresentarem uma taxa acelerada de diviso, o que favorece a replicao viral. Essas

clulas esto em diviso ativa, pois so encarregadas de substituir gradativamente as clulas das vilosidades que vo sendo esfoliadas. Com a destruio das clulas das criptas pela replicao viral, a substituio das clulas das vilosidades se torna deciente. Isso leva tambm decincia dos processos absortivos do ID, o que caracteriza a sndrome de m-absoro secundria. A destruio das clulas das criptas pela replicao viral resulta em achatamento das vilosidades e reao inamatria severa. A destruio de entercitos maduros leva exposio das camadas adjacentes, hemorragia e desidratao. A presena de sangue nas fezes se constitui em um achado freqente em vrias infeces vricas intestinais, podendo estar associada com nveis importantes de mortalidade. Em ambos os casos, as vilosidades se tornam atroadas e achatadas, podendo ocorrer necrose progressiva e descamao. Embora a maioria desses vrus replique preferencialmente no epitlio do ID, alguns deles podem infectar as clulas epiteliais das vilosidades do intestino grosso. Em geral, a replicao desses vrus ca restrita ao epitlio do intestino, com pouca ou nenhuma replicao em clulas da lmina prpria e tecidos subjacentes. Outros vrus infectam populaes especcas de clulas, alm das clulas epiteliais, como os astrovrus (clulas M e das placas de Peyer do ID).

A
movimento dos entercitos em maturao

B
Rotavrus Astrovrus Calicivrus Coronavrus Adenovrus Torovrus Torovrus Astrovrus

Vilosidade

Entercitos maduros (no-mitticos, absortivos) Epitlio do Dome (clulas M)

Clulas das criptas (mitticas, secretrias)

Placas de Peyer Linfonodo

Parvovrus Torovrus

Fonte: adaptada de Conner e Ramig (1997).

Figura 8.13. Ilustrao simplificada da estrutura do epitlio do intestino delgado (A) e local de replicao de alguns vrus entricos (B).

Patogenia das infeces vricas

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O BVDV est freqentemente associado com quadros de enterite, nos quais a replicao viral nos epitlios e/ou no tecido linfide adjacente resulta em leses erosivas e ulcerativas disseminadas pelo trato GI. Com certa freqncia, essas leses podem ser observadas ao longo do TGI, incluindo a lngua, mucosa oral, esfago, rmen, abomaso e intestino delgado. Alm da replicao nas clulas epiteliais, o carter sistmico do agente e a sua capacidade de replicar em clulas do sistema linforreticular provavelmente contribuem para a patogenia dessas leses. Os vrus que replicam no epitlio intestinal ou em rgos anexos (fgado) geralmente so excretados em altos ttulos nas fezes e so transmitidos principalmente pela via fecal-oral. Esses vrus so geralmente resistentes s condies ambientais, o que favorece a sua sobrevivncia no ambiente e transmisso. Os vrus hepatotrpicos (p. ex.: CAdV-1 e hepadnavrus) tambm so excretados nas fezes. Alguns vrus replicam em rgos anexos ao trato digestivo e so excretados pela saliva, podendo ser transmitidos por mordeduras (vrus da raiva em ces, gatos e morcegos; arenavrus entre roedores; herpesvrus B em macacos) ou pelo contato direto ou indireto com as secrees contaminadas (CDV, CAdV-1 e FMDV).

3.3.5 Infeces do sistema nervoso central


O SNC se constitui em rgo-alvo para a replicao de diversos vrus, cuja infeco geralmente revestida de signicado especial pela sua importncia. Os vrus que produzem infeces neurolgicas e encefalite geralmente invadem o encfalo atravs dos nervos, mas vrios deles podem atingir esse rgo pela via hematgena. Os vrus que replicam em clulas do sistema nervoso so ditos neurotrpicos, mas a maioria deles tambm capaz de replicar em outras clulas. Duas propriedades devem ser denidas com relao a infeco neurolgica por vrus. O termo neuroinvasividade se refere capacidade dos vrus atingir o SNC aps a replicao em stios perifricos. Os vrus que produzem infeces neurolgicas sob condies naturais so neuroinvasivos, pois do

contrrio no seriam capazes de alcanar o encfalo aps a sua penetrao no hospedeiro. O termo neurovirulncia se refere capacidade dos vrus de replicar, disseminar-se no SNC e produzir doena neurolgica. Para a maioria dos vrus que produzem infeces neurolgicas, estas duas propriedades esto presentes simultaneamente. No entanto, tem sido demonstrado que alguns vrus podem ser neurovirulentos se inoculados diretamente no SNC, mas no so capazes de atingir o encfalo aps replicao em stios perifricos. Ou seja, so potencialmente neurovirulentos, mas no neuroinvasivos. Alguns isolados do BoHV-1, por exemplo, s produzem infeces neurolgicas em coelhos aps a inoculao intratecal ou intracerebral, no sendo capazes de invadir o encfalo aps a inoculao intranasal ou intraconjuntival. A via nervosa fornece um acesso direto ao encfalo, pois os vrus so transportados ao longo de bras conectadas sinapticamente. O transporte ao longo de axnios e dentritos e a transmisso atravs das sinapses permite aos vrions percorrer longas distncias e atingir o encfalo a partir dos stios perifricos de replicao. A penetrao de vrus no SNC a partir do sangue oferece obstculos adicionais, representados pela barreira hematoenceflica. Essa barreira formada pela estrutura especializada da parede de certos capilares, que apresentam clulas endoteliais justapostas; pela lmina basal espessa; pelo plexo coride; e pelo epitlio ependimal, que no apresenta espao entre as clulas. Embora estas barreiras sejam ecientes para evitar a penetrao de alguns vrus no SNC, parecem no serem capazes de impedir a penetrao de outros. provvel que alguns vrus consigam ultrapassar essas barreiras; outros podem infectar as clulas endoteliais e serem liberados na face oposta; uma minoria parece ser transportada do sangue para o tecido nervoso no interior de clulas sangneas. Aps a penetrao no tecido nervoso, o vrus pode se disseminar localmente pela infeco de neurnios e clulas da glia localizadas nas proximidades; pode se disseminar pelos espaos intercelulares; e pode tambm atingir regies mais profundas dos SNC por transpor-

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Captulo 8

te transinptico. Embora as manifestaes clnico-patolgicas mais importantes das infeces neurolgicas devam-se a distrbios funcionais e morte dos neurnios, uma variedade de clulas pode ser infectada e contribuir para as patologias observadas. Ou seja, as patologias neurolgicas nem sempre so derivadas exclusivamente da infeco viral dos neurnios. Para vrios vrus que produzem infeces neurolgicas, as clulas-alvo da replicao no SNC ainda no so perfeitamente denidas. A identicao das clulas-alvo da replicao se constitui em um ponto-chave para o entendimento da patogenia de muitas infeces vricas neurolgicas. Os efeitos mais deletrios e mais estudados das infeces neurolgicas por vrus se devem destruio dos neurnios infectados. Dependendo do nmero de neurnios infectados e destrudos, esses eventos podem resultar em doena severa e na morte do hospedeiro, como ocorre em animais de laboratrio infectados experimentalmente com alguns buniavrus, vrus da raiva, herpesvrus e alfavrus. A morte celular pode dever-se a uma variedade de mecanismos, muitos j descritos na seco referente s interaes do vrus com as clulas hospedeiras (seo 2.1). A induo de apoptose em neurnios tambm tem sido implicada na patogenia de alguns vrus neurovirulentos. O tropismo especco do vrus por determinadas subpopulaes de neurnios pode inuenciar o padro de neurovirulncia e as conseqncias clnico-patolgicas da infeco. O poliovrus, por exemplo, infecta preferencialmente neurnios do corno anterior da medula espinhal, resultando em sintomatologia caracterstica. O buniavrus La Crosse infecta as clulas de Purkinge do cerebelo de camundongos infectados experimentalmente. A via de inoculao e penetrao no SNC tambm pode determinar as caractersticas clnico-patolgicas da infeco. O curso clnico e os sinais clnicos apresentados por coelhos inoculados com o BoHV-5 variam de acordo com a via de inoculao (intranasal e conjuntival), provavelmente reetindo diferentes padres temporais e espaciais de replicao viral no encfalo. Embora a infeco e destruio de neurnios seja o mecanismo mais atraente e talvez

aquele de ocorrncia mais freqente para explicar os distrbios neurolgicos associados com as infeces vricas do SNC, a ocorrncia de doena neurolgica grave sem infeco neuronal macia tambm tem sido descrita em infeces vricas. Isso demonstra que alguns vrus podem causar disfuno neuronal grave sem infeco ou morte de um nmero signicativo dessas clulas, o que poderia explicar, em parte, os casos de recuperao clnica que eventualmente ocorram aps infeces neurolgicas. Em muitos casos, ocorre a infeco de um nmero varivel de clulas da micrglia, de astrcitos e de oligodendrcitos, com um envolvimento pouco signicativo de neurnios. possvel que produtos virais txicos para os neurnios sejam liberados por essas clulas no meio extracelular. A liberao de citocinas e outros mediadores qumicos inamatrios tambm tm sido implicados na disfuno neuronal observada nessas infeces. Em particular, o xido ntrico que produzido por clulas da glia em resposta infeco vrica pode ser deletrio para os neurnios. De fato, tem sido demonstrado que as interaes entre clulas inamatrias e neurnios podem resultar em toxicidade e disfuno neuronal, sem necessariamente induzir a morte de neurnios. Os mecanismos efetores celulares e humorais da resposta inamatria tambm podem potencialmente contribuir para a injria e disfuno neuronal. Esses mecanismos podem explicar, em parte, a ocorrncia de doena neurolgica severa e at mesmo fatal, desacompanhada de infeco neuronal signicativa, como ocorre em algumas situaes. Alm das infeces neurolgicas agudas com conseqncias clnico-patolgicas variveis e freqentemente fatais alguns vrus estabelecem infeces persistentes no sistema nervoso. Uma parte das infeces agudas resulta em morte do hospedeiro dentro de poucos dias, tendo, assim, importncia epidemiolgica limitada (p. ex.: encefalites eqinas por alfavrus e avivrus, raiva e cinomose). Por outro lado, as infeces persistentes podem ter conseqncias epidemiolgicas mais importantes, pela perpetuao da infeco nos hospedeiros. Para estabelecer uma infeco persistente, o vrus no pode matar as clulas infectadas; ele deve manter a sua replica-

Patogenia das infeces vricas

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o em nveis baixos e possuir estratgias para escapar da vigilncia do sistema imunolgico. De fato, nessas infeces, a extenso da injria e leses geralmente muito pequena ou mesmo ausente. Por outro lado, a persistncia viral em clulas nervosas freqentemente associada com imunopatologia em neurnios e clulas da glia. O SNC apresenta caractersticas que podem favorecer a persistncia de infeces vricas, entre elas: possui uma populao estvel e heterognea de clulas susceptveis a vrios vrus; uma rede intrincada de processos (axnios e dendritos) que permite a disseminao do vrus a longas distncias; uma barreira hemato-enceflica que restringe o acesso de linfcitos T e anticorpos. No entanto, alguns vrus infectam concomitantemente clulas extraneurais e produzem viremia crnica, indicando que o SNC pode no oferecer todas as condies para a persistncia viral. As infeces persistentes do SNC podem ser classicadas em trs tipos principais, com conseqncias clnico-patolgicas e epidemiolgicas diferentes: infeces latentes, infeces crnicas defectivas e infeces crnicas produtivas. Os alfaherpesvrus (PRV, BoHV-1, BoHV-5 etc.) estabelecem infeces latentes em neurnios dos gnglios sensoriais e autonmicos prximos ao stio de infeco primria. Durante a infeco latente, o genoma do vrus permanece inativo no ncleo dos neurnios, sem expresso gnica ou produo de prognie viral. Ocasionalmente, em situaes de estresse, o vrus retoma a replicao ativa e transportado de volta aos stios de penetrao, onde replica e excretado. A reativao da infeco importante na epidemiologia desses vrus, pois permite a excreo e transmisso a outros animais. Algumas vezes a reativao acompanhada de recrudescncia clnica, com o desenvolvimento de leses no stio de penetrao, e tambm com o desenvolvimento espordico de infeco neurolgica e meningo-encefalite (BoHV-5). Ces que se recuperam da infeco aguda pelo CDV acompanhada ou no de sinais clnicos podem car portadores do vrus, que segue replicando em nveis muito baixos no SNC, geralmente desacompanhado de excreo viral. Eventualmente esses animais desenvolvem um quadro de encefalite viral e vo a bito, mas

essa ocorrncia pode demorar anos. A persistncia do vrus no SNC, aps a infeco aguda, pode ser favorecida por mutaes que resultem na produo de vrus defectivos. Outra forma de infeco persistente no SNC a estabelecida pelo retrovrus MVV, nos quais o vrus estabelece infeco crnica em clulas da linhagem macrofgica com produo de vrus ausente ou espordica. O vrus da doena de Borna (BDV) de eqinos tambm estabelece infeco persistente no sistema nervoso, porm a produo de vrus parece ser contnua, apesar de ocorrer em nveis baixos.

3.3.6 Infeces do sistema linforreticular e hematopoitico


Vrios vrus utilizam clulas linforreticulares e/ou da linhagem hematopoitica como alvos de replicao em infeces naturais. A variedade de tipos celulares e a multiplicao contnua de algumas dessas clulas favorecem a replicao desses vrus. Da mesma forma, a contnua recirculao dessas clulas especialmente os linfcitos favorece o carter sistmico dessas infeces. Em geral, a infeco se inicia nos rgos linfides secundrios, aps a drenagem da linfa dos tecidos ou com a passagem do sangue pelo bao. Os vrus presentes na linfa e/ou sangue so capturados por ou infectam clulas da linhagem monoctica/macrofgica, clulas dentrticas ou linfcitos dos linfonodos, bao, placas de Peyer e outros acmulos linfides. A replicao viral nessas clulas seguida da produo de prognie viral que infecta um nmero adicional de clulas prximas, alm de permitir a sua disseminao sistmica atravs de clulas circulantes. Assim o vrus pode se distribuir por outros rgos linforreticulares e se disseminar nesses tecidos. Infeces de clulas progenitoras hematopoiticas da medula ssea podem ocorrer nesses estgios da infeco. Os macrfagos, clulas dendrticas, linfcitos T e B so alvos de replicao de uma variedade de vrus que causam doenas em animais. Alm dessas, clulas progenitoras da linhagem linfide, mielide ou hematopoitica da medula ssea podem ser infectadas por alguns vrus e comprometer a reposio das clulas sangneas (alguns vrus induzem trombocitopenia).

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Captulo 8

A infeco macia do sistema linforreticular freqentemente leva depleo linfide e disfuno da resposta imunolgica. A disfuno do sistema imunolgico pode resultar em decincias na resposta a outros patgenos, com predisposio a infeces secundrias. Vrios vrus animais tm sido associados com infeco do sistema linfide e induo de imunossupresso, incluindo o vrus da doena de Gumboro em aves (IBDV), o FIV e o vrus da imunodecincia bovina (BIV). Outros vrus, como o BVDV, CSFV, CDV e CPV podem estar associados com quadros transitrios de supresso imunolgica. A imunossupresso produzida por esses vrus pode dar-se em razo de vrios mecanismos e ser abordada em seo especca. Alguns dos vrus mais virulentos para humanos e animais esto associados com infeces do tecido linforreticular e hematopoitico, incluindo o vrus ebola (lovrus), arenavrus, hantavrus, o vrus da febre do vale Rift (um buniavrus), o VEEV, CSFV e ASFV. Esses vrus esto associados com doena severa, caracterizada pelo curso agudo e pela ocorrncia de leses vasculares, disfunes hemodinmicas, de coagulao sangnea e ocorrncia de eventos hemorrgicos. Alguns isolados do BVDV tambm tm sido associados com doena aguda severa acompanhada de componentes hemorrgicos. Essas enfermidades possuem algumas caractersticas em comum, como o curso agudo, a ocorrncia de alteraes vasculares, leses endoteliais com perda de lquido vascular, proteinria e edemas. As manifestaes mais comuns da injria nos endotlios vasculares incluem hiperemia acentuada, petquias e sufuses nas mucosas e serosas, equimoses e hemorragias pontuais disseminadas em quadros severos. Quadros de choque hipovolmico so freqentes em estgios avanados da doena. As hemorragias e extravasamento de plasma podem ser por causa da injria nos endotlios vasculares pela replicao viral nas clulas endoteliais, por alteraes na coagulao sangnea (coagulao intravascular disseminada com consumo de plaquetas) ou ainda por trombocitopenia primria.

3.3.7 Infeco fetal


Os tecidos embrionrios e fetais apresentam uma alta taxa de multiplicao celular e, por isso, constituem-se em stios de predileo para a replicao de vrios vrus. Os vrus que infectam o feto se disseminam pela via hematgena e vrios deles produzem infeces inaparentes ou leves nas fmeas prenhes. Nesses casos, as conseqncias maiores da infeco so devidas s perdas reprodutivas. As conseqncias da infeco fetal variam com a espcie e cepa do vrus, com o status imunolgico da fmea e com a fase de gestao em que ocorre a infeco. As infeces que ocorrem em fases precoces da gestao so geralmente acompanhadas de morte embrionria ou fetal. Infeco fetal em estgios intermedirios pode produzir teratogenia ou abortos e infeco em fases avanadas pode induzir abortos, natimortos ou resultar em resposta imunolgica e erradicao da infeco pelo feto. A infeco fetal tambm pode representar um meio para o vrus persistir na populao, pela gerao de animais imunotolerantes e persistentemente infectados, capazes de disseminar o vrus por longos perodos. A produo de neonatos persistentemente infectados caracterstica da infeco fetal por cepas no-citopticas do BVDV entre os 40 e 120 dias de gestao, e pode ocorrer tambm com os pestivrus suno e ovino. Os efeitos da infeco fetal pelo BVDV esto ilustrados na Figura 8.14. Os efeitos observados no feto podem deverse replicao viral nos tecidos fetais e/ou replicao na placenta e interferncia com as funes placentrias. A mortalidade fetal pode ser seguida de reabsoro, mumicao fetal ou abortamento. Os abortos associados com infeces vricas geralmente ocorrem dias ou semanas aps a infeco, o que diculta a deteco de vrus e/ou produtos virais nos tecidos fetais e conseqentemente o diagnstico. Dentre os vrus animais que produzem infeces embrionrias e fetais destacam-se:

Patogenia das infeces vricas

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herpesvrus de vrias espcies: mortalidade fetal, abortos, doena ou mortalidade neonatal; pestivrus de bovinos (BVDV), sunos (CSFV) e ovinos (border disease virus BDV): mortalidade fetal, abortos, malformaes, natimortalidade, nascimento de animais persistentemente infectados; vrus da lngua azul (BTV, um orbivrus) em ovinos e bovinos: mortalidade fetal, abortos, malformaes congnitas; parvovrus suno (PPV): reabsoro embrionria, mortalidade fetal, abortos, mumicao, natimortalidade; vrus da panleucopenia felina (FPLV): hipoplasia cerebelar;

vrus da leucemia felina (FeLV): leucemia, mortalidade fetal; vrus da sndrome respiratria e reprodutiva dos sunos (PRRSV) e vrus da arterite viral eqina (EAV): mortalidade fetal, abortos; vrus Akabane (ovinos e bovinos): morte fetal, abortos, malformaes, natimortalidade; vrus da febre do vale Rift (RVFV) em ovinos: mortalidade fetal e abortos. Perdas reprodutivas por alguns desses agentes tambm tm sido relatadas aps o uso de vacinas atenuadas contendo os respectivos agentes. Por outro lado, para os vrus que causam perdas reprodutivas importantes, a vacinao deve ser realizada antes da cobertura ou inseminao para prevenir a infeco fetal e, assim, minimizar as perdas.

BVDV ncp ou cp Soropositivo, sem o vrus ncp Bezerro PI Natimortos Malformaes Bezerros PI Infertilidade Abortos

ncp ou cp

Atrofia da retina Cegueira


Embrio muito susceptvel Efeitos na fertilizao, implantao Leses no SNC Bezerros saudveis soropositivos

Imunotolerncia (PI) Abortos

40

80

120

160

200

240

280

D I A S D E G E S TA O

Figura 8.14. Efeitos da infeco de fmeas bovinas prenhes pelo vrus da diarria viral bovina (BVDV). As conseqncias da infeco dependem do status imunolgico da fmea, da cepa do vrus (biotipo e virulncia) e do estgio de desenvolvimento do embrio/feto.

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Captulo 8

4 Padres principais de infeco


A sobrevivncia dos vrus como espcie depende de infeces sucessivas e contnuas de diferentes indivduos e/ou de infeces prolongadas no mesmo indivduo. Por outro lado, o resultado da infeco viral em um animal depende de interaes mltiplas entre componentes virais e do hospedeiro. Objetivamente, depende do balano entre as estratgias virais para se perpetuar no organismo e dos mecanismos de defesa do hospedeiro para erradicar o agente. Apesar da diversidade dos vrus e da complexidade de suas interaes com os hospedeiros, dois padres

principais de infeco podem ser reconhecidos: as infeces agudas e as infeces crnicas (ou persistentes). No entanto, variaes e combinaes desses tipos tambm ocorrem com freqncia (Figura 8.15). Alguns vrus produzem infeces agudas, que se caracterizam pela curta durao e rpida erradicao do agente pela resposta imunolgica do hospedeiro. Outros vrus produzem infeces persistentes ou crnicas, caracterizadas pela permanncia do agente no hospedeiro por longos perodos, muitas vezes pelo resto da vida. A natureza autolimitante das infeces agudas se deve principalmente ecincia do sistema imunol-

Infeco Aguda

Infeco Latente

Infeco Persistente

Infeco Persistente temporria

Replicao viral Manifestaes clnicas

Fonte: adaptada de Flint et al. (2000).

Figura 8.15. Principais padres de infeco.

Patogenia das infeces vricas

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gico do animal em combater e erradicar a infeco. Visto por outro ngulo, o carter transitrio dessas infeces se deve incapacidade dos vrus persistir no animal na presena da resposta imunolgica. As infeces persistentes ou crnicas tambm podem ser vistas sob duas ticas: a) do ponto de vista do hospedeiro, a persistncia do agente em seus tecidos reete a incapacidade do sistema imunolgico de erradic-lo; e b) do ponto de vista do agente, a persistncia o resultado de estratgias evolutivas, que foram desenvolvidas para se adaptar ao hospedeiro e escapar da vigilncia do sistema imunolgico, garantindo, assim, a sua permanncia no animal.

es entricas por rotavrus em vrias espcies, vrus da inuenza em sunos e eqinos, vrus da raiva em vrias espcies, CPV, entre outras.

4.2 Infeces persistentes ou crnicas


As infeces crnicas ou persistentes se caracterizam pela persistncia do vrus ou do genoma viral no hospedeiro por longos perodos. A maioria dessas infeces se inicia como uma infeco aguda, caracterizada por uma rpida replicao viral, acompanhada ou no de sinais clnicos. No entanto, ao contrrio das infeces agudas, a resposta imunolgica montada pelo hospedeiro no capaz de erradicar o agente, resultando na sua permanncia nos tecidos por perodos variveis. Diferentes tipos de infeces crnicas podem ser reconhecidos de acordo com a biologia do agente, com a dinmica de replicao viral (ausncia ou presena de replicao ativa) e com a durao. Em geral, os nveis de replicao e excreo viral nas infeces crnicas so muito mais baixos do que nas infeces agudas e, algumas vezes, podem ser dicilmente detectveis. De acordo com a ocorrncia ou no de replicao viral durante a persistncia, dois tipos principais de infeces crnicas so reconhecidos: as infeces latentes e as infeces persistentes. As infeces latentes so caracterizadas pela permanncia do genoma viral nas clulas do hospedeiro, na maior parte do tempo sem replicao e produo de vrus. A replicao e produo de prognie viral somente ocorrem em situaes espordicas e duram horas ou poucos dias. J nas infeces persistentes, a replicao viral ocorre de forma contnua, em nveis variveis, e freqentemente acompanhada de excreo do agente. Em algumas infeces persistentes, no entanto, os nveis de replicao so to baixos e em determinados tecidos do organismo que no so acompanhados de excreo viral detectvel (p. ex.: persistncia do CDV no encfalo de ces adultos e persistncia do FMDV na faringe). Em outras, a replicao e excreo viral ocorrem de forma contnua e em nveis signicativos. As infeces persistentes aquelas que cursam com replicao viral contnua podem ser agrupadas em duas classes, que so determinadas pela biologia dos vrus e por suas interaes

4.1 Infeces agudas


A principal caracterstica das infeces agudas o curto perodo de tempo em que o vrus replica no organismo do hospedeiro. o padro de infeco mais estudado e conhecido e caracterstico de vrios vrus que replicam com ecincia em animais e em cultivos celulares. O termo aguda se refere rapidez de replicao e produo de prognie viral, que seguida tambm por uma rpida resoluo e erradicao da infeco. Os nveis de replicao viral no organismo aumentam rapidamente, atingem um pico aps alguns dias e decrescem tambm com certa rapidez (Figura 8.15). A reduo dos nveis de vrus no organismo coincide com o desenvolvimento de resposta imunolgica humoral (anticorpos) e celular (linfcitos T citotxicos). Em geral, a resposta imunolgica capaz de erradicar o agente dos tecidos aps alguns dias. Se, por um lado, o curto perodo de replicao e excreo pode ser detrimental para a sobrevivncia do vrus na populao, os altos ttulos de vrus que so excretados favorecem a transmisso do agente. importante ressaltar que o termo aguda se refere cintica de replicao viral (nveis e tempo) e no s manifestaes clnicas. De fato, muitas infeces agudas so absolutamente subclnicas, ou seja, so desacompanhadas de manifestaes clnico-patolgicas. No obstante, muitas vezes as infeces agudas no podem ser controladas pelo sistema imunolgico e resultam em doena de severidade varivel, algumas vezes fatais. Exemplos de infeces agudas incluem as infec-

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Captulo 8

com o hospedeiro. Para alguns vrus, o estabelecimento de infeco persistente uma regra e ocorre em, virtualmente, todos os indivduos infectados. Em outras palavras, a persistncia uma caracterstica biolgica inerente s relaes daquele vrus com os seus hospedeiros. Esse tipo de infeco persistente se prolonga por tempo indeterminado, provavelmente por toda a vida do animal. Essas so as infeces persistentes clssicas e so caractersticas das infeces pelos retrovrus animais, alm de outros vrus. Em outros grupos de vrus, infeces persistentes podem ser estabelecidas aps a infeco aguda, em um nmero varivel de indivduos, e a persistncia geralmente possui durao varivel, no necessariamente indenida. Nesses casos, a persistncia uma conseqncia provvel e muitas vezes freqente da infeco, mas no se constitui em regra ou padro biolgico da infeco por esses vrus. Alm disso, grande parte dos animais que se tornam portadores consegue erradicar a infeco aps algum tempo, determinando o m da persistncia, ou seja, so infeces persistentes temporrias (Figura 8.15). Algumas infeces persistentes so acompanhadas de sinais clnicos crnicos, que podem ser brandos ou graves; outras vezes a infeco absolutamente inaparente. Vrias infeces crnicas resultam em patologias progressivas de desenvolvimento lento (MVV, CAEV, vrus da pneumonia progressiva dos ovinos [OPPV] e FeLV), em imunopatologia ou imunodecincia (EIAV, FIV e LCMV) ou no desenvolvimento de neoplasias malignas (vrus da leucose aviria [ALV] e BLV). Essas patologias so mais comumente observadas nas infeces persistentes clssicas. Os locais de persistncia do vrus no so necessariamente os mesmos em que o vrus replicou e produziu patologias na fase aguda e, freqentemente, incluem stios de acesso restrito do sistema imunolgico. Os padres de replicao e excreo viral durante as infeces crnicas tambm so muito variveis. Em algumas infeces, a replicao viral contnua e ocorre em nveis moderados a altos; em outras, os nveis de replicao so muito baixos, com pouca ou nenhuma excreo viral. J as infeces latentes so caracterizadas por longos perodos de absoluta ausncia de replicao viral intercaladas com episdios espordicos de reativao, replicao e excreo viral.

4.2.1 Infeces latentes


Esse tipo de infeco tpico dos alfaherpesvrus animais (BoHV-1, BoHV-5, PRV, EHV1, herpesvrus canino, herpesvrus felino, entre outros) e se caracteriza pela permanncia do genoma viral inativo em neurnios dos gnglios sensoriais e autonmicos aps o trmino da replicao na fase aguda. Durante a infeco latente no ocorre produo de protenas virais, replicao do genoma ou produo de partculas vricas. Com isso, os neurnios que abrigam o genoma viral no so reconhecidos como infectados pelo sistema imunolgico, o que permite ao vrus escapar da vigilncia imunolgica. O genoma viral no integrado aos cromossomos celulares e permanece como um epissomo, fortemente associado com protenas celulares no ncleo dos neurnios. Esporadicamente, geralmente associado com situaes de estresse e produo de glicocorticides endgenos, a infeco reativada e o vrus replica de forma aguda e excretado. O perodo e a magnitude de excreo viral durante a reativao so geralmente bem inferiores queles observados durante a infeco aguda. A reativao da infeco ocasionalmente acompanhada de manifestaes clnicas, geralmente mais brandas do que aquelas observadas durante a infeco aguda. As reativaes ocorrem a intervalos variveis (semanas, meses, anos) em uma parcela dos indivduos e possvel que alguns hospedeiros no apresentem episdios de reativao. A infeco latente representa um meio do vrus se perpetuar no hospedeiro, e a sua reativao peridica permite a sua excreo e transmisso.

4.2.2 Infeces persistentes ou crnicas


Essas infeces se caracterizam pela contnua replicao e produo de partculas vricas nos tecidos do hospedeiro por tempo ilimitado, provavelmente por toda a vida do animal. possvel se detectar o agente infeccioso em qualquer momento aps a infeco aguda, desde que se examinem os tecidos certos com tcnicas apropriadas. As infeces persistentes se estabelecem porque o sistema imunolgico do hospedeiro no consegue erradicar o vrus durante a infeco

Patogenia das infeces vricas

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aguda. Subseqentemente, por diferentes mecanismos, o agente consegue coexistir com uma resposta imune que mantm um controle parcial da infeco, sem conseguir elimin-la totalmente. Os nveis de replicao nesse tipo de infeco variam de acordo com o vrus. Alguns vrus mantm nveis considerveis de replicao de forma contnua; outros apresentam uma replicao mnima, s vezes, de difcil deteco. As infeces pelos retrovrus animais (EIAV, BLV, FeLV, CAEV, entre outras), BTV e infeco persistente pelo BVDV so exemplos clssicos de infeces vricas persistentes. No caso dos retrovrus, a manuteno da infeco se deve integrao denitiva de cpias DNA do genoma viral nos cromossomos das clulas hospedeiras, ou seja, as clulas infectadas cam persistentemente infectadas e, caso se multipliquem, transmitem o genoma viral para a sua prognie. Assim, geraes sucessivas de clulas produzem vrus infecciosos ao longo da vida do animal. No caso do BLV, a manuteno da infeco persistente deve-se principalmente a divises celulares contnuas e transmisso do genoma viral para a prognie, do que produo de vrus infecciosos. interessante observar que os retrovrus, alm de inserir o seu material gentico nos cromossomos do hospedeiro, tambm sofrem contnuas mutaes que contribuem para a sua perpetuao no animal infectado. As infeces persistentes pelo BVDV somente ocorrem em animais que tenham sido infectados intra-uterinamente, entre os 40 e 120 dias de gestao. Esses animais se tornam imunotolerantes e so incapazes de montar uma resposta imunolgica contra o vrus infectante. Assim, o vrus pode replicar continuamente em altos ttulos no tecido linforreticular e epitlios dos animais, sem a interferncia do sistema imunolgico.

4.2.3 Infeces persistentes temporrias


Em alguns vrus, a infeco aguda pode ser seguida de persistncia do agente nos tecidos do hospedeiro por perodos variveis. Em algumas delas, a persistncia ocorre apenas em alguns animais, no se constituindo em uma regra. Em

outros casos, as infeces crnicas que se seguem s infeces agudas parecem ocorrer na maioria, seno em todos os animais. Os nveis de replicao e excreo viral variam de acordo com o agente e com a resposta do hospedeiro. A durao da persistncia tambm varivel, podendo ser de meses e at anos (ou at mesmo por toda a vida do animal). Naqueles casos em que a erradicao do agente ocorre aps algum tempo, provvel que o vrus tenha esgotado o seu arsenal de estratgias para persistir no animal, sendo eventualmente combatido pelo sistema imune. Vrios vrus produzem este tipo de infeco. O PRRSV permanece replicando nos testculos de reprodutores sunos por at seis meses aps a infeco aguda. O CAdV-1 tambm pode permanecer durante meses replicando no epitlio dos tbulos renais, que so locais de acesso restrito do sistema imunolgico. A infeco pelo CDV um exemplo de infeco que geralmente aguda na maioria dos animais mas pode se tornar crnica em uma parcela dos ces que no conseguem erradicar o vrus na fase aguda. Nesses animais, o vrus persiste replicando em nveis baixos no SNC. Essa replicao no acompanhada de excreo viral em secrees ou excrees. A maioria desses animais eventualmente desenvolve doena neurolgica de curso fatal, em um prazo que varia de meses a anos. No caso do calicivrus felino (FCV), a persistncia do vrus no hospedeiro parece ser favorecida pela ocorrncia contnua de mutaes genticas que resultam em variantes virais que escapam da resposta imune do animal. O FMDV produz uma infeco clnica aguda (febre aftosa) que se resolve em poucos dias. No entanto, uma parcela dos animais permanece abrigando o vrus na faringe por um determinado tempo. Os nveis de replicao so geralmente muito baixos e parecem no ser acompanhados de excreo viral. Alguns arenavrus e hantavrus produzem infeces crnicas em roedores silvestres. Essas infeces so acompanhadas por viremia prolongada muitas vezes por toda a vida e de transmisso vertical do vrus para a prognie. J as infeces crnicas por hantavrus so caracterizadas por viremia transitria seguida de excreo prolongada de vrus pela saliva, secrees nasais, fezes e urina. Esses vrus podem ser ocasional-

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Captulo 8

mente transmitidos para humanos e so importantes causas de febres hemorrgicas. A Tabela

8.4 apresenta as principais caractersticas das infeces virais persistentes.

Tabela 8.4 Stios de persistncia de vrus que estabelecem infeces latentes ou persistentes nos hospedeiros Tipo Famlia/subfamlia Vrus
BoHV-1 BoHV-5 BoHV-2 CaHV-1 Herpesviridae/ Alphaherpesvirinae FHV-1 CpHV PRV

Espcie
bovina bovina bovina canina felina caprina suna eqina aves suna ruminantes eqina aves bovina ovina caprina felina eqina aves ovina felina canina felina bovina, ovina e suna aves eqina suna bovina e ovina patos, gansos, marmotas, esquilos ovinos

Local de persistncia
Gnglios sensoriais e autonmicos, tonsilas e linfcitos T (BoHV-1.1), linfonodos da regio sacral (BoHV-1.2). Gnglio trigmeo e stios do SNC. Gnglio trigmeo, pele e linfonodos. Gnglios sensoriais e autonmicos. Gnglios sensoriais e autonmicos. Gnglios sensoriais e autonmicos. Gnglio trigmeo, bulbo olfatrio, tronco cerebral, medula espinhal, tonsilas. Gnglios sensoriais e autonmicos. Gnglios sensoriais e autonmicos. Glndula salivar, epitlio vesical e clulas mononucleares. Clulas linfoblastides. Clulas linfoblastides. Clulas da glndula da casca e do oviduto. Linfcitos B. Moncitos e macrfagos. Linfcitos, SNC, epitlio alveolar, moncitos e macrfagos. Clulas mielides, linfcitos T e B. Macrfagos e linfcitos. Clulas linfides, mielides, renais, sseas, endoteliais e mesenquimais. Clulas epiteliais do sistema respiratrio. Macrfagos. SNC (oligodendrcitos). Epitlio respiratrio e anexos. Clulas do sistema imune, SNC, medula ssea, clulas endoteliais e clulas epiteliais dos sistemas respiratrio e digestrio. Linfcitos T. Mucosa respiratria, adenides. Tecido linfide, rins e testculos. Clulas hematopoiticas.

Latente

EHV-1, 3 e 4 GaHV-1 Herpesviridae/ Betaherpesvirinae Herpesviridae/ Gammaherpesvirinae Adenoviridae PCMV (SHV-2) MCFV (AHV-1) EHV-2 e 5 DAdV-A BLV Maedi/ Visna CAEV FIV/FeLV Retroviridae EIAV ALV Vrus Jaagsiekte OPAV

Persistente

Coronaviridae Paramyxoviridae Caliciviridae

FIPV CDV* FCV BVDV, BDV e CSFV** MDV (GaHV-2) EAdV-2 PPV*** BTV DHBV, WHBV, GSHBV

Flaviviridae

Alphaherpesvirinae Adenoviridae Parvoviridae Reoviridae Hepadnaviridae

Hepatcitos.

Patogenia das infeces vricas

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Tabela 8.4 Continuao


Tipo Famlia/subfamlia Vrus
BPV-1 a 7 Papillomaviridae CaPV EPV-1 e 2 Adenoviridae CAdV-1 ASFV PCV-1 e 2 FMDV PRRSV Arteriviridae EAV TGEV Coronaviridae IBV Bornaviridae BDV aves eqina Clulas do epitlio renal. Neurnios, astrcitos e oligodendrcitos. eqina suna

Espcie
bovina canina eqina canina suna e bubalina suna bovina, suna e ovina suna

Local de persistncia
Clulas epiteliais. Clulas epiteliais. Clulas epiteliais. Epitlio dos tbulos renais. Clulas mononucleares e fagocticas, tonsilas e linfonodos. Clulas mononucleares sangneas, macrfagos e linfcitos. Mucosa da orofaringe. Macrfagos, clulas germinativas dos testculos. Macrfagos, clulas endoteliais e mesoteliais. Mucosas respiratria e intestinal.

Persistente temporria

Asfarviridae Circoviridae Picornaviridae

* Alguns animais que se recuperam da doena ficam portadores,mas no excretam o vrus, que replica em nveis baixos no SNC. **Fetos infectados em determinada fase de gestao ficam imunotolerantes e nascem persistentemente infectados. ***Alguns fetos infectados no tero se tornam imunotolerantes e ficam portadores, excretando o vrus por longos perodos.

4.3 Mecanismos envolvidos na manuteno das infeces persistentes


Os mecanismos envolvidos no estabelecimento e manuteno das infeces persistentes so muito complexos e pouco esclarecidos at o presente. No entanto, independentemente dos mecanismos responsveis, a manuteno de uma infeco vrica no organismo deve preencher trs condies essenciais: a) a infeco celular deve ser no-citoltica (ou de citopatogenicidade limitada); b) manuteno do genoma viral nas clulas do hospedeiro, e c) evaso da resposta imune do hospedeiro. Vrios mecanismos adicionais ou complementares tm sido sugeridos para explicar a persistncia desses agentes em tecidos do hospedeiro, por longos perodos, a despeito da resposta imunolgica desencadeada contra eles. provvel que nenhuma infeco persistente seja mantida por causa de apenas um desses mecanismos; ao contrrio, provavelmente so mantidas pela combinao de vrios deles.

4.3.1 Restrio do efeito citopatognico


Os vrus que produzem infeces no-citolticas so mais propensos a estabelecerem infeces persistentes, pois a sua replicao no resulta na destruio das clulas infectadas (ou resulta em destruio limitada). Exemplos de vrus nocitolticos que causam infeces persistentes so alguns arenavrus (infeco renal persistente em roedores), o BVDV (infeco de clulas do sistema linforreticular) e o vrus da hepatite B (infeco no-citoltica de hepatcitos).

4.3.2 Infeco de clulas semipermissivas


A replicao dos alfaherpesvrus em clulas epiteliais e do tegumento altamente citoltica, o que tambm observado em uma variedade de clulas in vivo e in vitro. A infeco tambm citoltica em vrios tipos de neurnios. No entanto, alguns neurnios sensoriais e autonmicos no so permissivos replicao ltica aguda. Como

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conseqncia, aps penetrar e ter o seu ciclo replicativo interrompido, o vrus estabelece infeces latentes nesses neurnios, ou seja, a infeco de clulas semi-permissivas infeco ltica o mecanismo responsvel pela persistncia dos alfaherpesvrus nos seus hospedeiros. Sob determinadas condies, esses neurnios que abrigam o genoma viral se tornam permissivos, o que desencadeia a reativao e replicao viral.

4.3.3 Infeco de um pequeno nmero de clulas


Essa forma de infeco tem sido observada por alguns vrus in vitro e possvel que tambm ocorra in vivo. Candidatos para esse tipo de modulao so os adenovrus e os arterivrus (EAV em eqinos e PRRSV em sunos). A infeco persistente no hospedeiro seria mantida atravs de infeces sucessivas citolticas ou no de um nmero pequeno de clulas a cada ciclo. Os vrus produzidos por essas clulas infectariam outra pequena populao de clulas e, assim, a infeco se prolongaria sucessivamente. Provavelmente algum mecanismo concomitante de evaso do sistema imune seja necessrio para permitir a ocorrncia dessas infeces continuadas, mesmo em baixos nveis.

sistncia no hospedeiro. Em muitos vrus, essas estratgias provavelmente complementam os outros mecanismos envolvidos na permanncia do agente no organismo. Os mecanismos mais utilizados pelos vrus para evaso da resposta imune so: a) restrio de produo das protenas virais (como no caso da latncia dos herpesvrus); b) infeco de locais imunologicamente privilegiados (p. ex.: infeco das clulas do SNC pelo CDV e e de clulas do epitlio seminfero dos testculos pelo PRRSV); c) variao antignica (EIAV, FCV e FMDV); d) tolerncia imunolgica (bovinos persistentemente infectados pelo BVDV); f) interferncia com clulas e molculas do sistema imunolgico (adenovrus e poxvrus).

5 Oncognese por vrus


A transformao celular e produo de tumores esto entre as conseqncias da replicao de alguns grupos de vrus nos seus hospedeiros. De fato, acredita-se que uma parte considervel dos tumores de humanos e animais possua a participao direta ou indireta de agentes virais. De acordo com o vrus, diferentes tipos celulares e rgos podem ser afetados, com conseqncias diversas. Alguns tumores induzidos por vrus so benignos, mas uma parcela importante constituda por neoplasias malignas que resultam em doena progressiva e morte do animal. Para alguns vrus indutores de tumores, os mecanismos moleculares de oncognese j foram razoavelmente esclarecidos. Para outros vrus, no entanto, esses mecanismos permanecem obscuros e se constituem em temas de contnuas investigaes. Dentre os vrus animais associados com neoplasias, encontram-se famlias de vrus RNA (retrovrus) e DNA (poliomavrus, papilomavrus, adenovrus e hepadnavrus).

4.3.4 Manuteno do genoma viral nas clulas hospedeiras


A manuteno do genoma viral nas clulas do hospedeiro pode ocorrer por dois mecanismos distintos: pela integrao do genoma viral nos cromossomos da clula do hospedeiro, como ocorre com as infeces pelos retrovrus, ou pela manuteno do genoma como elemento extracromossomal no ncleo da clula, como ocorre nas infeces latentes pelos alfaherpesvrus e papilomavrus.

5.1 Oncognese por retrovrus


Os retrovrus envolvidos com a produo de tumores tambm chamados de oncornavrus so amplamente distribudos na natureza e tm sido isolados de virtualmente todas as espcies animais. Esses vrus diferem entre si em relao ao tropismo celular, potencial oncognico, per-

4.3.5 Evaso da resposta imune do hospedeiro


As estratgias de evaso do sistema imunolgico esto entre os mecanismos mais importantes utilizados pelos vrus para assegurar a sua per-

Patogenia das infeces vricas

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odo de incubao e mecanismo de oncognese. Com base no tempo necessrio para a produo dos tumores, os oncornavrus podem ser divididos em vrus transformantes no-agudos, agudos e transindutores. Os retrovrus transformantes no-agudos induzem a formao de neoplasias aps um longo perodo de incubao (meses at dcadas), assim como os transindutores. Os retrovrus transformantes agudos induzem tumores em um intervalo menor de tempo (semanas). Os mecanismos de oncognese tambm variam entre os grupos. Os retrovrus transformantes no-agudos esto envolvidos em vrios tipos de neoplasias, incluindo linfomas e leucemias. Esses vrus no possuem genes especcos com atividade oncognica no seu genoma. Ao contrrio, induzem oncognese pela integrao do seu genoma (provrus DNA) nas proximidades de proto-oncogenes celulares ou de genes envolvidos no controle do ciclo e diferenciao celular. Com isso, a expresso desses genes alterada e pode levar transformao tumoral. Este processo denominado de oncognese insercional. Os retrovrus transformantes agudos podem induzir a formao de tumores dentro de poucos dias. Ao contrrio do grupo anterior, esses vrus possuem oncogenes (genes oncognicos) no seu genoma. Mais de 30 diferentes oncogenes j foram identicados no genoma de retrovrus animais e todos eles parecem ter sido adquiridos integralmente ou por rearranjos do genoma dos hospedeiros em infeces passadas. As funes dos produtos desses oncogenes so variveis e incluem desde quinases at fatores de transcrio. Uma caracterstica comum a quase todos os oncogenes retrovirais identicados at o presente que os seus produtos esto envolvidos em mecanismos de sinalizao intracelular (signal transduction). Retrovrus com essas caractersticas j foram identicados em vrias espcies animais e tm sido associados com uma grande variedade de tumores, incluindo sarcomas, carcinomas e linfomas em aves; sarcomas e linfomas em roedores; brossarcomas e linfossarcomas em felinos; e sarcoma em primatas. Os retrovrus transformantes transindutores produzem leucemias monoclonais de linfcitos T

e B aps um longo perodo de incubao. Entre esses vrus se destacam o vrus da leucemia de linfcitos T humano (HTLV) e o BLV. O genoma desses vrus no possui oncogenes e o mecanismo de induo da oncognese difere daqueles dos dois grupos anteriores. A transformao tumoral induzida por esses vrus parece estar ligada funo dos produtos de dois genes acessrios, tax e rex, que tambm possuem papel importante no ciclo replicativo do vrus. A protena Rex essencial para o ciclo replicativo ltico do HTLV, mas a sua participao na oncognese permanece desconhecida. J a protena Tax necessria para o ciclo ltico e tambm para a transformao tumoral das clulas hospedeiras. Esta protena um potente transativador de transcrio do provrus viral e tambm de vrios genes celulares. J foi demonstrado que vrios genes celulares que possuem um papel potencial na regulao do ciclo celular podem ser ativados pela protena Tax. Por isso a ativao de genes envolvidos no controle do ciclo celular um dos provveis mecanismos de oncognese pelos retrovrus transindutores.

5.2 Pequenos vrus DNA tumorignicos


Algumas famlias de vrus DNA possuem membros que tm sido associados com tumores, seja em infeces naturais ou aps inoculao experimental. Alguns deles produzem tumores em animais e, por isso, possuem importncia em medicina veterinria. Em particular, alguns vrus das famlias Polyomaviridae e Papillomaviridae tm sido associados com tumores em seus hospedeiros naturais e tm comprovado o seu potencial oncognico aps inoculao em hospedeiros heterlogos. O primeiro vrus DNA tumorignico identicado foi o CRPV (papilomavrus dos coelhos cauda-de-algodo) que causa papilomas cutneos benignos nos hospedeiros naturais. Quando inoculado em coelhos domsticos, no entanto, o CRPV induz papilomas que tendem a progredir e se tornar carcinomas. Vrios aspectos da tumorignese associada com infeces virais foram estudados nesse modelo animal. O papilomavrus de camundongos tambm tem sido associado com tumores mltiplos, sobretudo aps inoculao experimental em neonatos. O vrus

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Captulo 8

smio 40 (SV-40), tambm um membro da famlia Polyomaviridae, capaz de produzir tumores em hamsters recm-nascidos. O SV-40 tambm tem sido associado com alguns tumores raros em pessoas que foram vacinadas h aproximadamente 50 anos com uma vacina antipoliomielite contaminada com o vrus. Os papilomavrus bovinos (BPVs) tambm tm sido associados com a induo de tumores nos seus hospedeiros. O BPV-1 est associado com papilomas e bropapilomas, tumores cutneos de carter benigno e com freqncia muito menor, a tumores cutneos malignos. O BPV-4 est associado com a produo de carcinomas de laringe e esfago em bovinos, cuja etiologia parece estar combinada com a intoxicao por samambaia. Os papilomavrus humanos 16 e 18 (HPV-16; HPV-18) esto envolvidos na produo de um dos tumores mais freqentes em humanos, o carcinoma de colo de tero de mulheres. Os mecanismos pelos quais esses vrus induzem transformao neoplsica nas clulas hospedeiras tm sido intensivamente estudados nas ltimas dcadas. A capacidade oncognica desses vrus tem sido atribuda a uma ou mais protenas virais que se ligam e inativam protenas celulares envolvidas na regulao do ciclo celular. Em particular, as protenas celulares pRb e p53 so os alvos para o antgeno T, dos poliomavrus, e para as protenas E6 e E7 dos papilomavrus. As protenas da famlia da pRb e p53 exercem um papel regulatrio-chave no controle da estabilidade do genoma, na proliferao, diferenciao e apoptose em clulas de mamferos. A sua inativao pelas protenas virais citadas resulta no descontrole do ciclo celular e eventualmente pode resultar em transformao neoplsica. Os vrus da famlia Hepadnaviridae, tambm conhecidos como vrus das hepatites B, tambm tm sido associados com a produo de tumores em seus hospedeiros naturais. Alm do vrus da hepatite B humana (HBV), os hepadnavrus de esquilos (GSHV) e de marmotas (WHV) esto associados com o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular, que ocorre ocasionalmente em hospedeiros com hepatite crnica. Os mecanismos responsveis pela transformao neoplsica que ocorre nas infeces crnicas pelos hepadnavrus no esto completamente esclarecidos. V-

rios mecanismos tm sido propostos e acredita-se que a oncognese pode resultar da combinao de mais de um deles. Os mecanismos propostos incluem: a) ativao de proto-oncogenes celulares pela insero do genoma viral nos cromossomos; b) ativao de proto-oncogenes celulares pela protena X; c) injria e inamao heptica crnica, com produo de substncias potencialmente mutagnicas. Em geral, o desenvolvimento do carcinoma hepatocelular precedido por uma infeco heptica crnica de longa durao.

6 Imunopatologia em infeces vricas


O sistema imunolgico o responsvel pela proteo do organismo contra agentes agressores, porm a ativao da resposta imune nem sempre capaz de controlar a infeco. Alm disso, em determinadas situaes, a resposta produzida pode induzir leses imunomediadas, determinando a ocorrncia da doena. Vrias doenas vricas, como a AIDS, a dengue, a anemia infecciosa eqina e a artrite-encefalite caprina, entre outras, apresentam as leses resultantes da resposta imunolgica como componentes de sua patogenia. A resposta imune em infeces vricas tem como objetivo a eliminao e/ou neutralizao das partculas virais livres, pela ao de anticorpos e do complemento; alm da destruio das clulas infectadas, pela citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), linfcitos T citotxicos (CD8+) e lise por clulas natural killer (NK). Em algumas situaes, essa resposta suciente para eliminar o vrus do organismo. No entanto, em outras situaes, essa resposta pode causar injria tecidual, doena e at matar o hospedeiro. Em alguns casos, comum a coexistncia do hospedeiro com o vrus, com a ocorrncia de injrias celulares e teciduais mnimas, muitas vezes sem o comprometimento da sade geral do animal. O grau de leso que a resposta imunolgica pode produzir no hospedeiro depende, em parte, dos rgos envolvidos. Se a infeco ocorre no SNC ou no corao, as leses so geralmente graves, enquanto uma resposta localizada na pele, por exemplo, possui conseqncias limitadas.

Patogenia das infeces vricas

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Os vrus podem induzir imunopatologias por diferentes mecanismos, como a induo de auto-imunidade, imunossupresso e pela deposio de imunocomplexos, que caracteriza a reao de hipersensibilidade do tipo III. As leses imunomediadas ocorrem com maior freqncia em infeces persistentes ou crnicas, e principalmente em infeces por vrus no-citolticos.

6.1 Imunopatologia mediada por imunocomplexos


A conseqncia imunopatolgica mais freqente em infeces vricas agudas ou persistentes a formao de imunocomplexos. Esses complexos so formados por anticorpos ligados a partculas vricas ou a antgenos virais solveis. Quando esses imunocomplexos so produzidos em excesso, podem resultar em imunopatologia. Isso ocorre quando os antgenos virais no so eliminados ecientemente ou quando a replicao do vrus no controlada de forma eciente pelo sistema imunolgico. Dependendo do tipo de anticorpo e da sua capacidade neutralizante, os complexos podem carrear vrus viveis que podem penetrar produtivamente em clulas que possuam receptores para anticorpos (receptores para a poro Fc), como macrfagos e linfcitos ativados. Leses de glomerulonefrite imunomediada so freqentemente observadas em infeces vricas como a hepatite infecciosa canina, peritonite infecciosa felina, imunodecincia felina, peste suna clssica, peste suna africana, entre outras. Doenas mediadas por imunocomplexos somente ocorrem quando a sua produo excede a capacidade do organismo de remov-los dos tecidos e uidos corporais. Em condies normais, os imunocomplexos produzidos so removidos atravs de fagocitose por macrfagos e clulas mesangiais antes que eles se depositem e causem algum tipo de leso. Quando em excesso, a deposio dos imunocomplexos ocorre geralmente em locais com funo de ltragem de lquidos orgnicos, como os glomrulos renais, a parede dos vasos sangneos, as membranas sinoviais e o plexo coride. As leses causadas pela deposio dos imunocomplexos no so resultantes da

sua ao fsica e sim da ativao local do complemento e dos eventos inamatrios resultantes dessa ativao. A deposio de imunocomplexos na parede dos vasos e nos tecidos seguida do aumento da permeabilidade vascular local, mediada por aminas vasoativas como a histamina e serotonina. A ligao da regio Fc dos anticorpos dos imunocomplexos a receptores Fc das membranas provoca a liberao das aminas vasoativas provenientes de baslos, plaquetas e mastcitos que circulam no local da deposio. A poro Fc se liga ao componente C1 e ativa a via clssica do complemento. Ocorre a atrao de neutrlos para o local de deposio, e a formao do complexo de ataque membrana (MAC), o que contribui para a injria local. Os receptores para a poro Fc das imunoglobulinas G esto presentes no plexo coride, onde possuem distribuio periventricular. A localizao desses receptores parece ter relevncia na distribuio das leses por deposio de imunocomplexos observadas na infeco pelo MVV e CAEV em pequenos ruminantes (ovinos e caprinos). Na anemia infecciosa eqina, os anticorpos se ligam a vrions livres no plasma, e os imunocomplexos so depositados principalmente nos glomrulos renais, levando glomerulonefrite imunomediada. A circulao desses imunocomplexos tambm pode levar hemlise, resultando em anemia. O FeLV pode induzir deposio de imunocomplexos e imunodecincia. Algumas vezes ocorrem altos nveis de antgenos virais e a formao e deposio de imunocomplexos leva glomerulonefrite imunomediada. Em outros casos, ocorre depleo linfide, em parte pela ADCC. Essa depleo leva a uma maior susceptibilidade a infeces secundrias, como estomatites crnicas, gengivites, leses de pele e abscessos subcutneos. As leses imunomediadas podem ocorrer tambm como seqelas de infeces virais, sem envolvimento direto na patogenia da infeco, como a sndrome oftlmica que ocorre em ces convalescentes da infeco pelo CAdV-1. A leso caracterizada pela deposio de imunocomple-

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xos na crnea, resultando em opacidade, conhecida como olho azul.

6.2 Imunopatologia mediada por linfcitos T citotxicos


Os linfcitos T citotxicos (CTLs, CD8+) possuem um papel relevante na erradicao de infeces vricas dos hospedeiros, pela sua capacidade de identicar e lisar clulas infectadas por vrus. Os CTLs reconhecem peptdeos virais conjugados com molculas do MHC-I na superfcie das clulas infectadas, atravs das molculas TCR + CD8. Alm de lisar clulas infectadas, os CTLs parecem ser capazes de erradicar certos vrus (p. ex.: vrus da hepatite B humana), sem a necessidade de lisar as clulas infectadas, provavelmente interferindo (atravs de citocinas) com alguma etapa da replicao viral. Dessa forma, a infeco aguda pelo HBV geralmente erradicada por uma resposta vigorosa mediada principalmente por CTLs especcos para antgenos do vrus. Por outro lado, a resposta imunolgica de alguns pacientes no consegue erradicar a infeco e esses indivduos se tornam portadores de infeco heptica crnica. Nesses indivduos, a resposta mediada por CTLs fraca ou indetectvel, provavelmente devido a uma expanso clonal deciente. Essa resposta fraca e contnua tem sido implicada na patogenia da infeco crnica, levando a leses necro-inamatrias crnicas no fgado, ou seja, a injria celular de intensidade fraca, porm contnua, resultaria em um processo inamatrio persistente que resulta em hepatite crnica. Eventos semelhantes ocorrem em camundongos inoculados com o LCMV.

zir anticorpos contra protenas prprias. Assim, os linfcitos T que possuem papel essencial na resposta imune contra vrus so responsveis pela modulao da intensidade da resposta, limitando os danos causados por uma resposta agressiva. A expanso clonal dessas clulas em resposta a epitopos de protenas do hospedeiro, evento que pode ocorrer em determinadas infeces vricas, est envolvido na induo de autoimunidade. Esse processo ocorre, por exemplo, na encefalomielite murina de Theiler, em que a resposta especca de clulas T ao vrus ocorre junto com uma resposta imune contra a protena bsica da mielina, induzindo desmielinizao auto-imune.

7 Imunossupresso por vrus


Grande parte das infeces vricas acompanhada por disfunes no sistema imunolgico, muitas das quais podem ser detectadas in vivo e demonstradas experimentalmente in vitro. Freqentemente, essas alteraes ocorrem concomitantemente com uma resposta imunolgica efetiva contra o vrus que as induziu. Por outro lado, alguns vrus suprimem a resposta imunolgica contra os seus antgenos, proporcionando condies para o estabelecimento de infeces prolongadas ou persistentes. As alteraes imunolgicas causadas por infeces vricas podem aumentar a susceptibilidade do hospedeiro a infeces secundrias, dicultar ou retardar a resposta contra a prpria infeco, ou levar a um desequilbrio amplo e duradouro na resposta imunolgica contra vrios agentes. Falha em responder a outros antgenos, tanto por vacinao como infeco natural, resposta deciente em provas de hipersensibilidade retardada e resposta proliferativa e citotxica decientes, tm sido associadas com diversas infeces vricas em humanos e animais. Ativao policlonal de linfcitos B, que pode resultar em um aumento inespecco do nvel de imunoglobulinas plasmticas e dicultar o diagnstico sorolgico da infeco, alm de reduzir a resposta a antgenos recm-introduzidos, tambm tem sido identicada em algumas infeces.

6.3 Imunopatologia por induo de auto-imunidade


A induo de auto-imunidade outro mecanismo de imunopatologia que pode ocorrer em algumas infeces virais. Nesse mecanismo, pode ocorrer estimulao antignica por determinantes antignicos de protenas virais que sejam semelhantes a protenas do hospedeiro ou por distrbios na ativao de linfcitos, que podem produ-

Patogenia das infeces vricas

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Os mecanismos envolvidos nesses eventos, no entanto, nem sempre so facilmente elucidveis, sobretudo pela diculdade de se mimetizar experimentalmente in vitro a complexidade das interaes imunolgicas que ocorrem in vivo. Em geral, os mecanismos envolvidos com imunossupresso por vrus podem ser devidos replicao viral em clulas que participam da resposta imunolgica, alterao da resposta imunolgica normal pela resposta especca contra o vrus ou a efeitos indiretos da replicao e/ou de produtos virais. A Tabela 8.5 apresenta um resumo das alteraes imunolgicas j identicadas em infeces vricas e os mecanismos potencialmente envolvidos.

7.1 Replicao viral em clulas envolvidas na resposta imunolgica


Diversos vrus replicam em clulas da linhagem mielide e/ou linfide, cujas clulas diferenciadas esto envolvidas com a resposta imunolgica natural e adquirida. Para alguns vrus, essas clulas se constituem nos principais alvos da replicao, enquanto, para outros, elas representam apenas uma parcela das populaes celulares infectadas. A infeco e destruio de clulas imunolgicas o mecanismo mais atraente e lgico na tentativa de explicar a imunossupresso causada por vrus. No entanto, este no o ni-

Tabela 8.5. Principais alteraes imunolgicas e seus mecanismos de induo, por diferentes grupos de vrus

Alteraes imunolgicas Famlia/ Famlia grupo


Susceptibilidade Proliferao Aumento nas Replicao em Vrus clulas imunoglobulinfide a infeces imunolgicas linas reduzida

Mecanismos
Ativao do Produtos de sistema moncitos e imune linfcitos Th Protenas virais

Picornaviridae Flaviviridae Arteriviridae Coronaviridae

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Orthomyxoviridae Paramyxoviridae Rhabdoviridae Arenaviridae

Reoviridae Retroviridae Parvoviridae Adenoviridae Herpesviridae Poxviridae

Fonte: adaptada de Griffin (1997).

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Captulo 8

co e talvez nem seja o mecanismo mais relevante envolvido na supresso da resposta imunolgica por vrus. Na verdade, na grande maioria das infeces vricas imunossupressivas estudadas, o percentual de clulas de determinada populao que infectada raramente atinge 1%. Essa pequena proporo infectada dicilmente seria suciente para explicar a decincia imunolgica associada com essas infeces. O HIV, por exemplo, infecta linfcitos TCD4+. Em clulas quiescentes, o vrus se encontra em um estado de latncia, sem o genoma integrado nos cromossomos celulares. Por ocasio da ativao dessas clulas, que seguida da integrao do provrus DNA, a replicao viral iniciada. A frao de linfcitos TCD4+ circulantes que infectada situa-se em torno de 0,01 a 1%, sendo que menos de 10% destas produzem prognie viral. Essa proporo de clulas infectadas no justica as severas alteraes imunolgicas observadas nos pacientes soropositivos, indicando a participao de outros mecanismos na imunossupresso. J o IBDV, um birnavrus de galinhas, infecta liticamente populaes de linfcitos B que esto em diviso, resultando em imunossupresso profunda pela extensiva perda dessas clulas. Nos animais afetados, ocorre uma disfuno na resposta humoral, mediada por linfcitos B. Dentre os vrus animais que infectam clulas do sistema imunolgico se incluem: a) vrus que infectam linfcitos T: vrios retrovrus animais (p. ex.: FeLV e FIV) e GHV-2 (vrus da doena de Marek); b) vrus que infectam linfcitos B: birnavrus (IPNV e IBDV), vrus da leucemia murina (MuLV), retrovrus smio, BVDV e BLV; c) vrus que infectam clulas da linhagem monocticamacrofgica: VEEV, LCMV, vrus da inuenza, vrus Maedi-Visna, CAEV, vrus da parainuenza, vrus da peste suna africana (ASFV). ASFV, vrios coronavrus, circovrus, arterivrus (PRRSV, EAV, LDEV), EIAV e ALV.

contra o vrus infectante. Seriam, portanto, conseqncias inevitveis da resposta necessria para combater este agente e montar uma resposta duradoura que proteja contra reinfeces. Nesse sentido, decincias imunolgicas podem ser resultantes de: a) ativao generalizada de linfcitos T sem os sinais apropriados (muitos dos quais morrem por apoptose); b) produo anormal (quantitativa e qualitativamente) de citocinas; c) depleo de linfcitos T vrus-especcos pela sua ativao em resposta ao agente. A participao desses mecanismos na imunossupresso evidenciada pelo fato de que os nveis mximos de supresso coincidem com o aparecimento da resposta imunolgica especca e erradicao do agente. Esse tipo de imunossupresso tem sido detectado em infeces pelo vrus da inuenza, vrus da coriomeningite linfoctica (LCMV), entre outros.

7.3 Produtos de moncitos e linfcitos ativados


Vrias interleucinas so produzidas por clulas especializadas em resposta a infeces vricas, incluindo os interferons do tipoI (IFN alfa e beta), IL-2 e receptor de IL-2, entre outras. A maioria dessas interleucinas atua modulando e estimulando a resposta celular e/ou humoral contra o agente infeccioso. No entanto, j foram identicados vrios fatores produzidos por moncitos e linfcitos ativados que inibem a resposta imunolgica. A resposta contra o vrus de Newcastle, por exemplo, caracterizada pela reduo da atividade dos linfcitos T citotxicos contra um segundo vrus, associada com supresso dos nveis de IFN. As interleucinas 4 e 10 (IL-4, IL-10) produzidas por linfcitos ativados suprimem a funo de moncitos/macrfagos.

7.4 Protenas virais


Diversas protenas codicadas por vrus interferem com a resposta imunolgica do hospedeiro, retardando ou suprimindo esta resposta, permitindo, assim, a replicao e disseminao do vrus no hospedeiro (Tabela 8.6). Algumas dessas protenas podem ser secretadas pelas clulas infectadas e interferir com a funo de clulas

7.2 Imunossupresso associada com a ativao do sistema imune


Muitas alteraes da resposta imunolgica ocorrem no contexto da resposta desencadeada

Patogenia das infeces vricas

233

Tabela 8.6. Protenas virais que interferem com a resposta imunolgica do hospedeiro

Mecanismo efetor Famlia


Lise celular mediada por anticorpos e complemento

Vrus

Protena viral Vrus


gE+gI gC VCP E3/19K ICP47 UL-18 ? ? ? crmA orfB8R 38kDa 37kDa

Protena-alvo
Poro Fc das Igs C3b C3b+C4b Cadeia pesada MHC-I TAP Beta 2-microglobulina TNF TNF IL-1 beta TNF IL-1 beta IFN gama IFN gama, IL-2, IL-5 IFN gama

Vrus do herpes simplex Vrus vaccinia Adenovrus Vrus do herpes simplex Citomegalovrus Vrus do mixoma (Pox)

Apresentao de antgenos peloMHC-I a linfcitos citotxicos

Produo de citocinas por macrfagos

Vrus vaccina Cowpox Orthopox

Produo de citocinas por linfcitos Th

Tanapox Vrus do mixoma

Fonte: adaptada de Griffin (1997).

no-infectadas. J foi demonstrado, por exemplo, que a hemaglutinina do vrus da inuenza afeta diretamente a funo de neutrlos. Outras protenas virais podem se ligar a receptores de superfcie celular e interferir com a sua funo. Por exemplo, as glicoprotenas gE e gI do HSV (e provavelmente de outros alfaherpesvrus) se ligam na poro Fc das imunoglobulinas, impedindo que ocorra a ativao do complemento na superfcie de clulas infectadas e prevenindo, assim, a destruio dessas clulas. Protenas virais podem tambm atuar como superantgenos, ligando-se a receptores de linfcitos T e estimulando-os at a exausto e depleo. A protena E3/19 K dos adenovrus se liga com a cadeia pesada da molcula de MHC-I, retendo-a no retculo endoplasmtico. Assim, as clulas infectadas pelos adenovrus no apresentam peptdeos virais associados com o MHC-I e no so reconhecidas pelos linfcitos Tc. Alguns poxvrus e herpesvrus tambm suprimem a expresso de MHC-I na superfcie das

clulas infectadas. Os poxvrus codicam protenas que so secretadas pelas clulas infectadas e interferem com a ao de interleucinas produzidas em resposta infeco. Alguns desses vrus codicam uma protena que se liga ao fator de necrose tumoral (TNF) e o impede de se ligar superfcie das clulas infectadas. O vrus do mixoma codica uma protena homloga ao receptor do interferon gama (IFN ). Os vrus da vaccinia e cowpox codicam protenas que se ligam e inibem a funo da IL-1, IFN- e TNF. Em resumo, a infeco e alterao da funo de clulas envolvidas na resposta imunolgica no o nico mecanismo de imunossupresso causado por vrus. provvel que a imunossupresso observada nas infeces vricas, em sua maioria, deva-se interao de mltiplos fatores, que incluem citocinas/interleucinas, infeco e disfuno de clulas imunolgicas e efeitos de protenas virais especcas.

234

Captulo 8

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Patogenia das infeces vricas

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RESPOSTA IMUNOLGICA CONTRA VRUS


Luiz Carlos Kreutz

9
239 239
240 242 242 243 243 243

1 Introduo 2 Resposta imune inata


2.1 Interferon tipo I 2.2 Sistema complemento 2.3 Clulas natural killer 2.4 Clulas dendrticas 2.4.1 Interao entre as DCs e clulas NK 2.4.2 O papel das DCs na resposta imune adquirida

3 Resposta imune adquirida


3.1 Reconhecimento de antgenos pelo sistema imunolgico 3.1.1 Reconhecimento de antgenos pelos linfcitos B 3.1.2 Reconhecimento de antgenos pelos linfcitos T 3.2 Resposta imune celular 3.2.1 Importncia dos linfcitos Tc na imunidade antiviral 3.3 Resposta imune humoral 3.4 Respostas primria e secundria/memria imunolgica 3.5 As imunoglobulinas na defesa antiviral 3.5.1 Mecanismos de ao das imunoglobulinas 3.6 O papel da resposta humoral e celular na imunidade antiviral

244
244 244 245 249 250 250 252 253 254 255

4 Mecanismos virais de evaso da resposta imune


4.1 Infeces latentes no sistema nervoso central 4.2 Variaes antignicas 4.3 Induo de tolerncia 4.4 Integrao do material gentico viral no genoma do hospedeiro 4.5 Infeco de stios imunologicamente privilegiados 4.6 Interferncia com funes do sistema imunolgico

256
256 256 257 257 257 258

5 Consideraes nais 6 Bibliograa consultada

258 258

1 Introduo
A imunidade ou resistncia do hospedeiro contra infeces vricas depende da atuao integrada da resposta imune inata e da resposta imune adquirida. Os mecanismos envolvidos na resposta imune inata atuam imediatamente aps o contato do hospedeiro com os antgenos virais, no possuem capacidade de discriminao entre os vrus e no necessitam de exposio prvia para serem desencadeados. Os mecanismos envolvidos na resposta imune adquirida, por sua vez, desenvolvem-se seqencialmente e de forma mais lenta e sincronizada, resultando na induo de clulas efetoras, que iro combater o agente, e de clulas de memria, que possuem vida longa e que sero efetivamente reestimuladas em exposies posteriores ao mesmo agente. A diviso entre a resposta imune inata e adquirida no absoluta, e essas duas formas de resposta esto interligadas, atuando conjuntamente no combate aos agentes agressores. Os principais protagonistas da conexo entre essas respostas so as clulas dendrticas (dendritic cells, DCs). Essas clulas circulam pelos tecidos perifricos, onde capturam antgenos, e se dirigem aos rgos linfides secundrios, onde estimulam as clulas linfides. Alm disso, as infeces vricas so acompanhadas de estmulos qumicos e celulares que formam uma intrincada rede de informaes, que visam maximizar o mecanismo imunolgico mais efetivo contra a maioria dos vrus: os linfcitos T citotxicos (Tc). Os componentes da imunidade inata so ativados precocemente aps a infeco e se encarregam de limitar e restringir a replicao viral at que os mecanismos da resposta imune adquirida tenham sido desencadeados. Na resposta inata contra vrus, atuam principalmente o interferon do tipo I (IFN-I), clulas natural killer (NK) e os componentes ativos do complemento. A resposta imune adquirida mediada por clulas (linfcitos T) e por molculas circulantes (anticorpos), produzidas por clulas derivadas dos linfcitos B. As citocinas (ou interleucinas [ILs]) so peptdeos produzidos por uma variedade de clulas que moderam e inuenciam a funo de outras clulas do sistema imunolgico.

2 Resposta imune inata


A resposta imune inata (tambm denominada natural ou inespecca) mediada por clulas e molculas. Previamente estimulao dessa resposta, mecanismos naturais de proteo contra a penetrao de patgenos, como a pele, os plos, o muco, enzimas, peptdeos antivirais e anti-bacterianos representam as barreiras iniciais contra os agentes infecciosos. A ausncia ou disfuno desses mecanismos provavelmente resultaria em um aumento da freqncia e da severidade das infeces. Embora sejam considerados componentes da imunidade inata, essas barreiras no sero abordadas nessa reviso. Aqui, ser dado enfoque aos mecanismos imunolgicos naturais que efetivamente participam da imunidade antiviral e, principalmente, que cooperam com a ativao da resposta imune especca. A resposta imune inata assim denominada em razo de algumas caractersticas peculiares, tais como: a) atua imediatamente aps o contato com o agente; b) no discrimina diferentes tipos de antgenos; c) atua com intensidade relativamente constante e d) no possui memria. questionvel se, agindo isoladamente, a resposta inata seria capaz de erradicar uma infeco vri-

240

Captulo 9

ca estabelecida. No entanto, os seus mecanismos efetores se constituem em obstculos importantes, que retardam a progresso do processo infeccioso, controlando-o temporariamente e, assim, permitindo o desenvolvimento da imunidade especca. Os principais componentes da resposta inata contra vrus so representados pelo IFN-I, sistema complemento, clulas NK e DCs. Esses mecanismos so desencadeados seqencialmente aps a infeco vrica e antecedem o desenvolvimento dos mecanismos especcos (Figura 9.1).

2.1 Interferon
O primeiro obstculo infeco viral representado pelos IFN-I, que foram justamente identicados pela sua capacidade de interferir com a replicao viral. O IFN-I compreende dois tipos principais: interferon alfa (IFN-) e interferon beta (IFN-), que so produzidos por vrios tipos de clulas em resposta s infeces vricas. Vrios vrus so potentes indutores de IFN-I, e a sua induo est associada com a produo de RNA de ta dupla no interior da clula durante a replicao viral. A interao de alguns vrus com

os receptores celulares tambm parece estimular a produo de IFN-I. Qualquer clula nucleada capaz de produzir IFN-I em resposta a uma infeco por vrus, mas evidncias recentes indicam que as DCs plasmacitides (pDCs) representam a principal fonte dessa citocina. O IFN-I produzido por clulas infectadas secretado no meio extracelular e se distribui localmente, interagindo com as clulas vizinhas e induzindo um estado de resistncia antiviral (Figura 9.2). Essa interao mediada por receptores especcos na superfcie celular, que esto amplamente distribudos nos tecidos. A ligao do IFN-I aos receptores desencadeia uma srie de sinais intracelulares que induzem a transcrio de genes cujos produtos esto envolvidos na resposta mediada pelos IFNs. Os principais efeitos antivirais do IFN-I so devidos degradao de RNAs mensageiros (mRNA) e inibio da traduo. Dessa forma, esta citocina inibe a sntese de protenas na clula-alvo, tornando-a um meio imprprio para a replicao viral, uma vez que os vrus dependem integralmente da maquinaria celular de sntese protica para a sua replicao.

4 1

Aumento da expresso do MHC-I

Ativao de: Clulas NK; Linfcitos Tc; Macrfagos.

Estado de resistncia antiviral (inibio da sntese protica, degradao de mRNA)

Figura 9.2. Induo e principais funes do IFN-I na resposta imune inata. A presena de RNA de fita dupla em clulas infectadas por vrus induz a produo de IFN-I (1), que secretado no meio extracelular (2). O IFN-I interage com receptores nas clulas vizinhas (3) e desencadeia uma srie de reaes que resultam na induo de um estado de resistncia antiviral (4). O IFN-I tambm promove um aumento na expresso do MHC-I (5), alm de ativar clulas NK, linfcitos Tc e macrfagos (6).

Resposta imunolgica contra vrus

241

O IFN-I desencadeia uma srie de reaes intracelulares que levam expresso da enzima 2-5-adenilato sintetase. Essa enzima sintetiza oligmeros de adenina (oligo-A), que, por sua vez, ativam a endorribonuclease RNAse L. A ativao da RNAse L resulta na degradao de mRNA celulares e virais. Alm disso, o IFN-I promove a ativao da enzima protena kinase R (PKR), que fosforila e inativa o fator de iniciao da traduo (elongation initiation factor 2 - eIF-2). Com isso, a traduo de mRNAs celulares e virais tambm ca inibida. Outro grupo de IFN-I induz um estado antiviral pela induo das protenas Mx, que tambm contribuem para a inibio da sntese protica celular.

O IFN-I atua tambm como fator de sobrevivncia para as pDCs, promove o desenvolvimento, maturao e atividade microbiocida dos macrfagos e ativa as clulas NK, que, por sua vez, interagem sinergisticamente com as DCs. Alm de seu papel na imunidade inata, o IFN-I possui um papel importante no desenvolvimento da imunidade especca, por meio de diferentes mecanismos, tais como: a) induo da expresso de molculas do complexo de histocompatibilidade principal do tipo I (MHC-I), o que favorece o processamento e a apresentao de antgenos endgenos; b) ativao das DCs, produzindo um aumento da expresso de receptores e produo de citocinas; c) estimulao da

8
Fagcito

10 9 12 11

7
NK

Clula infectada

2 5

6
Linfcitos Tc

Dcs Clulas vizinhas

Figura 9.3. Mecanismos efetores associados com a resposta imune inata. A infeco viral (1) resulta na produo e secreo de IFN-I pelas clulas infectadas (2). O IFN-I secretado induz um estado de resistncia antiviral nas clulas vizinhas (3); ativa clulas NK (4), DCs (5), linfcitos Tc (6) e estimula a atividade fagoctica dos macrfagos (7). Simultaneamente, a presena de vrions pode levar ativao do complemento (8); cujos componentes ativados atraem e ativam fagcitos (9, 10), opsonizam vrions, facilitando a fagocitose (11) ou promovem a lise de vrus envelopados (12).

242

Captulo 9

sobrevivncia e proliferao de linfcitos T de memria; d) estimulao da produo de interferon gama (IFN-) pelas DCs e linfcitos T; e) participao direta e indireta na diferenciao e atividade dos linfcitos B. Os mecanismos de ativao e as atividades desempenhadas pelo IFN-I na resposta imune infeces vricas esto ilustrados nas Figura 9.2 e 9.3.

e fungos) torna-as resistentes ao complemento, pois inibe a ligao de alguns componentes que do continuidade cascata e posterior formao do MAC.

2.3 Clulas natural killer


As clulas natural killer (NK) so derivadas de progenitores linfides da medula ssea e foram assim denominadas em razo de sua capacidade de destruir clulas tumorais e clulas infectadas por vrus na ausncia de um reconhecimento antgeno-especco. Constituem o que se convencionou chamar de terceira populao de linfcitos (linfcitos B, T e clulas NK). Por no possurem marcadores especcos de linfcitos B ou de linfcitos T, foram inicialmente chamadas de clulas nulas (null cells). As clulas NK esto presentes principalmente nos tecidos linfides perifricos e atuam direta, pela capacidade de destruir clulas infectadas, e indiretamente mediante a secreo de citocinas. A atividade das clulas NK precede a ativao da resposta imune especca. A destruio de clulas infectadas por vrus realizada inicialmente pelas clulas NK e, posteriormente, pelos linfcitos Tc. A capacidade das clulas NK em distinguir clulas infectadas de clulas no-infectadas est relacionada com a presena de receptores inibidores da destruio (killing inhibitory receptors = KIR) na sua superfcie. Esses receptores reconhecem as molculas do complexo de histocompatibilidade principal do tipo I (MHC-I), que esto presentes na superfcie de virtualmente todas as clulas do organismo. A expresso do MHC-I est geralmente reduzida em clulas infectadas por vrus e em clulas tumorais. Dessa forma, utilizando os receptores KIR, as clulas NK podem detectar se uma clula est expressando molculas do MHCI em nveis normais. A ligao dos KIR em molculas do MHC-I inibe a ao das clulas NK. No caso da expresso das molculas de MHC-I estar reduzida, essa clula torna-se alvo de destruio pelas clulas NK. O mecanismo utilizado pelas clulas NK para destruir as clulas-alvo semelhante ao utilizado pelos linfcitos Tc. O contato com a clula infectada estimula as NK a liberarem perforinas

2.2 Sistema complemento


O sistema complemento composto por um conjunto de protenas presentes no plasma sangneo na forma inativa. Essas protenas podem ser ativadas pela presena de complexos imunes, formados pela ligao de imunoglobulinas com antgenos (via clssica de ativao), pela deposio espontnea do componente C3b do complemento na superfcie de microorganismos (via alternativa) ou devido ligao com protenas que se ligam manose (via da lecitina). A ativao do complemento por qualquer uma dessas vias resulta em uma cascata de ativao seqencial, com a formao de molculas intermedirias que possuem diversas atividades biolgicas, principalmente ligadas ativao do processo inamatrio. Dentre as funes dos componentes ativados do complemento destacam-se: opsonizao; quimiotaxia e ativao de neutrlos e outras clulas inamatrias; degranulao de mastcitos com conseqente vasodilatao e aumento da permeabilidade capilar e formao do complexo de ataque membrana (membrane attack complex, MAC), formado pela associao dos componentes C5-9 e que se inserem na membrana de clulas infectadas ou no envelope de vrions, resultando na sua destruio. O componente mais importante do complemento denominado C3, que, a partir da ativao da cascata, clivado de forma contnua e espontnea, gerando os produtos C3a e C3b. Uma vez produzido, o C3b se deposita em superfcies que no possuam cido silico, como o envelope de diversos vrus, e, assim, desencadeia a cascata de ativao do complemento, que culmina com a formao do MAC e com a destruio do vrion. A presena de cido silico na superfcie das clulas animais (e eventualmente em algumas bactrias

Resposta imunolgica contra vrus

243

no meio extracelular. As perforinas so protenas semelhantes aos componentes C5-C9 do complemento e produzem pequenos poros na membrana plasmtica da clula-alvo. As clulas NK liberam ento as granzimas, que penetram por estes poros e induzem morte celular por apoptose. Durante a resposta inata, as clulas NK destroem clulas infectadas independentemente do reconhecimento de antgenos especcos. No curso da resposta imune especca e aps a produo de anticorpos antivirais, as clulas NK tambm podem participar da destruio de clulas infectadas. Nesse caso, anticorpos produzidos contra antgenos virais se ligam em antgenos virais presentes na superfcie das clulas infectadas. Essa ligao facilita o seu reconhecimento pelas clulas NK, pois estas possuem receptores para a poro Fc das imunoglobulinas. Essa atividade denominada citotoxicidade celular dependente de anticorpos (antibody dependent cellular citotoxicity, ADCC) e tambm pode ser mediada por outras clulas que possuem receptores para a poro Fc (macrfagos, neutrlos e eosinlos). Alm de destruir clulas infectadas por vrus, as clulas NK contribuem para a defesa antiviral pela secreo de vrias citocinas, incluindo o IFN- e fator de necrose tumoral alfa (TNF-). Essas clulas tambm possuem receptores para vrias citocinas (IL-2, IL-12 e TNF-) que podem inuenciar na sua atividade.

freqentes de penetrao de agentes virais. As clulas de Langerhans (LC), por exemplo, esto localizadas na epiderme; DCs intersticiais esto localizadas na derme, nas mucosas e em tecidos perifricos. Por outro lado, as pDCs encontramse principalmente nos rgos linfides, como a medula ssea, timo, bao, tonsilas e linfonodos. As mDCs desempenham a importante funo de apresentar antgenos aos linfcitos T e transferir antgenos aos linfcitos B, eventos que se constituem no principal elo entre a imunidade inata e a imunidade adquirida. Alm disso, as pDCs so as principais clulas produtoras de IFN-I durante as infeces virais e participam ativamente da estimulao das clulas NK.

2.4.1 Interao entre as DCs e clulas NK


As DCs estimulam as clulas NK por meio de mediadores solveis e tambm por contato direto. A interao entre as DCs e as clulas NK importante para a ativao das prprias DCs. A ativao das DCs pelas clulas NK depende de contato direto, da proporo NK:DCs e de citocinas como o TNF-. Clulas NK pr-ativadas por IL-2 so potentes estimuladoras das DCs, agindo tanto de forma isolada como em sinergismo com estmulos inamatrios, como os lipopolissacardeos (LPS). A interao entre as clulas NK e DCs parece ocorrer nos locais da infeco, onde existem DCs imaturas residentes e para onde migram as clulas NK em resposta a estmulos inamatrios. Essa interao pode ocorrer tambm nos linfonodos e em outros rgos linfides secundrios, para onde as DCs migram aps capturar antgenos nos tecidos perifricos.

2.4 Clulas dendrticas


As clulas dendticas (DCs) constituem uma populao heterognea de clulas que diferem entre si em relao origem, fentipo, localizao, funo e necessidades para o desenvolvimento. As DCs que se originam de progenitores mielides da medula ssea so semelhantes aos moncitos e so denominadas de DCs mielides (mDCs). Por outro lado, as DCs que se originam dos progenitores linfides so denominadas de DCs plasmacitides (pDCs) e se assemelham aos plasmcitos. As mDCs so encontradas em quase todos os tecidos e rgos, com exceo do crebro, dos olhos e dos testculos. So especialmente abundantes nos linfonodos, na pele e em tecidos subjacentes a superfcies mucosas, locais

2.4.2 O papel das DCs na resposta imune adquirida


As DCs constituem o principal elo entre a imunidade inata e a imunidade adquirida. As DCs so especializadas na captura e apresentao de antgenos aos linfcitos T, evento essencial para a estimulao dessas clulas em resposta a antgenos. Por sua vez, a estimulao de linfcitos Th resulta na produo de citocinas que ativam tanto a resposta mediada por clulas (Tc) como a resposta humoral (linfcitos B plasmcitos). Os

244

Captulo 9

estmulos para a proliferao dessas clulas so fornecidos por mediadores solveis (citocinas ou interleucinas) produzidos pelas prprias DCs, ou no microambiente dos linfonodos, onde os linfcitos so ativados. As DCs encontram-se nos principais locais de penetrao dos vrus e tambm nos linfonodos e em outros tecidos linfides secundrios. Conseqentemente, o contato dos vrus ou de suas protenas com as DCs praticamente inevitvel e fundamental para que as DCs processem adequadamente os antgenos virais e os apresentem s diferentes populaes de linfcitos. Os mecanismos envolvidos na resposta imune inata contra vrus esto ilustrados na Figura 9.3.

3 Resposta imune adquirida


Os mecanismos imunolgicos especcos contra as infeces vricas so desencadeados aps a estimulao direta ou indireta dos linfcitos T e B pelos antgenos virais e possuem como caractersticas principais: especicidade (cada clula reconhece apenas um determinante antignico); diversidade (capacidade de reconhecer uma grande variedade de antgenos) e memria imunolgica (capacidade de produzir uma resposta qualitativa e quantitativamente diferente em exposies subseqentes a um determinado antgeno). Alm disso, a resposta imune especca se caracteriza pela tolerncia a antgenos do prprio organismo. De acordo com os mecanismos efetores, a resposta imune especca pode ser dividida em celular e humoral. A resposta celular mediada pelos linfcitos T auxiliares (T helper ou Th) e linfcitos Tc. A resposta humoral mediada pelos anticorpos produzidos pelos plasmcitos, clulas derivadas dos linfcitos B. Embora sejam tratados separadamente com ns didticos, os mecanismos envolvidos nessas duas respostas so complementares e atuam conjuntamente no combate s infeces vricas. A importncia relativa desses mecanismos, no entanto, varia entre os diferentes vrus, de acordo com a sua biologia. Para alguns vrus, a resposta mediada por linfci-

tos Tc fundamental na erradicao da infeco; para outros, a resposta humoral desempenha um papel mais importante na proteo. O conhecimento dos mecanismos especcos envolvidos na resposta imunolgica contra cada vrus fundamental para a elaborao de vacinas. A etapa inicial da resposta imunolgica especca o reconhecimento de antgenos pelos linfcitos Th, Tc e B. Em resposta ao contato com o antgeno, os linfcitos Th secretam vrias citocinas, que estimulam a atividade de outras clulas envolvidas na resposta imunolgica. Os linfcitos Tc reconhecem e destroem clulas infectadas por vrus e tambm secretam algumas citocinas. Estimulados pelo contato com o antgeno, os linfcitos B proliferam e se diferenciam em plasmcitos. Os anticorpos, produzidos pelos plasmcitos so protenas solveis que possuem diversas funes no combate aos agentes invasores.

3.1 Reconhecimento de antgenos pelo sistema imunolgico


A capacidade de distinguir antgenos prprios de antgenos no-prprios (neste caso, os antgenos virais) se constitui no evento central da resposta imune adquirida. Antgenos noprprios devem ser reconhecidos como tal, e o seu reconhecimento deve induzir uma resposta que resulte na sua eliminao e/ou inativao. Por outro lado, os antgenos prprios devem ser igualmente reconhecidos, porm devem ser tolerados. Ou seja, antgenos do prprio organismo no devem estimular uma resposta imunolgica. A resposta imunolgica especca contra vrus mediada por diferentes subpopulaes de linfcitos: os linfcitos Th, Tc e B. Essas trs populaes de linfcitos apresentam mecanismos efetores distintos e reconhecem os antgenos de formas diferentes. A seguir sero apresentados os mecanismos de reconhecimento de antgenos pelos linfcitos B e T.

3.1.1 Reconhecimento de antgenos pelos linfcitos B


Os linfcitos B reconhecem os antgenos virais atravs de receptores de membrana denomi-

Resposta imunolgica contra vrus

245

nados BCRs (B cell receptors). Os BCRs so molculas de imunoglobulinas das classes IgD e IgM, que possuem uma regio altamente varivel, capaz de se ligar a uma variedade muito grande de determinantes antignicos. Os BCRs podem se ligar a antgenos de qualquer natureza qumica, sejam protenas, carboidratos, lipdios ou outras macromolculas, ou seja, os linfcitos B podem reconhecer e responder a antgenos proticos e no-proticos, desde que esses possuam regies complementares s regies variveis dos seus BCRs. Isso faz com que os linfcitos B reconheam antgenos na sua forma nativa, solvel ou no, sem a necessidade de processamento prvio. No caso dos vrus, os principais antgenos reconhecidos pelos linfcitos B so as protenas de superfcie dos vrions, devido a sua localizao e acessibilidade aos BCRs. Protenas virais inseridas em membranas celulares, alm de protenas secretadas pelas clulas infectadas, tambm podem estimular os linfcitos B. Os linfcitos B tambm podem reconhecer antgenos virais capturados e armazenados na superfcie das DCs, sob a forma de pequenas esferas (icossomos). Do ponto de vista de proteo, os anticorpos induzidos contra protenas de superfcie (do capsdeo ou envelope) possuem importncia especial, pois podem se ligar e neutralizar a infectividade dos vrus. Os locais de contato entre os antgenos e os linfcitos B locais de reconhecimento do antgeno so principalmente os rgos linfides perifricos, dentre estes, os linfonodos.

por ambos. A forma de reconhecimento de antgenos por esses dois tipos de linfcitos, no entanto, diferente:

3.1.2.1 Reconhecimento de antgeno pelos linfcitos Th


Os linfcitos Th reconhecem antgenos virais atravs de seus receptores de membrana, denominados TCRs (T cell receptors), juntamente com a molcula acessria CD4. Por isso, so tambm chamados de linfcitos T CD4+. Para que um antgeno protico seja reconhecido pelo complexo TCR+CD4 e estimule o linfcito Th, ele deve ser previamente processado e apresentado de forma adequada por clulas especializadas. O processamento do antgeno protico envolve a sua internalizao por endocitose ou fagocitose, clivagem enzimtica em peptdeos de 12 a 16 aminocidos e conjugao dos peptdeos com molculas do complexo de histocompatibilidade principal do tipo II (MHC-II). Esses processos ocorrem em compartimentos citoplasmticos especializados (endossomos, fagossomos e retculo endoplasmtico). Os complexos MHC-II + peptdeo so, ento, transportados at a superfcie celular, onde cam expostos espera do reconhecimento pelos linfcitos Th. O reconhecimento dos complexos MHC-II + peptdeos realizado pelos receptores TCR+CD4 existentes na membrana dos linfcitos Th e resulta na ativao desses linfcitos. Essa via de apresentao denominada exgena, pois ocorre com protenas extracelulares que so previamente internalizadas e processadas. Protenas estruturais dos vrions, protenas virais secretadas pelas clulas infectadas ou extravasadas no meio extracelular aps a lise celular podem ser processadas desta maneira e ser apresentadas aos linfcitos Th. Em resumo, os linfcitos Th reconhecem antgenos virais proticos, desde que devidamente processados e apresentados em associao com molculas do MHC-II por clulas especializadas (Figura 9.4). Embora um nmero grande de clulas do organismo seja capaz de capturar protenas e outras macromolculas no meio externo e process-las, somente um grupo restrito de clulas expressa molculas do MHC-II. Dentre estas, incluem-se

3.1.2 Reconhecimento de antgenos pelos linfcitos T


O reconhecimento de antgenos pelos linfcitos T mais complexo e requer que o antgeno seja previamente processado e apresentado por clulas e molculas especializadas. Os linfcitos T no so capazes de responder a antgenos em sua forma nativa, solvel ou no, e somente so estimulados por antgenos proticos, ou seja, apenas as protenas virais estimulam a resposta celular. Dependendo da sua origem e da forma como so processadas, as protenas virais podem ser reconhecidas pelos linfcitos Th, pelos Tc ou

246

Captulo 9

Linfcito Th

1 4

2 3

ncleo Clula apresentadora de antgeno (APC)

Figura 9.4. Apresentao de antgenos virais extracelulares e resposta por linfcitos Th. Antgenos virais extracelulares so internalizados por endocitose e/ou fagocitose (1) e processados proteoliticamente no interior de vesculas (2), gerando peptdeos que so conjugados com molculas do MHC-II no retculo endoplasmtico (3). Os complexos peptdeo-MHC-II so transportados at a superfcie celular (4), onde so reconhecidos pelos linfcitos Th (5). Os linfcitos Th, estimulados por esse contato, secretam interleucinas (6) que possuem diversas aes modulatrias sobre as clulas envolvidas na resposta imunolgica.

as clulas da linhagem monoctica/macrofgica (moncitos, macrfagos, CDs, clulas interdigitantes e LC), algumas clulas endoteliais e os linfcitos B. Ou seja, somente essas clulas so capazes de apresentar antgenos virais presentes no meio extracelular (exgenos) aos linfcitos Th. As clulas que possuem como funo precpua a captura, processamento e apresentao de antgenos aos linfcitos Th so denominadas genericamente clulas apresentadoras de antgenos (APCs) prossionais e, dentre estas, destacam-se as DCs e os macrfagos. Embora no se constituam em APCs prossionais, os linfcitos B tambm apresentam antgenos virais de forma eciente aos linfcitos Th. A via exgena de apresentao de antgenos

aos linfcitos Th est representada esquematicamente na Figura 9.4.

3.1.2.2 Reconhecimento de antgeno pelos linfcitos Tc


Os linfcitos Tc reconhecem protenas virais atravs dos TCRs, juntamente com a molcula acessria CD8. Por isso, essas clulas tambm so chamadas de linfcitos T CD8+. Para que as protenas virais sejam reconhecidas pelos receptores TCR+CD8 e estimulem os linfcitos Tc, tambm devem ser adequadamente processadas e apresentadas. No entanto, essa forma de processamento e apresentao somente ocorre com as

Resposta imunolgica contra vrus

247

protenas sintetizadas no interior das clulas durante a infeco, e no com protenas extracelulares que so internalizadas. Por isso, essa via de apresentao denominada endgena. Protenas virais produzidas no interior das clulas durante o ciclo replicativo so clivadas enzimaticamente em peptdeos de 8 a 12 aminocidos, que so conjugados com molculas do MHC-I. Os complexos MHC-I+peptdeos virais so transportados at a superfcie celular, onde cam expostos (Figura 9.5). Esse um processo siolgico e resulta tambm na apresentao de fragmentos de protenas celulares. No entanto, apenas os peptdeos resultantes da clivagem das protenas virais so capazes de estimular os linfcitos Tc. O reconhe-

cimento dos complexos MHC-I+peptdeo realizado pelos complexos TCR+CD8 existentes na membrana dos linfcitos Tc. Essa interao gera estmulos que, em conjunto com citocinas produzidas pelos Th e DCs, levam ativao dos linfcitos Tc. Resumindo, os linfcitos Tc reconhecem protenas virais endgenas, aps o seu processamento e conjugao com molculas do MHC-I. Como, virtualmente, todas as clulas do organismo com exceo dos neurnios expressam o MHC-I, a infeco de quaisquer dessas clulas por vrus ir resultar no reconhecimento e resposta mediada por linfcitos Tc. Acredita-se, no entanto, que as DCs sejam mais efetivas na induo dos linfcitos Tc, pois, alm da apresentao

Linfcito Tc

7 6

1 5

Replicao viral ... prossegue...

2 4 3

ncleo

Qualquer clula nucleada

Figura 9.5. Apresentao de antgenos virais endgenos e resposta por linfcitos Tc. Aps a penetrao do vrus (1), as protenas virais so produzidas pelo aparato celular de traduo (2). Parte dessas protenas so processadas pelos proteassomos (3), resultando em peptdeos que so conjugados com molculas do MHC-I no RE (4). Esses complexos so transportados at a superfcie celular (5), onde sero reconhecidos pelos linfcitos Tc (6). Ativados pelo contato com o antgeno e por citocinas, os linfcitos Tc liberam o contedo citotxico de seus grnulos (7), destruindo a clula infectada.

248

Captulo 9

do MHC-I+ peptdeos, so capazes de fornecer os sinais adicionais para a ativao integral dos Tc. Essa via de apresentao e reconhecimento de antgenos muito importante na resposta a infeces vricas, pois permite ao sistema imunolgico reconhecer clulas infectadas por vrus e ativar o mecanismo mais efetivo para a sua destruio, os linfcitos Tc. Tanto as protenas estruturais como as no-estruturais produzidas durante a replicao viral podem ser processadas e apresentadas aos linfcitos Tc. A via endgena de apresentao de antgenos aos linfcitos Tc est representada esquematicamente na Figura 9.5.

As DCs desempenham um papel muito importante no processo de apresentao de antgenos a outras clulas do sistema imunolgico. As DCs podem ser infectadas por uma variedade de vrus e, assim, apresentar fragmentos de protenas virais conjugadas com o MHC-I aos linfcitos Tc. Alm de apresentar esses antgenos, as DCs fornecem estmulos qumicos (citocinas) para a ativao integral desses linfcitos (Figura 9.6). As DCs podem detectar vrions ou protenas virais atravs de receptores do tipo TLR 7 e 9, resultando em uma cascata de eventos intracelulares que as induzem a produzir citocinas e acelerar o seu

Linfcito Th

2a

2b

3 1 3 6

Linfcito Tc

Clula dendrtica

Linfcito B

8
CTL

5 9
Clula infectada Plasmcito

Figura 9.6. Interaes entre as DCs e os linfcitos e estimulao da resposta adquirida. As DCs so capazes de apresentar peptdeos exgenos aos linfcitos Th (1), estimulando-os a produzir citocinas do tipo Th1 (2a) ou Th2 (2b). O reconhecimento de antgenos em soluo ou nos icossomos da superfcie das DCs (3), juntamente com as citocinas do tipo Th2, estimula os linfcitos B a proliferar (4) e se diferenciar em plasmcitos, que so clulas secretoras de anticorpos (5). Os linfcitos Tc podem reconhecer antgenos endgenos na superfcie de clulas infectadas ou nas DCs (6). Este reconhecimento, juntamente com as citocinas do tipo Th1 (2a), ativa os linfcitos Tc que se tornam CTLs (7). Ao reconhecerem o mesmo padro antignico (MHC-I+ peptdeo viral) na membrana de clulas infectadas (8), os CTLs descarregam o seu arsenal citotxico que resulta em apoptose e morte celular (9).

Resposta imunolgica contra vrus

249

processo de maturao. As DCs possuem prolongamentos citoplasmticos denominados dendritos, que aumentam a sua superfcie, facilitando, com isso, a interao com as demais clulas do sistema imunolgico. As DCs so capazes de capturar e armazenar antgenos em pequenas esferas na sua superfcie, denominadas icossomos. Dessa forma, as DCs podem oferecer e transferir antgenos para outras DCs, para macrfagos e mesmo para os linfcitos B. As interaes entre as DCs e as clulas envolvidas na resposta imune adquirida esto ilustradas na Figura 9.6 O contato entre os antgenos e as clulas do sistema imunolgico apresentao e reconhecimento de antgenos ocorre principalmente nos linfonodos e outros tecidos linfides secundrios. Nesses tecidos, o microambiente existente favorece as interaes entre o antgeno, as DCs e outras APCs, linfcitos T e B e clulas acessrias, resultando na estimulao eciente de uma gama de clulas envolvidas com a resposta imunolgica especca. Alm de se constituir no evento central da imunidade adquirida, o reconhecimento de antgeno e a conseqente estimulao de populaes de linfcitos T e B representa a etapa inicial da resposta imunolgica especca.

3.2 Resposta imune celular


A resposta imune especca mediada por clulas representada pela atividade dos linfcitos T, pois a participao das demais clulas (macrfagos, DCs e clulas NK) faz parte da resposta inata e ocorre de forma inespecca. Os mecanismos efetores dos linfcitos Th e Tc so distintos. Os linfcitos Th modulam a resposta imunolgica atravs das citocinas, que agem estimulando e modulando a atividade de uma variedade de clulas do sistema imune. Os linfcitos Tc possuem a funo precpua de identicar e destruir clulas infectadas por vrus. De acordo com as citocinas produzidas, dois tipos de respostas mediadas por linfcitos Th podem ser identicadas: as respostas do tipo Th1 e Th2. A resposta do tipo Th1 caracterizada pela secreo de IFN-I, IL-2, IL-12 e TNF-. Essas citocinas atuam principalmente na estimulao da imunidade celular (linfcitos Tc, DCs, clulas

NK e macrfagos). A resposta do tipo Th2 caracteriza-se pela secreo de IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, citocinas que atuam principalmente na ativao da imunidade humoral. Essas citocinas possuem papel importante na ativao, proliferao e diferenciao de linfcitos B e secreo de anticorpos, ou seja, as citocinas produzidas pelos Th em resposta ao antgeno estimulam tanto a resposta celular como a resposta humoral. O balano entre as respostas do tipo Th1 e Th2 depende da biologia de cada vrus e de suas interaes com o sistema imunolgico. A funo principal dos Tc na resposta antiviral a destruio de clulas infectadas por vrus. Para muitas infeces vricas, a resposta celular, mediada pelos Tc, representa a forma mais eciente de combate e erradicao da infeco. A ativao dos linfcitos Tc ocorre aps o reconhecimento de antgenos apresentados por clulas infectadas. Esta ativao depende de dois estmulos bsicos: a estimulao resultante do reconhecimento dos complexos peptdeo-MHC-I na superfcie das clulas clulas infectadas e as citocinas produzidas pelas DCs ou pelos linfcitos Th ativados (Figura 9.6). Os complexos peptdeo-MHC-I so reconhecidos exclusivamente pelo TCR e CD8 dos linfcitos Tc. Aps a sua ativao, esses linfcitos tornam-se competentes para destruir as clulas que apresentem o mesmo complexo peptdeo-MHC-I que induziu a sua estimulao. Esses complexos sero encontrados nas clulas que albergam o vrus infectante. Os linfcitos Tc ativados e capazes de destruir clulas infectadas so denominados CTLs (citotoxic T lymphocytes). Ao entrar em contato com a clula infectada, os linfcitos Tc aderem a ela por meio do complexo TCR/CD8 e de outras molculas de superfcie. Essas interaes resultam na reorganizao do citoesqueleto, polarizando o linfcito Tc com o objetivo de descarregar o seu arsenal citotxico sobre a clula infectada. Entre os componentes citotxicos dos linfcitos Tc encontramse as perforinas, que possuem a capacidade de induzir a formao de poros na clula-alvo. Os linfcitos Tc tambm secretam as granzimas, que penetram nas clulas atravs dos poros e ativam mecanismos intracelulares que culminam com a morte programada da clula (apoptose). Poste-

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Captulo 9

riormente, o linfcito Tc desprende-se da clula e parte em busca de novas clulas-alvo, caracterstica que lhe confere o codinome de serial killer entre as clulas do sistema imunolgico. O mecanismo de destruio celular pelos linfcitos Tc similar ao desencadeado pelas clulas NK.

3.2.1 Importncia dos linfcitos Tc na imunidade antiviral


Clulas infectadas por vrus podem produzir milhes de novas partculas virais em um perodo de poucas horas. A disseminao dos vrions entre as clulas ocorre pela liberao de partculas virais no meio extracelular ou pela transmisso direta dos vrions entre clulas. A transmisso direta entre clulas minimiza a possibilidade de um encontro indesejado dos vrions com as clulas e molculas do sistema imunolgico. Nesse caso, as nicas defesas das clulas infectadas so a produo de IFN-I e a apresentao dos antgenos virais associados ao MHC-I. Dessa forma, a presena do vrus no interior das clulas pode ser detectada pelas clulas vizinhas (via IFN-I) e pelos linfcitos Tc. A estratgia do organismo em utilizar os linfcitos Tc para destruir precocemente clulas infectadas muito apropriada, pois prefervel destruir pequenas fbricas de vrions a tentar inativar milhes de partculas vricas disseminadas no organismo e com o potencial de infectar novas clulas. O processamento e apresentao de protenas virais aos linfcitos Tc em fases iniciais da infeco permite ao hospedeiro identicar e destruir as clulas infectadas antes do incio da produo da prognie viral. No obstante, alguns vrus desenvolveram estratgias para evitar ou retardar o reconhecimento de clulas infectadas, a m de assegurar a concluso do ciclo replicativo e a liberao de prognie viral.

3.3 Resposta imune humoral


A resposta especca humoral mediada pelas imunoglobulinas (Igs), popularmente conhecidas como anticorpos. As Igs so produzidas e secretadas pelos plasmcitos, que so clulas originadas da proliferao e diferenciao dos

linfcitos B em resposta a antgenos (Figura 9.7). As Igs apresentam cinco classes principais, com estrutura e funes diferentes: IgG, IgM, IgA, IgE e IgD. Imunoglobulinas das classes IgM e IgD so tambm encontradas na superfcie dos linfcitos B, onde servem de receptores (BCRs) para o reconhecimento de antgenos por essas clulas. Devido aos mecanismos de diversidade e especicidade, cada linfcito B e a sua prognie possuem BCRs idnticos entre si e com a capacidade para reconhecer um nico determinante antignico. Felizmente, o organismo possui bilhes de linfcitos B com BCRs diferentes e, por isso, capazes de reconhecerem e responderem a uma variedade virtualmente innita de antgenos. A capacidade de reconhecimento de antgenos pelos linfcitos B depende exclusivamente do BCR e, conseqentemente, os linfcitos B podem reconhecer antgenos solveis e tambm antgenos no-proticos. Ou seja, os linfcitos B reconhecem os antgenos em sua forma nativa, sem a necessidade de processamento e apresentao prvios, como ocorre com os linfcitos T. A ativao dos linfcitos B depende da sua interao com os antgenos virais (via BCR) e da ao de citocinas secretadas pelos linfcitos Th, tambm em resposta ao reconhecimento do antgeno. As DCs desempenham um papel fundamental nesse processo, pois podem transferir antgenos aos linfcitos B por meio dos icossomos e, simultaneamente, apresentar antgenos ao linfcitos Th (Figuras 9.6 e 9.7). Por outro lado, os linfcitos B, aps reconhecerem um antgeno, podem interagir diretamente com os linfcitos Th, em um processo de estimulao recproca. importante ressaltar que os linfcitos B, alm de secretarem imunoglobulinas, tambm so excelentes APCs, ou seja, podem apresentar antgenos associados ao MHC-II aos linfcitos Th. As citocinas produzidas pelos Th, juntamente com o reconhecimento do antgeno pelo BCR, resultam em estimulao, proliferao e diferenciao dos linfcitos B em plasmcitos, clulas secretoras de anticorpos. As DCs tambm podem fornecer citocinas importantes para uma adequada estimulao dos linfcitos B. O contato com o antgeno e as citocinas produzidas pelos Th estimulam os linfcitos B a se

Resposta imunolgica contra vrus

251

multiplicarem de forma rpida e abundante. As clulas resultantes dessa proliferao podem ter dois destinos: a grande maioria se diferencia em plasmcitos e uma minoria se diferencia em clulas de memria. Os plasmcitos possuem vida

relativamente curta; as clulas de memria possuem vida longa. Tanto os BCRs presentes na membrana dos linfcitos B de memria como as imunoglobulinas secretadas pelos plasmcitos possuem a mesma especicidade dos BCRs do

Vaso aferente

Clulas dendrticas 4

Crtex
2

B
5 7

Th

Centros germinativos
Clula de memria 10 Plasmcitos

Linfonodo

11

Vaso eferente

Figura 9.7. Mecanismos envolvidos na estimulao dos linfcitos B e produo de anticorpos. Partculas vricas ou antgenos virais drenados pela linfa nos tecidos perifricos penetram nos linfonodos pelos vasos aferentes (1). Esses antgenos podem ser reconhecidos diretamente pelos linfcitos B (2) ou em icossomos na superfcie das DCs (3). Tanto as DCs como os linfcitos B podem processar e apresentar antgenos virais aos linfcitos Th (4, 5), que secretam citocinas em resposta (6). Estas citocinas atuam nos linfcitos B, estimulando a sua proliferao (7) e diferenciao em plasmcitos (8) ou em clulas de memria (9). Os plasmcitos secretam grande quantidade de anticorpos (10) que tm acesso aos lquidos corporais (11). Clulas fagocticas e/ou DCs podem tambm penetrar nos linfonodos j com antgenos virais capturados nos tecidos perifricos e os apresentar aos linfcitos Th e B.

Diferenciao

Proliferao

Ativao

252

Captulo 9

linfcito B que os deu origem. A estimulao e proliferao dos linfcitos B ocorrem nos rgos linfides secundrios, sobretudo nos linfonodos. Os anticorpos produzidos so secretados no meio extracelular e atravs dos vasos eferentes podem ter acesso corrente sangnea e, posteriormente, aos tecidos. Os processos de reconhecimento do antgeno, proliferao e diferenciao dos linfcitos B esto ilustrados esquematicamente na Figura 9.7.

3.4 Respostas primria e secundria/memria imunolgica


Os linfcitos possuem um perodo de vida relativamente curto aps a sua produo a partir dos progenitores linfides na medula ssea. No entanto, a sua sobrevivncia pode ser prolongada desde que encontrem o antgeno que os estimule a proliferar e se diferenciar, ou seja, os linfcitos que no encontram o antgeno que os estimule possuem vida curta; aqueles que encontram o antgeno complementar ao seu BCR tm a sua vida prolongada. Dessa forma, a presena de antgenos especcos no organismo literalmente resgata os linfcitos da morte, estimulando-os a proliferar e se diferenciar, gerando uma resposta imune, denominada resposta primria. O principal evento da resposta primria a expanso dos clones de linfcitos que possuem receptores para os antgenos introduzidos pela primeira vez no organismo. Porm, a maioria das clulas originadas pela expanso clonal se diferenciar em clulas de vida curta, os plasmcitos. Os plasmcitos exercem a sua funo de secreo de Igs e sobrevivem por algumas semanas ou meses. Felizmente, aps a expanso clonal, uma frao pequena dos linfcitos estimulados no se diferencia em plasmcitos, e sim em clulas de memria. Estas mantm a capacidade de reconhecimento do mesmo antgeno que as estimulou (pois possuem os BCRs com especicidade idntica aos da clula original) e sobrevivem no organismo por um longo tempo. As clulas de memria habitam a medula ssea e circulam pelo organismo. Ao encontrarem o mesmo antgeno que as estimulou previamente (vrions ou protenas virais), essas clulas respondem rapidamente, produzindo

uma resposta proliferativa e de diferenciao rpida e intensa. Essa resposta denominada resposta imune secundria. Embora mais estudados em linfcitos B, pela facilidade de quanticao dos anticorpos, os eventos envolvidos na resposta primria e secundria provavelmente ocorram de forma semelhante aos linfcitos T. A resposta primria a um determinado vrus pode resultar de infeco natural ou de vacinao e prepara o sistema imunolgico para responder e montar uma resposta secundria caso ocorra uma reexposio posterior ao agente. A memria imunolgica de linfcitos B e T diferente. A produo contnua de anticorpos especcos tem sido detectada vrias dcadas aps a infeco por alguns vrus. Como a vida mdia dos anticorpos no organismo de poucas semanas, isto indica que ocorre uma produo contnua de anticorpos para que os nveis sejam mantidos. Uma possvel explicao para esse fato de que linfcitos B de memria seriam constantemente reestimulados a se diferenciarem em plasmcitos secretores de Igs, pois os plasmcitos possuem vida curta. O contato freqente com o antgeno e as conseqentes reestimulaes podem decorrer da reexposio ao prprio microorganismo ou resultar de reatividade cruzada com antgenos semelhantes, prprios ou heterlogos. Alm disso, recentemente foi observado que as DCs possuem a capacidade de armazenar antgenos em seus dendritos por perodos prolongados e liber-los lentamente para os linfcitos de memria, provocando a sua reestimulao contnua. Isso poderia proporcionar uma estimulao prolongada no somente dos linfcitos de memria, mas tambm de linfcitos que ainda no haviam sido estimulados (naive ou virgens). Estes, ao chegarem aos rgos linfides, encontrariam com o antgeno pela primeira vez, gerando novamente uma resposta imune primria e, conseqentemente, a produo de mais linfcitos de memria. Ao contrrio da fase efetora da resposta humoral cuja produo de anticorpos pode persistir por longos perodos a fase efetora da resposta celular de curta durao. A presena prolongada de linfcitos Th e Tc efetores seria deletria para o organismo, pois a secreo persistente de

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citocinas e a atividade citoltica continuada poderiam resultar em imunopatologia. Aps a fase efetora, as clulas T de memria so encontradas com freqncia mais alta e podem responder com mais rapidez e ecincia a estmulos antignicos secundrios. A rapidez e ecincia com que as clulas T de memria se deslocam para os stios de infeco e respondem a estmulos secundrios faz com que no seja necessria a preexistncia de clulas efetoras para gerar uma resposta protetora. Uma das questes fundamentais na resposta imune est relacionada com os mecanismos que garantem a sobrevivncia e manuteno das clulas T e B de memria. A estabilidade da memria dos linfcitos Tc, por exemplo, mantida por divises celulares lentas e continuadas. As clulas B de memria podem ser mantidas por estimulaes paralelas, ou seja, por citocinas produzidas pelas clulas Th e DCs em resposta a outros antgenos. No entanto, embora a medula ssea apresente o ambiente ideal para a manuteno, replicao e sobrevivncia dessas clulas, acredita-se que a reexposio e contato com o antgeno sejam importantes para a manuteno das clulas B de memria. Com isso, as reestimulaes contribuiriam para a reposio das clulas secretoras de Igs e a conseqente manuteno dos nveis de anticorpos circulantes. O conhecimento dos eventos que ocorrem durante a resposta primria e secundria fundamental para o entendimento das bases imunolgicas da proteo induzida por vacinas. A vacinao induz uma resposta primria, com a conseqente expanso de clones de linfcitos B e T especcos para os antgenos vacinais. Com isso, so produzidos plasmcitos e linfcitos T efetores, que possuem vida curta; e, principalmente, clulas B e T de memria, que possuem vida longa e so capazes de responder ao mesmo padro antignico que induziu a sua proliferao. A infeco subseqente de um animal vacinado ir induzir uma resposta secundria, com estimulao e proliferao muito mais rpida e intensa de linfcitos T e B, pois o nmero dessas clulas especcas para o antgeno agora muito maior, resultado da expanso clonal da resposta primria. Esta infeco resulta em estimulao

dos linfcitos de memria, que proliferam e se diferenciam em clulas efetoras, a exemplo do que ocorreu na resposta primria, porm com muito maior ecincia e rapidez. O resultado a produo de linfcitos Th e Tc efetores e de plasmcitos secretores de anticorpos, que se encarregam de combater o vrus invasor.

3.5 As imunoglobulinas na defesa antiviral


A importncia dos anticorpos na imunidade antiviral tem sido muito discutida e parece variar de acordo com a biologia do vrus e tambm com o estgio da infeco (infeco primria versus reinfeco). Como os anticorpos aparecem apenas tardiamente durante a infeco primria, acredita-se que desempenhem um papel secundrio na erradicao dessa infeco. O papel principal nesses casos seria assumido pelos linfcitos Tc. Os anticorpos teriam participao mais efetiva na proteo em casos de reinfeco, quando atuariam limitando e restringindo a penetrao e disseminao do vrus no organismo. Alm dessa diferena, a importncia relativa dos anticorpos e da imunidade celular variam de acordo com a biologia e interaes de cada vrus com o hospedeiro. Os principais locais de produo de anticorpos pelos plasmcitos so os centros germinativos dos linfonodos e as regies equivalentes dos outros rgos linfides secundrios. As Igs esto presentes nos uidos do organismo (plasma sangneo, saliva, lgrima, urina, colostro/ leite, muco, secrees, lquido cfalo-raquidiano e lquido sinovial) e so capazes de se ligar especicamente no determinante antignico que induziu a sua formao. Para vrias infeces virais, a quantidade de Igs especcas presentes no soro sangneo pode ser correlacionada com proteo. Por isso, esse parmetro utilizado para o monitoramento dos provveis nveis de proteo e da necessidade de novas imunizaes. Considerando-se que a resistncia antiviral devese, em grande parte, atividade dos linfcitos Tc (que efetivamente destroem clulas infectadas), a quanticao dos anticorpos no pode ser considerada o indicador nico de proteo. No obs-

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Captulo 9

tante, a sorologia muito utilizada para se avaliar os nveis de imunidade como um todo, visto que os mtodos para detectar e quanticar a funo de linfcitos T so de difcil aplicao.

3.5.1 Mecanismos de ao das imunoglobulinas


As Igs possuem vrias atividades biolgicas que potencialmente podem estar envolvidas na resposta antiviral. Algumas dessas atividades j foram demonstradas in vivo e a sua participao na resposta antiviral parece ser inquestionvel; outras somente foram demonstradas inequivocadamente in vitro e/ou possuem um papel controverso na resposta imunolgica contra os vrus. A seguir so listadas as principais atividades antivirais dos anticorpos (essas atividades na defesa contra vrus esto ilustradas na Figura 9.8): Neutralizao: a interao dos vrions com os receptores celulares para o incio da infeco mediada por regies especcas das protenas de superfcie dos vrions (anti-receptores). Anticorpos produzidos contra essas regies possuem a capacidade de se ligar aos vrions e impedir a interao com os receptores celulares, neutralizando a sua infectividade. Esses anticorpos so denominados genericamente neutralizantes e constituem uma parcela do total de anticorpos produzidos contra os vrus. Anticorpos com atividade neutralizante so direcionados contra protenas de superfcie dos vrions. A neutralizao de partculas virais pode ocorrer por Igs da classe IgA, presente nas mucosas e em secrees; ou por IgM e IgG, presentes no plasma sangneo. Um dos desaos da vacinologia a induo de proteo slida nas mucosas, pela estimulao de IgA com capacidade de neutralizar as partculas vricas nos locais mais freqentes de penetrao viral (sistema respiratrio, digestrio e reprodutivo) e, assim, impedir a instalao da infeco. A neutralizao da infectividade o mecanismo mais direto de ao dos anticorpos contra vrus e, talvez, o mais importante; Aglutinao: as IgM e IgG possuem a capacidade de aglutinar partculas virais e, com isso, facilitar a sua remoo mediada pelo sistema complemento e por clulas fagocticas;

Opsonizao: o revestimento de partculas vricas por molculas de imunoglobulinas (IgM e IgG) facilita a ligao e remoo dessas partculas pelas clulas fagocticas, via receptores para a poro Fc das Igs. A ativao do sistema do complemento tambm gera fragmentos capazes de opsonizao viral (C3b); Ativao do complemento: a ligao das Igs aos antgenos resulta em alteraes tridimensionais na sua regio Fc, expondo stios de ligao para o componente C1 do complemento, iniciando a sua ativao em cascata. O resultado a estimulao de vrios mecanismos da imunidade inata (vasodilatao, aumento da permeabilidade capilar, quimiotaxia para fagcitos, entre outros) e a formao do MAC sobre a superfcie dos vrions, o que pode resultar na inativao da infectividade dos vrus envelopados. A ligao de anticorpos em protenas virais inseridas na membrana de clulas infectadas pode ativar o complemento e levar formao do MAC. Com isso, a clula infectada pode sofrer lise osmtica. Esse mecanismo pode tambm ocorrer com bactrias; Citotoxicidade mediada por clulas dependente de anticorpos (ADCC): durante a replicao de alguns vrus, certas protenas virais podem ser inseridas na membrana plasmtica da clula infectada. Anticorpos especcos so produzidos contra essas protenas e se ligam a elas na superfcie celular. Com isso, a clula infectada se torna alvo para algumas clulas do sistema imunolgico que possuem receptores para a poro Fc das Igs (clulas NK e neutrlos) e destroem a clula. Embora a ADCC tenha sido amplamente demonstrada in vitro, a sua importncia in vivo ainda desconhecida; Outras atividades dos anticorpos: embora as Igs desempenhem funes bencas para a manuteno da integridade e funcionalidade do organismo, pelo combate a agentes infecciosos potencialmente nocivos, eventualmente podem participar de processos que so prejudiciais ao hospedeiro. A presena de grande quantidade de antgenos no plasma sangneo pode levar formao disseminada de complexos antgenoanticorpo. Esses complexos geralmente so removidos pelas clulas fagocticas. No entanto, quando esto em excesso, depositam-se em locais

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1 2

Tc
6

Figura 9.8. Atividades dos anticorpos na resposta contra vrus. Neutralizao da infectividade (1), aglutinao (2), opsonizao e fagocitose (3), ativao do complemento (4), lise de vrus envelopados mediada por complemento (5), ADCC (6) e lise celular mediada por complemento dependente de anticorpos (7).

como as superfcies articulares e tbulos renais e, freqentemente, causam imunopatologia. O revestimento de vrions com anticorpos sem atividade neutralizante pode, ao invs de neutraliz-lo, potencializar a sua infectividade. Essas Igs so reconhecidas por clulas que possuem receptores para a poro Fc (moncitos e macrfagos), resultando na internalizao eciente de vrions recobertos com anticorpos, facilitando a infeco dessas clulas, ou seja, os anticorpos aumentam a ecincia de penetrao desses vrions. Esse mecanismo denominado Antibody Dependent Enhancement (ADE) e tem sido descrito para v-

rios vrus, dentre os quais o vrus da dengue, o coronavrus felino e o vrus da imunodecincia humana (HIV). O papel da ADE na patogenia dessas doenas, no entanto, ainda tema de debates.

3.6 O papel das respostas celular e humoral na imunidade antiviral


Os avanos no estudo da imunologia antiviral tm resultado na emergncia de importantes componentes e mecanismos anteriormente relegados a papis secundrios na resposta imune,

256

Captulo 9

como as DCs. No entanto, o papel exato de cada componente na intrincada cadeia de relaes celulares e moleculares que resultam na eliminao de uma determinada infeco vrica ainda no est satisfatoriamente esclarecido. O esclarecimento desses mecanismos depende do entendimento detalhado da biologia e da patogenia de cada infeco e das interaes peculiares de cada vrus com o sistema imunolgico. No obstante, pode-se armar que os linfcitos Tc so fundamentais na erradicao da infeco primria, pela destruio das clulas infectadas. Os anticorpos no teriam grande participao no combate infeco primria, pois aparecem tardiamente no curso da infeco. Seriam de fundamental importncia por ocasio de uma reexposio ao agente, prevenindo e/ou limitando a infeco atravs de neutralizao viral e de outros mecanismos que restringiriam a disseminao do vrus no organismo. Caberia aos linfcitos Th o papel de coordenar e moderar as duas respostas (humoral, mediada por linfcitos B; e celular, mediada por linfcitos Tc) pela secreo de citocinas.

tolerncia, integrao do material gentico viral no genoma do hospedeiro, infeco de stios imunologicamente privilegiados e interferncia com funes do sistema imunolgico.

4.1 Infeces latentes no sistema nervoso central


O estabelecimento de infeces latentes um eciente mecanismo de perpetuao no hospedeiro utilizado pelos vrus da famlia Herpesviridae. A fase de latncia, que se segue infeco aguda, caracterizada pela presena do genoma viral inativo em neurnios, sem sntese protica ou produo de prognie viral. Como conseqncia, a infeco desses neurnios no detectada pelo sistema imunolgico e essas clulas podem manter o material gentico viral indenidamente. No entanto, sob determinadas circunstncias, geralmente associadas com estresse, ocorre a reativao e a retomada da replicao viral nos neurnios infectados. Os vrions produzidos migram pelos axnios de volta aos locais de replicao primria, de onde so excretados, podendo infectar outros hospedeiros. O estabelecimento e reativao de infeces latentes, portanto, constituem-se em estratgias dos herpesvrus para escapar do sistema imunolgico e garantir a sua perpetuao no hospedeiro e na populao. Infeces latentes ocorrem com os herpesvrus bovino tipo 1 e 5 (BoHV-1 e 5), herpesvrus suno (doena de Aujeszky), herpesvrus felino tipo 1 (FHV-1), herpesvrus eqinos tipo 1 e 4 (EHV-1 e 4), entre outros.

4 Mecanismos virais de evaso da resposta imune


A ocorrncia contnua de doenas virais somente possvel devido ao sucesso desses microorganismos em produzir infeces, resistir ou escapar dos mecanismos antivirais do hospedeiro e se disseminar para outros hospedeiros susceptveis. Hospedeiros imunes impedem a progresso da infeco, o que reduz drasticamente a possibilidade de transmisso do vrus para outros animais. Dezenas ou centenas de milhares de anos de coexistncia, alm da rapidez com que os vrus se multiplicam e evoluem geneticamente, permitiram o desenvolvimento de estratgias que lhes permitem evitar ou resistir s defesas do hospedeiro, causando infeces produtivas, agudas ou crnicas, e garantindo a sua manuteno e perpetuao na natureza. Dentre os mecanismos utilizados pelos vrus para compatibilizar a sua existncia e perpetuao, apesar dos mecanismos imunolgicos do hospedeiro, destacam-se os seguintes: infeces latentes no sistema nervoso central, variaes antignicas, induo de

4.2 Variaes antignicas


Alteraes na seqncia de aminocidos de determinantes antignicos em protenas de superfcie dos vrions permite o escape da neutralizao por anticorpos e uma estratgia muito utilizada pelos vrus, principalmente os vrus RNA. Essas alteraes surgem como resultado dos erros cometidos pela enzima RNA polimerase viral durante a replicao do genoma. Como conseqncia, aminocidos diferentes so freqentemente incorporados durante a sntese das protenas virais, alterando a sua seqncia e es-

Resposta imunolgica contra vrus

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trutura, podendo resultar no no-reconhecimento pelos anticorpos produzidos contra os epitopos originais. Vrions com alteraes antignicas podem, assim, escapar da resposta imune existente naquele momento no hospedeiro, principalmente da imunidade humoral, e infectar novas clulas. A presena desses novos determinantes antignicos elicitar a sntese de anticorpos com uma nova especicidade. Porm, novas variaes podero ser posteriormente produzidas e novamente alguns variantes podem escapar da neutralizao. Essas variaes antignicas discretas, geralmente associadas com a acumulao de mutaes em ponto, so denominadas genericamente de antigenic drift e tm sido bem caracterizadas nos vrus da inuenza, embora ocorram tambm em outros vrus. Alteraes antignicas mais drsticas ocorrem quando os vrus da inuenza trocam entre si os genes que codicam as protenas do envelope (HA e NA), resultando em vrus antigenicamente muito diferentes dos parentais. Esse mecanismo denominado antigenic shift e tem sido implicado no surgimento de vrus de maior patogenicidade, responsveis por epidemias de grandes propores.

mais. Essa condio s possvel pela tolerncia do sistema imunolgico aos antgenos virais.

4.4 Integrao do material gentico viral no genoma do hospedeiro


Os vrus da famlia Retroviridae podem persistir no hospedeiro durante toda a sua vida, mesmo na presena da resposta imune. O mecanismo de persistncia resulta de dois aspectos da biologia desses vrus: a) possuem a capacidade de inserir cpias do seu genoma nos cromossomos das clulas hospedeiras e b) possuem a enzima denominada transcriptase reversa, responsvel pela transcrio reversa do genoma (RNA para DNA), mas que no corrige os seus prprios erros. Com isso, a cada ciclo so produzidas populaes de vrus compostas por indivduos com pequenas diferenas genticas entre si (quasiespecies). A insero do material gentico viral garante que a infeco seja permanente, e as alteraes antignicas que resultam de cada ciclo de replicao viral asseguram que alguns vrions produzidos possam escapar da resposta imune para infectar novas clulas. Dentre as infeces por retrovrus animais destacam-se a anemia infecciosa eqina e a imunodecincia felina.

4.3 Induo de tolerncia


Em condies normais, o sistema imunolgico possui tolerncia, ou seja, no reage contra os antgenos do prprio organismo. Ocasionalmente o sistema imunolgico pode se tornar tolerante tambm a antgenos estranhos, contra os quais deveria produzir uma resposta. Um exemplo o que ocorre quando fetos bovinos so infectados por cepas no-citopticas do vrus da diarria viral bovina (BVDV) entre os 40 e 120 dias de gestao. Nessa fase, o sistema imunolgico do feto ainda est imaturo e no reconhece os antgenos virais como estranhos. Com isso, no ocorre a estimulao e proliferao de linfcitos B e T e, como conseqncia, o feto ca incapaz de montar uma resposta contra o vrus. Os fetos imunotolerantes nascem persistentemente infectados (PI) pelo BVDV e excretam o vrus continuamente em secrees e excrees. Os animais PI se constituem no ponto-chave da epidemiologia do BVDV, pois so fontes contnuas de vrus para os outros ani-

4.5 Infeco de stios imunologicamente privilegiados


Os tecidos e rgos aos quais os componentes do sistema imunolgico no possuem acesso imediato e irrestrito so denominados genericamente stios de privilgio. Os neurnios do SNC, por exemplo, no expressam de forma constitutiva as molculas do MHC-I, o que diculta o reconhecimento da infeco celular e a ao dos linfcitos Tc. Conseqentemente, os vrus que infectam neurnios so privilegiados, pois as clulas hospedeiras no denunciam a sua presena. Por outro lado, a falta de expresso de molculas do MHC-I pode ser considerada um mecanismo de proteo, evitando a destruio de clulas to importantes. Da mesma forma, a barreira hematoenceflica restringe o acesso de algumas clulas imunolgicas ao SNC. So tambm considerados stios de privilgio as clulas da epiderme (onde

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Captulo 9

ocorrem infeces pelos vrus da papilomatose), as clulas germinativas das gnadas (onde pode ocorrer a infeco pelo vrus da sndrome reprodutiva e respiratria dos sunos, PRRSV), retina, clulas dos tbulos renais (utilizadas pelos hantavrus e arenavrus) e tecidos fetais (diversos vrus).

4.6 Interferncia com funes do sistema imunolgico


Os estudos sobre as relaes vrus-clula e sobre a biologia dos vrus permitiram elucidar vrios mecanismos utilizados pelos vrus para subverter o sistema imunolgico, por meio da interferncia com a funo das clulas e molculas imunolgicas. Essa interferncia freqentemente leva a decincias na resposta imunolgica, conseqncias denominadas genericamente de imunossupresso. Cada vrus utiliza uma estratgia especca, dependendo da sua biologia, o que torna impraticvel enumer-las aqui. No entanto, como mecanismos gerais, citam-se: a) destruio, inibio ou induo da maturao das DCs, o que altera o padro de secreo de citocinas e de expresso de receptores nas DCs, resultando em prejuzo nas suas relaes com as demais clulas do sistema imunolgico, principalmente os linfcitos T; b) destruio ou alterao das funes dos linfcitos T; c) interferncia com a apresentao de antgenos, inibindo a ao das protenas TAP-1 e TAP-2 e inibio da formao do complexo peptdeo-MHC-I no retculo endoplasmtico (RE); d) produo de protenas que inibem a funo das citocinas; e) produo de protenas que protegem a clula infectada da ao do IFN-I e do TNF- e f) infeco dos linfcitos B, induzindo alterao na secreo de imunoglobulinas.

espcies animais. Observando a trajetria desses fascinantes microorganismos e de suas complexas interaes celulares e moleculares, percebese o quanto ainda h para descobrir em relao aos mecanismos imunolgicos protetores. Tanto verdade que o surgimento do HIV renovou o interesse dos pesquisadores pela imunologia. A partir de ento, o descobrimento de novas infeces e o desao de vencer velhos conhecidos fez da imunologia uma das reas do conhecimento que mais rapidamente acumula informaes. Paralelamente aos avanos no conhecimento das interaes dos vrus com o sistema imunolgico e dos mecanismos utilizados por esses agentes para se perpetuarem no hospedeiro surgem importantes linhas de pesquisa na rea de desenvolvimento de vacinas. Um dos maiores avanos dos ltimos anos foi a elucidao do papel central das DCs na resposta s infeces virais. Essas clulas se constituem no elo de ligao entre mecanismos imunolgicos naturais e especcos. Juntamente com a descoberta da importncia das DCs, novos questionamentos direcionam as investigaes futuras que, necessariamente, devero considerar a manipulao de vetores virais para maximizar a resposta imune com vistas produo de vacinas.

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5 Consideraes nais
inquestionvel o avano no entendimento dos mecanismos imunolgicos estimulados durante as infeces vricas. Os imunologistas aprendem imunologia com os vrus, cujas interaes com o sistema imunolgico so repletas de estratgias para driblar ou conviver com os mecanismos imunolgicos e, assim, perpetuar-se nas

Resposta imunolgica contra vrus

259
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EPIDEMIOLOGIA DAS INFECES VRICAS


Eduardo Furtado Flores

10
263 263
265 269 270 273 274 274

1 Introduo 2 A cadeia do processo infeccioso


2.1 Fontes de infeco 2.2 Vias de excreo 2.3 Mecanismos de transmisso 2.4 Vias de penetrao 2.5 O novo hospedeiro 2.5.1 Patogenia e resposta imunolgica

3 Mecanismos de perpetuao dos vrus na natureza


3.1 Infeces persistentes 3.2 Infeces latentes 3.3 Infeco de vrias espcies animais 3.4 Infeco de vetores 3.5 Sobrevivncia no ambiente 3.6 Transmisso vertical 3.7 Ciclos contnuos de transmisso

275
276 276 277 279 279 280 281

4 Doenas em populaes
4.1 Denio de populao 4.2 Populao de risco 4.3 Populaes abertas e fechadas 4.4 Quanticao de doena: incidncia e prevalncia

281
281 282 282 283

5 Padres temporais de ocorrncia das doenas vricas


5.1 Doenas espordicas 5.2 Doenas endmicas 5.3 Doenas epidmicas 5.4 Fatores determinantes das epidemias 5.5 Outros padres de ocorrncia

284
284 285 285 287 287

6 Distribuio espacial das doenas vricas


6.1 Doenas de distribuio mundial 6.2 Doenas com certa limitao geogrca 6.3 Doenas restritas geogracamente 6.4 reas livres naturais 6.5 reas livres articiais

288
288 289 289 289 290

7 Doenas vricas emergentes 8 Bibliograa consultada

290 293

1 Introduo
A epidemiologia estuda as doenas em populaes, investigando os seus determinantes, a sua dinmica e distribuio. Os fatores envolvidos na manuteno e transmisso das infeces vricas nas populaes so mltiplos e participam de interaes complexas, s vezes, de difcil compreenso. A complexidade dessas interaes muito varivel entre as viroses. Existem infeces vricas que so mantidas na populao por uma cadeia sucessiva de infeces agudas entre hospedeiros de uma nica espcie animal. Essas infeces apresentam, portanto, uma epidemiologia relativamente simples. Outras viroses conseguem persistir na populao graas a infeces persistentes ou latentes. Por outro lado, alguns vrus desenvolveram a capacidade de infectar vrias espcies de hospedeiros e a sua manuteno, na natureza, possvel pela ocorrncia de ciclos alternados de infeco nessas espcies. Infeco de espcies silvestres, transmisso por artrpodes, longos perodos de incubao ou de sobrevivncia no meio ambiente, transmisso vertical, variabilidade gentica e antignica, entre outras, fazem parte do arsenal de estratgias utilizadas pelos vrus para assegurar a sua sobrevivncia como espcie. Alguns vrus fazem uso concomitante de vrias dessas estratgias, o que torna a sua epidemiologia extremamente complexa, favorecendo a sua manuteno no ambiente e dicultando o seu controle.

Os principais objetivos das investigaes epidemiolgicas so o conhecimento dessas cadeias de interaes e a identicao de pontos frgeis que sejam passveis de interveno, visando ao controle das doenas. A nfase maior da epidemiologia a populao a sua sade e bem-estar. A importncia do indivduo limitase sua condio de componente da populao, pois, como tal, pode originar informaes teis para a preservao da sade coletiva. Este captulo aborda, de forma genrica, os principais aspectos da epidemiologia das infeces vricas de animais. Os aspectos epidemiolgicos mais relevantes de cada virose sero abordados oportunamente nos captulos especifcos. A epidemiologia aplicada s doenas animais possui uma terminologia prpria (epizootiologia, epizootia, enzootia etc.). Este texto, no entanto, utilizar a terminologia clssica (epidemia, endemia etc.), consagrada ao longo de dcadas na descrio de doenas humanas, mas que tambm tem sido utilizada em epidemiologia veterinria.

2 A cadeia do processo infeccioso


A sobrevivncia de um vrus como espcie depende de sua capacidade de cumprir uma seqncia de etapas que se convencionou chamar de cadeia do processo infeccioso. Para facilitar o seu entendimento, a cadeia do processo infeccioso pode ser dividida nas seguintes etapas: fontes de infeco, vias de excreo, mecanismos de transmisso, vias de penetrao e o novo hospedeiro (Figura 10.1).

Excreo

Penetrao

Fonte de infeco Transmisso

Novo hospedeiro

Figura 10.1. A cadeia do processo infeccioso.

264

Captulo 10

Inicialmente, o agente deve penetrar e se multiplicar no hospedeiro e, mesmo na presena da resposta imunolgica, produzir prognie vivel. Essa prognie deve ser excretada do hospedeiro a tempo, pela via adequada e em quantidade suciente para permitir a sua transmisso a outros indivduos (Figura 10.2). Aps a excreo, o agente deve ser capaz de resistir no meio ambiente o tempo necessrio para encontrar outro hospedeiro susceptvel. A transmisso dos vrus entre hospedeiros pode ocorrer por diferentes meios. Alguns vrus so transmitidos por contato direto entre hospedeiros. Nesses casos, a capacidade do vrus resistir em condies ambientais irrelevante, pois o tempo e espao entre os hospedeiros so virtuais. J outros agentes no so transferidos imediatamente, e a sua transferncia entre hospedeiros ocorre com o auxlio de objetos inanimados ou de artrpodes (insetos). Nesses casos, o agente necessita obrigatoriamente resistir no meio ambiente e/ou replicar ou persistir vivel nos vetores pelo tempo necessrio, a m de assegurar a sua transmisso ao prximo hospedeiro.

Ao contrrio de outros microorganismos (bactrias e fungos) a maioria dos vrus no capaz de manter a viabilidade por longos perodos no meio externo. Isso crtico para muitos desses agentes, uma vez que a viabilidade e a perspectiva de transmisso so freqentemente perdidas pela inativao no meio ambiente. Aps encontrar um hospedeiro susceptvel, o agente deve penetrar pela via adequada (Figura 10.3) e multiplicar nos tecidos e rgos-alvo para produzir prognie e ser novamente excretado. O cumprimento dessas etapas fundamental para a perpetuao dos vrus assim como de outros agentes infecciosos na natureza. Na realidade, o processo evolutivo fez com que os agentes virais que existem atualmente tenham desenvolvido meios para cumprir essas etapas e, assim, sobreviver como espcie. No obstante, as estratgias utilizadas para realizar essa tarefa so variadas e peculiares de cada vrus ou grupo de vrus. tambm provvel que, ao longo dos tempos, tenham surgido vrus que no foram capazes de cumprir alguma dessas etapas. Tais agentes certamente no tiveram sucesso em sua histria natural e, conseqentemente, desapareceram.

Descamaes cutneas Tecidos

Secrees urogenitais, smen

Secrees oronasais

Urina, fezes

Sangue, linfa Colostro e leite

Fetos, fluidos e membranas fetais

Figura 10.2. Vias de excreo de vrus que infectam animais.

Epidemiologia das infeces vricas

265

Mucosa conjuntival Pele Mucosa urogenital Mucosa respiratria

Mucosa orofarngea Mucosa intestinal

Figura 10.3. Vias de penetrao de vrus que infectam animais.

2.1 Fontes de infeco


Dene-se como fonte de infeco qualquer animal vertebrado que esteja infectado e seja capaz de transmitir o agente para outros animais susceptveis. Excluem-se dessa denio os artrpodes, que, na maioria das infeces vricas animais, parecem desempenhar um papel predominantemente de transmisso e no de manuteno do agente. Dependendo do resultado das interaes agente-hospedeiro, que podem ou no resultar em manifestaes clnicas, as fontes de infeco (tambm chamados de hospedeiros) podem ser classicadas em doentes e portadores. Os doentes so os animais infectados que manifestam sinais clnicos de doena. Do ponto de vista estritamente epidemiolgico, essas fontes de infeco possuem uma importncia relativamente menor, pois so facilmente reconhecidas como tal, o que permite o diagnstico e a adoo das medidas de controle pertinentes. Alguns exemplos so os ces, com sinais clnicos de raiva, e os bovinos, com sinais caractersticos de febre aftosa. No obstante, em infeces vricas, nas quais o desenvolvimento de doena freqente, os animais doentes se constituem nas fontes de infeco mais comuns e epidemiologicamente importantes.

Os portadores so os animais que abrigam e excretam o agente sem estar manifestando alteraes clnicas indicativas de doena. Por isso no so facilmente reconhecveis, o que os torna muito importantes na epidemiologia de cada infeco. Os animais portadores podem ser tambm denominados de hospedeiros assintomticos. Dependendo da sua participao na disseminao viral, dois tipos de portadores podem ser reconhecidos: ativos e passivos. Os portadores ativos so aqueles que excretam o vrus; os portadores passivos apenas abrigam e replicam o agente sem excret-lo ou transmiti-lo. A grande maioria dos portadores de agentes virais enquadra-se na primeira categoria. Entretanto, ces adultos podem abrigar o vrus da cinomose (CDV) no sistema nervoso central (SNC) de forma persistente sem excret-lo. Aparentemente, bfalos infectados pelo vrus da febre aftosa (FMDV) tornam-se portadores aps a infeco aguda, mas parecem ser incapazes de transmiti-lo. Nesses casos, esses animais se constituem em portadores passivos. Dependendo do perodo em que excretam o agente, os portadores ativos podem ser classicados em permanentes ou temporrios. Os portadores ativos permanentes so aqueles que excretam o vrus continuamente. Alguns exemplos so os animais infectados por retrovrus e aqueles persis-

266

Captulo 10

tentemente infectados pelo vrus da diarria viral bovina (BVDV). Os portadores ativos temporrios excretam o agente sem manifestar sinais clnicos concomitantes por determinados perodos. Quando a excreo viral inicia-se no perodo de incubao ou na fase prodrmica e os animais ainda no apresentam sinais clnicos, eles so chamados de portadores em perodo de incubao e portadores prodrmicos, respectivamente. Exemplos incluem os bovinos infectados com vrus respiratrios, que podem iniciar a excretar o vrus de um a trs dias antes do incio dos sinais clnicos. Em outras infeces, os animais podem seguir excretando o vrus aps a resoluo da doena clnica, sendo, ento, denominados portadores em fase de convalescena. Sunos infectados pelo vrus da sndrome respiratria e reprodutiva (PRRSV) e ces infectados pelo adenovrus canino (CAV) enquadram-se nessa categoria, pois podem permanecer excretando o vrus por semanas ou at meses aps o trmino dos sinais clnicos. Nesses casos, a excreo viral pode ocorrer durante perodos em que o animal no exibe sinais clnicos, o que caracteriza a condio de portador. Portadores ativos temporrios intermitentes (ou espordicos) excretam o vrus apenas esporadicamente, por poucas horas ou dias, a intervalos variveis. So caractersticos das infeces latentes por alfaherpesvrus, cujas reativaes peridicas resultam em excreo viral transitria, geralmente desacompanhada de manifestaes clnicas. Animais portadores podem permanecer por longo tempo na populao excretando o vrus e contribuindo para a perpetuao do agente no rebanho. Vrias infeces vricas somente conseguem se manter na natureza graas existncia de portadores, nos quais o agente encontra condies de se multiplicar continuamente. O reconhecimento e isolamento e/ou eliminao desses portadores constituem-se nos pontos-chave do combate a essas infeces. Outro conceito importante em epidemiologia o de reservatrio. Denomina-se reservatrio a espcie animal que abriga e mantm agentes infecciosos em um ecossistema, podendo transmiti-los para outras espcies. Embora utilizada, na

maioria das vezes, para designar espcies silvestres, essa denominao pode tambm ser utilizada para designar animais domsticos que sirvam de fontes de infeco e, como tal, mantenham e transmitam agentes infecciosos. Geralmente, as principais espcies que servem de reservatrios de agentes virais na natureza so as espcies de origem desses agentes, tambm chamadas de hospedeiros ou reservatrios naturais. No entanto, mesmo espcies que no se constituam nos hospedeiros naturais de determinados vrus podem, ocasionalmente, servir de reservatrios. Deve ser enfatizado que algumas espcies que abrigam agentes virais na natureza e que se constituem, portanto, em reservatrios desenvolvem a enfermidade devido infeco. Nesse sentido, os agentes que conseguem infectar e se manter em espcies animais sem causar doena apresentam uma grande vantagem, pois possuem uma maior probabilidade de perpetuao e transmisso. Exemplos de espcies reservatrios so as aves aquticas e migratrias, para os vrus da inuenza A; pssaros e outras aves, para os alfavrus; roedores silvestres, para os arenavrus e hantavrus; morcegos de vrias espcies, para diversos vrus (Nipah, Hendra, vrus da raiva). Os morcegos hematfagos e carnvoros silvestres (raposas, ces silvestres, raccons) so reservatrios do vrus da raiva e podem transmitilo a vrias espcies silvestres e domsticas (Figura 10.4). Os pssaros e outras aves silvestres so reservatrios do vrus do Nilo Ocidental (WNV) e dos vrus das encefalites do leste (EEEV) e oeste (WEEV) e podem transmiti-los para eqinos, aves domsticas (faises, emas) e, ocasionalmente, para humanos (Figura 10.5). Sudeos silvestres (warthogs) so reservatrios do vrus da peste suna africana (ASFV) e podem transmiti-lo para sunos domsticos. Nesses exemplos, independentemente se as espcies mencionadas constituem-se nos hospedeiros naturais do agente e em alguns casos parecem s-lo , na prtica, desempenham o papel de reservatrios, pois abrigam e transmitem o agente para outras espcies de interesse. O termo reservatrio, portanto, teria uma denio mais funcional do que ecolgica.

Epidemiologia das infeces vricas

267

Hospedeiros terminais

Hospedeiros terminais

Figura 10.4. Ciclo natural da raiva de herbvoros.

Ciclo natural

Hospedeiros acidentais

Figura 10.5. Ciclo natural dos vrus da encefalites eqina do leste (EEEV), oeste (WEEV) e vrus do Nilo Ocidental (WNV) e infeco de hospedeiros acidentais.

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Captulo 10

Espcies domsticas que mantenham um agente e o transmitam a outras espcies tambm podem ser consideradas reservatrios. A raiva pode ser mantida na populao de ces urbanos e, ocasionalmente, ser transmitida para pessoas. Nesse caso, os ces seriam os reservatrios para a populao humana. Espcies domsticas tambm podem servir de reservatrios de agentes virais e transmiti-los a animais silvestres. Surtos com alta mortalidade de mamferos marinhos (focas, lees marinhos e cetceos) associados a um morbilivrus (provavelmente o vrus da cinomose CDV) foram relatados nos mares Mediterrneo e Cspio. O CDV, provavelmente transmitido por ces domsticos, tambm foi associado com doena e mortalidade de lees e hienas em uma reserva na Tanznia e com doena em mos-pelada (racoons) e gatos nos Estados Unidos (Figura 10.6). Na frica do Sul, a raiva mantida principalmente em ces domsticos urbanos ou rurais e, ocasionalmente, transmitida a carnvoros selvagens (chacais), nos quais pode se manter por algum tempo. O termo hospedeiro terminal (dead end host) utilizado para designar indivduos de uma espcie que so infectados esporadicamente (ou acidentalmente) por um agente, mas no possuem participao relevante no seu ciclo de transmisso

e manuteno na natureza. Por isso, obviamente, no podem se constituir em seus hospedeiros naturais. As razes pelas quais essas espcies no participam da cadeia de transmisso podem ser vrias, incluindo o desenvolvimento de enfermidade rpida e fatal (no haveria tempo para uma excreo e transmisso signicativa), a produo de nveis baixos de viremia (insucientes para assegurar a transmisso) e incapacidade de transmitir o agente (pela razo anterior ou pela natureza da transmisso). O termo terminal se refere ao nal da cadeia de transmisso e no necessariamente ao curso da enfermidade. Os bovinos, gatos e ces podem ser ocasionalmente infectados pelo vrus da doena de Aujeszky (PRV), mas no possuem papel importante na transmisso, devido ao curso rpido e fatal da doena. Situao semelhante ocorre com a raiva nessas espcies e tambm em humanos. Mesmo na hiptese de a raiva bovina no possuir curso rpido e fatal, dicilmente seria transmitida por essas espcies, devido forma de transmisso (bovinos no possuem o hbito de morder outros animais). Os humanos, eqinos e outras espcies domsticas so freqentemente infectados pelo WNV, EEEV e WEEV, mas no possuem papel importante na transmisso. Nesses casos, os nveis e durao da viremia so geralmente incompatveis com a

Hospedeiros acidentais

Ciclo natural

Hospedeiros acidentais

Figura 10.6. Ciclo natural do vrus da cinomose e transmisso acidental para espcies de vida livre.

Epidemiologia das infeces vricas

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transmisso por mosquitos. Em alguns desses casos, a infeco tambm rpida e fatal, o que diculta a transmisso do agente a partir do animal infectado. Casos de transmisso do WNV entre pessoas, por transfuso sangnea, via placenta e pela amamentao j foram relatados, mas representam excees e possuem importncia epidemiolgica restrita. Pessoas infectadas pelos hantavrus tambm no participam ativamente na transmisso do agente. Acredita-se que as espcies em que um determinado vrus cause doena severa e mortalidade considervel no se constituam em seus hospedeiros naturais, e sim acidentais. A tendncia que os vrus no causem doena severa em seus hospedeiros naturais devido a um processo evolutivo que, eventualmente, tenha resultado em um equilbrio na interao

agente-hospedeiro, ou seja, o desenvolvimento de doena severa nos hospedeiros desfavoreceria a manuteno desses agentes na natureza.

2.2 Vias de excreo


Para que ocorra a transmisso entre indivduos, o vrus deve ser inicialmente excretado do hospedeiro infectado pela via adequada em quantidade suciente. As vias pela qual o agente excretado do organismo animal so denominadas vias de excreo (vias de eliminao) ou portas de sada. A via de excreo de um vrus determinada primariamente pelo seu tropismo, ou seja, pelo tecido ou rgo-alvo onde ocorre a sua replicao. Por exemplo, os vrus que replicam na mucosa das vias respiratrias so excretados pe-

Tabela 10.1. Vias de excreo dos principais vrus de animais

Vias de excreo

Tipos de vrus/infeco
vrus respiratrios

Exemplos
vrus da influenza, parainfluenza, rinovrus, herpesvrus bovino tipo 1 (BoHV-1) CDV, vrus da febre aftosa (FMDV), vrus da raiva enterovrus, coronavrus, parvovrus canino (CPV) vrus das hepatites arenavrus, hantavrus

Secrees oronasais e expectoraes

vrus que replicam na cavidade oral e anexos vrus entricos

Fezes vrus hepticos vrus que replicam nos epitlios dos tbulos renais Urina vrus que replicam no epitlio vesical outros vrus sistmicos vrus que replicam nas gnadas Smen e/ou secrees genitais vrus que replicam no trato genital externo vrus sistmicos vrus que infectam o feto vrus sistmicos vrus sistmicos ou vrus que produzem viremia permanente ou transitria vrus que replicam em camadas superficiais da pele ou na transio pele-mucosa retrovrus, BVDV, flavivrus, vrus da lngua azul (BTV), etc. PRRSV PRRSV, BoHV-1, vrus do exantema coital eqino (EHV-3) vrus da leucose bovina (BLV), outros retrovrus BVDV, BoHV-1, parvovrus suno (PPV), PRRSV

CDV

Fetos/membranas e fluidos fetais

Sangue e linfa

Pele, descamaes e exsudaes cutneas

poxvrus, vrus do ectima contagioso, papilomavrus, FMDV, BoHV-2

270

Captulo 10

las secrees oro-nasais e expectoraes; os vrus que replicam no fgado e no trato intestinal so excretados pelas fezes. As principais vias de excreo de agentes virais esto ilustradas na Figura 10.2, e os agentes que as utilizam esto apresentados na Tabela 10.1. A grande maioria dos vrus pode ser excretada por mais de uma via, embora geralmente uma delas apresente maior importncia em determinadas situaes. A via de excreo tambm determina a forma de transmisso. Os vrus que so excretados no smen sero transmitidos pela cpula ou pela inseminao articial; os vrus que so excretados nas fezes provavelmente sero transmitidos pela via fecal-oral, pela contaminao de gua e alimentos. Os vrus presentes no sangue e/ou na linfa provavelmente sero transmitidos por vetores ou por procedimentos iatrognicos (agulhas e material cirrgico contaminado).

2.3 Mecanismos de transmisso


A transferncia ou transmisso do agente entre indivduos representa o ponto-chave na cadeia do processo infeccioso. O agente excretado deve ser capaz de resistir no meio ambiente o tempo necessrio para encontrar e penetrar

em outro hospedeiro susceptvel. No entanto, ao contrrio de outros microorganismos que conseguem sobreviver no meio ambiente por longos perodos, a viabilidade da maioria dos vrus fora do organismo do hospedeiro muito limitada. Por isso, certamente, grande parte das partculas virais produzidas pelas infeces virais inativada no meio ambiente antes de ter conseguido alcancar um novo hospedeiro. As principais formas de transmisso dos agentes virais esto apresentadas na Figura 10.7 e Tabela 10.2. Em termos gerais, a transmisso dos vrus entre indivduos pode ser horizontal ou vertical. Transmisso horizontal se refere transmisso entre indivduos de uma mesma gerao, pela coabitao de um mesmo habitat. Transmisso vertical refere-se transmisso do agente de um hospedeiro para os seus descendentes. A transmisso horizontal pode ser direta ou indireta. A transmisso horizontal direta pode ocorrer por contato direto ou indireto. A transmisso indireta pode ocorrer com a participao de veculos, por vetores ou pelo ar. A transmisso direta por contato direto ocorre pelo contato fsico entre o hospedeiro infectado e o novo hospedeiro. O contato entre mucosas, entre pele e mucosa ou entre pele e pele permite ao agente passar diretamente ao animal susceptvel

Contato direto Direta Contato indireto Veculos Horizontal Indireta Vetores Mecnicos Area Transmisso Biolgicos

Transovariana Transplacentria Vertical Perinatal Colostro/leite

Figura 10.7. Formas de transmisso dos vrus de animais.

Epidemiologia das infeces vricas

271

e pode ocorrer por mordedura (transmisso do vrus da raiva, arenavrus entre roedores), lambedura (vrus entricos), contato focinho-focinho (viroses respiratrias, FMDV, CDV), focinhogenitlia (herpesvrus bovino tipo 1 [BoHV-1],

BVDV), focinho-pele (vrus da mamilite herptica [BoHV-2]), contato pele-pele (poxvrus, papilomavrus) e pela cpula (BoHV-1, vrus do exantema coital dos eqinos [EHV-3], PRRSV). Nessas formas de transmisso, o agente trans-

Tabela 10.2. Principais mecanismos de transmisso dos vrus de animais

Famlia

Mecanismo de transmisso
Contato direto e indireto (fecal-oral, respiratria), transplacentria (vrus da panleucopenia felina, parvovrus suno). Contato direto e indireto (fecal-oral, respiratria). Contato direto e indireto (cutnea, leses de pele). Contato direto e indireto (fecal-oral, respiratria). Contato direto ou indireto (cutnea [orf, cowpox], respiratria [sheep pox]), vetores artrpodes (vrus do mixoma). Contato direto ou indireto (sexual [exantema coital eqino [EHV-3], balanopostite e vulvovaginite pelo BoHV-1], respiratria (BoHV-1), transplacentria (PRV, BoHV-1). Contato direto ou indireto (respiratria), indireto por vetores (carrapatos), oral (alimento contaminado). Contato direto ou indireto (fecal-oral [enterovrus, FMDV], respiratria [rinovirus, FMDV]), transmisso indireta por veculos (alimentos contaminados, fmites [FMDV]). Contato direto ou indireto (fecal-oral, respiratria). Contato direto ou indireto (respiratria, sexual), indireto (fmites, smen contaminado [PRRSV, EAV]). Indireta por vetores. Indireta por vetores (WNV), contato direto e indireto (fecaloral, respiratria [BVDV, vrus da peste suna clssica [CSFV]), transplacentria (BVDV). Contato direto ou indireto (fecal-oral, respiratria) Contato direto ou indireto (urina contaminada, mordeduras, respiratria) Indireta por vetores (vrus da febre do Vale Rift) Contato direto ou indireto (respiratria) Contato direto (mordedura [vrus da raiva]), direto ou indireto (vrus da estomatite vesicular [VSV]), indireta por vetores (VSV). Contato direto ou indireto (respiratria). Contato direto ou indireto (fecal-oral [rotavrus, vrus da gastrenterite transmissvel dos sunos [TGEV]), indireta por vetores (BTV). Contato direto ou indireto, vertical (in ovo [leucose aviria] ou transplacentria [BLV]), ingesto, indireta por vetores (EIAV).

Parvoviridae

Circoviridae Papillomaviridae Adenoviridae Poxviridae

Herpesviridae

Asfarviridae Picornaviridae

Caliciviridae Arteriviridae Togaviridae

Flaviviridae

Coronaviridae Arenaviridae Bunyaviridae Orthomyxoviridae

Rhabdoviridae Paramyxoviridae Reoviridae

Retroviridae

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Captulo 10

ferido imediatamente a outro hospedeiro, assim, a sua capacidade de resistncia no meio ambiente pouco relevante para o sucesso da transmisso. Na transmisso direta por contato indireto no ocorre contato fsico entre o corpo do animal infectado e o novo hospedeiro. Nesses casos, ocorre o contato imediato entre o material contaminado recm-excretado (secrees, excrees, lquido ou membranas fetais) e uma superfcie mucosa (focinho, mucosa nasal, oral e genitlia) ou pele do novo hospedeiro. A diferena entre essa forma de transmisso e a transmisso indireta por veculos, descrita a seguir, muito tnue e de difcil percepo em alguns casos. A transmisso indireta envolve a transmisso do agente por meio de objetos inanimados (denominados veculos ou fmites) ou por vetores invertebrados (insetos). Veculos ou fmites, freqentemente envolvidos na transmisso de vrus animais, incluem agulhas hipodrmicas, material cirrgico, luvas de palpao retal, espculos, formigas, focinheira, tatuadores, aplicadores de brinco, roupas e utenslios, instalaes, equipamentos (ordenhadeiras), cochos, solo e outros. A gua, leite, smen, subprodutos crneos e outros alimentos contaminados com o agente tambm podem servir de veculos para a transmisso de agentes virais. No caso de transmisso por veculos, o sucesso da transmisso depende da capacidade de o agente preservar a sua viabilidade no meio ambiente o tempo suciente para alcancar o novo hospedeiro. A transmisso de vrus por luvas de palpao, espculos contaminados ou equipamento de inseminao articial tambm pode ocorrer (vrus da leucose bovina [BLV], BVDV, PRRSV). Viroses respiratrias (BoHV-1, BVDV, vrus respiratrio sincicial bovino [BRSV], vrus da parainuenza tipo 3 [bPI3v]) ou cutneas (FMDV, poxvrus, BoHV-2) podem ser transmitidas pelo contato de mucosas com cochos contaminados; viroses entricas e hepticas podem ser transmitidas pela via oro-fecal atravs da contaminao de cochos, gua e alimentos. O smen utilizado em inseminao articial pode servir de veculo para vrios vrus (BoHV-1, PRRSV, vrus da lngua azul [BTV], BVDV, PRV). O sangue contaminado, utilizado em transfuses e/ou outros

procedimentos, pode transmitir agentes como o VLB, vrus da leucemia felina (FeLV) e vrus da anemia infecciosa eqina (EIAV), entre outros. A possibilidade de transmisso por veculos maior para os vrus que possuem grande capacidade de resistncia no meio ambiente. O FMDV um exemplo de agente que possui grande capacidade de disseminao por meio de veculos (sapatos, roupas, utenslios, alimentos etc.). A transmisso por aerossis a curtas distncias pode ocorrer para os vrus que replicam na cavidade oronasal e anexos (vrus da inuenza, vrus da bronquite infecciosa das aves [IBV], vrus da laringotraquete infecciosa [ILTV], BoHV-1, CDV, vrus da Doena de Newcastle [NDV]). O termo iatrognico se refere transmisso de agentes por procedimentos mdicos e/ou relacionados com a sade animal. Os retrovrus animais (BLV, EIAV, vrus da imunodecincia felina [FIV]), alm de outros vrus que produzem viremia (BVDV, BTV) podem ser transmitidos por agulhas, material cirrgico ou outros equipamentos contaminados (p. ex.: tatuadores, aplicadores de brinco). Vrios vrus sistmicos podem ser transmitidos por transfuso de sangue ou derivados e tambm por transplante de rgos. Vrios vrus animais so transmitidos pela picada de artrpodes (insetos), denominados genericamente vetores. Dependendo de sua participao na transmisso, os vetores artrpodes podem ser classicados em vetores biolgicos e mecnicos. Na maioria dos casos, os insetos possuem um papel mais amplo do que simplesmente transferir o agente entre hospedeiros, ou seja, so susceptveis replicao e amplicao do vrus em seus tecidos, eventos que ocorrem aps a sua contaminao e que so necessrios para que ocorra a subseqente transmisso a outro hospedeiro. Por isso so chamados de vetores biolgicos. Exemplos de vrus transmitidos primariamente por mosquitos so os vrus das encefalites eqinas (EEEV, WEEV e vrus da encefalite venezuelana [VEEV]), o WNV, o vrus da dengue e febre amarela (YFV), alm de vrios buniavrus. Os culicides transmitem o BTV, carrapatos transmitem o ASFV, entre outros. Os vrus transmitidos primariamente por insetos so chamados genericamente de arbovrus (arthropod-borne viruses).

Epidemiologia das infeces vricas

273

Alm dos arbovrus, outros agentes virais podem ocasionalmente ser transmitidos por essa via. Nesses casos, a transmisso por insetos apenas uma das formas de transmisso geralmente no a principal e, por isso, possui importncia epidemiolgica limitada (p. ex.: BLV). Alguns vrus podem ser transmitidos por insetos, de forma mecnica, pela simples contaminao de partes de seu corpo (probscide, asas) (p. ex.: vrus da mixomatose, poxvrus, BLV, BoHV-2). Por outro lado, os tabandeos e as moscas do estbulo transmitem mecanicamente o EIAV, e esta a principal forma de transmisso do vrus. Transmisso mecnica por alguns insetos tambm pode ocorrer no ciclo natural do VEEV. Nesta infeco, no entanto, os insetos desempenham preponderantemente o papel de vetores biolgicos. No caso de transmisso mecnica, os vetores no so susceptveis replicao do agente, desempenhando apenas um papel mecnico na transferncia do agente entre hospedeiros. Por isso so denominados vetores mecnicos. Pela analogia de funo, os vetores mecnicos so ocasionalmente referidos como agulhas voadoras. A transmisso area pelo transporte de gotculas e/ou partculas contaminadas a longas distncias tem sido demonstrada em algumas viroses. Gotculas em aerossis (ou partculas dessecadas) podem ser resultado de espirro e/ou tosse em viroses respiratrias (inuenza) ou de aerossolizao/dessecao de urina (hantavrus) ou fezes (enterovrus). Essa forma de transmisso somente possvel para os agentes que apresentam grande resistncia no meio ambiente. J foi demonstrado que o FMDV pode se disseminar por vrios quilmetros, dependendo das condices de umidade do ar e ventos. No entanto, sabe-se que a maioria dos vrus, principalmente os respiratrios, s se dissemina pelo ar a pequenas distncias. A infeco por hantavrus em humanos ocorre freqentemente pela inalao e/ou deposio conjuntival de partculas de poeira oriundas de solo contaminado pela urina de roedores portadores. Os poxvrus, por causa de sua grande resistncia ambiental, tambm podem ser transmitidos por via area. A transmisso vertical de um vrus pode ocorrer de vrias formas (Figura 10.7). Certos retrov-

rus avirios e murinos so capazes de integrar o seu genoma no cromossomos dos gametas (vrus da leucose aviria [ALV], retrovrus murinos). Esse tipo de transmisso denominada transovariana. Essa forma de transmisso tambm ocorre com alguns vrus nos vetores artrpodes (p. ex.: a fmea do mosquito Aedes aegypty transmite o vrus da dengue aos ovos e larvas; esse tipo de transmisso tambm ocorre com o ASFV em carrapatos). Outros vrus so transmitidos atravs da placenta (transmisso transplacentria), resultando em infeco fetal com conseqncias diversas (BVDV, BLV, PRRSV, parvovrus suno [PPV], entre outros). A transmisso que ocorre nas proximidades e/ou durante o parto denominada de perinatal (herpesvrus canino [CHV], PRV, FIV). A transmisso pelo colostro e/ou leite contaminado (vrus da artrite-encefalite caprina [CAEV], maedi-visna, VLB) tambm considerada uma forma de transmisso vertical se envolver me e lho. A maioria dos vrus pode ser transmitida por mais de uma forma, embora geralmente uma delas desempenhe um papel epidemiolgico mais importante em cada situao.

2.4 Vias de penetrao


Aps ser excretado e transportado (se for o caso), o vrus deve penetrar no novo hospedeiro pela via adequada para que possa estabelecer a infeco. Os stios por onde os vrus penetram no hospedeiro so denominados vias de penetrao (ou portas de entrada) (Figura 10.3). A via de penetrao de um agente determinada primariamente pelo mecanismo de transmisso. Assim, os vrus transmitidos por gua e alimentos contaminados provavelmente iro penetrar pela via oral; os vrus transmitidos por vetores artrpodes iro penetrar atravs de orifcios (picadas) na pele; os vrus transmitidos pelo smen iro penetrar na mucosa genital feminina. A maioria dos vrus pode utilizar mais de uma via de penetrao, dependendo da via de excreo e do mecanismo de transmisso; poucos vrus utilizam uma nica via de penetrao. As principais vias de penetrao de agentes virais nos seus hospedeiros so:

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Captulo 10

mucosa respiratria: vrus respiratrios (vrus da inuenza, rinovrus, BoHV-1, NDV); mucosa conjuntival: adenovrus, hantavrus, alguns herpesvrus; mucosa orofarngea: CDV, FMDV, vrus sistmicos; mucosa intestinal: enterovrus, coronavrus, rotavrus; pele: BoHV-2, poxvrus, papilomavrus, arbovrus (pela picada de insetos); mucosa genital: BoHV-1, PRRSV, EHV-3, alm de agentes virais veiculados pelo smen.

2.5 O novo hospedeiro


A simples penetrao do agente no organismo de um animal no assegura o desenvolvimento da infeco. Para que isso ocorra, o hospedeiro deve ser susceptvel ao agente. O termo susceptibilidade refere-se ao conjunto de condies apresentadas pelo hospedeiro para permitir a multiplicao do vrus. O termo resistncia refere-se ao conjunto de barreiras que o organismo oferece para impedir ou limitar a infeco. A susceptibilidade e resistncia so caractersticas individuais e podem variar com vrios fatores, tais como: espcie, raca, sexo, idade, exposio prvia ao agente, estado nutricional e siolgico, entre outros. O termo refratariedade, por outro lado, refere-se a um grau absoluto de resistncia, que caracterstico da espcie animal. Por exemplo, a espcie canina naturalmente refratria ao vrus da imunodecincia humana (HIV); assim como os eqinos so refratrios ao FMDV. Os fatores que determinam a susceptibilidade (e resistncia) de uma espcie animal a um determinado vrus so mltiplos e, em muitos casos, no so completamente conhecidos. Nesse sentido, deve-se fazer uma distino entre susceptibilidade natural e susceptibilidade experimental. Algumas espcies no so naturalmente infectadas por um determinado agente, mas podem ser infectadas experimentalmente. Como exemplo, citam-se: a) os coelhos, que no so infectados naturalmente pelo BoHV-1 e BoHV-5, mas podem ser infectados experimentalmente, desenvolvendo a enfermidade; b) animais de laboratrio (cobaias, coelhos, camundongos e ratos), que podem ser

infectados experimentalmente por uma variedade de vrus humanos e animais, embora a infeco natural por esses agentes nessas espcies no tenha sido descrita. Essa caracterstica tem sido explorada para estudos de patogenia e outros aspectos da biologia desses agentes. provvel que a resistncia infeco natural (ou a ausncia de casos de infeco natural) de algumas dessas espcies deva-se falta de oportunidade de infeco mais do que resistncia propriamente dita, ou seja, possvel que algumas dessas espcies poderiam ser infectadas tambm in vivo, desde que providas as condies necessrias para tal (p. ex.: contato apropriado com animais que estejam excretando o vrus e penetrao do agente pela via adequada).

2.5.1 Patogenia e resposta imunolgica


Aps a penetrao no hospedeiro susceptvel, o vrus deve replicar prximo ao local de entrada (geralmente nas clulas epiteliais e/ou no tecido linforreticular adjacente) para produzir prognie suciente para ultrapassar as defesas do hospedeiro. Dependendo das interaes entre o agente e o hospedeiro, a infeco pode ou no resultar em manifestaes clnicas. Os mecanismos pelos quais os agentes infecciosos produzem doena em seus hospedeiros so considerados sob a denominao de patogenia ou patognese (pato = doena, genesis = origem, formao). O conjunto de respostas do hospedeiro infeco vrica (resistncia natural e adquirida) denominado genericamente de resposta imunolgica. Os mecanismos gerais da patogenia e da resposta imunolgica s infeces vricas foram tratados de forma geral nos Captulos 8 e 9, respectivamente, e, especicamente, nos captulos de cada famlia. Abaixo so relacionados alguns termos relacionados com a patogenia. O perodo de incubao de uma infeco o intervalo de tempo entre a penetrao do agente e o incio dos sinais clnicos. A sua durao varia de acordo com fatores do vrus (espcie, cepa, dose, virulncia etc.) e do hospedeiro (espcie animal, condio nutricional e imunolgica, via de inoculao etc.) e pode variar entre poucos dias (febre aftosa, inuenza), meses, at anos (leucose bovi-

Epidemiologia das infeces vricas

275

na). Quando a infeco for subclnica, o perodo de incubao pode ser innito. O periodo pr-patente o intervalo de tempo entre a penetrao do agente e o incio da excreo viral pelo hospedeiro. Depende principalmente da durao do ciclo replicativo do vrus e pode ser de horas, poucos dias (vrus respiratrios, FMDV) at semanas ou meses (alguns gamaherpesvrus). O perodo patente, tambm chamado de perodo de transmissibilidade ou comunicabilidade a fase da infeco em que o agente excretado e, portanto, pode ser transmitido. Em infeces agudas clnicas, a durao da excreo do vrus coincide razoavelmente com o perodo clnico, podendo iniciar horas ou poucos dias antes e estender-se por algumas horas ou alguns dias

aps. Em infeces persistentes por retrovrus, o agente pode ser excretado por um longo perodo (at anos) antes do aparecimento de sinais clnicos. Em outras infeces (PRRSV, ILTV, vrus da arterite eqina [EVAV], CAV, alguns coronavrus), os hospedeiros podem continuar excretando o vrus por longo perodos aps o trmino das manifestaes clnicas (Figura 10.8).

3 Mecanismos de manuteno dos vrus na natureza


A sobrevivncia dos vrus na natureza depende da sua capacidade de cumprir seqencialmente as etapas da cadeia do processo infeccioso. A incapacidade da maioria dos vrus de resistir

Infeco aguda

Infeco latente

Infeco persistente

Infeco persistente temporria

Replicao viral Manifestaes clnicas

Fonte: adaptado de Flint et al. (2000).

Figura 10.8. Padres de ocorrncia das infeces e perodo de transmissibilidade em diferentes tipos de infeces virais.

276

Captulo 10

por longo tempo no meio ambiente os obriga a utilizar diferentes estratgias para prolongar e perpetuar a sua existncia. Infeces persistentes ou latentes, longos perodos de replicao e excreo, longos perodos de incubao, infeco de vrias espcies animais e/ou de insetos, e transmisso aos descendentes (transmisso vertical) esto entre as estratgias utilizadas pelos vrus para se perpetuar na natureza. No obstante, as partculas vricas de diversos vrus so relativamente estveis, podendo persistir viveis por perodos considerveis no meio ambiente. Muitos vrus utilizam uma combinao de mais de uma dessas estratgias para conseguir se perpetuar na populao. Outros vrus no utilizam nenhuma dessas estratgias e s conseguem se manter na natureza por meio de infeces agudas sucessivas.

3.1 Infeces persistentes


As infeces persistentes, acompanhadas ou no de manifestaes clnicas, constituem-se em importantes meios de manuteno de vrios agentes virais na natureza. Durante o perodo de infeco que pode durar toda a vida do animal o vrus ca disponvel no organismo do animal e pode ser excretado de forma contnua ou intermitente, podendo infectar outros animais e, assim, alimentar a cadeia do processo infeccioso (Figuras 10.8 e 10.9). Alguns vrus so excretados

ou cam disponveis no organismo para serem transmitidos continuamente a partir do nal do perodo pr-patente. Exemplos so as infeces pelos retrovrus animais, pelo BTV, papilomavrus (persistem nas leses) e calicivrus felino (FeCV). Bezerros infectados intra-uterinamente pelo BVDV podem nascer portadores e excretar o vrus por toda a vida. Outros vrus podem ser excretados por longos perodos aps a infeco aguda (PRRSV, EVAV, CAV, alguns coronavrus). Por outro lado, alguns tipos de persistncia apresentam um papel pouco relevante do ponto de vista epidemiolgico, pois o vrus no excretado. Por exemplo, a infeco persistente pelo CDV no SNC de ces adultos geralmente no acompanhada de excreo viral. Da mesma forma, alguns bovinos previamente imunizados contra o FMDV e posteriormente infectados, assim como bubalinos infectados pelo FMDV, podem car portadores do vrus aps a infeco primria, embora a sua capacidade de transmitir o agente para outros hospedeiros ainda seja questionvel.

3.2 Infeces latentes


Animais infectados pelos alfaherpesvrus (BoHV-1, BoHV-5, PRV, EHV-1), entre outros, excretam o agente por alguns dias durante a infeco aguda, mas a replicao viral eventualmente cessa devido resposta imunolgica

Excreo viral

Infeco aguda
Dias

Infeco persistente
Meses, anos

Figura 10.9. Infeces persistentes de vrus de animais: vrus da anemia infecciosa eqina (EIAV).

Epidemiologia das infeces vricas

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Reativao da infeco Situaes de estresse etc.

Excreo viral

Infeco aguda

Infeco latente

Estabelecimento da latncia

Figura 10.10. Infeces latentes de vrus animais: vrus da doena de Aujeszky (PRV).

do hospedeiro. Esses animais, no entanto, cam portadores do agente na forma latente para o resto da vida. A infeco latente se caracteriza pela presena do genoma viral inativo, principalmente em neurnios de gnglios nervosos, sem a expresso de protenas e/ou produo de partculas virais. Esporadicamente, a infeco latente pode ser reativada por situaes de estresse, resultando em replicao e excreo viral (Figura10.10). O vrus excretado durante os eventos de reativao pode, ento, ser transmitido a outros animais. Os episdios de reativao e excreo podem se repetir peridica e indenidamente durante a vida do animal, proporcionando inmeras ocasies para a transmisso do agente. Assim, as infeces latentes e suas reativaes peridicas se constituem em meios ecientes de perpetuao e disseminao desses vrus na natureza e representam o principal obstculo para o estabelecimento de medidas de combate contra essas infeces. Por isso, a capacidade de estabelecer infeces latentes possui um papel central e fundamental na epidemiologia das infeces pelos alfaherpesvrus.

3.3 Infeco de vrias espcies animais


Ao contrrio de alguns vrus que possuem um espectro de hospedeiros restrito (infectam uma nica espcie animal), vrios outros agentes virais podem infectar mais de uma espcie, o

que representa uma vantagem em sua estratgia de sobrevivncia. Alguns exemplos clssicos so a maioria dos alfavrus (Togaviridae), alguns rabdovrus (vrus da estomatite vesicular, VSV) e avivrus, que podem infectar uma variedade de espcies de aves e mamferos (Figura 10.11). O vrus da inuenza A, por meio de mutaes/adaptaes, tambm pode infectar vrias espcies de aves domsticas e silvestres, alm de mamferos (Figura 10.12); o VSV pode infectar vrias espcies de mamferos. O WNV capaz de infectar naturalmente mais de 180 espcies de vertebrados, incluindo pssaros e outras aves silvestres e domsticas (mais de 150 espcies) e mamferos. A infeco alternada dessas espcies pode favorecer a permanncia do agente no ecossistema. Alm dos vrus que usualmente infectam mais de um hospedeiro como parte de seu ciclo natural, outros podem, ocasional ou acidentalmente, infectar outras espcies. Nesses casos, o hospedeiro acidental no participa da cadeia de transmisso do agente. A transmisso de vrus entre os reservatrios silvestres e destes para a espcie hospedeira principal pode ocorrer por vrios mecanismos e, freqentemente, envolve a participao de vetores artrpodes. Em geral, considera-se que quanto maior o espectro de hospedeiros susceptveis, mais favorecida ser a sobrevivncia do agente na natureza. No entanto, isso no impede que vrus que infectem naturalmente apenas uma espcie e os exemplos so numerosos consi-

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Captulo 10

Hospedeiros acidentais

Ciclo natural

Hospedeiros acidentais

Figura 10.11. Ciclo natural dos alfavrus e WNV em animais silvestres e infeco acidental de humanos e espcies domsticas.

Fonte: adaptado de Webster et al. (2006).

Figura 10.12. Evoluo do vrus da influenza A H5N1 por meio de infeces em vrias espcies.

Epidemiologia das infeces vricas

279

gam se manter indenidamente nas respectivas populaes.

3.4 Infeco de vetores


A infeco de vetores artrpodes (mosquitos, carrapatos) uma importante forma de transmisso de alguns vrus, denominados genericamente arbovrus. Aps a ingesto de sangue do hospedeiro infectado, o vrus replica no intestino e/ou nas glndulas salivares do inseto, podendo ser transmitido aps um perodo de incubao de alguns dias (chamado de perodo extrnseco de incubao). A transmisso consumada pela picada e inoculao de saliva contaminada em outro hospedeiro. Embora os insetos hematfagos tenham preferncia por determinada espcie para se alimentar, podem ocasionalmente transmitir o agente a animais de outra espcie. De fato, a transmisso por vetores hematfagos oferece uma oportunidade mpar para a transmisso interespcie de vrios vrus. Mosquitos podem transmitir o WNV e os alfavrus das encefalites eqinas entre aves, de aves para mamferos (eqinos, mamferos silvestres) e de aves para humanos. Os vrus da WNV e VEEV j foram identicados em mais de uma dezena de espcies de mosquitos, embora se acredite que, em cada ecossistema, apenas uma ou poucas espcies desses insetos tenham papel preponderante na transmisso desses agentes. O vrus da febre amarela pode ser transmitido pela picada de mosquitos entre primatas, entre primatas e o homem e entre pessoas. O ASFV transmitido por carrapatos entre sudeos silvestres e entre estes e sunos domsticos. Em geral, acredita-se que a manuteno dos arbovrus na natureza depende da transmisso peridica a um hospedeiro vertebrado, ou seja, a infeco seria mantida pela replicao seqencial e alternada em hospedeiros vertebrados e invertebrados (os vetores). A manuteno dos arbovrus em pocas de pouca ou nenhuma atividade dos vetores, devido a temperaturas baixas, pode ser explicada em parte pela transmisso transovariana do agente e tambm pela infeco ocasional de hospedeiros vertebrados com hbitos de hibernao. Embora a capacidade de manuteno de vrus por longos perodos exclusivamente

nos hospedeiros invertebrados seja questionvel, considera-se que esta seja uma das formas possveis de sobrevivncia desses microorganismos na natureza. Para o VEEV e WNV, j foi demonstrada a sobrevivncia do vrus em larvas de mosquitos ao longo de perodos prolongados (meses) de clima frio.

3.5 Sobrevivncia no ambiente


Os vrus necessitam clulas vivas para se multiplicar e a maioria deles no capaz de resistir por muito tempo no meio ambiente. A sua resistncia no ambiente depende da estabilidade fsica da partcula viral e das condices ambientais (temperatura, umidade, radiao solar). Os vrus sem envelope geralmente so capazes de resistir por mais tempo fora do hospedeiro (parvovrus, FMDV, enterovrus, adenovrus), embora alguns vrus envelopados (poxvrus, mixomavrus) tambm possam resistir por perodos considerveis. J foi demonstrado que o parvovrus canino (CPV) pode permanecer vivel no ambiente, desde que protegido por material orgnico, por perodos de at seis meses. O parvovrus suno (PPV) tambm pode resistir durante dias ou semanas em fezes e/ou em membranas e restos fetais. O parapoxvrus, agente do ectima contagioso de ovinos, pode permanecer vivel durante meses nas crostas que se desprendem das leses labiais dos animais afetados. O circovrus suno (PCV) tambm pode permanecer vivel por dias ou at semanas no ambiente. A contaminao de gua, alimentos, solo, pastagens e mesmo de insetos pode servir de meio para transmisso desses agentes. Os vrus com envelope especialmente aqueles que causam infeces respiratrias so geralmente mais instveis e, por isso, so mais rapidamente inativados por fatores sicos e/ou qumicos ambientais. Os poxvrus esto entre os vrus envelopados com maior resistncia ambiental. Embora possam resistir no ambiente por perodos considerveis e, assim, ser transmitidos de forma indireta, esses vrus so freqentemente transmitidos por contato direto ou indireto (Figura 10.13), ou seja, a transmisso indireta aps um perodo de sobrevivncia no ambiente representa uma estratgia adicional para assegurar a sua transmisso ao novo hospedeiro e perpetuao na populao.

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Captulo 10

Ambientes, solo, instalaes etc.

Meses

Figura 10.13. Sobrevivncia ambiental dos vrus animais: parvovrus canino (CPV).

3.6 Transmisso vertical


A transmisso ao feto e/ou ao recm-nascido constitui-se em um importante mecanismo de prolongamento da existncia de vrios vrus

animais. Os retrovrus, arenavrus, alguns herpesvrus, parvovrus e alguns togavrus so freqentemente transmitidos aos fetos/neonatos. Em alguns desses vrus (retrovrus e arenavrus), os fetos ou recm-nascidos infectados tornam-se portadores e servem de fontes contnuas e permanentes de infeco. Uma forma especial de perpetuao por esse mecanismo descrita para o BVDV, um pestivrus (famlia Flaviviridae) de ruminantes (Figura 10.14). A infeco de fetos bovinos entre os 40 e 120 dias de gestao freqentemente resulta na produo e nascimento de bezerros imunotolerantes, persistentemente infectados (PI). Os bezerros PI podem ser clinicamente saudveis (embora freqentemente apresentem crescimento retardado e susceptibilidade aumentada a outras doenas) e excretam o vrus em secrees e excrees em grandes quantidades durante toda a vida. Os animais PI representam o principal meio de perpetuao do BVDV na natureza, servindo de fonte de vrus para as infeces agudas e outras infeces fetais persistentes. As infeces fetais que resultam em morte fetal e abortamento possuem um menor impacto epidemiolgico, ainda assim os restos fetais (feto, uidos, membranas) ou objetos inanimados con-

Bezerro saudvel, soropositivo, no-infectado.

aborto; mumificao; natimorto.

Infeco fetal

Anos Excreo viral Bezerro persistentemente infectado

Figura 10.14. Transmisso vertical e infeco persistente pelo vrus da diarria bovina (BVDV).

Epidemiologia das infeces vricas

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taminados podem servir de veculos para a transmisso do agente e facilitar a sua diseminao.

3.7 Ciclos contnuos de transmisso


As estratgias mencionadas acima so caractersticas de famlias ou de grupos de vrus e representam vantagens evolutivas que favorecem a perpetuao desses agentes na natureza. No entanto, alguns vrus que no utilizam essas estratgias tambm so capazes de se manter indenidamente nas populaes. Como no so capazes de persistir por longos perodos no hospedeiro (infeco latente ou persistente) ou de infectar vetores ou outras espcies animais, e no resistem por muito tempo no ambiente, a sobrevivncia desses vrus depende da infeco seqencial, imediata e contnua de novos hospedeiros de uma nica espcie (Figura 10.15). Isso requer condies epidemiolgicas especcas, que incluem a presena constante de um percentual alto de hospededeiros susceptveis e condies de convivncia que favoream o contato freqente e, assim, a sua transmisso entre indivduos.

Os vrus que causam infeces agudas so geralmente excretados por secrees oronasais (vrus respiratrios) ou pelas fezes (vrus entricos) em altos ttulos durante um curto espao de tempo. Essas caractersticas, aliadas com a disponibilidade de hospedeiros susceptveis e facilidade de contato, permitem a transmisso contnua e o prosseguimento da cadeia infecciosa. Exemplos de vrus que se mantm dessa forma so: o CDV, os vrus respiratrios (bPI3v, NDV, BRSV), corona e rotavrus bovino, vrus da inuenza (transmisso dentro da espcie). No obstante, vrios vrus que so capazes de utilizar as outras estratgias tambm podem ser mantidos por perodos longos por meio de ciclos contnuos de transmisso.

4 Doenas em populaes
4.1 Denio de populao
Em epidemiologia, dene-se populao como o grupo de indivduos no qual se est estudando aspectos relacionados sade e doena. A partir desse conceito, pode-se derivar duas de-

Figura 10.15. Ciclos contnuos de transmisso do vrus da cinomose (CDV).

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Captulo 10

nies, dependendo da delimitao geogrca e do nmero de indivduos. Populao local um grupo de indivduos que habita uma determinada rea, sujeito s mesmas condies e cujos indivduos interagem freqentemente entre si. O termo metapopulao mais abrangente e se refere a uma populao maior, geralmente composta por vrias populaes locais, em que a migrao de indivduos entre populaes locais possvel. Para algumas espcies de animais sobretudo aquelas de interesse econmico , os termos rebanho e criao so muito utilizados como sinnimo de populao, principalmente quando se refere a populaes locais. O tamanho e as caractersticas das populaes-alvo de estudos epidemiolgicos so muito variveis. Pode-se estudar os fatores que determinaram a ocorrncia de cinomose em um canil, por exemplo. Nesse caso, a populao-alvo composta apenas pelos ces presentes no canil na poca da ocorrncia da doena. uma populao limitada e sob certo controle, o que caracteriza uma populao local. Em um estudo da infeco pelo parvovrus em ces de uma cidade, a populao-alvo abrange todos os ces da cidade. Essa uma populao com um nmero grande de indivduos, de difcil enumerao e identicao, e, por isso, sobre a qual no se tem controle. Estudos de viroses em animais silvestres (febre amarela em primatas, raiva em morcegos) tratam de uma populao de tamanho desconhecido e sobre a qual no se possui nenhum controle. Evidentemente, os estudos epidemiolgicos em populaes limitadas que habitam uma rea restrita e sobre a qual se tem controle so mais facilmente exequveis e produzem resultados mais objetivos e conveis. No entanto, estudos em populaes numerosas de dimenses desconhecidas so, muitas vezes, necessrios e, dependendo da metodologia empregada, podem tambm produzir resultados conveis e de grande utilidade. Nesses casos, geralmente, estuda-se apenas uma parcela da populao, denominada amostra.

enfermidade em questo. Se todos os indivduos da populao forem susceptveis ao agente, a populao de risco equivale populao total. A populao de risco para a febre aftosa em uma populao bovina no-vacinada, por exemplo, composta por todos os bovinos da populao, pois todos os animais so igualmente susceptveis. Em outras situaes, a populao de risco apenas uma parcela da populao, que susceptvel infeco ou enfermidade. Em estudos de abortos por vrus em bovinos, a populao de risco constituda apenas pelas vacas prenhes. Estudos sobre as causas de mastite em bovinos contemplam apenas as vacas em lactao. A denio da populao de risco importante quando se quantica os eventos de doena e se expressa em ndices ou taxas. Esses clculos devem sempre considerar a populao de risco (e no a populao total) como denominador.

4.3 Populaes abertas e fechadas


Dependendo da possibilidade de contato com o meio exterior (e com outras populaes), as populaes de animais podem ser classicadas em abertas e fechadas. Populaes abertas so aquelas sobre as quais no so impostas restries movimentao (entrada e sada) de animais e de subprodutos, estando, por isso, mais susceptveis introduo e disseminao de agentes infecciosos. As populaes de ces de cidades so exemplos de populaes abertas, pois no existem restries entrada e movimentao de animais oriundos de outras cidades ou regies. Muitos rebanhos bovinos, principalmente aqueles de criao extensiva, tambm se enquadram nessa categoria pela ausncia de medidas de biossegurana para impedir a entrada de agentes infecciosos. Nesses casos, as populaes locais podem, com maior ou menor freqncia, interagir com outras populaes locais dentro de uma mesma metapopulao. As populaes fechadas so grupos de animais mantidos sob certo isolamento do meio exterior. As condies de isolamento em nvel e rigor variveis geralmente so impostas pelo homem com o intuito de evitar a introduo de agentes infecciosos e preservar a condio sanitria da po-

4.2 Populao de risco


O termo populao de risco refere-se parcela da populao que susceptvel infeco ou

Epidemiologia das infeces vricas

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N de casos novos Incidncia (%) = _______________________ x 100
Populao de risco (mdia) x tempo

pulao. possvel manter populaes fechadas com diferentes abrangncias, desde rebanhos em propriedades, municpios, regies, estados, pases e at mesmo continentes. Rebanhos sunos ou granjas de aves livres de determinados patgenos (PRV, PRRSV, NDV) e que impem restries introduo de quaisquer fatores que possam introduzir o agente so exemplos de populaes pequenas fechadas. Por outro lado, pases como os Estados Unidos impem restries introduo de animais e subprodutos de outros pases, com o objetivo de preservar seus rebanhos suno e bovino livres do vrus da peste suna clssica (CSFV) e FMDV, respectivamente. A tendncia que criaes comerciais de vrias espcies animais se tornem progressivamente fechadas, a m de preservar uma condio sanitria compatvel com sade animal e atividade econmica.

4.4 Quanticao de doena: incidncia e prevalncia


A quanticao dos eventos de doena nas populaes se constitui em um dos instrumentos mais utilizados em epidemiologia. Essa quanticao expressa sob a forma de taxas e coecientes. Dene-se taxa (ou ndice) como uma frao em que o numerador nmero de casos e o denominador a populao de risco, ou seja, a expresso de uma freqncia relativa de casos de uma determinada doena ou indicador de sade. Dois ndices muito utilizados em epidemiologia so a incidncia e a prevalncia. Embora sejam ndices relacionados e, muitas vezes, confundidos, incidncia e prevalncia so ndices que possuem composio, clculo e signicados distintos e, como tal, devem ser considerados e analisados. O ndice de incidncia mais utilizado para descrever a dinmica de infeces agudas, em que o nmero de novos casos aumenta rapidamente com o decorrer do tempo. Dene-se incidncia como a freqncia relativa de novos casos da doena (casos novos em relao a populao de risco) que surgem em relao ao tempo. A incidncia calculada da seguinte forma:

O clculo da incidncia sempre considera o parmetro tempo, que pode ser dias, semanas, meses ou anos, dependendo da dinmica da infeco. A incidncia uma freqncia relativa que d uma idia da dinmica da infeco ou doena. expressa em percentagem (exemplo: 1% de novos casos por ms) ou frao (1/100.000 por ms) x tempo. A incidncia tambm denominada de taxa de ataque ou morbidade incidente. A prevalncia tambm uma freqncia relativa (nmero de casos/populao de risco), porm determinada em certo momento (no considera a varivel tempo). utilizada principalmente para expressar a freqncia de infeces ou doenas crnicas, ou de doenas que ocorram h algum tempo na populao e cujo incio no foi monitorado. Dene-se prevalncia como uma freqncia relativa de casos de uma doena (ou de outro fator relacionado) em um determinado momento. O clculo da prevalncia no considera o parmetro tempo e tambm pode ser expresso em percentual (p. ex.: 1% de infectados) ou frao (1/10.000).
N de casos Prevalncia (%) = ______________________ x 100
Populao de risco

A prevalncia de infeces em rebanhos freqentemente determinada por exames sorolgicos que detectam anticorpos e indicam que houve uma exposio prvia ao agente. A freqncia relativa de animais reagentes chamada de soroprevalncia. Ao contrrio da incidncia, o ndice de prevalncia no fornece informaes acerca da dinmica da infeco, e sim da situao momentnea, ou seja, constitui-se em uma informao esttica, pois no acompanha a evoluo do processo infeccioso. Outras taxas comumente utilizadas em epidemiologia so morbidade, mortalidade e letalidade. Taxa de morbidade o percentual (ou frao) dos

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animais expostos a um determinado agente que desenvolvem a doena. O clculo dessa taxa pode considerar, como denominador, a populao potencialmente exposta (abrange todos os animais do rebanho ou populao) ou a populao que realmente entrou em contato com o agente (somente os animais que foram infectados). No segundo caso, a taxa de morbidade seria um reexo direto da patogenicidade do agente; no primeiro caso, seria o produto da patogenicidade e da transmissibilidade. Taxa de mortalidade a frao dos animais (potencial ou realmente expostos) que vai a bito em decorrncia da infeco. Taxa de letalidade o percentual dos animais doentes que vai a bito ( uma medida da severidade da doena).

Doena Espordica

N de novos casos

Tempo B Doena Endmica

5 Padres temporais de ocorrncia das doenas


Os eventos de doena ocorrem continuamente com o decorrer do tempo, com freqncia e distribuio temporal que podem variar de acordo com diversos fatores. Dependendo da distribuio da freqncia ao longo do tempo, trs padres principais de ocorrncia podem ser reconhecidos: doenas de ocorrncia espordica, endmica e epidmica (Figura 10.16). Os termos endemia e epidemia so utilizados para designar doenas de ocorrncia endmica e epidmica, respectivamente. Os termos enzotica e epizotica so utilizados para referir-se a doenas animais. Porm, como mencionado anteriormente, os termos epidemiolgicos clssicos (endemia, epidemia) so tambm utilizados em epidemiologia veterinria.

N de novos casos

Tempo C Doena Epidmica

N de novos casos

Epidemia em ponto

Epidemia de propagao

Tempo

5.1 Doenas espordicas


As doenas espordicas so aquelas que no esto presentes na populao a maior parte do tempo e a sua ocorrncia caracterizada pelo aparecimento de um nmero geralmente pequeno de casos a intervalos variveis, irregulares e imprevisveis (Figura 10.16A). Tratando-se de doenas infecciosas, algumas possveis explicaes para esse comportamento so: a) o agente est sempre presente no ecossistema, porm em
Figura 10.16. Padres temporais de ocorrncia de doenas.

reservatrios (outras espcies animais). Esses reservatrios apenas ocasionalmente entram em contato e transmitem o agente para a espcie em questo, desencadeando o aparecimento da doena (p. ex.: casos de infeco pelo vrus ebola em pessoas na frica, hantavirose em humanos no Brasil); b) o agente est sempre presente na populao, porm causando infeces subclnicas

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na maioria e doena em uma minoria dos indivduos, ou seja, a infeco raramente causa a doena. Assim, a infeco seria endmica e a doena seria espordica (p. ex.: a infeco pelo BLV em bovinos endmica; a ocorrncia do linfossarcoma causado pelo BLV espordica); c) o agente no est presente na populao na maior parte do tempo, sendo esporadicamente introduzido. Quando introduzido, ocasiona os eventos de doena (p. ex.: casos de febre aftosa nos estados do Rio Grande do Sul e Mato Grosso do Sul nos ltimos anos).

laes. A infeco pelo BoHV-1, por exemplo, endmica na populao bovina do Brasil. Para infeces que ocorram endemicamente em todo o mundo, no necessrio especicar a populao. Por exemplo, a parvovirose uma doena endmica na populao canina (ca implcito que se trata da populao mundial).

5.3 Doenas epidmicas


Doenas de ocorrncia epidmica ou epidemias (epizootias) so aquelas que se caracterizam pela ocorrncia de um nmero excessivo e inesperadamente alto de casos em um determinado perodo em uma populao (Figura 10.16C), ou seja, ocorre com uma freqncia inesperada em certo intervalo de tempo. Os termos epidemia (epizootia) e surto so comuns e indistintamente utilizados para designar esses eventos. Surto um termo popular e tem sido utilizado mais amide para referir-se a eventos restritos geogracamente; enquanto epidemia um termo tcnico, mais comumente (mas no exclusivamente) utilizado para designar eventos mais abrangentes geogracamente. No entanto, deve-se enfatizar que no existe uma distino clara entre esses dois conceitos e ambos so utilizados indistintamente para se referir a esses eventos. A caracterizao de uma epidemia necessariamente requer a considerao dos parmetros freqncia (nmero excessivo de casos), tempo (dia, semana, ms, ano) e espao (populao). Uma epidemia no pode ser denida pelo nmero absoluto de casos, e sim pelo nmero relativo, que deve ser comparado com o nmero de casos esperado para o respectivo perodo naquela populao. Por exemplo, um nico caso de febre aftosa nos Estados Unidos (EUA), em 2006, pode congurar estatisticamente uma epidemia, pois a freqncia esperada era zero. Por outro lado, 1.000 casos de doena causada pelo PRRSV no estado de Nebraska, EUA, em maio de 2006, pode no congurar uma epidemia, pois pode ser semelhante freqncia observada nos meses anteriores. Estatisticamente, considera-se uma epidemia sempre que o nmero de casos exceder 1,96 desvio padro acima da mdia de casos esperados para aquele intervalo de tempo.

5.2 Doenas endmicas


Doenas endmicas ou endemias (enzootias) so aquelas que ocorrem continuamente, com freqncias pouco variveis e, portanto, razoavelmente previsveis na populao ao longo do tempo (Figura 10.16B). Em outras palavras, a infeco dita nativa da populao. Infeces endmicas so geralmente mantidas pela ocorrncia simultnea e contnua de mltiplas cadeias de transmisso do agente entre hospedeiros susceptveis. Trs componentes so absolutamente necessrios para que uma infeco seja endmica em uma populao: a) a presena do agente; b) o nmero/proporo adequado(a) de hospedeiros susceptveis e c) a presena dos mecanismos de transmisso. A ausncia de um desses componentes preclude a ocorrncia endmica da doena. Uma infeco ou doena pode ser endmica em diferentes nveis (hipoendmica [incidncia baixa], mesoendmica [incidncia moderada], hiperendmica [incidncia alta] e holoendmica [incidncia altssima]), dependendo do nmero/proporo de animais que afeta. Exemplos de infeces vricas endmicas em populaes animais so abundantes: cinomose e parvovirose em ces, infeco pelo BVDV e BoHV-1 em bovinos de muitos pases, rotavirose e parvovirose suna, leucose enzotica bovina, entre outras. O termo endmico refere-se ao padro temporal de ocorrncia de uma doena em uma determinada populao. Por isso, quando se refere uma doena endmica, preciso, necessariamente, mencionar a populao em questo, pois essa doena pode no ser endmica em outras popu-

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As dimenses de uma epidemia podem variar amplamente de acordo com o nmero de animais afetados e rea ocupada pela populao. A introduo de um animal infectado pelo BVDV em um rebanho de cria, por exemplo, pode resultar em um surto localizado de abortos naquela propriedade. Mordeduras de morcegos em bovinos e eqinos produzem surtos de raiva que, freqentemente, atingem uma ou mais propriedades vizinhas. O surto de febre aftosa no Rio Grande do Sul (RS), em 2000, e no Mato Grosso do Sul (MS), em 2005, envolveu vrios municpios; na Argentina, em 2000, houve o envolvimento de vrias provncias e, na Inglaterra, atingiu praticamente todo o pas. Epidemias pequenas (envolvendo rebanhos ou populaes pequenas) provavelmente ocorram continuamente em populaes animais do mundo inteiro, sem despertar a ateno. No entanto, algumas epidemias atingem grandes propores por envolver pases e at mesmo continentes. A epidemia de SARS (2003-2004) atingiu grande parte da sia, alguns pases europeus e o Canad. Epidemias que atingem populaes de continentes ou eventualmente de todo o mundo so denominadas pandemias, das quais a parvovirose canina (a partir da dcada de 1980) e a infeco pelo HIV constituem-se em exemplos contemporneos. Dois tipos de epidemia podem ser reconhecidos de acordo com a dinmica (taxa de aumento da incidncia de acordo com o tempo) e durao, reetindo doenas com diferentes formas de transmisso e propagao. As epidemias em ponto so caracterizadas por um aumento brusco, de magnitude varivel e curta durao, no nmero de novos casos (Figura 10.16C). Geralmente so resultantes de exposio simultnea de vrios indivduos ao agente, seja diretamente na fonte de infeco (animal infectado), em gua, alimentos, aerossis ou em produtos contaminados. So caractersticas de infeces altamente transmissveis (FMDV, CSFV, inuenza) ou de infeces transmitidas macia e simultaneamente por uma fonte comum de infeco. Ocorrem freqentemente pela ingesto de gua ou alimentos contaminados aos quais os animais tm acesso simultaneamente. Caracterizam-se por uma grande concentrao de novos casos em um curto espaco

de tempo. A introduo de um animal infectado pelo FMDV em um rebanho pequeno susceptvel provavelmente resultar em uma epidemia com essas caractersticas. Essas epidemias geralmente possuem curta durao. Epidemia em torre, macia, de fonte comum ou hdrica so sinnimos utilizados para designar eventos com essas caractersticas. As epidemias de propagao so aquelas em que a incidncia aumenta gradualmente e no de forma explosiva medida que novos animais vo sendo infectados, transmitem o agente a novos hospedeiros e apresentam sinais clnicos (Figura 10.16C). So caractersticas de infeces transmitidas por contato direto ou indireto. A epidemia da AIDS em humanos, a parvovirose em ces e a PRRS em sunos so exemplos recentes de epidemias de propagao. Epidemias de propagao geralmente possuem durao prolongada. Acredita-se que, mesmo em populaes de animais silvestres e sem a interveno humana, as epidemias sejam autolimitantes e no continuem indenidamente. O m das epidemias ocorre eventual e inevitavelmente pelo esgotamento dos susceptveis, tanto pela morte como pelo desenvolvimento de imunidade pelos indivduos. Algumas enfermidades epidmicas em seu incio, principalmente aquelas causadas pela introduo de um agente novo na populao, podem se tornar endmicas com o decorrer do tempo. Exemplos so a parvovirose canina e a PRRS, que, aps um incio explosivo, se tornaram endmicas nas populaes canina e suna de vrios pases, respectivamente. A infeco pelo WNV foi introduzida nos EUA, em 1999, quando resultou em epizootias/epidemias em aves e humanos. Aps esta introduo e incio epidmico, a infeco se estabeleceu no ecossistema e se tornou endmica em vrios estados norte-americanos. Recentemente o WNV foi detectado no noroeste da Amrica do Sul e tambm na Argentina. Outras epidemias se tornam restritas temporalmente (por fatores naturais ou por medidas de controle) e no persistem de forma endmica na populao. Exemplos recentes incluem a SARS e as ocorrncias de febre aftosa no RS, em 2000; no MS, em 2005; e na Inglaterra, em 2001, cujas me-

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didas de combate resultaram na erradicao do agente e no trmino das respectivas epidemias.

5.4 Fatores determinantes das epidemias


Os surtos de doenas vricas resultam do desequilbrio das interaes agente-hospedeiro-meio ambiente e podem ser potencialmente determinados por inmeros fatores que podem atuar individualmente ou em conjunto. Os surtos de febre aftosa no RS e Gr-Bretanha, em 20002001, por exemplo, foram determinados pela introduo do agente em populaes susceptveis. A pandemia de parvovirose canina, a partir da dcada de 1980, foi determinada pelo surgimento de um novo vrus na espcie canina, a partir da mutao/evoluo do vrus da panleucopenia felina. A pandemia de AIDS provavelmente originou-se h decadas pela transmisso e adaptao de um vrus de primatas (vrus da imunodecincia smia [SIV]) para humanos. Os surtos anuais de gripe em humanos devem-se, entre outros fatores, contnua evoluo e variao antignica do vrus. A inuenza denominada gripe do frango, que acomete pessoas e aves na sia desde 1997, deve-se a um vrus de aves que sofreu mutaes sucessivas e tornou-se mais virulento para aves silvestres e domsticas e capaz de infectar pessoas. O PRRSV de sunos provavelmente se originou de um vrus de roedores (lactate dehidrogenase elevating virus, LDEV) que sofreu mutaes e adaptao em sudeos silvestres, sendo posteriormente transmitido e disseminado entre sunos domsticos. O vrus da SARS que infectou milhares de pessoas na sia, Europa e Canad, em 2003-2004, provavelmente se originou e foi transmitido a humanos a partir de espcies de animais silvestres. Alterao em fatores ambientais, sem modicaes evidentes no agente, tambm podem resultar em um aumento expressivo da freqncia de doenas. A superpopulao de morcegos hematfagos em determinadas reas, devido a alteraes ecolgicas, so acompanhadas de surtos de raiva em herbvoros. Mudanas ecolgicas relacionadas com a agricultura tm causado aumento da populao e mudana de hbitos de

roedores silvestres que servem de reservatrios para os hantavrus e arenavrus. Essas alteraes tm sido implicadas na ocorrncia de hantavirose e doena hemorrgica por arenavrus em humanos. O estresse do transporte e aglomerao ao qual bezerros so submetidos aps o desmame tem sido associado com surtos de viroses respiratrias (BoHV-1, BRSV) e encefalite herptica (BoHV-5). A temperatura e umidade no vero favorecem a proliferao de vetores e a conseqente ocorrncia de arboviroses (WNV, encefalites eqinas, dengue). A aglomerao de ces em canis e pet shops pode favorecer o contato entre os animais e a conseqente transmisso do CDV e vrus respiratrios, entre outros. A falha de cobertura vacinal na populao em um determinado ano pode resultar em surtos de doenas que normalmente so endmicas e cuja freqncia geralmente baixa. A reativao de infeces latentes, geralmente associada com fatores ambientais (estresse, m nutrio, aglomerao, mudana de alimentao) tem sido freqentemente responsabilizada por surtos de doenas associadas ao BoHV-1 e BoHV-5 em bovinos. Esses fatores ambientais podem tambm atuar em conjunto sobre o sistema imunolgico, predispondo os animais a outras enfermidades. Em resumo, virtualmente, qualquer fator do agente, do hospedeiro e do meio ambiente que determine direta ou indiretamente o aumento na freqncia esperada de uma doena pode ser considerado o fator determinante de uma epidemia. A origem e os fatores determinantes de surtos podem ser freqentemente determinados pela realizao de investigaes epidemiolgicas criteriosas e sistemticas. No entanto, em muitas situaes, as interaes que produzem esses eventos so muito complexas e no permitem a identicao da origem e dos fatores responsveis.

5.5 Outros padres de ocorrncia


Alm dos padres clssicos de ocorrncia, algumas infeces vricas agudas apresentam variaes de incidncia diferentes dos descritos acima. Vrias infeces vricas agudas apresentam aumentos de incidncia coincidentes com

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determinadas estaes do ano. Viroses respiratrias (BRSV, parainuenza canina) geralmente apresentam picos de incidncia no inverno; em contraste, algumas viroses entricas e arboviroses apresentam picos no vero. Esse tipo de comportamento denominado sazonal ou estacional, e o aumento de incidncia vericado nessas pocas deve-se geralmente ao direta ou indireta de fatores climticos sobre os hospedeiros, vetores e/ou agentes. A maior incidncia de viroses respiratrias no inverno