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MICROSCOPIA MICROSCPIO - noes gerais O olho humano tem poder de resoluo de aproximadamente 0,1 mm ou 100 m.

Isto significa que se voc olhar dois pontos separados por uma distncia menor que 100 m, esses pontos aparecero como um ponto nico. Para distinguir estruturas separadas uma das outras por menos de 100 m, h necessidade de instrumentos pticos que tenham poder de resoluo aumentada. importante salientar a diferena entre poder de resoluo e poder de aumento. Se voc ampliar vrias vezes uma mesma fotografia comum, a imagem aumenta, mas os pontos separados por menos de 100 m continuaro a aparecer como um ponto s,borrado. possvel, portanto, aumentar a ampliao, sem contudo melhorar a resoluo.Os microscpios permitiram ao homem observar estruturas com ampliao maior e maior resoluo. O limite de resoluo dos microscpios pticos, que so aqueles que utilizam a luz para iluminar o objeto que est sendo analisado, de cerca de 0,2 m (ou 200 nm ou 2 000 A ); melhor que o olho humano cerca de 500 vezes. No se consegue construir microscpios pticos com desempenho melhor que este, pois o fator limitante o comprimento de onda da luz. Com o advento do microscpio eletrnico, o poder de resoluo foi aumentado cerca de 1000 vezes em relao ao microscpio ptico. Para isso, em vez de feixes de luz, empregam-se feixes de eltrons para "iluminar" o objeto a ser analisado. As reas do material que permitem melhor transmisso de eltrons (regies transparentes aos eltrons) aparecem como reas claras; as reas que absorvem ou defletem os eltrons (regies densas aos eltrons) aparecem como reas escuras. Os microscpios eletrnicos tm limite de resoluo prximo de 2 A, cerca de 500 000 vezes maior que o do olho humano. O microscpio ptico (MO) Os primeiros microscpios de luz ou microscpios pticos (MO) surgiram no sculo XVII, principalmente com o holands Anton van Leeuwenhoek (1632-1723) e o ingls Robert Hooke (1635-1703). Leeuwenhoek construia microscpios com uma nica lente, que chegavam a aumentos de mais de 200 vezes. Esses microscpios com uma lente s so chama os microscpios simples, e a imagem fornecida no boa. Hooke construiu seu microscpio com duas lentes: uma delas era a ocular e a outra, a objetiva. Esses microscpios so chamados microscpios

compostos, e a imagem fornecida melhor que a do microscpio composto. Colorao A maioria dos tecidos incolor, o que torna difcil sua observao ao microscpio ptico. Devido a isso foram introduzidos mtodos para a colorao dos tecidos, de modo a tornar seus componentes visveis e destacados uns dos outros. A colorao feita usando-se geralmente misturas de substncias qumicas denominadas corantes. A maioria dos corantes usados em histologia comportam-se como cidos ou bases e tendem a formar ligaes salinas com radicais ionizveis presentes nos tecidos. Os componentes dos tecidos que se coram facilmente com corantes bsicos so chamados basfilos, sendo chamados de acidfilos os que se ligam a corantes cidos. O microscpio eletrnico (ME) ''... No inicio do sculo XIX estala definido o limite de resoluo do microscpio ptico. Segundo o fsico alemo Ernst Abbe (1840-1905), esse limite dependia principalmente do comprimento de onda () da luz com que se observa o objeto. O MO no pode ver pontos do objeto mais prximos do que 0,2 micrometros (1 m = 10-3 mm), ou seja, seu aumento mximo est em torno de mil vezes. (No muito mais do que Leeuwenhoek conseguia! ) O conhecimento dos fenmenos ondulatrios permite-nos saber que a imagem de um ponto luminoso obtida atravs de uma lente formada por um circulo central luminoso cercado de anis claros, com intensidades decrescentes (difrao). Quando buscamos aumentos baixos, no observamos essa figura, mas ela que determina o limite de aumento para cada cor da luz de iluminao. Quanto maior mais critica a situao. Dai concluirmos que j atingimos o aumento mximo permitido pelo MO, pois as aberraes (distores) das lentes j foram suficientemente bem corrigidas, mas o nosso olho infelizmente no v a luz com menor que o violeta. ento que entramos com um novo universo que o ME pde proporcionar. No inicio do sculo XX, o fsico francs Louis De Broglie (1892-1987) props que partculas qunticas, como o eltron, tm associadas a si ondas cujos
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comprimentos variam com o inverso da velocidade. Para eltrons acelerados, por exemplo, por um potencial de 50 quilovolts (um kV = mil volts), aproximadamente dez mil vezes menor do que o da luz verde. Portanto, o efeito da difrao para eltrons seria extremamente menor do que para a luz. Esta a razo terica da capacidade de aumento do ME. (...) Na dcada de 1930, Ernst Ruska (1906-1988), na Alemanha, construiu o que foi considerado como o primeiro ME. Hoje em dia o ME pode chegar a aumentos acima de um milho de vezes (mil vezes mais que o MO), mas nas primeiras tentativas as imagens eram muito inferiores s do MO, em qualidade e aumento. O ME consiste basicamente em: canho eletrnico com R fonte de eltrons (fio aquecido), que podem ser acelerados em potenciais em geral de 20 at 100 KV. sistema eltrico para suprir as tenses e correntes do aparelho. lentes magnticas, que so bobinas (fios enrolados) para produzir um campo magntico atuante sobre os eltrons, tendo um efeito semelhante ao de uma lente comum para a luz. sistema de bombas para produzir alto vcuo (presso de cerca de 10-6 atm) e permitir que os eltrons migrem pelo tubo do aparelho, alm de evitar a combusto do filamento pelo oxignio do ar. tela fluorescente para produzir uma imagem final visvel, quando atingida pelos eltrons. O microscpio acima descrito chamado microscpio eletrnico de transmisso (MET), pois o que se observa a projeo de uma fatia muito fina do material (como no MO, embora muito mais fina). Mais recentemente, na dcada de 1960, surgiu o chamado microscpio eletrnico de varredura (MEV), cuja aplicao est na observao da superfcie dos materiais. Nesse aparelho, a superfcie do material varrida ponto a ponto por um feixe de eltrons (...) O preparo de amostras, particularmente as biolgicas, fundamental para obteno de boas imagens. Para o MET, a amostra deve ser fixada com reagente especifico, lavada, desidratada gua substituida por acetona) e imersa numa resina epxi que endurece aps ficar 48 horas numa estufa a 60 C. A ento ela cortada em fatias finssimas (espessura de 0,05 pm), corada com sais de metais pesados, como urnio e chumbo, e s depois disso observada no MET. No caso do MEV, como desejamos uma superfcie bem preservada e que produza uma boa corrente de eltrons secundrios para obteno de uma boa imagem, o material fixado como na forma anterior, mas a desidratao feita por um mtodo (ponto critico do CO2 - dixido de
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carbono) que praticamente no deforma o material. Aps essa desidratao, a amostra coberta com fina camada de ouro, por mtodo especial (sputtering). Depois disso, ela est pronta para observao no MEV. No Brasil temos algumas dezenas de MEs, muitos dedicados pesquisa biolgica. Uma rea que tem sido bastante auxiliada pelos MEs a protozoologia, especialmente no estudo de protozorios patognicos tanto para os animais quanto para as plantas (...) A microscopia eletrnica tem se desenvolvido muito nos ltimos anos, culminando com a criao do chamado microscpio de tunelamento quntico, cujos autores, Gerd Binning e Heinrich Roher, do Zurich Research Laboratory (IBM), dividiram com Ruska o Prmio Nobel de Fsica de 1986".

MICROSCPIO PTICO OU FOTNICO Os microscpios pticos modernos so descendentes do microscpio composto usado por Robert Hooke. Podem tambm ser chamados microscpios Fotnicos (do grego photos, luz), pois utilizam luz em seu funcionamento. Esses aparelhos possuem dois sistemas de lentes de vidro ou cristal (ocular e objetiva) e fornecem ampliaes da imagem geralmente entre cem e mil vezes.

1 = ocular 2 = objetivas e revlver 3 = platina 4 = charriot 5 = macromtrico 6 = micromtrico 7 = diafragma no condensador 8 = condensador 9 = boto do condensador 10 = dois parafusos centralizadores do condensador 11 = fonte de luz 12 = controle de iluminao 13 = diafragma de campo (alavanca no lado esquerdo do microscpio) 14 = dois parafusos de ajuste da lmpada (esquerdo e direito) 15 = focalizadora da lmpada (alavanca no lado direito do microscpio - no visvel no fotografia)

No microscpio ptico, a luz proveniente do objeto observado atravessa as lentes objetiva e ocular e chega ao olho do observador, onde se forma a imagem ampliada. Se empregarmos, por exemplo, uma lente ocular que amplie dez vezes e uma lente objetiva que amplie cem vezes, o valor final da ampliao ser de mil vezes (o aumento da ocular multiplicado pelo aumento da objetiva).

Poder de resoluo e limite de resoluo A qualidade de um microscpio no depende apenas da ampliao, mas tambm do poder de resoluo, que a capacidade de distinguir pontos situados muito prximos (adjacentes) no objeto observado. Quanto maior essa capacidade, melhor a definio da imagem. O poder de resoluo de um microscpio ptico tem limite. Se dois pontos estiverem a menos de 0,25 micrometro (1 um= 1 x 10 mm) um do outro, eles sero vistos como um nico ponto .Essa distncia o limite de resoluo. O poder de resoluo funo do comprimento de onda de luz visvel utilizada (400 a 700 nm) e da abertura numrica (uma medida de capacidade de concentrar luz). O limite de resoluo obtido com o menor comprimento de onda da luz visvel e com a objetiva de maior abertura numrica. - Lentes de maior aumento aberturas numricas maiores
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Quando as objetivas de 100x ou mais (de grande abertura numrica) so utilizadas, aplica-se uma gota de leo de imerso de alta pureza entre a espcime e a objetiva. Quando o leo aplicado, os raios emergentes do espcime so coletados, aumentando assim a quantidade de luz captada pela lente, melhorando a visualizao da amostra.

MTODOS PARA OBSERVAO MICROSCPICA Preparao de lminas para microscopia Para ser observado ao microscpio ptico necessrio que o material seja translcido, uma vez que a imagem ampliada forma-se depois de o feixe de luz atravessar o objeto e as lentes. Aps passar por um ou mais processos de preparao, como veremos a seguir, o material colocado sobre uma lamina retangular de vidro, que serve de suporte, e recoberto por uma lamnula fina e geralmente quadrada. Esse conjunto observado ao microscpio. Esfregao No caso de materiais biolgicos cujas clulas so soltas, como o sangue, por exemplo, pode-se simplesmente colocar sobre a lamina uma gota do material, espalhando-o uniformemente, para que as clulas distribuam-se em uma fina camada, o que facilita a observao. Essa tcnica conhecida como esfregao e tambm pode ser usada para materiais cujas clulas sejam pouco unidas entre si. Clulas da parte interna (mucosa) da boca, por exemplo, soltam-se facilmente quando raspadas de leve com um palito, podendo ser espalhada sobre a lamina e observada ao microscpio. Esmagamento Alguns materiais tm clulas relativamente bem unidas, mas que, por esmagamento, se separam entre a lamina e a lamnula. Em alguns casos, o material pode ser ligeiramente fervido para que as clulas se separem, com maior facilidade. Por exemplo, partes vegetais macias, como pontas de razes e anteras, podem ser fervidas por alguns minutos em corante e esmagadas entre lamina e lamnula.
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Colorao Quando se observam ao microscpio preparaes de material biolgico fresco (vivo), pouco se distingue da estrutura interna das clulas. As diferentes estruturas celulares apresentam pouco contraste ptico, isto , tm mais ou menos o mesmo grau de transparncia luz, de modo que a aparncia do contedo celular homognea. Para superar esse problema os citologistas desenvolveram tcnicas de colorao, que consiste em mergulhar a clula em uma substncia denominada corante, capaz de tingir diferencialmente uma ou mais partes celulares. H umas poucas substncias corantes que no matam as clulas, e por isso so chamadas corantes vitais. Geralmente, porm, os corantes so txicos para as clulas, sendo usados depois que estas foram fixadas. H dezenas de tipos de corante, cada um com suas propriedades especficas. A hematoxilina, por exemplo, um corante azul que apresenta grande afinidade pelo ncleo da clula e pouca afinidade pelo citoplasma. Em muitos casos, uma mesma preparao pode ser submetida ao tratamento com dois ou mais corantes, o que aumenta a diferenciao entre as estruturas celulares