Artigo

Diagnstico Clnico e Laboratorial da Toxoplasmose

Tatiane Luiza da Costa1, Marcos Gontijo da Silva2, Isolina Maria Xavier Rodrigues3, Aline Almeida Barbaresco4, Mariza Martins Avelino5, Ana Maria de Castro6 1 a 3 - Mestres em Medicina Tropical na rea de Parasitologia do Instituto de Patologia Tropical e Sade Pblica IPTSP-UFG 4 - Mestranda em Medicina Tropical na rea de Parasitologia do Instituto de Patologia Tropical e Sade Pblica IPTSP-UFG 5 - Prof. Adjunto do Departamento de Pediatria e Puericultura da Faculdade de Medicina da UFG 6 - Prof. Adjunto da disciplina de Parasitologia e orientadora desse estudo, no PPGMT do IPTSP-UFG

Resumo
Os autores fazem uma reviso da literatura sobre o tema toxoplasmose, sendo enfatizado o diagnstico clnico e laboratorial. Toxoplasmose a infeco causada pelo Toxoplasma gondii , um protozorio intracelular obrigatrio. Disseminada nas regies tropical e temperada e nos vrios nveis socioeconmicos, considerada uma das parasitoses mais freqentes no homem e talvez nos animais homeotrmicos. No Brasil, sua prevalncia varia de 10% a 80%, dependendo da rea estudada. O diagnstico da toxoplasmose baseado na deteco de anticorpos de diferentes classes de imunoglobulinas (IgG, IgM, IgA e IgE) anti- T. gondii . Apesar de a sorologia ser eficaz em 89,5% das grvidas, h inespecificidade quando se refere confirmao da infeco no feto e/ou recm-nascido pela influncia da imaturidade imunolgica. O advento das tcnicas automatizadas de diagnstico sorolgico trouxe a realidade de anticorpos residuais, levando a resultados duvidosos e/ou inconclusivos, tornando necessrio o uso de mtodos parasitolgicos, entre os quais se destacam as tcnicas de biologia molecular. Entretanto, muito cedo para determinar uma tcnica padro-ouro diferente da sorologia, pois essa atualmente a principal abordagem para estabelecer o diagnstico precoce de toxoplasmose. Palavras-chave: Diagnstico da toxoplasmose, T. gondii, toxoplasmose congnita

Summary
Clinical and laboratory diagnosis of toxoplasmosis The authors present a literature review about toxoplasmosis, emphasizing the clinical and laboratory diagnosis. Toxoplasmosis is an infection caused by Toxoplasma gondii, an obligatory intracellular protozoan. Disseminated throughout the tropical and temperate regions and the various social and economical levels, it is considered one of the most frequent parasitosis in humans and maybe in homoeothermic animals. In Brazil, its prevalence ranges from 10% to 80%, depending on the area studied. Toxoplasmosis diagnosis is based on the detection of different classes of anti-T. gondii immuneglobulins antibodies (IgG, IgM, IgA, and IgE). Although the serology shows efficiency in 89.5% of pregnant women, it presents unspecificity regarding the confirmation of the infection in fetuses or newborns due to their immunological immaturity. The use of automated methods for serological diagnosis brought about the reality of residual antibodies, which can lead to doubtful and/or inconclusive results, making necessary the use of parasitological methods, among which are the molecular biology techniques. Nevertheless, it is too soon to determine a golden standard technique different from serology, because this is currently the main approach to establish precocious diagnosis of toxoplasmosis. Keywords: Toxoplasmosis diagnosis, T. gondii, congenital toxoplasmosis

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Introduo

a existncia do T. gondii em leso do sistema nervoso central de uma criana falecida com um ms de vida. Tambm realizaram a primeira transmisso experimental de toxoplasmose humana para animais, tendo ainda demonstrado um agente infeccioso produzindo doena intra-uterina. A descoberta do T. gondii, como causa de doena adquirida no adulto, creditada a Pinkerton & Weinman (4), que descreveram um caso de doena fatal generalizada em um jovem. Hutchinson (5) foi o primeiro a reconhecer o papel do gato no ciclo evolutivo do parasito, mostrando que esses animais poderiam elimin-lo pelas fezes. A verdadeira natureza do parasito permaneceu um mistrio at que Frenkel et al. (6) estabeleceram que o parasito um protozorio Coccdeo, que tem por hospedeiro definitivo o gato e existe em dois ciclos distintos: enteroepitelial em gatos e extraintestinal em tecidos de outros hospedeiros inclusive os felideos. Hutchinson et al. (7) descreveram o oocisto como forma infectante do parasito. T. gondii um protozorio do filo Apicomplexa, pertencente famlia Sarcocystidae, da classe Sporozoa , subclasse Coccidia , subordem Eimereina. Apresentase na natureza sob trs formas: - Oocisto, responsvel pela

mose, foi reconhecido provavelmente pela primeira vez no Brasil, em So Paulo, por Alfonso Splendore em julho de 1908 (1). Este pesquisador de origem italiana e radicado no Brasil, ao trabalhar com coelhos em seu laboratrio, observou uma doena cujo quadro anatomopatolgico era semelhante leishmaniose visceral humana. Apresentou uma descrio completa das leses patolgicas e dos corpsculos parasitrios presentes na forma livre e intracelular, isolados e agrupados, em diversos tecidos de animais infectados. Em 26 de outubro de 1908, Nicolle e Manceaux do Instituto Pasteur de Tunis descreveram um microrganismo semelhante quele observado por Splendore, em clulas monocelulares do bao e do fgado de um roedor norte-africano, o Ctenodactylus gondii (2). Nos Estados Unidos da Amrica, Wolf & Cowen (3) foram os primeiros autores a descrever a infeco congnita no homem relatando a ocorrncia de toxoplasmose fatal em recm-nascido com encefalite, meningite e mielite, embora com alguns erros de classificao posteriormente corrigidos. Comunicaram

Toxoplasma gondii, agente responsvel pela toxoplas-

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produo de esporozotos - Taquizota ou a forma proliferativa - Bradizota, denominado a forma cstica Essas trs formas apresentam organelas citoplasmticas caractersticas do Filo Apicomplexa (visveis apenas a nvel de microscopia eletrnica de transmisso) que constituem o complexo apical: conide, anel polar (em nmero de dois), microtbulos subpeliculares, roptrias, micronemas e grnulos densos. Os oocistos so produzidos nas clulas intestinais de feldeos no imunes e so eliminados imaturos junto com as fezes. Em condies adequadas de umidade e temperatura o oocisto sofre esporulao formando dois esporocistos, cada um contendo quatro esporozotos. Aps uma infeco aguda no gato, os oocistos so liberados em grandes quantidades pelas fezes, chegando a bilhes por dia. Essa eliminao macia de oocistos mxima entre cinco e dez dias aps a infeco inicial e dura apenas algumas semanas. O oocisto, aps sua maturao, vivel por muitos meses e at anos no solo, desde que em condies razoveis de umidade relativa (1) O taquizoto a forma encontrada durante a fase aguda da infeco, sendo tambm denominada forma proliferativa, forma

livre ou trofozoto. Foi a primeira forma descrita e o seu aspecto morfolgico, em forma de arco (toxon = arco), deu o nome ao gnero. Essa forma requer um habitat intracelular para se multiplicar e sobreviver, sendo rapidamente destruda no suco gstrico (8). Sua reproduo dentro das clulas do hospedeiro ocorre por endodiogenia, um processo de brotamento interno em que duas clulas-filhas so formadas dentro da clula-me, sendo ento liberadas aps ruptura. A forma de taquizoto encontrada no estgio agudo da infeco, invadindo todos os tipos de clulas. Aps a invaso das clulas do hospedeiro, os microrganismos se multiplicam rapidamente nos seus vacolos, formando rosetas. O citoplasma torna-se repleto de taquizotos a ponto de se romper e provocar a liberao destes, que invadem clulas contguas ou so fagocitados (9). A forma de resistncia do T. gondii nos tecidos o cisto contendo bradizotos, que podem estar presentes em todos os tecidos, porm, os principais stios de infeco latente ocorrem no miocrdio, crebro e tecido msculo-esqueltico (10). A parede do cisto pode ser rompida por causa da pepsina ou da tripsina, sendo que os bradizotos liberados permanecem

viveis por at duas horas em meio contendo cido clordrico e pepsina, ou at seis horas, em meio contendo tripsina, permitindo sobreviverem ao perodo de digesto normal do estmago e no duodeno. O congelamento abaixo de 20C negativos e o aquecimento acima de 66C destri a forma cstica do parasito, entretanto em temperatura de 4C, este pode sobreviver por at dois meses (8). Um aspecto importante do cisto uma possvel reativao da infeco, causada pela liberao de bradizotos, que se transformam em taquizotos e promovem uma nova infeco aguda local (11). O ciclo biolgico do T. gondii do tipo heteroxeno, pois ocorre em duas fases distintas. Uma fase se passa no hospedeiro definitivo, conforme definido por Frenkel et al. (6) e no apenas o gato, mas sim os feldeos em geral. A outra fase acontece no hospedeiro intermedirio que pode ser o homem, outros mamferos e as aves. O ciclo no hospedeiro definitivo (gatos e feldeos jovens) ocorre somente nas clulas epiteliais, principalmente do intestino delgado. Durante o desenvolvimento desse ciclo ocorre uma fase assexuada (merogonia) e outra sexuada (gamogonia) do parasito. Deste modo, um gato jovem e no imune, infectando-

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se oralmente por oocistos, cistos ou taquizotos, desenvolver o ciclo sexuado (1). Os esporozotos, bradizotos ou taquizotos, ao penetrarem no epitlio intestinal do gato, sofrero um processo de multiplicao por endodiogenia e merogonia, dando origem a vrios merozotos. O conjunto desses merozotos formados dentro do vacolo parasitforo da clula denominado meronte ou esquizonte maduro. O rompimento da clula parasitada libera os merozotos que penetraro em novas clulas epiteliais e se transformaro nas formas sexuadas masculinas ou femininas: os gametcitos ou gamontes, que, aps um processo de maturao, formaro os gametas masculinos (microgametas) e os gametas femininos (macrogametas). O macrogameta (imvel) permanecer dentro de uma clula epitelial, enquanto os microgametas (mveis e flagelados) sairo de sua clula e iro fecundar o macrogameta, formando o ovo ou zigoto. Este evoluir dentro do epitlio formando uma parede externa dupla, dando origem ao oocisto. A clula epitelial sofrer rompimento em alguns dias, liberando o oocisto ainda imaturo. Esta forma alcanar o meio externo juntamente com as fezes onde sofrer um processo de matu-

rao denominado esporogonia aps um perodo de cerca de quatro dias, e apresentar dois esporocistos contendo qua tro esporozotos cada. O gato jovem e infectado capaz de eliminar oocistos durante um ms, aproximadamente. O oocisto, em condies de umidade, temperatura e local sombreado favorvel, capaz de se manter infectante por cerca de 12 a 18 meses (12). O tempo decorrido entre a infeco e o aparecimento de novos oocistos nas fezes dos feldeos (perodo pr-patente) depender da forma do parasito ingerido. Este perodo ser de trs dias, quando a infeco ocorrer por cistos, 19 ou mais, por taquizotos e 20 ou mais dias, por oocistos (9). O hospedeiro intermedirio (homem, por exemplo) se infecta por via oral, atravs de transfuso sangnea, transplante de rgos, transmisso acidental por auto-inoculao em laboratrio e por transmisso transplacentria. A infeco por via oral pode ocorrer atravs de: ingesto de oocistos presentes em jardins, caixas de areia, latas de lixo ou alimentos contaminados; ingesto de cistos contendo bradizotos, encontrados em carne crua ou mal cozidos; ingesto de taquizotos em leite contaminado. As formas

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de taquizotos que chegam ao estmago sero destrudas, mas as que penetram na mucosa oral podero evoluir do mesmo modo que os cistos e oocistos. Cada taquizoto, esporozoto ou bradizoto sofrer intensa multiplicao, aps rpida passagem pelo epitlio intestinal e penetrar em vrios tipos de clula do organismo, formando um vacolo citoplasmtico (vacolo parasitforo). Neste sofrero divises sucessivas por endodiogenia, formando novos taquizotos (fase proliferativa), que iro romper a clula parasitada, liberando novos taquizotos, que invadiro novas clulas. Essa disseminao do parasito no organismo ocorre atravs de taquizotos livres na linfa ou no sangue circulante, que podero provocar um quadro polissintomtico, cuja gravidade depender da quantidade de formas infectantes adquiridas, cepas do parasito e da suscetibilidade do hospedeiro. Essa fase inicial da infeco fase proliferativa caracteriza a fase aguda da doena. Neste ponto, a evoluo poder ir at a morte do hospedeiro, o que poder ocorrer em fetos ou em indivduos com comprometimento imunolgico, ou diminuir e cessar pelo aparecimento de resposta imune especfica. Com o aparecimento da imunidade, os

parasitos extracelulares desaparecem do sangue, da linfa e dos rgos viscerais, ocorrendo uma diminuio intracelular (9). Alguns taquizotos, no entanto, invadem as clulas, desenvolvem, aps proliferaes iniciais, uma cpsula cstica na parede do vacolo parasitforo, diminuindo seu metabolismo e transformando-se em uma forma de metabolismo mais baixo, os bradizotos, que pela constante resposta imunolgica permanecem no interior do cisto sem despertar sintomatologia significante do hospedeiro por meses, anos e provavelmente dcadas (13). A resposta imunolgica limita a progresso da infeco e o desenvolvimento de novas leses, porm no erradica os cistos j existentes encontrados em mltiplos rgos, sendo formas de resistncia do parasito. Estes cistos ocasionalmente se rompem liberando os bradizotos, que podem evoluir para taquizotos e reinfectar clulas vizinhas, despertando reao inflamatria, com rpido controle pelo sistema imune. Caso o hospedeiro esteja com a resposta imune comprometida, o bloqueio imune dessa proliferao pode no ser eficiente, desenvolvendo-se um processo localizado de toxoplasmose (12). Outra possibilidade a trans-

misso congnita, que ocorre no perodo gestacional principalmente durante a infeco aguda. Fora desse perodo, tem sido descrita em gestaes sucessivas e em gestantes com sndrome de imunodeficincia adquirida (SIDA), que j tiveram toxoplasmose em alguma fase de sua vida e que esto com uma depresso imune grave (14, 15). As vias de infeco para o feto so: Transplacentria quando a gestante adquire a toxoplasmose durante a gestao e, apresenta a fase aguda da doena, poder transmitir T. gondii ao feto, sendo provavelmente os taquizotos como formas responsveis. Rompimento de cistos no endomtrio apesar de a gestante apresentar a doena na fase crnica, alguns cistos localizados no endomtrio poderiam se romper (distenso mecnica ou ao ltica das vilosidades corinicas da placenta), liberando os bradizotos que penetrariam no feto. Taquizotos livres no lquido amnitico os taquizotos presentes no lquido amnitico atingiriam o feto (2). Diagnstico Clnico da Toxoplasmose Os sintomas da toxoplasmose aguda em gestantes podem ser transitrios e inespecficos.

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Quando esto presentes, no mximo em 10% dos casos, geralmente limitam-se linfadenopatia e fadiga. A linfadenopatia pode persistir durante meses e comprometer apenas um nico linfonodo. Menos freqentemente, tem sido descrita uma sndrome do tipo mononucleose caracterizada por febre, malestar, faringite, cefalia, mialgia e linfocitose atpica (16). A forma mais comum da protozoose quando adquirida na vida extra-uterina por organismo imunocompetente, a ganglionar, que corresponde a processo febril com adenopatias e comum hepatoesplenomegalia. Contudo, trata-se de infeco pleomorfa, podendo causar, em indivduos imunodeprimidos, encefalite, mielite, miocardite, pneumonia intersticial e outros comprometimentos (9). A possibilidade de transmisso fetal remota quando a toxoplasmose adquirida antes da concepo. Mas durante a gestao o risco de transmisso para o feto no primeiro trimestre de 6%, no segundo, de 29% a 40%, no terceiro, de 59% a 72%. Cerca de 50% dos recmnascidos de mes que soroconverteram durante a gravidez so infectados e s 10% apresentam manifestaes clnicas precoces (17). No primeiro trimestre, a toxoplasmose tem sido respon-

sabilizada por bito intra-uterino (18). Entretanto, esta ocorrncia em pacientes com infeco crnica rara e no significativa (19). A infeco que se manifesta no perodo neonatal caracterizada pela trade clssica de Sabin, composta por alteraes do volume craniano (hidrocefalia ou microcefalia), coriorretinite (geralmente bilateral, macular ou perimacular, simtrica), calcificaes intracranianas e retardamento mental. conveniente ainda referir que, em alguns recm-nascidos gravemente acometidos, desenvolvem-se manifestaes hemorrgicas de vrios tipos, alm de outras manifestaes menos citadas, como nistagmo, estrabismo, microftalmia, pneumonia intersticial, miocardite, envolvimento de supra-renais, hipertrofia de linfonodos, alteraes endcrinas e gastrointestinais, com repercusses traduzidas por mixedema, diabetes inspidus e puberdade precoce (20). A grande maioria dos recmnascidos com toxoplasmose congnita tem doena subclnica ao nascer. Contudo, estes recm-nascidos podem apresentar anormalidades da retina e do sistema nervoso central quando so submetidos a exames especializados, ou podem apresent-las no decorrer do

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seu desenvolvimento (21, 22). A concreta possibilidade de crianas congenitamente infectadas no exibirem distrbios detectveis clinicamente ou atravs de exames subsidirios em fase inicial da vida, constitui condio que merece conveniente ateno. A toxoplasmose congnita pode permanecer latente por vrios anos e, no excepcionalmente, durante a puberdade (talvez por influncia hormonal) ou mais adiante, reativar. Os distrbios oculares e neurolgicos so exemplos comuns observados neste tipo de reativao clnica (9). O diagnstico clnico da toxoplasmose congnita , por vezes, impreciso, pois as manifestaes clnicas podem ser confundidas com as causadas por outros agentes como o Citomegalovrus, Herpes simples, Rubola, H IV, Epstein Barr, Treponema pallidum , Listeria monocytogenes, Borrelia burgdorferi e Trypanosoma cruzi . Outras doenas tambm podem apresentar sinais clnicos semelhantes toxoplasmose como a eritroblastose fetal e determinadas doenas degenerativas (23). O exame clnico apenas sugere a eventualidade dessa etiologia, mesmo na toxoplasmose sintomtica, ficando a sua confirmao a cargo de exames laboratoriais que identifiquem o

parasito ou a presena de anticorpos especficos (1). Com relao toxoplasmose ocular podem-se identificar duas formas distintas: a congnita e a adquirida. Em ambas, o acometimento pode ser precoce ou tardio, podendo em alguns casos, manifestar-se clinicamente pela primeira vez, anos depois da infeco sistmica (24). A identificao de retinocoroidite pela fundocospia ocular muito freqente, mesmo nos casos sem outros sintomas, e permite realizar o diagnstico presuntivo de infeco congnita. Contudo, a doena comumente confirmada atravs de testes sorolgicos, devido dificuldade de se fazer o diagnstico clnico ou parasitolgico. As dificuldades aparecem porque a retinocoroidite pode ser causada por mais de quinze doenas infecciosas oculares, como sfilis e herpes, mas a toxoplasmose se constitui em principal suspeita (9). Em imunodeprimidos, as manifestaes clnicas citadas so encontradas com freqncia. Talvez pela reativao das formas latentes dos cistos contendo bradizotos nos diferentes rgos, revelando ser o T. gondii um agente de carter oportunista. H de salientar-se que com a extenso da SIDA (Sndrome de Imunodeficincia Adquirida) ficou claro que a toxoplasmose

em pacientes infectados pelo HIV tem como rgo de agresso primria, o sistema nervoso central (25). Diagnstico Laboratorial As respostas imunes de um h o s p e d e i r o t oxo p l a s m o s e podem ser natural ou adquirida. Quando um hospedeiro se infecta com o parasito, aps a multiplicao na porta de entrada, segue-se a sua disseminao por todo o organismo atravs das vias sangnea e linftica. Durante este perodo, inicia-se a formao de anticorpos especficos e o desenvolvimento de mecanismos imunecelulares que so responsveis pela destruio dos taquizotos extracelulares. Durante a fase crnica da toxoplasmose, somente os bradizotos ou taquizotos intracelulares persistem e so responsveis pela manuteno de ttulos sorolgicos que podem durar toda a vida do hospedeiro (12). Ainda na vigncia da parasitemia, observada nas primeiras semanas da primo-infeco, surgem anticorpos especficos representados por isotipos IgM, IgA, IgE e IgG e os taquizotos extracelulares so lisados por anticorpos especficos quando esses esto combinados com o complemento. No incio da infeco do hospedeiro as imunoglobulinas da classe IgM, IgA e

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IgE aparecem primeiro, podendo ser detectadas pelas reaes sorolgicas dentro de oito a 12 dias aps a infeco aguda pelo T. gondii. A pesquisa de IgM e IgA em recm-nascidos utilizada para o diagnstico de toxoplasmose congnita, pois no atravessam a placenta e quando presentes no soro indicam a produo pelo prprio feto, em resposta a uma infeco intrauterina (26). Na evoluo da infeco configura-se um perfil sorolgico de transio, com nveis elevados de anticorpos IgG, de afinidade crescente pelo antgeno. Esto ausentes os anticorpos IgA, IgE, podendo os anticorpos IgM ocasionalmente estar presentes em baixos ttulos. Progressivamente, este quadro sorolgico d lugar ao perfil de infeco latente ou crnica, que em geral se mantm por toda a vida, com nveis de IgG em baixos ttulos com alta avidez e ausncia dos anticorpos de outros isotipos, ainda que ocasionalmente se encontrem resduos de IgM. A transio do perfil sorolgico de infeco recente para o perfil de infeco latente mais ou menos lenta, em semanas ou meses, dependendo do estado imunitrio dos pacientes (27). A passagem da IgG especfica pela placenta dificulta o diagnstico da infeco congnita, pois

sua presena no sangue do lactente pode refletir a imunoglobulina materna que foi passada via transplacentria durante a gestao como proteo, ou se referir produzida pelos mecanismos de defesa imune da criana. No entanto, a comparao dos ttulos dos anticorpos do binmio me-filho pode diferenciar essa situao quando o recm-nascido apresentar nveis de IgG maiores do que os da me em no mnimo quatro diluies (27). A dificuldade na interpretao dos valores de IgG continua durante o acompanhamento da criana porque o anticorpo de origem materna pode persistir no sangue do lactente por at um ano. Mas a sua persistncia em ttulos significativos com o passar dos meses indica produo pela criana porque os nveis oriundos da me so decrescentes com o tempo. Aps um ano, sua presena no sangue da criana significa que o sistema imune dela foi estimulado pelo T. gondii e, portanto, houve infeco (28). Embora a sobrevivncia a uma fase aguda resulte em resistncia reinfeco, a imunidade associada com a infeco crnica somente relatada na natureza. Um nmero de diferentes investigadores tem relatado que a imunidade prvia para o T. gondii em camundongo,

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causada pela infeco no protege o suficiente para prevenir uma reinfeco. Alm disso, camundongos imunizados contra uma cepa de T. gondii e subsequentemente inoculados com outra cepa tm ambas as espcies encistadas em seus tecidos. Isso provavelmente ocorre em humanos (29). Classicamente, o diagnstico laboratorial da toxoplasmose tem se baseado na pesquisa de anticorpos contra o parasito atravs de testes sorolgicos. Segundo as caractersticas desses anticorpos, diferentes marcadores sorolgicos tm sido descritos para distinguir entre infeco latente, comum na populao, e infeco recente ou toxoplasmose-doena (30). Outras respostas se esperam, tambm, da sorologia da toxoplasmose, como datar na gestante seu contgio pelo toxoplasma ou, no paciente imunocomprometido, a reagudizao de uma toxoplasmose latente. Por tais interrogaes, a sorologia da toxoplasmose apresenta-se como uma das mais complexas, em contnua evoluo, exigindo uma variedade de testes e experincia do responsvel pela realizao e interpretao dos resultados. Entretanto, a evidenciao do parasito, por isolamento a partir do material do paciente, ou pela demonstrao de seus componentes, como antgenos ou segmentos do DNA, de alto valor diagnstico,

especialmente nos imunocomprometidos, seja por imunodepresso ou por imunoimaturidade como no feto e no recm-nascido (26). Diagnstico Sorolgico O teste de Hemaglutinao Indireta (HAI) descrito originalmente por Jacobs & Lunde (31) com hemcias de carneiro recobertas por componentes do parasito, principalmente citoplasmticos, apresentava baixa sensibilidade. Este teste no detectava IgM ou IgG de baixa avidez, alm de sofrer a interferncia de anticorpos heterfilos com conseqente resultado falso-positivo. Tais falhas foram solucionadas ao se utilizarem hemcias de aves recobertas com antgenos completos do parasito aglutinveis por anticorpos IgG e IgM, tornando o teste altamente sensvel. considerado um teste prtico de baixo custo, no exigindo equipamento sofisticado e um bom mtodo para triagem da toxoplasmose. Ocasionalmente, observam-se resultados falsos-positivos por interferncia de anticorpos IgM naturais, aglutininas IgM no-especficas, em geral de ttulos baixos. Distingue-se de reaes especficas por permanecer com ttulos inalterados, enquanto aquelas se elevam em poucos dias na fase aguda da toxoplasmose (32). A reao de Imunofluorescncia Indireta (IFI)

considerada de boa especificidade e sensibilidade. Tem sido empregada para amplificar o sinal de fluorescncia e aumentar a sensibilidade. Essa reao tem a vantagem de utilizar toxoplasmas preservados, fixados em lminas de microscopia, tornando-a muito mais prtico e seguro para a rotina laboratorial, quando comparada ao Dye test. Alm do mais, esse teste permite a identificao dos anticorpos segundo as classes de imunoglobulinas. Pode apresentar resultados falsos-positivos de anticorpos IgM pela interferncia de fatores reumatides, eventualmente presentes no soro. Os testes para anticorpos IgM podem tambm revelar resultados falsosnegativos, devido competio entre os anticorpos IgG e IgM, impedindo que estes se fixem aos antgenos parasitrios (33). Em cerca de 75% dos casos de recmnascidos com toxoplasmose congnita podem ocorrer resultados falsos-negativos, conseqncia de altos ttulos maternos de anticorpos da classe IgG. A reao de Aglutinao por Imunoabsoro (ISAGA) utilizada para identificao de anticorpos IgM, sendo importante no diagnstico de infeco aguda. Os antgenos adicionados s placas constituem-se em uma suspenso de toxoplasmas, que se aglutinam na presena de IgM especfica (34).

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 A introduo do Ensaio Imunoenzimtico (ELISA) trouxe um grande avano para o diagnstico da doena. Camargo et al. (35) descreveram a tcnica para anticorpos IgG e IgM, observando porm, presena de resultados falsos-positivos paraIgM em pacientes portadores do fator reumatide. Desmonts et al. (34) desenvolveram uma tcnica para deteco de IgM, denominada de ELISA duplo sanduche (DS - ELISA IgM) ou teste de captura de IgM. Atravs dela foi possvel detectar a presena de IgM especfica para T. gondii em 92% dos indivduos com toxoplasmose recentemente adquirida, e que eram negativos na reao de Imunofluorescncia para IgM. A tcnica ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) um teste automatizado no sistema VIDAS da Bio-Mrieux usada para deteco de anticorpos da classe IgG e IgM anti T. gondii. O princpio da reao associa o mtodo imunoenzimtico com uma deteco final em fluorescncia. Os anticorpos da classe IgM so pesquisados por imunocaptura. As imunoglobulinas IgM antitoxoplasma so detectadas especificamente graas a um imunocomplexo marcado com fosfatase alcalina. Este mtodo quando comparado com o mtodo ISAGA apresentou sensibilidade de 93,5%, especificidade de

99,3% e concordncia de 98,9% (36). A tcnica MEIA (Microparticle Enzyme Immunoassay) usada para a determinao quantitativa de anticorpos da classe IgG e IgM antitoxoplasma no soro ou plasma humano. A reao realizada no analisador de imunoensaio, com acesso randmico e contnuo, AXSYM da Abbott. As amostras usadas para pesquisa dos anticorpos da classe IgM so tratadas com tampo de neutralizao do Fator Reumatide (FR), para remover os anticorpos de interferncia (se presentes) do complexo antgeno-anticorpo, a fim de se evitar resultados falsamente positivos. Ao final da reao, o complexo imune ligado ao conjugado marcado com a fosfatase alcalina reage com o substrato 4-Metil Umbeliferil Fosfato (MUP). A fosfatase alcalina cataliza a hidrlise do MUP a MU (Metil Umbeliferil). A quantidade de fluorescncia proporcional concentrao de anticorpos da amostra analisada (37). No incio da dcada de 1990, foi desenvolvido o teste de ELISA IgG para avidez, que tem se mostrado excelente mtodo de diagnstico de infeco aguda adquirida. Este mtodo avalia a avidez de ligao ao antgeno dos anticorpos IgG contra o T. gondii, separando os anticorpos de baixa avidez, produzidos numa fase

inicial da infeco, dos anticorpos de alta avidez, indicativos de infeco crnica (38). A avidez com que os anticorpos IgG ligam-se a seus respectivos antgenos pode ser avaliada pela maior ou menor facilidade de quebra dessa ligao. Mede-se por um teste imunoenzimtico ELISA-IgG modificado, pela dissociao dos complexos antgenos-anticorpos formados e liberao dos anticorpos IgG de baixa avidez, por meio de uma soluo caotrpica, por exemplo de uria 6M (ELISA-uria). Para este fim, aps a incubao do soro na placa, essa lavada com a soluo de uria e, em seguida, prosseguese a reao pela incubao com o conjugado enzimtico. Uma baixa avidez indicada por acentuada diminuio do ttulo com relao ao ttulo original obtido sem o tratamento pela uria (39). A reao de Western blot tem mostrado que o soro materno e o da criana reconhecem diferentes antgenos do T. gondii, quando a criana est congenitamente infectada (40). Hofflin & Remington (41) j tinham reconhecido antgenos diferentes por anticorpos das classes IgG e IgM pela me e filho congenitamente infectado. Anticorpos das classes IgM e IgA podem ser identificados contra a principal protena de superfcie do T. gondii, a protena P30, pela tcnica de Western blot. Comparando-se a tcnica de Western blot com a

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imunocaptura ELISA, demonstrase que a primeira tem vantagens sobre a segunda especialmente no diagnstico da toxoplasmose cerebral dos pacientes com AIDS (42). No paciente com HIV e encefalite, o uso dessa reao mostra diversidade antignica entre diferentes cepas do T. gondii. Para a pesquisa de anticorpos IgA e IgE especficos para a toxoplasmose, utilizam-se as tcnicas imunoenzimticas, tanto a indireta como a de captura. Embora estas reaes estejam sujeitas a alguma discrepncia de resultado, pois ainda no esto suficientemente padronizadas, elas vm assumindo importncia crescente como marcadores de infeces recentes inclusive congnitas (43, 44). A IgA especfica pode ser detectada no sangue de adultos e crianas congenitamente infectados, usando ELISA ou ISAGA. Sua sensibilidade maior na identificao da infeco congnita ou agudamente adquirida (45). Esse mtodo importante em sangue do cordo umbilical para evitar a contaminao pelo sangue materno, uma vez que o anticorpo no atravessa a barreira placentria e o seu encontro no feto diagnstico de infeco congnita. Os ttulos permanecem elevados por um perodo de 26 semanas, praticamente semelhantes persistncia da IgM (45). A IgE especfica pode ser detectada por Imunoabsoro, podendo tambm ser usada para

o diagnstico da doena aguda e congnita (29). Os componentes desse teste so: anticorpos monoclonais para IgE humana, amostra do paciente e taquizotos do T. gondii tratados com formalina. Quando os anticorpos IgE especficos anti T. gondii esto presentes, ocorre aglutinao visivelmente detectada. Por esse mtodo, podem ser testados soro, sangue fetal, fluido cerebroespinhal e fluido amnitico. A persistncia do anticorpo especfico no sangue materno detectada at por quatro meses nas pesquisas realizadas, tornando esse mtodo mais seguro do que o da determinao da IgM no diagnstico da infeco na gestante. Por outro lado, no atravessa a placenta, e sua presena no sangue do feto ou do recm-nascido diagnstico de transmisso congnita da infeco. Entretanto, no sangue de pacientes com toxoplasmose congnita, o anticorpo pode ser encontrado por tempo prolongado (um ano) e durante perodos de recrudescncias, aps a suspenso da teraputica com Sulfa-Pirimetamina (46).

etapas recentes de avaliao. muito cedo para determinar uma tcnica padro-ouro diferente da sorologia, pois essa a principal abordagem para estabelecer um diagnstico de toxoplasmose. Este baseado na pesquisa de anticorpos de diferentes classes de imunoglobulinas (IgG, IgM, IgA e IgE) anti-T. gondii. Alm disso, a presena dos anticorpos antitoxoplasma no curso da infeco permite a anlise de perfis sorolgicos, seja de infeco recente, em fase aguda, ou de infeco antiga, em fase de latncia ou crnica (30). Com o advento das tcnicas automatizadas no diagnstico sorolgico, trouxe a realidade de anticorpos residuais, levando a resultados duvidosos e/ou inconclusivos, tornando necessrio o uso de mtodos parasitolgicos, dentre eles as tcnicas de biologia molecular, permitindo assim um diagnstico precoce e seguro, podendo monitorar a carga parasitria de gestantes e at mesmo validar o tratamento utilizado. Assim, a preveno da toxoplasmose congnita de fundamental importncia para um melhor controle da infeco evitando as graves seqelas que podem ocorrer em fetos e recm-nascidos.

Discusso
O diagnstico da toxoplasmose baseado na sorologia, porm os resultados devem ser interpretados concomitantemente clnica do paciente. histria do paciente e sintomatologia. As tcnicas moleculares se encontram em

Correspondncias para: Profa. Dra. Ana Maria de Castro amaria@iptsp.ufg.br

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