UNIVERSIDADE TCNICA DE LISBOA Faculdade de Medicina Veterinria

RIQUETSIOSES DO GRUPO DAS FEBRES EXANTEMTICAS EM CANDEOS DOMSTICOS EM PORTUGAL: REVISO BIBLIOGRFICA E ESTUDO RETROSPECTIVO

MARIA TERESA TEODORO ROCHA DUARTE

CONSTITUIO DO JRI Doutor Jos Henrique Duarte Correia Doutora Isabel Fonseca Sampaio Doutor Jos Paulo Sales Lus Dra. Maria Joo Dinis da Fonseca

ORIENTADORA Dra. Maria Joo Dinis da Fonseca CO-ORIENTADOR Doutor Jos Paulo Sales Lus

2008 LISBOA

UNIVERSIDADE TCNICA DE LISBOA Faculdade de Medicina Veterinria

RIQUETSIOSES DO GRUPO DAS FEBRES EXANTEMTICAS EM CANDEOS DOMSTICOS EM PORTUGAL: REVISO BIBLIOGRFICA E ESTUDO RETROSPECTIVO

MARIA TERESA TEODORO ROCHA DUARTE

DISSERTAO DE MESTRADO INTEGRADO EM MEDICINA VETERINRIA

CONSTITUIO DO JRI Doutor Jos Henrique Duarte Correia Doutora Isabel Fonseca Sampaio Doutor Jos Paulo Sales Lus Dra. Maria Joo Dinis da Fonseca

ORIENTADORA Dra. Maria Joo Dinis da Fonseca CO-ORIENTADOR Doutor Jos Paulo Sales Lus

2008 LISBOA

Agradecimentos Gostaria de agradecer a todos aqueles que contriburam para a realizao desta dissertao. Ao Professor Doutor Jos Paulo Sales Lus (co-orientador) e Dra. Maria Joo Fonseca (orientadora) por todo o apoio e conselhos prestados. Doutora Rita de Sousa do Instituto Nacional de Sade Dr. Ricardo Jorge por toda a sua coloraborao, pacincia, experincia e conhecimentos transmitidos durante a realizao deste trabalho, Doutora ngela Xufre coordenadora do Laboratrio DNAtech pela disponibilidade e colaborao na realizao do estudo retrospectivo e ao Dr. Diogo Magno por ter sugerido o tema escolhido e apoiado em todas as fases de realizao desta dissertao. Professora Doutora Isabel Neto pelos conselhos e experincia transmitidos no tratamento estatstico dos dados. Professora Doutora Isabel Fonseca por toda a sua colaborao e pacincia. A todos os mdicos veterinrios e auxiliares do Hospital Veterinrio do Restelo pelos conhecimentos e experincias partilhadas no perodo de estgio. Por ltimo, um obrigado a toda a famlia e amigos pelo apoio e presena constantes durante todos os anos de percurso acadmico.

Resumo As riqutsias do grupo das febres exantemticas esto amplamente distribudas, em focos endmicos, por vrias regies geogrficas do Mundo e so importantes causas de morbilidade e mortalidade no Homem e nos animais domsticos. Em Portugal, Rickettsia conorii o principal agente deste grupo e causa febre botonosa em humanos. Esta foi a nica riqutsia identificada por mtodos de biologia molecular em ces portugueses doentes. O vector de R. conorii no pas o ixoddeo Rhipicephalus sanguineus. Os ces, os principais hospedeiros deste ixoddeo, podem servir como sentinelas e dar alguma indicao sobre a prevalncia da infeco. Apesar da elevada seroprevalncia desta riqutsia em candeos, existem poucos estudos que relacionam a infeco por este agente com doena nestes animais. O mesmo animal pode ser infectado concomitantemente por vrios agentes transmitidos por vectores e muitas vezes os quadros clnicos das diferentes doenas so inespecficos e semelhantes. Por isso, deve ser feito diagnstico diferencial entre vrias patologias e neste mbito, as tcnicas laboratoriais assumem maior importncia que o diagnstico clnico. Foi realizado um estudo restrospectivo sobre uma amostra de 91 animais apresentados a consulta no Hospital Veterinrio do Restelo, entre Maio de 2007 e Fevereiro de 2008, com sintomas suspeitos de doena transmitida por ixoddeos e aos quais foram pesquisados anticorpos anti-R. conorii. Alguns dos casos clnicos includos neste estudo decorreram fora do perodo de estgio pelo que houve conhecimento dos mesmos pelo acesso a base de dados do hospital. A tcnica de Imunofluorescncia Indirecta (IFI) foi utilizada para pesquisa de anticorpos contra R. conorii (n=91), E. canis (n=90), L. infantum (n=56) e B. canis (n=26). Na amostra, a seroprevalncia de R. conorii foi de 73%, superior a de qualquer um dos outros agentes. Foram encontradas possveis co-infeces de vrios agentes em 38 dos 66 animais que possuiam anticorpos contra a riqutsia em questo. A associao de sinais clnicos com resultados de IFI positivos para R. conorii foi realizada em seis animais. Foram detectados vrios sinais e sintomas como pirxia, uvete, petquias e hematomas, dor de origem inespecfica, rigidez muscular e esplenomeglia. Anemia, trombocitopnia e hipoproteinmia foram as alteraes hematolgicas verificadas. Nesta amostra, a maioria dos ces de rua e dos animais com histria de parasitismo por ixoddeos, possuia anticorpos contra agentes transmitidos por ixoddeos, nomeadamente R. conorii. Palavras-chave: Rickettsia conorii, Rhipicephalus sanguineus, IFI, seroprevalncia, candeos, Portugal. ii

Abstract Rickettsia of the Spotted Fever group are widely distributed, in endemic focii, throughout the world and are important causes of morbidity and mortality in man and domestic animals worldwide. In Portugal, Rickettsia conorii is the main organism of this group, causing boutounneuse fever in humans. Also, this was the only rickettsia identified by molecular biology methods in sick portuguese dogs. In Portugal, the arthropod that transmits this rickettsia is the tick Rhipicephalus sanguineus. Dogs, the main hosts of this tick, may serve as sentinels and elucidate about the prevalence of infection. Despite the high prevalence of this rickettsia in these animals, there are few studies that link infection by this agent and clinical signs in canines. The same animal can be infected by several vector-borne agents simultaneously which can cause overllaping and unspecific clinical signs. Therefore, some differential diagnosis should be included and, for this concern, the laboratorial techniques assume an important role to achieve the definitive diagnosis. Between May 2007 and February 2008, several animals were assisted in Hospital Veterinrio do Restelo for tick-borne diasease symptoms. Of these, 91 were included in this retrospective study. Some of the animals came to the hospital out of the externship period therefore, knowledge of the cases was taken accessing the hospital data base. An indirect fluorescent-antibody test (IFA) was performed to search for antibodies against R. conorii in (n=91), E. canis (n=90), L. infantum (n=56) and B. canis (n=26). In this sample, the R. conorii seroprevalence was 73%, higher than the seroprevalence for the other agents. Possible co-infections were found in 38 of the 66 canines that had antibodies against the rickettsia in question. The association between clinical signs in dogs and positive IFA results for R. conorii was done in 6 animals. In these canines, symptoms such as fever, uveitis, petequial hemorrhages, bruises, unspecific pain, tremors, muscle stiffness and splenomegaly were detected. Anemia, thrombocytopenia and hypoproteinemia were the hematologic changes found. In this sample, the majority of the stray dogs and animals with a history of parasitism by ticks featured antibodies against tick-borne agents, especially R. conorii. Keywords: Rickettsia conorii, Rhipicephalus sanguineus, IFA, seroprevalence, canine, Portugal.

iii

ndice Geral

Agradecimentos ......................................................................................................................... i Resumo ....................................................................................................................................... ii Abstract ..................................................................................................................................... iii ndice Geral ............................................................................................................................... iv ndice de Figuras ...................................................................................................................... vi ndice de Grficos .................................................................................................................... vi ndice de Tabelas..................................................................................................................... vii ndice de Abreviaturas e Smbolos ...................................................................................... viii Nota Prvia .................................................................................................................................1 I. 1. 2. 3. 4. 5. Reviso Bibliogrfica ....................................................................................................2 Introduo........................................................................................................................2 Taxonomia do Gnero Rickettsia ....................................................................................3 As riqutsias: morfologia, estrutura e composio qumica ...........................................4 Riquetsioses do grupo das febres exantemticas no Mundo.........................................5 Riquetsioses do grupo das febres exantemticas em Portugal .....................................7

5.1. Febre Botonosa ..........................................................................................................10 5.1.1. Epidemiologia ..........................................................................................................10 5.1.2. Estudos de seroprevalncia e factores de risco em candeos ...............................11 5.1.3. Vector: caractersticas e ciclo biolgico ..................................................................12 5.1.4. Hospedeiros reservatrio de R. conorii...................................................................15 5.1.5. Formas de infeco dos vectores ...........................................................................15 5.1.6. Ciclos epidemiolgicos............................................................................................16 5.1.7. Vias de infeco dos hospedeiros ..........................................................................17 5.1.8. Patogenia.................................................................................................................18 5.1.9. Resposta imunitria.................................................................................................19 5.1.10. Quadro clnico..........................................................................................................21 5.1.11. Diagnsticos diferenciais.........................................................................................24 5.1.12. Diagnstico laboratorial...........................................................................................25 a) b) Diagnstico indirecto .................................................................................................26 Imunofluorescncia Indirecta (IFI).........................................................................27 Diagnstico directo ....................................................................................................28 Deteco de cidos nucleicos pela Reaco em Cadeia da Polimerase (PCR).28 iv

c)

Isolamento de Rickettsia conorii em cultura de clulas........................................29 Imunodeteco em sangue e tecidos ...................................................................29 Isolamento e deteco de riqutsias a partir dos artrpodes vectores....................30

5.1.13. Tratamento especfico e de suporte .......................................................................30 5.1.14. Profilaxia e controlo .................................................................................................34 II. III. 1. 2. Objectivos ....................................................................................................................36 Material e mtodos ......................................................................................................37 Material ..........................................................................................................................37 Mtodos .........................................................................................................................38

2.1. Tcnica de Imunofluorescncia Indirecta para deteco de anticorpos anti-R. conorii em soros de candeos .........................................................................................................39 2.2. Tcnica de Imunofluorescncia Indirecta para deteco de anticorpos contra os restantes agentes pesquisados ..........................................................................................40 2.3. Exames hematolgicos ..............................................................................................41 2.3.1.Hemograma................................................................................................................41 2.3.2.Parmetros bioqumicos ..............................................Erro! Marcador no definido. 2.3.3.Exame microscpico de esfregao sanguneo..........................................................42 2.4. Clculo da seroprevalncia na amostra dos vrios agentes pesquisados ...............43 2.5. Mtodos estatsticos...................................................................................................43 IV. 1. 2. Resultados ...................................................................................................................43 Resultados da titulao de anticorpos contra os vrios agentes .................................43 Resultados da titulao de anticorpos contra R. conorii ..............................................44

2.1. Estudo do grupo de animais positivos para R. conorii mas suspeitos para outros agentes ................................................................................................................................45 2.2. Estudo do grupo de animais com anticorpos contra outros agentes alm de R. conorii 47 2.3. Estudo do grupo de animais apenas com anticorpos contra R. conorii ....................47 3. 4. 5. Tratamento aplicado nos candeos em estudo apenas infectados com R. conorii 48 Estudo da prevalncia de agentes transmitidos por ixoddeos na amostra de ces de rua Associao entre parasitismo por ixoddeos e presena de anticorpos contra os agentes Discusso dos resultados ..........................................................................................49 Concluso ....................................................................................................................53 Referncias bibliogrficas..........................................................................................55 Anexos ..........................................................................................................................62 v

em estudo ..............................................................................................................................49 transmitidos por estes vectores ............................................................................................49 V. VI. VII. VIII.

Anexo I- Resumo das tarefas realizadas durante o estgio curricular.................................62 1. 2. Caracterizao da populao de animais assistida .....................................................62 Actividades desenvolvidas ............................................................................................63

Anexo II Protocolo de deteco de R. conorii por Imunofluorescncia Indirecta do Laboratrio DNAtech .............................................................................................................69

ndice de Figuras

Figura 1- Taxonomia do Gnero Rickettsia (Euzby, 2008)3 Figura 2- R. rickettsii em clulas de hemolinfa de ixoddeos (colorao Gimenez).4 Figura 3- Imagem de microscopia electrnica de R. conorii em cultura de clulas endoteliais humanas ..4 Figura 4- Alguns vectores de Rickettsia do grupo das febres exantemticas em Portugal9 Figura 5- Rhipicephalus sanguineus..13 Figura 6- Taxonomia do Gnero Rickettsia (Euzeby, 2008)..14 Figura 7- Patogenia de Rickettsia spp...18 Figura 8- Diagnstico de Rickettsia spp26

ndice de Grficos Grfico 1- Habitat da amostra de candeos em estudo ............................................................38 Grfico 2- Ms do ano em que foi realizada a pesquisa de anticorpos anti-R. conorii ...........38 Grfico 3- Resultados de IFI obtidos para cada um dos agente pesquisados ........................44 Grfico 4- Resultados de titulao de anticorpos anti-R. conorii nos animais em estudo.......44 Grfico 5- Grupos de animais com anticorpos contra R. conorii ..............................................45 Grfico 6- Tipos de co-infeco encontrados na amostra em estudo......................................47 Grfico 7- Proporo das vrias espcies de pacientes assistidos em consulta e internamento ...................................................................................................................................................62 Grfico 8- Proporo de machos e fmeas de candeos e feldeos assistidos em consulta e internamento..............................................................................................................................63 Grfico 9- Tipo de animais exticos observados em consulta e internamento .......................63 Grfico 10- Tipos de cirurgia assistidos....................................................................................67 vi

ndice de Tabelas

Tabela 1- Alguns agentes transmitidos por vectores com importncia em candeos .................. 2 Tabela 2- Espcies de Rickettsia descritas nos diferentes continentes ........................................ 5 Tabela 3- Resumo de estudos de prevalncia de R. conorii em candeos de pases endmicos 7 Tabela 4- Riqutsias do grupo das febres exantemticas j isoladas em Portugal ...................... 8 Tabela 5- Caractersticas biolgicas de Rhipicephalus sanguineus ............................................ 13 Tabela 6- Estudos que associaram infeco natural por R. conorii com quadro clnico em candeos ........................................................................................................................................ 22 Tabela 7- Grupos de antibiticos com eficcia conhecida contra riqutsias em animais ........... 31 Tabela 8- Antibiticos utilizados no tratamento de febre das Montanhas Rochosas .................. 32 Tabela 9- Principais grupos de acaricidas eficazes na eliminao de ixoddeos ........................ 35 Tabela 10- Parmetros de hemograma avaliados e valores de referncia para cada um dos contadores de clulas utilizado ..................................................................................................... 41 Tabela 11- Parmetros bioqumicos avaliados e valores de referncia para cada um deles ..... 42 Tabela 12- Tipo de consultas assistidas....................................................................................... 64 Tabela 13- Proporo das vrias reas da patologia mdica ...................................................... 64 Tabela 14- Tipos de neoplasias observadas em consulta ........................................................... 65 Tabela 15- Tipos de tratamento realizados em consulta e internamento .................................... 65 Tabela 16- Tipos de urgncias assistidas..................................................................................... 66 Tabela 17- Tipos de patologia de animais exticos ..................................................................... 66 Tabela 18- Proporo dos mtodos complementares de diagnstico utilizados......................... 67 Tabela 19- Tipos de cirurgias de tecidos moles assistidas .......................................................... 68 Tabela 20- Pequenas intervenes cirrgicas.............................................................................. 68

vii

ndice de Abreviaturas e Smbolos ADN ARN ALP ALT C dL EDTA ELISA EV fL g IFI Ig IM INF Kg L LPS m mg mL mm3 NK Omp PBS PCR Pg PO Primer rARN SC FNT UI L cido Desoxiribonucleco cido Ribonucleco Fosfatase Alcanina Alanina Aminotransferase Grau Centgrado Decilitro cido etileno-diamino-tetra-actico Enzime-linked Immunoabsorbent Assay Endovenoso Fento-Litro Grama Tcnica de Imunofluorescncia Indirecta Imunoglobulina Intramuscular Interfero Quilograma Litro Lipopolissacridos Mil Miligrama Mililitro Milmetro cbico Natural killer Outer membrane protein Tampo Fosfato Alcalino Polimerase chain reaction Picograma Per os Oligonucletido iniciador cido ribonucleico ribossmico Subcutneo Factor de necrose tumoral Unidades internacionais Microlitro viii

Nota Prvia Este trabalho foi efectuado com base em dados e informaes obtidos num estgio curricular, realizado no Hospital Veterinrio do Restelo, durante um perodo de seis meses, decorrente entre 3 de Setembro de 2007 e 29 de Fevereiro de 2008, sob orientao da Dra. Maria Joo Dinis da Fonseca. Neste hospital so recebidos, rotineiramente, animais de vrias espcies, onde predominam candeos e feldeos, embora os animais exticos surjam cada vez com mais frequncia. Durante o perodo de estgio, houve participao activa em vrias actividades da medicina de pequenos animais como consultas, cirurgias, procedimentos de urgncia, cuidados de internamento, tratamentos e mtodos complementares de diagnstico tendo, portanto, contactado com vrias reas da patologia clnica dos animais de companhia. Foi tambm solicitada a elaborao de dois trabalhos com os temas Linfoma renal em ces e gatos e PCR e imunocitoqumica, o que o Veterinrio precisa saber?, os quais foram uma mais valia para os conhecimentos adquiridos durante este perodo. Com o intuito de ilustrar as actividades realizadas durante o perodo de estgio, foram elaborados vrios grficos e tabelas, em anexo (Anexo I). Ao longo destes seis meses, houve percepo do elevado nmero de candeos aos quais era feito despiste de doenas infecciosas transmitidas por vectores. Esta constatao est relacionada com a elevada frequncia de ocorrncia destas patologias no nosso pas, favorecendo assim o aumento da suspeio, e por outro lado, pelo facto destas se caracterizarem, muitas vezes, por quadros clnicos inespecficos e semelhantes, obrigando ao recurso a tcnicas de diagnstico laboratoriais para um diagnstico definitivo. O tema Riquetsioses do grupo das febres exantemticas em candeos em Portugal foi escolhido por esta razo e pelo facto de poucos estudos sobre estes agentes terem sido realizados em candeos portugueses.

I.

Reviso Bibliogrfica

1.

Introduo

Os candeos esto grandemente expostos ao parasitismo por parte de artrpodes tais como ixoddeos, pulgas, insectos, entre outros. Estes parasitas provocam danos directos no animal devido as suas aces mecnica (leso dos tecidos), espoliadora, irritativa e inflamatria. Para alm disto, podem tambm estar na origem de reaces alrgicas e os produtos resultantes do seu catabolismo ou morte, podem ter uma aco txica no hospedeiro. Por outro lado, estes artrpodes tm tambm uma aco indirecta, na medida em que so vectores de diversos agentes patognicos. A tabela 1 rene alguns dos agentes transmitidos por vectores com importncia em candeos.

Tabela 1- Alguns agentes transmitidos por vectores com importncia em candeos Vector Piolhos (Trichodectes canis) Pulgas (Ctenocephalides canis, C. felis, Pulex irritans) Mosquitos (Phlebotomus ariasi e P. perniciosus, Culicdeos dos gneros Anopheles Culex e Aedes) Bactrias: Borrelia spp., Ehrlichia spp., Anaplasma Ixoddeos (Rhipicephalus spp., Dermacentor spp., Ixodes spp.) spp., Rickettsia spp. Protozorios: Babesia spp., Hepatozoon canis Vrus: encefalite transmitida por carraas Filrias: Dipetalonema grassi O mesmo animal pode ser parasitado por mais do que um vector e consequentemente ser infectado por mais do que um agente (co-infeco). Em zonas endmicas, podem ocorrer co-infeces de erliquiose, babesiose, riquetsiose e leishmaniose (Shaw, Day, Birtles & Breitschwerdt, 2001). 2 Protozorios: Leishmania infantum Filarias: Dirofilaria immitis Cstodes: Dipilidium caninum Agente Cstodes: Dipilidium caninum

As doenas transmitidas por ixoddeos assumem importncia crescente em candeos, devido expanso dos vectores a reas urbanas e semi-urbanas por todo o mundo, ao movimento de ces infectados para reas no-endmicas e ao desenvolvimento de novas tcnicas de diagnstico molecular (Shaw et al., 2001). Por estas razes, esta reviso vai centrar-se nestes agentes, mais particularmente nos organismos do gnero Rickettsia. As riqutsias so bactrias intracelulares obrigatrias que tm como alvo preferencial as clulas endoteliais dos hospedeiros e provocam doenas (riquetsioses) que afectam o Homem e alguns animais domsticos. O seu ciclo de vida est associado a artrpodes vectores, como ixoddeos, que so os principais vectores de rickettsias do grupo das febres exantemticas. O gnero Rickettsia inclui dois grupos distintos: o grupo das febres exantemticas e o grupo do tifo (Sousa, Nbrega, Bacellar & Torgal, 2003). As riqutsias do grupo das febres exantemticas vo ser abordadas mais aprofundadamente ao longo desta reviso. Estas esto amplamente distribudas, em focos endmicos, por vrias regies geogrficas do Mundo, inclundo Portugal, e so importantes causas de morbilidade e mortalidade no Homem e nos animais domsticos (Kidd, 2006). Na ltima dcada, as mudanas climticas tm influenciado a incidncia e a distribuio geogrfica destas doenas relacionado com as alteraes no ciclo de vida dos vectores. 2. Taxonomia do Gnero Rickettsia

Figura 1- Taxonomia do Gnero Rickettsia (Euzby, 2008)

As riqutsias so organismos que pertencem ao Domnio Bacteria, Filo Proteobacteria, Classe Alpha-Proteobacteria, Ordem Rickettsiales, Famlia Rickettsiaceae que engloba os Gneros 3

Rickettsia e Orientia (Euzby, 2008). O Gnero Rickettsia divide-se taxonomicamente em dois grupos distintos (Sousa et al., 2003): O grupo do tifo e o grupo das febres exantemticas sendo que cada um destes grupos constitudo por diversas espcies de riqutsias que podem afectar o Homem e/ou os animais domsticos. Como exemplos de riqutsias do grupo das febres exantemticas podem ser referidas R. conorii, R. felis, R. slovaca, R. rickettsii e R. akari. Ao grupo do tifo pertencem R. typhi e R. prowazekii . 3. As riqutsias: morfologia, estrutura e composio qumica

Para compreender a patogenia das doenas que provocam, essencial conhecer um pouco a morfologia das riqutsias. Os membros do gnero Rickettsia so bactrias (cocobacilos) Gram negativas intracelulares obrigatrias. Estes organismos tm geralmente 0,8 a 2 m de comprimento e 0,3 a 0,5 m de dimetro (La Scola & Raoult, 1997) e coram com a tcnica Giemsa ou Gimenez (Raoult & Roux, 1997) (Figuras 2 e 3).

in www.cdc.gov/ncidod/dvrd/rmsf/organism.htm

in http://gsbs.utmb.edu/ microbook/ch038.htm

Figura 2- R. rickettsii em clulas de hemolinfa de ixoddeos (colorao Gimenez).

Figura 3- Imagem de microscopia electrnica de R. conorii (r) em cultura de clulas endoteliais humanas. Um dos organismos em diviso binria (seta)

Sendo

bactrias

Gram

negativas,

possuem

parede

celular

com

peptidoglicano

lipopolissacridos (LPS) (Mc Dade, 1998). Os LPS so antignios especficos das riqutsias do grupo das febres exantemticas, por existirem em todas as riqutsias deste grupo e em pouca quantidade nas do grupo do tifo (Bacellar, 1996; Mc Dade, 1998). Tm papel na fixao do complemento e esto na origem das reaces imunitrias cruzadas que ocorrem entre as vrias riqutsias e entre estas e outros microrganismos (Bacellar, 1996). 4

As riqutsias possuem, na sua membrana, protenas de diferentes pesos moleculares, que foram denominadas de rOmp (rickettsia outer membrane protein) e constituem os principais antignios usados na classificao das diferentes espcies de riqutsia. Pelo processo de adaptao ao ambiente intracelular, estes organismos tm a capacidade de se movimentarem dentro das clulas infectadas atravs de filamentos de actina (Heinzen, Grieshaber, Kirk & Devin, 1999; Walker, Valbuena & Olano, 2003). As riqutsias do grupo das febres exantemticas tm capacidade de passar de uma clula para a outra sem provocar destruio das mesmas, ao contrio das do grupo do tifo que se multiplicam na clula hospedeira at que esta rebente (Walker et al., 2003). 4. Riquetsioses do grupo das febres exantemticas no Mundo

A distribuio das riqutsias no Mundo est directamente relacionada com a distribuio dos seus vectores. A tabela 2 resume a distribuio das principais riqutsias pelos diferentes continentes (Parola, Paddock & Raoult, 2005; Raoult & Raoux, 1997; Sousa et al., 2003).

Tabela 2- Espcies de Rickettsia descritas nos diferentes continentes Continente Europa Amrica frica sia Oceania Espcies descritas R. conorii, R. felis, R. aeschlimannii, R. sibrica e R. sibirica estirpe mongolotimonae, R. slovaca, R. akari, Grupo R. massiliae, R. helvetica e R. rhipicephali R. rickettsii, R. bellii, R. montana, R. rhipicephali, R. akari, R. canada, R. parkeri, R. amblyomii e R. felis R. conorii, R. rhipicepahli, Grupo R. massilae, R. felis, R. aeschlimannii, R. africae R. sibirica, R. sibirica estirpe mongolotimonae, R. conorii, R. akari, R. japonica R. australis, R. honei

Algumas das riqutsias referidas j foram associadas a casos de doena em humanos, nomeadamente R. sibirica (agente do tifo siberiano), R. sibirica estirpe mongolotimonae (LAR Lymphangitis Associated Rickettsiosis), R. akari (riquetsiose vesicular), R. japonica (febre exantemtica Oriental), R. slovaca (TIBOLA - Tick-borne lymphadenopathy ou DEBONEL Dermacentor-borne-necrosis-erythema-lymphanedopathy) e R. africae (febre da carraa africana) (Blanco & Oteo, 2006; Parola et al., 2005; Raoult & Raoux, 1997; Sousa et al., 2003). As duas riqutsias j descritas na Oceania tambm so patognicas. R. australis transmite tifo 5

da carraa de Queensland e R. honei agente de febre botonosa das Ilhas Flinders (Raoult & Raoux, 1997; Sousa et al., 2003). R. rickettsii, o principal agente de febres exantemticas no continente americano (Lpez, Abarca & Azocar, 2007), tendo j sido relatados casos de doena em pases como Estados Unidos, Canad, Mxico, Colmbia, Brasil, Costa Rica e Panam (Raoult & Roux, 1997), onde tem crescente importncia em sade pblica (Galvo et al., 2005). Estudos de seroprevalncia encontraram anticorpos anti-R. rickettsii em 5 a 15% dos candeos nos E.U.A (Greene & Bretschwerdt, 2006) e em 4 a 31% dos candeos no Brasil (Galvo et al., 2002; Horta et al., 2004). No foi comprovada a existncia desta espcie noutros continentes (Lpez et al., 2007). Em relao aos candeos, esta a nica riqutsia com poder patognico comprovado e reconhecido no continente americano (Greene & Breitschwerdt, 2006). A bactria R. conorii, descrita pela primeira vez no princpio do sculo XIX, considerada como agente endmico na bacia do Mediterrneo, Rssia, Norte Africa, e ndia (Raoult & Roux, 1997). No continente africano, R. conorii j foi isolada na frica Central, Somlia, Qunia, Zimbabwe e frica do Sul apesar de ser prevalente no Norte deste continente. Existem diferentes estirpes de Rickettsia conorii: R. conorii estirpe Malish, R. conorii estirpe Israeli tick typhus; R. conorii estirpe Indian tick typhus e R. conorii estirpe Astrakahan (Massung, Nicholson, Eremeeva & Dasch, 2008; Zhu, Fournier, Eremeeva & Raoult, 2005). Dentro destes quatro grupos existem vrias designaes para a mesma estirpe, dependendo de onde ela foi isolada (Parola et al., 2005). Os ces que vivem nas zonas endmicas so expostos a esta riqutsia e, estes animais infectados naturalmente, podem ser seropositivos durante meses. Estudos em ces espanhis revelaram que alguns deles ainda possuiam anticorpos 750 dias aps o primeiro resultado positivo (Tesouro, Bacellar, Sainz & Filipe, 1998). A tabela 3 resume os resultados de vrios estudos de seroprevalncia de R. conorii em candeos realizados em pases considerados endmicos.

Tabela 3- Resumo de estudos de prevalncia de R. conorii em candeos de pases endmicos Pas Portugal Itlia Espanha Israel Seroprevalncia de R. conorii 85,6%1, 38,5%2, 85%3 15 a 35%4 56,4%5 estirpe Morrocan 58%6 estirpe Israeli Tick Typhus28%6
1- Bacellar et al. (1995a); 2- Alexandre (2005); 3- Nncio et al. (1999); 4- Mannelli et al. (2003); 5- SolanoGallego et al. (2006b); 6- Baneth et al. (1998)

O poder patognico desta Rickettsia em candeos ainda no est bem definido. No entanto, alguns estudos j associaram infeco com R. conorii a quadros clnicos nestes animais (Baneth, Breitschwerdt, Hegarty, Pappalardo & Ryan, 1998; Alexandre, 2005; Kidd, 2006). Alguns estudos concluram que a seroprevalncia de R. conorii em ces e pessoas est associada (Herrero et al., 1992; Mannelli, Mandola, Pedri, Tripoli & Nebbia, 2003). No entanto, como os ces so mais parasitados por carraas, a seroprevalncia de R. conorii nestes animais superior da populao humana (Tesouro et al., 1998). 5. Riquetsioses do grupo das febres exantemticas em Portugal

Em Portugal, a sobrevivncia e disseminao das riqutsias nos animais e no Homem pode ser explicada pela elevada prevalncia de vectores ao longo de todo o ano (Bacellar, Dawson, Silveira & Filipe, 1995a). De facto, as condies climticas e ambientais que o pas oferece aos ixoddeos so consideradas excelentes. Em Portugal, j foram isoladas vrias espcies de Rickettsia do grupo das febres exantemticas a partir de vectores e/ou de humanos, tal como ilustram a tabela 4 e figura 4.

Tabela 4- Riqutsias do grupo das febres exantemticas j isoladas em Portugal Agente Vector Capacidade patognica conhecida ? R. sibirica1, 2 ,3 Rhipicephalus pusillus e Hyalomma spp. R. rhipicephali 4 R. slovaca5, 6, 7,8 No Sim No No Sim Identificada em doentes portugueses? Sim

R. sanguineus

Dermacentor marginatus e D. reticulatus

R. helvetica9, 10

Ixodes ricinus e I. ventalloi

Sim

No

Grupo R. massilae 1,11

R. turanicus e R. sanguineus

Sim

No

R. estirpe PoTiRb1691 R. aeschlimannii 9, 12 R. estirpe RpA4 1, 6

R. bursa

No Sim No

No No No

H. marginatum D. marginatus e D. reticulatus

R. conorii estirpes Malish e Israeli Tick Tyhus 3, 14 R. felis 10; 15

R. sanguineus

Sim

Sim

Archaeopsylla erinacei maura e Ctenophtalmus spp.

Sim

No

1-Sousa et al., 2006a; 2- Sousa et al., 2008; 3- Sousa et al., 2003; 4- Bacellar et al., 1995b; 5Bacellar, et al., 1995c; 6- Santos-Silva et al., 2006; 7- Parola et al., 2005; 8- Selmi et al., 2008; 9- Silva et al., 2006; 10- Blanco & Oteo, 2006; 11- Vitale et al., 2006; 12- Bacellar, 1996; 13Raoult et al., 2002; 14- Sousa et al., 2007; 15- Sousa et al., 2006b

Figura 4- Alguns vectores de Rickettsia do grupo das febres exantemticas em Portugal

in http://commons.wikimedia.o rg/wiki/Image:Dermacentor_ reticulatus_M_070825.jpg

in www.biolib.cz/IMG/GAL/ 10788.jpg

Gnero Dermacentor
http://entomology. worldpress.com/

Gnero Archaeopsylla

in http://webpages.lincoln.ac.uk in www.entomology. cornell.edu

Gnero Ixodes

Gnero Rhipicephalus

Gnero Hyalomma

O poder patognico de muitas destas riqutias j foi comprovado, com casos clnicos em diversos pases. O primeiro caso de doena atribudo a R. slovaca foi relatado em 1997 e as alteraes encontradas foram uma escara no couro cabeludo e aumento dos linfonodos cervicais (Parola et al., 2005). A doena ficou assim conhecida como TIBOLA (Tick-borne lymphadenopathy) (Parola et al., 2005) ou DEBONEL (Dermacentor-borne-necrosis-erythemalymphanedopathy) (Blanco & Oteo, 2006). Em Itlia, mais recentemente, foram relatados novos casos de patologia provocada por este agente com sinais clnicos semelhantes (Selmi, Bertolotti, Tomassone & Mannelli, 2008). Em Frana, foi descrito um caso de riquetsiose provocado por R. aeschlimannii num doente que tinha regressado de Marrocos (Raoult, Fournier, Abboud & Caron, 2002). Segundo Blanco & Oteo (2006), os sintomas desta doena so semelhantes aos da febre botonosa, embora o curso de patogenia no seja to grave. R. helvetica, est associada a quadros patolgicos menos graves que R. conorii e a doena que provoca no caracterizada por rash cutneo, ao contrrio da febre botonosa (Blanco & Oteo, 2006).

R. massilae foi isolada a partir de um doente em Itlia que apresentava sintomas como febre e rash (Vitale, Mansueto, Rolain & Raoult, 2006). No que respeita a R. felis, todas as pulgas da espcie Archaeopsylla erinacei maura e do gnero Ctenophtalmus que foram colhidas de diferentes regies e animais de Portugal estavam infectadas por este agente, o que sugere uma elevada taxa de infeco dos vectores no nosso pas (Sousa et al., 2006b). O papel patognico desta riqutsia foi demonstrado por PCR e serologia em pacientes franceses e alemes (Blanco & Oteo, 2006). Esta riquetsiose deve fazer parte dos diagnsticos diferenciais em pacientes com febre e/ou rash e com histria de picada de pulga ou contacto com gatos (Blanco & Oteo, 2006). Apesar de serem vrias as espcies dos agentes das febres exantemticas identificadas em Portugal, apenas R. conorii estirpes Malish e Israeli tick typhus e R. sibirica estirpe Mongolotimonae foram detectadas/isoladas em doentes portugueses (Sousa et al., 2003; Sousa et al., 2006a; Sousa et al., 2006b). R. sibirica foi associada a quadro clnico em dois doentes portugueses com febre, linfadenopatia e rash (Sousa et al., 2006a; Sousa et al., 2006b). As duas estirpes de R. conorii, contudo, so agentes da nica riquetsiose com significado em termos de sade pblica no pas, a febre botonosa (Sousa et al., 2003). Para alm disto, R. conorii foi a nica espcie de riqutsia detectada por PCR em candeos doentes no nosso pas (Alexandre, 2005). Por estas razes, este agente ser alvo de uma abordagem mais aprofundada. 5.1. Febre Botonosa 5.1.1. Epidemiologia A febre botonosa tambm conhecida como febre escaro-nodular, febre da carraa na linguagem popular (Bacellar, 1998) ou Mediterranean Spotted Fever na denominao anglo-saxnica, uma zoonose transmitida por Rhipicephalus sanguineus (Amaro, Bacellar & Frana, 2003). Os agentes etiolgicos responsveis por esta patologia so duas estirpes do complexo R. conorii: R. Conorii estirpe Malish e R. Conorii estirpe Israeli Tick Typhus. Ambas foram isoladas a partir de amostras humanas, e do vector (Bacellar et al., 1999; Sousa et al., 2007). Esta uma doena de declarao obrigatria desde 1950 e endmica em Portugal (Sousa & Bacellar, 2004). A sua taxa de incidncia mdia durante o perodo de 1989 a 2003 foi de 8,9/105 habitantes e registou-se, desde 1996, um aumento do nmero de casos graves de doena (Sousa & Bacellar, 2004). No entanto, a sub-notificao dificulta a caracterizao da afeco no pas estimando-se que ocorram sete vezes mais casos por ano do que os que so declarados (Sousa & Bacellar, 2004). 10

Em humanos considerada uma doena sazonal sendo que, em Portugal, 85% dos casos clnicos so relatados entre Julho e Setembro, com um mximo de casos declarados em Agosto (Sousa & Bacellar, 2004). Em relao aos candeos, a maioria das amostras para pesquisa de agentes transmitidos por vectores, no geral, tambm submetida a diagnstico entre Julho e Setembro (. Xufre coordenadora Laboratrio DNAtech comunicao pessoal, Maro 26, 2008). No entanto, dois estudos realizados em Portugal, um no Canil Municipal de Setbal (Bacellar et al., 1995a) e outro numa populao de candeos do Algarve (Alexandre, 2005), concluram que no existe sazonalidade na seroprevalncia de febre botonosa em candeos. Devido ao aquecimento global, os ixoddeos encontram condies para sobreviver durante todo o ano, especialmente aqueles que esto bem adaptados ao ambiente familiar, completando os seus ciclos de vida de forma muito mais eficiente. Por isso, a febre botonosa no deve ser mais caracterizada como sendo uma doena sazonal, devendo tambm estar includa nos diagnsticos diferenciais nos meses de Outono e Inverno (Sousa, Luz, Parreira, Santos-Silva & Bacellar, 2006c).

5.1.2. Estudos de seroprevalncia e factores de risco em candeos Em Portugal j foram realizados diversos estudos de seroprevalncia de R. conorii em candeos (Tabela 3). Num universo de 104 ces alojados no Canil Municipal de Setbal e sem sinais de doena, 85,6% tinha anticorpos contra R. conorii (Bacellar et al., 1995a). Em 1999, um outro estudo realizado em diferentes populaes de ces (militares, populao rural e populao urbana), concluiu que a prevalncia de anticorpos contra R. conorii era de 38%, 36% e 11% respectivamente, sendo que a seroprevalncia na totalidade da amostra foi de 85% (Nncio, Bacellar & Filipe, 1999). Alexandre (2005) encontrou seroprevalncias de R. conorii mais baixas (38,5%) num estudo realizado em candeos da regio do Algarve. Os valores de seroprevalncia devem, no entanto, ser interpretados com alguma reserva, pois existem alguns aspectos que so passveis de induzir em erro. Por um lado, R. sanguineus no apenas vector de R. conorii, mas tambm de outros organismos do grupo das febres exantemticas j isolados em Portugal (Tabela 4). Por outro lado, os candeos podem ser parasitados por outros ixoddeos vectores de outras riqutsias do grupo das febres exantemticas como por exemplo, membros do gnero Dermacentor. As riqutsias transmitidas por estas carraas, quer tenham capacidade patognica conhecida quer no, induzem produo de anticorpos (Bacellar, Nncio, Alves & Filipe, 1995c). Apesar de serem dirigidos contra outros agentes, estes anticorpos podem fazer reaces imunitrias cruzadas com os anticorpos anti-R. conorii e todos eles so detectados, pela tcnica de pesquisa de anticorpos, 11

como dirigidos contra R. conorii, pois a serologia no distingue a espcie de riqutsia infectante. Este fenmeno pode elevar erradamente a seroprevalncia de R. conorii. Foram tambm realizados vrios estudos no sentido de associar seroprevalncia contra R. conorii com alguns factores de risco como presena de ixoddeos, idade, sexo, aptido, habitat e estao do ano. Em Espanha, Delgado e Crmenes (1995), concluram que h uma maior seroprevalncia deste agente em animais provenientes de zonas rurais utilizados em actividades de pastoreio e em animais parasitados por ixoddeos. Constataram tambm que a frequncia de ces seropositivos superior nos meses de Vero. Um estudo publicado em 2006 concluiu que ces machos so mais susceptveis a possuir anticorpos contra R. conorii (Solano-Gallego, Llull, Osso, Hegarty & Breitschwerdt, 2006b). Melgrati et al. (citado por Alexandre 2005) no encontraram relao entre seropositividade para R. conorii com factores como comprimento e cor do plo, sexo e residncia, mas verificaram que ces com idade superior a dois anos possuam uma seroprevalncia superior aos de idade inferior (44 vs 30%). Alexandre (2005) tambm concluiu que idade superior a dois anos um factor de risco para seropositividade para R. conorii explicando esta dependncia de variveis pelo maior nmero de oportunidades de exposio ao vector, e consequentemente ao agente, medida que a idade dos animais avana.

5.1.3. Vector: caractersticas e ciclo biolgico Com excepo da R. akari e da R. felis, que so transmitidas respectivamente por caros gamasdeos e pulgas, todas as outras espcies de Rickettsia do grupo das febres exantemticas so transmitidas exclusivamente por ixoddeos (Sousa et al., 2003). Existe uma certa especificidade entre a riqutsia infectante e o ixoddeo vector, embora a mesma riqutsia possa ter mais do que um vector. Pelo contrrio, estudos (Macaluso, Sonenshine, Ceraul & Azad, 2002) apoiam que o mesmo vector no pode ser infectado por mais do que uma riqutsia pois existem mecanismos inibitrios entre elas. Ou seja, as riqutsias competem pelo microambiente dentro do ixoddeo e criam mecanismos que impedem a infeco por outras riqutsias. No entanto, j foram encontradas carraas infectadas com vrios agentes e acredita-se que estes vectores com infeces mltiplas existem na natureza e que tm um papel vital na manuteno das riqutsias (Hechemy, Oteo, Raoult, Silverman & Blanco, 2006). Como j foi referido, o vector de R. conorii em Portugal uma carraa da famlia Ixodidae: Rhipicephalus sanguineus, vulgarmente designado por carraa castanha do co (Figura 5).

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Figura 5- Rhipicephalus sanguineus

in http://creatures.ifas.edu/urban/medical/brown_dog_tick.htm

Em cima: Esquerda: ninfa; Direita: larva Em baixo: Adultos (Esquerda: fmea; Direita: Macho)

Para alm de vector, este ixoddeo pode tambm pode actuar como reservatrio do agente, sendo responsvel pela sua perpectuao na natureza (Dantas-Torres, 2008). A espcie R. sanguinueus existe em quase todas as regies do Mundo, com excepo das zonas circumpolares (Silva, Santos, Formosinho & Bacellar, 2006). Estes ixoddeos so encontrados em todo o pas, porm as suas densidades populacionais so mais elevadas no Sul (Alexandre, 2005). As caractersticas e ciclo biolgico deste parasita esto resumidos na tabela 5 e figura 6 (Espuny, 1999; Silva et. al, 2006). Tabela 5- Caractersticas biolgicas de Rhipicephalus sanguineus Caractersticas Fases de vida livre e parasitria Estdios de desenvolvimento: Ovo, Larva, Ninfa, Adulto Ciclo de vida de 3 hospedeiros Mono1 ou Ditrpico2 Adultos comportamento exoflico3 Formas imaturas comportamento endoflico3 Hematfagos estritos4
1-Todas as fases evolutivas se alimentam no mesmo hospedeiro. 2- As formas imaturas alimentam-se de micromamferos ou pequenos mamferos silvticos e as adultas procuram hospedeiros de maior porte. 3- Disperso relativamente ao local onde eclodiram. Comportamento endoflico: mantm-se prximos da zona onde eclodiram e evoluem habitualmente no local onde os hospedeiros se refugiam. Estadios exoflicos: tendem a afastar-se mais. 4- Fmeas fixam-se e alimentam-se de uma vez s; Machos alimentam-se de forma intermitente.

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Apesar das caractersticas referidas, existem algumas populaes destes ixoddeos que vivem em estreita dependncia do seu hospedeiro preferencial (o co) pelo que, nestes casos, o seu ciclo biolgico essencialmente monotrpico e endoflico e tanto as formas imaturas, como os adultos, alojam-se nos canis ou dentro das prprias habitaes dos humanos (Silva et al., 2006). Figura 6- Ciclo biolgico de Rhipicephalus sanguineus

Durante o seu ciclo de vida, as diferentes fases evolutivas de R. sanguineus podem passar vrios dias fora do hospedeiro, podendo sobreviver mais de 568 dias no solo (Espuny, 1999). Este ciclo condicionado por factores como temperatura, humidade relativa, fotoperodo e a disponibilidade de hospedeiros vertebrados (Silva et al., 2006; Alexandre, 2005). Quando as condies ambientais so favorveis, o ciclo de vida deste ixoddeo pode completar-se em 63 dias com posturas na ordem dos 5000 ovos (Espuny, 1999; Silva et al., 2006). Em condies de laboratrio, estes ixoddeos, podem sobreviver e manter-se activos de 8C a 40C, desde que seja respeitada uma humidade relativa de 45%, pelo que este ltimo um parmetro considerado limitante na sobrevivncia dos vectores (Sousa & Bacellar, 2004). Em Portugal, o aumento das temperaturas durante os meses de Inverno e a diminuio da pluviosidade, favorecem a actividade de R. sanguineus durante todo o ano (Caeiro, 1999). Apesar de se alimentarem preferencialmente em ces, estes ixoddeos podem parasitar outros animais domsticos, animais silvticos e tambm o Homem. Pensa-se que os estados imaturos, por serem menos especficos em relao ao hospedeiro, sejam os responsveis pela transmisso da infeco a humanos, principalmente no Vero (Mannelli et al., 2003), altura em 14

que esto mais activos. Sendo assim, o parasitismo do Homem por este ixoddeo fortuito e, consequentemente, este um hospedeiro acidental no ciclo epidemiolgico de R. conorii (Alexandre, 2005).

5.1.4. Hospedeiros reservatrio de R. conorii Segundo Bacellar (1996), os potenciais hospedeiros reservatrio de R. conorii podem ser divididos em trs grupos:
-

Animais silvticos como membros das famlias Muridae (Apodemus sylvaticus rato do campo), Insectvora (Erinaceus europaeus ourio-cacheiro), Lagomorpha (Oryctolagus cuniculus - coelho); Espcies cinegticas de grandes mamferos como o javali (Sus scrofa ferus), o veado (Cervus elaphus) e o gamo (Dama dama); Animais domsticos;

Em relao aos animais domsticos, estudos serolgicos j revelaram exposio de ces, gatos, ovinos, caprinos e bovinos a R. conorii (Alexandre, 2005). Contudo, ainda no se conseguiu isolar R. conorii de hospedeiros vertebrados infectados de forma natural (Alexandre, 2005). Por isso o seu papel no ciclo de transmisso deste agente necessita de ser esclarecido (Manelli et al., 2003). Estudos experimentais realizados em pequenos roedores confirmaram que estes, para alm de serem sensveis infeco, desenvolvem riquetsimia durante tempo suficiente para infectar os ectoparasitas durante a sua refeio de sangue (Bacellar, 1996). Pelo contrrio, os candeos no possuem as condies ideais para serem reservatrio deste agente pois a sua riquetsimia transitria (Kelly et al., 1992; R. Sousa, comunicao pessoal, Maro 6, 2008). Contudo, o papel dos ces na epidemilogia deste agente de extrema importncia na medida em que so os hospedeiros preferenciais do vector (Organizao Mundial de Sade, 2004).

5.1.5. Formas de infeco dos vectores As carraas podem ficar infectadas com o agente durante a sua refeio de sangue em hospedeiros vertebrados de pequeno porte e riquetsimicos, no entanto, pensa-se que a maior parte da transmisso ocorra pelas vias transtadial e transovrica. Ocorre infeco transovrica, quando os ovrios e ocitos de uma fmea adulta ficam infectados, o que permite a transmisso vertical entre geraes. A partir do momento em que um ovo de ixoddeo est infectado, as carraas mantm-se infectadas durante a transio para estados evolutivos superiores, da ocorrer transmisso transtadial. Quando as riqutsias so transmitidas de forma 15

eficiente, tanto pela via transtadial como transovrica, o ixoddeo serve de reservatrio para a bactria e a distribuio desta riquetsiose idntica do seu vector (Parola & Raoult, 2001). Aps a infeco das carraas, ocorre replicao do agente no trato digestivo do vector. A partir daqui, as riqutsias espalham-se e multiplicam-se noutros tecidos da carraa inclundo glndulas salivares e ovrios. Durante os perodos em que a carraa no se alimenta, e visto que estas podem sobreviver por longos perodos de tempo fora de um hospedeiro vertebrado (Baneth et al., 1998; Espuny, 1999), ocorrem alteraes morfolgicas nas riqutsias mas estas no morrem. Pelo contrrio, quando so fornecidas condies ambientais mais favorveis ou depois de uma refeio por parte do vector, a virulncia inicial da bactria restituda (Parola et al., 2005). Este fenmeno conhecido por reactivao (Parola et al., 2005). Um estudo realizado em ixoddeos em Portugal (Alexandre, 2005) detectou, pela tcnica de PCR, riqutsias do grupo das febres exantemticas em 22,2% das carraas R. sanguineus colhidos no Sul do pas. Contudo, este valor no corresponde na sua totalidade a R. conorii porque os primers utilizados amplificaram tambm ADN de riqutsias no patognicas (Alexandre, 2005). Um estudo de Bacellar et. al (citado por Alexandre, 2005), resultado da colheita sistemtica de ixoddeos entre 1991 e 2001, concluiu que apenas 1% dos espcimens estava infectado com R. conorii, enquanto que em 27% destes foram isoladas riqutsias consideradas no patognicas. Segundo os autores, as riqutsias no patognicas possuriam mecanismos que impediam a infeco dos vectores por riqutsias patognicas, da esta diferena de resultados. Estudos publicados noutros pases encontraram valores semelhantes aos portugueses. Na Scilia, a percentagem de carraas desta espcie infectadas por R. conorii de 19,7% enquanto que em Israel 7,3% (Solano-Gallego et al., 2006b). Em Espanha, Mrquez et al. (2008), s detectaram R. conorii num espcimen de R. sanguineus numa amostra de 132 ixoddeos desta espcie e 388 R. turanicus. Pelo contrrio, R. massilae foi identificada em 48 ixoddeos dos gneros Rhipicephalus e Ixodes (Mrquez et al., 2008). Portanto, a percentagem de carraas infectadas bastante inferior de candeos. Esta constatao pode ser explicada pelo facto de algumas riqutsias, como R. conorii, tambm serem patognicas para os vectores, havendo uma elevada taxa de letalidade nos parasitas infectados (R. Sousa, comunicao pessoal, Maro 6, 2008).

5.1.6. Ciclos epidemiolgicos Numa riquetsiose, geralmente, existe um foco primrio que envolve os pequenos mamferos que so parasitados pelos vectores (Bacellar, 1996). Num segundo foco, actuam as influncias de animais domsticos e sinatrpicos, que vo ser a fonte de infeco para os humanos

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(Bacellar, 1996). Assim, existem dois ciclos de transmisso de febre botonosa: um ciclo domstico e um ciclo silvtico (Bacellar, 1996). O ciclo domstico estabelece-se entre o co e o Homem. Como j foi referido, a seroprevalncia de riquetsioses em ces e humanos est relacionada. Os ces, por estarem em grande proximidade com os vectores, podem traz-los para o ambiente humano e possibilitar a infeco destes ltimos. Em muitas cidades da Europa, as populaes de ces de companhia esto a crescer o que tem resultado no aumento da incidncia de casos de febre botonosa nas cidades (Organizao Mundial de Sade, 2004). Nas zonas rurais, a proximidade do Homem com estes animais grande e, portanto, a exposio ao vector tambm (Organizao Mundial de Sade, 2004). Segundo Espejo et al. (1993), 92% dos pacientes afectados por esta doena em Espanha possuem ou tiveram contacto com candeos. Nos E.U.A., foram descritos casos de febre das Montanhas Rochosas que primeiro afectaram candeos e depois o seu dono (Elchos & Goddard, 2003). Desta forma, os ces podem ser considerados como sentinelas da doena humana (Kidd, 2006). O ciclo silvtico mantido por diversas espcies de animais como coelhos, lebres, roedores e diversas espcies cingicas que j foram referidas anteriormente. Apesar de no serem indispensveis no ciclo natural das riquetsias, estes animais tm um papel primordial na manuteno e disperso dos vectores infectados (Manelli et al., 2003).

5.1.7. Vias de infeco dos hospedeiros R. conorii inoculada pela picada indolor de qualquer um dos estados evolutivos da carraa do co, Rhipicephalus sanguineus (Lpez et al., 2007), durante a sua refeio sangunea. Muitas vezes, quer em animais, quer em humanos, no h histria de paratismo por ixoddeos. Para que ocorra transmisso da infeco, o ixoddeo tem de se alimentar durante seis a vinte horas no hospedeiro (Bacellar, 1998). Este perodo tambm necessrio para que ocorra replicao das riqutsias nas glndulas salivares dos vectores durante a sua alimentao (Greene & Breitschwerdt, 2006). Apesar da infeco por picada do ixoddeo necessitar de contacto prolongado com o hospedeiro, o mesmo no acontece com o contacto de membranas mucosas com fezes ou hemolinfa das carraas, contacto com animais de laboratrio infectados, culturas de clulas ou sangue de mamfero, que constituem formas de infeco mais rpidas (Greene & Breitschwerdt, 2006). Este tipo de transmisso mecnica pode ocorrer em humanos (Greene & Breitschwerdt, 2006). O risco das carraas transmitirem riqutsias est relacionado com o nmero de carraas infectadas numa determinada regio, com a afinidade ixoddeo-hospedeiro e com a abundncia

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dos vectores em si (Raoult & Roux, 1997). Este ltimo factor est dependente das condies climticas e ecolgicas (Raoult & Roux, 1997).

5.1.8. Patogenia Considera-se que os mecanismos de patogenicidade das riqutsias, no geral, so semelhantes, pelo que vai ser apresentado um sumrio generalizado de estudos realizados em diversas espcies destas bactrias (Figura 7). Os agentes transmitidos por ixoddeos, genericamente, podem causar doena aguda ou crnica em hospedeiros susceptveis (Baneth et al., 1998). Outros hospedeiros recuperam espontaneamente pela eliminao dos agentes ou assumem estado de portador, possuindo infeces assintomticas ou subclnicas, que exarcebam com factores de stress ou doenas concomitantes (Shaw et al., 2001). Por isso, apesar do curso de patogenia referido em seguida, podem ser encontrados candeos com infeces assintomticas ou subclnicas infectados (de forma natural ou experimental) com riqutsias (como R. rickettsii ou R. conorii) (Kelly et al., 1992; Greene & Breitschwerdt, 2006; Solano-Gallego et al., 2006b).

Figura 7- Patogenia de Rickettsia spp.

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Aps a inoculao das riqutsias pelos vectores, estas disseminam-se pelo sistema circulatrio e invadem e replicam-se nas clulas endoteliais de pequenas arterolas e vnulas que constituem os principais alvos da infeco por R. conorii (Greene & Breitschwerdt, 2006; Kidd, 2006). A ligao a receptores das clulas alvo (que ainda no esto bem conhecidos) induz alteraes no citosqueleto da clula (Walker et al., 2003). A clula responde a estas alteraes trazendo para o seu interior a poro da membrana lesionada e neste processo, a riqutsia tambm levada para dentro da clula (Mac Dade, 1998). Este um mecanismo de fagocitose induzida em que, tanto as riqutsias, como as clulas endoteliais, participam no processo. Ainda antes de serem expostas s enzimas lisossomais, as riqutsias escapam dos fagossomas (possivelmente por mecanismos que envolvem a actividade da fosfolipase A2) e proliferam no citosol multiplicando-se por diviso binria (Valbuena, Feng & Walker, 2002; Walker et al., 2003). As riqutsias do grupo das febres exantemticas podem movimentar-se de clula em clula e sem lhes causar ruptura, atravs da reorganizao de filamentos de actina (Heinzen et al., 1999; Walker et al., 2003). Os danos nas clulas endolteliais, iniciam um processo de vasculite generalizada que pode ser causada pela activao do sistema complemento, quimiotaxia celular e subsequente necrose vascular e extravaso de sangue (Greene & Breitschwerdt, 2006). Concomitantemente, ocorre activao do sistema de coagulao e do sistema fibrinoltico (Greene & Breitschwerdt, 2006). A vasculite culmina num aumento da permeabilidade vascular que leva a acumulao de fluidos intersticiais nos tecidos vizinhos, originando edema (que pode tambm ser cerebral ou pulmonar) e perda de volume vascular. Como consequncia, pode ocorrer hipovolmia, que tem como resultado a diminuio da perfuso sangunea a vrios rgos, com consequncias associadas ao rgo em questo. Simultaneamente, ocorrem hemorragias microvasculares e surge trombocitopnia cuja principal causa aparenta ser imunomediada (Greene & Breitschwerdt, 2006). As petquias que se observam na pele de doentes infectados por R. conorii so o resultado de todo este processo de vasculite (Alexandre, 2005).

5.1.9. Resposta imunitria Qualquer que seja o curso da infeco (assintomtica, subclnica, aguda, crnica), secundariamente invaso das clulas endoteliais, ocorre uma resposta imunolgica com consequente produo de anticorpos (Baneth et al., 1998). Portanto, podem ser encontrados anticorpos anti-riqutsias do grupo das febres exantemticas em ces saudveis (Greene & Breitschwerdt, 2006). Estes anticorpos podem ser uma consequncia de infeces assintomticas ou subclnicas ou o resultado de exposio a riqutsias no patognicas (Greene & Breitschwerdt, 2006). 19

A resposta imunitria desenvolvida predominantemente celular e desencadeada pelas prprias clulas endoteliais envolvendo produo de vrias citoquinas (quer pelas clulas endoteliais, quer no endoteliais), estimulao da resposta de fase aguda e activao de fagcitos e clulas NK (Valbuena et al., 2002). Igualmente, ocorre expresso de molculas de adeso e quimocinas que vo activar o papel dos leuccitos (Valbuena et al., 2002). O mecanismo de eliminao das riqutsias por parte das clulas endoteliais envolve induo de apoptose mediada por citoquinas e inicia-se por activao da morte intraendotelial destes organismos. O FNT e o INF, este ltimo produzido pelas clulas NK no incio da infeco, actuam sinergicamente para activar a sintase-2 de xido ntrico que acabar por destruir as riqutsias intracelulares (Walker et al., 2003). Posteriormente, a remoo das clulas feita por linfcitos T citotxicos CD8. A imunidade humoral particularmente dirigida para epitopos das protenas OmpA e OmpB (Walker et al., 2003) e pode tambm ter um papel importante na eliminao das riqutsias e na proteco contra reinfeco (Valbuena et al., 2002). Anticorpos administrados a ratinhos, quatro ou cinco dias aps estabelecimento de infeco, reduziram significativamente os contedos infecciosos de riqutsias no bao, pulmes e fgado 24 a 48 horas depois, e prolongaram a sua vida em doze dias em mdia (Feng, Whitworth, Olano, Popov & Walker, 2004). Feng et al. (2004) concluram que soros hiperimunes e alguns anticorpos monoclonais contra OmpA ou OmpB conferiram proteco completa contra riqutsias, ao contrrio de anticorpos contra o LPS que revelaram ser no protectores. A imunidade adquirida naturalmente tem um papel importante na proteco contra a doena clnica e, aparentemente, de longa durao (Greene & Breitschwerdt, 2006; Kidd, 2006). Em ces infectados experimentalmente, o contacto imunognico com R. rickettsii, induz uma resposta protectora de reinfeco at trs anos (Greene & Breitschwerdt, 2006). A reinfeco com R. ricketsii no foi induzida em ces infectados experimentalmente e no foi documentada em ces ou humanos infectados naturalmente (Breitschwerdt et al., 1990). Em relao a R. conorii j foram detectados anticorpos contra este agente 750 dias depois do primeiro resultado positivo (Tesouro et al., 1998), o que revela que os anticorpos contra este agente tambm persistem durante muito tempo. A compreenso dos mecanismos de imunidade contra as riqutsias e o seu papel na patogenia e eliminao das mesmas, iria permitir a descoberta de vacinas eficientes, assim como estratgias de interveno para controlar infeces avanadas nas quais os antibiticos, por si, no conseguem evitar complicaes secundrias, incluindo a morte (Valbuena et al., 2002).

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5.1.10. Quadro clnico Apesar das seroprevalncias de R. conorii registadas em candeos portugueses e de outros pases endmicos (Tabela 3), existem poucos estudos que identificaram R. conorii em ces doentes. Pelo contrrio, muitos artigos publicados consideram que este agente no provoca doena nestes animais. O perodo de incubao de R. conorii em candeos foi determinado apenas por infeces experimentais, observando-se leses entre os trs e os sete dias ps-inoculao (Kelly et al., 1992). Neste mesmo estudo, concluiu-se que a riquetsimia nos ces detectvel, de forma intermitente, entre o segundo e o dcimo dia aps infeco (Kelly et al., 1992). Kelly et al. (1992) inocularam, experimentalmente, ces com uma estirpe de R. conorii do Zimbabwe. Para alm de eritema local, dor e linfadenopatia regional no se verificaram outros sinais clnicos ou alteraes hematolgicas. Contudo, todos os animais desenvolveram anticorpos IgM e IgG contra R. conorii. Solano-Gallego et al. (2006b), no encontraram associao entre seroreactividade e doena clnica nestes animais. As causas para a falta de associao de infeco por este agente e desenvolvimento de quadro clnico em candeos, ainda no esto bem esclarecidas (Kidd, 2006). Os ces podem no ser to susceptveis doena como as pessoas, talvez devido a adaptao do agente ao vector e ao co (Kidd, 2006). Outra hiptese, que seja necessrio que os animais estejam imunocomprometidos ou exibam alteraes metablicas para apresentarem sinais clnicos (Kidd, 2006), por exemplo no caso de co-infeces com L. infantum. Pode tambm acontecer que as infeces por este agente sejam de carcter agudo, auto-limitantes e no especficas o que, combinado com a falta de suspeio por parte dos mdicos veterinrios atrasou a associao de infeco com R. conorii a sinais clnicos em ces (Solano-Gallego et al., 2006a). No entanto, alguns trabalhos concluram que este agente pode provocar doena em candeos (Tabela 6).

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Tabela 6- Estudos que associaram infeco natural por R. conorii com quadro clnico em candeos Estudo Baneth et al. (1998) Font et al. (citado por Alexandre, 2005) Mtodo de diagnstico Imunofluorescncia Indirecta Imunofluorescncia Indirecta Febre, letargia, linfadenomeglia Febre, anorexia, depresso, linfadenomeglia, petquias, equimoses Kidd (2006); Solano-Gallego et al. (2006a) Imunofluorescncia Indirecta e PCR Febre, anorexia, letargia, taquicardia, linfonodos poplteos aumentados, cifose, andamentos rgidos, dor articular, conjuntivite, blefarite Alexandre (2005); Alexandre (no publicado) Baneth et al. (1998) estudaram 40 candeos com sintomas suspeitos de doena transmitida por ixoddeos, realizando deteco de anticorpos, pela tcnica de Imunofluorescncia Indirecta, contra vrios agentes: Babesia gibsoni, Ehrlichia canis, Rickettsia conorii estirpes Morrocan e Israeli Tick Typhus, Borrelia burgdorferi e Bartonella vinsonii. Em 20 destes candeos, a pesquisa de anticorpos foi feita com base em duas amostras colhidas com duas semanas de intervalo, para averiguar se ocorreria seroconverso (aumento de quatro vezes ou mais do ttulo de anticorpos) e, assim, afirmar a presena de uma infeco recente. Trs destes animais seroconverteram para duas estirpes de R. conorii o que, segundo os autores, apoia a possibilidade deste agente causar sinais clnicos em candeos. Um dos ces era um cachorro de trs meses que apresentava febre, letargia e linfadenomeglia. Aps tratamento com doxiciclina, estes sintomas ficaram resolvidos. 22 PCR Febre, anorexia, petquias Neutrofilia, trombocitopnia, anemia, hipoproteinmia, hipoalbuminmia, aumento ALT, 1 e 2 globulinas e -2 globulina e protena C reactiva Trombocitopnia, leucopnia, anemia Leucocitose/leucopnia, anemia, trombocitopnia Sinais clnicos Alteraes hematolgicas -

Em 2006, foram publicados dois estudos (Kidd, 2006; Solano-Gallego, 2006a) sobre trs ces Italianos com infeco aguda por R. conorii e sinais clnicos. Os trs ces foram apresentados a consulta entre Maio e Setembro de 2005. Pertenciam raa Yorkshire Terrier e tinham idades compreendidas entre os dois e os seis anos. Todos eles tinham histria prvia de infestao por carraas. No exame fsico, foram encontradas anomalias inespecficas com alguns dias de durao e que poderiam ser compatveis com doena transmitida por ixoddeos (Tabela 6) (Kidd, 2006). Nas anlises bioqumicas verificou-se aumento de ALT (alanino-aminotransferase) e hipoproteinmia. A electroforese de protenas revelou hipoalbuminmia e aumento ligeiro de 1 e 2-globulinas e 2-globulina. Os trs animais possuam protena C reactiva aumentada. Este um marcador no especfico de inflamao e que tambm se encontra aumentado em pacientes humanos com febre exantemtica (Kidd, 2006). Foram enviadas amostras de sangue para PCR e serologia (tcnica de Imunofluorescncia Indirecta) para pesquisa de vrios agentes: Ehrlichia canis, gnero Rickettsia, Leishmania infantum, gnero Babesia, Borrelia burgdorferi e Anaplasma phagocytophilum. Os antignios utilizados na tcnica de Imunoflurescncia Indirecta para pesquisa de Babesia e Rickettsia foram Babesia canis, Rickettsia conorii e R. rickettsii. Para ambas as tcnicas, foram enviadas trs amostras de cada animal, correspondendo a diferentes etapas do tratamento. Atravs do sequenciamento de fragmentos do gene ompA amplificados por PCR concluiu-se que estes correspondiam a estirpe Malish de R. conorii (Kidd, 2006). Nenhum dos outros agentes foi identificado por PCR (Kidd, 2006). Os resultados da serologia para R. conorii corroboram a hiptese de infeco activa, na medida em que houve um aumento do nmero de anticorpos em quatro vezes da primeira para a segunda titulao em dois dos ces e, no outro animal, o ttulo de IgM inicial era muito elevado e, 65 dias depois j tinha diminudo (Kidd, 2006). No entanto, para alm de detectar anticorpos contra este agente, a serologia teve resultados positivos contra outros organismos pesquisados. Portanto, e apesar de R. conorii ter sido o nico agente identificado por PCR, no se pode afastar a possibilidade de que co-infeco com Ehrlichia canis, Babesia, Borrelia burgdorferi e Anaplasma phagocytophilum, possa ter contribudo para os sinais clnicos apresentados, j que a serologia identificou anticorpos contra vrios agentes (Kidd, 2006). De facto, em ces da zona mediterrnea, est documentada associao entre anticorpos contra R. conorii, E. canis e A. phagocytophilum (Solano-Gallego et al., 2006b) e tambm se sabe que a infeco com um agente pode alterar a susceptibilidade do hospedeiro para outros organismos (Thomas, Anguita, Barthold & Fikrig, 2001; Stoicov et al., 2004). A contrariar estes factos e a apoiar a relao de R. conorii com doena clnica em ces, est o facto de o PCR ter tido resultados positivos na primeira mas no nas restantes amostras, o que coincidiu com o resolver dos sinais clnicos, e o

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facto do prprio laboratrio ter posto de parte erros tcnicos (como contaminao) que poderiam ter influenciado os resultados (Kidd, 2006). Em Portugal, Alexandre (2005) amplificou ADN de Rickttesia conorii a partir do buffy coat obtido de candeos com sintomas suspeitos de doena transmitida por ixoddeos. Mais tarde, conseguiu identificar a estirpe da riqutsia em questo: R. conorii estirpe Malish e R. conorii estirpe Israeli Tick Typhus (Alexandre, no publicado). Contudo, ainda no se conseguiu fazer isolamento deste agente em candeos (Alexandre, 2005). Sendo assim, existem j vrios casos de ces com sintomas clnicos em que foi detectada R. conorii por mtodos de biologia molecular. Por estas razes e, de acordo com os resultados de Alexandre (2005), a infeco por microrganismos do gnero Rickettsia deve ser considerada entre os diagnsticos diferenciais de quadros sintomatolgicos que incluam febre, anorexia e petquias, associados a anomalias laboratoriais como trombocitopnia, leucopnia e anemia. Em humanos, ao contrio dos ces, o quadro clnico de febre botonosa est geralmente bem definido caracterizando-se, tradicionalmente, por febre, exantema e escara de inoculao (Sousa & Bacellar, 2004). A escara de inoculao surge em 30 a 70% dos casos e consiste numa lcera com centro necrtico resultante da leso traumtica causada pela introduo do aparelho bucal do ixoddeo e pelas leses celulares causadas pelas riqutsias (Sousa, et al. 2003, Bacellar, 1998). O perodo de incubao de cerca de cinco a sete dias (Bacellar, 1996) e a riquetsimia ocorre durante um perodo de tempo muito curto, pelo que o Homem o elo terminal na cadeia de infeco (Alexandre, 2005). Desde 1996, registou-se um aumento do nmero de casos graves de doena e estes podem mesmo ser fatais (Sousa & Bacellar, 2004; Amaro et al., 2003). Em termos de alteraes laboratoriais, esto descritas leucocitose com neutrofilia ou neutropnia, anemia normcitica moderada, trombocitopnia, aumento velocidade de sedimentao, diminuio actividade de protrombina, aumento das enzimas hepticas e de algumas enzimas musculares, como creatinofosfocinase, aldolases e lactato desidrogenase, e alteraes da funo renal com elevao da creatinina, hiponatrmia e hipoclormia (Poas, Bacellar & Filipe, 2002).

5.1.11. Diagnsticos diferenciais Anteriormente, foram descritos alguns dos sinais e sintomas que so provocados por infeco por R. conorii em ces. No entanto, so quadros muito inespecficos que obrigam a fazer diagnstico diferencial com outras patologias. A generalidade das doenas transmitidas por ixoddeos, tambm caracterizada por quadros clnicos inespecficos e com uma grande variedade de sinais, pelo que deve ser feito diagnstico diferencial com estas patologias, nomeadamente erliquiose monoctica canina e babesiose. A borreliose de Lyme deve ser 24

includa nos diagnsticos diferenciais, em animais que apresentem sinais clnicos de poliartrite, como dor articular (Alexandre, 2005). Muitas vezes, a sintomatologia apresentada pode ser confundida com quadros clnicos de leishmaniose canina e por isso esta doena tambm deve ser includa nos diagnsticos diferenciais. A trombocitopnia a principal anomalia hematolgica da erliquiose monoctica canina (Alexandre, 2005) e, como j foi referido, tambm pode caracterizar as alteraes sanguneas decorrentes de febre botonosa. Este achado laboratorial pode ser confundido com trombocitopnia imunomediada primria. No entanto, os candeos com trombocitopnia imunomediada primria apresentam apenas quadros hemorrgicos, no surgindo febre ou linfadenopatia (Tilley & Smith, 2000). Em animais com hemorragias, deve ser descartada a hiptese de ingesto de anticoagulantes rodenticidas. Nestes casos vai haver alterao dos tempos de coagulao com aumento do tempo de coagulao activado, e tempos de protrombina e tromboplastina activadas, enquanto que em doenas transmitidas por ixoddeos o perfil de coagulao est normal sendo a hemorragia causada por trombocitopnia ou trombopatia (Alexandre, 2005). Para alm das referidas, todas as doenas que possam provocar febre, anorexia, trombocitopnia, leucopnia e /ou anemia devem ser descartadas.

5.1.12. Diagnstico laboratorial Apesar de o exame clnico ser parte essencial do diagnstico, a sintomatologia encontrada inespecfica e, para alm disto, existe possibilidade de co-infeco com outras doenas transmitidas por ixoddeos e outros vectores. Por estas razes, o diagnstico laboratorial assume maior relevo que o diagnstico clnico, para se obter um diagnstico definitivo (Alexandre, 2005). Devido natureza intracelular destes microrganismos, os mtodos tradicionais utilizados em bacteriologia no podem ser aplicados no diagnstico (Parola et al., 2005). Existem, no entanto, vrios mtodos complementares de diagnstico disponveis para identificao de Rickettsia spp., desde serologia a tcnicas de biologia molecular (Figura 8). Os mtodos mais eficientes no diagnstico laboratorial de uma infeco aguda so os que detectam riqutsias directamente (La Scola & Raoult, 1997).

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Figura 8 Diagnstico de Rickettsia spp.

a) Diagnstico indirecto A deteco de anticorpos (Ac) a tcnica mais usada para diagnstico de riquetsioses na prtica clnica. Existem vrios mtodos de deteco de anticorpos anti-riqutsia (Esquema 4) como o mtodo Weil-Felix, a Imunofluorescncia Indirecta, a Fixao de Complemento, o teste de Microaglutinao, a Aglutinao em Ltex, o teste de ELISA (Enzime-Linked Immunoabsorbent Assay), o Western immunoblot, entre outros, mas nem todos podem ser realizados por laboratrios de rotina. O mtodo Weil-Felix, desenvolvido em 1916, o mais antigo de todos. Baseia-se na reaco de aglutinao das clulas totais de antignios do gnero Proteus quando postas em contacto com soro de doentes que contraram uma riquetsiose (Bacellar, Miranda & Filipe, 1994). Os anticorpos que reagem com as riqutsias reagem igualmente com determinantes antignicos de superfcie de algumas espcies do gnero Proteus pelo que vo ser detectadas reaces cruzadas. Por ser um mtodo de baixa sensibilidade e especificidade, caiu em desuso (Sousa et al., 2003). No entanto, ainda utilizado em alguns pases em desenvolvimento. Pelo contrrio, a Imunofluorescncia Indirecta, a tcnica de deteco de anticorpos recomendada pela Organizao Mundial de Sade (Galvo et al., 2005) pelo que ser abordada mais aprofundadamente.

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Imunofluorescncia Indirecta (IFI)

Com este mtodo, possvel a deteco de IgM, IgG ou ambas (La Scola & Raoult, 1997). A identificao e a titulao de anticorpos IgM especficos para as vrias espcies de riqutsias fornecem indicao de uma infeco recente (La Scola & Raoult, 1997). Idealmente, devem ser enviadas duas amostras, soro ou plasma, para titulao com um intervalo de trs a quatro semanas, considerando-se que a infeco est activa quando o ttulo de anticorpos aumenta pelo menos quatro vezes entre as duas amostras (La Scola & Raoult, 1997). Pela serologia, um resultado positivo no implica doena clnica nem uma exposio recente ao agente (Kidd, 2006) pois, vrios estudos, indicam que animais infectados possuem anticorpos durante meses (Tesouro et al., 1998; Breitschwerdt et al., 1990). Estes ttulos persistentes podem representar exposies repetidas ao agente, exposio a outras riqutsias consideradas no patognicas ou plasmcitos com longos tempos de vida (Kidd, 2006). Por outro lado, um resultado de serologia negativo, no exclui a presena de doena porque pode no ter ocorrido ainda seroconverso (Greene & Breitschwerdt, 2006). Igualmente, baixos ttulos de anticorpos ou ttulos no detectveis nas diluies utilizadas como limiar de positividade, podem originar falsos negativos (Galvo et al., 2005). Outro aspecto que complica a interpretao dos resultados de serologia a co-infeco com outros agentes que pode originar reaces de anticorpos cruzadas, como j foi mencionado. Para alm disto, a espcie de riqutsia identificada, vai depender do antignio que utilizado nos mtodos de serologia. Para comprovar este facto, em 1990 foram reportados casos de riquetsiose humana na Argentina atribudos a R. conorii, por estudos serolgicos (Venzal et al., 2004). No entanto, tcnicas moleculares demonstraram que a espcie de Rickettsia em questo era R. parkeri (Venzal et al., 2004). A serologia apenas pode confirmar a presena de anticorpos contra o gnero Rickettsia, ou seja, que o animal foi exposto a uma riqutsia do grupo das febres exantemticas, no permite discriminar a espcie de riqutsia envolvida. Contudo, uma das vantagens desta tcnica, como mtodo de diagnstico, permitir o estudo evolutivo do ttulo de anticorpos, com base em medies em intervalos regulares: entre trs a seis meses, consoante o clnico e a disponibilidade do proprietrio (. Xufre, comunicao pessoal, Maro 26, 2008). Este ttulo pode variar ao longo do tempo, fornecendo, assim, indicao da necessidade de realizar novo tratamento (. Xufre, comunicao pessoal, Maro 26, 2008). Pelo contrrio, o PCR convencional d um resultado positivo ou negativo, no quantificando a amostra analisada.

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Portanto, a deteco de anticorpos contra um determinado antignio no soro de um co, pode ser devido a uma exposio anterior que resolveu, a uma infeco subclnica ou assintomtica que decorre no momento ou a uma infeco activa (Baneth et al., 1998). Por tudo isto e, segundo La Scola e Raoult (1997), esta tcnica s deve ser considerada para estudos seroepidemiolgicos em reas onde a seroprevalncia de riquetsioses esteja bem estabelecida. b) Diagnstico directo As tcnicas de diagnstico directo apresentam vantagens sobre aquelas de diagnstico indirecto por permitirem, na maioria das vezes, alcanar um diagnstico definitivo e especificar a espcie de riqutsia envolvida, mesmo quando os anticorpos no so ainda detectveis (Alexandre, 2005). Deteco de cidos nucleicos pela Reaco em Cadeia da Polimerase (PCR)

Segundo La Scola e Raoult (1997), esta , provavelmente, a tcnica de eleio na maioria dos laboratrios, para diagnstico precoce, ainda antes de existirem anticorpos detectveis por outras tcnicas. A tcnica de PCR permite detectar ADN do agente em amostras de sangue, mesmo que este surja em pequeno nmero em circulao, e consegue obter resultados positivos em pacientes seronegativos, pelo que pode ser til para diagnstico da doena em fases agudas. Alguns PCR revelaram mesmo ser mais sensveis que algumas tcnicas de cultura de clulas (Fournier & Raoult, 2004). Para alm do sangue, que deve ser colhido para tubos com EDTA ou citrato de sdio, podem ser utilizados material de bipsias de pele, tecidos frescos ou conservados em parafina ou lquido cefalo-raquidiano (La Scola & Raoult, 1997; Raoult & Roux, 1997). Em humanos, a escara de inoculao a leso ideal para fazer bipsia e o melhor material para PCR (La Scola & Raoult, 1997; Raoult & Roux, 1997). As tcnicas actuais de PCR, para diagnstico de riquetsioses em candeos, fazem amplificao de segmentos dos genes que codificam protenas tais como 17-kD, gltA (enzima citrato sintase), OmpA e OmpB (La Scola & Raoult, 1997). Os resultados falsos negativos so um dos problemas da tcnica de PCR e podem ser devidos a destruio do material gentico pelas DNases ou RNases, pela inibio da reaco pelo io Fe2+ ou pela heparina (Galvo et al., 2005).

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Isolamento de Rickettsia conorii em cultura de clulas

O isolamento de riqutsias em cultura a melhor forma de obter um diagnstico definitivo sobre a espcie de riqutsia, embora no seja um mtodo de diagnstico rpido (Bacellar & Sousa, 2004). Em relao ao PCR, esta tcnica tem a vantagem de poder ser utilizada noutro tipo de investigaes para alm da realizao de um diagnstico, como por exemplo em estudos com antibiticos (. Xufre, comunicao pessoal, Maro 26, 2008). Apesar disto, esta tcnica s pode ser realizada em laboratrios de referncia, com nvel 3 de biosegurana, pois acarreta alguns perigos para os trabalhadores devido a possibilidade de infeco dos mesmos (Sousa et al., 2003). Para isolamento, as amostras devem ser colhidas antes do incio da antibioterapia, mantidas em refrigerao a 4C e congeladas a -80C ou processadas em 24 a 48 horas. (Galvo et al., 2005). As amostras incluem buffy coat de sangue heparinizado, sangue total heparinizado ou em EDTA, plasma, material de necrpsia ou material de bipsia (Galvo et al., 2005; La Scola & Raoult, 1997). Vrios mtodos foram utilizados, ao longo dos anos, para isolar este agente, como inoculao em animais de laboratrio ou ovos embrionados, mas o mtodo de eleio, hoje em dia, a cultura de clulas por shell-vial. Para cultura, podem ser utilizadas clulas Vero, L929 e outras (Bacellar & Sousa, 2004). Aps a inoculao, feita centrifugao, passo essencial pois aumenta a fixao e a penetrao das riqutsias nas clulas, aumentando assim a sensibilidade da tcnica (La Scola & Raoult, 1997). Posteriormente, so realizados outros procedimentos para verificar o crescimento do agente, variveis consoante o laboratrio (como IFI, colorao Giemsa ou Gimenez) (Kidd, 2006). Depois de se obter um isolado, so realizadas as tcnicas para identificao da espcie de riqutsia, com o auxlio de anticorpos monoclonais ou tcnicas moleculares (Kidd, 2006). Imunodeteco em sangue e tecidos

A tcnica de imunohistoqumica pode ser utilizada para demonstrar riqutsias em cortes histolgicos ainda antes de ocorrer seroconverso (La Scola & Raoult, 1997). As amostras podem ser analisadas a fresco ou aps incluso em parafina e, segundo La Scola e Raoult (1997), os materiais mais utilizados so bipsias de pele ou pstulas de inoculao. No entanto, em casos fatais de doena em animais ou humanos, a bactria pode ser detectada em tecidos de vrios rgos como o fgado, pulmo, bao, corao, pele e meninges (La Scola & Raoult, 1997).

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Usam-se anticorpos anti-riqutsia, mono ou policlonais. Dependendo do tipo de anticorpo usado para deteco, podem ocorrer reaces cruzadas entre as vrias riqutsias do mesmo grupo. O uso de anticorpos monoclonais permite identificar a espcie de Rickettsia infectante (Raoult & Roux, 1997). Esta tcnica tem uma especificidade de 100% e sensibilidade entre 53% e 75% (La Scola & Raoult, 1997). Foram desenvolvidos mtodos para deteco imunolgica de R. conorii em clulas endoteliais circulantes, a partir de sangue ou tecidos de pacientes infectados, que permitem obter resultados em trs horas aps a colheita de amostras (La Scola & Raoult, 1997). Este assim, considerado por La Scola e Raoult (1997), o exame mais rpido para diagnstico antes da seroconverso. Permite visualizar riqutsias mortas e ter resultados mesmo em amostras a partir das quais no se podem realizar culturas e pode ser realizado em qualquer laboratrio, ao contrrio da cultura de clulas, que necessita de condies especiais de segurana (La Scola & Raoult, 1996). Contudo, um resultado positivo indicativo de febre botonosa mas um resultado negativo no exclui o diagnstico (La Scola & Raoult, 1996). Este mtodo tem uma sensibilidade de 50% e est limitado pela quantidade e qualidade das clulas endoteliais circulantes no momento da prova que, muitas vezes, surgem degeneradas (La Scola & Raoult, 1997). O nmero de clulas endoteliais circulantes est directamente relacionado com a gravidade da doena (La Scola & Raoult, 1997). c) Isolamento e deteco de riqutsias a partir dos artrpodes vectores O teste da hemolinfa, utilizado quando se pretende avaliar a presena de riqutsias em ixoddeos e deve ser realizado com espcimens vivos (La Scola & Raoult, 1997). Consiste em seccionar um membro da carraa e colher um pouco de hemolinfa. Esta hemolinfa depois colocada numa lmina que corada pelo mtodo Gimenez ou submetida a mtodos de imunodeteco. A tcnica shell vial e os mtodos de PCR tambm podem ser usados para identificao de riqutsias em ixoddeos (La Scola & Raoult, 1997).

5.1.13. Tratamento especfico e de suporte Apesar de, nesta reviso, terem sido referidos casos de deteco de ADN de riqutsia, por PCR, em ces com sintomatologia clnica, ainda no existe informao sobre o tratamento de febre botonosa em candeos. Por estas razes, optou-se por fazer extrapolao da teraputica usada na febre das Montanhas Rochosas para a febre botonosa, na medida em que ambas as 30

doenas so causadas por riqutsias do grupo das febres exantemticas, tendo fisiopatologias semelhantes e, possivelmente, tratamento idntico. Existem vrios antibiticos com eficcia conhecida contra riqutsias (Tabela 7) (Breitschwerdt et al., 1991; Breitschwerdt et al., 1999 Couto, 2003; Greene & Breitschwerdt, 2006) .

Tabela 7- Grupos de antibiticos com eficcia conhecida contra riqutsias em animais Antibitico Tetraciclinas (Doxiciclina) Fluoroquinolonas (Enrofloxacina, Trovafloxacina) Macrlidos (Azitromicina (?)) Cloranfenicol Breitschwerdt et al. (1999) compararam a eficcia de trs antibiticos usados no tratamento de infeces experimentais por R. rickettsii em ces (doxiciclina, trovafloxacina e azitromicina) e concluram que as tetraciclinas e as quinolonas apresentam um desempenho similar no tratamento de riquetsioses, devendo ser utilizadas como molculas de primeira escolha. Neste estudo, a doxiciclina, uma tetraciclina lipossolvel, conseguiu eliminar as riqutsias em circulao mais precocemente que os outros antibiticos, enquanto que tanto a doxiciclina como a trovafloxacina, se mostraram igualmente eficientes na resoluo ou preveno da perda de lquido vascular. A resoluo rpida da leso vascular deveria reduzir a morbilidade e mortalidade associadas a infeco por R. rickettsii, assim como o aparecimento de sequelas aps o tratamento (Breitschwerdt et al., 1999). A azitromicina, um macrlido, no se mostrou to eficaz como as outras molculas mas, segundo os autores, este facto pode dever-se apenas dose que foi utilizada neste estudo experimental. Outro antibitico de eficcia conhecida contra microrganismos do gnero Rickettsia o clorafenicol que, num outro estudo (Breitschwerdt et al., 1991), comprovou ser to eficaz como a fluorquinolona enrofloxacina e as tetraciclinas. Duas fontes bibliogrficas consultadas (Couto, 2003; Greene & Breitschwerdt, 2006) tambm referem o uso de tetraciclinas, doxiciclina, enrofloxacina ou cloranfenicol no tratamento de febre das Montanhas Rochosas (Tabela 8). Estes so os frmacos anti-riqutsia mais usados (Couto, 2003) e doxiciclina o tratamento de eleio contra R. rickettsii em ces e pessoas e R. conorii em pessoas (Kidd, 2006).

31

Tabela 8- Antibiticos utilizados no tratamento de febre das Montanhas Rochosas Greene & Breitschwerdt (2006) Antibitico Dose 22-30 mg/Kg Doxiciclina (derivado tetraciclinas) 12 em 12 Enrofloxacina 3 PO SC PO EV SC IM
PO- via oral; EV- via endovenosa; SC- via subcutnea; IM- via intramuscular

Couto (2003) Dose 22 mg/Kg 5-10 PO Via Frequncia Durao PO 8 em 8 horas 14 a 21 dias

Via Frequncia Durao PO EV PO EV 7 dias 8 em 8 horas

Tetraciclina

10-20 mg/Kg

mg/Kg 12 em 12 3 mg/Kg PO SC PO 8 em 8 horas 14 dias horas 7 dias

horas

(fluoroquinolona) mg/Kg Cloranfenicol 15-30 mg/Kg

8 em 8 horas

22-25 mg/Kg

No que respeita a R. conorii, o nico tratamento referido em estudos publicados foi o realizado aos trs ces de raa Yorkshire em Itlia (Solano-Gallego et al., 2006a) e o utilizado no cachorro no estudo de Baneth et al. (1998). A dois dos Yorkshires foi administrada doxiciclina na dose de 10 mg/Kg, por via oral, uma vez ao dia, durante um ms. Os sinais clnicos comearam a resolver dois dias depois do incio da antibioterapia. O outro Yorkshire foi tratado com cefatriaxona na dose de 30mg/Kg, via endovenosa, duas vezes ao dia, durante cinco dias. Os sinais clnicos desapareceram ao fim de quatro dias. No entanto, este antibitico (cefatriaxona) no tem eficcia conhecida contra riqutsias (Parola et al., 2005), pelo que provvel que a eliminao do agente por parte do sistema imunitrio tenha tido um papel importante na resoluo do quadro clnico (Kelly et al., 1992). Do estudo de Baneth et al. (1998) sabe-se que o cachorro foi tratado com doxiclina e que recuperou, embora a dose e durao do tratamento no sejam mencionados. No entanto, e como j foi referido anteriormente, no existem dados concretos sobre tratamento de febre botonosa em candeos. Na prtica clnica, s raramente o tratamento feito a pensar 32

apenas em Rickettsia conorii, devido a existncia de muitas co-infeces e s limitaes j referidas do mtodo de IFI, a tcnica mais utilizada para diagnstico destas patologias. Como consequncia, o mais frequente realizar uma teraputica igualmente eficaz para o tratamento de riquetsiose e erliquiose caninas. Neste sentido, a teraputica aplicada e frequentemente de primeira escolha doxiciclina 10 mg/Kg, via oral, cada 24 horas ou 5 mg/Kg, via oral, cada 12 horas durante 28 dias (Visconti & Dez, 2001; Neer & Harrus, 2006). No entanto, outros antibiticos podem ser usados no tratamento de erliquiose canina (Visconti & Dez, 2001; Neer & Harrus, 2006). No tratamento de riquetsioses, a resposta a antibioterapia rpida surgindo entre 24 a 48 horas (Kidd, 2006). A administrao parenteral dos antibiticos deve ser opo em pacientes que esto a vomitar (Greene & Breitschwerdt, 2006). Os antibiticos mencionados, apesar de eficazes, tm efeitos adversos pelo que a sua utilizao deve ser avaliada caso a caso. As tetraciclinas (incluindo a doxiciclina) formam complexos estveis com o clcio dos tecidos onde h formao ssea o que pode causar inibio do crescimento (Visconti & Dez, 2001). A administrao destes antibiticos a cachorros ou a cadelas gestantes provoca colorao amarela dos dentes deciduos que tambm pode atingir a dentio definitiva (Prescott, 2000b). Tambm pode ocorrer hipoplasia do esmalte (Visconti & Dez, 2001). Por estas razes, estes princpios activos no so recomendados em animais com menos de um ano e em fmeas gestantes (Visconti & Dez, 2001). Outros efeitos secundrios destes antibiticos so as alteraes gastro-intestinais que provocam como vmitos aps administrao oral e distrbios da flora intestinal (Prescott, 2000b). Ao contrrio das restantes tetraciclinas, a doxiciclina pode ser usada em pacientes com insuficincia renal pois a sua excreo no feita por esta via (Prescott, 2000b; Tilley & Smith, 2000). Para alm disto, a doxiciclina mais eficaz que os outros frmacos do mesmo grupo pois tem maior capacidade de penetrao nas clulas (Prescott, 2000b). As fluorquinolonas, apesar da sua eficcia, no devem ser usadas em ces com menos de oito meses de idade e no caso de raas grandes/gigantes no devem ser administradas antes dos 12 meses devido possibilidade de causarem artropatia (Walker, 2000). Estes antibiticos esto tambm associados a alteraes gastro-intestinais (nusea, vmitos, diarreia) (Walker, 2000). O principal efeito txico do cloranfenicol a aplasia medular que provoca, cuja probabilidade de ocorrncia, aumenta com a dose utilizada e a durao do tratamento (Prescott, 2000a). No entanto, se forem usadas as doses de manuteno e a durao da teraputica for inferior a dez dias, pouco provvel que estes efeitos txicos aconteam, a no ser que o animal tenha as funes heptica (principal meio de metabolizao deste frmaco) ou renal alteradas (Prescott, 2000a). Para alm disto, os ces no so to susceptveis a esta toxicidade como os gatos 33

(Prescott, 2000a). Por estas razes, a administrao oral de cloranfenicol em candeos segura (Prescott, 2000a). Para alm de estar associado a aplasia medular, j foram relatados casos de anafilaxia, vmitos e diarreia em ces e gatos tratados com doses teraputicas de cloranfenicol (Prescott, 2000a). Para alm da antibioterapia, tal como noutras doenas transmitidas por ixoddeos, pode ser realizado tratamento de suporte, consoante as necessidades, nomeadamente em situaes de choque, alteraes de coagulao ou alteraes metablicas. No entanto, a fluidoterapia endovenosa deve ser administrada com precauo pois, como j foi referido, existe aumento de permeabilidade vascular nestes animais havendo perigo de provocar edema cerebral ou pulmonar (Greene & Breitschwerdt, 2006). O uso de glucocorticoides em doses antiinflamatrias ou imunossupressoras em associao com a antibioterapia no potencializa a gravidade dos sinais clnicos em candeos infectados experimentalmente com R. rickettsii (Breitschwerdt, Davidson, Hegarty, Papich & Grindem, 1997). Pelo contrrio, estes trazem benefcios e so vulgarmente utilizados como complemento da antibioterapia quando os sintomas dos animais esto relacionados com uma resposta imunitria exagerada como dor articular, uvete, entre outros. A eficcia do tratamento est relacionada com a rapidez com que executado pelo que diagnstico e incio de tratamento tardios esto associados a aumento da morbilidade e mortalidade em pessoas e ces com riquetsiose (Kidd, 2006).

5.1.14. Profilaxia e controlo Uma vez que a febre escaro-nodular uma zoonose cujos vectores e reservatrios circulam livres na natureza, a sua erradicao praticamente impossvel (Sousa et al., 2003). A vigilncia epidemiolgica, atravs da notificao, essencial para o conhecimento da evoluo do nmero de casos de doena, permitindo a adopo de medidas preventivas e de controlo pelas autoridades de sade quando se justifique (Sousa et al., 2003). Ainda no existe uma vacina eficaz contra riqutsias no geral, apesar de j terem sido feitas vrias tentativas (Daz-Montero, Feng, Crocquet-Valdes & Walker, 2001). Muitos aspectos da resposta imunitria contra estes agentes esto ainda por conhecer mas sabe-se que a resposta mediada por clulas tem um papel preponderante. Portanto, uma vacina eficaz seria aquela que possusse elementos imunoestimuladores que activassem este tipo de resposta imunolgica (Daz-Montero et al., 2001). Sendo assim, a preveno destas doenas, nomeadamente de febre botonosa, deve ser dirigida no sentido de evitar o parasitismo pelos vectores (Bacellar, 1998). Sabendo que estes parasitas possuem fases de vida livre e parasitria e que R. sanguineus est adaptado a 34

concluir o seu ciclo de vida prximo dos candeos, o controlo das suas populaes deve ter sempre em conta o animal e o ambiente, numa tentativa de eliminar os seus bitopos. Existem vrios grupos qumicos de acaricidas eficazes na eliminao destes ectoparasitas (Tabela 9) (Taylor, 2001; Beugnet, 2004).

Tabela 9- Principais grupos de acaricidas eficazes na eliminao de ixoddeos Grupos de acaricidas Formadiminas Piretrinas e Piretrides Fenil-pirazis Organofosforados Carbamatos Lactonas macrocticas (avermectinas/milbemicinas) Os princpios activos apresentados anteriormente tm aco neurotxica (Beugnet, 2004). Contudo, actualmente, empregam-se cada vez mais na preveno de parasitismo por ixoddeos em animais de companhia, inibidores de crescimento ou desenvolvimento dos artrpodes (insect growth regulators) e o (s)-metopreno, um anlogo da hormona juvenil, o principio activo deste grupo com maior utilizao (Taylor 2001; Beugnet, 2004). Para aplicao no animal, estes acaricidas podem ter vrias apresentaes como coleiras, champs, sprays, ou produtos spot-on. Devido a facilidade de aplicao e ao seu efeito residual, as formulaes spot-on e as coleiras (polmeros plsticos onde a matriz impregnada pelo acaricida), so utilizadas com maior frequncia (Beugnet, 2004; Taylor, 2001). A regularidade de aplicao destes produtos depende do grau de infestao e do efeito residual do acaricida, devendo ser sempre seguidas as instrues do fabricante (Dantas-Torres, 2008). No entanto, sempre que necessrio, podem ser adoptados esquemas de tratamento alternativos (Dantas-Torres, 2008). O tempo que decorre desde a aplicao do acaricida at a eliminao de grandes infestaes no bem conhecido (Dantas-Torres, 2008). Em termos de estudos de eficcia, a associao imidoclopride e permetrina revelou uma capacidade curativa de 74,9% e uma capacidade de preveno do parasitismo acima dos 90%, oferecendo proteco durante cinco semanas (Epe, Coati & Stanneck, 2003). A admnistrao tpica de selamectina (semanal ou de duas em duas semanas) demonstrou uma eficcia contra R. sanguineus acima dos 89% (Jernigan et al., 2000). 35 Exemplos Amitraz Deltametrina, Flumetrina, Cipermetrina Fipronil Diazino Propoxur, Cabaril Milbemicina oxima, Selamectina, Moxidectina

Em relao ao ambiente, pode proceder-se a aplicao dos acaricidas em fumigaes (carbaril, permetrinas, piretrinas, entre outros), sendo tambm de extrema importncia a correcta manuteno das instalaes dos animais. O uso indiscriminado dos acaricidas, contrbui para a seleco de espcies de ixoddeos resistentes pelo que j foram relatadas resistncias a determinados produtos (Dantas-Torres, 2008). Em Espanha, Estrada-Pea (2005) encontrou resistncia baixa a moderada ao propoxur, elevada resistncia a deltametrina e nenhuma resistncia ao amitraz, em 15 populaes de R. sanguineus. Sendo assim, o controlo de R. sanguineus e de ixoddeos no geral, deve ser realizado com base no conhecimento da ecologia local destes parasitas e a utilizao dos acaricidas deve ser criteriosa para evitar a criao de resistncias (Dantas-Torres, 2008). II. Objectivos

Os ixoddeos, como vectores de uma grande variedade de agentes patognicos, so responsveis pela infeco do Homem e dos animais com estes agentes. Os ces, em contacto com o exterior, esto altamente expostos a estes parasitas e, por conseguinte, aos agentes patognicos que estes albergam. conhecido que muitos destes organismos causam doena clnica em candeos. No entanto, existem dvidas sobre a capacidade de R. conorii provocar doena nestes animais. Com este intuito, foi realizado um estudo retrospectivo com base em casos clnicos do Hospital Veterinrio do Restelo. Sendo este um estudo retrospectivo que tambm inclui datas fora do perodo de estgio (de Maio de 2007 a Setembro de 2007), nem todos estes casos foram assistidos pela estagiria e, nestas situaes, houve conhecimento dos mesmos pelo acesso a base de dados do hospital. Os objectivos principais deste estudo foram:
-

Estabelecer a seroprevalncia de R. conorii na amostra em estudo; Fornecer evidncias serolgicas de quadros clnicos causados por R. conorii na amostra de candeos e o tratamento aplicado nestes casos; Comparar a seroprevalnica de R. conorii na amostra em estudo com a obtida para outros agentes transmitidos por vectores na mesma amostra.

Secundariamente pretendeu-se: Comparar a presena de anticorpos em machos e fmeas; Avaliar a existncia de sazonalidade de resultados de serologia positivos para R. conorii; Estudar a prevalncia de agentes transmitidos por ixoddeos na amostra de ces de rua; 36

Associar vectores.

histria

de

parasitismo

por

ixoddeos

com

resultados

de

Imunofluorescncia Indirecta positivos para agentes transmitidos por estes

III.

Material e mtodos

1.

Material

A amostra de candeos em estudo, apresentou-se consulta no Hospital Veterinrio do Restelo, entre os meses de Maio de 2007 (ms em que o hospital comeou a trabalhar com o Laboratrio DNAtech que colaborou na realizao deste estudo) e Fevereiro de 2008 (fim do perodo de estgio). Foram includos, neste estudo, animais com suspeita de doena transmitida por ixoddeos e aos quais foram pesquisados anticorpos anti-Rickettsia. Estes ces possuam, pelo menos, um dos sinais/sintomas ou componentes da histria pregressa abaixo enumerados, que constituram os critrios de incluso: Alteraes de coagulao (epistxis, hematomas, petquias); Alteraes gastro-intestinais (diarreia, vmitos); Alteraes inespecficas (pirxia, anorexia, perda de peso, cansao). Alteraes neurolgicas/ musculo-esquelticas (convulses, ataxia); Alteraes oculares (uvete); Ces vadios adoptados; Dor de origem inespecfica; Esplenomeglia; Linfadenomeglia; Histria de parasitismo por ixoddeos;

Obteve-se, assim, uma amostra de 91 candeos, provenientes de quatro distritos do pas (Lisboa (n=88), Leiria (n=1), Santarm (n=1) e Setbal (n=1)). A amostra era constituda por 31 fmeas e 60 machos, com idades compreendidas entre os 4 meses e os 15 anos (mdia de 7 anos). As idades mais representadas foram os 8 e 9 anos com 13 animais cada. Destes animais, 27 eram de raa indeterminada e 64 pertenciam a uma raa definida. A raa Caniche, com 6 animais, e as raas Yorkshire Terrier e Labrador Retriever, com 5 animais cada, foram as mais representadas. Da amostra em estudo, 16 candeos tinham histria de parasitismo por ixoddeos. O habitat destes animais foi referido pelos donos, e agrupado nas quatro categorias expressas no grfico 1. Em 11 animais, contudo, esta informao no estava disponvel.

37

Grfico 1- Habitat da amostra de candeos em estudo

51

Nmero de animais

11

13 5

Casa

Casa e Exterior

Exterior

Rua

Habitat

Foi considerado como habitat o local onde os animais passavam a maioria do seu tempo, admitindo, portanto, que os animais com habitat casa possam ter contacto directo com o exterior. O grfico 2, refere o nmero de candeos em que foi realizada pesquisa de anticorpos contra R. conorii nos vrios meses em estudo.

Grfico 2- Ms do ano em que foi realizada a pesquisa de anticorpos anti-R. conorii

23 20 20 18

Nmero de animais

10

M aio /Jun. 07

Jul./A g. 07

Set./Out. 07

No v./Dez. 07

Jan./Fev. 08

Ms do ano

Na generalidade dos casos, as histrias clnicas destes animais foram escritas de modo muito sucinto e, muitas vezes, os mdicos veterinrios apenas referiram o que consideraram ser os principais componentes da histria pregressa e as alteraes de exame fsico que consideraram relevantes. Este facto prejudicou a colheita dos dados usados para a realizao deste estudo. 2. Mtodos 38

Aos 91 animais, foram colhidas amostras de sangue perifrico, para tubos secos, para serem submetidas tcnica de Imunofluorescncia Indirecta (IFI) para deteco e titulao de anticorpos contra de R. conorii. Em 90 ces foi tambm realizada a pesquisa de anticorpos antiEhrlichia canis. Em alguns deles foi ainda realizada a mesma tcnica de diagnstico para deteco de anticorpos contra Babesia canis (n=26) e Leishmania infantum (n=56), de acordo o quadro clnico apresentado. Tcnicas hematolgicas como hemograma, anlises bioqumicas ou outros procedimentos de hematologia foram tambm realizados, consoante as necessidades de cada caso. 2.1. Tcnica de Imunofluorescncia Indirecta para deteco de anticorpos anti-R. conorii em soros de candeos Aps a colheita, as amostras foram submetidas a centrifugao e, os soros obtidos, foram enviados, em refrigerao, para o Laboratrio DNAtech que realizou a tcnica de IFI. O protocolo do teste de IFI utilizado definido pelo fabricante do kit de deteco (VIRCELL) (Anexo II). O kit contm lminas preparadas com antignios de cultura de R. conorii estirpe Morrocan crescidos em clulas Vero. A tcnica utilizada detecta anticorpos tipo IgG e segundo, estudos do fabricante, possui sensibilidade e especificidade de 100%. Cada um dos soros foi diludo com PBS de forma a serem conseguidas duas diluies: 1:40 e 1:80. A partir destas diluies foi realizada a prova em questo, consoante o seguinte mtodo: 1. Foram colocados 20 l de cada diluio nos vrios poos da lmina; 2. As lminas foram incubadas em cmara hmida a 37C durante 30 minutos; 3. O excesso de soro foi depois arrastado das lminas com uma primeira lavagem rpida em PBS, seguindo-se de uma submerso entre 10 a 15 minutos em PBS e de uma lavagem ligeira com gua destilada; 4. Depois de secas ao ar, foram colocados 20 l de soro anti-IgG de co conjugado com fluorescena e as lminas novamente incubadas e lavadas como descrito em 2 e 3; 5. As lminas foram outra vez secas, juntou-se uma gota de meio de montagem a cada poo e cobriu-se com lamela; 6. Em cada lmina, dois poos foram utilizados para soros controlo positivos e negativos. No final, as lminas foram observadas em microscpio de fluorescncia Olympus BX60 com uma ampliao de 400x. Os resultados positivos manifestam-se pela visualizao de estruturas de morfologia cocobacilar, as riqutsias, com fluorescncia cor verde-ma. Numa reaco negativa, esta fluorescncia no detectada e observada uma cor vermelha devido a utilizao de um 39

corante (Azul de Evans) que adicionado juntamente com o conjugado. O ttulo dos soros foi atribudo pela mxima diluio em que foram observadas reaces positivas e os resultados enviados como positivos a 1:80 e/ou 1:40 ou negativos. Existem, no entanto, alguns casos em que se observam micorganismos de cor vermelha mas com uma fluorescncia muito tnue e que so considerados como apresentando fluorescncia basal. Este fenmeno pode ocorrer por inespecificidade da tcnica, por reaces cruzadas com anticorpos especficos de outros agentes ou por se estar perante um perodo onde ainda no foram produzidos anticorpos necessrios obteno de um ttulo positivo. Por isso, estes casos devem ser interpretados isoladamente, de acordo com o agente que se est a pesquisar, com o ttulo de anticorpos e com os sinais clnicos que o animal apresenta. Neste contexto, importante uma correcta interpretao dos resultados obtidos pelo que, dever ocorrer entre o mdico veterinrio e o laboratrio, um cruzamento de informaes de forma a obter o diagnstico mais acertado. Regra geral, se um animal apresentar fluorescncia basal na pesquisa de qualquer agente, na ausncia de quadro clnico compatvel com o mesmo, dever ser considerado suspeito e ficar sob vgia (na eventualidade de surgirem alguns sintomas) e a anlise deve ser repetida no espao de um ms e meio, no mesmo laboratrio (A. Xufre, comunicao pessoal, Abril 14, 2008). Deste modo, pode haver comparao entre os resultados obtidos e avaliao da evoluo do ttulo de anticorpos. Para controlo interno do laboratrio DNAtech, 15% das amostras recebidas no mesmo dia so repetidas aleatoriamente, qualquer que seja o agente pesquisado por IFI. 2.2. Tcnica de Imunofluorescncia Indirecta para deteco de anticorpos contra os restantes agentes pesquisados Como j foi referido, foram tambm pesquisados, embora no em todos os animais, anticorpos contra outros agentes: B. canis, E. canis e L. infantum. O mtodo de IFI utilizado nestes casos foi semelhante ao descrito para R. conorii, variando apenas o antignio da lmina e as diluies efectuadas, para cada um dos agentes.

40

2.3. Exames hematolgicos Devido as alteraes hematolgicas que podem ser provocadas por R. conorii, a avaliao de alguns parmetros sanguneos, tem elevado interesse neste estudo. As tcnicas de hematologia foram realizadas de acordo com as necessidades de cada caso clnico, pelo que no foram utilizadas em todos os animais. 2.3.1. Hemograma Para a realizao desta tcnica, o sangue foi colhido numa veia perifrica para tubo com heparina e processado imediatamente em contador de clulas automticas (MS4+ ou Idexx VetLab Station) existente no Hospital Veterinrio do Restelo. Foram avaliados vrios parmetros de diferentes linhas celulares e os valores de referncia utilizados para ambas as mquinas foram determinados pelos fabricantes (Tabela 10).

Tabela 10- Parmetros de hemograma avaliados e valores de referncia para cada um dos contadores de clulas utilizado Contador de clulas automtico Parmetro Hematolgico N total de leuccitos Linfcitos diferencial de Contagem Moncitos Neutrfilos Eosinfilos Basfilos Hematcrito N total de eritrcitos Volume corpuscular mdio Concentrao de hemoglobina Hemoglobina corpuscular mdia Concentrao de hemoglobina corpuscular mdia N total de plaquetas 175 K/L - 500 K/L 120 m/mm3 - 600 m/mm3 Idexx VetLab Station 5,50 x 109/L - 16,90 x 109/L 0.50 x 109/L - 4,90 x 109/L 0,30 x 109/L - 2,00x 109/L 2,00 x 109/L - 12,00 x 109/L 0,10 x 109/L - 1,49 x 109/L 0,00 x 10 /L - 0,10 x 10 /L 37,00% - 55,00% 5,50 x 10 /L - 8,5 x 10 /L 60,00 fL - 77,00 fL 12,00 g/dL - 18,00 g/dL 18,50 pg - 30,00 pg 30,00 g/dL - 37,50 g/dL
12 12 9 9

Contador de clulas automtico MS4+ 6,00 m/mm3 - 17,00 m/mm3 1,00 m/mm3 - 4,60 m/mm3 0,15 m/mm3 - 1,35 m/mm3 3,00 m/mm3 - 11,50 m/mm3 35,00% - 55,00% 5,5 M/mm3 - 8,5 m/mm3 58,00 fL - 73,00 fL 10,00 g/dL - 18,00g/dL 19,5 pg - 24,5 pg 28,00 g/dL - 40,00 g/dL

41

2.3.2. Parmetros bioqumicos Os parmetros bioqumicos foram avaliados com recurso tcnica de qumica seca, realizada na mquina Spotchem EZ SP-4430, pelo uso de tiras de reagentes Spotchem II. A tabela 11 resume os diferentes parmetros avaliados, assim como os respectivos valores de referncia tambm determinados pelos fabricantes.

Tabela 11- Parmetros bioqumicos avaliados e valores de referncia para cada um deles Parmetros bioqumicos Ureia Creatinina Glucose ALP ALT Protenas totais Valores de referncia <16 mg/dL <2 mg/dL 40-150 mg/dL <147 UI/L <120 UI/L 6 a 8 mg/dL

2.3.3. Exame microscpico de esfregao sanguneo O exame microscpio de esfregao sanguneo foi utilizado, como meio complementar de diagnstico, em alguns dos casos clnicos includos neste estudo. Esta tcnica muitas vezes requerida, pelos clnicos do hospital em questo, para confirmar trombocitopnias dadas pelos contadores de clulas automticas, para realizar contagem diferencial de leuccitos e para avaliar o tipo de anemia quanto resposta medular (avaliando as caractersticas das clulas sanguneas e realizando uma contagem de reticulcitos). Para alm disto, permite observar agentes hemticos como Babesia e Ehrichia (nomeadamente Ehrlichia platys, agora designada por Anaplasma platys, j a pesquisa deste agente pela tcnica de Imunofluorescncia Indirecta pode dar reaces cruzadas com outras espcies de Ehrlichia). A colorao utilizada do tipo Romanowsky (colorao Giemsa). A confirmao de trombocitopnia realizada segundo Harvey (2001). De acordo com este autor, numa ampliao de 1000 vezes, o nmero de plaquetas deve variar entre 10 a 30 por campo. Desta forma, valores de plaquetas por campo, inferiores aos referidos so indicativos de trombocitopnia. Nestes casos, deve ser realizada uma contagem e o nmero de plaquetas por L de sangue pode ser estimado multiplicando o nmero mdio de plaquetas encontrado por campo (na ampliao de 1000 vezes) por 15000 a 20000 (Harvey, 2001).

42

2.4. Clculo da seroprevalncia na amostra dos vrios agentes pesquisados Aps a interpretao dos resultados de IFI, a seroprevalncia foi calculada utilizando a seguinte frmula:

Seropreval ncia =

n de ces seropositivos n total de soros

2.5. Mtodos estatsticos Neste estudo, foram utilizados mtodos estatticos descritivos pelo recurso ao software Microsoft Excel 2003. IV. Resultados

1.

Resultados da titulao de anticorpos contra os vrios agentes

Aps a realizao da tcnica de Imunofluorescncia Indirecta e observao das lminas ao microscpio de fluorescncia, podem ser obtidos, para cada uma das diluies efectuadas (1:40 e 1:80), resultados positivos (onde os micorganismos fixados apresentam cor verde-ma fluorescente), resultados negativos (onde se visualiza uma cor vermelha devido ao corante Azul de Evans utilizado) ou com fluorescncia basal (suspeitos). Dos 91 animais estudados, apenas 13 (14,3%) no tinham anticorpos contra qualquer um dos trs agentes transmitidos por ixoddeos, embora um deles fosse positivo para leishmaniose. Isto significa que 85,7% dos candeos da amostra possuia anticorpos contra pelo menos um dos agentes transmitidos por ixoddeos pesquisados. S num animal foram detectados anticorpos contra os quatro agentes (L. infantum, R. conorii, E. canis e B. canis) e cinco candeos mostraram seroreactividade contra R. conorii, E. canis e B. canis. O grfico 3 revela os resultados obtidos para cada um dos agentes transmitidos por vectores pesquisados.

43

Grfico 3- Resultados de IFI obtidos para cada um dos agente pesquisados

66

Nmero de animais

45

41

44

25 11 12 0
R.R. conorii conorii (Total=91) (Total=91)

Positivos Negativos
4
E. canis Erlichia (Total=90) (Total=90)

3 Babesia B. canis (Total=26) (Total=26)

Fluorescncia basal
4

Leishmania L. infantum (Total=56) (Total=56)

Agente pesquisado

2.

Resultados da titulao de anticorpos contra R. conorii

A seroprevalncia de R. conorii na amostra em estudo foi de 73%, sendo portanto superior encontrada para E. canis (50%), B. canis (42%) e L. infantum (18%). Verificou-se que 67,7% das fmeas includas na amostra e 75% dos machos possuam anticorpos contra R. conorii. No que respeita a anlise dos resultados nos diferentes meses em estudo, constatou-se que Maio/Junho e Julho/Agosto foram os meses com maior percentagem de resultados positivos. Nos restantes meses, no houve uma diferana to significativa entre o valor de resultados positivos e negativos (Grfico 4).

Grfico 4- Resultados da titulao de anticorpos anti-R. conorii nos vrios meses em estudo

90,0

95,7

Percentagem

60,0 40,0 44,4

55,6

60,0 40,0

Positivo Negativo

10,0

4,3 Jul./Ag. Set./Out. Nov./Dez. Jan./Fev.

Maio/Jun.

Ms do ano

44

Em relao ao habitat, verificou-se que a seroprevalncia de R. conorii na amostra de candeos de rua (80%) e de ces que habitavam no exterior (84,6%), foi superior da amostra de ces cujo o principal habitat era casa (72,5%) ou casa e exterior (63,6%). Nesta amostra, apenas dois animais com anticorpos contra R. conorii tinham idade inferior a dois anos. Os 66 animais que possuam anticorpos contra R. conorii foram divididos em trs grupos (Grfico 5).

Grfico 5- Grupos de animais com anticorpos contra R. conorii

38

Nmero de animais

19

Animais com anticorpos contra R. conorii

A- Resultado de IFI positivo para R. conorii mas suspeito contra um dos outros agentes B- Resultado de IFI positivo apenas para R. conorii C- Resultado de IFI positivo para outros agentes alm de R. conorii

2.1. Estudo do grupo de animais positivos para R. conorii mas suspeitos para outros agentes Em nove animais com resultados positivos de Imunofluorescncia Indirecta contra R. conorii, foram obtidos resultados com fluorescncia basal (suspeitos) contra alguns dos outros agentes (Grfico 5 (A)): dois com resultados suspeitos para L. infantum, trs suspeitos para B. canis e quatro para E. canis. Na medida em que no podem ser includos num dos outros dois grupos, estes animais foram alvo de uma abordagem mais aprofundada, numa tentativa de interpretar os seus resultados de IFI.

Resultados suspeitos para L. infantum:

Dois animais que revelaram anticorpos contra E. canis e contra R. conorii obtiveram um resultado suspeito para L. infantum. Idealmente e para uma interpretao fidedigna dos 45

resultados, como j foi dito, devia ter sido repetida a pesquisa de L. infantum nestes animais um ms e meio depois, mas no foi. No entanto, em termos clnicos, estes ces no apresentavam alteraes caractersticas de leishmaniose, pelo que, possvel que tenham ocorrido reaces cruzadas de anticorpos, j que estes foram detectados contra os dois outros agentes.

Resultados suspeitos para B. canis:

Neste estudo, trs animais positivos para R. conorii tiveram resultados suspeitos para B. canis. Um deles revelou anticorpos contra E. canis e R. conorii e histria de parasitismo recente por ixoddeos. Neste caso, possvel que os anticorpos tenham sido detectados cedo no curso clnico da doena e que ainda no tivesse havido resposta imunitria contra Babesia. Outro co teve resultados positivos para R. conorii em ambas as diluies e fluorescncia basal para B. canis, no entanto, recuperou completamente dos sinais clnicos que apresentava (uvete) apenas com tratamento especfico para a riquetsiose. Por isso, provavelmente, a fluorescncia detectada poder ter sido devida a reaces cruzadas. Em relao ao terceiro animal referido, a informao disponvel no permite excluir co-infeco com B. canis. Os tempos de coagulao para este animal encontravam-se muito aumentados por isso os sinais clnicos poderiam ter sido causados por intoxicao por antagonistas da vitamina K, mas no possvel excluir, na totalidade, a contibuio da infeco por R. conorii e B. canis para o quadro clnico.

Resultados suspeitos para E. canis:

Dos candeos que constituam o grupo de animais com resultados suspeitos, quatro possuam fluorescncia basal para E. canis e anticorpos contra R. conorii, numa ou ambas as diluies. A dois destes animais, foram diagnosticadas neoplasias que, para alm de poderem causar os sinais clnicos apresentados, poderiam aumentar a susceptibilidade para a agudizao de infeces antigas. Por estas razes, nestes casos, as causas de fluorescncia basal podem ser inespecificidade da tcnica ou reaces cruzadas. Um outro animal foi adoptado da rua e apresentado consulta para avaliao geral. No apresentava sintomas mas, por precauo, foi realizada pesquisa e titulao de anticorpos antiR. conorii, anti-E. canis e anti-B. canis, tendo tido resultados positivos para R. conorii apenas na diluio 1:40, negativos para B. canis e fluorescncia basal para E. canis. Estes valores sugerem uma infeco antiga por Rickettsia e fluorescncia basal por inespecificidade da tcnica. Em relao ao quarto animal, a informao disponvel no permite fazer uma interpretao correcta dos resultados da tcnica de IFI, visto que este faleceu sem terem sido eliminadas todas as outras possveis causas para os sintomas que apresentava. 46

2.2. Estudo do grupo de animais com anticorpos contra outros agentes alm de R. conorii Nos 38 casos em que foram detectados anticorpos contra mais do que um agente (Grfico 5 (C)), pode estar-se perante a infeco do mesmo animal por vrios organismos, que em conjunto, podem contribuir para o quadro clnico apresentado. Este o fenmeno de coinfeco que, como j foi referido anteriormente, ocorre frequentemente, pois o mesmo ixoddeo pode estar infectado por vrios agentes e transmiti-los ao mesmo animal durante a sua refeio de sangue. O grfico 6 resume os diferentes tipos de co-infeco encontrados nos animais com anticorpos contra R. conorii.

Grfico 6- Tipos de co-infeco encontrados na amostra em estudo

R+E+B+L, 1

Tipos de coinfeco

R+B+L, 1 R+E+L, 2 R+L, 3 R+B, 3 R+E+B, 4

R= R. conorii E= E. canis B= B. canis L= L. infantum

R+E, 24

Nmero de casos de coinfeco

2.3. Estudo do grupo de animais apenas com anticorpos contra R. conorii Os candeos que constituam o grupo de animais em que apenas foram detectados anticorpos contra R. conorii (Grfico 5 (B)) tinham no mnimo trs anos. Os casos clnicos destes 19 animais, foram analisados mais aprofundadamente, no sentido de associar a presena de anticorpos com sinais clnicos porque, como j foi referido, a deteco destes anticorpos em candeos no implica doena ou infeco recente. Por estas razes, devem ser excludas outras causas possveis para os sintomas apresentados, quando existam, e fazer uma interpretao dos resultados de IFI, caso a caso. Sendo assim: Em seis destes animais os sintomas identificados foram considerados como causados por R. conorii;

47

Em trs foram diagnosticadas outras patologias que poderiam estar por trs do quadro clnico; Em nove no foi possvel excluir a contribuio da infeco pelo agente em estudo para os sinais clnicos apresentados mas, a informao disponvel, tambm no permitiu que este agente fosse considerado como nica causa de patologia; Um candeo no apresentava qualquer sintoma e a titulao foi positiva para R. conorii em ambas as diluies.

No exame fsico dos seis animais em que foi feita associao entre resultado de IFI positivo para R. conorii e existncia de sinais clnicos, detectou-se pirxia (existente em dois candeos), uvete (em dois candeos) e outras alteraes como dor de origem inespecfica, rigidez muscular, hematomas e petquias. Um dos animais, apenas apresentava esplenomeglia palpao. Em quatro destes animais, foram realizadas anlises hematolgicas. Anemia e trombocitopnia (confirmadas por esfregao sanguneo) foram as alteraes de hemograma verificadas em dois animais. Em termos bioqumicos, apenas um animal revelou alteraes apresentando hipoproteinmia. Nos restantes animais, os parmetros sanguneos encontravamse dentro dos valores normais. Destes seis animais, apenas num os donos referiram histria anterior de parasitismo por ixoddeos. Em termos de ttulo, todos eles tinham anticorpos detectveis em ambas as diluies (1:40 e 1:80). Nos nove animais em que o papel da Rickettsia como entidade de patologia exclusiva no pode ser concludo, as alteraes ao exame fsico eram semelhantes as apresentadas anteriormente: alteraes oculares, de coagulao e alteraes musculo-esquelticas havendo, no entanto, alguns casos de alteraes neurolgicas como tetraparsia e perda de fora que s poderiam ser esclarecidos aps realizao de outras tcnicas complementares de diagnstico que no foram efectuadas. As alteraes de hemograma verificadas nestes animais tambm se resumem a anemia e trombocitopnia. No entanto, em termos bioqumicos, para alm de hipoproteinmia, em alguns casos estava tambm presente azotmia e aumento das enzimas hepticas. Destes animais, seis tinham anticorpos detectveis em ambas as diluies e em apenas trs o ttulo foi 1:40. 3. Tratamento aplicado nos candeos em estudo apenas infectados com R. conorii

Em todos os animais cujos sintomas poderiam ser causados por R. conorii, e que continuaram a ser seguidos no Hospital Veterinrio do Restelo aps diagnstico, foi realizada teraputica. Doxiciclina foi o antibitico de escolha na dose de 5 mg/Kg, via oral, duas vezes ao dia ou 10 mg/Kg, por via oral, uma vez ao dia. A durao da teraputica variou, consoante o caso, entre 21 e 28 dias. 48

A mesma teraputica tambm foi usada em quatro animais com sinais clnicos mas que tiveram resultados de Imunofluorescncia Indirecta negativos para todos os agentes pesquisados. Estes candeos recuperaram dos sinais clnicos apresentados inicialmente. 4. Estudo da prevalncia de agentes transmitidos por ixoddeos na amostra de ces de rua em estudo Neste estudo, foram analisados cinco ces vadios adoptados por novos donos, que foram levados a consulta para avaliao do seu estado geral. Apresentando anomalias de exame fsico ou apenas por preveno, a todos eles foi colhido sangue para pesquisa de R. conorii e E. canis. Em quatro foram pesquisados anticorpos anti-L. infantum e apenas a um foi pesquisado B. canis. Um destes animais, revelou resultados negativos para todos os organismos testados. Os restantes possuam anticorpos dirigidos contra R. conorii e contra um dos outros agentes transmitidos por ixoddeos. 5. Associao entre parasitismo por ixoddeos e presena de anticorpos contra os agentes transmitidos por estes vectores Na anamnese, foi referida histria de parasitismo por ixoddeos, em 16 dos animais em estudo. Em todos eles foram pesquisados, anticorpos anti-E. canis e anti-R. conorii e em 7 foi tambm pesquisada infeco por B. canis. Apenas dois destes animais no estavam infectados por qualquer um dos organismos pesquisados. Foram detectados anticorpos contra R. conorii em treze (81,3%) destes ces. V. Discusso dos resultados

Este foi um estudo retrospectivo baseado em casos clnicos seguidos no Hospital Veterinrio do Restelo. Neste sentido, o principal objectivo dos mdicos veterinrios, prendia-se com a resoluo dos sinais clnicos que os animais apresentavam, fazendo muitas vezes frente a situaes de controlo de custos. Por estas razes, nem sempre foram realizados os mesmos exames complementares de diagnstico em todos os animais, e tambm no foram enviadas duas amostras de sangue para deteco de anticorpos, com intervalo de trs a quatro semanas, de forma a averiguar se ocorreria seroconverso e, assim, poder afirmar se se est perante uma infeco activa/recente ou antiga, como recomenda a bibliografia. Por outro lado, 49

este um hospital de referncia que recebe muitos casos vindos de outros colegas e que, aps diagnstico, voltam a ser seguidos nos mesmos. Este facto, contribuiu para a inconcluso e falta de informao sobre muitos dos casos referidos. Todos estes factores concorrem, de uma ou de outra forma, para que o estudo realizado tenha muitas limitaes. Contudo, foi possvel chegar a alguns resultados semelhantes a outra bibliografia publicada. Dos 91 animais que constituram a amostra, apenas em 13 no foram detectados anticorpos contra qualquer um dos agentes transmitidos por ixoddeos pesquisados. Estes foram nmeros semelhantes aos encontrados por Bacellar et al. (1995a) que, ao analisarem uma amostra de 104 animais, verificaram que somente 12, no possuam anticorpos contra R. conorii, E. canis, C. burnetii e R. typhi. Estes valores comprovam a grande de frequncia de infeces transmitidas por ixoddeos em candeos. O facto de neste estudo terem sido pesquisados diferentes agentes, consoante o quadro clnico apresentado, comprova o que foi afirmado na reviso bibliogrfica. Muitas vezes, as doenas transmitidas por vectores tm sintomas semelhantes e, em alguns casos, todas elas podem ser includas como parte dos diagnsticos diferenciais. Para alm disto, existe a possibilidade de o mesmo animal ser infectado por diversos agentes, o que tambm foi demonstrado neste estudo. Apenas um animal do total da amostra mostrou ter seroreactividade contra os quatro agentes pesquisados e cinco possuiam anticorpos contra R. conorii, E. canis e B. canis. Dos 66 animais seroreactivos para R. conorii, 38 possuam tambm anticorpos contra outros agentes e a coinfeco detectada mais comumente foi de R. conorii e E. canis, num total de 24 animais, embora estes tambm tenham sido os agentes mais pesquisados. Bacellar et al. (1995a) tambm encontraram vrios animais positivos para estes dois agentes. Pelo facto de existirem quadros clnicos semelhantes e possibilidade de co-infeco de vrios agentes, o diagnstico clnico deve ser complementado com tcnicas de diagnstico laboratorial. A seroprevalncia de R. conorii nesta amostra foi de 73%, apenas um pouco inferior aos valores de 85,6% e 85% detectados por Bacellar et al. (1995a) e Nncio et al. (1999), respectivamente. Este resultado, no entanto, foi bastante superior seroprevalncia de 38,5% encontrada por Alexandre (2005). A semelhana entre os valores encontrados no presente estudo e os de Bacellar et al. (1995a) e Nncio et al. (1999), pode ser explicada pelo facto de no existir muita diferena no limiar de positividade utilizado (1:40 neste estudo e 1:64 nos outros). Por outro lado, o limiar de positividade de 1:128 utilizado por Alexandre (2005) pode explicar, segundo o autor, a menor percentagem de animais da sua amostra com anticorpos contra R. conorii. Nesta amostra, a seroprevalncia de R. conorii, foi superior encontrada para E. canis, L. infantum e B. canis, o que est de acordo com o estudo de Solano-Gallego et al. (2006b). A prevalncia de anticorpos contra R. conorii tambm foi superior de E. canis no estudo de Alexandre (2005). 50

Contudo, as elevadas seroprevalncias encontradas neste estudo podem no ser reais pois, como j foi referido, existem outras riqutsias transmitidas por ixoddeos que podem originar reaces cruzadas de anticorpos com R. conorii. Como a tcnica de IFI no consegue distinguir a espcie de riqutsia infectante, apenas o grupo, s as tcnicas de biologia molecular, poderiam elucidar da prevalncia real de R. conorii nesta amostra. No entanto, estas so limitaes inerentes a qualquer estudo de seroprevalncia. A percentagem de candeos machos com anticorpos detectados contra R. conorii (75%) foi superior de candeos fmeas (67,7%) apesar de a diferena de valores ter sido pouco significativa. Solano-Gallego et al. (2006b) tambm chegaram a esta concluso. Foram obtidas diferentes seroprevalncias de R. conorii na amostra em vrios perodos do ano. Os meses Maio/Junho e Julho/Agosto tiveram uma maior percentagem de resultados positivos, comparativamente com os restantes meses, o que revelou sazonalidade da infeco nesta amostra. Isto poder ser explicado pelo facto de o vector estar mais activo nos meses de Vero. Delgado e Carmenes (1995) tambm detectaram maior frequncia de animais positivos nos meses de Vero. Pelo contrrio, Alexandre (2005) no encontrou associao entre o perodo do ano e a seropositividade para R. conorii. Bacellar et al. (1995a) tambm no encontraram diferenas entre o grupo de amostras Outono/Inverno e Primavera/Vero. Dos 16 animais que s apresentavam anticorpos contra R. conorii, apenas em 6 foi possvel atribuir o quadro clnico a infeco por este agente. Nestes candeos, foram detectados vrios sinais e sintomas como pirxia, uvete, petquias e hematomas, dor de origem inespecfica, rigidez muscular e esplenomeglia. Anemia, trombocitopnia e hipoproteinmia foram as alteraes hematolgicas verificadas. A maioria destas alteraes foi j descrita por outros autores (Kidd, 2006; Alexandre, 2005; Font et al. (citado por Alexandre, 2005)). Contudo, no se pode afirmar com toda a certeza que no existem outro tipo de sintomas provocados por R. conorii, devido aos nove animais em que era necessrio outro tipo de exames para responsabilizar apenas o agente em questo pelo quadro clnico apresentado. Os animais que apenas apresentaram anticorpos contra R. conorii tinham no mnimo 3 anos, o que est de acordo com o estudo de Alexandre (2005) que concluiu que, idade superior a dois anos um factor de risco para a infeco, na medida em que o nmero de exposies ao agente aumenta com a idade. Neste estudo, o ttulo de anticorpos foi utilizado, em conjunto com a avaliao do quadro clnico, para realizar uma interpretao mais correcta dos resultados de IFI. Tendo em conta que, os anticorpos podem persistir durante meses em animais que tiveram contacto com R. conorii, a variao do seu ttulo pode elucidar sobre a forma como o animal est a responder infeco. Sendo assim, ttulos de anticorpos mais baixos (1:40) podem ocorrer em animais com infeces antigas, enquanto que resultados positivos na diluio de 1:80 podem significar infeces 51

recentes (A. Xufre, comunicao pessoal, Abril 14, 2008). Todos os animais em que houve associao serolgica de doena com infeco por R. conorii tinham anticorpos detectados em ambas as diluies. Pode ser ento assumido que estas eram infeces recentes ou agudizao de infeces antigas. No entanto, por vezes, a interpretao do ttulo de anticorpos pode no ser muito fidedigna, nomeadamente em animais com doenas imunossupressoras, na medida em que no conseguem montar uma resposta imunitria eficaz. Por isso, nestes casos, podemos estar perante uma infeco recente e os anticorpos serem detectados apenas na diluio de 1:40. A constatao de que os animais de rua e de exterior possuem maior seroreactividade j era esperada, na medida em que estes candeos tm contacto mais prximo com os vectores. De facto, s um dos ces de rua no possuia anticorpos contra pelo menos um dos agentes transmitidos por ixoddeos que foram pesquisados. Pelo contrrio, os valores obtidos para os animais com habitat casa e com habitat casa e exterior, so ambguos. Seria de esperar que os animais com contacto mais intenso com o exterior possussem maior seroprevalncia de R. conorii, mas isso no se sucedeu. Esta contradio pode ser explicada pois, apesar de os donos terem referido que os animais habitavam em casa, o seu contacto com o exterior e, consequentemente, com os vectores, no pode ser anulado, podendo ocorrer nos seus passeios regulares. Por outro lado, os animais com habitat casa e exterior, podem no ser to controlados pelos donos o que faz com que pequenas alteraes que neles ocorram, possam no ser notadas to facilmente, ao contrrio dos animais que vivem sempre em casa em contacto com os proprietrios. Sendo assim, os valores de seroprevalncia encontrados nos animais de diferentes habitats deste estudo podem no ser fidedignos. Os resultados de prevalncia obtidos para os animais em que foi identificado parasitismo por ixoddeos demonstram que, apesar de parasitismo por carraas no ser um achado consistente da histria pregressa, quando este facto mencionado, muito provvel que o animal tenha sido infectado por um dos agentes transmitidos por estes vectores. semelhana de outros estudos (Baneth et al., 1998; Solano-Gallego et al., 2006b), doxiciclina foi o princpio activo escolhido como teraputica especfica para os animais doentes por R. conorii, embora existam outros antibiticos com eficcia conhecida contra este agente. Todos estes candeos responderam bem teraputica administrada ocorrendo remisso dos sinais clnicos apresentados. O facto de quatro animais em que no foram detectados anticorpos contra qualquer um dos agentes transmitidos por ixoddeos, terem sido na mesma submetidos a tratamento, vem apoiar o que foi dito na reviso bibliogrfica acerca das limitaes da tcnica de IFI, que por variadas razes, inerentes tcnica ou capacidade imunitria do animal, pode emitir resultados falso-negativos.

52

VI.

Concluso

As doenas transmitidas por ixoddeos assumem cada vez maior importncia tanto em animais, como em humanos. Este facto deve-se, em parte, s alteraes climticas, que proporcionam condies para a sobrevivncia dos vectores, diminuindo a mortalidade dos mesmos nos meses de Inverno. Por outro lado, a movimentao dos candeos permite-lhes estabelecer contacto, quer com os hospedeiros silvticos, quer com os hospedeiros humanos, sendo assim um potencial elo de ligao entre os dois ciclos domstico e silvtico, contribuindo desta forma para a manuteno da doena. A deteco de anticorpos pela tcnica de Imunofluorescncia Indirecta, mtodo recomendado pela Organizao Mundial de Sade, a forma de diagnstico mais frequentemente utilizada na prtica clnica. No entanto, por ter vrias limitaes, os resultados obtidos por IFI devem ser interpretados com o maior rigor possvel, sempre em associao com os sinais clnicos e indo sempre mais alm do que um simples resultado positivo ou negativo, tal como ficou patente neste estudo. Neste sentido, a opo por tcnicas de biologia molecular, pode ajudar a ultrapassar as limitaes das tcnicas de diagnstico indirecto, apesar de no existir nenhuma forma de diagnstico perfeita. Nesta amostra, foi possvel encontrar elevadas seroprevalncias de R. conorii, o que revela a abundncia de infeces por este organismo, e relacion-las com quadro clnico em candeos. No entanto, o facto de tambm existirem, nesta amostra, animais seroreactivos que no apresentavam sinais clnicos, sugere que nem todos os candeos tm a mesma susceptibilidade ao agente. Talvez em animais imunodeprimidos ou com outras patologias subjacentes, R. conorii encontre as condies ideais para se multiplicar e causar sintomas. Este estudo, com todas as limitaes que lhe esto inerentes, foi mais um contributo para o facto de que R. conorii, para alm dos inmeros casos de doena que provoca em humanos, pode tambm causar quadros clnicos em candeos. Embora existam vrias publicaes sobre Rickettsia do grupo das febres exantemticas em Portugal, estas incidem maioritariamente na populao humana e poucas se referem populao canina. Contudo, existe uma elevada seroprevalncia de R. conorii em candeos do pas. Para alm disto, j vrios estudos (portugueses e estrangeiros) associaram presena de quadro clnico nestes animais com infeco pelo agente e j foram relatados casos de riquetsiose humana que precederam doena em candeos. Analisando todos estes factores e, tendo em conta que ces podem ser sentinelas da doena no Homem, e que o nmero de casos de riquetsiose humana tem aumentado, urgente colmatar a falta de informao sobre esta doena em candeos. Neste sentido, talvez fosse interessante realizar um estudo em 53

Portugal que correlacionasse a existncia de anticorpos em candeos e na populao humana, tentando clarificar qual o papel do co como sentinela. Paralelamente, talvez a notificao dos casos de riquetsiose em candeos contribusse para a vigilncia dos casos na populao humana. Com estas medidas, poder-se-ia caracterizar e antever a evoluo da doena no pas, j que a sua erradicao praticamente impossvel. Por outro lado, talvez tambm fosse interessante realizar um estudo prospectivo numa populao de ces saudveis, fazendo titulao de anticorpos faseada no tempo e assim perceber a evoluo do ttulo, em conjunto com a evoluo do quadro clnico. Com base num trabalho deste gnero, seria mais fcil para o mdico veterinrio decidir como proceder perante um co saudvel com anticorpos contra R. conorii, nomeadamente acerca da necessidade de realizar tratamento ou qual o melhor momento para voltar realizar uma titulao de anticorpos contra o agente em questo. Ao serem realizados mais estudos sobre esta doena em Portugal, ser possvel um melhor esclarecimento da populao portuguesa, sensibilizando-a, assim, para uma preveno adequada do parasitismo, a melhor arma disposio contra o vector.

54

VII.

Referncias bibliogrficas

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61

VIII.

Anexos

Anexo I- Resumo das tarefas realizadas durante o estgio curricular Os grficos e tabelas que se seguem pretendem ilustrar as actividades realizadas no perodo de estgio.

1. Caracterizao da populao de animais assistida Das vrias espcies de animais assistidas em consulta e em internamento, os candeos tiveram o maior destaque (Grfico 7), predominando os animais do sexo masculino em candeos e feldeos (Grfico 8). Foram tambm prestados cuidados a vrios animais exticos como roedores, aves, lagomorfos e rpteis (Grfico 9). Grfico 7- Proporo das vrias espcies de pacientes assistidos em consulta e internamento
55,7

Percentagem

36,6

7,7

Candeos

Feldeos Espcie

Animais Exticos

62

Grfico 8- Proporo de machos e fmeas de candeos e feldeos assistidos em consulta e internamento

62,5 61,9

Percentagem

37,5

38,1

Machos Fmeas

Candeos

Feldeos

Espcie

Grfico 9- Tipo de animais exticos observados em consulta e internamento

32 28 28

Percentagem

12

Aves

Rpteis

Lagomorfos

Roedores

Tipo de animais exticos

2. Actividades desenvolvidas Durante o estgio, houve oportunidade de participar de forma activa em vrias actividades da clnica de pequenos animais como internamento, cirurgia, consultas, entre outros. No internamento, houve um seguimento prximo dos casos clnicos e a estagiria pode realizar diversas tarefas como tratamentos e meios complementares de diagnstico, discutir as diversas hipteses de tratamento, entre outros. Nas consultas, houve oportunidade de recolher histrias pregressas, de realizar exames fsicos, listas de diagnsticos diferenciais e meios complementares de diagnstico, quando necessrio. Os motivos que trouxeram os animais consulta foram variados (Tabela 12), predominando as alteraes patolgicas.

63

Dentro da patologia clnica, as alteraes gastrointestinais foram as mais frequentes, seguindo-se a patologia cardio-respiratria e do aparelho urinrio (Tabela 13).

Tabela 12- Tipo de consultas assistidas

Consultas Patologia Clnica Tratamentos Imunoprofilaxia Reavaliaes Urgncias Check-up Geritrico

Percentagem 59% 21% 7% 6% 6% 1%

Tabela 13- Proporo das vrias reas da patologia mdica

reas da patologia mdica Gastroenterologia Hematologia/Doenas Infecciosas Patologia Cardio-Torcica Urologia Ortopedia Endocrinologia Patologia Reprodutiva Dermatologia Oftalmologia Otologia Oncologia Neurologia Estomatologia Neonatologia

Percentagem 15,1% 12,5% 11,3% 11,3% 9,4% 7,5% 7,5% 6,0% 5,7% 5,7% 4,2% 3,8% 2,3% 1,1%

64

No que respeita a oncologia, houve a possibilidade de assistir e auxiliar nas diferentes etapas de diagnstico, tratamento e acompanhamento dos casos. O linfoma, nas suas vrias formas, foi a neoplasia mais comum, principalmente nos feldeos (Tabela 14).

Tabela 14- Tipos de neoplasias observadas em consulta

Tipo de neoplasia Linfoma Tumores do aparelho reprodutor feminino Tumores cutneos Sarcoma Sticker

Percentagem 45,5% 27,3% 18,2% 9,1%

Muitos dos animais internados e outros que vinham para consulta, necessitavam que lhes fosse realizado algum tipo de tratamento. Neste mbito, a administrao de medicamentos por via parenteral e a elaborao de pensos, principalmente no seguimento de cirurgias, foram as actividades mais desenvolvidas (Tabela 15). Tabela 15- Tipos de tratamento realizados em consulta e internamento

Tipo de tratamento Injeces Pensos Fluidoterapia em consulta Remoo de pontos ou agrafos Algaliaes Quimioterapia Transfuses sangue Enemas

Percentagem 35,7 26,8 17,9 13,4 7,1 5,4 5,4 3,6

O hospital Veterinrio do Restelo, estando aberto 24 horas, recebe vrios casos de urgncia ao longo do dia e noite (Tabela 16). As urgncias cardio-respiratrias e as intoxicaes/reaces anafilticas foram os principais motivos das consultas de urgncia assitidas.

65

Tabela 16- Tipos de urgncias assistidas

Tipo de urgncia Intoxicaes/Reaces anafilticas Urgncias cardio-respiratrias Atropelamentos Quedas de altura Convulses

Percentagem 26,9 26,9 19,2 15,4 11,5

No que confere aos animais exticos, tambm houve possibilidade de contactar com diferentes tipos de patologia nas consultas, no internamento e nas cirurgias. Neste universo, grande parte dos quadros clnicos apresentados advm de problemas de maneio como m alimentao, fraco enriquecimento do ambiente e ms condies de alojamento destes animais. A estes factos, se devem alguns casos de patologia respiratria, gastro-intestinal e queimaduras observados (Tabela 17). Tabela 17- Tipos de patologia de animais exticos

Tipo de Patologia Patologia Gastrointestinal Patologia Respiratria Sndrome Vestibular Oncologia Queimaduras Patologia Comportamental Patologia Reprodutiva

Percentagem 31,8% 22,7% 22,7% 9,1% 4,5% 4,5% 4,5%

A tabela 18 ilustra os meios complementares de diagnstico que foram utilizados durante o estgio curricular, por suspeita de algum tipo de alterao ou apenas para uma avaliao pranestsica ou check-up. Muitos destes meios de diagnstico como colheita de sangue para anlises sanguneas e radiografias foram realizados pela estagiria.

66

Tabela 18- Proporo dos mtodos complementares de diagnstico utilizados Mtodos complementares de diagnstico Anlises Sanguneas Radiologia Ecografia Abdominal Citologia Ecocardiografia Exame Electrocardiogrfico Testes Rpidos de Diagnstico Urianlise Medio Presso Arterial Puno de Medula ssea Raspagem de Pele Electroretinografia Endoscopia Percentagem 30,3% 26,5% 15,2% 3,8% 3,8% 3,8% 3,8% 3,8% 3,0% 1,9% 1,9% 1,1% 1,1%

Houve tambm oportunidade de assistir e auxiliar em vrias cirurgias predominando, neste campo, a cirurgia de tecidos moles (Grfico 8). As intervenes cirrgicas electivas, nomeadamente castraes e ovrio-histerectomias, foram as mais comumente observadas (Tabela 19). Grfico 10- Tipos de cirurgia assistidos
55,3

Percentagem

35,5

9,2

Cirurgia tecidos moles

Cirurgia ortopdica

Pequenas intervenes cirrgicas

Tipo de cirurgia

67

Tabela 19- Tipos de cirurgias de tecidos moles assistidas

Tipo de cirugia Aparelho reprodutor feminino Aparelho reprodutor masculino Aparelho digestivo Oftalmologia Extirpao de neoplasia Aparelho urinrio Outras

Percentagem 30,2% 20,9% 16,3% 16,3% 9,3% 4,7% 2,3%

Frequentemente, houve necessidade de realizar pequenas intervenes cirrgicas (Tabela 20), onde predominaram a realizao de suturas, nomeadamente em ces mordidos. Nestes casos, a estagiria pode ter tambm um papel activo, auxiliando em muitas destas intervenes. Tabela 20- Pequenas intervenes cirrgicas

Tipo de pequenas intervenes cirrgicas Suturas Remoo de cavilhas Toracocentese Bipsia Outros

Percentagem 54,1% 16,2% 13,5% 5,4% 10,8%

68

Anexo II Protocolo de deteco de R. conorii por Imunofluorescncia Indirecta do Laboratrio DNAtech

69

70

71