Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
Roteiro da Aula Prtica Nro. 1
1. Ttulo: Uso do material de laboratrio e medidas de segurana 2. Objetios: Aprender e reconhecer os diferentes materiais e instrumentais utilizados corriqueiramente no laboratrio. 3. As!ectos Tericos: 3! "aterial de la#oratrio Todo o material de laboratrio deve ser usado somente para o fim para o qual foi fabricado. 3$ %nstrumentos de &olume 'i(o aquele que apresenta uma nica marca indicando o nvel a que deve chegar o contedo lquido para se obter um determinado volume fixo. 3$! Bal)es &olum*tricos So recipientes de vidro que permitem medir com preciso volumes fixos de lquidos. So rigorosamente calibrados a determinada temperatura! no podendo ser aquecidos ou submetidos a mudan"as bruscas de temperatura. #s bal$es volum%tricos so utilizados para a prepara"o das solu"$es de reagentes em concentra"$es exatas! particularmente de solu"$es padr$es. #s bal$es volum%tricos esto calibrados para um volume exato de um lquido. #s bal$es no devem ser usados para transferir volumes. 33 %nstrumentos graduados So os que apresentam uma escala que permite medir! al%m de um volume determinado! fra"$es deste volume. 33! C+lices graduados So instrumentos de volume de pouca preciso. Se utilizam !em geral! para preparar solu"$es de concentra"o aproximada ou para obter rapidamente uma primeira aproxima"o da medida que logo ser& a'ustada. 33$ ,ro&etas graduadas 1 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica So instrumentos de medida volum%trica de pouca preciso! mas permitem uma aproxima"o maior que a do c&lice! '& que! por sua forma! uma varia"o de volume de seu contedo! pode ser apreciado por um maior desnvel. Serve! portanto! para fazer medidas r&pidas de volumes. (xistem provetas graduadas desde )ml at% v&rios litros! as provetas podero ter rolhas esmerilhadas ou ser aberta em bico para vazo. 333 ,ipetas 333! ,ipetas de &idro *entre deste tipo de pipetas devemos diferenciar entre as pipetas volum%tricas e as pipetas graduadas. As primeiras permitem pipetar um volume nico de lquido! em tanto que as pipetas graduadas permitem a pipetagem de diferentes volumes. Ainda deve ser reconhecida uma diferen"a importante+ as pipetas ,se'a de um tipo ou de outro- possuem uma o duas listras no extremo superior. A exist.ncia de duas listras significa que quando o liquido % despe'ado! o que restar dentro da pipeta no deve ser extrado ,ou soprado-. # caso contr&rio acontece 'ustamente com as pipetas que possuem uma listra. importante neste ponto considerar que diferentes tipos de solu"$es podem ter distintas viscosidade e/ou tenso superficial! com o qual um especial cuidado deve ser tomado quando se pipeta um lquido viscoso com uma pipeta de duas listras. Se o liquido % despe'ado muito rapidamente! a tend.ncia ser& a que fique maior quantidade deste lquido no interior da pipeta! com o qual o volume pipetado "#R$ %#NOR AO &A'OR NO%(NA'. 0ma pipetagem pr%via do lquido % aconselh&vel para minimizar problemas de tenso superficial. (%PORTANT#+ Sempre que pipetar &cidos ou bases fortes ,ou qualquer outro lquido que se'a corrosivo-! evitar de colocar a pipeta na boca. #S 12ST304(2T#S *( 5#604( 718# S9# *( 4A1#3 :3(;1S9# <0( #S =3A*0A*#S ( (ST9# ;A61>3A*#S :A3A A 4(*1*A *# 6?<01*# (4 04A T(4:(3AT03A *(T(3412A*A. 333$ ,ipetas autom+ticas As pipetas autom&ticas tem como vantagem a rapidez de uso. ;uidados especiais! por%m! devem ser considerados. Toda pipeta autom&tica tem dos est&gios no seu .mbolo. 2o momento de sugar o lquido! o .mbolo deve ser colocado no primeiro est&gio. :ara expulsar o lquido das ponteiras! o .mbolo tem que ser levado ao segundo est&gio. 5&rios pontos devem ser cuidadosamente verificados+
a. 2unca sugar um lquido ou solu"o colocando o .mbolo no segundo est&gio. Se for assim! o volume pipetado seria maior do que o valor nominal. b. <uando selecionar o volume! verificar que o volume escolhido este'a dentro da baixa de volumes da pipeta autom&tica a ser utilizada. #u se'a! 2 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica se por exemplo uma pipeta tem uma faixa de volumes que vai de @AA a BAAA l! sob nenhuma circunstCncia deve ser pipetado um volume de Dpor exemploE BBAA l. 2a verdade! a elei"o da pipeta adequada depende do volume que se dese'a pipetar e da faixa de volumes na qual cada pipeta trabalha. (xemplo+ num laboratrio tem @ pipetas autom&ticas. A pipeta A! tem uma faixa de volumes de BA a FA l e a pipeta ) tem uma faixa de volumes de @A a BAA l ,*igura 1a-. Se fosse necess&rio pipetar FA l! a escolha certa seria a pipeta )! devido a que o volume dese'a no fica num dos extremos da faixa de trabalho da pipeta. c. (speciais cuidados devem ser levados em considera"o quando a solu"o que se quer pipetar % c&ustica ,um &cido ou uma base forte! por exemplo-. 2este caso qualquer gota do liquido ,ou ainda o vapor do composto- que fique dentro da pipeta pode danificar seriamente o instrumental. 0ma solu"o muito simples % colocar um peda"o de algodo dentro da ponteira! verificando que no se'a atingida pelo lquido no momento de sugar. # algodo absorver& qualquer respingo que houver! impedindo que o lquido fique no interior da pipeta ,*igura 1b-. 3 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica 33- Recipiente no &olum*trico o material que se usa para conter lquidos durante a sua manipula"o mas no % um instrumento de medida. (xemplos+ tubos de ensaio! becGers! erlenmeHer! etc. 3- .*cnicas e medidas de seguran/a no la#oratrio 3-! .*cnicas de pipetagem (pipetas de &idro) 1. seguraEse a pipeta entre o polegar e os I ltimos dedos da mo. 2. ;olocaEse a pipeta no lquido,bem abaixo de sua superfcie- e aspiraE se cuidadosamente at% que a coluna do lquido este'a um pouco acima da marca superior, a aspira"o se faz comumente com a boca! no caso de lquidos vol&teis e/ou txicos! a mesma pode ser feita com p.ras de aspira"o-. 3. 7echaEse a abertura com o dedo indicador e retiraEse a pipeta da solu"o. *eixando entrar um pouco de ar vagarosamente pela extremidade superior ,controlar com o dedo indicador-! permiteEse escorrer a coluna de lquido at% a coluna atingir a marca superior ,mantendo em posi"o vertical e a marca ao nvel dos olhos-. 4. 3emoveEse ento o lquido aderente a parede externe da pipeta por um papel absorvente. 5. (m seguida! colocaEse a ponta da pipeta 'unto a parede interna do tubo receptor! deixando escoar lentamente o contedo da pipeta at% o nvel dese'ado. 2o escoamento completo % importante remover a ltima gota encostando a pipeta na parede do tubo. R#+O%#N,A-.#"+ - Ao pipetar solu"$es cu'o frasco cont%m depsito de soluto! introduzir a pipeta no sobrenadante. - 2unca introduzir pipetas su'as nos frascos que contenham solu"$es ou reativos qumicos puros. - *eveEse sempre usar pipetas secas para no diluir o lquido. 3-$ 0quecimento 4uitos materiais so constitudos de vidro especial que resiste ao aquecimento! mas deveEse ter alguns cuidados como+ - 2unca deveEse aquecer um vidro vazio em chama direta. ;uidar que por acidente possa evaporar todo o contedo. - Sempre que se aquece um lquido em um recipiente de vidro usar uma tela de amianto. - #s tubos de ensaio podem ser aquecidos em banhoEmaria ou diretamente na chama do bico de g&s! cuidando para obter um aquecimento regular ao longo do tubo. (ste tubo dever& conter lquido abaixo da metade do seu volume total. 4 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica - :ara segura o tubo so usados agarradores apropriados de madeira. - # tubo deve ser conservado sobre constate agita"o a fim de evitar superEaquecimento localizado e consequentes esguichos do material. - *urante o aquecimento! seguraEse o tubo num Cngulo de F) A ! tendo o cuidado de dirigir a boca do mesmo em dire"o adequada! a fim de evitar danos ou acidentes devido a esguichos. - A chama do bico de g&s no dever& ser amarela e luminosa! o que indicar& combusto incompleta e forma"o de fuligem! mas sim azul! para tal deve se aberta e regulada a entrada inferior de ar. Roteiro da Aula Prtica Nro. / 1. Ttulo: +ura de Titula0o 2. Objetios: 3econhecer o efeito tamponante. 1dentificar a composi"o de uma solu"o tampo. 3econhecer o significado de pGa de um &cido. 3. As!ectos Tericos: *e maneira gen%rica! ao adicionar &cido ou base J solu"o aquosa seu pK diminui ou se eleva respectivamente de forma significante. (ntretanto! ao adicionar &cido ou base Js solu"$es tamp$es estas resistem ou sofrem apenas pequenas varia"$es de pK! dentro de certos limites. (sta propriedade das solu"$es tamp$es % importante no somente Lin vitroM mas tamb%m para a prpria sobreviv.ncia dos organismos vivos. :or exemplo o pK do sangue humano mant%m uma variabilidade mnima em torno de N!I) D N!F)! e valores pouco distantes dessa faixa de normalidade caracterizam um pK incompatvel com a vida. 4. Procedimento: A1 D ;olocar em um >ecGer BAml de K @ # destilada e com o auxlio de papel indicador determinar o valor do pK. (m seguida adicionar K;l D A!)4 em fra"$es de A!)ml! agitando e medindo o ph a cada adi"o anotando os valores conforme descrito na tabela abaixo. 5olume adicionad o K@# BAml K;l A!)ml K;l A!)ml K;l A!)ml K;l A!)ml K;l A!)ml 5olume total BAml BA!)ml BBml BB!)ml B@ml B@!)ml pK 5 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica A/ D 3epetir AB! por%m utilizando 2a#K A!)4 5olume adicionad o K@# BAml 2a#K A!)ml 2a#K A!)ml 2a#K A!)ml 2a#K A!)ml 2a#K A!)ml 5olume total BAml BA!)ml BBml BB!)ml B@ml B@!)ml pK )1 D ;olocar em um >ecGer BAml de solu"o tampo acetato A!@4 e com o papel indicador medir o pK. Adicionar K;l A!)ml! agitando e medindo o pK a cada adi"o anotando os valores conforme descrito na tabela abaixo. 5olume adicionad o Tampo Acetato BAml K;l A!)ml K;l A!)ml K;l A!)ml K;l A!)ml K;l A!)ml 5olume total BAml BA!)ml BBml BB!)ml B@ml B@!)ml pK )/ D 3epetir >B! por%m utilizando 2a#K A!)4 5olume adicionad o Tampo Acetato BAml 2a#K A!)ml 2a#K A!)ml 2a#K A!)ml 2a#K A!)ml 2a#K A!)ml 5olume total BAml BA!)ml BBml BB!)ml B@ml B@!)ml pK 1. Resultados: ;ada aluno dever& construir um gr&fico em papel milimetrado colocando na abscissa as quantidades de K;l adicionadas em ordem decrescente e as de 2a#K em ordem crescente. 2a ordenada colocar os respectivos valores de pK. *evero ser construdas duas curvas! uma referente ao item A e outra ao item >! no mesmo gr&fico. Analisando o gr&fico descrever o valor do pOa do &cido ac%tico. (m cada por"o da curva >,tampo acetato- representar as formas predominantes do Pcido de >ronsted ,&cido ac%tico- e de sua base con'ugada , acetato -. 6 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica +O%PO"(-2O ,A "O'U-2O TA%P2O ,# A+#TATO (m negrito as formas predominantes na solu"o quando em equilbrio. Ao adicionar K;l ,K Q - na solu"o tampo! este on tende a se associar com o on acetato ,+3 4 +OO 5 - produto da dissocia"o do acetato de sdio ,rea"o @- formando &cido ac%tico ,rea"o B-. Assim o equilbrio % mantido! e mesmo com adi"o de K Q na solu"o este no permanece livre e portanto o pK no diminui. (sse equilbrio % mantido at% que no exista mais acetato disponvel ,proveniente da dissocia"o do sal-. Ao adicionar 2a#K ,#K E - na solu"o tampo! este on tende a se associar com o on K Q produto da dissocia"o do &cido ac%tico ,rea"o B- formando mol%culas de &gua ,rea"o I-. (ssa associa"o desloca a rea"o reversvel do &cido ac%tico para a direita! suprindo a demanda de K Q ! e o pK no % elevado. (sse equilbrio % mantido at% que no exista mais on K Q disponvel ,proveniente da dissocia"o do &cido ac%tico-! a partir da o pK come"a a aumentar. CH 3 COOH H + + CH 3 COO -
CH 3 COONa Na + + CH 3 COO -
(cido fraco. reac. 1) (base conjugada. reac. 2) H 2 O H + + HO - (reac. 3) 7 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica Roteiro da Aula Prtica Nro. 4 Ttulo: #s!ectro6otometra 7 ,osagem de Protenas 1. Objetios: Treinamento na utiliza"o de t%cnicas espectrofotom%tricas. *etermina"o da concentra"o de protenas totais numa amostra biolgica. 2. Parte e8!erimental: $! 0spectos tericos
*iversas biomol%culas absorvem luz em comprimentos de onda ,- caractersticos por este motivo podemos usar um espectrofotRmetro para fazer medi"$es da capacidade de absor"o de luz. (ste m%todo % usado para+ 1dentifica"o de mol%culas o 4edir a concentra"o de solu"$es 'embremos alguns conceitos # espectro eletromagn%tico 2a espectrofotometria vamos trabalhar na regio ultravioleta e na regio do visvel. ;ores complementares amarelo vermelho laranja verde azul violeta amarelo vermelho laranja verde azul violeta 8 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica :ara fazer uma determina"o em uma solu"o de cor azul terei que fazer incidir um feixe de luz cor laran'a ,cor complementaria do azul-! assim vou ganhar preciso na leitura. 1sto pode ser feito com um monocromador. # monocromador % utilizado para se obter uma luz monocrom&tica ,com uma nica banda espectral-. =eralmente os monocromadores no conseguem isolar um nico comprimento de onda ,-! eles isolam uma banda espectral que quanto menor se'a esta banda mais preciso vou obter. ;omo funciona um fotocolormetro e/ou em espectrofotRmetro (stes equipamentos consistem basicamente em+ *OTO+O'OR9%#TRO #"P#+TRO*OT:%#TR O 7#2T( *( 60S >ranca ,Tungst.nio- >ranca ,Tungst.nio-T deut%rioT mercrio 3(;1:1(2T( :A3A S#60U9# ;ubeta ;ubeta A absor"o de radia"$es eletromagn%ticas obedece aos seguintes dois princpios+ 7otoc%lula ;alan<metro A=>?>/1 7onte de luz 6Cmpada de tungst.nio! deut%rio ou mercrio :risma ;ubeta com amostra 7enda 1 A 1 ;alan<metro A=>?>/1 1 A 1 6ente 7iltro colorido FOTOCOLO!"#TO #$%#CTOFOT&"#TO 7otoc%lula ;alan<metro A=>?>/1 7onte de luz 6Cmpada de tungst.nio! deut%rio ou mercrio :risma ;ubeta com amostra 7enda 1 A 1 ;alan<metro A=>?>/1 1 A 1 6ente 7iltro colorido FOTOCOLO!"#TO #$%#CTOFOT&"#TO ' Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica 1( A rela"o entre a luz absorvida e o nmero de mol%culas de soluto numa solu"o ,concentra"o- % exponencial. 2( A absor"o de luz relacionaEse exponencialmente com o comprimento da distCncia que a luz percorre atrav%s da amostra (stes dos princpios foram integrados na 'ei de 'ambert5)eer+ 'ei de 'ambert5)eer. Absor0o de lu@ !elas molAculas. log I0BI= cl onde! %1 % a intensidade da luz incidenteT % % a intensidade da luz transmitidaT % o coeficiente de extin"o molar ,em unidades litro por molEcentmetro-T c % a concentra"o da solu"o a ser analisada ,moles/litro-T l % a largura da cubeta ,em centmetros-. A 6ei de 6ambertE>eer assume que a luz incidente % paralela e monocrom&tica e que a distribui"o das mol%culas na solu"o % ao acaso. A expresso log %1/% % chamada de absorbCncia ,extin"o ou densidade tica- % se designa com a letra A! ficando ento A=cl # coeficiente de extin"o molar % caracterstico de cada substancia sobre uma serie de condi"$es definidas tais como comprimento de onda! solvente e temperatura. L<uando uma faixa de luz monocrom&tica atravessa uma solu"o colorida! a quantidade de luz absorvida % diretamente proporcional J concentra"o da solu"o colorida e J espessura da camada atravessada.M
# espectrofotRmetro informa quanta luz foi transmitida ,T- ou quanta luz foi absorvida ,A-. Sendo T a percentagem de radia"o que atravessa uma solu"o homog.nea. A escala de transmitCncia % decimal e vai de A a BAAV e a de absor"o % logartmica e vai de A a @. A absorbCncia ,A- tem a vantagem de que varia em forma linear com a concentra"o da amostra. ;omo a absorbCncia % a quantidade de luz que uma solu"o absorve e a transmitCncia % a quantidade de luz que uma solu"o deixa passar! ou se'a no absorve! % lgico que as duas escalas so inversamente proporcionais. # que fa"o se a mol%cula que quero dosar no tem corW 1( :ode se transformar a biomol%cula em um composto corado por liga"$es especficas com um corante ,ex. m%todo de >iureto para dosar protenas-. 2( :oso usar radia"o da regio 05 4(T#*# *( >103(T# X um m%todo para a determina"o de protenas totais. 2este m%todo os ons cobre em meio alcalino ,reagente de >iureto- reagem com as liga"$es 1) Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica peptdicas das protenas formando uma cor prpura! que tem absorbCncia m&xima em )F) nm! proporcional a concentra"o das protenas na amostra. ;#4# #>T(3 A ;#2;(2T3AU9# *A A4#ST3AW #btida a absorbCncia no aparelho! podeEse obter o valor da concentra"o da amostra atrav%s da frmula+ ;Y A/ l. K& duas maneiras de se fazer a an&lise colorim%trica+ :elo m%todo gr&fico ou ;urva :adro :elo m%todo matem&tico ou 7ator de ;alibra"o 4T#*# =3P71;# #0 ;035A :A*39# :reparamEse alguns padr$es de concentra"$es conhecidas e fazEse a leitura das abs ;olocaEse os dados de concentra"$es no eixo das abcissas e os valores de abs no eixo das ordenadas! em um gr&fico feito em papel milimetrado! unindoEse os pontos obtidos temos a ;urva :adro dessa substCncia. Se a substCncia segue exatamente a 6ei de 6ambertE>eer! a curva % uma reta de F)Z que passa pela origem e so necess&rios poucos marcadores para sua elabora"o. <uando a substCncia no segue exatamente a 6ei de 6ambertE>eer! obtemEse uma curva qualquer e so necess&rios muitos marcadores para sua elabora"o. 4. Procedimentos: 3! Constru/2o de uma Cur&a ,adr2o 0tilizando albumina bovina como protena de refer.ncia! sero feitas solu"$es de concentra"o de [AT FAT @A e BA mg/ml. ;om esse intuito! ser& feito B ml de uma solu"o de [A mg de albumina bovina. As seguintes concentra"$es sero feitas diluindo J metade a solu"o de concentra"o imediatamente superior. 3$ Determina/2o da concentra/2o de protenas totais #s seguintes passos devem ser seguidos+ 1. Tomar \ tubos de ensaio e marcaElos B! @! I! F! Am e > e preench.E losde acordo com o seguinte esquema+ (m!ortante+ esta solu"o % c&ustica! logo deve existir cuidado na manipula"o. Tubos de ensaio marcados B [Amg/ ml @ FAmg/ ml I @A mg/ml F BA mg/ml Amostra Am >ranco > Pgua destilada 0ma gota B!) ml B!) ml B!) ml B!) ml B!) ml B!) ml 11 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica 3eagente de >iureto (m!ortante+ o 3eagente de >iureto % uma solu"o c&ustica! logo deve existir cuidado na manipula"o. *evido ao pequeno volume! esta pipetagem tem que ser realizada cuidadosamente. 33 *eixar incubar B) minutos a IN A ;! para dar tempo J forma"o do complexo colorido. 3- :assar o contedo dos tubos para cubetas pl&sticas. 6er no espectrofotRmetro a )FA nm. Tendo como refer.ncia o tubo >! para zerar a leitura. 33 1nformar os resultados no quadro. ;om os resultados de todos os grupos ser& feita uma reta comum. 34 Achar a concentra"o da solu"o problema. 12 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica Roteiro da Aula Prtica Nro. D 1. Ttulo: Eumica de Protenas 2. Objetios: *eterminar a composi"o elementar das protenas. *etermina"o do ponto isoel%trico ,p1- de protenas. 4%todos de an&lise das protenas e amino&cidos. 4. Parte e8!erimental: 4.1. Teste da com!osi0o elementar das !rotenas. 3!! 0spectos tericos As protenas so sempre compostas por ;arbono! Kidrog.nio! #xig.nio! 2itrog.nio e geralmente (nxofre. Atrav%s da pesquisa destes elementos podeEse determinar a composi"o elementar das protenas. (6(4(2T# 1*(2T171;A*# :#3 ... ;arbono ;arboniza"o do p ,:rotena- pelo aquecimento. Kidrog.nio #xig.nio *eposi"o de vapores de &gua nas paredes do tubo. 3!$ 5(perimentos E ;olocar em um tubo de ensaio uma pitada de casena em p ,o p e o tubo devem estar bem secos-. E Suspender na boca do tubo uma tira de papel tornassol vermelho umedecido em &gua destilada! e um peda"o de papel filtro umedecido em solu"o de acetato de chumbo. E Aquecer o tubo diretamente na chama e observar. E Assinalar no quadro abaixo os resultados observados. #>S(35AU](S 3(S06TA*# ;or do resduo 13 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica Aparecimento ou no de &gua 4./. ,etermina0o do !onto isoelAtrico da casena. 3$! 0spectos tericos constatado que o nmero de cargas positivas e/ou negativas presentes em uma protena depende do pK da solu"o que a contem. Assim! variando o pK da solu"o % possvel obterEse um estado em que a protena apresenta nmero igual de cargas positivas e negativas. # pK desta solu"o! nesta condi"o! % chamado de ponto isoel%trico ou p1. A determina"o do p1 pode ser obtida analisandoEse a solubilidade da protena! '& que nele as mol%culas no apresentam carga el%trica efetiva e! portanto! esto menos su'eitas J repulso entre siT consequentemente! elas tendem a coalescer e precipitar. 3$$ 5(perimentos ;#4:#2(2T(S T0># B T0># @ T0># I K@# destilada [!) m6 \!\ m6 @!F m6 Sol. ;asena B m6 B m6 B m6
E ;olocar a casena como ltimo componente E Agitar os tubos imediatamente E #bservar a turbidez logo aps a agita"o. E 5erificar o pK com pap%is indicadores e anotar no quadro abaixo os resultados. T0>#S B @ I pK Assinale com 8 o aparecimento da turbidez 4.4. Rea0o da Ninidrina 33! 0spectos tericos
<uando um amino&cido % aquecido com 2inidrina formaEse um composto intensamente corado. ;or violeta % obtida na rea"o de 2inidrina por todos os amino&cidos! peptdios e protenas que apresentam um alfaEaminogrupo livre ,a prolina e o hidroxiprolina! em que o AlfaEaminogrupo est& substitudo! produzem derivados de cor amarela-. 33$ 5(perimentos T0>#S 3(A=(2T(S B @ I F K@# ) m6 14 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica Sol. 2inidrina Bg/BAAm6 A!) m6 A!) m6 A!) m6 A!) m6 E Aquecer em banhoEmaria fervente durante BA minutos. E #bservar. E Assinalar com ,Q-! no quadro abaixo o aparecimento de cor violeta nos diferentes tubos. T0>#S B @ I F 3esultado 4.D. Rea0o do )iureto 3-! 0spectos tericos
TemEse constatado empiricamente que ;uS# F diludo Q 2a#K em contato com liga"$es peptdicas desenvolve uma colora"o viol&cea. :ara que a rea"o do >iureto se'a positiva h& necessidade da presen"a de pelo menos duas liga"$es peptdicas na mol%cula. :ortanto! amino&cidos e dipeptdios no do rea"o do >iureto positiva. (sta rea"o de colora"o dos peptdios e das protenas % largamente empregada na detec"o qualitativa e quantitativa das protenas! como veremos na prxima aula. 3-$ 5(perimentos T0>#S 3(A=(2T(S B @ I F K@# @ m6 ;uS#F A!) g V A!) m6 A!) m6 A!) m6 A!) m6 #bs.+ ;uS# F A!) V dever& ser adicionado gota a gota agitando no intervalo de cada adi"o at% o aparecimento da cor. Assinalar com ,Q- no quadro abaixo o aparecimento da cor azul viol&cea nos diferentes tubos. T0>#S B @ I F 3esultado 15 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica Roteiro da Aula Prtica Nro. 1 1 . Ttulo: +inAtica en@imtica /. Objetios:
(studar o efeito da concentra"o do substrato sobre a
velocidade das rea"$es enzim&ticas! determinando o Om. 4. Parte e8!erimental: 3!0spectos tericos 2esta aula pr&tica ser& utilizada a invertase ,>.*. frutoEfuranosideE frutohidrolase! I.@.B.@\-. (sta enzima % de grande importCncia no desenvolvimento da cin%tica enzim&tica por ter sido a que Kenri e 4ichaelis determinaram o efeito da concentra"o do substrato sobre a velocidade da rea"o enzim&tica. # trabalho pr&tico se realizar& em duas etapas+ :rimeira etapa+ 3ea"o (nzim&tica A"o da invertase sobre o substrato ,sacarose- dando como produtos frutose e glicose. enzima SA;A3#S( Q K @ # =61;#S( Q 730T#S( (sta rea"o dever& ocorrer em exatos ) min para que se possa avaliar a atividade da enzima. 2este intervalo de tempo a velocidade da rea"o para uma mesma concentra"o % constante. Segunda etapa+ 3ea"o ;olorim%trica Aps interrompida a rea"o enzim&tica com o reativo I!)*2S! iniciaEse simultaneamente a rea"o colorim%trica! ou se'a! os produtos da rea"o enzim&tica ,glicose e frutose- reagiro com o I!)*2S para formar o I!)*AS. I!)*2S EEEEEEEE Pcido I!) *initrossaliclico I!)*AS EEEEEEEE Pcido I!) *iaminossaliclico 16 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica 3$ 5(perimentos :reparar N tubos seguindo o quadro abaixo+ T0>#S B @ I F ) \ > 3eagentes Tampo Acetato pK F!N A!^ml A!^ml A!^ml A!^ml A!^ml A!^ml A!^ml K@# destilada B!)ml :ara obter um tempo de incuba"o de ) min! adicionar em cada tubo A!B ml da enzima invertase e interromper a rea"o com B ml de I!)*2S segundo o quadro abaixo+ ,agitar cada tubo aps a adi"o das solu"$es-.
T0>#S B @ I F ) \ > Tempo Tempo para a adi"o da invertase ,A!Bml- Tempo inicial A_ IA__ B_ B_IA__ @_ @_IA__ EEEEEEE Tempo para interrup"o da rea"o com Bml de I!)*2S )_ )_IA__ \_ \_IA__ N_ N_IA__ <ualE quer - ;olocar todos os N tubos em banhoEmaria a BAA A ; por )mim. - 3etirar do banhoEmaria e adicionar a cada tubo N!) ml de K @ # destilada - Komogeneizar - 6er no espectrofotRmetro contra o branco a ))Anm - Anotar as absorbCncias lidas no quadro abaixo+ T0>#S `sacarosea AbsorbCncia B B) \ FAA
17 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica - ;onstruir o gr&fico em papel milimetrado! com a concentra"o de sacarose nas abcissas e a absorbCncia nas ordenadas. *eterminar o Fm segundo 4ichaelisE4enten. 18 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica Roteiro da Aula Prtica Nro. G 1 . Ttulo: #6eito da aria0o de !3 na atiidade en@imtica /. Objetios:
Avaliar a influ.ncia do pK nas rea"$es catalisadas por enzimas.
4. Parte e8!erimental: 3!0spectos tericos # pK afeta o estado de ioniza"o dos resduos de amino&cidos das protenas. (m valores extremo de pK! existiro resduos de amino&cidos na forma ionizada que pode pre'udicar a intera"o entre o stio ativo e o substrato! diminuindo a atividade enzim&tica. 3$ 5(perimentos :reparar N tubos seguindo o quadro abaixo+ T0>#S B @ I F ) \ > 3eagentes Sol. Tampo pK I!A A!^ml K@# destilada B!)ml :ara obter um tempo de incuba"o de ) min adicionar em cada tubo A!Bml de invertase e interromper a rea"o com Bml de I!)*2S! seguindo o quadro abaixo+ ,agitar cada tubo aps a adi"o das solu"$es-
T0>#S B @ I F ) \ > 1' Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica Tempo Tempo para a adi"o da invertase ,A!Bml- Tempo inicial A_ IA__ B_ B_IA__ @_ @_IA__ EEEEE E Tempo para interrup"o da rea"o com Bml de I!)*2S )_ )_IA__ \_ \_IA__ N_ N_IA__ <ual E <uer - ;olocar todos os N tubos em banhoEmaria por ) minutos. - 3etirar do banho e adicionar a cada tubo N!) ml de K @ # destilada - Komogeneizar - 6er no espectrofotRmetro contra o branco a ))Anm - Anotar as absorbCncias no quadro abaixo+ T0>#S :K AbsorbCncia B I!A \ ^!A - ;onstruir o gr&fico em papel milimetrado! com os valores de pK nas abcissas e a absorbCncia nas ordenadas. *eterminar o valor do pK timo. 2) Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica Roteiro da Aula Prtica Nro. H 1. Ttulo: Eumica de ;licdios /. Objetios:
#bservar a idrlise &cida e enzim&tica do amido at% sua ose
fundamental! a glicose. 4. Parte e8!erimental: 3!6idrlise 7cida 0spectos tericos # amido % um homopolisacardeo noEredutor que! quando tratado com &cido sulfrico J quente! sofre uma sucesso de hidrlises at% se converter totalmente em mol%culas de sua ose fundamental! a glicose. A comprova"o da hidrlise &cida do amido se d& pela positividade da rea"o de >enedict realizada! '& que a glicose % um a"car redutor! pois possu uma nica hidroxila livre. 2o tubo ;B! que % tomado como testemunha da prova! a rea"o de >enedict foi negativa! pois no houve degrada"o do amido. 3$ 5(perimentos 1. (m I tubos marcados A! > e ;! colocar+ Tubo A D ) ml de amido Bg V e ) ml de K @ S# F @2. Tubo > D pequenas partculas de gro de milho! ) ml de K @ # destilada e ) ml de K @ S# F @2. Tubo ; D ) ml de amido BgV e ) ml de K @ #. 2. ;olocar os tubos em banhoEmaria por IA minutos. 3. *epois de retirar os tubos do banho! resfriar os mesmos. 4. 2os tubos A e >! adicionar )ml de 2a#K @2,para neutralizar o K @ S# F @2 da hidrlise-. 5. 2o tubo ; adicionar mais ) ml de &gua. 6. 3eservar os tubos. (fetuaEse agora a rea"o de >enedict! para demonstrar que o amido! por hidrlise &cida! se degradou at% glicose! conforme a seguir+ 1. Tomar outros I tubos e marc&Elos como AB! >B e ;B! adicionando em cada o seguinte+ Tubo AB D @ml do tubo A ,da etapa da hidrlise- e @ ml do reagente de >enedict. 21 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica Tubo >B E @ml do tubo > ,da etapa da hidrlise- e @ ml do reagente de >enedict. Tubo ;B E @ml do tubo ; ,da etapa da hidrlise- e @ ml do reagente de >enedict. 2. Aquecer os tubos em banhoEmaria fervente por ) minutos. 3. #bservar a redu"o ,cor alaran'ada com precipitado vermelho- nos tubos AB e >B! no tubo ;B no ocorre redu"o. 336idrlise 5n8im+tica 0spectos tericos # amido quando tratado com saliva! se degrada totalmente at% glicose! sua ose fundamental. 1sso ocorre por que encontramos na saliva a enzima Eamilase! que atua sobre o amido! realizando sua hidrlise enzim&tica. 2essa hidrlise! o amido passa pelas seguintes etapas intermedi&rias+ A%(,O +or a@ul com lugol IiodoJ
A%('O,#KTR(NA +or ro8a com lugol
#R(TRO,#KTR(NA +or ermelLa com lugol A+RO,#KTR(NA (ncolor com lugol %A'TO"# Rea0o de )enedict M ;'(+O"# Rea0o de )enedict M Ao colocarmos a saliva em contato com o amido! no tubo 8! se inicia a hidrlise enzim&tica! por a"o da Eamilase. ;onforme vamos adicionando volumes do contedo deste tubo 8 nos outros tubos que cont%m lugol! podemos observar todas as etapas do processo de hidrlise+ amilodextrina! eritrodextrina! acrodextrina! maltose e glicose ,conforme a mundan"a de cor-. <uando colocamos o reagente de >enedict no tubo 8! ocorre uma colora"o alaran'ada que indica redu"o. # amido inicial colocado no tubo! '& foi hidrolizado pela enzima chegando at% maltose e glicose. 2o experimento @ a alta temperatura inativa a enzima Eamilase pesente na saliva assim no h& hidrlise do amido! isso % comprovado pela rea"o de >enedict negativa. 3- 5(perimentos 22 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica (xperimento B+ (m N tubos de ensaio marcados A! >! ;! *! (! 7 e = colocar F gotas de lugol em cada tubo. Tomar um tubo de ensaio J parte! marc&Elo como 8 e colocar neste tubo BA ml de solu"o de amido BgV. 3etirar B ml deste tubo 8 e adicionar no tubo A. #bservar a cor azul ,neste tubo no h& hidrlise! permanece amido puro-. ;olocar [ gotas de saliva ,recolhida previamente em um >ecGer- no tubo 8. 4isturar bem! por inverso do tubo. 4arcar o tempo! e aps um minuto! colocar B ml do contedo do tubo 8 no tubo >. Aps mais um minuto! colocar B ml do contedo do tubo 8 no tubo ;. Suceder desta forma at% o tubo =. (m seguida! colocar em um tubo de ensaio @ ml da solu"o do tubo 8. Adicionar @ ml do reagente de >enedict. ;olocar em banhoEmaria fervente por ) minutos. (xperimento @+ ;olocar [ gotas de saliva ,recolhida previamente em um >ecGer- no tubo b com I!A ml de K @ #. *eixar no banho maria fervente por BA minutos. Adicionar B!A ml de solu"o de amido BV esperar ) minutos. 3etirar B!A ml da solu"o do tubo b e adicionar @ gotas de lugol. Retirar 1?> ml da solu0o do tubo N e adicionar /?> ml do reatio de )enedict. 23 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica Roteiro da Aula Prtica Nro. O 1 . Ttulo: +adeia Res!iratria /. Objetios:
*emonstrar o transporte de el%trons na cadeia respiratria.
Avaliar o efeito de um inibidor e um descapolador do transporte de
el%trons.
Avaliar o efeito de diferentes substratos no transporte de
el%trons. 4. Parte e8!erimental: 4.1. %aterial utili@ado E *issecar fgado de rato! camundongo ou peixe. Aps a extra"o do rgo! secar em papel de filtro e pesaElo. # fgado ser& homogeneizado em solu"o fisiolgica numa propor"o de I ml de solu"o por cada B g de tecido. # homogeneizado deve ser centrifugado ,)AA x g durante BA min! a F o ;- e mantido no frio. E /?G ,+*(* Idicloro6enol indo6enolJ+ 0tilizar numa concentra"o de B m4. # @! *;717 % um composto de cor azul que quando % reduzido perde esta cor. comumente utilizada na determina"o da atividade da succinato desidrogenase. #bserve que um fluxo maior de el%trons acontecendo ao longo da cadeia respiratria deveria aumenta a taxa de descoramento do @!\ *;717 24 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica E "ubstratos+ succinato numa concentra"o de BAA m4. E (nibidor da cadeia res!iratria+ O;2! numa concentra"o de BA m4. 4./. Procedimento IaJ ;ada grupo dever& preencher tr.s tubos! segundo o indicado na tabela+ Tubo 1 Tubo / Tubo 4 ,1- Tampo )AA l )AA l )AA l ,51- Substrato E B@) l B@) l ObseraPes im!ortantes:
# inibidor % um composto #KTR#%A%#NT# TQK(+O. A manipula"o fica por conta dos docentes a cargo. Aps colocar o inibidor ,passo 15-! esperar 1 %(NUTO" antes de colocar o corante e o substrato ,passos 5 e 51-.
#bserve que o Tubo 1 constitui o branco dos Tubos / e 4. IbJ ;ada grupo dever& registrar o tempo que leva descoramento em cada tubo. Alternativamente podeEse registrar numa escala qualitativa que tubo ou tubos apresentaram cor mais intensa e quais apresentaram menor cor. 25 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica IcJ #s dados ,tempo ou intensidade de descoramento- obtidos por cada grupo sero registrados numa tabela+ Tratamento Tem!o ou intensidade de descoramento Tubo B Tubo I 2o relatrio! deveram ser interpretados os resultados obtidos em cada tubo! discutindo os efeitos do inibidor utilizado. Roteiro da Aula Prtica Nro. R 1 . Ttulo: Eumica de 'i!dios /. Objetios:
*iferenciar &cidos graxos saturados e insaturados.
;aracterizar lipdios saponific&veis,complexos-.
3econhecimento da lecitina a partir da detec"o do seu grupo
fosfato e da colina. 4. Parte e8!erimental: 4.1. ,i6erencia0o entre cidos gra8os saturados e insaturados Iteste de iodo !ara cidos gra8osJ. 3!! 0spectos tericos #s &cidos graxos insaturados adicionam o iodo Js liga"$es duplas tornandoEse saturados. # vermelho rseo que se observa no tubo que cont%m clorofrmio % a cor 26 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica caracterstica das solu"$es em que o iodo se encontra na forma livre. 3!$ 5(perimento *istribuir os reagentes em F tubos de ensaio conforme o esquema abaixo+ S#60U](S T0>#B T0>#@ T0>#I T0>#F :adro de cor ,clorofrmio- @!A ml B!)ml Sol 8 ,'& pipetada- A!)ml #s &cidos graxos esto dissolvidos em clorofrmio.
Adicionar aos F tubos B gota de reativo de Kubl ,1
@ Q Kg;l @ Q etanol-.
Agitar e observar.
Adicionar mais B gota aos F tubos de reativo de Kubl! agitar e
observar.
3epetir at% que se'am adicionadas mais ) gotas de reativo em
cada tubo.
Anotar o que foi observado no quadro de respostas.
4./. "a!oni6ica0o 3$! 0spectos tericos #s lipdios complexos quando hidrolizados em meio alcalino produzem glicerol e sais de &cidos graxos. (xemplo+ 27 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica 3$$ 5(perimento
(m tubo de ensaio que '& cont%m I!A ml de lipdio! acrescentar ,com
pipeta de )!Aml- @!Aml de 2a#K BA2 e BA ml de etanol absoluto.
7echar o tubo com algodo.
;olocar em banho mara fervente! agitando ocasionalmente at% a
forma"o de uma pasta.
#bservar o produto formado e anotar na folha de respostas.
4.4. +aracteri@a0o da 'ecitina 33! 0spectos tericos A lecitina quando hidrolisada totalmente produz+ glicerol! &cidos graxos! &cido fosfrico ,K I :# F - e colina ,K#D;K @ D;K @ D2 Q E,;K I - I -. # fosfato reage com o molibdato de amRnio formando fosfomolibdato de amRnio. ;om a adi"o do reagente redutor formamEse xidos de molibd.nio que determinam a colora"o azul! o que evid.ncia indiretamente a presen"a de fosfato inorgCnico. 7osfato Q 4olibdato de AmRnio 7osfomolibdato de amRnio 7osfomolibdato de amRnio Q reagente redutor cxido de molibd.nio,azul- 33$ 5(perimento9 Determina/2o dos grupos 'os'atos H 2 C
| HC H 2 C | OCO-R 1 OCO-R 2 OCO-R 3 + 3 NaOH OH OH OH | H 2 C HC | H 2 C
+ 3 R-COO - Na + Triacilglicerdio Glicerol Sal do cido graxo 28 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica # material a ser utilizado % o hidrolisado completo de lecitina. 3eagentes T0># B T0>#@ T0>#I K @ # B!A ml Sol molibdato de amRnio B!A ml B!A ml B!A ml A<0(;(3 (4 >A2K#E4A31A :#3 B min 3eagente redutor A!F ml A!F ml A!F ml 3egente redutor+ &cido aminonaftol sulfRnico Q bissulfito de sdio Q sulfito de sdio. Agitar aps adi"o deste reagente e assinalar com ,Q- no quadro da folha de resposta o aparecimento da cor azul. 333 5(perimento9 Determina/2o dos cristais de Florence E ;olocar B gota de hidrolisado sobre uma lCmina. E Adicionar B gota de lugol concentrado. E ;olocar a lCmina no refrigerador durante o tempo de execu"o dos demais testes. E (xaminar ao microscpio o produto da rea"o entre iodo e a colina! a qual precipita sob a forma cristalina,cristais de 7lorence- J temperatura inferior a B) o ;.
2' Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica 3) Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica Roteiro da Aula Prtica Nro. 1> 1 . Ttulo: +romatogra6ia /. Objetios: 1. (studar os princpios b&sico da cromatografia e suas aplica"$es na identifica"o de compostos executando o processo de cromatografia em papel. 4. Parte e8!erimental: 3! 0spectos .ericos9 A cromatografia % um m%todo fsicoEqumico de separa"o e identifica"o de substCncias baseado na diferen"a de afinidade de duas ou mais substCncias em rela"o a um material estacion&rio e uma fase mvel. A fase mvel pode ser lquida ou gasosa e a fase estacion&ria pode ser lquida! slida ou fase ligada. A cromatografia em papel possui fase mvel lquida. 0m eluente que % escolhido conforme os compostos a serem analisados na pr&tica de aula % composto por >utanol/ Acetona/ Pcido Ac%tico/ Pgua ,I)/I)/N/@I v/v-. A fase estacion&ria % slida representada pelo papel. 3$ 5(perimento9 1. ;om auxlio de um tubo capilar de vidro aplicar uma gota de cada uma das solu"$es de amino&cidos ,glicina! alanina! creatina e a mistura- nos respectivos pontos indicados no papel! as gotas devem estar a B!) D @!A cm da borda inferior e B!A cm entre cada gota. 2. =rampear as extremidades do papel conforme orienta"o. 3. 1mergir o papel no eluente que est& no >ecGer de modo que a extremidade do papel que cont%m os pontos fique em contato com o lquido. 4. Tampar o >ecGer. 5. *eixar proceder a cromatografia por aproximadamente FA minutos. 6. 3etirar o papel. 7. 4arcar a altura do solvente. 8. *esgrampear. '. Secar o papel com secador. 1). >orrifar o papel com reativo revelador ,solu"o de ninidrina-. 11. ;olocar o papel na estufa J FA Z 31 Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica 12. 4arcar com l&pis as manchas formadas delimitando o seu contorno e centro geom%trico. 13. #bservar a separa"o das substCncias da solu"o 4. 33 C+lculo do R' (Fator de Reten/2o)9 3f % uma constante fsica importante para determinar um composto. 3f Y distCncia de migra"o percorrida pela amostra / distCncia de migra"o percorrida pelo eluente ,istCncia de migra0o !ercorrida !ela amostra+ % a distCncia entre o ponto de aplica"o at% o centro geom%trico da mancha. ,istCncia de migra0o !ercorrida !elo eluente+ % a distCncia entre o ponto de aplica"o e a frente percorrida pelo eluente. 32