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S c i e n t i a Ch r o ma t o g r a p h i c a
CROMATOGRAFIA LQUIDA (LC) / ESPECTROMETRIA DE MASSAS
A Cromatografia Lquida Moderna
e a Espectrometria de Massas:
finalmente compatveis?
Resumo
A cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC ou CLAE) uma das principais tcnicas utilizadas na
anlise de compostos no volteis e/ou termicamente instveis. Apesar de ser uma excelente tcnica de separao, a
HPLC necessita de uma tcnica confirmatria quando a anlise qualitativa (confirmao da identidade qumica)
tambm necessria. Dentre as vrias opes existentes neste momento, a espectrometria de massas a tcnica que
melhor fornece as informaes estruturais necessrias; o acoplamento
entre estas duas tcnicas d origem a uma ferramenta analtica verstil e
de grande potencial na anlise qualitativa e quantitativa: a LC/MS
(Cromatografia Lquida acoplada Espectrometria de Massas). O
presente artigo apresenta de forma crtica e detalhada os fundamentos
do acoplamento LC/MS.
Abstract
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is one of the most utilized analytical techniques for
determination of non volatile and thermally unstable compounds. Although being a separation technique, HPLC
requires a confirmatory technique when qualitative analysis is being performed. Amongst the several available
complimentary techniques, Mass Spectrometry is the one that supplies
the structural information required to complement the HPLC
separation; by coupling these two techniques, a powerful tool become
available for qualitative and quantitative analysis: LC/MS (Liquid
Chromatography-Mass Spectrometry). This paper presents in a critical
and detailed description the fundamentals of the LC/MS technique.
Palavras-chave
Cromatografia Lquida; HPLC;
CLAE; Espectrometria de Massas;
LC/MS.
Keywords
Liquid Chromatography; HPLC;
Mass Spectrometry; LC/MS.
Fernando M. Lanas
Universidade de So Paulo
Instituto de Qumica de So Carlos
13560-970 So Carlos (SP)
Brasil
flancas@iqsc.usp.br
Fernando M. Lanas
Editor
S c i e n t i a C h r o m a t o g r a p h i c a
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1. Introduo: Fundamentos da
Cromatografia Lquida Moderna
(HPLC ou CLAE)
A instrumentao necessria para a
Cromatografia Lquida Moderna mais complexa e
sofisticada do que aquela empregada em
Cromatografia Lquida Clssica. Apesar de que, em
alguns casos mais simples, um equipamento mais
modesto pode ser empregado; na separao e
quantificao de amostras complexas, um grau maior
de sofisticao , usualmente, necessrio.
Diferentemente da cromatografia gasosa, na qual
todos os itens do cromatgrafo so enclausurados em
uma caixa selada, em cromatografia lquida, os
equipamentos so, frequentemente, modulares.
Assim, geralmente, possvel intercambiar um
mdulo de um equipamento (um detector, por
exemplo) de uma marca por um equivalente de outra
marca, o que permite que os equipamentos sejam
montados com mdulos provenientes de diferentes
fabricantes, de acordo com o interesse do usurio.
Isso permite ao usurio configurar um cromatgrafo
lquido de acordo com as suas necessidades e
preferncias, e no de acordo com modelos rgidos
preestabelecidos
1
.
A figura 1 ilustra um diagrama esquemtico de
um LC moderno. O solvente, tambm denominado
eluente ou fase mvel, acondicionado em um frasco
apropriado, impulsionado, ou aspirado, por uma
bomba de alta presso em direo coluna. No
caminho, a amostra introduzida na fase mvel, por
de uma vlvula de introduo de amostra (ou vlvula
de injeo) e arrastada para a coluna, na qual ocorre a
separao. O efluente da coluna direcionado para
um detector, que acusa a presena dos analitos eludos
da mesma. O sinal gerado pelo detector captado por
um software apropriado, tratado no computador, e um
cromatograma gerado, mostrando a variao do
sinal do detector em funo do tempo de anlise
2-5
.
As tcnicas cromatogrficas de anlise esto
entre as principais tcnicas de separao,
especialmente na anlise de substncias presentes em
matrizes complexas, tais como fluidos biolgicos,
produtos naturais, sedimentos de rio e outras. Isto se
deve, principalmente, sua capacidade de separao
dos componentes presentes nas misturas em funo da
eficincia e do poder de resoluo das colunas
modernas.
A cromatografia lquida foi definida na
primeira dcada do sculo passado, pelos trabalhos do
botnico russo, Mikhail S. Tswett. Seus estudos eram
focalizados na separao de pigmentos em uma
coluna empacotada com partculas, pigmentos estes
extrados de plantas usando solventes
6
.
Geralmente, atribui-se a Csaba Horvth ao redor
de 1970 a proposta da sigla HPLC (inicialmente
significando High Pressure Liquid Chromatography
e, posteriormente, com a evoluo da tcnica, High
Performance Liquid Chromatography).
Em cromatografia lquida moderna (HPLC ou
CLAE), o uso de detectores como ndice de Refrao
7,8
,
Ultravioleta
9-12
, Espalhamento de luz
13-15
,
Fluorescncia
16
e outros
17
, aliados a softwares
dedicados, permitem a anlise quantitativa dos
componentes das misturas em concentraes
extremamente baixas. Apesar de tais caractersticas, a
utilidade desta como tcnica de identificao bastante
Figura 1. Diagrama ilustrativo das principais partes de um cromatgrafo lquido moderno.
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limitada
1
. Mesmo com grandes esforos obtidos pelo
uso de colunas de diferentes polaridades,
desenvolvimento de sistemas de ndices de reteno e
outros artifcios, a anlise qualitativa sujeita a muitos
erros devido ao uso dos tempos de reteno para a
identificao dos analitos. Apesar do tempo de reteno
ser caracterstico de um composto, ele no nico, ou
seja, vrios compostos podem ter o mesmo tempo de
reteno nas condies cromatogrficas empregadas
18
.
Desta forma, poder ocorrer coeluio entre vrios
compostos, sendo o pico identificado como apenas um
deles (ou ento como outro composto ainda). A maneira
encontrada para solucionar este problema foi,
inicialmente, utilizar um detector fotomtrico operando
nas regies ultravioleta e visvel (UV-VIS) do espectro,
no qual dois comprimentos de onda distintos eram
monitorados (usualmente 220 nm e 254 nm). A razo
entre o sinal obtido com um padro analtico para os dois
comprimentos de onda (A
220
/A
254
) deveria ser a mesma
que a obtida para o composto suspeito. Certamente, um
grande inconveniente neste caso a necessidade de
conhecer-se o composto a ser identificado (ou, pelo
menos, ter uma suspeita de sua identidade) para que uma
soluo de um padro analtico do composto suspeito
pudesse ser preparada, analisada pelo mesmo mtodo e,
posteriormente, comparada com a do composto-alvo ou
suspeito. O desenvolvimento dos detectores UV-VIS de
comprimento de onda varivel, baseados nos
espectrofotmetros ao invs dos fotmetros, permitiu a
obteno dos espectros completos de um pico
cromatogrfico nesta regio espectral
19
. Apesar de um
avano em relao s situaes anteriores, os espectros
obtidos para uma grande quantidade de picos presentes
em amostras complexas eram de pouco auxlio devido
falta de especificidade dos mesmos e a similaridade
entre vrios dos compostos em anlise. O
desenvolvimento dos detectores baseados em arranjos
(malhas) de diodos (Photodiode Array, PDA),
adicionou mais uma facilidade: o uso de vrios diodos
para adquirir e armazenar dados de uma faixa espectral e
o desenvolvimento de computadores rpidos, com boa
memria e a custos compatveis, permitiram a gerao
de espectros tridimensionais e o uso de softwares
apropriados para determinao automtica da pureza de
picos cromatogrficos. Apesar de o grande avano em
relao situao existente no incio do
desenvolvimento da tcnica, a identificao positiva dos
picos cromatogrficos ainda era uma situao difcil, na
maioria dos casos. Este quadro teve uma mudana
recentemente com o desenvolvimento de novas
ferramentas que permitiram uma melhora no
acoplamento entre cromatografia lquida e
espectrometria de massas (LC/MS)
20,21
.
2. Fundamentos da
Espectrometria de Massas (MS)
A histria da Espectrometria de Massas
moderna geralmente considerada como havendo
sido iniciada com os experimentos de J.J.Tomson
(Figura 2) sobre raios catdicos. Ao aplicar um campo
eltrico no tubo, Tomson, em 1897, observou uma
deflexo do eltron dentro do mesmo (Figura 3),
sendo esta considerada uma das primeiras
determinaes da razo m/z. Tomson ganhou o
prmio Nobel de Fsica em 1906 por estes estudos.
Figura 2. J.J. Tomson, considerado o pai da
Espectrometria de Massas moderna.
Figura 3. Esquema dos experimentos de J.J. Tomson com raios catdicos. esquerda, montagem antes da aplicao do campo
eltrico; direita, deflexo do eltron com a aplicao do campo.
O desenvolvimento da Espectrometria de
Massas at seu estgio atual resultou em um nmero
considervel de ganhadores do Premio Nobel em
Qumica e em Fsica diretamente vinculados aos
avanos na tcnica (Figura 4), alm de outros que a
utilizaram na soluo de problemas aplicados de
diferentes reas do conhecimento. A Tabela 1 resume
os principais avanos na rea.
Tabela 1. Avanos importantes no desenvolvimento da
Espectrometria de Massas(MS).
Data Pesquisador Local Contribuio
1897 J.J.Tomson
Manchester,
England
Experimentos com tubos de
raios catdicos, os quais so
considerados o incio da
Espectrometria de Massas
1953 W. Paul Alemanha
Inveno do quadrupolo e
do on trap
1968 M. Dole USA
Desenvolvimento do
Electrospray
1974 Horning USA Desenvolvimento do APCI.
1983 Vestal USA
Desenvolvimento do
Thermospray
1984 J.Fenn USA
Demonstrao da
aplicabilidade prtica do
Electrospray
De acordo com o Prof. J. B. Fenn (Figura 5),
ganhador do Premio Nobel em Qumica no ano de 2002
pelo trabalho pioneiro no uso de Electrospray como
fonte de ionizao branda para espectrometria de massas
22
, a Espectrometria de Massas a arte de medir
tomos e molculas para determinar suas massas
moleculares. Tal informao sobre a massa ou peso
muitas vezes suficiente, frequentemente necessria, e
sempre til na determinao da identidade de uma
espcie. Para praticar esta arte, colocamos carga nas
molculas de interesse, isto , os analitos, e ento
medimos como as trajetrias dos ons resultantes
respondem, sob vcuo, a vrias combinaes de
campos eltricos e magnticos. Claramente, a condio
sine qua non deste mtodo a converso de
molculas neutras de um analito em ons .
A Figura 6 ilustra um esquema genrico e
simplificado de um espectrmetro de massas (MS). A
amostra a ser analisada introduzida por um inlet
(dispositivo para a introduo da amostra no
espectrmetro) e direcionada para a fonte de
ionizao. Nos estgios iniciais do desenvolvimento
da tcnica, a amostra era introduzida pela vaporizao
direta da mesma; com o desenvolvimento das tcnicas
cromatogrficas tornou-se bastante comum o uso de
um cromatgrafo como fonte de introduo da
amostra no MS. Neste ltimo caso, os picos
cromatogrficos gerados pela separao dos
componentes da amostra so individualmente
introduzidos na fonte de ionizao do MS para gerar
os ons a serem posteriormente separados no
analisador e encaminhados para deteco e
quantificao. Um software apropriado instalado em
um computador efetua os clculos, gera os espectros
de massas a serem impressos e comanda as funes do
espectrmetro.
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Figura 4. Ganhadores do Premio Nobel em Qumica e em Fsica associados diretamente ao desenvolvimento da Espectrometria
de Massas (MS).
Figura 5. J. B. Fenn, um dos ganhadores do Premio Nobel
em Qumica, no ano de 2002, pelo trabalho pioneiro no uso
de Electrospray como fonte de ionizao branda para
espectrometria de massas.
2.1. Sistemas de introduo da amostra (inlets)
A insero direta, ou seja, a introduo direta da
amostra na fonte de ons do espectrmetro sem prvia
separao, uma tcnica pouco utilizada atualmente,
uma vez que o MS sozinho melhor para a anlise de
compostos puros. No passado, o composto alvo era
previamente isolado e ento inserido diretamente
atravs de uma sonda, processo lento e que dificultava
a anlise de impurezas em concentraes muito
baixas
23
. A alternativa para amostras com elevada
volatilidade era o acondicionamento da amostra em
frascos de vidro no formato de bales; as amostras
eram introduzidas no MS pela abertura de vlvulas de
controle (Figura 7). Nas ltimas dcadas, o
acoplamento da Espectrometria de Massas com a
Cromatografia Gasosa (GC-MS) por meio do uso de
fontes de ionizao apropriadas, notadamente, a
ionizao por impacto eletrnico (EI) e ionizao
qumica (CI) possibilitaram o uso da tcnica MS em
anlises rotineiras. A GC-MS uma ferramenta
analtica poderosa, utilizada usualmente na anlise de
misturas complexas de compostos em fase gasosa. Isto
limita a tcnica anlise de compostos volteis e
semivolteis, de baixa polaridade e baixa massa
molecular. Para compostos de massa molecular maior
e/ou maior polaridade e menor volatilidade, o
acoplamento entre Cromatografia Lquida e
Espectrometria de Massas (LC-MS) a tcnica de
preferncia. Os sistemas de ionizao utilizados neste
caso sero comentados no prximo item.
2.2. Fontes de Ionizao
As formas de ionizao que tiveram maior
sucesso, e por isso so as mais empregadas no
acoplamento GC-MS, so o impacto eletrnico (EI) e
a ionizao qumica (CI). Essas formas de ionizao
operam em baixas presses (Figura 8), usualmente
denominadas vcuo (na verdade, no ocorre formao
de vcuo mas uma diminuio da presso na fonte de
ons com o auxlio de bombas denominadas,
incorretamente, de bombas de vcuo). Dentre elas, o
impacto por eltrons , de longe, a mais popular, uma
vez que usualmente fornece um grande nmero de
ons os quais permitem a identificao da substncia
em estudo.
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Figura 6. Esquema das principais partes de um
Espectrmetro de Massas.
Figura 7. Sistema para Insero (Introduo) direta de Amostra Gasosa em MS.
As fontes de ionizao, inicialmente
investigadas para o acoplamento LC-MS, foram
baseadas no impacto eletrnico (EI) e na ionizao
qumica (CI) empregadas com sucesso no
acoplamento GC-MS. Entretanto, devido s
diferentes caractersticas existentes entre as fases
mveis empregadas nas duas tcnicas de separao
(GC e HPLC), este acoplamento mostrou-se
inadequado para anlise de compostos em baixas
concentraes, alm de no apresentarem robustez
necessria. Aps dcadas de esforos novas fontes de
ionizao foram desenvolvidas as quais so capazes
de combinar duas caractersticas em um mesmo
sistema: facilitar a transferncia da amostra que sai da
coluna para a fase gasosa (interface coluna-MS) e a
ionizao da amostra. As fontes que mostraram
melhor desempenho no acoplamento LC-MS
produzem a ionizao em presso atmosfrica (API,
Atmospheric Pressure Ionization) ao invs de vcuo
como em EI e CI utilizadas em GC-MS (Figura 9). As
formas de ionizao mais utilizadas no momento no
acoplamento LC-MS, as quais operam presso
atmosfrica so: Electrospray (ESI, Electrospray
I onization) > Ionizao Qumica Presso
Atmosfrica (APCI, Atmospheric Pressure
Chemical I onization) > Ionizao por Ftons
Presso Atmosfrica (Atmospheric Pressure Photon
I onization). Dentre estas, o Electrospray , de longe,
a forma de ionizao mais empregada no acoplamento
LC-MS, seguida da APCI. A ionizao por ftons,
APPI mais recente, sendo a terceira forma de
ionizao mais empregada nesta tcnica
24
.
Ionizao pelo processo Electrospray
A ionizao pelo processo Electrospray (ESI)
permite a criao de ons na presso atmosfrica ao
invs de vcuo. Neste processo, a amostra dissolvida
em um solvente, usualmente no polar, e pressurizada
em um tubo capilar feito de ao inox, ao qual
aplicada uma voltagem tipicamente entre 3.000 e
5.000 V. Como resultado, o lquido emerge do capilar
presso atmosfrica, na forma de um aerossol. As
gotculas formadas perdem sucessivamente o solvente
(so dessolvatadas) e os ons fluem para o
espectrmetro de massas induzidos pelos efeitos da
atrao eletrosttica e pelo vcuo (lembrar que apenas
o processo de ionizao ocorre presso atmosfrica;
a partir deste ponto, o espectrmetro de massas se
encontra sob vcuo).
Os detalhes de como efetivamente ocorre o
processo Electrospray ainda motivo de muita
discusso e controvrsia. Os dois mecanismos mais
aceitos para explicar o fenmeno so o proposto por
Dole
25
, em 1968, tambm conhecido como
mecanismo do resduo de carga ou da fisso, e o
proposto por Iribarne e Tomson
26
, em 1976,
conhecido como mecanismo da evaporao do on.
De acordo com Dole, medida em que as gotculas
evaporam, sua carga permanece inalterada. Ainda de
acordo com este mecanismo, como a tenso
superficial das gotculas incapaz de se opor s foras
repulsivas resultantes da carga imposta, estas
explodem em inmeras gotculas menores,
denominada exploso coulmbica. Este processo
continua at que apenas um on do analito permanea;
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Figura 8. Montagem das principais partes de um espectrmetro de massas tpico, ilustrando a fonte de ons dentro de um sistema
submetido a alto vcuo.
Figura 9. Montagem das principais partes de um espectrmetro de massas tpico, ilustrando a fonte de ons fora do sistema de
alto vcuo. Neste caso, a ionizao ocorre presso atmosfrica (API).
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aps a evaporao da ltima gotcula do solvente,
forma-se um on em fase gasosa. De acordo com o
mecanismo proposto por Iribarne e Tomson,
pequenas gotculas so tambm formadas na exploso
coulmbica, como o proposto por Dole. A diferena
principal entre estes modelos que Iribarne e
Tomson
6
propem que a partir da formao das
gotculas, a fora do campo eltrico na superfcie
destas suficientemente elevada para remov-las da
superfcie, transferindo diretamente para a fase gasosa
energeticamente mais favorvel para ons solvatados.
A Figura 10 ilustra de forma simplificada estes
dois mecanismos, evidenciando na parte superior a
formao das gotculas, processo comum aos dois
mecanismos, e a partir da as diferenas entre o
modelo da evaporao do on e o da fisso ou
exploso Coulmbica.
Mais recentemente, M. Cole props que os
dois mecanismos podem operar simultaneamente
28
.
O mecanismo de Dole
25
, ou do resduo de carga, seria
predominante em massas superiores a 3.000 Daltons
(Da); o mecanismo de Iribarne e Tomsom
26
, ou da
evaparao do on predominaria em massas
inferiores. De qualquer forma, nenhuma das
propostas encontra unanimidade entre os usurios da
ionizao via Electrospray.
Uma montagem tpica de uma sonda de
Electrospray colocada frente e ortogonal entrada
dos ons apresentada na Figura 11. Observa-se que
um gs em contracorrente, usualmente N
2
, utilizado
para diminuir os aglomerados de ons indesejveis
que se formam (clusters), assim como para facilitar
o processo de eliminao do solvente (dessolvatao).
No modo de ionizao Electrospray (ESI), o
efluente da coluna de cromatografia lquida entra na
sonda do ESI com carga balanceada; quando a deixa,
carrega uma carga inica lquida. Para assegurar que a
ESI seja um processo contnuo, a soluo precisa
compensar a carga por processos eletroqumicos nos
quais uma superfcie condutiva age como eletrodo, no
qual ocorre transferncia de eltrons (Figura 12). O
Electrospray pode ser operado no modo positivo ou
negativo, dependendo do sinal da tenso aplicada. No
modo positivo, as gotculas que saem do spray tero
carga positiva e o eletrodo receber os eltrons,
ocorrendo um processo de oxidao. De forma
anloga, no modo negativo o oposto ocorrer.
Figura 10. Mecanismos da evaporao do on e da fisso
Coulmbica (modificado de Cech e Enke)
27
.
Figura 11. Desenho simplificado de uma sonda para
Electrospray. esquerda, figura esquemtica da sonda;
direita as setas ilustram o caminho percorrido pelo
nitrognio em contracorrente, empregado para minimizar os
clusters no espectro, assim como para auxiliar no
processo de eliminao do solvente (dessolvatao).
O desenho bsico de uma interface para
LC-MS utilizando a ionizao via Electrospray
apresentado na Figura 13. A sada da coluna de
HPLC conectada sonda (probe), formada por um
tubo capilar de metal circundado por um fluxo de gs
nebulizador (geralmente N
2
). Aplica-se uma
diferena de potencial de alguns milhares de volts
entre a ponta do tubo de metal e o cone de amostragem
(para melhor visualizao, veja Figura 11), criando
um spray formado por gotculas do analito na fase
mvel, e o gs nebulizador. O solvente ento
evaporado (usualmente com auxilio de aquecimento
da sonda para facilitar a evaporao), pelos processos
descritos na Figura 10, fazendo com que a gotcula
diminua sucessivamente de tamanho, at que os ons
do analito evaporem e sejam direcionados para o cone
de amostragem indo, ento, para o analisador de ons.
Ionizao Qumica Presso Atmosfrica
(Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI)
A introduo da ionizao qumica presso
atmosfrica (APCI) usualmente atribuda a Horning,
o qual, em 1973, demonstrou o funcionamento deste
modo com vrias tcnicas de introduo da amostra,
incluindo a HPLC
30
. Esta tcnica de ionizao tem
sido utilizada principalmente na anlise de molculas
no polares e mais volteis, as quais no apresentam
as caractersticas desejveis para serem convertidas
em ons na fase gasosa a partir de uma fase
condensada como um lquido em HPLC. Na tcnica
APCI (Figura 14), os analitos provenientes da coluna
de cromatografia lquida so introduzidos na sonda
(usualmente um tubo capilar de vidro o qual
circundado e continuamente lavado com um gs
denominado de make-up gs ou gs auxiliar,
usualmente N
2
) cuja extremidade circundada por um
sistema de aquecimento e dentro da qual um gs
adicional passa continuamente para volatilizar a
amostra e solvente (gs nebulizador). Prximo
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Figura 12. Os ons formados no processo Electrospray so conduzidos para o contraprato pelo campo eltrico aplicado.
(modificado da referncia
29
).
Figura 13. Interface do tipo Electrospray utilizada para o
acoplamento LC-MS.
sonda, instalada uma agulha metlica, denominada
de eletrodo de descarga tipo corona, que, submetido a
um potencial de alguns milhares de Volts, provocar o
aparecimento do denominado efeito corona. Este
efeito ocorre quando um material condutor
submetido a um campo eltrico elevado, provocando
uma descarga parcial e tendo como resultado uma
ruptura eltrica da atmosfera circundante do condutor
devido ionizao provocada pelo efeito corona. No
caso do acoplamento LC(APCI)MS, o efluente da
coluna, ao sair da sonda, conter vapores do analito,
da fase mvel e gs nitrognio; a fase mvel ser
ionizada pelo efeito corona descrito, reagindo com o
analito em fase gasosa.
Utilizando-se uma interface do tipo APCI,
pode-se operar tanto no modo positivo (PCI, Positive
Chemical Ionization), quanto no modo negativo
(NCI, Negative Chemical Ionization). O sucesso
do processo depender basicamente da afinidade
protnica do analito. No modo positivo, o analito (M)
precisa ter uma afinidade por prtons maior do que o
eluente (BH
+
), de maneira que o analito ir abstrair o
prton dele, formando uma espcie denominada ion
quase-molecular (quasi-molecular ion), de
acordo com a Equao 1:
PCI: BH
+
+ M [M+H]
+
+ B (eq.1)
eluente analito quasi-molecular ion
sendo BH
+
= cidos de Bronsted.
O quase-molecular on formado neste caso
corresponder molcula original protonada, ou seja,
com uma unidade de massa a mais do que o on
molecular (espcie formada quando espcie original
perde apenas um eltron). Portanto, subtraindo-se
uma unidade de massa do quase-molecular on
possvel, neste caso, obter-se a massa molecular do
analito em estudo.
No modo negativo (Eq.2), a afinidade por
prtons da fase mvel (eluente) dever ser menor do
que o analito, de maneira que o analito ir doar o
prton para o eluente:
NCI: B
-
+ M [M-H]
-
+ BH (eq.2)
eluente analito quasi-molecular ion
sendo B
-
= bases de Bronsted
Neste caso, o quase-molecular on
corresponder ao analito desprotonado, ou seja, com
uma unidade de massa a menos que o on molecular, o
que permite a determinao da massa molecular do
analito.
Apesar da transferncia de prtons ser a forma
mais comum em ionizao qumica, a formao de
diversos adutos tem sido tambm utilizada com
sucesso nesta tcnica. Um exemplo bastante comum
a formao de adutos com sdio ou potssio, dando
origem aos ons [M+Na]
+
e [M+K]
+
ao invs de
[M+H]
+
. Quando sais provenientes de cidos fracos e
bases fracas como o acetato de amnio so
empregados na fase mvel, pode ocorrer formao de
adutos do tipo [M+NH
4
]
+
.
Fotoionizao Presso Atmosfrica
(Atmospheric Pressure Photoionization , APPI)
O princpio da interface APPI baseia-se na
absoro de ftons de luz pelo analito, ocasionando sua
ionizao com perda de um eltron, e formando um
ction radicalar do tipo M
+
(por simplicidade,
usualmente representado por M
+
). Este on radicalar
poder ser detectado nesta forma, ou participar de
reaes com o ambiente que o circunda, formando
outros ons os quais sero detectados
31
. O processo mais
comum, neste caso, ser a abstrao de um tomo de
hidrognio do solvente
32
, de acordo com a Equao 3:
M + hv M
+
+ e
-
M
+
+ HX [M+H]
+
+ X
-
(eq.3)
Uma variao deste procedimento consiste no uso
de um Dopante (D), substncia ionizvel a qual
adicionada fase mvel para carregar cargas
(alternativamente, um solvente fotoionizvel pode ser
utilizado para o mesmo propsito), conforme Equao 4.
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Figura 14. Interface do tipo APCI (Atmospheric Pressure
Chemical Ionization) para LC-MS.
D + hv D
+
D
+
+ M [M+H]
+
+ D [-H] (eq.4)
Nesta tcnica, tanto os ons produzidos por
ionizao do solvente, quanto pelo dopante, podem
reagir com molculas neutras do analito (via
diferentes processos como transferncia de prtons ou
reaes de transferncia de carga) provocando a
ionizao do analito em estudo
33
. Quando um dopante
empregado nesta tcnica de ionizao, o sistema se
assemelha bastante ao APCI, da a tcnica ser tambm
denominada photoionization-induced APCI ou
dopant APPI
32
.
No momento da redao deste artigo, existiam
dois fornecedores principais de fontes APPI utilizadas
em equipamentos de diferentes fabricantes: a Syagen
(USA), que produz uma fonte de geometria aberta
com uma lmpada de elevada intensidade, e que
tambm pode utilizar dopantes, e a MDS Sciex
(Canad), que projetou uma fonte que inclui um tubo
de reao para aumentar as reaes on-dopante.
A ionizao produzida por esta fonte
usualmente branda, com o aparecimento de poucos
ons no espectro, uma vez que o potencial de ionizao
da maioria dos solventes acima de 10 eV, energia do
fton primrio emitido por uma lmpada de Criptnio
(Kr), usualmente empregada nesta tcnica.
Um esquema de uma fonte de APPI mostrado
na Figura 15. Comparando-se com a Figura 14,
observa-se a grande similaridade entre as fontes
(APPI e APCI), com a principal diferena sendo a
substituio da agulha de descarga corona utilizada
em APCI por uma lmpada UV em APPI.
Comparao entre as fontes de ionizao
Electrospray (ESI), APCI e APPI
A Figura 16 ilustra a faixa aproximada de
aplicaes destas formas de ionizao utilizadas em
LC-MS, e sua comparao com a faixa tpica de uso
da GC-MS. Observa-se alguma sobreposio entre
elas, sendo que a GC-MS, tanto empregando EI
quanto CI, representa o extremo para molculas no
polares e de baixa massa molecular, enquanto que a
LC-MS, empregando Electrospray como fonte de
ionizao, representa o outro extremo ideal para
anlise de molculas mais polares e de massa
molecular maior.
Como regra geral, a ESI prefervel para a
anlise de compostos bastante polares ou inicos,
termolbeis, ou com massa molecular elevada
(superior a 1.000 Da). Compostos no polares ou de
polaridade muito baixa tendem a apresentar melhor
ionizao empregando-se APPI, enquanto que os
pouco polares e de polaridade intermediria
geralmente do bons resultados com APCI.
Com relao a operao em fluxos (vazes)
mais elevados da fase mvel, a APCI bastante
sensvel faixa de operao, diminuindo a sua
capacidade de ionizao com a diminuio do fluxo
(vazo). Por outro lado, tanto o ESI quanto APPI
funcionam bastante bem em fluxos baixos,
compatveis com o uso de colunas capilares e nano.
A ESI uma tcnica de ionizao bastante
robusta, sendo a mais utilizada no presente, em
especial para a anlise de protenas, aminocidos, e
vrias substncias de interesse em bioanaltica,
alimentos e farmacutica. A alternativa mais recente
S c i e n t i a Ch r o ma t o g r a p h i c a
44 www. sci ent i achromatographi ca. com
Figura 15. Interface do tipo APPI (Atmospheric Pressure
Photoionization) para LC-MS.
Figura 16. Principais caractersticas das formas de ionizao
empregadas em LC-MS e sua comparao com GC-MS.
para a anlise de compostos no polares a APPI;
entretanto, em se tratando de uma tcnica
relativamente nova, ainda est em fase de
aprimoramento e vrias novas aplicaes esto sendo
publicadas. Novos desenvolvimentos instrumentais
(fonte com outras gases que no o Kr; multifonte
contendo ESI/APCI/APPI, e lmpadas mais intensas)
esto em andamento, sugerindo que a APPI poder, a
curto prazo, tornar-se a forma de ionizao de escolha
em LC-MS para substncias no polares
33
.
Enquanto que a ESI funciona muito bem
somente em fase reversa (em fase normal poder
necessitar de reaes ps-coluna para adequar as
condies da fase mvel aos requisitos para obter-se
boa ionizao), a APCI e APPI funcionam melhor em
fase normal e razoavelmente bem em fase reversa.
Outro aspecto a ser considerado a supresso de
ons, a qual mais comum em ESI do que nas outras
duas formas de ionizao discutidas neste trabalho.
Este fenmeno ocorre devido a uma competio na
ionizao quando a amostra contm sal ou analitos
que podem sofrer ionizao com facilidade nas
condies utilizadas no experimento. A eliminao
(ou minimizao) deste efeito importante para
anlise quantitativa, e deve ser levado em conta
quando no desenvolvimento do mtodo
cromatogrfico. Em APCI este efeito pouco
pronunciado, e em APPI praticamente inexistente
34
.
Finalmente, a estabilidade trmica do analito
em estudo importante, e a APCI a pior dentre as
trs formas de ionizao para anlise de compostos
termolbeis, seguida da APPI. O ESI o modo de
ionizao prefervel para analitos de baixa
estabilidade trmica.
2.3. Analisadores de Massas
O efluente da coluna cromatogrfica, aps ser
ionizado geralmente presso atmosfrica (API)
por um dos processos descritos no item anterior (ESI,
APCI ou APPI) - direcionado para o analisador de
massas. Os analisadores de massas separam os ons de
acordo com a relao existente entre suas massas e
cargas, ou seja, a razo m/z. As caractersticas de
construo e operao diferem de um analisador para
outro, assim como seus benefcios e limitaes. Uma
vez que existe hoje uma grande diversidade de
analisadores de massas, a escolha do mais apropriado
deve ser efetuada considerando-se a aplicao (ex.
faixa de massas desejada), desempenho (ex.
resoluo) desejado e custo (em funo do tipo de
analisador, um MS para o acoplamento LC-MS pode
variar desde algumas dezenas de milhares de dlares,
at valores superiores a um milho de dlares, preo
FOB). Em funo destes fatores, no existe um
analisador de massas o qual seja ideal para todas as
aplicaes, conforme discutido h 2 dcadas por
Brunnee
35
.
2.3.1. Analisadores de massas baseados em setores
eltricos e magnticos
Nos estudos experimentais sobre a natureza
dos raios catdicos (eltrons), J. J. Thomson
empregou campos magnticos e eltricos a um feixe
de eltrons obtendo uma estimativa da razo m/e para
este feixe
36
. O equipamento utilizado considerado
como o precursor dos espectrmetros de massas
modernos, muitos dos quais ainda utilizando os
mesmos princpios com pequenas modificaes
tecnolgicas.
Em um espectrmetro de massas de deflexo
magntica, os ons ao deixarem a fonte so acelerados
a uma alta velocidade, passando por um setor
magntico no qual um campo magntico aplicado na
direo perpendicular da direo do movimento do
on. Quando uma acelerao aplicada
perpendicularmente direo de movimento de um
objeto qualquer, sua velocidade permanece constante
e o mesmo viajar em um caminho circular. Assim, o
setor magntico segue um arco; o raio e o ngulo do
arco variam de acordo com os detalhes de construo.
Um setor magntico sozinho ir separar ons de
acordo com a razo massa/carga; entretanto, a
resoluo neste caso ser limitada pelo fato de que os
ons saindo da fonte no tero exatamente a mesma
energia e, portanto, no tero exatamente a mesma
velocidade. Para melhorar a resoluo, adiciona-se
um setor eltrico que focaliza os ons de acordo com
suas energias cinticas. O formato ser o mesmo do
campo magntico, ou seja, em arco, uma vez que
aplicar uma fora perpendicular direo do
movimento do campo.
Nos espectrmetros denominados
equipamentos de setores, dois tipos de princpios
fsicos (campos associados aos setores) so
empregados: magntico (B) e eltrico (E). Um on de
carga ze movimentando-se em um campo magntico
B descrever um movimento circular de raio r
m
, no
qual a fora centrfuga igualada fora que o campo
magntico exerce sobre o on, de acordo com a
Equao 5:
ze Bv
mv
r
m
=
2
(eq.5)
2009 | v. 1 | n. 2 45
S c i e n t i a Ch r o ma t o g r a p h i c a
por meio da qual pode-se determinar mv, a quantidade
de movimento (Eq.6):
mv = ze B r
m
(eq.6)
Neste caso, o campo magntico funciona como
um separador baseado na quantidade de movimento
ou momentum, mv. Para que ons de mesma massa e
carga sigam o mesmo caminho (r
m
) em um campo
magntico (B) fixo, necessrio que o momentum
(ou, alternativamente, para uma dada massa a
velocidade v ou a energia cintica mv
2
/2) seja
constante.
Acelerando o on em um campo eltrico V
a
,
conferindo ao mesmo uma energia cintica
conhecida, teremos:
mv
ze V
a
2
2
= (eq.7)
Pela Eq. 6, a velocidade v pode ser dada por :
v
ze B r
m
=

m
(eq.8)
Substituindo a velocidade v (Eq.8) na Eq. 7,
teremos:
m ze B r m
ze V
m
a
[( / )]
2

2
= ou (eq.9)
m ze B r
m
ze V
m
a
( )
2 2 2
2
2

= ou (eq.10)
ze B r
m
ze V
m
a
2 2 2
2

= ou (eq.11)
Portanto,
ze B r m ze V
m a
2 2 2
2 = (eq.12)
Isolando-se m obtem-se (Eq.13)
ze B r
m
ze V
m
a
2 2 2
2

= ou
ze B r
V
m
m
a


2 2
2
= (eq.13)
Dividindo-se os dois lados por z obtem-se
(Eq. 14)
e B r
V
m
z
m
a


2 2
2
= (eq.14)
Portanto, neste caso a razo m/z do on uma
funo dos parmetros experimentais B e Va,
conforme mostra a Eq. 14 rearranjada:
m
z
e B r
V
m
a
=


2 2
2
(eq.15)
Neste caso, a energia cintica dos ons
depender de suas energias iniciais e da distribuio
espacial antes da acelerao. Assim, formado um
setor eletrosttico.
Quando os ons se movem por um campo
eltrico radial, o caminho ser determinado por:
mv
r
zeVe
d
e
2
= (Eq.16)
Ve = potencial aplicado nos pratos
d = distncia entre os pratos
r
e
= raio do caminho dos ons no campo eltrico
Para uma dada geometria, r
e
e d so fixos; o
potencial aplicado Ve seleciona a energia cintica mv
2
/2.
medida em que os ons se movem com a
mesma velocidade por dos dois setores (eltrico e
magntico), suas velocidades podem ser igualadas
nos dois setores, de acordo com a Equao 17:
zeBr
m
zeV r
md
m e e
= (Eq.17)
Esta equao permite medir-se um espectro de
massas pela varredura do campo eletrosttico (V
e
),
magntico (B) ou ambos, de acordo com:
m
z
ed
V r
B r
e e
m
=
2 2
(Eq.18)
Observa-se que a razo m/z independente do
potencial de acelerao inicial (V
a
).
A Figura 17 ilustra um espectrmetro de massas
denominado de duplo foco ou duplo setor (magntico e
eltrico). Espectrmetros deste tipo so capazes de
operarem em elevadas resolues (frequentemente
acima de 10.000) na determinao de massas
superiores a 15.000 Da, com exatido de massas
elevada. Estes parmetros podem ser ampliados para
valores ainda melhores, diminuindo-se a voltagem
aplicada e estreitando as fendas. Porm, isto ocorrer s
custas de uma diminuio significativa da
sensibilidade. Uma diminuio no espalhamento de
ons e melhora na transmisso dos mesmos pode ser
conseguida operando a fonte de ons em valores
elevados (superiores a 8.000 V), o que cria uma
dificuldade para o acoplamento LC-MS, empregando
ESI como modo de ionizao devido formao de
arco voltaico pela elevada voltagem e presses
relativamente altas. Este problema tem sido corrigido
em instrumentos de gerao mais moderna. Como
ocorre com qualquer outro equipamento, estes
instrumentos apresentam vantagens e limitaes,
dependendo da aplicao e dos recursos financeiros
disponveis.
S c i e n t i a C h r o m a t o g r a p h i c a
46 www. sci ent i achromatographi ca. com
As principais vantagens apresentadas pelos
equipamentos que utilizam setores eltrico e
magntico como analisadores de ons so a alta
resoluo e exatido de massas. As principais
limitaes so o elevado custo e complexidade (tanto
na aquisio, operao, quanto manuteno),
velocidade limitada de varredura, sensibilidade baixa
quando operado em resolues elevadas, potenciais
problemas no acoplamento com LC-ESI devido a
formao de arco voltaico. Em funo destas
caractersticas, e das limitaes, este tipo de
instrumento, atualmente, mais empregado em
medidas de massas com alta resoluo e em estudos
bsicos em MS, tais como estudos de fragmentao.
2.3.2. Analisadores de massas do tipo Quadrupolo
O quadrupolo o analisador de massas mais
popular no momento devido, principalmente, sua
simplicidade, preo relativamente baixo, boa
linearidade em anlises quantitativas, facilidade de
ser entendido e operado. Apesar de usualmente ser
operado em resoluo baixa (tipicamente R= 1.000),
esta pode ser aumentada em condies favorveis
para valores superiores a 4.000. Sua exatido de
massas encontra-se, geralmente, entre 0,1 e 0,2
unidades de massa atmica (u.m.a., a.m.u. ou Dalton),
e a faixa de massas usualmente entre 10 e 4.000 u.m.a.
O quadrupolo composto de quatro barras,
usualmente feitas de metal (quadrupolos de vidro j
foram produzidos e comercializados, porm
descontinuados), dispostas em dois pares (Figura 18).
Apesar das barras com sesso de choque hiperblico
serem mais eficientes, por questes econmicas
utiliza-se usualmente barras cilndricas. Um par de
barras mantido em um potencial eltrico positivo,
enquanto que o outro a um potencial negativo. Uma
combinao de corrente contnua (DC) e
2009 | v. 1 | n. 2 47
S c i e n t i a Ch r o ma t o g r a p h i c a
Figura 17. Esquema simplificado de um espectrmetro de massas de duplo foco ou duplo setor.
Figura 18. Arranjo das quatro barras utilizadas em um
analisador do tipo quadrupolo.
S c i e n t i a Ch r o ma t o g r a p h i c a
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radiofrequncia (Rf) aplicada nas barras. O par
positivo de barras atuar como um filtro para massas
mais elevadas, enquanto que o par negativo age como
um filtro para massas pequenas. Os quadrupolos
operam a uma resoluo constante (a qual depende da
razo Rf/DC), mantendo a razo Rf/DC constante.
Considerando-se uma dada amplitude para as
voltagens Rf e DC, somente os ons que apresentarem
determinada razo massa/carga (m/z), a qual esteja
em ressonncia com o campo aplicado, iro passar
pelas barras do quadrupolo e sero detectados. Os
demais ons que entrarem no quadrupolo tero suas
trajetrias instveis e, como consequncia, atingiro
as barras e sero eliminados pela bomba de vcuo
(Figura 19). Estas voltagens aplicadas criam nas
barras um campo hiperblico dado por (Eq.19):
= +

( cos( . ) V V t
x y
r
dc rf

2 2
0
(eq.19)
A fora sobre o on posicionado nas
coordenadas x,y ser proporcional sua distncia do
eixo z, e a sua janela de estabilidade determinada pela
frequncia da V
rf
() e pela razo V
rf
/V
dc
. A distncia
entre as barras (r
0
) e a frequncia do potencial RF ()
so constantes para um dado quadrupolo, e as
equaes de movimento que descrevem esta janela de
estabilidade podem ser numericamente resolvidas em
funo de dois parmetros (Eq. 20 e 21):
a
eV
m r
dc
=
4
2
0
2

(eq.20)
q
eV
m r
rf
=
2
2
0
2

(eq.21)
Mantendo constante a razo V
dc
/V
rf
, um
grfico de a x q permite definir graficamente uma
linha de estabilidade dos ons. Frequentemente a
razo V
dc
/V
rf
selecionada de maneira que uma janela
de 1 Da escolhida, resultando em uma resoluo
unitria em toda a faixa de massa analisada.
2.3.3. Analisadores de massas do tipo Ion Trap
Os analisadores do tipo ion trap
(aprisionadores de ons) so tambm denominados de
quadrupolo tridimensional ou quadrupolo ion trap,
enquanto que os quadrupolos descritos no item
anterior so denominados simplesmente quadrupolos
ou, alternativamente, quadrupolos lineares. Nos
analisadores do tipo ion trap um eletrodo
hiperblico na forma de um anel (denominado ring
electrode) colocado entre dois eletrodos
hiperblicos denominados, eletrodos end cap.
Uma voltagem Rf (corrente alternada, AC), de
amplitude varivel V e com frequncia ao redor de 1
MHz, aplicada ao ring electrode, enquanto que os
eletrodos end cap so aterrados (Figura 20). Os
dois eletrodos end cap apresentam um orifcio no
centro; o eletrodo superior permite a passagem dos
ons provenientes da fonte de ionizao (eletrodo de
entrada) e direcionados para o ring electrode,
enquanto que o orifcio do eletrodo de sada serve
para direcionar os ons ejetados para deteco (Figura
21). Neste tipo de analisador normalmente no se
aplica voltagem DC (corrente direta); apenas a Rf.
Tipicamente, o filamento ligado e os ons dentro do
trap (armadilha) formados ou nele introduzidos
com um valor de m/z acima de um limite estabelecido
por V sero aprisionados (trapped) por um tempo
Figura 19. Esquema de um analisador do tipo quadruplo mostrando que os ons em ressonncia com o campo aplicado
atravessam as barras e dirigem para o detector onde sero registrados.
2009 | v. 1 | n. 2 49
S c i e n t i a Ch r o ma t o g r a p h i c a
ao redor de 1 ms (milisegundo). O filamento ento
desligado, e uma varredura de V executada para
obter-se um espectro de massas. Os ons de razo
massa/carga igual a m/z sero acelerados na direo
do eixo z, e ejetados pelo eletrodo end cap de sada
dos ons sendo, ento, detectados. As equaes que
descrevem o movimento dos ons do on trap so
similares s descritas para o quadrupolo linear, e no
sero discutidas.
A repulso entre ons de mesma carga
confinados no centro do trap tende a desestabilizar
suas trajetrias por disperso (efeito space-charge).
Para contornar este problema, adiciona-se um gs
usualmente He ou H
2
a uma presso de 10
-3
torr - o
qual resfria os ons por coliso (perda de energia
cintica), mantendo-os aprisionados com refocalizao
para o centro do trap e aumentando a resoluo e
sensibilidade.
Juntamente com o quadrupolo linear, o ion
trap um dos analisadores de ons mais populares no
momento devido a seu custo relativamente baixo
(comparvel ao quadrupolo) e pequeno tamanho
podendo ser utilizado na obteno de analisadores
que ocupam pouco espao. Sua resoluo similar
do quadrupolo linear (unitria), podendo ser
aumentada empregando-se varreduras mais lentas em
uma faixa de massas menor. Nestas condies,
resolues prximas de 5.000 podem ser obtidas. As
aplicaes tpicas deste analisador so similares
quelas do quadrupolo.
2.3.4. Analisadores de massas do tipo
Time-of-Flight (Tempo de Vo)
Apesar de ser geralmente aceito que o conceito
do analisar do tipo TOF foi desenvolvido por William
Stephens
37,38
,

na Universidade da Pensilvnia (USA)
em torno de 1946, foram William Wiley e I.H.
McLaren da empresa Bendix (USA) os pioneiros a
desenvolverem e comercializarem um equipamento
deste tipo, no final de 1955
39
.
Em um sistema do tipo TOF, os ons formados
na fonte de ionizao so extrados e acelerados em
alta velocidade por um campo eltrico em um tubo
longo denominado usualmente drift tube, aps o
qual atingem o detector. A velocidade alcanada pelo
on acelerado proporcional raiz quadrada de sua
razo m/z por simplicidade, assume-se ser
inversamente proporcional massa. De forma
anloga, o tempo necessrio para um on atravessar o
tubo ser inversamente proporcional raiz quadrada
da razo m/z tambm por simplicidade, comum
assumir-se que o mesmo proporcional massa - uma
vez que a distncia entre a formao do on e o
detector fixa (depende do comprimento do tubo). A
Figura 22 ilustra de forma esquemtica um analisador
do tipo TOF em uma de suas configuraes mais
simples, enquanto que a Figura 23 apresenta cpia de
uma pgina da patente original de Stevens.
O princpio de operao do TOF baseia-se na
medida do tempo de voo de um on dentro do
espectrmetro de massas. Uma vez que as dimenses
do tubo e a energia cintica dos ons so bem
conhecidas, o clculo da razo m/z torna-se simples.
Figura 20. Eletrodos que formam a parte principal de um
analisador do tipo ion trap. O eletrodo central (em forma
de anel, ou ring electrode) circundado por dois
eletrodos sendo um de entrada e outro de sada dos ons.
Figura 21. Viso geral de um analisador do tipo ion trap
ilusrando os eletrodos de entrada, central (ring electrode)
e de sada.
S c i e n t i a Ch r o ma t o g r a p h i c a
50 www. sci ent i achromatographi ca. com
Figura 22. Desenho esquemtico de um analisador do tipo TOF em uma configurao linear, um de
seus modos mais simples.
Figura 23. Pgina da patente [USA- 2612607] onde Stephens descreve seu analisador tipo TOF. O pedido de patente foi
preenchido em 5 de abril de 1947, e a patente confirmada em setembro de 1952 . |Source=United States Patent and Trademark
Office |Date=1952 |Author= USPT).
A energia cintica de um on submetido a um
campo eltrico E ser dada por (Eq. 22):
mv
zeE
2
= (eq.22)
onde E a energia do campo eltrico usado na
acelerao do on em Volts; m a massa do on; z a
carga do on; e a carga de um eltron e v a velocidade
final do on aps a acelerao.
Isolando-se a velocidade nesta equao,
obtem-se a Equao 23:
v
zeE
m
=
2
(eq.23)
Uma vez que a distncia da fonte de ons ao
detector conhecida e igual a d, o tempo t necessrio
para o on atravessar o tubo ser (Equao 24):
t
d
v
d
zeE
m
d
m
z
eE
= = =

2
1
2 2
1
2
(eq.24)
Como d, e, e E so constantes e podem ser
agrupadas como c, o tempo de voo t de um on ser
proporcional raiz quadrada da razo m/z (Equao 25) :
t
m
z
c =
1
2
(eq.25)
Ou seja, medindo-se o tempo de vo t a razo
m/z ser determinada, uma vez que os componentes
do termo c so constantes.
Uma vez que para a medida do tempo t
fundamental estabelecer o incio e final do evento, os
ons precisam ser formados por ionizao pulsada (a
durao do pulso ao redor de 0,2 a 1 milisegundo
ms). Isto torna possvel converter o efluente lquido
do LC em um pacote contendo os ons a serem
acelerados. Apesar de a preciso na medida de tempo
influenciar diretamente na determinao correta da
razo m/z, a energia cintica inicial e a distribuio
espacial dos ons sero importantes. Variaes na
energia cintica e na posio do on ao entrar na etapa
de acelerao iro modificar sua energia, provocando
erros na medida do tempo de voo e, como
consequncia, da razo m/z, resultando em perda de
resoluo no TOF.
A introduo de um refletor (tambm
conhecido como espelho de ons ou espelho
eletrnico) e o uso de tcnicas ortogonais de
introduo dos ons (o-TOF) contriburam para a
melhora da resoluo por meio de um aprimoramento
no controle ou compensao do espalhamento inicial
de energia e na distribuio espacial dos ons.
O reflectron (tipo de TOF que utiliza um
refletor no tubo de voo), proposto pelo pesquisador
russo, Boris A. Mamyrin
40,41
, utiliza um campo
eltrico aplicado a uma srie de grades ou eletrodos
(tambm denominados pratos ou discos) para reverter
a direo da trajetria dos ons que entram nele. Por
meio deste dispositivo, os ons de mesma razo m/z
chegam ao mesmo tempo no detector, ainda que
apresentem diferenas em sua energia cintica.
A parte (a) da Figura 24 mostra uma ilustrao
de um on formado na fonte sendo acelerado pelo
drift tube em direo ao detector, sem ajuda do
reflectron. Na parte (b) da mesma figura o reflectron
ligado observando-se que a trajetria do on agora
ser curva, a disperso dos ons de mesma razo m/z
diminuda e a resoluo aumentada, e os ons
retornam ao drift tube antes de serem detectados.
Desenvolvido inicialmente como um sistema
de um nico estgio, o reflectron evoluiu para um de
duplo estgio, largamente empregado em
analisadores atuais. O relectron de um estgio (Figura
25 a) consiste em uma regio na qual aplicado
apenas um campo eltrico, podendo ser linear ou no
linear. O reflectron no linear pode ter campo curvo
42
ou quadrtico
43
.
2009 | v. 1 | n. 2 51
S c i e n t i a Ch r o ma t o g r a p h i c a
Figura 24. Esquema simplificado de um TOF com o reflectron fora de operao (esquerda) e em operao (direita), ilustrando a
curva na trajetria dos ons provocada pelo reflectron.
Um reflectron de duplo estgio possui duas
regies nas quais so aplicados campos eltricos
diferentes (Figura 25b); o campo aplicado na primeira
regio, o estgio maior, o que reduz o tamanho do
equipamento e melhora a focalizao dos ons
44
.
Um campo eletrosttico constante
empregado no reflectron para reflexo do feixe de
ons em direo do detector. Os ons de maior energia
percorrero uma distncia maior no reflectron,
enquanto que os ons de menor energia percorrero
uma distncia menor. A Figura 26 uma fotografia de
um reflectron evidenciando as placas metlicas que
conduzem a voltagem formando um campo eltrico o
qual reflete os ons.
Alm do uso do reflectron, outra forma de
aumentar a resoluo utilizando analisador do tipo
TOF com o uso de geometria ortogonal (o-TOF).
Neste sistema os ons so produzidos de forma
contnua na fonte de ionizao (Electrospray, por
exemplo) e acelerados e focalizados com ajuda de
lentes apropriadas. A seguir, aplica-se uma acelerao
pulsada ortogonal (perpendicular) ao movimento dos
ons, os quais iro adquirir velocidades as quais so
independentes de suas velocidades adquiridas pela
acelerao na fonte (Figura 27).
O desempenho do oa-TOF (TOF com acelerao
ortogonal) pode ser ainda melhorado com a adio de
um gs. Este colide com os ons em um guia de vrios
polos (usualmente, um quadrupolo ou hexapolo
operando apenas com radiofrequncia modo
rf-only) diminuindo a energia (resfriando) dos ons
antes de entrarem na regio de acelerao ortogonal,
tambm denominada pulser, resultando na
focalizao dos ons em um feixe de dimetro menor. Na
regio de alto vcuo situada antes do pulser, um
conjunto de lentes eletrostticas torna o feixe de ons
paralelo, minimizando problemas de
divergncia na direo de acelerao.
A combinao destes sistemas
acelerao ortogonal e resfriamento
por coliso com gs, juntamente com
o reflectron, aumentaram a resoluo
dos atuais TOF MS, sem diminuir sua
sensibilidade.
A Figura 28 ilustra o esquema
de um TOF MS atual de alta
resoluo, com acelerao ortogonal
e reflectron. Os hexapolos e
quadrupolos servem de guia para os ons no modo
TOF, podendo ser utilizados para uma montagem em
tandem ou MS-MS do tipo Q-TOF (quadrupolo-tempo
de voo). Estes equipamentos possuem elevada
resoluo (no modo linear a resoluo limitada), boa
sensibilidade, velocidade de varredura muito rpida
(importante para picos cromatogrficos estreitos).
Porm, exigem eletrnica bastante sofisticada, bom
controle do tempo e da energia inicial e distribuio
espacial dos ons. Sua aplicao bastante ampla,
especialmente quando alta resoluo necessria. A
faixa de massas que analisa ampla (teoricamente
ilimitada, mas, na prtica, massas muito elevadas
muito superiores a 500.000 Da - so difceis de serem
determinadas com boa preciso e exatido).
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Figura 25. Esquema de um reflectron (a) um estgio, linear
(b) duplo estgio.
Figura 27. Pgina da patente {U.S. Patent 7230234}onde T.
Kobayashi descreve um espectrmetro de massas do tipo
tempo de voo (TOF) com acelerao ortogonal (Orthogonal
acceleration time-of-flight mass spectrometer (submetido
em 13 de julho de 2005 por Tatsuji Kobayashi ).
Figura 26. Reflectron de duplo estgio contendo 46 placas metlicas (Shimadzu, Japo).
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2.3.5. Outros tipos de Analisadores de Massas
Apesar de existirem outros analisadores de
massas para MS, os trs descritos at o momento
(quadrupolo, ion-trap e TOF) so, de longe, os mais
empregados no acoplamento LC-MS. Enquanto que
os dois primeiros so compactos, apresentam grande
simplicidade, baixo custo, e facilidade operacional,
apresentam como principal limitao a baixa
resoluo. O TOF, por outro lado, perde para os dois
analisadores nestes quesitos, mas apresenta resoluo
muito superior, principalmente no modo ao-TOF, o
que pode ser necessrio em anlises que requeiram
alta resoluo. Outro tipo de analisador de massas,
introduzido comercialmente mais recente e de custo
ainda acentuadamente elevado (porm com resoluo
igualmente superior aos 3 analisadores j discutidos)
o FTICR (Fourier Transform Ion Cyclotron
Resonance ou Ressonncia Ciclotrnica de ons
com Transformada de Fourier).
O FTICR-MS, tambm conhecido apenas
como FT-MS, foi desenvolvido por Mel Comisarow e
Alan G. Marshall, na Universidade de British
Columbia, Canad, em 1974
45
. Os fundamentos da
tcnica foram baseados no uso da Ressonncia de ons
em Ciclotron Espectrometria de Massas (ICR-MS),
publicado por Hipple em 1949
46
e na existncia do
fenmeno bem estabelecido e conhecido do uso de
Transformada de Fourier em Ressonncia Magntica
Nuclear (FT-NMR).
Em FT MS, os ons gerados na fonte passam
por uma srie de estgios de diminuio de presso,
em direo a um alto vcuo. Ao entrarem na cela
(Figura 29), que sero aprisionados (ion trap), a
temperatura estar prxima ao zero absoluto e a
presso ao redor de 10
-8
bar. Isto conseguido
mantendo-se a cela dentro de um supercondutor de
alto campo magntico (geralmente entre 4,7 e 13
Tesla, valores estes que tm sido aumentado
rapidamente) o qual resfriado pelo emprego de
nitrognio e hlio, ambos no estado lquido. Ao
passarem pelo campo magntico B, os ons tero sua
trajetria descrita por um movimento circular em um
plano perpendicular ao do campo (Figura 30). A fora
F sentida por um on de carga z e velocidade v ao
entrar no campo magntico B ser dada pela
expresso de Lorentz (Eq. 26):
F = z v x B (eq.26)
Os ons no so expulsos da cela graas a uma
pequena voltagem (corrente contnua) aplicada aos
Figura 28. Analisador do tipo TOF com sistema de acelerao ortogonal e Reflectron, podendo operar no modo
LC-MS/MS na configurao Q-TOF (quadrupolo -TOF) ou no modo LC-TOF utilizando o quadrupolo apenas
como filtro de massa ao invs de analisador, ou seja, aplicando apenas radiofreqncia, Rf (Rf-only mode).
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eletrodos de aprisionamento (trapping electrodes)
a qual gera um campo eltrico E perpendicular ao
campo magntico B.
A frequncia de rotao de um on no ciclotron
(
c
) depende de sua massa (m) e carga (z) de acordo
com a Equao 27:

c
zB
m
=
2
(eq.27)
No incio do experimento nenhum sinal
observado, pois o raio do movimento muito pequeno.
Varrendo-se a radiofrequncia RF pulsada pelas placas
de excitao existentes na cela, possvel excitar-se
cada on com razo m/z. Cada frequncia de excitao
entra em ressonncia com determinado on e o excita
para rbitas maiores, onde induz uma corrente
alternada entre as placas do detector (Figura 31). A
corrente induzida tem a mesma frequncia de ciclotron
dos ons, e intensidade proporcional a seu nmero.
Quando a frequncia sai de ressonncia para uma dada
razo m/z, os ons retornam ao estado primitivo e um
outro pacote de ons com a prxima razo m/z ser
excitado e o processo continua desta forma. Para efeito
prtico, entretanto, considera-se as frequncias como
simultneas, resultando em espectros complexos da
variao da frequncia com o tempo. Este sinal
complexo gerado sofrer deconvoluo por meio de
mtodos, empregando transformada de Fourier
47
,
resultando em espectros que apresentam a variao de
intensidade em funo da frequncia
c
.
Rearranjando-se a Equao 27, obtm-se a expresso
que relaciona m/z com a frequncia
c
, a qual permite a
converso ento do espectro para intensidade em
funo da massa, de acordo com a Eq. 28:
m
z
B
c
=
2
(eq.28)
Uma calibrao do sistema deve ser feita neste
momento. Estas transformaes, representadas na
Fig. 31, podem ser melhor visualizadas na Figura 32.
Figura 29. Foto de uma cela ICR de um espectrmetro de massas
LTQ-FT-ICR da Thermo-Electron. A cela feita de placas de cobre em
forma cilndrica e insataladas em um sistema de vcuo. Acessvel em
http://en.wikipedia.org/wiki/File:ICR_Cell.jpg. O autor da foto Jeff Dahl
e o acesso mesma foi efetuado em 21.02.2009.
Figura 30. Movimento de um on antes e depois do processo de excitao, mostrando a rbita
ciclotrnica percorrida. Em (a) os ons aprisionados oscilam com amplitude trmica baixa,
incoerente; em (b) a excitao varre os ons em rbita eletrnica coerente; em (c) um
pr-amplificador e digitalizador pegam os potenciais induzidos na cela.
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Figura 31. Esquema simplificado de um sistema FT-ICR-MS ilustrando a deteo e gerao de sinal via o
aprisionamento de on (ion trap).
Figura 32. Etapas de transformao do sinal at obter-se o espectro de massas na forma
m/z versus intensidade do on.
O FT MS o analisar de massas para uso
acoplado com LC (Fig. 33) que apresenta a maior
resoluo (superior a 10
6
, ou seja, quase ilimitada),
sensibilidade e velocidade de aquisio de dados.
Entretanto, seu custo ainda elevado, possuindo uma
tecnologia mais complexa que os demais analisadores
descritos, especialmente em relao ao alto vcuo
necessrio. Sua principal aplicao, no momento,
em estudos onde uma resoluo extremamente
elevada necessria, ou para estudos fundamentais de
fragmentao de molculas.
2.4. Detectores
O detector o ultimo mdulo de um
espectrmetro de massas (Figura 6). Assim como o
analisador considerado o corao de um
espectrmetro de massas, o detector pode ser
entendido como seus olhos. Novos detectores so
necessrios para corrigir, melhorar e ampliar a
deteco de ons e, portanto, nossa viso qumica
48
.
O detector registra a carga induzida ou a corrente
produzida quando um on atravessa uma superfcie ou
atinge sua superfcie. No caso de um
equipamento que possa efetuar uma
varredura de massas, o sinal produzido no
detector durante uma varredura em
funo da razo m/z ou posio do on na
varredura, ir gerar um espectro de
massas (Figura 34). Assim, um espectro
de massas um registro dos ons
detectados em funo da razo m/z.
As principais fontes de ionizao e
os analisadores mais utilizados no
momento foram comentados, assim como
a significativa evoluo tecnolgica
nestas reas. Entretanto, os detectores de
ons no receberam a mesma ateno; a
maior parte do avano deveu-se a
melhoras nos conceitos existentes do que
em inovaes brilhantes.
Existe atualmente uma grande
variedade de detectores para MS, sendo a
escolha efetuada a partir do projeto do
espectrmetro e suas aplicaes analticas.
Os mais empregados sero discutidos a
seguir; o leitor interessado no assunto deve
consultar a excelente reviso de Barnes e
colaboradores
48
.
2.4.1. Chapas Fotogrficas
As chapas fotogrficas foram
empregadas como primeiro sistema de
deteco em larga escala para
espectrometria de massas. J.J. Thompson
utilizou chapas fotogrficas com
anteparos luminescentes para visualizar e
mostrar espectros de massas. Foto-placas
sensveis a ons foram, posteriormente,
colocadas na regio de vcuo de um
espectrmetro de massas para a deteco
direta de ons. At recentemente estes
dispositivos eram fabricados, e alguns
ainda se encontram em utilizao ao redor
do mundo. A Figura 35 ilustra um
S c i e n t i a C h r o m a t o g r a p h i c a
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Figura 33. Acoplamento LC(ESI)-FT MS (Cromatografia Lquida e
Espectrometria de Massas com Transformada de Fourier empregando uma
fonte de ionizao do tipo Electrospray).
Figura 34. Registro da abundncia (ou intensidade) dos ons detectados em
funo da razo massa/carga (m/z), denominado espectro de massas, para o
composto n-decano (C
10
H
22
).
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S c i e n t i a Ch r o ma t o g r a p h i c a
diagrama de funcionamento de um detector baseado
em chapa fotogrfica, juntamente com o resultado da
exposio de vrios ons em funo da relao m/z.
Apesar de a simplicidade e alguns aspectos
positivos, este tipo de detector apresenta vrias
desvantagens e limitaes. A sensibilidade baixa,
aqum da requerida na maioria das aplicaes atuais,
preciso ruim, difcil quantificao, faixa linear
dinmica pequena, alm da necessidade de revelar a
imagem depois do experimento.
2.4.2. Detector de Faraday
Tambm chamado de copo de Faraday, por sua
geometria mais popular lembrar este formato, o
detector consiste em um copo feito de metal (Figura
36) projetado para captar partculas carregadas em
baixas presses (vcuo). A corrente medida e seu
valor utilizado para determinar a quantidade de ons
ou eltrons que chegam no copo.
Apesar de no apresentar a mesma
sensibilidade de uma multiplicadora de eltrons este
detector, amplamente usado nos primrdios da MS,
ainda empregado na determinao de partculas
carregadas devido a sua exatido em funo da relao
direta entre a corrente medida e o nmero de ons.
2.4.3. Detectores baseados na
multiplicao de eltrons (EM)
Os detectores baseados na multiplicao de
eltrons (EM, Electron Multiplier) so os mais
utilizados atualmente para deteco de ons, podendo
ter vrias geometrias diferentes. Os modelos mais
antigos eram baseados na tecnologia da deteco de
ftons por tubos denominados fotomultiplicadoras
(PMT). As multiplicadoras de eltrons utilizam como
catodo um metal, xido metlico ou liga que apresenta
facilidade em perder eltrons quando atingida por um
on. Os eltrons removidos do catodo por processo
denominado emisso secundria ou SEM ( secondary
electron multiplier - cada eltron gera entre 1 e 3
novos eltrons, em mdia) sero direcionados para um
Figura 35. Detector do tipo chapa fotogrfica para
espectrometria de massas.
Figura 36. Esquema de um detector do tipo Copo de Faraday
eletrodo que apresenta uma diferena de potencial
positiva em relao ao catodo, atraindo os eltrons.
Este processo multiplicado em cascata em vrios
eletrodos colocados no tubo, denominados dinodos
(tipicamente entre 6 e 20 por EM). Cada dinodo
apresenta uma diferena de potencial em relao ao
anterior entre 100 V e 200 V, facilitando a atrao dos
eltrons gerados no processo (Figura 37). Ao final do
processo, um elevado nmero de eltrons coletado no
anodo para cada on que chegou inicialmente no
catodo, com um fator de amplificao bastante
eficiente (usualmente, uma corrente contendo mais que
10
6
eltrons gerada para um nico on incidindo na
EM). Este tipo de EM tambm conhecido como
discrete-dynode SEM, ou seja, eletromultiplicadora
de emisso secundria com dinodos discretos.
Um dinodo contnuo pode ser construdo a
partir da deposio de um filme de um material
semicondutor em uma superfcie isolante, usualmente
em forma de funil, ao qual uma voltagem negativa
aplicada na entrada (mais larga) e
positiva na sada (mais estreita). A
diferena de voltagem dentro do
tubo produz um campo
continuamente acelerado. Os ons,
ao atingirem a superfcie da
entrada do detector, produzem a
emisso de eltrons secundrios
os quais produziro a emisso de
outros eltrons em cascata. No
final do processo, um eletrodo
separado (anodo) utilizado para
coletar os eltrons multiplicados.
Estes detectores, encontrados em
vrias geometrias, so conhecidos como
continuous-dynode EM (CDEM) ou channel
electron multiplier (CEM). Uma das verses mais
utilizadas deste detector atualmente comercialmente
denominada de Channeltron.
Uma forma geomtrica diferente para estes
detectores do tipo dinodo contnuo o prato
multicanal (multichannel plate, MCP). O MCP
48

considerado como um arranjo bidimensional em
paralelo de uma srie de pequenas multiplicadoras de
eltrons de dinodo contnuo - cerca de 10-100 m de
dimetro cada. Os microcanais, cerca de 100 por
MCP, so construdos em paralelo, no formato de
prato ou disco, ao invs de funil (Figura 38). Quando
um on atinge a superfcie emissiva prxima da
entrada do microcanal, ir ocorrer um processo
similar ao que ocorre nas CDEM. Os ons, ao sarem
do microcanal, sero coletados em um anodo para
deteco da corrente, como nas SEM.
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Figura 37. Multiplicao de eltrons em uma EM (electron multiplier). esquerda, desenho esquemtico de como ocorre a
amplificao dos eltrons em uma EM de dinodos discretos; direita desenho de uma EM de dinodos contnuos, do tipo
Channeltron.
Figura 38. Detector MCP (multichannel plate).
2.4.4. Consideraes finais sobre os
detectores de ons usados em MS
O detector , muito provavelmente, a parte da
instrumentao em MS que sofreu a menor evoluo.
Dentre os atributos desejveis para um detector de
ons em espectrometria de massas, pelo menos os
seguintes devem constar
48
: resposta a uma ampla
faixa de massas; baixo ou nenhum rudo; alta
estabilidade; resposta independente da massa;
deteco simultnea; resposta rpida. Do ponto de
vista prtico, deveria apresentar pouca ou nenhuma
manuteno; durabilidade; facilidade de ser
substitudo e barato. Nenhum detector existente no
mercado preenche estes requisitos desejveis, ficando
a escolha dependendo do projeto do equipamento e
dos requisitos analticos para o qual o equipamento
ser utilizado. Na prtica, na maioria dos
instrumentos utilizados para o acoplamento LC/MS,
em especial do tipo quadrupole e on trap, as
multiplicadoras de eltrons (EM) apresentam uma boa
razo entre custo e benefcio, sendo as preferidas.
Nos sistemas MS nos quais o analisador do tipo TOF
a parte eletrnica do detector precisa registrar o
espectro de massas completo dentro do tempo de voo
dos ons, usualmente na faixa entre 1 e 100 s, com
largura de pico da ordem de nano-segundos (ns). Os
detectores empregados neste caso usam velocidades
de amostragem da ordem de GHz, o que ainda limita a
resoluo do TOF quando adequadamente ajustado
49
.
A deteco de ons aprisionados e ainda em
movimento pode ser feita pela corrente induzida em
eletrodos adjacentes. No caso de um equipamento do
tipo FTICR-MS, os ons aprisionados ou em
ressonncia so detectados pelas correntes que eles
induzem em um par de placas de deteco em uma
cela cbica de ICR (Fig. 39). Uma vez que a
determinao eletrnica de frequncia pode ser
bastante exata, a razo m/z pode ser determinada com
alta resoluo e elevada exatido de massa,
especialmente quando a amostra pode ser medida
mais de uma vez. Isto possvel porque sendo esta
tcnica baseada na medida de corrente de imagens, a
mesma no destrutiva, permitindo que os ons
permaneam na cela, sejam reexcitados vrias vezes e
detectados
50
.
2.3. O Acoplamento entre Cromatografia
Lquida e Espectrometria de Massas
(LC/MS): Finalmente compatveis ???
Durante os primeiros trabalhos visando o
acoplamento entre tcnicas cromatogrficas e
espectrometria de massas, a discusso
invariavelmente terminava na seguinte disputa: a
cromatografia era um mero sistema de introduo
de amostras para a espectrometria de massas, ou a
espectrometria de massas era um mero detector para
cromatografia? Certamente as duas correntes
encontraram seus defensores, a ponto de uma empresa
americana haver cunhado, na dcada de 1970, o termo
mass selective detector (MSD) para descrever um
espectrmetro de massas dedicado a funcionar como
detector para cromatografia gasosa. Os
cromatografistas achavam a espectrometria de massas
muito complexa e cara para ser utilizada como
detector, e os espectrometristas de massas achavam a
cromatografia desnecessria para seus estudos.
A popularizao das duas tcnicas mostrou
aos usurios o que cada uma delas tem de melhor: a
cromatografia como uma tcnica de separao e a
espectrometria de massas, de identificao.
Certamente os extremistas ou radicais, de qualquer
dos lados como o pesquisador americano, que em
seu website escreve que se uma anlise no pode ser
feita por espectrometria de massas
porque no vale a pena faz-la - no
contribuem nem um pouco, como em
outros campos do conhecimento, para o
avano na rea. Os menos radicais
perceberam, h muito tempo, que o
acoplamento entre elas pode trazer
benefcio para ambas as reas,
especialmente com as novas exigncias
de melhora na sensibilidade dos
mtodos, aumento na complexidade das
amostras, exigncia de maiores critrios
para identificao de compostos de
interesse na rea ambiental, sade,
forense, alimentos e outras. A
simplificao dos computadores para o
2009 | v. 1 | n. 2 59
S c i e n t i a Ch r o ma t o g r a p h i c a
Figura 39. Esquema de um detector do tipo corrente-imagem para FTICR MS.
nvel pessoal (PC) com custos razoveis e
desempenho muito superior, fez com que na dcada
de 1980 o acoplamento GC/MS j fosse uma tcnica
analtica madura. Devido s diferenas existentes
entre as propriedades de gases e lquidos, a
cromatografia lquida acoplada a espectrometria de
massas (LC/MS) no conseguiu o mesmo xito.
Varias interfaces foram desenvolvidas na tentativa de
acomodar o eluente da coluna de HPLC em elevada
presso e volumes: introduo direta de lquidos
(DLI); correia giratria (moving belt) spray
trmico (Thermospray); feixe de partculas
(Particle Beam) e outros. Entretanto, o
acoplamento somente comeou a se tornar popular
aps o desenvolvimento das tcnicas de ionizao a
presso atmosfrica (API), notadamente o
Elesctrospray, ocorrido no final da dcada de 1980
e incio da dcada seguinte. Nos ltimos anos, uma
grande melhora tem sido vista no desempenho dos
cromatgrafos, espectrmetros de massas e no
acoplamento entre eles. Ainda assim, o acoplamento
entre cromatografia lquida e espectrometria de
massas no atingiu, at o momento, a mesma
popularidade do acoplamento GC/MS, por diversas
razes. Uma delas certamente a demora na
miniaturizao da LC quando comparada com a GC, e
as perdas dela decorrentes. Outro fato que enquanto
em GC/MS podemos contar com a ionizao via
impacto com eltrons (EI) para estudos estruturais,
esta tcnica no teve xito em LC/MS, especialmente
devido ionizao da fase mvel de massa molecular
prxima a compostos de comum interesse na tcnica
(em GC emprega-se usualmente H
2
ou He como fase
mvel, o que no interfere na formao de ons de
interesse na tcnica). Em LC/MS utiliza-se tcnicas
de ionizao a presso ambiente (API), consideradas
tcnicas brandas de ionizao as quais geram poucos
ons para ajudarem na determinao da estrutura
qumica dos analitos investigados. Assim, a tcnica
LC/MS tem, at o momento, sido mais empregada em
rotina de estudos para confirmao de compostos alvo
do que determinao da identidade dos compostos
desconhecidos de interesse. O desenvolvimento e
posterior aprimoramento das tcnicas denominadas
tandem MS (MS/MS ou MS
n
) representam um
grande avano no acoplamento com cromatografia,
gerando sistemas como LC/MS/MS que se tornaram
bastante populares nos ltimos anos. Este
acoplamento ser motivo de outro trabalho nesta
srie, a ser publicado em outro nmero do Scientia
Chromatographica.
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