Recebido para publicao em 19/11/2007 e aceito em 03/06/2009 Elaborao de uma bebida probitica fermentada a partir de extrato hidrossolvel de soja com sabor de frutas The making of a probiotical fermented drink from soybean water soluble extract with fruit favor Milene Oliveira Pereira 1 Marlene Bampi 2 Flvio Thihara Rodrigues 3 Osmar Roberto Dalla Santa 4 Herta Stutz Dalla Santa 5 Maurcio Rigo 6 Resumo O extrato hidrossolvel de soja possui caractersticas qumicas e nutricionais que o qualifcam como um alimento funcional, mas tem pouca aceitabilidade entre os consumidores, pois apresenta gosto de feijo cru. O objetivo deste trabalho foi elaborar uma bebida a partir da fermentao do extrato hidrossolvel de soja por culturas probiticas, com adio de polpa e essncia de frutas e verifcar sua aceitabilidade. O nmero de colnias viveis de bactrias lcticas na bebida fermentada armazenada a 5 C durante 21 dias foi superior a 10 7 UFC/mL, valores que esto de acordo com o exigido pela legislao vigente para produtos probitios. As bebidas fermentadas com sabor de abacaxi e limo obtiveram aceitao signifcativamente maior pelos julgadores nos testes 1 Graduanda em Engenharia de Alimentos pela Universidade Estadual do Centro-Oeste UNICENTRO; E-mail: engmarlene@hotmail.com 2 Graduanda em Engenharia de Alimentos pela Universidade Estadual do Centro-Oeste UNICENTRO; E-mail: milene_mop@hotmail.com 3 Graduando em Engenharia de Alimentos pela Universidade Estadual do Centro-Oeste UNICENTRO; E-mail: faviothihara@hotmail.com Dr.; Bilogo; Professor do Departamento de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual do Centro-Oeste UNICENTRO, E-mail: ordallasanta@yahoo.com.br. 5 Dra.; Biloga; Professora do Departamento de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual do Centro-Oeste UNICENTRO, E-mail: hdalsanta@yahoo.com.br. Dr.; Engenheiro de Alimentos; Professor do Departamento de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual do Centro-Oeste UNICENTRO; E-mail: mauriciorigo@yahoo.com.br. Ambincia - Revista do Setor de Cincias Agrrias e Ambientais V. 5 N. 3 Set./Dez. 2009 476 sensoriais, se comparado ao sabor de ameixa preta. Os resultados deste estudo demonstraram que o extrato hidrossolvel de soja com 2% de sacarose possibilitou o cultivo de bactrias lticas para obteno de uma bebida prbitica, e adio de frutas no produto propiciou um incremento na qualidade sensorial com boa aceitao pelo consumidor. Palavras-chave: extrato hidrossolvel de soja; bebida fermentada; bactrias lticas. Abstract The soy bean water soluble extract has chemical and nutritional characteristics that qualify it as a functional food; however, it has little acceptability amongst the consumers because it tastes like raw beans. The objective of our research has been to produce a drink from the fermented water soluble soy extract by means of probiotical cultures, with the addition of fruit pulps and essences, so as to verify its acceptability. The amount of viable lactic bacteria cells in the fermented drink stored at 5 C during 21 days was greater than 107UFC/mL. The values are consistent with those established by the current Brazilian law for probiotical products. When compared with the black plum favor, the fermented drinks with pineapple and lemon favors had signifcantly better acceptability for the subjects in the sensorial tests. The results of this study have demonstrated that the water soluble soybean extract with 2% of saccharose allowed for the culture of lactic bacteria for the making of a probiotical drink, and the addition of fruits to the product improved the sensorial quality with good acceptance by the consumer. Key words: water soluble soybean extract; fermented drink; lactic acid bacteria. Introduo O interesse por produtos alimentcios saudveis e nutritivos tem aumentado mundialmente. O uso dos alimentos como promoo do bem-estar e sade e, ao mesmo tempo, como redutor dos riscos de algumas doenas, tem incentivado as pesquisas de novos componentes naturais e o desenvolvimento de novos ingredientes, possibilitando a inovao em produtos alimentcios e a criao de novos nichos de mercado (MATSUBARA, 2001). As protenas de origem animal so consideradas de melhor qualidade do que as de origem vegetal porque apresentam um melhor balano de aminocidos essenciais. Entretanto, a protena de soja muito parecida protena de origem animal e pode ser considerada, dentre as protenas vegetais, como a de melhor qualidade, possuindo cerca de 477 90% de digestibilidade (ZANGELMI et al., 1982; MORAIS e SILVA, 199). Dentre os produtos de origem vegetal com potencial no desenvolvimento de novas bebidas destaca-se o extrato hidrossolvel de soja, popularmente denominado de leite de soja, devido as suas caractersticas qumicas e nutricionais que o qualifcam como um alimento funcional. Alm da qualidade de sua protena, a soja e seus derivados podem ser utilizados de forma preventiva e teraputica no tratamento de doenas cardiovasculares, cncer, osteoporose e sintomas da menopausa (HASLER, 1998). A acei t abi l i dade do ext rat o hidrossolvel de soja pelo consumidor limitada por apresentar caractersticas sensoriais semelhantes s do feijo cru, devido a compostos volteis de baixo peso molecular que so produtos da ao das lipoxigenases, que por sua vez, podem ser inativadas atravs de tratamento trmico adequado. Alm disso, o extrato apresenta um favor desfavorvel e um alto teor de oligossacardeos como a rafnose e estaquiose, responsveis pelos fatores de fatulncia que limitam o consumo da soja (RIBEIRO et al., 1987; HOU et al., 2000). Por outro lado, por serem indigerveis pelo homem, estes oligossacardeos exercem funo muito importante no organismo, pois estimulam e promovem o crescimento de microrganismos probiticos, como as bifdobactrias, e por isso so considerados prebiticos (HOU et al., 2000; TAMIME et al., 1995; SCALABRINI et al., 1998). A fermentao tem sido uma tcnica muito empregada para desenvolver produtos derivados de soja, neste sentido o extrato hidrossolvel de soja empregado como meio de crescimento e de atividade bioqumica de vrias bactrias lticas na produo de queijo de soja e diversos tipos de bebidas fermentadas (CHOU e HOU, 2000). Da mesma forma, do ponto de vista tecnolgico, a qualidade sensorial do extrato hidrossolvel de soja pode ser melhorada atravs da fermentao dos carboidratos presentes por bactrias lcteas a cido ltico, o que d um sabor refrescante bebida, mascarando o sabor classifcado como de feijo cru caracterstico do extrato (MORAES et al., 200). Entretanto, o baixo teor de carboidratos fermentveis na soja limita o uso do extrato hidrossolvel de soja como um substrato para o crescimento de culturas lticas, sendo necessria adio de glicose, sacarose ou at mesmo lactose para tornar o extrato adequado fermentao (SCALABRINI et al., 1998). Dentre as principais bactrias lticas utilizadas para a fermentao do extrato hidrossolvel de soja esto Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, Bifidobacterium lactis e Streptococcus thermophilus. A presena viva destes microrganismos em alimentos produz efeitos benficos ao organismo humano, e por isso so denominados de probiticos (TAMIMI et al., 1995). Neste escopo, o presente trabalho teve por objetivo elaborar uma bebida fermentada por bactrias lticas a partir do extrato hidrossolvel de soja, com adio de polpa de frutas e avaliar sua aceitabilidade. Material e Mtodos Obteno do extrato hidrossolvel de soja A soja utilizada para obteno do extrato hidrossolvel foi da variedade PEREIRA, M. O. et al. Ambincia - Revista do Setor de Cincias Agrrias e Ambientais V. 5 N. 3 Set./Dez. 2009 78 BRS - 232, doada pelo Departamento de Agronomia da Universidade Estadual do Centro-Oeste. O extrato hidrossolvel de soja foi preparado seguindo o mtodo descrito pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria (EMBRAPA, 2002). Preparo do inculo Na produo da bebida fermentada foi utilizada uma mistura lioflizada de trs tipos de bactrias lticas, constitudas de L. casei, Streptococcus thermophilus e L. bulgaricus doados pela Rhodia, Inc. Dairy Business. O inculo foi preparado realizando-se duas prfermentaes em meio de cultura contendo 11% de leite em p desnatado (Ninho - NESTL) e 3,5% de extrato de levedura (DIFCO) (esterilizado a 110C/10 min). A primeira prfermentao foi feita com 0,01% (p/v) de cultura mista liofilizada de bactrias lticas, que foram incubadas a 0C/5 h (Logen Scientifc). Na segunda prfermentao, foram adicionados 5% do inculo obtido da primeira pr- fermentao anterior em Erlenmeyer contendo o meio de cultura, o qual foi incubado a 0C/8 h. Este ltimo meio fermentado foi utilizado como inculo para fermentar o extrato hidrossolvel de soja. Fermentao do extrato hidrossolvel de soja e preparo das bebidas sabor limo, abacaxi e ameixa A f er ment ao do ext r at o hidrossolvel de soja seguiu o processamento descrito na figura 1. Devido baixa concentrao de carboidratos no extrato hidrossolvel de soja, foram adicionados 2% (p/v) de sacarose no produto com o objetivo de servir como substrato para as bactrias lticas. A concentrao de 2% de sacarose foi adicionada de acordo com os dados da literatura relacionados fermentao de extrato hidrossolvel de soja (MITAL e STEINKRAUS, 197; SHELEF et al., 1988). A partir do extrato hidrossolvel de soja fermentado foram elaboradas bebidas de trs diferentes sabores: limo, abacaxi (sabores incomuns em bebidas fermentadas no mercado nacional) e ameixa. Monitoramento do pH durante o processo fermentativo O processo de fermentao foi feito em estufa (Logen Scientifc) sem ventilao, mantida a temperatura constante. Alquotas das bebidas foram retiradas para determinao do pH em intervalos de uma hora. As medidas de pH foram feitas em duplicata utilizando pHmetro digital Requipal RQ 210. A fermentao da bebida ocorreu at o pH do meio atingir valores de ,25 (0,25). Este intervalo de pH foi determinado considerando as caractersticas sensoriais e de conservao do produt o. O monitoramento do pH foi realizado com intervalos de uma hora. Anlises fsico-qumicas do extrato e das bebidas fermentadas A composio bsica do extrato hidrossolvel e das bebidas fermentadas de abacaxi e limo foi determinada segundo as metodologias descritas na AOAC (1995): o teor de umidade por dessecao em estufa a 105C; cinzas (resduo mineral fxo) por incinerao do material em forno tipo mufa a 500C; protena bruta pelo mtodo de Kjeldhal e multiplicado pelo fator de ,25; e fbra total (alimentar). Os lipdeos totais foram 479 quantifcados pelo mtodo de BLIGH e DYER (1959). Os carboidratos foram calculados por diferena (AOAC, 1995). As anlises foram feitas em duplicata. A acidez titulvel foi determinada em alquotas de 10 mL de amostra por meio de titulao com soluo de hidrxido de sdio 0,111 N (soluo Dornic) na presena do indicador fenolftalena, a resposta foi expressa em gramas de cido ltico / 100 mL de amostra (TRONCO 1997). Contagem de bactrias lcticas A contagem total de bactrias lcticas foi realizada no extrato hidrossolvel de soja fermentado sem a adio de polpas e/ou essncia nos tempos 0, 2, , , 8, 10, 1 e 21 dias de armazenamento a 5C. Da amostra, foi retirado, assepticamente, alquota de 1 mL e transferida para um frasco de diluio contendo 9 mL de gua peptonada estril. A partir dessa diluio, foram feitas as diluies subsequentes necessrias anlise do produto. A quantidade total de bactrias lcticas no extrato hidrossolvel foi determinada pela contagem em placas, em gar De Man, Rogosa e Sharpe (DIFCO) utilizando a tcnica de semeadura em profundidade (pour-plate) com adio de sobrecamada. Aps inoculao, as Figura 1. Fluxograma da obteno das bebidas do fermentado de extrato hidrossolvel de soja Fonte: Os autores PEREIRA, M. O. et al. Ambincia - Revista do Setor de Cincias Agrrias e Ambientais V. 5 N. 3 Set./Dez. 2009 80 placas foram incubadas em estufa para cultura bacteriolgica Logen Scientifc ECB 1.1 temperatura de 37 por 8 horas, sendo a contagem realizada em contador de colnias manual Phoenix CP 02 (SILVA et al., 1997). Avaliao sensorial das bebidas obtidas a partir do extrato hidrossolvel de soja fermentado por bactrias lcticas No extrato de soja fermentado, (100 mL) foi adicionado polpa (7 mL) nos seguintes sabores: abacaxi, ameixa preta e limo e aroma saborizante comercial nas respectivas essncias (0,5 mL) (Duas Rodas Industrial). Os sabores foram escolhidos seguindo os critrios: i) sabores incomuns em bebida fermentada no mercado nacional: limo e abacaxi; e ii) sabor de fruta comum em bebida fermentada: ameixa preta. Estas bebidas foram avaliadas sensorialmente por 1 julgadores no treinados recrutados entre alunos e professores, da Universidade Estadual do Centro-Oeste, Campus CEDETEG. Os testes foram conduzidos em cabines individuais. As bebidas de soja saborizadas foram servidas geladas (72C), em copos de plstico com cerca de 15 mL de cada amostra, codifcados com nmeros de trs dgitos. A ordem de apresentao das bebidas de soja para cada provador foi aleatorizada. Para estudar a aceitao das bebidas saborizadas foi usada a escala hednica de sete pontos (1 - desgostei muito; 2 - desgostei moderadamente; 3 - desgostei ligeiramente; 4 - nem gostei/nem desgostei; 5 - gostei ligeiramente; 6 - gostei moderadamente; 7 - gostei muito) (DUTCOSKY, 199). gua mineral temperatura ambiente foi disponibilizada para os consumidores para efetuar a limpeza do palato entre uma amostra e outra. Anlise estatstica Para a organizao e validao dos dados experimentais das anlises sensoriais, os dados foram submetidos anlise de varincia (ANOVA), a diferena mnima signifcativa entre as amostras foi determinada pelo teste de Tukey e o nvel de signifcncia utilizado foi 5%. Resultados e Discusso Composio qumica do extrato hidrossolvel de soja A composio qumica do extrato hidrossolvel de soja est descrita na tabela 1. Os valores mdios para a umidade foram de 91,33%, prximo ao encontrado por Jackson et al. (2001), de 90,8%. Segundo Bowles e Demiate (200), que encontraram umidade mdia de 9,2% em seus experimentos, valores menores na umidade so resultantes de melhores taxas de extrao no processo de preparo do extrato hidrossolvel. Tabela 1. Composio centesimal do extrato hidrossolvel de soja Componentes Quantidade (g/100g em base seca) Cinzas 6,34 Protena bruta 45,67 Gordura total 29,41 Fibra total (alimentar) 13,61 Carboidratos totais 4,96 Fonte: Os autores 81 No presente trabalho, a porcentagem mdia dos componentes encontrados em base seca foi de 5,7% de protenas, 29,1% de lipdios, ,3% de cinzas, que so superiores aos encontrados por Bowles e Demiate (200): de 33,0% para as protenas, 17,77% para os componentes lipdicos, 2,2% para os minerais. Entretanto, esses resultados esto mais prximos aos relatados por Jackson et al. (200) de 39,0% para as protenas, 21,7% para os componentes lipdicos e 5,% para os minerais. A diferena entre os resultados pode ser relacionada com a taxa e formas de extrao e que resulta diretamente na concentrao dos compostos contidos no extrato (BOWLES e DEMIATE, 200). Outro fator que infuencia na concentrao dos componentes presentes no extrato a variedade de soja, segundo constado por Ciabotti et al. (2007), que em suas pesquisas com variedades encontraram variaes nos valores para protenas de 52 a %, para lipdeos de 2 a 31%, e para cinzas de 3,7 a 5,8%, o que demonstra que os resultados obtidos no presente trabalho so condizentes com os da literatura. Monitoramento do pH durante o processo fermentativo da bebida A estabilidade, o aroma, o sabor e a textura dos produtos a base de extrato de soja fermentado dependem do pH. Segundo Granata e Morr (199), o pH timo para este tipo de produto situa-se entre ,2 e ,3. Dessa forma, o monitoramento do processo fermentativo foi conduzido at que o pH da amostra atingisse esta faixa. Quando o meio atingiu pH entre 5,3-5,7 foi observado o incio da desnaturao das protenas solveis do extrato hidrossolveis de soja atravs da mudana na consistncia da bebida devido formao do cogulo, ou seja, o meio passou de um estado lquido para o de gel. Em pH abaixo de ,0, o produto se torna muito cido, alm de ocorrer a precipitao das protenas da soja. Por outro lado, um valor de pH acima de ,5 compromete a conservao do produto e tambm o seu sabor, uma vez que a melhoria da qualidade sensorial do extrato de soja obtida pelo efeito mascarante dos produtos de fermentao, especialmente compostos como cido ltico, acetaldedo e diacetil, sobre os compostos volteis do extrato de soja, como o n-hexanal, que o responsvel pela nota desagradvel de feijo cru, segundo Patel et al. (1980) citado por Silva et al. (2007). A evoluo dos valores de pH durante a fermentao do extrato hidrossolvel de soja est apresentada na figura 2. Por sua vez, a produo de cido depende da quantidade de carboidratos que so metabolizados pelas bactrias lticas. A soja madura contm em torno de 10% de acares solveis do peso seco, e estes so formados por 99%, ou seja, em sua maioria por oligossacardeos como a rafinose e estaquiose, alm de sacarose, porm em nveis insufcientes para se obter uma boa fermentao (TRUGO et al., 1995; MITAL e STEINKRAUS, 197). Alm disso, os tratamentos empregados na preparao do extrato de soja como a infuso em gua e o cozimento reduzem o contedo de acares fermentescveis no produto, portanto, sendo necessria suplementao com lactose, glicose ou sacarose segundo Murti et al. (1993). A fermentao do extrato de soja pelas bactrias lticas levou cinco horas PEREIRA, M. O. et al. Ambincia - Revista do Setor de Cincias Agrrias e Ambientais V. 5 N. 3 Set./Dez. 2009 82 at atingir o pH desejado. A diminuio do pH durante o processo fermentativo pode ser atribuda relao simbitica entre o S. thermophilus e o L. bulgaricus. O crescimento associado destas duas culturas resulta em menor tempo de coagulao do extrato, maior produo de cido ltico e um maior desenvolvimento de sabor e aroma no produto (OMOGBAI et al., 2005). Avaliao sensorial das bebidas fermentadas a partir do extrato hidrossolvel de soja As mdias dos resultados obtidos na anlise sensorial esto mostradas na tabela 2. De acordo com a anlise estatstica desses dados no houve diferena signifcativa (P 0,05) entre as amostras de bebidas adicionadas polpa de abacaxi e limo, porm a bebida fermentada com polpa de ameixa preta apresentou diferena signifcativa (P 0,05) em relao s demais, obtendo menor aceitao pelos julgadores. Tabela 2. Valores mdios do teste de acei t ao de bebi das fermentadas saborizadas de extrato hidrossolvel de soja (1) Bebida fermentada com polpa e essncia de frutas Mdias atribudas (pontos) Abacaxi , (a) Ameixa preta 5,58 (b) Limo ,83 (a) Nota: (1) Valores obtidos de escala hednica de sete pontos; mdias seguidas por letras iguais, na coluna, no diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. Fonte: Os autores Anlises fsicoqumicas das bebidas fermentadas adicionadas de polpa de fruta As formulaes de sabor limo e abacaxi, que obtiveram a melhor aceitao na avaliao sensorial, foram utilizadas para a caracterizao fsico-qumica (Tabela 3). Os resultados para umidade foram de 75,3% e 7,79% para as bebidas sabor abacaxi e limo, respectivamente. Figura 2. Variao de pH durante o processo fermentativo de cultura ltica do extrato hidrossolvel de soja com adio de sacarose (2%) Fonte: Os autores 83 Tabela 3. Caractersticas fsicoqumicas das bebidas fermentadas com polpas de frutas Componente Quantidade (g/100g em base seca) Abacaxi Limo Cinzas 2,93 2,7 Acidez titulvel 1,87 3,10 Protena bruta 7,81 7,97 Gordura total 9,77 7,8 Fibra total (alimentar) 2,5 2,02 Carboidratos totais 1,05 ,78 Fonte: Os autores O teor de cinzas das amostras com polpa de frutas apresentou valor prximo ao obtido para o extrato hidrossolvel de soja no fermentado (Tabela 1). As demais anlises variaram de acordo com a adio dos ingredientes em cada amostra. As bebidas elaboradas neste trabalho, obtidas a partir do extrato hidrossolvel de soja so classifcadas como produtos a base de soja, segundo a legislao brasileira (BRASIL, 2000). Contagem microbiolgica No e n s a i o d e c o n t a g e m microbiolgica, foi verifcada a capacidade de crescimento das linhagens lioflizadas de L. casei, S. thermophilus e L. bulgaricus em gar MRS, para contagem de clulas viveis. Os resultados experimentais da concentrao de clulas viveis do extrato hidrossolvel de soja fermentado, em diferentes tempos de armazenamento a 5 C so apresentados na figura 3. O desenvolvimento e manuteno da populao ltica no extrato hidrossolvel de soja suplementado com 2% de sacarose comercial demonstraram que este extrato um excelente meio para o cultivo de bactrias lticas probiticas. O nmero de colnias viveis na bebida fermentada armazenada durante 21 dias a temperatura de refrigerao variou de 1,1 x 10 7 a 2,0 x 10 8 UFC/mL; este valor mximo foi acompanhado do menor valor de pH mensurado na bebida, de ,2. A manuteno da populao de bactrias lticas deve ser no mnimo de 10 6 UFC/mL no produto fnal, durante todo o prazo de validade, segundo o Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade de Bebidas Lcteas da Instruo Normativa N 3, de 31 de outubro de 2000 (BRASIL, 2000). No caso dos probiticos, o produto deve constar quantidade dos microrganismos viveis que garantem a ao alegada dentro do prazo de validade do produto, segundo Resoluo RDC N 2, de 7 de janeiro de 2002 (BRASIL, 2002), portanto, o extrato hidrossolvel fermentado est de acordo com a legislao quanto a este requisito item. Mc Donough et al. (1982) sugerem a ingesto na ordem de 100 mL, pelo menos, duas vezes por semana, a fm de que os PEREIRA, M. O. et al. Ambincia - Revista do Setor de Cincias Agrrias e Ambientais V. 5 N. 3 Set./Dez. 2009 8 produtos probiticos consigam exercer sua ao benfca no organismo. Concluso O estudo da fermentao do extrato hidrossolvel de soja por culturas lticas probiticas apresentou bons resultados tanto com relao ao tempo de fermentao de apenas cinco horas, como em termos de aceitao alcanada no produto fnal. O nmero de bactrias lticas viveis na bebida fermentada de soja armazenado a 5C manteve-se acima de 10 7 UFC/mL durante 21 dias, valores que esto de acordo com o exigido pela legislao vigente para produtos probiticos. Alm disso, o desenvolvimento e manuteno da populao ltica demonstram que o extrato hidrossolvel de soja suplementado com 2% de sacarose comercial um excelente meio para o cultivo de bactrias lticas probiticas. As bebidas fermentadas de abacaxi e limo obtiveram boa aceitao pelos julgadores mostrando, portanto, potencial de mercado. Os resultados deste estudo demonstraram ser possvel melhorar a qualidade sensorial do extrato de soja atravs de fermentao ltica e adio de polpas de frutas resultando no desenvolvimento de bebidas que obtm boa aceitao pelo consumidor. O produto desenvolvido neste trabalho vem ao encontro com a demanda crescente dos consumidores por novos produtos funcionais, os quais apresentam os benefcios dos microrganismos probiticos, tais como as bactrias lticas utilizadas, Figura 3. Evoluo do nmero de bactrias lcticas viveis durante o perodo de estocagem a 5 C do extrato hidrossolvel de soja fermentado Fonte: Os autores 85 e dos componentes prebiticos, como os oligossacardeos presentes na soja. O produto desenvolvido tambm contribui na manuteno do balano da microbiota intestinal, na reduo de problemas intestinais como a m absoro da lactose, na proteo contra PEREIRA, M. O. et al. infeces e, portanto, na preveno de doenas de origem digestivas. Agradecimentos Os aut or es est o gr at os a Universidade Estadual do Centro-Oeste (UNICENTRO). Referncias ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALITYCAL CHEMISTS - AOAC. Offcial Methods of Analysis of the AOAC International. 12th ed. Washington, 1995. BRASIL, 2000. 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