UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

Seminrio do Programa de Ps-Graduao em Engenharia Qumica

XIII Oktoberfrum PPGEQ

De 08 a 10 de outubro de 2014

MODELO DE SNTESE ENZIMTICA DE BIODIESEL UTILIZANDO MISTURAS DE

LIPASES IMOBILIZADAS
Jakeline Kathiele Poppe Todeschini1, Rafael Costa Rodrigues1, Marcho Antnio Zachia Ayub1,
1

Laboratrio de Biotecnologia
Departamento de Engenharia Qumica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)
R. Eng. Luis Englert, s/n. Campus Central. CEP: 90040-040 - Porto Alegre - RS - BRASIL,
e-mail: {jakeline.poppe, mazayub}@enq.ufrgs.br

Resumo: Reaes enzimticas de transesterificao so geralmente catalisadas por uma preparao especfica de lipase. No
entanto, devido heterogeneidade dos leos, o uso de misturas de lipases pode promover uma completa converso dos
triglicerdeos disponveis na reao. Nesta pesquisa foi testado o conceito combi-lipase, que se baseia no uso de misturas
de lipase com diferentes especificidades para o substrato. As lipases comerciais imobilizadas Novozym 435 (CALB), Lipozyme
TL-IM (TLL), e Lipozyme RM-IM (RML) foram usadas como biocatalisadoras na sntese de biodiesel via transesterificao
enzimtica do leo de oliva, com etanol como aceptor acila. A mistura de 29,0 % de TLL, 12,5 % de RML, e 58,5 % de CALB
foi a melhor combinao, permitindo 95 % de converso em 18 h de reao. Repetidas reaes em batelada foram realizadas
para testar a estabilidade operacional do sistema combi-lipase. Os resultados demonstraram que a mistura de
biocatalisadores pde ser usada em pelo menos sete ciclos, mantendo em torno de 80 % da sua atividade inicial.
Palavras-chave: Biodiesel; TLL; RML; CALB; combi-lipase; reuso de enzimas.

1. Introduo
O biodiesel uma mistura de mono-alquil steres de
cidos graxos, obtido pela transesterificao de leos
vegetais com alcois de cadeia curta (geralmente metanol),
sendo esta reao catalisada por diversos tipos de agentes
(DEMIRBAS, 2008). Alm dos leos vegetais, tambm
pode ser utilizadas outras fontes de matria-prima como
gordura animal, resduos de leos das indstrias de
extrao e restaurantes, e leo de microalgas (ANTCZAK
et al., 2009).
Em escala industrial, o biodiesel produzido
principalmente pelo processo qumico convencional, em
que os catalisadores bsicos so usados. Em termos de
tempo de reao e rendimentos, este um processo
eficiente, no entanto, a sntese qumica apresenta algumas
desvantagens em termos de recuperao de glicerol,
gerao de grandes quantidades de guas residuais e altos
custos de energia (AKOH et al., 2007; LEUNG et al.,
2010). Entre os processos testados para contornar estes
problemas, a utilizao de enzimas, mais precisamente
lipases, um dos mais promissores (AARTHY et al.,
2014).
As lipases possuem excelentes atividades catalticas e
alta estabilidade em meios no aquosos, e, devido a suas
caractersticas de especificidade, regiosseletividade e
enantioseletividade, podem ser aproveitadas com sucesso
para muitas aplicaes em sntese orgnica, incluindo a
produo de biodiesel (PETERSEN et al., 2001). O
processo enzimtico utiliza diversas lipases derivadas

predominantemente de bactrias, fungos e leveduras, tais

como:
Candida
rugosa,
Candida
antarctica,
Thermomyces lanuginosus e bactrias do gnero
Pseudomonas (RIBEIRO et al., 2011). Essas enzimas (EC
3.1.1.3) possuem a funo biolgica de catalisar a
hidrlise parcial ou completa de gorduras e leos,
desempenhando um papel fundamental no metabolismo
dos lipdeos. No entanto, em meios reacionais com
restrio de gua, podem ainda catalisar outros tipos de
reao, a exemplo da transesterificao (SOUZA, 2010).
Em relao classificao, as lipases so separadas em
trs grupos: Enantiosseletivas, tipo-seletivas, e
regiosseletivas. Este ltimo ainda subdivide-se em: lipases
no especficas, e 1,3-especficas (TONGBORIBOON et
al., 2010).
A principal vantagem das lipases, o que diferencia a
reao enzimtica de uma reao qumica, a
especificidade. Essa caracterstica controlada pelas
propriedades moleculares da enzima, a estrutura do
substrato, e os fatores que afetam a ligao da enzima com
o substrato. Devido especificidade para com o substrato
ser muito elevada, sendo por vezes absoluta, deve notar-se
a necessidade de conhecer as caractersticas da lipase e
encontrar o substrato ideal para ser utilizado nas reaes
(CASTRO et al., 2004).
As
reaes
de
transesterificao
so
preferencialmente catalisadas por uma preparao
especfica de lipase que resulta em rendimentos
satisfatrios de converso. No entanto, o uso combinado

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de enzimas outra estratgia que tem sido testado

atualmente visando aumentar a produtividade em reaes
de biocatlise. O termo combi-lipase foi proposto por
Alves et al. (2014) como um novo conceito de combinao
de lipases para o uso em reaes com substratos
heterogneos. Este conceito baseia-se no fato de que, um
biocatalisador composto por uma mistura de lipases seja
mais eficaz sobre substratos heterogneos do que uma
lipase individual. No referido trabalho, foi avaliado a
hidrlise do leo de soja, com resultados indicando que a
mistura de lipases de Rhizomucor miehei (RML) e Candida
antarctica (CALB) foi mais eficiente do que a lipase de
Thermomyces lanuginosus (TLL) utilizada individualmente
(ALVES et al., 2014).
Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi
avaliar o conceito combi-lipase em reao de
transesterificao para a sntese de biodiesel. Como
substrato foi empregado o leo vegetal de oliva e etanol
como aceptor de acila. As lipases comerciais imobilizadas
de Candida antarctica (CALB, Novozym 435),
Thermomyces lanuginosus (TLL, Lipozyme TL-IM), e
Rhizomucor miehei (RML, Lipozyme RM-IM) foram
utilizadas para compor a combinao de biocatalisadores.
As enzimas tambm foram testadas individualmente, a fim
de verificar suas atividades independentes. Os parmetros
de reao de transesterificao foram otimizados a partir da
melhor combinao de lipases. Alm disso, a reciclagem
do biocatalisador foi testada por vrios ciclos de
reutilizao, a fim de testar a sua estabilidade operacional.
2. Materiais e Mtodos
2.1. Materiais
As lipases de Thermomyces lanuginosus imobilizada
em resina acrlica (RML - Lipozyme TL-IM), de
Rhizomucor miehei imobilizada em resina de troca
aninica (RML - Lipozyme RM-IM), e de Candida
antarctica imobilizada em resina macroporosa (CALB Novozym 435) foram gentilmente doadas pela Novozymes
(Novozymes, Espanha). leo de oliva foi adquirido em
mercado local, com a composio de cidos graxos
indicada na Tabela 1 (RAMOS et al., 2011). Etanol e os
outros reagentes qumicos foram de grau analtico.
Tabela 1. Composio de cidos graxos do leo de oliva.

em cromatgrafo gasoso (Shimadzu, modelo GC-17A)

equipado com um detector de ionizao de chama (FID) e
uma coluna capilar DB-5 (30 m x 0,25 milmetros ID
0,25 mM, J&W Scientific). A temperatura do injetor foi
de 300 C, razo de split = 1:30 e a temperatura do
detector FID foi de 310 C. Nitrognio foi usado como gs
de arraste num fluxo de 1,0 mL min-1. As condies
cromatogrficas foram: temperatura inicial da coluna de
50 C, velocidade de aquecimento de 10 C / min at a
temperatura final de 310 C. A quantidade de amostra
injetada foi de 1 L, e o tempo total da anlise foi de 30
min.
Heptadecanoato de metila foi utilizado como padro
interno, e foi misturado com solvente heptano para se
preparar uma soluo estoque de concentrao de 10 mg /
mL. 50 mg de amostra foi misturada a 1 mL de soluo
estoque de padro interno. O padro Faee Mix Supelco
(Fatty Acid Ethyl Esters) contendo uma mistura de steres
etlicos (C4-C24) foi usada para identificar os picos
correspondentes aos steres produzidos. O contedo
FAEE foi calculado utilizando o mtodo de normalizao
com padronizao interna, com base na norma europeia
DIN EN 14103 (EN, 2001).
2.3. Reaes usando a mistura de lipases
Com a finalidade de determinar a melhor
combinao de lipases para a reao de transesterificao,
um planejamento de mistura cbico especial com 3 fatores
e anlises superficiais triangulares foram realizados. O
modelo
simplex-centride
composto
por
sete
experimentos com duas repeties do ponto central est
representado na Tabela 2.
Tabela 2. Experimentos realizados no projeto de mistura.
Experimento

TLL

RML

CALB

Converso (%)

1,00

0,00

0,00

48,57

0,00

1,00

0,00

32,19

0,00

0,00

1,00

56,04

0,50

0,50

0,00

49,77

0,50

0,00

0,50

57,19

0,00

0,50

0,50

44,17

cido graxo

Estrutura

Composio mdia (%)

0,33

0,33

0,33

54,91

Palmtico

16:0

10,2

0,33

0,33

0,33

55,34

Palmitoleico

16:1

0,33

0,33

0,33

54,30

Esterico

18:0

2,50

Oleico

18:1

78,10

Linoleico

18:2

7,10

Linolenico

18:3

0,76

2.2. Reao de transesterificao e anlise

As reaes de transesterificao foram realizadas em
frascos Erlenmeyers de 50 ml, em agitador orbital a 180
rpm. A temperatura de reao e as quantidades de etanol,
gua e teor de enzima foram de acordo com o desenho
experimental, partindo de 1 g de leo.
Aps a concluso da reao, 5 mL de gua destilada
foi adicionada, seguido por centrifugao (2 500 g, 7
min, 4 C). A fase superior, contendo steres, foi analisada

As reaes foram preparadas em frascos Erlenmeyers

de 50 mL, e mantidas em agitador orbital (180 rpm)
durante 18 h. As condies foram: razo molar
etanol:leo, 6:1; temperatura, 40 C; contedo de
biocatalisador, 10 % (em relao a massa de leo);
contedo de gua, 4 % (em relao a massa de leo). O
teor individual de biocatalisador ou em mistura foi de
acordo com a Tabela 2. Todas as condies de reao,
incluindo o tempo, foram definidas com base em estudos
prvios (RODRIGUES et al., 2008; POPPE et al., 2013).
2.4. Delineamento experimental
Um delineamento composto central rotacional
(DCCR) de trs variveis foi realizada a fim de se obter as

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condies timas para a sntese de biodiesel, utilizando a

mistura de biocatalizador (combi-lipase) previamente
otimizada. As variveis e os valores codificados e
decodificados so apresentados na Tabela 3, enquanto que
na Tabela 4 encontram-se os 17 tratamentos para as trs
variveis, cada uma com cinco nveis. O planejamento foi
construdo com oito pontos fatoriais com nveis -1 e +1,
seis pontos axiais nos nveis: -1,68; 0 e +1,68, e duas
repeties no ponto central. Em cada caso, a percentagem
de converso de transesterificao foi determinada aps 18
h de reao. O modelo polinomial de segunda ordem
utilizado para modelagem dos dados experimentais foi
determinada por equao de Fisher:
Y = 0 + iXi+ ijXiXj+iiXi2

(1)

Onde Y a varivel de resposta; 0 o ponto de

interseo; i, ii, ij so referentes aos efeitos lineares,
quadrticos, e de interao dupla, respectivamente; e Xi e
Xj so as variveis referentes aos fatores.
Tabela 3. Variveis do processo de transesterificao e dos
seus limites utilizadas na CCD.
Variveis

Nveis codificados

Nome
-1,68

-1

1,68

4,21

7,78

30

32,59

37

41,16

44

7,03

10

12,97

15

Razo molar
do substrato
(etanol:oliva)

X1

Temperatura
(C)
Quantidade de
combi-lipase
por massa de
leo (%)

X2

X3

2.5. Anlise estatstica

O modelo experimental e a anlise dos resultados
foram realizadas utilizando o programa Statistica 7.0
(Statsoft, EUA). Os efeitos das variveis, os respectivos
erros e a significncia estatstica (p) foram calculados a
um limite de confiana de 95 %. A Anlise de Resduos
foi realizada atravs do Teste de Significncia do ajuste do
modelo, baseados na Anlise de Varincia (ANOVA).
Para cada varivel, os modelos quadrticos foram
representados como grficos de contorno (2D).
2.6. Reutilizao do biocatalizador
Aps a reao de transesterificao, as enzimas
imobilizadas foram separadas do meio de reao por
filtrao em vcuo usando um funil de vidro sinterizado.
O biocatalisador foi lavado 3 vezes com 5 volumes de
hexano, e aps isso, o solvente foi eliminado por
incubao durante 24 h a 30 C, seguindo a metodologia
descrita em trabalho anterior (POPPE et al., 2013). Aps
estar completamente seco, o biocatalisador foi reutilizado,
seguindo as condies de reao descritas anteriormente.
3. Resultados e Discusses
3.1. Seleo da melhor combinao de lipases
As trs lipases imobilizadas foram testadas
individualmente ou em combinao, de acordo com o
planejamento de mistura. Os resultados so mostrados na
Tabela 2 e representados graficamente na Figura 1.

Tabela 4. Delineamento experimental e resultados da

converso.
Tratamento

X1

X2

X3

Converso (%)

-1

-1

-1

68,32

-1

-1

72,77

-1

-1

51,23

-1

56,01

-1

-1

69,61

-1

77,18

-1

64,73

76,72

-1,68

71,06

10

1,68

79,26

11

-1,68

81,9

12

1,68

56,61

13

-1,68

58,85

14

1,68

98,30

15

80,15

16

83,24

17

83,31

Figura 1. Superfcie triangular para o planejamento de mistura.

Condies de reao: razo molar etanol:oliva 6:1; 10 % de combi-lipase
(em relao massa de leo); 4 % de gua (em relao massa de leo);
37 C; 180 rpm; 18 h.

A mistura RML e CALB forneceu o pior resultado

de converso, enquanto que a mistura TLL e CALB,
apresentou o melhor rendimento. Ambas as misturas so
compostas por enzimas que apresentam diferentes
especificidades pelo substrato. CALB uma enzima
inespecfica que catalisa a transesterificao de
triglicerdeos de modo aleatrio (CARVALHO et al.,
2003a), e RML e TLL so classificadas como sn-1,3especficas, que se caracteriza pela especificidade pelas
posies sn-1 e sn-3 das molculas de acilglicerol, sendo
incapazes de agir na posio sn-2 da molcula devido a
um impedimento estrico (LI et al., 2010). O que forneceu
essa distinta combinao das enzimas resultando em
opostos rendimentos de converso, foi a maior atividade
de transesterificao da TLL em relao RML, resultado

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igualmente relatado nos trabalhos de Rodrigues e Ayub

(2011).
A lipase Novozym 435 (CALB) extensivamente
aplicada na pesquisa por exibir uma elevada atividade na
preparao de biodiesel. No entanto, no aplicada na
indstria devido ao elevado preo, por vezes muito
superior a TLL. Assim, alm de aumentar o rendimento de
converso, a combinao destas enzimas torna-se uma
alternativa economicamente vivel quando comparado com
as suas aplicaes individuais, diminuindo o custo de
produo industrial de biodiesel (LI et al., 2006).
A anlise estatstica indicou que a melhor combilipase para transesterificao do leo de oliva constituda
por 29 % de TLL, 58,5 % de CALB e 12,5 % de RML. Por
conseguinte, esta mistura foi utilizada nos experimentos
seguintes.
3.2. Otimizao dos parmetros de transesterificao
3.2.1. Ajuste do modelo e anlise de varincia
Aps a seleo da melhor combinao de lipase, os
parmetros de reao foram otimizados para atingir a
maior converso de biodiesel. O DCCR foi preparado para
avaliar a temperatura de reao, quantidade de combilipase, e razo molar etanol:leo de oliva. Os resultados
so apresentados na Tabela 4.
A maior converso obtida foi de 98,30 %, fornecida
pelo tratamento 14 (razo molar etanol: oliva de 6:1; 37 C
e 15 % de combi-lipase em relao massa de leo).
Os dados experimentais foram ajustados pelo modelo
de regresso considerando apenas as variveis com efeito
significativo. O modelo polinomial de segunda ordem
apresentado na Equao (2).

Tabela 5. Anlise estatstica do DCCR.

Varivel
Efeito
Erro padro
Mdia

p-valor

83,362*

0,361

<0,005

X1

7,871*

0,339

0,002

X2

-11,971*

0,339

<0,005

X3

13,933*

0,339

<0,005

X1X1

-8,488*

0,374

0,002

X2X2

-12,674*

0,374

<0,005

X3X3

-6,070*

0,374

0,004

X1X2

7,130*

0,443

0,004

X2X3

2,585*

0,443

0,030

X2X3

1,187

0,443

0,115

Linear

Quadrtico

Interaes

* Estatisticamente significativo ao nvel de 95 % de

confiana

Com exceo da interao X2X3, todas as outras

variveis foram estatisticamente significativas. Os efeitos
lineares mais expressivos foram a temperatura (negativo)
e a quantidade de combi-lipase (positivo), e por essa
razo, foi construdo um grfico de curvas de contorno
que demonstram a interao entre essas duas variveis
(Figura 2).

Y = 83.36 + 3.93X1 4.24X12 5.98X2 6.33X22 + 6.96X3

3.03X32 + 3.56X1X2 + 1.29X1X3
(2)
onde Y a percentagem de converso da reao de
transesterificao, e X1, X2, e X3, so os valores
codificados de razo molar de substrato, temperatura e teor
de combi-lipase, respectivamente.
A anlise de varincia (ANOVA) para o modelo foi
realizada com um nvel de confiana de 95 % para p =
0,045, e a avaliao da qualidade estatstica do modelo foi
determinada pelo teste de Fisher, revelando um valor de f
calculado de 3,37. O coeficiente de determinao
apresentou um valor de R2 de 0,91. Estes resultados
mostraram uma representao satisfatria do modelo do
processo e uma boa correlao entre os resultados
experimentais e os valores tericos previstos pela equao.
3.2.2. Efeito dos parmetros de reao
A Tabela 5 apresenta os efeitos lineares, quadrticos,
e de interao entre as variveis: Razo molar etanol:oliva
(X1), temperatura (X2), e quantidade de combi-lipase (X3).
Os valores dos efeitos, p-valor e seus respectivos erros
padres tambm esto indicados. Para a tomada de deciso
de quais efeitos calculados foram estatisticamente
significativos, o valor de p correspondente deveu-se ser
menor que 0,05, ao nvel de significncia de 95 %.

Figura 2. Curvas de contorno para reaes de transesterificao

enzimtica de sntese de biodiesel. Contedo de combi-lipase versus
temperatura. Os nmeros na legenda indicam os valores do rendimento
de converso (%), sob as condies de reao testadas. A varivel razo
molar etanol:oliva foi fixado no ponto central.

Verifica-se que um acrscimo na quantidade de

combi-lipase, mantendo a temperatura num nvel mais
baixo, promove um aumento no rendimento de sntese de
biodiesel. Segundo Jeong e Park (2008), este efeito
negativo de temperatura pode estar associado com a perda
de atividade enzimtica. No trabalho desenvolvido por
este grupo, a enzima CALB foi exposta a temperaturas na
faixa de 25-55 C em reaes de transesterificao do leo
de colza. Em temperaturas maiores que 40 C, a enzima
perdeu significativamente sua atividade, reduzindo dessa
forma o rendimento da reao. Outros autores tambm
relataram que a faixa de temperatura tima de TLL, RML,
e CALB situa-se entre 30 e 35 C (RODRIGUES et al.,
2008). Mais especificamente para TLL, Xu et al. (2004)
relataram uma diminuio significativa no rendimento da

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transesterificao de leo de soja, quando a temperatura de

reao foi aumentada de 40 para 50 C, o que provocou,
uma reduo na atividade da enzima. Dessa forma,
temperaturas de reao mais suaves so consideradas mais
vantajosas, uma vez que promove uma reduo no gasto de
energia do processo, alm de manter a atividade da enzima
inalterada.
Os maiores rendimentos de converso promovidos
pelo aumento da quantidade de combi-lipase j era
esperado, pois o acrscimo de enzima na reao favorece o
aumento da velocidade de reao, implicando no maior
nmero de stios ativos no meio reacional (HA et al.,
2007). No entanto, de acordo com Krishna et al. (2000)
apenas as molculas de substrato que so combinadas com
a enzima podem ser transformadas em produto, e dessa
forma, h um limite onde o aumento na quantidade de
enzimas no afeta a formao do produto. Os autores
testaram
Lipozyme
IM-20,
nas
reaes
de
transesterificao, variando as quantidades de enzimas a
partir de 0,5 g a 10 g. Foi verificado que com apenas 3 g de
enzima foi possvel atingir uma converso de 95 %, o
maior rendimento obtido.
3.2.3. Condies ideais de sntese e validao do modelo
Os valores timos de cada varivel foram obtidos em
funo da resposta desejada, ou seja, o rendimento mximo
de sntese de biodiesel depois de 18 horas de reao. Estes
valores foram: razo molar etanol:oliva de 7,04:1;
temperatura de 35,9 C; 13,7 % de combi-lipase em relao
massa de leo. Sob estas condies, o valor terico para o
rendimento de converso previsto pelo modelo foi de
98,3 %. Novos experimentos foram realizados sob as
condies otimizadas, com rendimento mdio de
converso, a partir de trs repeties, de 95,12 1,56 %,
mostrando excelente correlao entre o resultado
experimental e o previsto pelo modelo.
3.3. Cintica da reao de transesterificao
A fim de comparar as reaes de transesterificao
catalisada pelos biocatalisadores em mistura (combi-lipase)
e individualmente, cinticas de transesterificao foram
realizadas, seguindo as condies otimizadas no
planejamento. Os resultados do desempenho das lipases
so apresentados na Figura 3.

Figura 3. Tempo de curso de transesterificao catalisada pelo combilipases (), ou com enzimas individuais () TLL, () RML, e
( ) CALB. Condies de reao: razo molar etanol:oliva 7,04:1;
temperatura de 35,9 C; quantidade de combi-lipase de 13,7 % (em massa
de leo); 4 % de gua (em massa de leo).

Um pico de 95 % de converso mxima foi alcanado

em 18 h de reao utilizando a combi-lipase, (RML-TLLCALB), valor muito superior em relao ao uso das
enzimas individualmente. Nenhum dos biocatalisadores
converteu mais de 50 % dos seus substratos quando
utilizados individualmente.
As consideraes sobre estes resultados emergem das
diferenas na especificidade das enzimas relacionadas
com o tipo de cidos graxos utilizados como substratos.
Lipases no-especficas, tais como a de Candida
antarctica, atuam em todas as posies na molcula de
substrato, por outro lado, as lipases sn-especfica
(Thermomyces lanuginosus e Rhizomucor miehei) atuam
de preferncia nas posies sn-1 e sn-3 de molculas de
acilglicerol (CARVALHO et al., 2003b). Alm disso,
segundo Pleiss et al. (1998) a CALB apresenta maior
atividade para cidos graxos de curto e mdio
comprimento da cadeia, diminuindo essa atividade para os
cidos graxos de cadeia longa. Ao contrrio, RML tem
baixas atividades para os cidos graxos de cadeia curta,
mas no para os cidos graxos longos. Essa diferena de
especificidade foi observada no presente trabalho, onde
cada enzima foi especfica em determinado cido graxo, e
dessa forma, foi possvel alcanar rendimentos muito bons
de converso.
Os resultados obtidos no presente trabalho esto de
acordo com outros estudos similares de transesterificao
relatados na literatura. Lee et al. (2011) obtiveram
converses de at 99 % no perodo de 21 h, na metanlise
do leo de soja utilizando a combinao das lipases
Rhizopus oryzae e Candida rugosa (1,3-sn-especfica e
no-especfica, respectivamente). Quando utilizadas
individualmente, a converso decaiu para 70 % e 20 %,
respectivamente. As lipases em combinao tambm
podem atuar sinergicamente, de modo a reduzir a
quantidade total de enzima necessria para uma eficiente
transesterificao. Por exemplo, Li et al. (2006) relataram
que a combinao de 3 % de TLL e 1 % de CALB (lipases
1,3-sn-especfica e no especfica, respectivamente)
produziu 95 % de converso na metanlise do leo de
colza com terc-butanol como solvente em 12 h. Em
contraste, a produo de steres metlicos foi de 85 % em
reao utilizando-se 20 % de TLL, e 90 %, usando 2 % de
CALB (ambas individualmente). Novozym 435, (CALB
imobilizada comercialmente) uma excelente lipase capaz
de sintetizar biodiesel em altas taxas de converso, no
entanto, seu custo muito mais elevado do que outras
lipases comerciais (LI et al., 2010). Dessa forma, o uso de
TLL reduz a quantidade necessria de CALB, reduzindo
os custos de sntese de biodiesel (CHRISTOPHER et al.,
2014).
3.4. Reuso da combi-lipase para a sntese de biodiesel
As lipases so compostos bioqumicos de alto custo e
seria muito importante se estas enzimas pudessem ser
reutilizados em vrios ciclos de reao, a fim de permitir a
sua aplicao industrial na sntese de biodiesel. Dessa
forma, foram realizadas sete bateladas repetidas usando a
combi-lipase (TLL:RML:CALB). As reaes foram
desenvolvidas nas condies ideais previamente
otimizadas, realizando uma lavagem dos biocatalisadores
com solvente hexano entre as repeties. As lavagens
foram necessrias para remover a camada de
leo/biodiesel formado em torno da enzima, que poderia

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causar a perda de atividade e limitar a taxa de difuso de

substrato e produto (HSU et al., 2004). Os resultados
destas reaes so apresentados na Figura 4.

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M. D. Aplicao de lipases microbianas na obteno de
concentrados de cidos graxos poliinsaturados. Qumica
Nova, v. 26, p. 75-80, 2003b.

Figura 4. Estabilidade operacional do combi-lipase em 7 ciclos de reuso.

Todas as reaes foram desenvolvidas sob as condies otimizadas, em
18 h.

Ao final das sete bateladas, o biocatalisador combilipase manteve o rendimento de converso em torno de
80 % em relao ao primeiro ciclo. Dessa forma, confirmase a aplicabilidade desses biocatalisadores, tornando-se
promissores no uso industrial em reaes de sntese de
biodiesel.
4. Concluses
O conceito do biocatalisador combi-lipase para
reaes de transesterificao utilizando o substrato
heterogneo de leo de oliva foi empregado com sucesso
na sntese de biodiesel. A combinao de enzimas resultou
em converses mais elevadas do que quando foram
utilizadas individualmente. Fatores ligados estabilidade
das enzimas que limitam a utilizao desses
biocatalisadores puderam ser superados neste trabalho,
uma vez que a atividade do combi-lipase manteve-se
relativamente alta nos 7 ciclos de reuso testados. Nesse
sentido, os objetivos propostos nesse estudo puderam ser
alcanados, demonstrando que a transesterificao
enzimtica utilizando misturas de lipases uma tecnologia
promissora para a produo em grande escala de biodiesel.
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