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Revista Eletrnica de Farmcia Vol 2 (2), 73-79, 2005.

ISSN 1808-0804

ESTUDO DA LIGAO CRUZADA INDUZIDA PELO FORMALDEDO


EM CPSULAS DE GELATINA DURA
Study of formaldehyde induced cross-linking in hard gelatin capsules
Ana Lcia T. C. Zampieri; Eliana M. Lima*, Danielle G. A. Diniz
Faculdade de Farmcia/ UFG - Laboratrio de Tecnologia Farmacutica/ FF
* Autor para correspondncia: e-mail: emlima@farmacia.ufg.br
Recebido em 23/11/2005 - Aceito em 16/12/2005

RESUMO: O formaldedo um agente desnaturante que induz a ligao cruzada covalente na gelatina, sendo
um dos agentes utilizados para a promoo da gastro-resistncia em formas farmacuticas gelatinosas, contudo,
seu uso carece de avaliaes minuciosas e da definio de protocolos especficos para as diversas classes de
frmacos. O objetivo deste trabalho foi investigar a ligao cruzada induzida pelo formaldedo em cpsulas de
gelatina dura. Cpsulas foram imersas em soluo hidroalcolica (70-90%) contendo diversas concentraes de
formaldedo. Amostras foram submetidas aos testes de avaliao da extenso da ligao cruzada determinandose o nmero de grupos amino livres por espectrofotometria e a quantificao do formaldedo residual feita por
HPLC. A extenso da ligao cruzada ocorrida foi notavelmente influenciada pela concentrao de formaldedo e
de gua e lcool nas solues usadas para o tratamento das cpsulas. Os resultados demonstraram que o
resduo de formaldedo determinado aps o tratamento das cpsulas esteve dentro de limites aceitveis.
Entretanto, avaliaes seriadas durante o armazenamento das cpsulas demonstraram que a ligao cruzada
continua ocorrendo, levando a uma resistncia superior ao necessrio para a administrao de frmacos nesta
forma farmacutica.
PALAVRAS-CHAVE: gastro-resistncia; cpsulas de gelatina; formaldedo; ligao-cruzada.

ABSTRACT: Formaldehyde induced cross-linking in gelatin can be used to promote gastric-resistance in gelatin
based oral drug delivery systems. However, thorough evaluations for each drug class must be performed before
establishing its use for this purpose. In this work, formaldehyde induced cross-linking in hard gelatin capsules was
investigated. Capsules were immersed in hydroalcoholic (70-90%) solutions containing several different
concentrations of formaldehyde. Cross-linking was evaluated by the determination of free amino groups in the
samples by UV spectrophotometry. Residual formaldehyde was determined by HPLC. Cross-linking reaction was
strongly influenced by water and alcohol concentrations in the solutions used for the treatment of the capsules.
Residual formaldehyde was within acceptable range. However, repeated analysis during a short term storage of
the capsules proved that the cross-linking continues as long as any residual formaldehyde is present, leading to a
much higher resistance than what would be convenient for the oral drug delivery.
KEYWORDS: gastric-resistance; gelatin capsules; formaldehyde; cross-linking.
INTRODUO
As formas farmacuticas slidas de administrao oral representam a grande maioria dos produtos
farmacuticos disponveis no mercado. importante destacar que, embora essas formas farmacuticas sejam
absorvidas no trato gastrintestinal, h regies ao longo deste sistema onde certos frmacos so melhor
absorvidos. Por exemplo, existem frmacos que por serem irritantes ao estmago ou sensveis ao baixo valor do
pH do suco gstrico (entre 1,0 e 2,5) devem passar intactos pelo estmago para serem absorvidos no intestino.
Isso possvel protegendo a forma farmacutica com revestimentos ditos gastro-resistentes (PRISTA et al, 1995).

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O revestimento gastro-resistente uma tcnica utilizada na preparao de formas farmacuticas para que
resistam, sem alterao, ao do suco gstrico, devendo, porm, desagregar-se rapidamente no suco intestinal
(TRONDSTAD et al,1985; RADI & AMIJI, 2003) e tem despertado o interesse de muitos pesquisadores em
desenvolver mtodos eficazes e reprodutveis para esse revestimento.
Vrios materiais e tcnicas podem ser usados na preparao dos revestimentos gastro-resistentes, como
por exemplo, PINA et al (1995 e 1996) usaram a tcnica de imerso ou mergulho seguido de secagem na
preparao de cpsulas de gelatina dura com solues hidroalcolicas de formaldedo tornando-as gastroresistentes. O formaldedo um agente desnaturante que induz a ligao cruzada covalente na gelatina o que
proporciona gastro-resistncia e possibilita sua degradadao por ao de enzimas no intestino (PINA et al, 1995
e 1996). Esta reao predominantemente devida formao das bases de Schiff, reao entre os grupos amino
da lisina ou grupos laterais da hidroxilisina da gelatina e o aldedo disponvel (SCHACHT et al, 1997; FRIESS et al,
1998). A figura 1 representa a formao da base de Schiff resultante da ao do formaldedo.

Figura 1: Representao da formao da base de Schiff (SCHACHT et al, 1997).


Embora o formaldedo seja o agente de revestimento h mais tempo conhecido da tecnologia farmacutica
(BRJO & SOUSA, 1972; PINA et al, 1995 e 1996; GHOLAP & SINGH, 2004) seu uso no tratamento de cpsulas
de gelatina com o objetivo de torn-las gastro-resistentes, carece de avaliaes minuciosas e da definio de
protocolos especficos para as diversas classes de frmacos.
Diversos parmetros relacionados ligao cruzada na gelatina induzida pelo formaldedo, para a
obteno de cpsulas gastro-resistentes tm sido estudados (BRJO & SOUSA, 1972; PINA et al 1995 e 1996),
como por exemplo, a concentrao do formaldedo na soluo gastro-resistente; o tempo de contato dessa
soluo com a cpsula de gelatina dura; os processos de secagem das cpsulas aps o contato com a soluo de
tratamento; o tempo de estocagem dessas cpsulas e a possvel presena de formaldedo residual nas cpsulas
gastro-resistentes. Devido a essas variveis, o tratamento gastro-resistente em cpsulas de gelatina dura
apresenta dificuldades em sua realizao. A investigao desses parmetros para a criao de um mtodo de
tratamento torna-se imprescindvel, caso contrrio o processo pode ser considerado emprico (BRJO & SOUSA,
1972). Estudar o efeito da extenso da ligao cruzada em cpsulas de gelatina dura contendo naproxeno, a
partir de solues de tratamento contendo diferentes concentraes de formaldedo e do etanol e determinar o
resduo de formaldedo nas cpsulas gastro-resistentes.
MATERIAL E MTODOS
Materiais
Foram empregados os seguintes materiais: cpsulas de gelatina dura, incolor, nmero zero, naproxeno,
formaldedo 36,6%, lcool etlico 96 GL, lcool etlico P. A., cido clordrico, cido fosfrico, hidrxido de sdio,
fosfato monobsico de potssio, acetonitrila, 2,4-dinitrofenilhidrazina (2,4-DNPH), bicarbonato de sdio, cido
trinitrobenzenosulfnico (TNBS) e ter etlico. Os equipamentos usados foram Espectrofotmetro UV-Vis (VarianCary-50), HPLC (Varian, modelo Pro-Star 240), Agitador Magntico (Tecnal, modelo TE-085), Balana Analtica
(Gehaka, modelo AG 200), Balana de Preciso (Gehaka, modelo BG 4001), Estufa de Secagem (Quimis) e
Encapsulador Manual (Gehaka).
O frmaco Naproxeno utilizado como modelo no processo desenvolvido neste trabalho, um agente
antinflamatrio no esteride (AINES) derivado do cido propinico; com frmula estrutural apresentada na figura
2. praticamente insolvel em gua (THE MERCK INDEX, 2001) e apresenta pka igual a 4,15 (AHFS DRUG
INFORMATION, 1996). um efetivo agente analgsico, antinflamatrio e anti-pirtico. Apresenta baixa tolerncia
gstrica e diversos estudos demonstram que o naproxeno pode causar danos mucosa gstrica podendo gerar
ulcerao e/ou hemorragia (TRONDSTAD et al, 1985; SHEBA et al, 2002). Com isso, a diminuio da irritao
gstrica proveniente da administrao de naproxeno tem sido estudada atravs de modificaes na forma
farmacutica e administrao do frmaco (TRONDSTAD et al, 1985; ODDSSON et al, 1990).

Figura 2: Frmula Estrutural do Naproxeno.

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Mtodos
Preparao das cpsulas gastro-resistentes
As cpsulas foram manipuladas contendo 250mg de naproxeno de acordo com as Boas Prticas de
Manipulao (BRASIL-RDC n33, 2000) e seladas manualmente atravs da imerso da extremidade aberta da
tampa das cpsulas em uma soluo contendo glicerina, lcool etlico 96 GL e gua, em partes iguais.
As solues de formaldedo (0,2 mMol.L-1 a 0,5 mMol.L-1) foram preparadas em soluo hidroalcolica (70
a 95% de etanol), com as quais foram tratados grupos de cpsulas de naproxeno contendo 12 unidades cada,
atravs da imerso em 100g de soluo por 15 minutos, em frasco aberto (PINA et al, 1996). As cpsulas foram
secadas inicialmente em estufa a 37C por 30 minutos e em seguida foram expostas temperatura ambiente por
24 horas.
Avaliao da ligao cruzada
O nmero de moles de grupos amino livres da gelatina antes e depois do tratamento com diversos
aldedos tm sido usados para determinar a extenso da ligao cruzada ocorrida (OFNER, et al 1996; VANDELLI
et al, 2001, 2004). Este teste foi realizado pesando uma quantidade exata de 11mg de cpsulas vazias
previamente tratadas com diferentes solues contendo formaldedo e etanol. Essas cpsulas foram tratadas com
1ml de bicarbonato de sdio por 04 horas a 40C e 1ml de cido trinitrobenzenosulfnico (TNBS). Foram
adicionados 3ml de cido clordrico 6N e o material foi autoclavado por 01 hora a 120C (15-17 psi). O produto
hidrolisado foi diludo com 5ml de gua e extrado com 5ml de ter etlico. Uma alquota de 5ml da fase aquosa foi
aquecida a 37C por 15 minutos, resfriada temperatura ambiente e diluda novamente com 15ml de gua. O
nmero de moles dos grupos amino livres de gelatina foram determinados por espectrofotometria na regio do UV
em 346nm, contra um branco. A soluo referncia (branco) foi preparada da mesma forma que a amostra acima
descrita, porm o cido clordrico 6N foi adicionado antes do TNBS a fim de bloquear a reao com os grupos
amino livres da gelatina.
Os clculos foram realizados convertendo os valores das absorbncias obtidas para moles de grupos
amino por grama da gelatina, a partir do mtodo descrito por OFNER et al (1996).
Quantificao do formaldedo residual
Para este teste foram avaliadas cpsulas previamente submetidas a diferentes tratamentos com
concentraes variadas de formaldedo (0,2-0,37mMol.L-1) e de etanol nas solues de tratamento (70-90%). As
amostras para o ensaio foram coletadas aps 24 horas de exposio temperatura ambiente, como tambm aps
30 dias de armazenamento. Duas cpsulas foram depositadas em frasco fechado contendo 20ml de gua
destilada em temperatura ambiente e agitadas em agitador magntico por 2 horas. Posteriormente foi retirado 01
ml para anlise em HPLC do formaldedo residual.
Mtodo para quantificao do formaldedo residual
O mtodo usado foi baseado no mtodo proposto por HEYDEN et al (2002). Para a cromatografia lquida
de alta eficincia foi utilizada coluna Licosphere RP-18 (250x4mm), tendo como fase mvel uma mistura de 45/55
(v/v) de acetonitrila e 0,025M de soluo tampo fosfato ajustado para pH 4,0 com uma soluo 1M de cido
fosfrico. As condies de anlise foram: fluxo 2ml/min, volume de injeo 20l, deteco ultravioleta (= 345nm).
Em etapa prvia ao ensaio cromatogrfico foi promovida a derivao da amostra contendo formaldedo
com 2,4-dinitrofenilhidrazina (2,4-DNPH), possibilitando assim, a quantificao do formaldedo, a partir do produto
dessa reao. Nessa derivao 0,4ml de uma soluo de 2,4-DNPH 0,1% foi adicionada a 1,0ml de amostra. A
mistura foi agitada por 01 minuto em vrtex seguido de repouso por 02 minutos. A soluo foi estabilizada
adicionando 0,4ml de uma soluo tampo fosfato 0,1M (pH 6,8) e 0,7ml de NaOH 1M. Esta mistura foi ento
injetada no cromatgrafo.
A curva de calibrao foi preparada a partir de uma soluo estoque de formaldedo (0,1% (m/v)) em fase
mvel. Pela regresso linear da curva, foi obtido um coeficiente de correlao igual a 0,8502. A expresso da
curva foi Conc.= Y 55210 / 8*107.
Os clculos referentes concentrao do formaldedo residual foram efetuados a partir da rea dos picos
identificados atravs da separao cromatogrfica do produto de reao formado pelo formaldedo e o reagente
2,4-DNPH.
RESULTADOS E DISCUSSO
Avaliao da ligao cruzada
Os resultados referentes avaliao da extenso da ligao cruzada ocorrida entre as molculas de
gelatina esto apresentados na figura 3 e indicaram a diminuio do nmero de moles dos grupos amino livres

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aps o tratamento com concentraes crescentes de formaldedo. Entretanto, quando a concentrao de


formaldedo foi constante e a concentrao de etanol aumentou houve o aumento do nmero de moles dos grupos
amino livres. Como esse nmero, aps o tratamento com formaldedo, representam a extenso da ligao
cruzada, possvel concluir que a ligao cruzada nas cpsulas gastro-resistentes tratadas com o formaldedo
cresceu com o aumento da concentrao de formaldedo e decresceu com o aumento da concentrao de etanol.
Os resultados obtidos esto de acordo com VANDELLI et al (2001), que verificaram a extenso da ligao
cruzada promovida pelo DL-gliceraldedo (GAL) em microesferas de gelatina. Foi verificado que o aumento na
concentrao de GAL promoveu a diminuio dos grupos amino livres, ou seja, o aumento da ligao cruzada. Da
mesma maneira, VANDELLI et al (2004) verificaram a extenso da ligao cruzada, em microesferas de gelatina,
promovida pelo aquecimento em fornos a diferentes temperaturas. Constataram que, o aumento na temperatura
dos fornos promoveu a diminuio dos grupos amino livres, ou seja, o aumento da ligao cruzada.
Portanto, a variao da quantidade de grupos amino livre da gelatina evidenciou os diferentes nveis de
ligao cruzada ocorrida aps o tratamento com o formaldedo, tendo sido esta a reao responsvel pela gastroresistncia das cpsulas.

Moles de grupos amino livres / mol de


gelatina

4,000E-03
3,500E-03
0,2mMol.L-1(90%)
3,000E-03
0,2mMol.L-1(80%)
2,500E-03

0,2mMol.L-1(70%)

2,000E-03
1,500E-03
1,000E-03
5,000E-04

0,5mMol.L-1(70%)

0,000E+00
Solues utilizadas para o tratam ento gastro-resistente das cpsulas de
gelatina

Figura 3: Relao entre moles dos grupos amino livres por moles de gelatina presentes nas cpsulas de gelatina
dura aps tratamento gastro-resistente com diferentes solues contendo formaldedo 0,2-0,5mMol.L-1 e etanol 7090%.
Quantificao do formaldedo residual
Os resultados obtidos esto apresentados na tabela 1 e demonstraram que, para as cpsulas analisadas
aps o procedimento de secagem e exposio temperatura ambiente por 24 horas, quanto maior a concentrao
de formaldedo presente na soluo de tratamento, maior a concentrao residual. De maneira inversa, quanto
maior a concentrao de etanol na soluo de tratamento menor o resduo de formaldedo quantificado.
PINA et al (1987; 1996) avaliaram cpsulas de gelatina dura gastro-resistentes a partir da exposio
destas em diferentes solues contendo formaldedo e etanol e observaram que quanto maior a concentrao de
formaldedo maior era a concentrao residual desse. Contudo, a concentrao de formaldedo residual detectado
por PINA et al (1987) nas cpsulas tratadas com 2,0% de formaldedo em 90% de etanol foi 0,332mg/cpsula, ao
passo que, a concentrao obtida nesse trabalho, para as cpsulas tratadas com 0,2 mMol.L-1 de formaldedo e
90% de etanol (concentrao similar quela citada por PINA et al (1987) foi 0,022 mg/cpsula. Essa diferena
pode ser explicada pelas diferentes metodologias empregadas nos tratamentos gastro-resistentes, como por
exemplo, o tamanho da cpsula usada, j que o trabalho citado usou uma cpsula bem maior (nmero 00).

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Tabela 1 Quantificao do Formaldedo residual aps o procedimento de secagem e exposio temperatura


ambiente por 24 horas
Solues de tratamento
Formaldedo residual mg/cpsula
0,37 mMol.L-1 de formaldedo / 70% de etanol
0,536 mg/cpsula
0,2 mMol.L-1 de formaldedo / 70% de etanol
0,360 mg/cpsula
0,2 mMol.L-1 de formaldedo / 80% de etanol
0,041 mg/cpsula
0,2 mMol.L-1 de formaldedo / 90% de etanol
0,022 mg/cpsula
Aps 30 dias de armazenamento das cpsulas tratadas com 0,2 mMol.L-1 de formaldedo e 90% de etanol
no foi detectada a presena de formaldedo residual demonstrando que, devido sua volatilidade, o formaldedo
residual diminui com tempo de armazenamento.
De acordo com INTERNATIONAL PROGRAMME ON CHEMICAL SAFETY (1989), a concentrao de
formaldedo normalmente ingerida por um adulto atravs dos alimentos pode variar de 1,5 a 14mg/dia. A partir
dessa informao possvel concluir que, todas as cpsulas analisadas aps 24 horas do tratamento
apresentaram concentrao residual dentro de limites aceitveis, sendo que, nas cpsulas tratadas com
0,2mMol.L-1 de formaldedo e 90% de etanol essa concentrao foi ainda menos significativa
Os cromatogramas referentes tabela 1 esto apresentados na figura 4. Esses cromatogramas
demonstraram que o produto de reao do formaldedo foi mais evidente nas amostras de cpsulas tratadas com
maior concentrao de formaldedo presente nas solues de tratamento, sendo, contudo, menos evidentes nas
amostras de cpsulas tratadas com maior concentrao de etanol. importante ressaltar que a rea do pico
formado pelo produto de reao do formaldedo inversamente proporcional rea do pico relativo ao reagente
2,4-DNPH.
Os resultados demonstraram tambm que as modificaes propostas ao mtodo de HEYDEN et al (2002),
permitiram uma reduo no tempo de eluio do composto analisado, como tambm uma melhor definio dos
picos formados.

II+

II-

II+

II-

II+

II-

mAU

2,4-DNPH
0,37 mmol.l-1 de formaldedo e 70% de etanol
0,2 mmol.l-1 de formaldedo e 70% de etanol
0,2 mmol.l-1 de formaldedo e 80% de etanol
0,2 mmol.l-1 de formaldedo e 90% de etanol

50

00

Produto da reao
entre o formaldedo e
o reagente 2,4-DNPH

50

-19
2.5

5.0

7.5

10.0
Minutes

Figura 4 Cromatogramas de amostras de formaldedo residual de cpsulas tratadas com diferentes solues e
analisadas aps 24 horas de secagem: anlise por HPLC em coluna Licosphere RP-18, 250x4mm, deteco
ultravioleta (= 345nm).

CONCLUSES
Os resultados obtidos demonstraram que o teste de avaliao da ligao cruzada permitiu a verificao da
extenso desta, sendo notavelmente influenciada pelo formaldedo e a concentrao de etanol nas solues
usadas no tratamento das cpsulas. A ligao cruzada sofrida pela gelatina aumentou numa razo direta em

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relao ao aumento da concentrao de formaldedo contido na soluo de tratamento, ao passo que, o aumento
da concentrao de etanol diminuiu proporcionalmente a ligao cruzada sofrida pela gelatina.
Os resultados mostraram ainda que, todas as cpsulas gastro-resistentes analisadas aps 24 horas do
tratamento apresentaram concentrao residual de formaldedo dentro de limites aceitveis, sendo que, o resduo
de formaldedo determinado aps 30 dias de armazenamento, nas cpsulas tratadas com 0,2mMol.L-1 de
formaldedo e 90% de etanol foi nulo. Vale ressaltar que, alm do mtodo cromatogrfico empregado para a
quantificao do formaldedo residual ser vivel, apresenta vantagens sobre o mtodo no qual foi baseado.
Portanto, a realizao de ensaios que conduzam a elucidao dos diferentes parmetros que influenciam
a ligao cruzada na gelatina induzida pelo formaldedo imprescindvel para o desenvolvimento de um mtodo
de tratamento gastro-resistente eficiente e reprodutvel.
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