Guia Como Observar Cromossomos

Como observar cromossomos:
Um Guia de Tcnicas em
Citogentica Vegetal,
Animal e Humana
Como observar cromossomos:

Um Guia de Tcnicas em
Citogentica Vegetal,
Animal e Humana
Marcelo Guerra
Departamento de Botnica
Universidade Federal de Pernambuco
e
Maria Jos de Souza
Departamento de Gentica
Universidade Federal de Pernambuco
Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

(Cmara Brasileira do Livro, SP, Brasil)
Guerra, Marcelo
Como observar cromossomos : um guia de tcnicas
em citgentica vegetal, animal, e humana /
Marcelo Guerra, Maria Jos de Souzas. -Ribeiro Preto, SP : Fundao de Pesquisas
Cientficas de Ribeiro Preto, 2002.
Bibliografias.
1. Citogentica 2. Cromossomos I. Souza, Maria
Jos. II. Ttulo.
ISBN: 85-87528-38-6
02-3218
CDD-572.8072
ndices para catlogo sistemtico:

1. Citogentica : Tcnicas de laboratrio :
Cincias da vida 572.8072
Todos os direitos desta edio reservados
Fundao de Pesquisas Cientficas de Ribeiro Preto.
Editor Chefe: Prof. Dr. Francisco A. Moura Duarte
Editor Associado: Prof. Dr. David De Jong
Supervisora de Produo: Eneida Oliveira Banks
Engenheiro de Sistemas: Domingos Yamada
Computao Grfica: Jos Meneghetti Jnior
Revisora Tcnica: Margareth P. Monteiro de Barros
Coordenador de Produo Grfica: Edmundo Cruz Canado
Supervisora de Editorao Grfica: Fabiana Pereira da Silva
Capa: Fabiana Pereira da Silva
FUNPEC - Editora
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Tel./Fax: (16) 620-1251
e-mail: funpecrp@uol.com.br
www.funpecrp.com.br
2002, Impresso no Brasil
APRESENTAO
Este livro comeou como um roteiro para aulas prticas ministradas
independentemente por ambos os autores. Ao longo de muitos anos, o
texto foi modificado, ajustando-se melhor s tcnicas j bem estabelecidas
e incorporando-se novas, servindo tambm de referncia para a rotina dos
estagirios e ps-graduandos dos nossos laboratrios. Finalmente, foi
reorganizado como um guia prtico de tcnicas em citogentica. Desde o
incio at a sua forma final, os procedimentos tcnicos foram sempre
testados, criticados e aperfeioados por nossos alunos, aos quais somos
imensamente gratos pelas inmeras sugestes, principalmente queles que
trabalharam intensamente conosco na fase final de redao deste texto,
contribuindo, inclusive, com muitas das fotos apresentadas.
Na parte relativa Citogentica Vegetal, o autor gostaria de destacar a
colaborao fundamental de Ana Emlia Barros e Silva, que como amiga e
tcnica do laboratrio, checou e discutiu todos os protocolos, preparo de
solues, etc, alm de revisar o texto final vrias vezes, e de Reginaldo de
Carvalho, que gentilmente preparou todas as pranchas dessa rea. Na
Citogentica Animal, a autora particularmente grata s colegas Tania T.
Rieger, pela leitura e contribuies sugeridas, e Rita de Cssia de Moura,
pela elaborao de alguns desenhos, bem como s tcnicas Francisca
Tavares Lira e Cirlene Maria da Silva pelo constante apoio nas diferentes
fases deste trabalho. Gostaramos ainda de agradecer doutoranda Ana
Christina Brasileiro pela reviso do portugus de todo o livro.
PREFCIO
A anlise cromossmica sempre foi um dos campos mais excitantes da
Citologia e da Gentica, tanto quando relacionada a estudos taxonmicos e
evolutivos, quanto a estudos estruturais, no melhoramento gentico, na
caracterizao de germoplasmas ou na anlise clnica. Apesar da revoluo
provocada pela Gentica Molecular, a anlise cromossmica continua sendo
a nica maneira de observar todo o genoma de um eucariota na forma de
blocos individualizados de material gentico, passveis de serem
mensurados, diferenciados em sub-unidades e manipulados de diversas
maneiras. Em nenhuma outra instncia, o material gentico to claramente
observado. Com a introduo das tcnicas moleculares, os chamados corpos
corados da Citologia, esto cada vez mais brilhantemente corados, em cores
e pseudo-cores as mais variadas.
A obteno de bons resultados, depende basicamente do perfeito
domnio de diferentes tcnicas de colorao. Com isso, a Citogentica alia a
informao obtida sobre o material gentico, estampada em uma simples
foto, a uma esttica prpria da rea, capaz de impressionar iniciantes e
profissionais experientes. O fascnio da Citogentica evidente at nos
trabalhos rotineiros. Em aulas prticas, por exemplo, mesmo professores
mais experientes no conseguem ser muito objetivos na anlise de uma
lmina bem preparada de mitose em cebola. So sempre possudos pelo
desejo de olhar mais e mais, uma e outra clula. Uma metfase bonita, bem
espalhada e corada com hematoxilina, Giemsa ou DAPI uma paisagem
difcil de tirar da memria por horas ou mesmo dias.
Durante o processo evolutivo das espcies, os caritipos se
transformaram seguindo regras prprias, muitas das quais ainda
desconhecidas, gerando uma imensa diversidade cromossmica em nmero,
forma, tamanho, capacidade de pareamento meitico, contedo de
heterocromatina, etc. Os vrios exemplos apresentados no texto, ilustram
no apenas o efeito final de determinadas tcnicas de colorao como tambm
fornecem uma amostra da diversidade revelada com essas tcnicas. As fotos
foram quase sempre tiradas de trabalhos nossos j publicados, mostrando
assim o que possvel produzir com essas tcnicas.
O estudo da variabilidade cariotpica e do seu significado tem sido nosso
tema de pesquisa h cerca de 30 anos. Este livro o resultado dessa
experincia em pesquisa, em aulas prticas e na orientao de alunos nos
mais diversos ramos da citogentica. Os protocolos apresentados tm sido
utilizados em aulas prticas de diferentes cursos de graduao e psgraduao ministrados pelos autores na Universidade Federal de Pernambuco
e em outras Universidades. A citogentica humana foi restrita, neste texto,
s tcnicas bsicas, tanto por no ser a rea de pesquisa dos autores, quanto
por ser uma rea j to especializada que possui guias particulares nos
quais tem sido bastante exploradas.
O texto est dividido em duas partes praticamente independentes: a
citogentica vegetal e a citogentica animal e humana. Cada uma dessas
partes de autoria exclusiva de apenas um dos autores e por isso tem estilo
de apresentao prprio, apesar da intensa troca de idias e sugestes. Os
captulos finais da parte de citogentica vegetal, sobre o preparo de solues,
revelao de filmes e sugestes gerais para o dia-a-dia do laboratrio, se
aplicam igualmente bem na citogentica animal e so recomendados a
qualquer pesquisador iniciante. O texto foi escrito para servir de guia prtico
para aqueles interessados em desenvolver essas tcnicas em seus
laboratrios. Por essa razo, so descritas no apenas as etapas de cada
tcnica mas tambm os detalhes de como fazer cada uma delas e os cuidados
que devem ser tomados. Para os iniciados na rea, uma leitura atenta atravs
das tcnicas e recomendaes provavelmente revelar algumas observaes
importantes.
O livro certamente incompleto, uma vez que apresentamos apenas
aquelas tcnicas utilizadas rotineiramente em nossos laboratrios. Em caso
contrrio, faramos um texto muito volumoso e sem muita experincia. O
leitor interessado em outras tcnicas deve consultar outras obras, algumas
das quais recomendamos no captulo final. Das tcnicas atuais, a grande
ausente a de hibridizao in situ, na qual a nossa experincia no to
extensa que nos permita tratar vontade as vrias etapas envolvidas e por
isso preferimos apenas recomendar livros recentes de autores com vasta
experincia na rea. Esperamos que as tcnicas apresentadas possam ajudar
estudantes e pesquisadores iniciantes a descobrir mais sobre esse fantstico
mundo guardado dentro das clulas.
MARCELO GUERRA
MARIA JOS
DE
SOUZA
NDICE
Parte I - Citogentica Vegetal
15
1
1.1
1.2
1.3
1.4
Como coletar material para anlise citogentica

Obteno de tecido com atividade mittica intensa
Pr-tratamento com antimitticos
Fixao das clulas
Estocagem do material
17
17
19
20
20
2
2.1
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.3.4
2.4
23
23
25
25
28
29
31
31
32
33
33
2.4.1
2.4.2
Como analisar cromossomos mitticos

A escolha da tcnica e do corante adequados
Tcnicas de esmagamento seguido de colorao
Colorao com Giemsa
Controle da colorao Giemsa
Colorao com hematoxilina a 1%
Tcnicas de colorao seguida de esmagamento
Colorao com hematoxilina actica a 1%
Colorao com orcena actica a 2%
Preparao de lminas permanentes com corantes acticos
Colorao Feulgen
Representao do caritipo na forma de cariograma
ou idiograma
Construo de um cariograma
Construo de um idiograma
3
3.1
3.2
3.2.1
3.2.2
3.3
3.3.1
3.3.2
3.4
Como analisar cromossomos meiticos

Observaes gerais para a preparao das lminas
Tcnicas de colorao seguida de esmagamento
Colorao com carmim actico a 2%
Tcnicas de esmagamento seguido de colorao
Colorao com Giemsa
Anlise de clulas do tapete e da mitose polnica
39
39
41
41
43
44
44
45
46
Como corar diferencialmente algumas

regies cromossmicas
Preparao de lminas com digesto enzimtica
Bandeamento C Observao da heterocromatina constitutiva
Dupla-colorao com os fluorocromos CMA e DAPI
Tripla-colorao CMA/DA/DAPI
Colorao sequencial CMA-DAPI com contracorantes
(CMA/DA-DAPI/AMD)
Colorao com Hoechst 33258, quinacrina ou iodeto
de propdeo
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
36
36
37
49
49
50
52
55
56
56
4.7
4.8
5
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
5.9
5.10
5.11
5.12
5.13
5.14
5.15
5.16
5.17
5.18
5.19
5.20
5.21
5.22
5.23
5.24
5.25
5.26
5.27
6
6.1
6.1.1
6.1.2
6.1.3
6.1.4
6.2
6.3
6.3.1
Colorao com nitrato de prata: observao de nuclolos

e RONs
Descolorao de lminas coradas com prata
Como preparar as solues mais utilizadas na
citogentica vegetal
Fixador Carnoy 3:1 - 20 ml
Colchicina a 0,1% ou 0,5% - 50 ml
8-Hidroxiquinolena (8HQ) 0,002M - 300 ml
HCl 1N e 5N - 300 ml
Carmim actico a 2% - 100 ml
Hematoxilina actica 1% - 100 ml
Orcena actica a 2% - 100 ml
Soluo corante de Giemsa (soluo estoque) - 66 ml
Giemsa a 2% (soluo de uso) - 100 ml
Reativo de Schiff - 400 ml
gua sulfurada - 300 ml
Tampo fosfato pH 6,8 (tampo de Sorensen) - 2 litros de
soluo estoque
Tampo McIlvaine pH 7,0 - 2 litros de solues estoque
Tampo McIlvaine pH 5,5 - 20 ml
Tampo citrato-fosfato pH 4,8 - 1 litro
20xSSC - 1 litro
2xSSC - 100 ml
Soluo de celulase 2% - pectinase 20% - 20 ml
Soluo saturada de hidrxido de brio - 120 ml
DAPI (4- 6diamidino - 2 - fenilindol) 2 g/ml - 10 ml
de soluo estoque
CMA (Cromomicina A3) 0,5 mg/ml - 10 ml
AMD (Actinomicina D) 0,2 mg/ml - 5 ml
DA (Distamicina A) 0,1 mg/ml - 10ml
Hoechst 0,5 g/ml - 2 ml de soluo estoque
Quinacrina 0,5% - 10 ml
Iodeto de propdeo 1 g/ml - 10 ml de soluo estoque
Meio de montagem Glicerol:/McIlvaine 1:1
(para fluorocromos) - 50 ml
Como revelar os filmes fotogrficos
Reveladores e fixadores mais comuns
Revelador Dektol - 1 litro de soluo estoque
Revelador Microdol - 1 litro de soluo estoque
Revelador HC-110 (para filme de ASA 400)
Fixador universal - 1 litro
Cuidados com os reveladores e fixadores
Revelao dos filmes mais comumente utilizados
Filme Copex Pan Agfa ou Imagelink Kodak (ASA 25)
57
58
61
61
61
61
62
62
62
62
63
63
63
64
64
65
65
65
65
66
66
66
66
67
67
67
67
68
68
68
69
69
69
70
70
70
71
71
71
6.3.2
6.3.3
Filme T-Max ou Tri-X Pan Kodak (ASA 400)

Filme Panatomic X ou T-Max Kodak (ASA 100)
71
72
Como organizar melhor seu laboratrio e apresentar

seus resultados
Cuidados gerais com os protocolos
Preparao da bancada
Anotaes gerais no laboratrio
Reutilizao de lminas e lamnulas
Descarte de cidos e substncias txicas
Conservao de corantes e lminas coradas
Observao de uma clula em diferentes microscpios
Cuidados com a fotografia
A escolha dos filmes
Organizao da documentao fotogrfica
Seleo de fotos para publicao
Montagem de fotos em uma prancha
73
73
74
74
75
75
75
76
76
77
77
78
78
7.1
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
7.10
7.11
7.12
Parte II - Citogentica animal e humana

8
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
9
9.1
9.1.1
9.1.2
9.2
9.2.1
9.2.2
9.2.3
9.2.4
9.2.5
9.2.6
9.3
9.3.1
9.3.2
9.4
Como observar cromossomos mitticos em insetos

Manuteno de gafanhotos em cativeiro
Obteno de embries
Preparao de lmina a partir de embrio total
Obteno de cromossomos mitticos a partir de clulas de
parede de ovarolos
Obteno de cromossomos mitticos a partir de clulas de
cecos gstricos (suspenso celular)
Como observar cromossomos mitticos humanos e
de pequenos mamferos
Cultivo de linfcitos humanos
Macrotcnica para cultivo de linfcitos
Microtcnica para cultivo de linfcitos
Cultivo de fibroblastos em pequenos mamferos
Obteno de bipsias
Implantao do cultivo
Tripsinizao
Preparao do material para anlise cromossmica
Congelamento de clulas
Descongelamento de clulas
Observao de cromossomos mitticos em clulas de
medula ssea e de bao de pequenos mamferos
Utilizando clulas de medula ssea
Utilizando clulas de bao
Anlise do caritipo mittico
81
83
83
85
86
87
87
89
89
89
90
91
92
93
94
94
95
96
96
96
97
98
9.4.1
9.4.2
10
10.1
10.1.1
10.1.2
10.2
10.3
10.4
10.4.1
10.4.2
10.4.3
11
11.1
11.1.1
11.2
11.3
11.4
11.5
11.6
11.7
11.7.1
11.7.2
11.8
11.8.1
11.8.2
Construindo um cariograma: o exemplo do cariograma

humano
A montagem do cariograma
98
99
Como observar cromossomos meiticos e

complexos sinaptonmicos
101
Disseco de gafanhotos
101
Preparao de lminas por esmagamento de folculos
testiculares de gafanhotos
102
Preparao de lminas por suspenso de clulas testiculares
de gafanhotos
103
A meiose em pequenos mamferos (roedores,
morcegos e marsupiais)
103
Anlise da freqncia e distribuio de quiasmas em
gafanhotos
104
Anlise de complexo sinaptonmico em insetos e
pequenos mamferos
105
Anlise do complexo sinaptonmico em pequenos
mamferos (tcnica de disperso ou spreading)
106
Anlise de complexo sinaptonmico de pequenos
mamferos (tcnica de suspenso celular)
107
Anlise de complexo sinaptonmico em gafanhotos
107
(tcnica de disperso ou spreading)
Como corar diferencialmente cromossomos mitticos,
meiticos, politnicos e a cromatina sexual
111
Bandeamento C (para vertebrados e invertebrados,
especialnente insetos)
112
Bandeamento C (colorao com acridina orange)
112
Anlise da heterocromatina constitutiva atravs da colorao
com os fluorocromos CMA3/DA/DAPI (trplice colorao)
115
A colorao DA/DAPI em cromossomos humanos
116
Colorao seqencial AgNO3/CMA3
118
Observao de nuclolos, RONs, cores e cinetcoros de
insetos
119
Anlise das RONs em vertebrados
119
Bandeamento G e bandeamento R em humano e outros
mamferos
120
Bandeamento G para humano e outros mamferos
120
Bandeamento R por incorporao de 5-bromodesoxiuridina
(5-BrdU)
121
Anlise de cromossomos politnicos de drosfila e da
cromatina sexual humana
122
Coleta de drosfila na natureza
122
Preparao de lminas para obteno de cromossomos
politnicos
122
11.8.3 Localizando a cromatina sexual humana

Como preparar as solues e meios de cultura
usados na citogentica animal
12.1
Soluo de Ringer (soluo fisiolgica de insetos) - 1000 ml
12.2 Soluo de Hanks (soluo salina balanceada) - 500 ml
12.3 Soluo desinfetante de merfene - 75 ml
12.4 Orcena actica a 2% -100 ml
12.5 Orcena lcto actica a 1% - 100 ml
12.6 Soluo de fermento - 25 ml
12.7 Soluo coloidal de gelatina - 50 ml
12.8 Meio de cultura para drosfila
12.9 Meio de cultura para linfcitos - 120 ml
12.10 Meio de cultura para fibroblastos - 120 ml
123
12
Referncias Bibliogrficas
125
125
125
125
125
125
126
126
126
127
127
129
PARTE I
CITOGENTICA
VEGETAL
1 - Como coletar material para

anlise citogentica
Na anlise cromossmica, tanto com tcnicas de colorao simples
quanto com as mais sofisticadas, uma coleta e preparao do material muito bem feitas so fundamentais para a obteno de bons resultados. Os
procedimentos descritos abaixo tm sido aplicados com xito na anlise
citogentica de vegetais dos mais diversos grupos e constituem um resumo dos mtodos mais comumente utilizados para observao de cromossomos em plantas. Antes de se aplicar qualquer das tcnicas de colorao
so necessrios alguns cuidados especiais na obteno de tecidos em atividade intensa de diviso, bem como no pr-tratamento, fixao e estocagem
desse material.
1.1 - Obteno de tecidos em atividade mittica intensa
Em plantas, a maior quantidade de clulas em divises mitticas se
encontra no tecido meristemtico. Esse tecido pode ser encontrado em
diferentes rgos das plantas e se caracteriza por no apresentar clulas
diferenciadas. Para anlise cromossmica mittica o melhor meristema o
de razes, devido principalmente ao maior volume celular e ao crescimento muito rpido. Alm disso, as pontas de razes absorvem mais facilmente
solues onde so mergulhadas, o que muito importante no uso de
antimitticos. A obteno de razes para a anlise cromossmica pode ser
feita a partir de diferentes fontes. As mais comuns so sementes, bulbos e
caules. Abaixo descrevemos como proceder para obter razes adequadas a
partir de diferentes partes da planta.
a) Sementes. Coloque sementes limpas para germinar em placas de
Petri com papel de filtro umedecido. A raiz deve ser coletada preferencialmente quando o seu tamanho for aproximadamente igual ao do eixo maior
da semente. Quando as razes forem muito grossas, prefervel esperar
que cresam um pouco mais e se tornem mais finas. Observe que o papel
de filtro deve ser mantido apenas mido. A maioria das espcies germina
rapidamente e dispensa maiores cuidados. Entretanto, em alguns casos,
prefervel esterilizar externamente a semente para evitar o desenvolvimento de fungos e bactrias que afetem a sua viabilidade ou diminuam o seu
ndice mittico. Nesses casos, antes de colocar as sementes na placa de
Petri, elas devem ser esterilizadas em etanol 70% ou em hipoclorito de
sdio (gua sanitria) a 4%, em um recipiente sob agitao intensa por 15 a
20 segundos, e lavadas rapidamente em gua destilada ou esterilizada. Sementes com tegumentos muito duros podem precisar de algum tratamento
que facilite a absoro da gua pelo embrio. Para isso, pode-se lixar as
sementes em um ponto da superfcie ou mergulh-las cuidadosamente em
cido sulfrico concentrado para escarificar o tegumento. O tempo de
escarificao depende do material, podendo ser testado, inicialmente,
Um guia de tcnicas em citogentica vegetal, animal e humana
17
tempos bem curtos (2 a 5 minutos) at tempos mais longos (30 minutos ou

mais). Geralmente possvel observar o efeito corrosivo do tratamento
sobre o tegumento a olho nu ou na lupa.
b) Bulbos. No caso de plantas com bulbos, como a cebola, ou com
estruturas similares, deixe apenas a base do bulbo em contato com a gua
dentro de um frasco. As capas mais externas e as razes envelhecidas ou
secas do bulbo devem ser retiradas para evitar apodrecimento da gua. Se
necessrio, mude a gua freqentemente. No caso de cebola, as razes
para coleta devem ter 1 a 2 centmetros de comprimento.
c) Caule. Muitas plantas enrazam facilmente quando colocadas na
gua e produzem um excelente meristema. o caso da maioria das
monocotiledneas, como as arceas (comigo-ningum-pode, imb, etc),
comelinceas e gramneas, e de muitas dicotiledneas, como os maracujs e as espirradeiras. Nesse caso, deve-se mergulhar na gua a parte inferior do ramo ou caule, para que emita razes adventcias. Sempre que possvel, deve-se retirar as folhas submersas para evitar que apodream e afetem a qualidade da gua. Em plantas como a mandioca ou as arceas em
geral, pode-se obter melhores resultados enterrando-se o caule em um
jarro com cubos de xaxim, de coco ou bolinhas de cermica, garantindo
assim um excelente nvel de umidade e aerao - duas condies fundamentais para um bom desenvolvimento das razes.
d) Plantas cultivadas em jarro. No caso de plantas cultivadas em
jarro, pode-se inverter o jarro por inteiro apoiando a terra em volta da planta
na palma da mo e, com pancadas cuidadosas no fundo do vaso, deslocar
para fora todo o seu contedo sem desmanchar o bloco de terra. As razes
jovens, que geralmente se situam no fundo do vaso ou junto s paredes,
podem ser facilmente coletadas sem danificar o restante do raizame. No
caso de plantas pequenas, o ideal deix-las crescendo em jarros pequenos
enterrados no cho ou em um jarro bem maior. Assim, os vasos pequenos
no ressecam facilmente e as plantas so manipuladas sem dificuldades.
e) Plantas inteiras coletadas diretamente no campo. Especialmente em poca chuvosa, muitas plantas fornecem excelentes razes quando
extradas cuidadosamente do solo. Se no h razes jovens, pode-se coletar a planta, retirar todas ou a maioria das razes e deixar crescer novas em
um vaso com gua. No caso de gramneas, ciperceas e outras plantas que
formam pequenas touceiras, deve-se retirar todas as razes e mergulhar a
base da touceira na gua.
f) Outros meristemas. Na falta de razes adequadas, diversos outros meristemas podem tambm ser utilizados, como, por exemplo, a parte
mais jovem e central dos brotos foliares em crescimento, anteras e parede
de ovrio dos menores botes florais e vrios outros rgos em crescimento ativo (gavinhas, ptalas, embries, etc). Nesses meristemas, embora o
tamanho das clulas seja geralmente menor que o observado em razes, a
18
Como observar cromossomos
quantidade de clulas em diviso maior e por isso eles so especialmente recomendados. Em plantas que tm sementes muito pequenas ou razes
muito finas, como muitas cactceas, orquidceas, veloziceas, etc, esses
outros meristemas so quase sempre muito melhores que as pontas de
razes . Uma desvantagem que nesses tecidos os antimitticos
freqentemente no penetram to facilmente quanto nas razes. Isso pode
ser contornado cortando o material em fatias relativamente finas. Por outro
lado, em espcies com cromossomos muito pequenos, como bromlias,
cactos e outros, esses meristemas podem apresentar bons resultados mesmo sem o uso de antimitticos.
1.2 - Pr-tratamento com antimitticos
Sempre que o objetivo for analisar o nmero e a morfologia cromossmica ser necessrio pr-tratar o material com agentes antimitticos. Esses
agentes tm as seguintes vantagens: a) bloqueiam o ciclo mittico em
metfase, acarretando um acmulo de clulas nesse estgio; b) provocam
maior contrao cromossmica, permitindo visualizar melhor as constries
primrias e secundrias, definindo melhor a morfologia cromossmica; c)
produzem um maior espalhamento cromossmico, devido destruio ou
inibio das fibras do fuso acromtico.
Os agentes mais comumente utilizados so: colchicina 0,01 a 0,5%, 8hidroxiquinolena (8HQ) 0,002M e solues saturadas de paradiclorobenzeno (PDB) ou -bromonaftaleno. O tempo ideal de tratamento
com essas drogas pode variar de uma espcie para outra, dependendo,
principalmente, da temperatura e da concentrao utilizadas. A maioria das
espcies reage bem com um tratamento de 8HQ 4-5 horas a 18 C ou 20-24
horas a 6-8 C. Temperaturas acima de 18 C, especialmente no caso da
8HQ, devem ser evitadas porque podem causar aderncias entre cromossomos. Espcies com cromossomos grandes, acima de 6 m, freqentemente reagem melhor com colchicina que com outros antimitticos. Isso
deve-se ao fato de que a colchicina promove uma condensao cromossmica mais intensa, permitindo um melhor espalhamento e definio da
morfologia cromossmica. Na citogentica humana e animal, em geral, utiliza-se a colchicina ou um composto sinttico similar denominado Colcemid.
Em algumas espcies, como trigo, aveia e centeio, um tratamento com
choque de frio pode causar efeito idntico aos antimitticos qumicos, produzindo excelentes metfases. Nesse caso, as razes so colocadas em um
pequeno recipiente com gua, o qual colocado em uma caixa de isopor
contendo gua e cubos de gelo. O conjunto mantido na geladeira por 6 a
24 horas. A temperatura da gua deve ficar em torno de 0-2 C. A maioria
dos autores que trabalham atualmente com essas gramneas prefere esse
tipo de pr-tratamento.
Todos os meristemas destacados da planta e mantidos em ambiente
mido, continuam seus ciclos nucleares normalmente durante horas ou
mesmo dias, dependendo do rgo de onde provm. Para permitir uma
melhor absoro do antimittico, prefervel pr-tratar pontas de razes, ou
outros meristemas, de tamanho relativamente pequeno.
19
O pr-tratamento do meristema deve ser realizado preferencialmente

de manh, por volta das 10:00 h. Nesse horrio, a maioria das espcies
apresenta uma proporo mais alta de clulas em prfase, resultando em
um maior acmulo de metfases bloqueadas ao final do tratamento. Certifique-se de que todo o material em contato com o antimittico e com as
razes (pina, frasco para pr-tratamento, etc) est rigorosamente limpo. Por
outro lado, a fixao das clulas poder ser feita a qualquer hora do dia,
dependendo do pr-tratamento utilizado.
1.3 - Fixao das clulas
A fixao uma etapa extremamente crtica para a obteno de bons
resultados, especialmente na anlise meitica e em tcnicas de
bandeamento cromossmico. O fixador mais utilizado o de Carnoy 3:1
(trs partes de lcool etlico P.A. para uma de cido actico glacial). Pode-se
tambm utilizar o lcool metlico em substituio ao etlico, embora o
metlico seja desaconselhado por ser mais txico. A soluo fixadora deve
ser preparada imediatamente antes de ser utilizada. Antes de colocar as
razes no fixador, agite bem a mistura fixadora. Essas substncias no se
misturam to facilmente quanto se pode imaginar. Aps mergulhar o material no fixador, especialmente no caso de botes florais, agite novamente
o frasco (se possvel, agite algumas vezes durante o tempo de fixao). O
volume do fixador deve ser, de preferncia, 10 vezes maior que o volume
do material a ser fixado. A fixao sempre feita temperatura ambiente,
salvo indicao em contrrio na tcnica.
Razes muito grossas, botes florais e brotos foliares devem sempre
ser seccionados com uma lmina (nova, de preferncia) antes de serem
fixados. Observe que a fixao no ocorre facilmente atravs de paredes
grossas ou em tecidos duros.
Geralmente deixa-se o material no fixador de um dia para o outro. Contudo, aps as primeiras 2 horas o material j est fixado e j pode ser
estocado. Um tempo de fixao maior que 24 horas pode prejudicar o material. No caso de materiais mais sensveis, prefervel fazer uma fixao
inicial por 10 a 15 minutos e, em seguida, substituir o fixador por um novo
por mais 1 a 2 horas.
1.4 - Estocagem do material
O material fixado pode ser imediatamente utilizado para colorao ou
estocado para ser usado dias ou anos aps. A estocagem pode ser feita
simplesmente guardando o material fixado no freezer, no prprio fixador,
ou, ento, transferindo o material para etanol 70% e guardando na geladeira. Em qualquer caso, certifique-se de que os frascos estejam hermeticamente fechados. Use de preferncia frascos com batoque de presso e
tampa de rosca.
Todas as fixaes devem estar devidamente etiquetadas. As etiquetas devem ser feitas no prprio laboratrio, em papel branco e de tamanho adequado para fcil visualizao atravs do vidro. As anotaes na
20
etiqueta so sempre feitas a lpis. A etiqueta sempre mantida dentro

do frasco de fixao, junto com o material, com a face anotada para fora.
Nunca anote nos dois lados da etiqueta. Na etiqueta deve constar sempre
um nmero ou cdigo de referncia do material, a data da fixao e,
eventualmente, alguma outra anotao que ajude a reconhecer o material
(por exemplo, o tempo de fixao, quando este for intencional ou acidentalmente diferente do normal).
Cada pesquisador deve ter suas fixaes reunidas em caixas plsticas
prprias, para facilitar a localizao no freezer. Nos projetos que demandam grande quantidade de fixaes importante utilizar tambm uma pequena etiqueta autocolante no lado de fora do frasco para permitir uma
identificao mais fcil das fixaes.
21
2 - Como analisar cromossomos mitticos

A observao de cromossomos mitticos, tanto para anlise do ciclo
mittico quanto para estudo do caritipo, geralmente feita pelas tcnicas
de colorao convencional. Essas tcnicas coram os cromossomos por igual,
isto , indistintamente, sem nenhuma preferncia por determinado tipo de
cromatina, composio do DNA ou de protenas. So chamadas de convencionais para serem distinguidas das tcnicas de colorao diferencial, desenvolvidas a partir do final dos anos 60. Nessas ltimas, so includas as tcnicas de bandeamento cromossmico que coram principalmente, ou exclusivamente, um determinado tipo de cromatina (captulo seguinte).
As tcnicas convencionais so as mais utilizadas na citogentica vegetal e tm a vantagem de permitir uma colorao rpida e bem definida dos
cromossomos. Alm disso, a repetibilidade dos resultados obtidos com
essas tcnicas praticamente de 100%. Por outro lado, as tcnicas de colorao diferencial, por envolverem um nmero maior de etapas experimentais, so mais laboriosas e a repetibilidade dos resultados sempre inferior, ou seja, nem sempre a execuo da tcnica produz os resultados esperados. Essas desvantagens so compensadas pelo fato de permitirem observar detalhes que no seriam visveis com a colorao convencional.
Os resultados obtidos com qualquer dessas tcnicas podem ser apresentados na forma de cariograma ou idiograma, os quais permitem uma
melhor organizao e visualizao das principais caractersticas cariotpicas.
Ao final do captulo, so apresentados os procedimentos para construo
de cariogramas e idiogramas. Atualmente, existem no comrcio diversos
programas para anlise de imagem que ajudam bastante, ou automatizam
completamente, a construo de cariogramas e idiogramas. Contudo, os
programas especficos para essa finalidade so muito caros e s valem a
pena ser adquiridos se houver uma rotina intensa de trabalho com essas
tcnicas.
2.1 A escolha da tcnica e do corante adequados
Existem muitas maneiras de preparar e corar lminas para anlise cromossmica em plantas. Neste trabalho sero enfatizadas as tcnicas mais
utilizadas em nosso laboratrio, embora diversas outras possam ser igualmente eficientes.
A escolha da tcnica mais adequada pode depender dos objetivos
desejados e dos recursos disponveis no laboratrio. As tcnicas mais simples, que utilizam drogas mais baratas e dispensam nitrognio lquido (ou
gelo-seco), so mais recomendadas para aula prtica. Nesses casos, as clulas devem ser primeiramente coradas e depois esmagadas entre lmina
e lamnula, podendo ser analisadas logo em seguida. Essas tcnicas de
colorao seguida de esmagamento utilizam geralmente os chamados
corantes acticos (carmim actico, orcena actica ou hematoxilina actica)
ou o reativo de Schiff. Uma outra opo primeiramente esmagar as clulas numa lmina em cido actico a 45%, retirar a lamnula por congela-
23
mento em nitrognio lquido e depois cor-las (tcnicas de esmagamento

seguido de colorao). A grande vantagem desse ltimo procedimento
que, ao retirar a lamnula por congelamento, as clulas permanecem presas lmina e podem ser submetidas aos mais diversos tratamentos antes
de serem coradas. Uma outra vantagem que o material aderido lmina,
sem a proteo da lamnula, seca e se achata, permitindo a observao de
todos os cromossomos de uma metfase em um nico plano focal o que
fundamental para a documentao fotogrfica. Alm disso, as lminas
feitas com essas tcnicas so normalmente montadas de forma permanente, enquanto nas tcnicas de colorao seguida de esmagamento a montagem permanente exige um procedimento parte.
A escolha do corante tambm depender do objetivo e do material
que est sendo analisado. Alguns corantes permitem visualizar simultaneamente os cromossomos e os nuclelos, enquanto outros coram apenas os
cromossomos, porm com maior nitidez e contraste. Quando os cromossomos so grandes, a colorao com hematoxilina, orcena ou Feulgen pode
ser mais adequada, por ser mais simples e permitir uma observao rpida
e direta dos cromossomos. Quando os cromossomos so muito pequenos,
deve ser utilizado o corante de Giemsa ou a hematoxilina, que garantem
uma colorao mais intensa e melhor contrastada. Em algumas espcies o
citoplasma pode reagir um pouco com o corante, diminuindo o contraste da
preparao. O mesmo pode ocorrer devido qualidade da fixao fixaes antigas ou feitas em excurses, freqentemente coram tambm o citoplasma. Nesses casos, importante tentar diferentes corantes, at se conseguir um que produza um melhor contraste.
A tcnica de colorao Feulgen, descrita inicialmente por Feulgen e
Rossenbeck, em 1924, utiliza uma soluo corante chamada reativo de
Schiff. uma tcnica clssica que oferece bons resultados e dispensa a
retirada da lamnula. A intensidade da colorao, nesse caso, depende muito
das condies de fixao e hidrlise. Quando essas condies so bem
controladas, a intensidade de colorao dos ncleos diretamente proporcional quantidade de DNA que eles apresentam. Por isso, essa colorao
utilizada para medir a quantidade de DNA nuclear (veja mais detalhes
sobre essa colorao em Mello e Vidal, 1978). Alm do reativo de Schiff,
alguns fluorocromos coram tambm de forma estequiomtrica (isto , proporcional quantidade de DNA presente no ncleo) e podem ser utilizados
para determinar a quantidade de DNA.
A seguir so descritas algumas das tcnicas de colorao cromossmica mais comumente utilizadas na citogentica vegetal. Cada uma delas apresenta inmeras variaes de procedimentos descritas na literatura especializada. Essas variantes, geralmente, refletem apenas a experincia prtica
de diferentes autores e muito raramente constituem melhorias objetivas
na tcnica. Nas tcnicas onde necessrio um pr-tratamento, feita a
recomendao de um procedimento geral com 8-hidroxiquinolena, como
utilizado em nosso laboratrio, embora outros tipos de pr-tratamento possam ser utilizados (item 1.2). A orcena actica, o carmim actico e o reativo
de Schiff so classicamente os corantes mais utilizados para vegetais. Por
outro lado, o corante de Giemsa (uma mistura de corantes estabelecida por
24
Gustav Giemsa) o mais utilizado na citogentica humana e animal (principalmente para vertebrados). Posteriormente, o uso desse corante foi aplicado tambm a vegetais e, em nossa experincia com a citogentica de plantas, a colorao com Giemsa, ou com hematoxilina, produz os melhores
resultados, tanto para mitose quanto para meiose (veja mais detalhes sobre essas tcnicas em Guerra, 1983, 1999).
O material ideal para treinar qualquer das tcnicas descritas abaixo,
relacionadas anlise de cromossomos mitticos, a cebola. Isso por numerosas razes: um material universal, disponvel durante todo o ano,
enraza facilmente, as razes so macias e com meristema abundante, apresenta clulas e cromossomos grandes, alm de ter cromossomos pouco
numerosos e extensamente estudados na literatura.
2.2 - Tcnicas de esmagamento seguido de colorao
Essas tcnicas so recomendadas para anlise convencional de
caritipos de plantas em geral. A tcnica de Feulgen (item 2.3.4), tambm
recomendada para a anlise de caritipos. Contudo, se os cromossomos
forem muito pequenos prefervel utilizar as tcnicas abaixo, que coram
os cromossomos mais fortemente.
2.2.1 - Colorao com Giemsa
a) Pr-tratamento. Colete pontas de razes em crescimento ativo e

mergulhe-as em um recipiente aberto contendo uma pequena quantidade
de 8HQ por 20-24 horas na geladeira a cerca de 10 C.
b) Fixao. Mergulhe as razes em Carnoy 3:1 por 2 a 20 horas
temperatura ambiente.
c) Estocagem. Caso no queira trabalhar com o material imediatamente, estoque as razes no prprio fixador no freezer ou em etanol na
geladeira (veja item 1.4).
d) Lavagem. Lave as razes, mergulhando-as duas vezes em gua
destilada (5 minutos cada).
e) Hidrlise. Enxugue as razes rapidamente em papel de filtro e
mergulhe-as em HCl 5N temperatura ambiente por 20 minutos. No caso
de espcies com razes muito duras, como as de gramneas, prefervel
primeiro digerir a parede celular com celulase-pectinase antes de fazer a
hidrlise (veja como faz a digesto da parede no item 4.1.c). Nesse caso,
faa uma digesto menos intensa (metade do tempo indicado para a digesto normal) para facilitar o manuseio posterior das razes.
f) Preparao da lmina. Transfira uma ponta de raiz para a lmina. Enxugue cuidadosamente a raiz com papel filtro e acrescente uma gota
de cido actico a 45%. Com o auxlio de um estereomicroscpio, retire a
25
coifa e as capas mais externas da raiz procurando deixar apenas o meristema.

Corte ou fragmente o meristema em pedaos to pequenos quanto possvel. Cubra com uma lamnula e bata cuidadosamente, com uma agulha de
ponta rombuda, diretamente em cima dos fragmentos do meristema at
que cada um deles se transforme numa pequena mancha de clulas espalhadas. Verifique no microscpio comum, com o diafragma do condensador
parcialmente fechado ou com o condensador do microscpio deslocado
para baixo, se as clulas esto bem espalhadas. Se o espalhamento no
estiver bom, bata novamente com cuidado, at obter um espalhamento
satisfatrio. Nesse ponto, esmague o material colocando o conjunto lminalamnula em um papel filtro dobrado, pressionando firme e cuidadosamente para no permitir nenhum deslize da lamnula sobre a lmina.
Ateno:
Para esmagar o material, utilize de preferncia 3 folhinhas de papel
filtro cortadas em tamanho 35 x 90 mm e dobradas ao meio. A lmina
e a lamnula devem ser ajustadas no canto das folhinhas e ento
pressionadas firmemente. Isso evita que a lamnula deslize sobre a
lmina e enrole as clulas.
Observe que as batidas tm apenas a funo de espalhar as clulas,
enquanto o esmagamento propriamente tem a funo de espalhar
melhor os cromossomos.
importante que cada lmina contenha uma quantidade no muito
grande de tecido, permitindo um bom espalhamento das clulas. A
preparao deve conter o mximo de tecido meristemtico e o mnimo
de outros tecidos, de forma a aumentar a concentrao de clulas em
diviso na lmina.
Se surgirem bolhas de ar na preparao, acrescente uma gota de cido
actico a 45% ao lado da lamnula e retire o excesso com papel filtro.
g) Retirada da lamnula. Congele o conjunto lmina-lamnula no
nitrognio lquido ou gelo-seco por alguns minutos e com o auxlio de
uma gilete ou de um bisturi retire rapidamente a lamnula. Deixe a lmina
secar ao ar.
Ateno:
A reteno das clulas exclusivamente na lmina se deve ao fato de
que elas aderem superfcie mais gelada. Como a lmina mais
espessa, conserva mais o frio que a lamnula e por isso retm as clulas.
Se a retirada da lamnula no for rpida, a temperatura se eleva
rapidamente nas duas superfcies e as clulas podem ser retidas em
parte na lamnula e em parte na lmina, causando geralmente
deformaes tanto nas clulas quanto nos cromossomos.
Caso no disponha de nitrognio lquido, gelo-seco ou CO 2
comprimido, coloque a lmina em uma superfcie gelada dentro do
freezer, por pelo menos 20 minutos, e rapidamente abra o freezer e
retire a lamnula. Nesse caso, pode-se perder uma certa proporo de
clulas, mas o que fica suficiente para trabalhar.
26
h) Colorao com Giemsa. Coloque as lminas em uma cubeta e

acrescente a soluo de Giemsa a 2%. Controle cuidadosamente a intensidade da colorao (veja item seguinte). Para retirar as lminas da soluo,
acrescente lentamente gua de torneira at que os cristais sobrenadantes
transbordem. Em seguida, retire o restante da soluo corante e lave rapidamente as lminas com gua destilada ou tampo fosfato.
i) Montagem da lmina. Seque as lminas com uma bomba de ar,
acrescente uma gota de meio de montagem e cubra com uma lamnula limpa.
A Figura 1 ilustra a colorao com Giemsa em clulas pr-tratadas de
diferentes organismos. Em 1a observa-se um par de cromossomos
satelitados, em uma metfase de Costus pulverulentus (zingibercea), onde
apenas um deles mostra a constrio secundria distendida e corada.
Figura 1
Cromossomos mitticos corados com Giemsa. a, Metfase de Costus pulverulentus (2n=18).
b, Metfase de Eleutherine bulbosa (2n=12). Setas em a e b apontam constries secundrias. Asteriscos
em b mostram a regio onde deve existir uma constrio secundria distendida e no-corada. c, Prometfase
de Sesbania tetraptera. Os nmeros indicam os pares cromossmicos com o mesmo padro de condensao
profsica. d, Metfase de um brifito, Notothylas vitalii (2n=10). Tringulos vazios apontam
microcromossomos. Fotos: a, Guerra, 1988a; b, Guerra, 1988b; c, Forni-Martins e Guerra, 1999; d, original.
27
Em 1b , as constries secundrias em uma metfase de Eleutherine bulbosa (iridcea) aparecem distendidas e completamente nocoradas, parecendo tratar-se de dois cromossomos extras. Satlites
com a constrio secundria no-corada, como em 1b , tm freqentemente levado a erro na contagem dos cromossomos. Observe nessa
figura, a ocorrncia de uma inverso pericntrica no par maior, resultando em um cromossomo acrocntrico e um outro metacntrico. Como
a inverso envolveu parte do satlite, os satlites tm tambm tamanhos diferentes.
A Figura 1c mostra uma prometfase de Sesbania tetraptera
(leguminosa) com alguns braos cromossmicos parcialmente descondensados, gerando um padro de condensao cromossmica caracterstico
para cada par cromossmico.
Em 1d observa-se o complemento cromossmico diplide de uma
espcie de brifito do grupo dos antceros, destacando-se a presena de
microcromossomos (o par menor nesta metfase), comuns em brifitos.
2.2.2 - Controle da colorao Giemsa
A colorao Giemsa utilizada tanto na anlise cromossmica convencional quanto em outras tcnicas, principalmente o bandeamento C e N.
Entretanto, vrios fatores interferem na reao de colorao, entre eles as
condies de fixao, a natureza do material e a qualidade do corante (diferentes remessas de um mesmo fabricante podem apresentar reaes significativamente diferentes). Por essa razo, importante controlar cuidadosamente a intensidade de colorao.
O tempo de colorao varia de acordo com o tamanho dos cromossomos e com a concentrao e qualidade do corante. Espcies com cromossomos muito pequenos, como a maioria dos brifitos, podem precisar de
20 minutos ou mais, enquanto outras com cromossomos grandes, como
cebola ou trigo, coram bem com 5 minutos ou menos. Quando no se conhece o tempo exato de colorao do material com um determinado estoque de corante, deve-se verificar a intensidade de colorao a partir dos
primeiros um ou dois minutos. Para isso, retire a lmina do corante, enxugue rapidamente o verso da lmina e confira no microscpio com a objetiva
de 10x. Se a colorao no for suficiente, devolva a lmina para o corante,
agitando-a um pouco ao mergulh-la na soluo, de forma a evitar os cristais sobrenadantes.
Caso o tempo de colorao tenha sido excessivo, possvel retirar o
excesso de corante dos cromossomos e do citoplasma, at obter um melhor contraste. Para isso, deve-se:
a) Localizar no microscpio uma clula que esteja excessivamente
corada para tomar como controle.
b) Mergulhar a lmina em um borel contendo gua destilada ligeiramente acidificada (2 a 3 gotas de cido actico a 45% em 80 ml de gua) e
mov-la firmemente na horizontal umas 6 ou 8 vezes.
28
c) Retirar a lmina do borel, lavar rapidamente com um jato de gua

destilada, enxugar o verso da lmina e verificar ao microscpio o efeito na
intensidade de colorao. Caso no tenha sido suficiente, repita a operao at obter um contraste ideal. Ao final, lave a lmina em gua destilada,
seque e monte como no procedimento normal.
Lminas recm-montadas que ficaram mal coradas podem tambm ser
recoradas seguindo-se as etapas abaixo:
i)
Se o meio de montagem no endureceu ainda, pode-se destacar a
lamnula, com a ajuda de uma gilete, e mergulhar a lmina em um
borel com xilol (na capela) at que o meio de montagem seja
completamente dissolvido. Esse processo, que dura uma hora ou mais,
pode ser acelerado agitando-se a lmina no borel. Se o meio de
montagem estiver endurecido, mergulhe o conjunto lmina e lamnula
em xilol e aguarde que o meio se dissolva e a lamnula caia. Em seguida,
passe ligeiramente a lmina em um segundo borel com xilol, para
permitir uma completa retirada do meio de montagem, e seque-a com
uma bomba de ar.
ii) Com a lmina apoiada horizontalmente, coloque algumas gotas
de cido actico 45% sobre as clulas por 10-15 minutos, ou mais, at
obter uma completa descolorao. Em seguida, retire o cido actico
com um jato de gua destilada, lavando bem a lmina.
iii) Seque bem a lmina e recore com uma soluo mais concentrada
de Giemsa (3-4%), controlando cuidadosamente o tempo de colorao.
2.2.3 - Colorao com hematoxilina a 1%
a) Preparao da lmina. Todo o procedimento de preparao da
lmina nessa tcnica idntico ao anterior (itens 2.2.1.a a g), diferindo
apenas a partir da colorao.
b) Colorao com hematoxilina. Coloque uma gota de hematoxilina
a 1% em cima da mancha de clulas espalhadas na lmina e cubra com
uma lamnula. A colorao instantnea e a lmina pode ser examinada
imediatamente.
c) Montagem de lmina permanente. Para tornar a lmina permanente, retire a lamnula com um jato de gua destilada, seque-a completamente, acrescente uma gota de meio de montagem e cubra-a com uma
lamnula limpa.
Ateno:
A colorao com hematoxilina pode facilmente ser descorada e
recorada com Giemsa ou vice-versa. A hematoxilina prontamente
descorada retirando-se a lamnula e acrescentando-se algumas gotas
de HCl 5N em cima da regio corada. Em seguida, a lmina deve ser
29
lavada com um jato de gua destilada, seca e corada normalmente

com Giemsa. No caso inverso, para descorar o Giemsa, usa-se o cido
actico a 45% (item 2.2.2.ii). Depois de seca, a lmina deve ser corada
normalmente com hematoxilina, como no item b.
A Figura 2a mostra uma metfase e ncleos interfsicos de uma espcie de orqudea corados com a tcnica acima. Observe que o citoplasma
c
Figura 2
Colorao com hematoxilina (a, b) e com orcena (c). a, Metfase e ncleos interfsicos
de Pelexia cf viridis (2n=46). b, c, Clulas sem pr-tratamento de cebola (b) e Nothoscordum
pulchellum (c), mostrando diversas fases da mitose. P, prfase; M, metfase; A, anfase, Ti, telfase
inicial; Tf, telfase final. Fotos: a, Leonardo Felix; b, Guerra, 1999; c, original.
30
das clulas no visvel, enquanto os cromossomos so fortemente corados. A presena de um par cromossmico acrocntrico bem maior que os
demais caracteriza esse caritipo como bimodal.
2.3 - Tcnicas de colorao seguida de esmagamento
Essas tcnicas so mais recomendadas quando no se dispe de nitrognio lquido, gelo-seco ou similar. So recomendadas, principalmente,
para observar o ciclo mittico e meitico em aulas prticas, por serem mais
simples e rpidas. Contudo, tanto os ciclos nucleares quanto os cromossomos pr-tratados podem ser observados com qualquer das tcnicas descritas a seguir.
2.3.1 - Colorao com hematoxilina actica a 1%
a) Obteno de razes. Para anlise do ciclo mittico, coloque
um bulbo de cebola em um recipiente com gua de torneira, de maneira que o bulbo fique suspenso na borda do recipiente e apenas sua
base entre em contato com a gua. Antes disso, retire com uma gilete
as razes secas, cortando inclusive parte do eixo da base da cebola
(veja item 1.1b).
b) Fixao. Quando as razes estiverem com um ou dois centmetros de comprimento, retire-as com uma pina e coloque-as em um
frasquinho de vidro com fixador de Carnoy 3:1 por 2 a no mximo 20 horas
temperatura ambiente. Se necessrio, estoque as razes no fixador ou em
etanol (item 1.4).
c) Lavagem. Retire as razes do fixador e mergulhe-as duas vezes
em um recipiente com gua destilada (5 minutos cada).
d) Hidrlise. Enxugue as razes rapidamente em papel de filtro e
mergulhe-as em HCl 5N temperatura ambiente por 20 minutos.
e) Lavagem. Lave as razes novamente, como no item c, sendo dessa vez trs lavagens de 5 minutos cada, para retirar completamente o HCl.
f) Colorao. Enxugue ligeiramente as razes em um papel filtro e as
transfira para um recipiente pequeno e com tampa, como um tubo de Eppendorf
ou, de preferncia, uma caixinha de guardar lentes de contato com tampa de
rosca. Logo em seguida, acrescente duas ou trs gotas de hematoxilina a 1% e
mantenha o recipiente fechado por 30 minutos temperatura ambiente.
g) Preparao da lmina. Transfira uma raiz para a lmina e acrescente uma gota de cido actico a 45%. Retire a coifa e as capas mais externas da raiz, procurando deixar apenas o meristema. Corte o tecido restante
em pedaos to pequenos quanto possvel. Cubra com uma lamnula e bata
cuidadosamente com uma agulha de ponta rombuda diretamente sobre os
31
fragmentos de meristema. Verifique ao microscpio se as clulas esto

realmente bem espalhadas. Se o espalhamento estiver bom, esmague o
material colocando o conjunto lmina-lamnula em um papel filtro dobrado,
pressionando com cuidado para no permitir que a lamnula deslize.
h) Controle da lmina. Verifique no microscpio a qualidade final
da lmina. Lute as melhores lminas passando esmalte de unha na borda
da lamnula e as analise em seguida. A colorao pode se manter em bom
estado por um ou dois dias, se estiver bem lutada.
Ateno:
H vrios aspectos muito importantes na hidrlise e na preparao
da lmina que so comuns a outras tcnicas e se encontram descritos
com mais detalhes nos itens 2.2.1.e e f.. Confira esses itens.
A Figura 2b mostra clulas de cebola, sem pr-tratamento, coradas
com a tcnica acima. Observe que os ncleos e os cromossomos esto
fortemente corados enquanto o citoplasma quase imperceptvel.
2.3.2 - Colorao com orcena actica a 2%
a) Obteno e fixao das razes. Proceda como nos itens a e b
da tcnica anterior para obter e fixar razes.
b) Colorao. Retire as razes do fixador, enxugue-as ligeiramente
em papel de filtro e coloque-as em um tubo de ensaio com orcena actica
a 2%. Acrescente uma gota de HCl 1N para cada nove de orcena (ou cerca
de 10% do volume de corante) e agite. Aquea o tubo (aberto) na chama de
uma lamparina a lcool at que o corante comece a borbulhar. Retire o tubo
rapidamente da chama e deixe o material esfriar no corante por 20-30 minutos, mantendo o tubo fechado.
Ateno:
Observe que nessa tcnica no h necessidade de lavar as razes
antes de corar.
Use apenas uma quantidade de orcena suficiente para cobrir todas
as razes.
Quando aquecido na chama, o corante pode ferver bruscamente e
expulsar violentamente todo o contedo do tubo. Por essa razo, durante
o aquecimento, deve-se manter a boca do tubo voltada para a parede,
de preferncia azulejada.
c) Preparao da lmina. Coloque uma raiz numa lmina limpa,
seccione a poro apical da raiz e elimine o restante do material. Tente
deixar apenas o meristema da raiz, eliminando as capas de tecidos mais
externos. Com a ajuda de agulhas, fragmente o meristema em pedaos
menores, tendo cuidado para o tecido no ressecar na lmina enquanto o
manuseia. Acrescente uma gota de corante no aquecido e cubra com uma
32
lamnula limpa. Bata levemente com uma agulha de ponta rombuda por
cima da lamnula, diretamente sobre o material, at espalhar bem as clulas de cada fragmento. Controle ao microscpio o espalhamento das clulas. Pressione a lamnula contra a lmina, dentro de uma folha dobrada de
papel filtro (veja mais detalhes no item 2.2.1.f). Observe ao microscpio e
lute com esmalte de unha, se necessrio.
A Figura 2c ilustra essa colorao em clulas de Nothoscordum
pulchellum (alicea), sem pr-tratamento. Observe que o citoplasma, embora fracamente corado, mais visvel que nas tcnicas anteriores. A foto
ilustra tambm as vrias etapas do ciclo mittico.
2.3.3 - Preparao de lminas permanentes com corantes acticos
a) Congele a lmina-lamnula no gelo-seco ou nitrognio lquido por
alguns minutos e, com o auxlio de uma gilete ou um bisturi, retire rapidamente a lamnula.
b) Transfira a lmina para um borel com etanol absoluto por cerca de
1 minuto.
c) Transfira para outro borel com etanol absoluto, pelo mesmo
tempo.
d) Mergulhe a lmina rapidamente em um borel com xilol puro. Observe que todo trabalho com xilol deve ser feito em uma capela.
e) Com a lmina ainda molhada de xilol coloque uma gota de Entellan,
ou outro meio de montagem, e cubra com uma lamnula limpa. Mantenha a
lmina deitada at o meio secar (cerca de 24 h).
Ateno:
No caso de preparaes para meiose, a retirada da lamnula em
nitrognio lquido freqentemente provoca rachaduras nas clulas e
por essa razo prefervel analisar e fotografar as clulas antes.
Caso no disponha de nitrognio lquido ou gelo seco, mergulhe a
lmina corada num borel com cido actico 20% at a lamnula cair. Se
tiver ficado muito material na lamnula, faa com a lamnula uma
segunda lmina permanente.
Em geral, as preparaes com corantes acticos (carmim,
hematoxilina, orcena) apresentam melhor contraste antes de serem
tornadas permanentes. A colorao da lmina fresca pode se manter
estvel por poucos dias. Se as lamnulas forem bem lutadas e mantidas
na geladeira, podem ser conservadas por uma semana ou mais, embora
o contraste seja inferior ao dos primeiros dias.
2.3.4 - Colorao Feulgen
a) Pr-tratamento. Colete e pr-trate as razes como no item 2.2.1.a.
33
b) Fixao. Transfira as razes para o fixador de Carnoy 3:1 por 2 a

20 horas temperatura ambiente.
c) Lavagem. Lave as razes, mergulhando-as duas vezes em gua
d) Hidrlise. Enxugue as razes rapidamente em papel de filtro e
mergulhe-as em HCl 5N temperatura ambiente por 20 minutos. No caso
de espcies com razes muito duras, como as de gramneas, prefervel
fazer primeiro uma digesto enzimtica (veja item 4.1) e em seguida a
hidrlise.
e) Colorao. Mergulhe as pontas de razes no reativo de Schiff em
um vidro tampado e protegido da luz por 1 a 2 horas (at ficarem bem
coradas). Aps a colorao, transfira as razes para um vidro com gua
sulfurada por 10 minutos e repita essa operao mais duas vezes. Ao final,
transfira as razes para a gua destilada enquanto prepara as lminas.
Ateno:
Observe que a ponta da raiz fica mais corada que o lado cortado.
Isso se deve ao menor volume do citoplasma das clulas do
meristema, aumentando, assim, a densidade de ncleos corados
nessa regio.
f) Preparao da lmina. Transfira uma ponta de raiz para a lmina. Retire o excesso de gua com papel filtro e acrescente uma gota de
cido actico a 45%. Com o auxlio de agulhas e de um estereomicroscpio,
retire a coifa e as capas mais externas da raiz, procurando deixar apenas
o meristema. Corte o tecido em pedaos to pequenos quanto possvel.
Cubra com uma lamnula e bata cuidadosamente, com uma agulha de ponta rombuda, diretamente em cima dos fragmentos do meristema at que
cada um deles se transforme numa pequena mancha de clulas espalhadas. Em seguida, esmague o material colocando o conjunto lmina-lamnula
em um papel filtro dobrado, pressionando firme e cuidadosamente para
no permitir nenhum deslize da lamnula sobre a lmina. A lmina pode
ser analisada imediatamente ou lutada e conservada na geladeira por um
ou dois dias.
Ateno:
Durante a preparao, a gota de cido actico 45% colocada no incio
dessa etapa, utilizada para facilitar o espalhamento das clulas, pode
ser substituda por uma gota de carmim ou orcena actica. Esse
procedimento amplamente empregado (exceto quando o objetivo
medir a quantidade de DNA) por intensificar a colorao cromossmica,
corando apenas levemente o citoplasma. Em clulas com cromossomos
grandes, como na Figura 3a, esse reforo na colorao dispensvel.
g) Montagem de lmina permanente. Congele a lmina-lamnula
34
c
Figura 3
Representao do caritipo atravs de cariograma (a, b) e idiograma (c). a, b Metfase e
cariograma de Alstroemeria sp. c, Idiograma de Emilia fosbergii, com a localizao das bandas C. Fotos em
a e b foram digitalizadas e o cariograma montado pelo programa Qwin da Leica. Fotos: a, b, Leonardo Felix
e Natoniel Melo; c, Guerra e Nogueira, 1990.
no nitrognio lquido ou gelo-seco por alguns minutos e com o auxlio de

uma gilete ou de um bisturi, retire rapidamente a lamnula e deixe a lmina secar ao ar. Em seguida, acrescente uma gota de meio de montagem e
cubra com uma lamnula. Veja mais detalhes sobre a preparao e montagem da lmina nos itens 2.2.1.f e g.
35
Ateno:
Para medio da quantidade de DNA, o procedimento para colorao Feulgen exige alguns cuidados a mais, principalmente na fixao, que pode ser realizada em Carnoy 3:1 ou formaldedo, dependendo do material (veja detalhes em Greilhuber, 1988; Greilhubert
e Ebert, 1994).
2.4 Representao do caritipo na forma de cariograma ou
idiograma
2.4.1 Construo de um cariograma
a) Selecione a melhor foto do material, considerando os seguintes
parmetros: 1) clula completa, bem focada e contrastada; 2) cromossomos sem superposio ou com o menor nmero possvel delas; 3)
constries primrias (centrmeros) e secundrias visveis; 4) cromossomos sem distores mecnicas causadas pelo esmagamento.
b) Se a clula tiver uma diferenciao na morfologia e tamanho
cromossmicos bastante evidente e no apresentar superposio de cromossomos, basta uma cpia fotogrfica para recortar e montar o cariograma.
c) Pelo contrrio, se a clula contiver cromossomos bem espalhados
e diferenciados mas com superposies, sero necessrias ao menos duas
cpias fotogrficas, de maneira a permitir recortar cada um dos cromossomos superpostos de uma cpia diferente.
d) Para clulas que apresentem muitos cromossomos, prefervel
ter ao menos duas cpias. Uma delas servir para identificar e anotar
(em cima da prpria foto, com tinta removvel) os provveis pares cromossmicos, comeando pelos mais evidentes. A segunda cpia ser
utilizada para recortar os cromossomos e montar o cariograma. A tentativa de identificar os pares cromossmicos na clula, antes de comear a
recort-los, ajuda na identificao correta dos pares por permitir uma
melhor comparao de cada cromossomo com todos os demais do complemento. Ainda assim, alguns pares precisaro ser reordenados na
montagem do cariograma.
e) Para a montagem do cariograma os cromossomos podero ser organizados de diferentes maneiras. Mais freqentemente, os pares so alinhados pelos centrmeros, dispondo-se os braos curtos para cima e numerando-se os pares cromossmicos por ordem decrescente do maior para
o menor brao curto. Dessa maneira, a silhueta superior do cariograma apresenta-se como uma escada decrescente, facilitando a visualizao da variao na morfologia cromossmica.
f) importante apresentar uma escala (barra com equivalncia em
micrmetros) para que se possa estimar o tamanho real dos cromossomos.
36
Uma cpia da metfase inteira pode tambm ser apresentada junto com o
cariograma, comprovando que os cromossomos pertencem a uma nica
clula (Figuras 3a, e b).
2.4.2 Construo de um idiograma
a) Selecione e fotografe cinco a dez metfases completas, sem
distores mecnicas, e que permitam visualizar bem os centrmeros e as
extremidades dos cromossomos.
b) Coloque o filme negativo de cada uma das metfases em uma
ampliadora fotogrfica (ou um projetor de eslaides), projete a imagem em
uma folha de papel branco e desenhe os contornos de cada cromossomo.
Desenhe todas as clulas na mesma ampliao.
c) Retire o negativo da metfase e coloque o negativo de uma escala
micromtrica fotografada na mesma ampliao que os cromossomos. Desenhe no mesmo papel, uma linha reta entre dois intervalos consecutivos da
escala. A escala deve indicar a quantos micrmetros corresponde um milmetro na figura ampliada, sendo vlida para todos os desenhos.
d) Aps desenhar todas as clulas na mesma ampliao, mea o comprimento de cada brao cromossmico e dos satlites, utilizando uma rgua milimetrada comum. Numere todos os cromossomos arbitrariamente,
de maneira a lhe permitir identificar cada um deles.
e) Em uma outra folha de papel , construa uma tabela com quatro
colunas, como exemplificado a seguir. A primeira, apresenta os nmeros
de 1 ao equivalente ao nmero 2n daquela espcie. A segunda, apresenta
os tamanhos do brao curto, brao longo e comprimento total para cada um
dos cromossomos. Nessa coluna, o cromossomo que aparece na nona linha, por exemplo, correspondente na coluna anterior ao nmero 9 e contm os dados do cromossomo anotado no seu desenho como 9, embora
no necessariamente seja o nono maior cromossomo. A terceira coluna
apresenta os mesmos valores da segunda, porm ordenados em pares pela
similaridade de tamanho e morfologia cromossmica. Nessa coluna, o maior cromossomo ser colocado na linha 1, o segundo maior na linha 2, etc.
direita desses valores, coloque, entre parnteses, o nmero que cada
cromossomo apresentava na coluna anterior, de maneira a permitir o reconhecimento daquele cromossomo no desenho a qualquer momento. A quarta coluna apresenta os tamanhos mdios desses pares para o brao curto,
o brao longo e o comprimento total.
f) Cromossomos com satlites tm o tamanho do satlite medido e
apresentado separadamente, como um terceiro segmento cromossmico.
Contudo, na determinao do tamanho do brao cromossmico ao qual o
satlite se encontra ligado, o tamanho do satlite acrescido ao do restante do brao. Na representao esquemtica final do idiograma, o satlite
37
deve aparecer separado do restante do brao cromossmico por uma

constrio ou um pequeno intervalo.
Nmero do
cromossomo
no desenho
Brao curto
+ brao longo
= total
Cromossomos
ordenados do
maior para o menor
( )
( )
( )
( )
( )
( )
Mdia dos
pares de
cromossomos
g) Aps construir uma tabela para cada metfase, rena em uma outra
tabela os valores mdios dos pares cromossmicos, como mostrado abaixo.
Tamanhos mdios
Pares
Metfase 1 Metfase 2, Valores mdios (convertidos para
etc
cromossmicos
em milmetros
micrmetros)
1
2
3
h) Na ltima coluna da tabela acima, converta os tamanhos ampliados

de cada par cromossmico, de milmetros para valores reais em
micrmetros. Para isso, compare o tamanho da escala micromtrica com o
tamanho dos braos cromossmicos, utilizando uma regra de trs.
i) Os valores mdios para cada par cromossmico podem tambm
ser seguidos do desvio padro de cada mdia, indicando a variao das
medidas obtidas.
j) Os valores em milmetros podem ser utilizados para construir uma
representao esquemtica desses dados.
A Figura 3c mostra uma das maneiras possveis de apresentar um
idiograma. Nesse caso, alm da representao esquemtica do complemento haplide, os valores obtidos para tamanho (S) e proporo entre braos
(AR), para cada cromossomo dessa espcie (Emilia fosbergii), esto claramente indicados (veja uma clula metafsica correspondente a esse
idiograma na Figura 8b). Havendo heteromorfismo cromossmico para esses parmetros, em todos os indivduos analisados, as duas formas encontradas devem ser apresentadas no idiograma. Os cromossomos na Figura
3c esto ordenados pelo tamanho do brao curto, do maior para o menor.
38
3 - Como analisar cromossomos meiticos

A anlise convencional de cromossomos meiticos feita praticamente da mesma maneira que a anlise mittica. A colorao classicamente
mais utilizada a colorao com carmim actico seguida de esmagamento,
embora para cromossomos pequenos, as tcnicas de esmagamento seguido de colorao permitam melhor espalhamento e contraste e sejam, por
isso, mais recomendadas. As tcnicas utilizadas para anlise meitica permitem tambm observar a primeira diviso mittica dos gros-de-plen.
Nesse ltimo caso, deve-se utilizar preferencialmente a colorao com
hematoxilina ou com carmim. A colorao com Giemsa no muito recomendada para esse fim porque cora a exina do plen, necessitando, portanto,
estourar os gros de plen.
A anlise das fases da meiose, e especialmente a interpretao dos
bivalentes, no muito fcil em espcies com cromossomos pequenos.
Por isso, fortemente recomendado adquirir alguma experincia inicial com
espcies que apresentem cromossomos grandes e pouco numerosos. Entre essas espcies, destacamos o centeio com n=7, as espcies de Allium
(cebola, alho) com n=8 e as espcies diplides de Nothoscordum (alho de
cheiro) com n=5. O milho (n=10), o maracuj (n=9), o tomate e a jurubeba
(Solanum), com n=12, embora tenham cromossomos bem menores, so
materiais fceis de coletar e tambm permitem uma anlise satisfatria das
fases da meiose.
Da mesma maneira que na anlise mittica, as tcnicas de anlise
meitica podem ser divididas em dois grupos. As tcnicas de colorao
seguida de esmagamento so mais simples e rpidas, enquanto as de esmagamento seguido de colorao so um pouco mais demoradas, mas
resultam em lminas permanentes, cromossomos sempre em um mesmo
plano focal e colorao, geralmente, mais contrastada, sendo por isso mais
recomendadas para a rotina de pesquisa. Ambas as tcnicas possuem uma
srie de detalhes comuns na coleta, fixao e seleo dos botes, descritos no item abaixo.
3.1 - Observaes gerais para a preparao das lminas
a) Coleta de material. Colete botes florais com tamanhos prximos metade do tamanho do boto na antese. Se possvel, antes de iniciar a fixao, retire uma das anteras de um desses botes, coloque em
uma lmina com uma gota de cido actico a 45%, dilacere a antera, cubra
com uma lamnula e verifique no microscpio, com o condensador abaixado, se j tem gros de plen. Em caso positivo, elimine os botes maiores que esse. Para estabelecer um tamanho mnimo a ser coletado, localize, da mesma maneira, um boto bem menor que esse que no apresente plen nem meicitos. Definidos os limites, procure fixar o maior nmero possvel de botes.
b) Fixao. Fixe os botes em lcool-cido actico 3:1 por 2 a 20
39
horas e estoque no freezer ou transfira o material para etanol 70% e estoque na geladeira.
Ateno:
Uma boa fixao dos meicitos fundamental para a posterior anlise dos cromossomos e exige bastante ateno. A fixao dos meicitos
dificultada pela presena de spalas e ptalas que protegem as anteras
e formam uma barreira penetrao do fixador no seu interior. No caso
de Nothoscordum e de algumas outras plantas, quando as anteras esto em meiose, as ptalas ou tpalas so ainda muito mal desenvolvidas e as anteras ficam bastante expostas, facilitando a fixao. Nesse
caso, basta remover as brcteas e outras estruturas que protegem a
inflorescncia, retirar os botes mais velhos e mergulhar a inflorescncia no fixador. Na maioria das espcies, no entanto, necessrio
remover ou afastar as spalas e ptalas, de forma a permitir uma fixao rpida e eficiente dos meicitos. Em algumas espcies, como em
ciperceas e orqudeas, prefervel remover as anteras e fix-las em
um pequeno frasco ou tubo de Eppendorf. Esses procedimentos precisam ser feitos na lupa, demandando mais tempo, mas sempre produzem resultados de mais alta qualidade.
Quando no houver condies de proceder a uma disseco cuidadosa, deve-se ao menos fazer um corte longitudinal no boto, com
uma gilete, partindo da base para o pice. Uma pequena compresso
do eixo maior de cada metade do boto ajuda a relaxar um pouco a
estrutura interna do boto, facilitando a penetrao do fixador.
Lembre-se de colocar cinco a dez vezes mais fixador que material
a ser fixado em cada frasco. Enquanto est colocando os botes ou
anteras no fixador, agite regularmente o frasco com fixador para
garantir que os lquidos dos tecidos sejam realmente substitudos pelo
fixador. Em casos mais crticos, mude o fixador aps os primeiros 10 a
15 minutos. Caso demore mais de 20 minutos dissecando ou cortando
os botes, feche o frasco com os botes j fixados, faa um novo fixador
e continue a fixao.
c) Seleo do boto floral adequado e preparao da lmina.
Coloque em uma lmina cinco ou seis botes, alinhados por ordem de
tamanho, mantendo todos bem umedecidos. Afaste um dos botes e, com
a ajuda de uma lupa, retire uma das anteras. Coloque a antera em outra
lmina com uma gota de cido actico a 45%. Com uma agulha de seringa,
corte a antera transversalmente e bata em cima das duas metades de
forma que os meicitos sejam liberados da antera. Verifique no microscpio o estgio exato do boto floral. Para isso, abaixe o condensador do
microscpio e utilize a objetiva de 5x ou de 10x (certifique-se de que a
objetiva no tem possibilidade de encostar no material). Se a meiose j
tiver sido concluda, os gros de plen aparecero soltos e em grande nmero na lmina. Isso pode ser visto ao microscpio com a objetiva de menor aumento, ainda antes de cobrir o material com a lamnula. Nesse caso,
limpe a lmina e tente a antera de outro boto mais jovem. Anteras em
40
estgios pr-meiticos no liberam imediatamente o seu contedo e podem tambm ser facilmente reconhecidas. Anteras em meiose so prontamente reconhecidas pelo grande nmero de meicitos, que so clulas
maiores que as demais (em algumas espcies as clulas do tapete podem
ser ainda maiores), arredondadas e envoltas por uma capa refringente, formada pela parede de calose (ausente nas clulas do tapete). Em caso de
dvida, ou caso haja meicitos em estgio apropriado, retire os restos de
parede da antera deixando apenas os meicitos, cubra com uma lamnula e
analise ao microscpio. Ao final, esmague cuidadosamente a preparao
com a ajuda de folhas de papel de filtro e analise novamente.
Ateno:
Dentro de uma antera, o desenvolvimento meitico geralmente
sincrnico, mesmo em espcies com anteras grandes. As anteras de
um mesmo boto tm tambm desenvolvimento mais ou menos
sincrnico, podendo conter fases distintas da meiose. Entretanto, se
ocorrer plen, ou estgios pr-meiticos, ser impossvel encontrar
clulas em meiose no mesmo boto, exceto em botes com grande
nmero de estames (cactceas, p. ex.) e em espcies com flores
heterodnamas (flores com dois ou mais conjuntos de estames de
tamanhos diferentes, ex. Crotalaria).
A localizao da antera no estgio correto pode exigir muitas
tentativas e por isso necessrio organizar essa etapa de forma a
permitir analisar um grande nmero de botes num mnimo de tempo.
Com prtica em uma determinada espcie, no entanto, possvel
reconhecer o boto adequado pelo seu tamanho ou pelo aspecto geral
das anteras.
A Figura 4a mostra uma meiose sincrnica, em uma espcie de orqudea. A Figura 4b mostra meicitos de uma nica antera de Psittacanthus sp
(lorantcea), com diferentes fases do ciclo meitico. Observe que as clulas
aparecem sempre envoltas na capa de calose. Essas clulas foram apenas
hidrolisadas com HCl 5N, mas no foram coradas nem esmagadas, deixando
os cromossomos mais contrastados e a parede de calose inteira. Observe a
presena de uma ponte anafsica em uma clula em final de anfase II.
3.2 - Tcnicas de colorao seguida de esmagamento
3.2.1 - Colorao com carmim actico a 2%
a) Coleta e fixao de botes. Como descrito nos itens 3.1.a e b.
b) Seleo de botes, colorao e preparao das lminas. A
seleo dos botes deve ser feita como no item 3.1.c. Quando transferir
uma antera para outra lmina, coloque uma gota de carmim a 2%, ao invs
do cido actico a 45%. O restante do procedimento igual, apenas a anlise ao microscpio no precisa ser feita com o condensador abaixado,
uma vez que o material j deve estar corado.
41
Figura 04 Observao da meiose. a, Clulas de Oncidium varicosum (n=56), todas em metfase I, exceto
uma nica clula (AI) que iniciou a anfase I. Colorao com hematoxilina. b, Meicitos de Psittacanthus sp
sem corante, apenas hidrolisados com HCl 5N e observados ao microscpio com o condensador abaixado.
c, Metfase I de uma pteridfita, Acrostichum aureum (n=30), corada com carmim. Fotos: a, Leonardo Felix;
b, original; c, Adriana Marcon.
Ateno:
Alguns autores recomendam o uso de agulhas de ferro nessa etapa
da tcnica, ao invs de agulhas inoxidveis. Nesse caso, enquanto os
meicitos estiverem no corante, a agulha de ferro ajuda a oxidar mais
o corante e intensificar a colorao dos cromossomos. Bons resultados
42
podem tambm ser obtidos aquecendo-se inicialmente os botes

fixados em um tubo de ensaio com o carmim, como na tcnica descrita
anteriormente para colorao de mitose de raiz com orcena.
Se o citoplasma estiver muito corado, aquea levemente a lmina
numa chama at clarear o citoplasma. Esse aquecimento ajudar
tambm na dilatao da clula e no espalhamento dos cromossomos.
c) Conservao da lmina. A lmina corada com carmim deve ser
lutada e analisada dentro de um ou poucos dias. Caso queira torn-la permanente, siga o roteiro descrito no item 2.3.3.
A Figura 4c mostra uma metfase I de uma pteridfita (Acrostichum
aureum), fotografada em uma lmina recm-preparada. Observe que o citoplasma claramente observado, o que no ocorre na Figura 4a.
a) Coleta e fixao de botes. Como descrito nos itens 3.1.a e b.
b) Lavagem. Lave os botes mergulhando-os duas vezes em gua
c) Hidrlise. Retire os botes da gua, enxugue-os rapidamente em
papel-filtro e mergulhe-os em HCl 5N temperatura ambiente por apenas 5
a 10 minutos.
d) Lavagem. Lave novamente os botes em gua destilada (duas vezes, 5 minutos cada), com cuidado para no perder o material (se a hidrlise
for excessiva, o material pode ficar demasiadamente macio e frgil).
e) Colorao. Transfira o material para um pequeno recipiente (placas de Petri bem pequenas, ou mesmo um vidro de relgio), acrescente
uma ou mais gotas de hematoxilina actica a 1%, de forma que todos os
botes fiquem imersos, e cubra para no evaporar. Mantenha o material no
corante por 30 minutos temperatura ambiente.
f) Preparao da lmina. Transfira um dos botes para uma lmina, acrescente uma gota do corante e destaque uma das anteras. Transfira
essa antera para outra lmina com uma gota de corante, corte-a transversalmente e procure liberar o contedo da antera. Retire os restos de parede
de antera, cubra com uma lamnula e observe ao microscpio. Se houver
meicitos, esmague cuidadosamente a preparao. Maiores detalhes so
descritos no item 3.1.c.
g) Conservao da lmina. Se a lmina estiver boa, ela poder ser
lutada com esmalte de unha, para anlise dentro de um ou dois dias, ou
tornada permanente. Nesse ltimo caso, siga exatamente o procedimento
descrito no item 2.3.3.
43
A Figura 5a mostra uma clula de Nothoscordum cf pulchellum em

final de diplteno, corada com essa tcnica. Nesse caso, o tempo de hidrlise
foi encurtado para permitir a visualizao do nuclolo (associado a uma
constrio secundria terminal).
Figura 05 Observao da meiose. a, Final de diplteno de Nothoscordum pulchellum (n=5) corado

com hematoxilina. b, Metfase I de Vigna unguiculata (n=11) corada com Giemsa. c, Metfase I de Rhoeo
spathacea (n=6), corada com Giemsa, mostrando uma cadeia de 7 e outra de 5 cromossomos. d, Metfase
I e ncleos interfsicos de uma alga vermelha, Laurencia sp. (n=29), corados com hematoxilina actica a 4%.
Cabeas de setas em a e d apontam nuclolo; seta em d indica a regio de conexo com a clula vizinha.
Fotos: a, Guerra, 1999; b, Reginaldo de Carvalho; c, original; d, Fujii e Guerra, 1998.
3.3 - Tcnica de esmagamento seguido de colorao

3.3.1 - Colorao com Giemsa
a) Coleta, fixao, lavagem, hidrlise, seleo do boto e
44
preparao da lmina. Como descrito na tcnica anterior (veja tambm

os itens 3.1.a, b e c). A nica diferena que na colorao com Giemsa
no h necessidade de uma lavagem aps a hidrlise, como indicado na
tcnica anterior. Nesse caso, aps a hidrlise transfira os botes para um
recipiente com gua destilada e inicie o procedimento de seleo do boto adequado.
b) Colorao com Giemsa. Aps a preparao da lmina, a lamnula
deve ser retirada em nitrognio lquido e secada ao ar. A colorao com
Giemsa a 2% pode ser feita mergulhando a lmina na soluo corante,
como descrita na tcnica 2.2.1.h para clulas de raiz. O tempo de colorao depende do material analisado, variando em geral de 5 a 20 minutos.
Aps a colorao, deixe a lmina secar completamente e monte em Entellan
ou similar.
Ateno:
Se a colorao com Giemsa resultar excessiva, descore um pouco a
lmina mergulhando-a em gua acidificada (veja item 2.2.2).
Devido principalmente a problemas na fixao, o citoplasma dos
meicitos pode corar com o Giemsa. Se a colorao do citoplasma no
for muito intensa, a descolorao indicada acima suficiente para resolver o problema. Entretanto, se o citoplasma corar fortemente (geralmente em fixaes feitas em campo) prefervel descorar a lmina e
corar novamente com hematoxilina ou carmim, que reagem menos
com o citoplasma.
A retirada da lamnula no nitrognio lquido, devido ao congelamento
excessivo, freqentemente racha os meicitos estragando a preparao. Por essa razo, recomendado ao invs de mergulhar a lmina
diretamente no nitrognio lquido, mant-la suspensa na cmara fria
acima da superfcie do nitrognio, ou usar gelo seco, que menos frio.
As Figuras 5b e c mostram metfases I com cromossomos pequenos
(b) e grandes (c) corados com Giemsa. Os cromossomos da comelincea
Rhoeo spathacea (5c) apresentam um complexo de translocao, formando
geralmente um anel de 12 cromossomos. Nessa clula, no entanto, dois
quiasmas no se formaram, resultando em uma cadeia de sete cromossomos
e uma menor com cinco.
a) Coleta, fixao, lavagem, hidrlise e preparao da lmina como descrito na tcnica anterior.
b) Colorao com hematoxilina. Aps retirar a lamnula no nitrognio lquido e deixar a lmina secar, coloque uma gota de hematoxilina
actica a 1% em cima das clulas na lmina, cubra com uma lamnula e
analise ao microscpio. Para tornar a lmina permanente, retire a lamnula
com um jato de gua, seque a lmina e monte em Entellan ou similar.
45
Ateno:
Se houver interesse em observar o nuclolo, a etapa da hidrlise
deve ser excluda ou realizada em HCl 1N por cerca de 3 a 5 minutos.
Nesse caso, entretanto, o citoplasma poder ficar um pouco mais corado.
A colorao com hematoxilina pode facilmente ser descorada e
recorada com Giemsa ou vice-versa (item 2.2.3).
Para anlise da mitose ps-meitica, prefervel analisar os
micrsporos antes de tornar a lmina permanente.
Nessa tcnica possvel corar com carmim actico ao invs de
hematoxilina, principalmente se os cromossomos no forem pequenos.
A colorao com carmim, no entanto, menos intensa.
A Figura 4a, mostra clulas de Oncidium varicosum, em meiose I,
coradas com hematoxilina a 1%. Na Figura 5d, observa-se uma metfase I
de uma alga vermelha, do gnero Laurencia, na qual o nuclolo persiste
durante todo o ciclo meitico. Para revelar o nuclolo e evidenciar melhor
os pequenos cromossomos, a clula foi corada com hematoxilina a 4%. O
disco escuro, bem corado, abaixo dos cromossomos, corresponde a uma
estrutura da parede celular dessas algas que liga clulas vizinhas.
3.4 - Anlise de clulas do tapete e da mitose polnica
Quando se analisa a meiose na antera, possvel observar dois outros
tipos de clulas da antera em diviso: as clulas do tapete e a mitose polnica.
O tapete formado por uma camada de clulas grandes, com paredes celulares geralmente finas, que envolve a massa de meicitos. Em
alguns casos, como na maioria das arceas, a parede das clulas do
tapete desaparece, formando uma nica grande massa de citoplasma e
ncleos. As clulas do tapete so geralmente binucleadas (raramente
mononucleadas ou multinucleadas) , ficando os ncleos bem prximos
um do outro, ou mesmo parcialmente fusionados (Figura 6a). No estgio
de zigteno a paquteno, freqente se observar essas clulas em
prfase ou prometfase. Nesse estgio, cada ncleo do tapete diplide,
mas posteriormente todos se tornam poliplides (Figura 6b ) devido
ocorrncia de ciclos endomitticos. Em alguns grupos de plantas, como
em vrias espcies do gnero Vigna , ao invs de formarem ncleos
poliplides, esses ciclos resultam na formao de ncleos politnicos
(Figura 6c). O tapete tem a funo de nutrir o meicito e ajudar na formao do gro de plen, degenerando logo aps a formao desse. Essas
clulas so facilmente visveis com qualquer tcnica de colorao cromossmica.
Logo aps a dissoluo da ttrade e a formao da exina, o gro de
plen apresenta uma primeira diviso mittica (Figuras 7a, e b), originando
o ncleo reprodutivo e o generativo (na realidade, duas clulas distintas). A
observao dessa primeira mitose ps-meitica pode ser feita mais facilmente com as tcnicas de colorao com carmim ou hematoxilina, descritas nos itens 3.2.1 e 3.2.2, uma vez que esses corantes no reagem com a
exina, como ocorre com o Giemsa. As tcnicas de esmagamento seguido
46
c
Figura 06 Clulas do tapete. a, Uma clula binucleada e duas outras trinucleadas ao lado de clulas
zigotnicas em Psittacanthus sp, sem colorao b, Clula octoplide do tapete de Passiflora racemosa,
que normalmente apresenta 2n=18, corada com DAPI. Acima observa-se alguns ncleos diplides. c,
Clula politnica ao lado de um ncleo diplide em Vigna unguiculata (2n=22), corados com Giemsa.
Cabeas de seta apontam a constrio primria distendida em alguns cromossomos. Fotos: a, b, originais;
c, Gianna Carvalheira.
de colorao no so aconselhadas, nesse caso, porque freqentemente

se perdem muitos gros de plen durante ou aps a retirada da lamnula.
Igualmente, quando as lminas coradas com carmim ou hematoxilina so
tornadas permanentes, os gros de plen podem ser perdidos, sofrer
distores e ter a colorao do citoplasma intensificada.
47
c
Figura 07 Primeira mitose polnica, corada com hematoxilina (a, b) ou com Giemsa (c). a, b, Metfase (a)
e anfase (b) em Nothoscordum pulchellum (n=5), com dois cromossomos acrocntricos e trs
metacntricos. Observe o contorno da exina e o crculo formado pelos centrmeros nos dois polos da
anfase. c, Metfases em Rhynchospora tenuis (n=2) mostrando a exina ligeiramente corada. Fotos: a, Guerra,
1999; b, original; c, Andr Vanzela.
Alguns grupos de plantas apresentam um comportamento diferenciado dos demais no final da microsporognese (aps o estgio de ttrade) ou
no incio da microgametognese (primeira diviso do plen), dificultando a
interpretao dos resultados para um citologista no familiarizado com essas variantes. Algumas leguminosas mimosodes, por exemplo, ao invs
de produzirem gros de plen isolados, produzem polades (agregados de
quatro, oito ou mais micrsporos), enquanto muitas orqudeas produzem
mssulas (agrupamentos irregulares com nmeros variados de micrsporos).
Nas ciperceas, as quatro clulas resultantes da meiose permanecem reunidas, formando um nico gro de plen. Todas as quatro clulas iniciam a
primeira diviso mittica. Entretanto, trs delas, deslocadas para uma posio perifrica, alcanam no mximo a fase de metfase, degenerando em
seguida. A Figura 7c ilustra essa particularidade das ciperceas em
Rhynchospora tenuis (n=2). Nessa figura, aquilo que parece ser uma s
clula, na realidade, so quatro micrsporos unidos, cada um com apenas
dois cromossomos. Trs conjuntos desses so visivelmente menores (provavelmente porque no passaram por uma fase S antes dessa mitose) e
apenas a clula maior e central continua o seu desenvolvimento, formando
o microgametfito.
48
4 - Como corar diferencialmente

algumas regies cromossmicas
Muitos cromossomos possuem um ou mais segmentos, com constituio ou organizao molecular diferente, os quais podem ser corados de
forma diferencial. Esses segmentos diferenciais podem estar restritos a
uma determinada regio do cromossomo, formando as chamadas bandas,
ou podem envolver todo o cromossomo. A presena de bandas permite
caracterizar melhor alguns cromossomos, identificar homlogos e auxiliar
na anlise da evoluo cromossmica comparada.
A preparao de lminas para todas as tcnicas de colorao diferencial, inclusive a hibridizao in situ, segue o mesmo protocolo inicial de
digesto enzimtica. Os procedimentos anteriores preparao das lminas, como por exemplo, o tipo de antimittico utilizado ou o tempo de prtratamento, so iguais aos das tcnicas convencionais.
As tcnicas para colorao diferencial, especialmente para o
bandeamento C, podem ser realizadas de maneiras muito diferentes. Os
procedimentos apresentados aqui so os mais freqentemente referidos
na literatura e funcionam bem em uma grande diversidade de organismos.
O roteiro para bandeamento C est baseado na tcnica proposta por
Schwarzacher et al. (1980), a colorao com CMA e DAPI est baseada na
tcnica de Schweizer (1976), descrita com mais detalhes por Deumling e
Greilhuber (1982), e a colorao com nitrato de prata est baseada em Stack
et al. (1991). Uma caracterstica comum a todas essas tcnicas que a
obteno de bons resultados no ocorre todas as vezes. No caso do
bandeamento C, freqente que em algumas tentativas apenas os satlites
corem diferencialmente, enquanto as demais bandas corem fracamente ou
no corem. Portanto, muito importante repetir o procedimento algumas
vezes para se certificar de que os resultados estejam corretos.
4.1 - Preparao de lminas com digesto enzimtica
a) Pr-tratamento e fixao como descrito nas tcnicas anteriores
b) Lavagem. Lave as razes, mergulhando-as duas vezes em gua
destilada ou tampo citrato (5 minutos cada).
c) Digesto enzimtica. Enxugue ligeiramente as razes em papel
filtro, coloque-as em uma lmina e acrescente uma gota da soluo
enzimtica, contendo 2% de celulase e 20% de pectinase. Mantenha a lmina em cmara mida a 37 C at as razes ficarem macias. Aps a primeira
1/2 hora, verifique a cada 1/2 hora quando as razes esto suficientemente
macias. Esse tempo varia muito entre espcies. Por exemplo, cebola e feijo so digeridos mais rapidamente (60-90 minutos), enquanto gramneas
podem necessitar de 2 a 3 horas. Se a atividade das enzimas estiver muito
forte, aps o tempo ideal de digesto as razes devem ser transferidas para
um recipiente com gua destilada para evitar que se dissolvam.
49
Ateno:
A concentrao das enzimas pode ser modificada dependendo da
atividade que apresentem (a celulase menos crtica e geralmente
mantida em 2%, enquanto a pectinase pode variar entre 4 e 20%). O
importante que as razes fiquem bastante macias, sem que se dissolvam ao toque.
Em algumas espcies, aps a digesto, a regio terminal da ponta da
raiz se desprende facilmente. Nesse caso, prefervel fazer a digesto
na prpria lmina onde ser realizado o esmagamento.
No caso da preparao de lminas para meiose, a digesto enzimtica deve ser feita num tempo muito mais curto (em torno de 20 minutos). As demais etapas seguem essencialmente iguais.
d) Preparao da lmina. Transfira uma ponta de raiz para a lmina. Enxugue cuidadosamente a raiz com papel filtro e acrescente uma gota
de cido actico a 45%. Com o auxlio de um estereomicroscpio, retire a
coifa e as capas mais externas da raiz, procurando deixar apenas o
meristema. Utilizando estiletes bem finos ou agulhas de seringas, fragmente o tecido em pedaos to pequenos quanto possvel. Cubra com uma
lamnula e bata cuidadosamente com uma agulha de ponta rombuda, diretamente em cima dos fragmentos de meristema, at que cada um deles se
transforme numa pequena mancha de tecido espalhado. Verifique ao microscpio com o condensador abaixado, se as clulas esto bem espalhadas. Nesse caso, esmague as clulas colocando o conjunto lmina-lamnula
em um papel filtro dobrado, pressionando firme e cuidadosamente para
no permitir nenhum deslize da lamnula sobre a lmina.
e) Retirada da lamnula. Congele a lmina-lamnula no gelo-seco
ou no nitrognio lquido por alguns minutos e, com o auxlio de uma gilete
ou um bisturi, retire rapidamente a lamnula. Deixe a lmina secar ao ar.
f) Estocagem das lminas. Em algumas tcnicas, a lmina recmpreparada pode ser utilizada imediatamente. Em outras, como no bandeamento C, a lmina precisa ser envelhecida (isto , guardada temperatura ambiente por um ou mais dias). O efeito ao nvel molecular do envelhecimento no conhecido, mas sabe-se que tem um papel fundamental no
funcionamento dessas tcnicas. Em qualquer caso, as lminas recm-preparadas e secas devem ser mantidas em caixa protegida de poeira, de preferncia em jarros de Coplin tampados.
Ateno:
Essas lminas podem ser conservadas por vrios meses, como se
fossem frescas, se forem mantidas secas no freezer, em recipiente vedado.
4.2 - Bandeamento C - Observao da heterocromatina constitutiva
a) Preparao e envelhecimento de lminas. Prepare as lminas
com digesto enzimtica e guarde-as por 2 dias temperatura ambiente. O
50
tempo de envelhecimento pode ser posteriormente ajustado para 1 a 3

dias ou mais, dependendo do material.
b) Hidrlise. Mergulhe as lminas em cido actico a 45% em banho-maria pr-aquecido a 60 C durante 10 minutos. Aps esse perodo,
verta o cido actico a 45% em um outro recipiente essa mesma soluo
ser reutilizada mais adiante temperatura ambiente.
Ateno:
Os recipientes contendo o cido actico 45% e o 2xSSC (item f)
devem ser colocados no banho-maria, para pr-aquecimento, ao menos
20 minutos antes de utilizar essas solues. A temperatura deve ser
controlada diretamente na soluo e o nvel desta deve ser igual ou
inferior ao da gua do banho-maria.
O jarro de Coplin no suporta grande variao de temperatura entre
seus lados interno e externo. Por isso, antes de colocar uma soluo
no jarro em banho-maria, deve-se primeiro aquecer a soluo em um
bquer ou Erlenmeyer do tipo pyrex, depois transferir a soluo para o
jarro e mergulh-lo imediatamente no banho-maria.
c) Lavagem. Lave as lminas em gua de torneira corrente por cerca
de 1 minuto e em seguida seque-as com uma bomba de ar.
d) Desnaturao. Mergulhe as lminas cuidadosamente em um jarro de Coplin contendo uma soluo saturada de hidrxido de brio temperatura ambiente, durante 10 minutos. Alternativamente, pode ser tentada a
mesma soluo a 50-60 C pelo mesmo tempo.
e) Lavagem. Acrescente gua de torneira na cubeta cuidadosamente, at que os cristais sobrenadantes transbordem junto com a gua. Em
seguida, retire a gua do jarro e adicione a soluo de actico a 45% utilizada no item b. Imediatamente depois, devolva o cido actico para o recipiente onde estava. Essa rpida lavagem em cido actico visa apenas eliminar o hidrxido de brio das lminas. Lave as lminas em gua corrente no
jarro de Coplin por 2 minutos. Enxge com gua destilada.
Ateno:
No descarte o cido actico a 45% na pia. Estoque em depsito
apropriado para cidos usados (veja captulo 7).
f) Renaturao e extrao diferencial de DNA. Seque as lminas, transfira-as para um jarro de Coplin e acrescente uma soluo de 2xSSC
pr-aquecida a 60 C. Imediatamente em seguida, coloque o jarro em banho-maria durante 80 minutos.
Ateno:
Nessa etapa, prefervel no trabalhar com o jarro cheio de lminas
e sim com a metade da capacidade de lminas do jarro.
51
O tempo de renaturao pode ser ajustado para cada espcie. Se ao

final do procedimento, toda a preparao ficar descorada demais, pode
ser devido extrao excessiva de DNA no 2xSSC.
g) Lavagem, colorao e montagem. Lave as lminas rapidamente em gua destilada, seque com uma bomba de ar e core com Giemsa a
2% por 15-30 minutos. Controle a colorao geral das clulas (item 2.2.1.e)
e monte a lmina em Entellan ou similar. Observe que no bandeamento C a
eucromatina (a maior parte da cromatina total) deve ficar fracamente corada
(Figuras 8a e b) e, portanto, a lmina deve parecer menos corada que na
tcnica convencional. Os ncleos interfsicos geralmente evidenciam melhor o bandeamento e podem servir como um indicador confivel da colorao. Em caso de dvida, coloque uma gota de gua destilada e monte
com uma lamnula para checar melhor a colorao. Em seguida, retire a
lamnula com um jato de gua destilada, seque a lmina novamente e monte em Entellan, ou devolva a lmina para o Giemsa.
Ateno:
Aps o procedimento para bandeamento C, a colorao geralmente
utilizada a de Giemsa, mas outras coloraes, como o Hoechst e o
DAPI, podem tambm ser utilizadas. As Figuras 8c e d mostram uma
metfase de centeio, tratada com a tcnica de bandeamento C, corada
com Hoechst (8c), descorada e corada com Giemsa (8d). Nesse tipo de
colorao, em geral, as bandas coradas com o Hoechst so idnticas
s coradas com Giemsa.
4.3 - Dupla-colorao com os fluorocromos CMA e DAPI
a) Preparao da lmina. Prepare as lminas com digesto enzimtica (item 4.1) e guarde-as em uma cubeta, protegidas da poeira, por 3
dias temperatura ambiente.
b) Colorao com CMA . Coloque uma gota de CMA (0,5 mg/ml)
em cima das clulas e cubra com uma lamnula. Guarde a lmina em
cmara mida, escura, por 1 hora. Retire a lamnula e o excesso de corante
com um jato de gua destilada e seque a lmina rapidamente com uma
bomba de ar.
c) Colorao com DAPI. Coloque uma gota de DAPI (2 g/ml) em
cima das clulas e cubra com uma lamnula. Guarde em caixa escura por
30 minutos. Retire a lamnula e o excesso de corante com um jato de gua
destilada e seque rapidamente a lmina.
d) Montagem da lmina. Coloque uma gota de meio de montagem
glicerol/McIlvaine (contendo MgCl2), cubra com uma lamnula e comprima
ligeiramente entre duas folhas de papel de filtro para tirar o excesso de
meio. Guarde em caixa escura por pelo menos trs dias antes de analisar
ao microscpio.
52
Figura 08 Bandeamento C. a, Metfase e ncleos interfsicos de cebola. b, Metfase e ncleos interfsicos

de Emilia fosbergii (2n=20). c, d, Metfase incompleta de centeio, bandeada e corada com Hoechst (c),
descorada e corada com Giemsa (d). Observe a presena de dois cromosssomos B (setas) com blocos de
heterocromatina terminais. Clulas em a e b, coradas com Giemsa. Fotos: a, Maria Jos Gomes de Andrade;
b, Guerra e Nogueira, 1990; c, d, Ana Christina Brasileiro.
e) Anlise ao microscpio. Para observar a colorao DAPI use filtro de 340 a 380 nm. Para o CMA use filtro de 390 a 490 nm ou outro comprimento dentro dessa faixa.
53
f) Fotografia. Ao contrrio da fotografia de microscopia de campo

claro (colorao com carmim, Giemsa, etc), a fotografia com luz ultravioleta
geralmente feita com o sistema manual de fotomicroscopia. Para isso,
precisar fazer inicialmente alguns testes com diferentes tempos de exposio para as coloraes CMA e DAPI (em geral o tempo ideal para CMA
muito maior que para DAPI). Tambm possvel fotografar as clulas coradas com DAPI ou outro fluorocromo estvel com exposio automtica,
necessitando para isso um ajuste adequado do sistema fotogrfico. No caso
de fluorocromos mais instveis, utilize filme de ASA alta (ASA 400 ou mais).
As Figuras 9a e b mostram uma mesma metfase de Eleutherine
bulbosa fotografada com o filtro para CMA (a) e para DAPI (b). Observe que
com essa colorao possvel observar que o maior par cromossmico
sofreu uma inverso pericntrica, mudando a posio das bandas e a
morfologia dos cromossomos (compare com a Figura 1b).
Ateno:
Aps a colorao com fluorocromos, possvel descorar a lmina e
corar com outras tcnicas. As Figuras 9c e d mostram uma mesma
metfase de uma gimnosperma (Podocarpus macrophyllus) corada com
CMA/DAPI (apenas a foto com DAPI apresentada), descorada e corada
com Giemsa a 2%. Observe uma banda terminal DAPI+ em quase todos
os cromossomos e um par de cromossomos com uma banda DAPIcorrespondente regio da constrio secundria em 9d.
Dependendo dos objetivos, pode ser usada ao invs da dupla-colorao CMA/DAPI apenas CMA ou apenas DAPI. Nesses casos, o procedimento o mesmo, dispensando apenas o item b ou c, respectivamente.
Alguns autores preferem utilizar a chamada colorao seqencial
CMA-DAPI. Nesse caso, feita primeiro a colorao DAPI, com montagem, anlise da lmina e fotografia. Em seguida, a lmina descorada
e recorada com CMA, como descrito acima, e refotografada.
Para descorar a lmina, retire a lamnula com um jato de gua destilada e mergulhe a lmina em um borel com fixador Carnoy 3:1 recmpreparado, por 30 minutos. Em seguida, transfira a lmina para um
borel com etanol 100% por pelo menos 2 horas (de preferncia deixe
de um dia para o outro na geladeira).
Todos os corantes diminuem sua colorao com a exposio demasiada luz, porm os fluorocromos so particularmente sensveis. Por
essa razo, durante toda a preparao da lmina, evite exposio intensa ou prolongada luz. Mantenha as solues de fluorocromos
sempre em frascos escuros e envoltos em papel alumnio.
Muitos fluorocromos so mutagnicos, devendo ser evitado contato
com a pele. Pela mesma razo, no devem ser jogados diretamente na
pia. recomendvel ter um depsito de boca larga para fazer a retirada
da lamnula e do excesso de fluorocromo (itens b e c anteriores). Quando o depsito estiver com metade da sua capacidade preenchida, seu
contedo deve ser eliminado em local de difcil acesso rede fluvial
(veja item 6.5).
54
Figura 09 Dupla colorao CMA/DAPI e colorao seqencial com hematoxilina. a, b, Metfase de

Eleutherine bulbosa (2n=12) corada simultaneamente com CMA (a) e DAPI (b). c, d, Metfase e ncleo
interfsico de uma gimnosperma, Podocarpus macrophyllus (2n=38), corados com CMA/DAPI (foto, em c,
mostra apenas a colorao com DAPI), descorados e corados com Giemsa (d). Setas em c apontam as
constries secundrias. Fotos: a, b, Guerra, 1998b; c, d, originais.
4.4 - Tripla colorao CMA/DA/DAPI

a) Preparao da lmina e colorao com CMA. Prepare e core a
lmina como descrito nos itens 4.3.a e b da tcnica anterior.
b) Contracolorao com Distamicina A (DA). Acrescente uma gota
de distamicina A (0,1mg/ml) em cima das clulas e cubra com uma lamnula.
55
Guarde em caixa escura por 30 minutos. Retire a lamnula e o excesso de

corante com um jato de gua destilada e seque rapidamente a lmina com
uma bomba de ar.
c) Colorao com DAPI, montagem da lmina, anlise e fotografia. Como descrito nos itens 4.3.c, d, e e f da tcnica para dupla-colorao com CMA/DAPI.
4.5 - Colorao seqencial CMA-DAPI com contracorantes (CMA/DADAPI/AMD)
a) Preparao da lmina, colorao com CMA e contracolorao com Distamicina A. Como descrito no itens 4.3.a e b e 4.4.b.
b) Montagem, anlise e fotografia do CMA/DA. Como descrito
nos itens 4.3.d, e e f.
c) Retirada dos corantes CMA/DA. Retire a lamnula com um jato
de gua, seque a lmina e a mantenha em Carnoy 3:1 por 12 a 24 horas na
geladeira, mudando o fixador aps os primeiros 30 minutos e pelo menos
mais duas vezes durante esse perodo. Em seguida, seque a lmina e a
transfira para etanol (P.A.) por 1 a 2 horas temperatura ambiente ou 24
horas na geladeira.
d) Colorao com DAPI. Como descrito no item 4.3.c.
e) Contracolorao com Actinomicina D (AMD). Acrescente uma
gota de AMD (0,2 mg/ml) na lmina e cubra com uma lamnula. Guarde em
caixa escura por 30 minutos. Retire a lamnula e seque a lmina.
f) Retirada dos corantes DAPI/AMD. Como descrito no item 4.3.c.
g) Montagem da lmina, anlise e fotografia. Como descrito
nos itens 4.3.d, e e f.
Ateno:
Em algumas espcies podem ser obtidos melhores resultados combinando a tcnica de bandeamento C com a de CMA/DAPI. Para isso,
realize todo o procedimento para o bandeamento C seguido da colorao com os fluorocromos. Muito cuidado deve ser tomado com o fato
de que, utilizando a combinao dessas duas tcnicas, as bandas brilhantes com DAPI ou CMA podem no ser especificamente ricas em
AT ou GC, como as observadas na colorao direta. Em geral, todas as
bandas C aparecem positivas se coradas apenas com DAPI, inclusive
aquelas ricas em GC, como a heterocromatina associada RON.
4.6 Colorao com Hoechst 33258, quinacrina ou iodeto de
propdeo
56
a) Preparao da lmina. Para qualquer colorao com fluorocromos, trate as razes com digesto enzimtica e prepare as lminas como
descrito no item 4.1.
b) Colorao com Hoechst. Coloque uma gota de Hoechst (0,5 g/
ml) em cima das clulas, cubra com uma lamnula e guarde em caixa escura por 30 minutos. Em seguida, retire a lamnula com um jato de gua,
seque e monte em glicerol/tampo McIlvaine (item 4.3.d).
c) Colorao com quinacrina. Siga o mesmo procedimento do item
anterior, utilizando uma soluo de quinacrina a 0,5% e um tempo de colorao de 10 minutos.
d) Colorao com iodeto de propdeo. Siga o mesmo procedimento
do item b, utilizando uma concentrao de iodeto de propdeo de 1 g/ml e
um tempo de 10 minutos.
Ateno:
O corante Hoechst, semelhana do DAPI, pode tambm ser utilizado
em combinao com o CMA ou aps o bandeamento C (Figura 8c e d).
4.7 - Colorao com nitrato de prata: observao de nuclolos e RONs
a) Prepare as lminas com digesto enzimtica (item 4.1). As lminas,
nesse caso, no precisam ser envelhecidas, embora tambm seja possvel
trabalhar com lminas feitas alguns dias antes.
b) Acrescente uma pequena gota (para isso, utilize uma pipeta Pasteur
de ponta bem fina) de nitrato de prata a 50% (0,5 g de nitrato de prata em 1
ml de gua destilada) em cima da mancha de clulas na lmina e cubra com
uma tela de nilon, de poros bem estreitos, cortada em tamanho e formato
de uma lamnula. Tambm pode ser utilizada lamnula comum, embora a
tela produza freqentemente uma colorao mais uniforme.
c) Coloque a lmina em uma cmara mida (placa de Petri fechada contendo papel de filtro molhado e dois suportes para a lmina) na estufa a 60 C.
d) Aps os primeiros 15 minutos, verifique periodicamente se a mancha de clulas na lmina assume uma colorao marrom ou dourada. Verifique ao microscpio, com a lente de menor aumento, a intensidade de
colorao dos nuclolos.
e) Quando os nuclolos apresentarem colorao escura (marrom a
preto), a colorao deve ser interrompida com um jato de gua ao lado da
tela de nilon, expulsando a tela e o excesso de nitrato.
f) Caso seja necessrio evidenciar melhor os cromossomos, possvel contracorar com carmim (no caso de meiose), orcena, hematoxilina
57
ou Giemsa. Nos dois primeiros casos, basta colocar um gota do corante e

cobrir com uma lamnula. No caso da colorao com hematoxilina ou
Giemsa, a lmina ficar mais limpa se for primeiramente hidrolisada com
HCl 5N por 10 minutos, depois lavada em gua destilada e ento corada.
Em qualquer caso, as estruturas coradas com prata no so alteradas pela
segunda colorao.
g) Seque a lmina com uma bomba de ar e monte-a com Entellan ou
similar.
Ateno:
A colorao dos nuclolos facilmente observada, entretanto a
obteno de RONs bem marcadas geralmente exige vrias tentativas.
A soluo de nitrato de prata deve ser preparada de preferncia na
quantidade mnima necessria para o uso imediato.
4.8 - Descolorao de lminas coradas com prata
a) Descolorao. Coloque 1-2 gotas de hexacianoferrato de potssio (K3[Fe(NC)6]) a 1%, recm-preparado e resfriado a aproximadamente 0
C, em cima da mancha de clulas na lmina e cubra com uma lamnula.
Deixe descorando por 15 a 60 segundos.
b) Limpeza da lmina. Retire a lamnula e a soluo descorante
com um jato de gua destilada. Mergulhe a lmina em tiossulfato de sdio
penta-hidratado a 20% por cerca de 15 segundos. Lave em gua destilada e
deixe secar ao ar.
Ateno:
Esta tcnica utilizada para colorao seqencial prata-banda C,
prata-convencional, etc. Em qualquer caso, prefervel fazer primeiro
a colorao com nitrato de prata, para evitar precipitao excessiva
da prata.
A Figura 10a mostra uma metfase de Eleutherine bulbosa com as
constries secundrias e a heterocromatina adjacente marcadas com nitrato de prata. O caritipo apresenta uma constrio secundria maior no
cromossomo metacntrico e uma outra menor no cromossomo acrocntrico
(compare com o da Figura 1b). A Figura 10b mostra ncleos interfsicos
de Emilia sonchifolia (serralheira) com um nico nuclolo bem corado e
uma prfase com as constries secundrias associadas ao nuclolo. Observe os satlites, bem corados, ao lado do nuclolo.
58
Figura 10 Colorao com nitrato de prata. a, Metfase de Eleutherine bulbosa (2n=12). b, Ncleos
interfsicos e prfase de Emilia fosbergii mostrando o nuclolo e os cromossomos associados ao nuclolo.
Setas em a apontam RONs. Fotos: a, Guerra, 1991; b, Guerra e Nogueira, 1990.
59
5 - Como preparar as solues mais

utilizadas em citogentica vegetal
Ao preparar as solues abaixo, certifique-se de que toda a vidraria a
ser utilizada esteja rigorosamente limpa. Todos os depsitos de solues
devem estar etiquetados, com as anotaes feitas a grafite ou com tinta
insolvel em gua, nunca com caneta esferogrfica comum. A etiqueta
deve indicar claramente o nome do produto, a concentrao e a data de
preparao.
Para cada soluo foi sugerido um volume que consideramos mais
prtico, os quais devem ser ajustados s necessidade de cada laboratrio. Como regra, prepare apenas os volumes mnimos necessrios, para
evitar que as solues percam ou diminuam suas atividades antes de serem utilizadas.
Os fluorocromos, em geral, so substncias caras e vendidas geralmente em p e em pequenas quantidades. Quando a quantidade muito
pequena, como no caso da cromomicina A, aconselhvel primeiramente
injetar um pouco de solvente (uma mistura de tampo com gua) no frasco,
dissolver completamente o fluorocromo, retirar a soluo e completar com
o solvente para o volume indicado.
Todas as solues de fluorocromos devem ser divididas em alquotas,
para evitar o aquecimento desnecessrio de todo o estoque a cada vez que
vai ser usado. As alquotas podem ser acondicionadas em tubos de
Eppendorf de 1 a 2 ml, todos etiquetados e numerados, de forma a permitir
o uso de apenas uma alquota de cada vez.
5.1 - Fixador Carnoy 3:1 - 20 ml
a) Misture 15 ml de etanol com 5 ml de cido actico glacial.
b) Agite bastante a soluo antes e depois de acrescentar o material a
ser fixado.
Ateno:
A soluo deve ser preparada imediatamente antes de ser usada.
O volume de fixador deve ser aproximadamente 10 vezes o volume
do material a ser fixado.
5.2 - Colchicina a 0,1% ou 0,5% - 50 ml
a) Dissolva 0,05 g ou 0,025 g de colchicina em 50 ml de gua destilada.
b) A soluo deve ser dividida em alquotas e mantidas no congelador.
Apenas uma delas deve ser mantida na geladeira (por at 6 meses), se
estiver em uso frequente.
5.3 - 8-Hidroxiquinolena (8HQ) 0,002M - 300 ml
61
a) Dissolva 0,087 g de 8HQ em 300 ml de gua destilada temperatura ambiente. Para isso, utilize um agitador magntico em uma capela (exala
gases txicos).
b) Guarde a soluo em frasco bem fechado na geladeira.
Ateno:
prefervel no estocar a soluo por mais de 6 meses na geladeira.
Evite expor a soluo luz. Se com o tempo a colorao da soluo
esmaecer pode indicar perda da atividade.
5.4 - HCl 1N e 5N - 300 ml
a) HCl 1N: Coloque primeiramente 275,16 ml de gua destilada em
uma proveta e acrescente 24,84 ml de HCl.
b) HCl 5N: Coloque primeiramente 175,8 ml de gua destilada em
uma proveta e acrescente 124,2 ml de HCl.
c) Guarde em recipiente bem fechado.
5.5 - Carmim actico a 2% - 100 ml
a) Dissolva 2 g de carmim em uma soluo contendo 55 ml de gua
destilada e 45 ml de cido actico glacial.
b) Deixe fervendo em um condensador de refluxo por 2 a 3 horas.
c) Deixe esfriar, filtre e guarde a soluo em recipiente fechado.
5.6 - Hematoxilina actica a 1% - 100 ml
a) Dissolva com um basto de vidro 1 g de hematoxilina e 0,25 g de
almem frrico em 100 ml de cido actico a 45%.
b) Coloque a mistura em um vidro escuro tampado com uma chumao
de algodo, em ambiente aberto para evitar os gases. Aps uma semana,
filtre a soluo e conserve em vidro escuro fechado.
5.7 - Orcena actica a 2% - 100 ml
a) Dissolva 2 g de carmim em uma soluo contendo 55 ml de gua
destilada e 45 ml de cido actico glacial.
b) Deixe fervendo (de preferncia em um condensador de refluxo) por
2 a 3 horas.
c) Deixe esfriar, filtre e guarde a soluo em recipiente fechado.
62
5.8 - Soluo corante de Giemsa (soluo estoque) - 66 ml

a) Dissolva 0,5 g do corante de Giemsa em p em 33 ml de glicerina
a 60 C em banho-maria por 2 horas.
b) Depois que a soluo esfriar, adicione 33 ml de lcool metlico,
guarde em vidro escuro bem fechado por uma semana e, em seguida, filtre
e mantenha em vidro escuro.
5.9 - Giemsa a 2% (soluo de uso) - 100 ml
- Misture 2 ml da soluo estoque de Giemsa (ou da soluo comprada
pronta) e 98 ml de tampo fosfato pH 6,8. Para uso rotineiro, a diluio pode
ser feita em gua destilada.
5.10 - Reativo de Schiff - 400 ml
Na literatura h diversas maneiras diferentes de preparar o reativo de
Schiff, utilizando os mesmos componentes. Aqui so apresentados dois
protocolos diferentes. Dependendo da qualidade dos produtos utilizados,
um dos dois pode apresentar colorao cromossmica mais intensa.
Protocolo 1 (baseado em Greilhuber e Ebert, 1994)
a) Dissolva 2 g de fucsina bsica em 60 ml de HCl 1N.
b) Dissolva 7,6 g de metabissulfito de sdio (Na2S2O5) em 340 ml de
gua destilada.
c) Misture as duas solues em um Erlenmeyer, com agitador magntico por no mnimo 3 1/2 horas.
d) Adicione aproximadamente 1 g de carvo vegetal soluo. Agite
bastante e filtre com a ajuda de uma bomba de vcuo.
e) Repita a etapa anterior duas vezes ou mais, sempre adicionando
mais carvo, at o filtrado ficar perfeitamente incolor e cristalino.
f) Verifique o pH, que deve estar entre 1,9 e 2,2. Ajuste com HCl ou
NaOH.
g) Guarde na geladeira em frasco escuro ou coberto com papel
alumnio.
Protocolo 2 (baseado em Garcia, 1990)
a) Coloque 400 ml de gua destilada em um Erlenmeyer e aquea ao
ponto de ebulio.
63
b) Acrescente 0,8 g de fucsina bsica e 0,8 ml de cido clordrico

concentrado. Tampe o Erlenmeyer com uma placa de vidro e coloque a
soluo no agitador magntico durante 20 minutos.
c) Acrescente 16 g de metabissulfito de sdio soluo e agite por
mais 30 minutos.
d) Acrescente 3,2 g de carvo ativado e agite por mais 45 minutos.
e) Deixe o carvo decantar por 1 a 2 horas e filtre.
f) Verifique se o pH est entre 1,9 e 2,2. Ajuste com HCl ou NaOH.
g) Guarde na geladeira em frasco escuro ou coberto com papel alumnio.
Ateno:
O metabissulfito de sdio pode ser substitudo por 8,9 g de
metabissulfito de potssio (K2S2O5) para o mesmo volume de soluo.
O metabissulfito de sdio ou potssio voltil e muito txico. Por
essa razo, o preparo do reativo de Schiff deve ser inteiramente
realizado em capela.
Se a soluo apresentar colorao rsea ou outra qualquer, deve ser
eliminada.
Para usar o corante, retire-o do frasco de preferncia por meio de
uma pipeta bem limpa e seca, ao invs de verter o frasco.
5.11 - gua sulfurada - 300 ml
- Dilua 18 ml de uma soluo 1% de metabissulfito de sdio (1 g de
Na2S2O5 dissolvido em 100 ml de gua destilada) em 300 ml de gua destilada e acrescente 15 ml de HCl 1N.
5.12 - Tampo fosfato pH 6,8 (tampo de Sorensen) - 2 litros de
solues estoque
a) Solues estoque:
- Soluo A. Dissolva 9,079 g de fosfato de potssio (KH2PO4) em cerca
de 500 ml de gua destilada e complete posteriormente para um litro. Guarde na geladeira.
- Soluo B. Dissolva 11,876 g de fosfato de sdio bi-hidratado
Na2HPO4.2H2O em cerca de 500 ml de gua destilada e complete posteriormente para um litro. Guarde na geladeira.
b) Soluo de uso (100 ml):
- Misture 50,9 ml da soluo A com 49,1 ml da soluo B.
Ateno:
Os tampes em geral, principalmente as solues de uso, no po-
64
dem ser estocadas por muitos meses, porque facilmente fungam. Verifique sempre se aparecem pequenos flocos brancos na soluo (nesse caso, deve ser substituda por uma nova soluo).
A soluo de uso de todos os tampes deve ter o pH indicado no
protocolo. Contudo, importante checar o pH dessas solues e, se
necessrio, ajustar com HCl ou NaOH.
5.13 - Tampo McIlvaine pH 7,0 - 2 litros de solues estoque
a) Solues estoque:
- Soluo A: Dissolva 21,14 g de cido ctrico mono-hidratado
(C6H8O7.H2O) em 500 ml de gua destilada e posteriormente complete para
um litro (0,1M).
- Soluo B: Dissolva 28,39 g de fosfato de sdio (Na2HPO4) ou 71,63 g
de Na2HPO4.12H2O em 500 ml de gua destilada e posteriormente complete
para um litro (0,2M).
b) Soluo de uso (100 ml):
- Misture 17,6 ml de A com 82,4 ml de B.
5.14 - Tampo McIlvaine pH 5,5 - 20 ml
a) Esse tampo utilizado no preparo do Hoechst e constitudo das
mesmas solues do tampo McIlvaine pH 7,0, mudando apenas as propores.
b) Misture 9 ml de cido ctrico 0,1M (soluo A do item anterior) com
11 ml de fosfato de sdio 0,2M (soluo B).
5.15 - Tampo citrato-fosfato pH 4,8 - l litro
- Dissolva 10,5 g de cido ctrico monohidratado (C6H8O7. H2O) e 32,25
g de fosfato de sdio dibsico doze vezes hidratado [Na2HPO4. 12(H2O)] em
500 ml de gua destilada e posteriormente complete para um litro. O ltimo
composto pode ser substitudo por 12,76 g de fosfato de sdio dibsico
anidro (Na2HPO4).
5.16 - 20xSSC - 1 litro
a) Dissolva em um bquer, no agitador magntico, 175,6 g de cloreto
de sdio (NaCl) e mais 88,2 g de citrato de sdio bihidratado (C6H5Na3O7
.2H2O) em cerca de meio litro de gua destilada.
b) Complete com gua destilada at um litro e agite at a completa
dissoluo.
c) Guarde na geladeira. Verifique sempre se no surgem fungos na
soluo.
65
5.17 - 2xSSC - 100 ml

a) Dilua 10 ml de 20xSSC em 90 ml de gua destilada.
b) Agite antes de utilizar.
5.18 - Soluo de celulase 2% - pectinase 20% - 20 ml
a) Dissolva 0,4 g de celulase em 4 ml de pectinase.
b) Complete para 20 ml com tampo citrato-fosfato pH 4,8.
c) Divida os 20 ml em 10 tubos de Eppendorf de 2 ml cada e mantenha-os no congelador.
Ateno:
Essas concentraes indicadas se referem celulase de Aspergillus
(100.000 unidades da Calbiochem 21947) e pectinase da Sigma (j
fornecida diluda em glicerol 40%). Enzimas de outras marcas, com
atividade diferente, devem ser testadas em diferentes propores e
concentraes at produzirem um efeito semelhante.
5.19 - Soluo saturada de hidrxido de brio - 120 ml
a) Aquea 120 ml de gua destilada at a ebulio e adicione rapidamente 5 g de hidrxido de brio.
b) Agite com o auxlio de um basto de vidro e deixe esfriar.
Ateno:
Esta soluo deve ser preparada em uma capela. Quando em contato
com a gua quente, o brio pode efervescer rapidamente, transbordar
e causar um acidente.
5.20 - DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) 2 g/ml - 10 ml de soluo
estoque
a) Soluo estoque (100x):
- Dissolva 2 mg de DAPI em 10 ml de gua destilada. Divida em alquotas
e conserve no freezer.
b) Soluo de uso (2g/ml):
- Dilua 100 l da soluo estoque em 10 ml de tampo McIlvaine pH
7,0. Divida em alquotas e guarde no freezer.
Ateno:
Dependendo do material, concentraes mais diludas (1 ou 0,5 g/
ml) podem dar melhor resultado.
66
Tanto a soluo estoque quanto a de uso devem ser mantidas no

freezer. A soluo estoque deve ser dividida em pequenas alquotas,
em tubos de Eppendorf de 1 a 2 l cada, mantidas no freezer e utilizadas
at o final, uma a uma.
5.21 - CMA (Cromomicina A3) 0,5 mg/ml - 10 ml
a) Dissolva 5 mg de CMA em 10 ml de uma mistura 1:1 de tampo
McIlvaine pH 7,0 e gua destilada.
b) Acrescente 10 l de MgCl2 5M ou utilize um tampo contendo 10
mM de MgCl2 (0,2033 g de MgCl2.6H2O em 100 ml de tampo).
c) Prepare essa soluo pelo menos uma semana antes de ser utilizada e guarde na geladeira.
5.22 - AMD (Actinomicina D) 0,2 mg/ml - 5 ml
a) Dissolva 1 mg de AMD em 5 ml de tampo McIlvaine pH 7,0.
b) Acrescente 1 mM de EDTA, agite, divida em alquotas e guarde no
freezer.
5.23 - DA (Distamicina A) 0,1 mg/ml - 10 ml
a) Dissolva 1 mg de distamicina A em 10 ml de tampo McIlvaine
pH 7,0.
b) Divida em alquotas de 2 ml e conserve no freezer.
5.24 - Hoechst 0,5 g/ml - 2 ml de soluo estoque
a) Soluo estoque (50 g/ml):
- Dissolva 100 g de Hoechst 33258 em 2 ml de gua destilada. Conserve no freezer
b) Soluo de uso (0,5 g/ml):
- Dilua 0,1 ml da soluo estoque em 9,9 ml de tampo McIlvaine
pH 7,0.
- Divida os 10 ml da soluo de uso em alquotas e guarde no freezer.
Ateno:
Como a concentrao de Hoechst utilizada muito baixa, fica difcil
pesar com preciso os poucos microgramas. Nesse caso, mais prtico
pesar o mnimo possvel do Hoechst em p, conferir o peso exato e, a
partir dessa quantia, preparar o volume correspondente de soluo
estoque na proporo de 50 g/ml.
Alguns autores usam concentraes duas a cem vezes mais altas
67
que o sugerido aqui. Entretanto, solues entre 0,5 e 2 mg parecem

adequadas para corar bem qualquer tipo de cromossomo.
5.25 - Quinacrina 0,5% - 10 ml
a) Dissolva 0,05 g de quinacrina di-hidroclordrica em 10 ml de gua
destilada
b) Divida em alquotas e conserve na geladeira
5.26 - Iodeto de propdeo 1 g/ml - 10 ml de soluo estoque
a) Soluo estoque (100 g/ml):
- Dissolva 1 mg de iodeto de propdeo em 10 ml de gua destilada.
Divida em alquotas e conserve no freezer.
b) Soluo de uso (1 g/ml):
- Dilua 10 l da soluo estoque em 1 ml de gua destilada. Conserve
no freezer.
5.27 - Meio de montagem glicerol/McIlvaine 1:1 (para
fluorocromos) - 50 ml
a) Misture 25 ml de tampo McIlvaine pH 7,0 em 25 ml de glicerol
para fluorescncia (ou glicerol comum).
b) Guarde na geladeira.
Ateno:
Quando esse meio de montagem for usado para lminas coradas
com CMA ele deve conter 2,5 mM de cloreto de magnsio. Para isso,
acrescente 0,1017 g de MgCl2.6H2O em 100 ml de tampo. Agite
bastante e guarde na geladeira.
Esse meio pode ser usado para qualquer fluorocromo, embora apenas
para as lminas coradas com CMA seja importante a presena de cloreto
de magnsio.
Todas as solues de fluorocromos, assim como o meio de
montagem, devem ser usados temperatura ambiente.
68
6 Como revelar os filmes fotogrficos

Em citogentica, a documentao fotogrfica muito importante para a
anlise comparada dos resultados e principalmente para a apresentao
dos dados. A revelao e cpia dos filmes preto-e-branco bastante simples e deve ser feita pelo prprio pesquisador ou por pessoal especializado nesse tipo de fotografia.
A qualidade do filme depende fundamentalmente do tamanho mdio
dos gros de prata, que definem sua sensibilidade indicada por uma unidade padro denominada ASA ou ISO. Como as marcas de filmes fotogrficos
disponveis no comrcio mudam com o lugar ou o tempo, mais importante considerar a sensibilidade do filme adequado para cada situao. Filmes
com gros muito finos (ASA 25, por exemplo) apresentam baixa sensibilidade luz e exigem um tempo de exposio fotogrfica relativamente longo.
Esses filmes apresentam um alto contraste e so indicados para a
microscopia de campo claro em geral. Por outro lado, filmes com gros
mais grossos (ASA 400, por exemplo) possuem maior sensibilidade luz e
necessitam um tempo de exposio menor para sensibilizar (queimar) adequadamente todos seus gros. Estes filmes apresentam um menor contraste e podem produzir imagens granuladas. Apesar dessas desvantagens,
so muito recomendados para fotografar cromossomos corados com determinados fluorocromos, como o CMA ou o FITC, que perdem o brilho rapidamente quando expostos luz ultravioleta. Fluorocromos que no perdem o
brilho com a exposio, como o DAPI em uma colorao cromossmica
direta, podem ser fotografados com filmes de baixa sensibilidade.
A sensibilidade da maioria dos filmes pode ser um pouco alterada,
modificando-se o tempo de exposio e o processo de revelao. Alm
disso, alguns filmes, como o Kodak Technical Pan, possuem sensibilidade
varivel, podendo ser utilizados para alto e baixo contraste, dependendo
da revelao utilizada. Assim, possvel utilizar esse filme tanto para ASA
25 quanto para ASA 400.
Os papis fotogrficos tambm podem apresentar alto ou baixo contraste. Em geral, utiliza-se papis de alto contraste, mas papis de baixo
contraste tambm so muito teis para amenizar o contraste excessivo de
determinados filmes negativos. Alguns papis podem ter seu contraste ajustado mediante o uso de filtros acoplados ampliadora fotogrfica.
Abaixo esto indicados alguns tipos de reveladores, fixadores e filmes comumente utilizados para fotografia em preto-e-branco. Outros filmes, com idntica sensibilidade, podero ser utilizados e revelados de
maneira similar.
6.1 - Reveladores e fixadores mais comuns
6.1.1 - Revelador Dektol - 1 litro de soluo estoque
a) Prepare um litro de soluo estoque de revelador Dektol (Kodak)
segundo instrues na embalagem.
69
b) Prepare um litro de soluo de uso diluindo a soluo-estoque em

gua de torneira na proporo de 1 de revelador para 2 de gua.
c) Mantenha ambas as solues na geladeira.
Ateno:
O volume a ser utilizado depende das dimenses do tanque de revelao. Em geral, 300 ml so suficientes para mergulhar completamente o filme no revelador. Essa soluo deve ser preparada na quantidade necessria para uso e guardada em recipiente separado para
ser reutilizada.
6.1.2 - Revelador Microdol 1 litro de soluo estoque
a) Prepare um litro de soluo estoque do revelador Microdol (Kodak)
segundo instrues na embalagem e mantenha na geladeira.
b) Prepare a soluo de uso diluindo o estoque na proporo 1:3 (75
ml da soluo estoque + 225 ml de gua).
6.1.3 - Revelador HC-110 (para filme de ASA 400)
a) Soluo estoque:
- Dissolva a soluo de HC-110 (Kodak) em gua de torneira na proporo de 1:3 (100 ml de revelador em 300 ml de gua).
b) Soluo para uso:
- Dissolva a soluo estoque na proporo de 1:7 em gua.
6.1.4 - Fixador universal - 1 litro
a) Dissolva 200 g de hipossulfito de sdio e 20 g de metabissulfito de
potssio em cerca de 800 ml de gua de torneira em um bquer de 1 litro.
Agite com um basto de vidro ou em um agitador magntico.
b) Aps completa dissoluo dos cristais acrescente mais gua, at
completar 1 litro.
Ateno:
Esse fixador dito universal por ser utilizado para qualquer tipo de
filme ou papel fotogrfico. Como o produto relativamente barato, na
maioria dos laboratrios esse fixador comprado pronto e dissolvido
conforme indicaes na embalagem.
Para a fixao de filmes, o fixador deve ser usado apenas uma vez.
Esse mesmo fixador poder ser estocado em garrafa apropriada e
reutilizado vrias vezes na fixao de papel fotogrfico at apresentar
turbidez ou colorao mais escura.
70
6.2 - Cuidados com os reveladores e fixadores

a) Reveladores e fixadores devem ser guardados na geladeira e substitudos quando apresentarem colorao amarelo-escura, turbidez
ou precipitao.
b) Certifique-se de que os frascos onde armazena essas solues fiquem sempre bem fechados. O contato com o ar oxida mais rapidamente
essas solues diminuindo sua vida til.
c) O revelador Dektol, utilizado na revelao de filme Copex ou Imagelink, pode ser reutilizado vrias vezes, desde que no apresente alterao visvel. Para revelao de papel fotogrfico, pode-se usar um revelador
j utilizado para filme, uma vez que na revelao do papel o tempo de
revelao controlado visualmente. Em todo caso, o revelador deve ser
substitudo sempre que o tempo de revelao do papel se tornar mais longo que o usual.
d) recomendvel dispor ao menos das seguintes solues de uso
em garrafas etiquetadas: 1) Revelador para filme de ASA 25; 2) Revelador
para filme de ASA 400; 3) Revelador Dektol para papel; 4) Fixador para filme; 5) Fixador para papel.
6.3 - Revelao dos filmes mais comumente utilizados
6.3.1 - Filme Copex Pan Agfa ou Imagelink Kodak (ASA 25)
a) Revele em Dektol por 5 a 6 minutos (testar) temperatura de 18 C,
virando o tanque a cada minuto ou agitando freqentemente o tanque de
revelao. Devolva o revelador para a garrafa de revelador usado.
b) Encha o tanque com gua de torneira, agite bastante e elimine a
gua.
c) Fixe por 15 minutos e lave por 1 hora em gua corrente.
Ateno:
Esses filmes no so especficos para ASA 25, mas produzem bons
resultados quando revelados nas condies indicadas acima.
A tonalidade desse filme, como de qualquer outro, pode ser intensificada modificando-se cuidadosamente o tempo ou a temperatura de
revelao.
Pode tambm ser usado o revelador HC-110 da Kodak, diludo em
gua de torneira na proporo de 1:50 (v/v). O tempo de revelao de
12 minutos a 20 C, agitando a intervalos regulares. Esse revelador
deve ser usado uma s vez e jogado fora.
6.3.2 - Filme T-Max ou Tri-X Pan Kodak (ASA 400)
71
a) Revele o filme no Microdol a 24 C, virando o tanque a cada

minuto ou agitando freqentemente o tanque de revelao durante 14 a 16
minutos (testar). Pode tambm utilizar o HC-110 a 21 oC por 7 minutos e
meio. Aps o uso, descarte o revelador, encha o tanque de revelao com
gua de torneira e agite fortemente.
b) Retire a gua e acrescente o fixador universal por 15 minutos
temperatura ambiente.
c) Remova o fixador e lave por 1 hora em gua corrente.
6.3.3 - Filme Panatonic X ou T-Max Kodak (ASA 100)
- Procedimento igual ao indicado para filmes de ASA 400, apenas o
tempo de revelao deve ser alterado, passando a ser de 6 minutos a 20 C.
72
7 - Como organizar melhor seu laboratrio

e apresentar seus resultados
Antes de encerrar essa primeira parte, deixamos algumas sugestes
de ordem prtica, visando a auxiliar na rotina do laboratrio e na organizao e apresentao dos dados obtidos.
Diferentes laboratrios tm encontrado as mais diversas solues para
trabalhar com maior eficincia, evitando desperdcio de material e contornando pequenos problemas. O pesquisador no deve sentir-se desconfortvel por precisar improvisar para contornar a falta de determinados equipamentos ou vidrarias apropriadas, desde que isso no comprometa a qualidade e fidelidade dos resultados obtidos. Em muitos dos laboratrios mais
produtivos so freqentes o improviso e as medidas para diminuir os gastos. Uma ateno especial deve ser dada ao registro fotogrfico, que na
citogentica atual muito importante e nem sempre os iniciantes se apercebem dos cuidados que precisam tomar. Freqentemente, s se percebe
os cuidados que devem ser tomados com o registro fotogrfico no momento da publicao ou anos depois, quando se precisa de uma foto original
para ilustrar determinado tema. Abaixo esto indicadas algumas solues
encontradas na rotina do nosso laboratrio que podero ser teis para aqueles que esto se iniciando na pesquisa em citogentica vegetal ou animal.
7.1 - Cuidados gerais com os protocolos
A maioria das tcnicas bem estabelecidas, como as coloraes convencionais, funcionam muito bem em praticamente qualquer material e em
qualquer laboratrio, enquanto tcnicas como o bandeamento C podem
exigir algum ajuste. Em princpio, deve-se sempre seguir fielmente o protocolo e no considerar que a tcnica no funciona para determinado material antes de repet-la ao menos trs vezes ou com algum com experincia
nessa tcnica. Lembre-se que a maioria das tcnicas exige um mnimo de
prtica e vrias no tm 100% de repetibilidade. Caso necessite fazer ajustes, altere apenas uma etapa de cada vez (por exemplo, apenas o tempo
de envelhecimento da lmina, no bandeamento C).
Alguns autores descrevem, na metodologia empregada, infindveis
detalhes, como numerosas lavagens, fraes de tempo e temperatura muito precisas, produtos de marca e estoques especficos, etc, parecendo assim extremamente meticulosos. Essas variantes tcnicas muito minuciosas raramente foram definidas com base em experimentos adequadamente
controlados e repetidos, e s muito raramente tm alguma importncia para
a repetio da tcnica por outro pesquisador.
Assim, para a rotina do laboratrio, procure sempre as alternativas de
protocolo mais simples, tornando sua rotina mais gil e produtiva. Por exemplo, a soluo de Giemsa normalmente pode ser preparada com gua destilada, evitando, nesse caso, ter que preparar tampo fosfato. Entretanto, se
ao tentar dessa forma uma tcnica j conhecida, no obtiver bons resulta-
73
dos, volte ao protocolo com o mximo de rigor, procurando inclusive utilizar solues qumicas novas e de qualidade comprovada.
7.2 - Preparao da bancada
Antes de iniciar o trabalho, verifique se tudo o que vai precisar (banhomaria a 60 C, soluo de uso do tampo, nitrognio lquido, corante, etc)
est disponvel, em quantidade suficiente e em bom estado de uso. Cada
pesquisador deve possuir seu prprio estojo com o kit bsico para preparar lminas contendo ao menos agulhas (seringas de insulina so muito
boas) ou estiletes, pina fina, bloco de papel filtro, placa escura (muito til
para preparar lminas sem colorao), caneta para retroprojetor, etc. Limpe
com lcool todas as lminas e lamnulas que vai utilizar e equipe a bancada
ou o seu espao de trabalho com tudo o que vai precisar. Uma tbua de
madeira, com aproximadamente um centmetro de espessura, por oito de
largura e 15 de comprimento, contendo ranhuras inclinadas, fundas e paralelas, muito til para apoiar convenientemente as lminas e lamnulas
limpas e para secar ao ar as preparaes aps a retirada da lamnula.
7.3 - Anotaes gerais no laboratrio
muito importante ter ao menos trs cadernetas no laboratrio: uma
para tcnicas, outra para resultados e uma terceira para anotar coordenadas do microscpio. Na caderneta de tcnicas, deve ser anotado exatamente como as tcnicas foram feitas (h sempre uns detalhes no previstos nos
protocolos e umas modificaes sugeridas por diferentes autores). Essa
caderneta deve ainda conter informaes sobre os produtos e equipamentos utilizados (marca, modelo, capacidade, frmula qumica, etc). Essas informaes podero ser muito teis meses ou anos depois.
A caderneta de resultados deve conter todas as observaes dirias
da pesquisa. aconselhvel colocar data em tudo o que fizer (nas cadernetas, nas etiquetas de fixao, nos vidros de solues, nas lminas, nos
filmes, etc). Alm de indicar quando foi realizado cada procedimento, essa
rede de datas pode ajudar a reconstituir situaes e evitar pequenas falhas de anotaes. Uma regra fundamental no laboratrio nunca delegar
prpria memria a funo de guardar quaisquer dados.
A caderneta de coordenadas contm apenas as coordenadas das clulas analisadas, com indicaes ao lado ajudando a reconhecer a clula
ou chamando a ateno para algum detalhe. Observe que as coordenadas
de um charriot (as duas rguas atrs e ao lado da lmina no microscpio)
s valem para aquele microscpio. Portanto, necessrio anotar tambm
em qual microscpio foram feitas as coordenadas.
Para aqueles trabalhos que incluem coletas de plantas no campo,
muito importante ter ainda uma caderneta de registro de plantas, contendo todos os dados relativos planta e local de coleta, alm da data e nome
do coletor (raramente o autor do trabalho o coletor de todas as plantas
que analisa). Cada espcie ou populao diferente deve receber um nmero diferente. Indivduos diferentes da mesma populao devem ter o mes-
74
mo nmero seguido do numeral 1, 2, etc, separados por barra ou trao.

Esse nmero deve ser o mesmo contido na etiqueta de fixao e deve
constar nas lminas que forem preparadas desse material.
7.4 - Reutilizao de lminas e lamnulas
Lminas e lamnulas podem ser reutilizadas diversas vezes, exceto se
contiverem falhas ou arranhes. Cada pesquisador deve ter seu prprio
frasco para lamnulas usadas, assim cada um controla melhor a qualidade
de seus materiais. As lminas usadas podem ser mantidas em lcool em
um depsito etiquetado de uso comum do laboratrio. Isso se aplica principalmente a lminas que no foram montadas em meio rgido, como o blsamo do Canad ou similares. Embora esses meios possam ser removidos
em xilol, o trabalho e a qualidade da lmina resultante nem sempre compensam. Para tcnicas que envolvem muitas etapas e/ou no apresentam
repetibilidade de resultados elevada, como o bandeamento C, por exemplo, recomendado o uso de lminas e lamnulas novas, exceto se essas
tcnicas j forem bem dominadas pelo pesquisador.
7.5 - Descarte de cidos e substncias txicas
As solues cidas mais freqentemente utilizadas na citogentica
vegetal (cido actico a 45%, fixador Carnoy, HCl 5N e 1N) no devem ser
descartadas na pia, mas sim estocadas em garrafas de vidro de 1 litro, bem
fechadas, e posteriormente descartadas em local de difcil acesso rede
fluvial. Antes de ser descartada, essa mistura de cidos pode ser utilizada
na limpeza de vidrarias e na inativao de substncias txicas. Toda a vidraria em contato com corantes, hidrxido de brio e outras substncias que
aderem ao vidro, pode ser mais facilmente limpa se passada primeiramente em uma soluo cida. Igualmente, substncias muito txicas, como a 8hidroxiquinolena e os fluorocromos, no devem ser descartadas diretamente na pia, mas primeiramente misturados com cidos, para perderem a
atividade, e depois descartados longe da rede fluvial.
Alm dessas garrafas, importante ter tambm no balco um ou dois
recipientes de vidro de boca larga, com tampa e capacidade para cerca de
2 a 3 litros. Esses depsitos so teis na retirada das lamnulas com fluorocromos ou com hematoxilina, utilizando um jato de gua, como por exemplo nos procedimentos 3.3.2 e 4.3. prefervel ter um depsito de descarte s para fluorocromos em geral. Antes que esse depsito chegue na metade de sua capacidade deve ser acrescido de igual volume da mistura
cida e posteriormente descartado. As lamnulas acumuladas no fundo desse depsito no devem ser reutilizadas, exceto se extensamente lavadas
em gua corrente.
7.6 - Conservao de corantes e lminas coradas
Todos os corantes devem ser guardados em vidro escuro. As lminas
coradas tambm devem ser guardadas em caixas apropriadas, igualmente
75
protegidas da luz. A exposio luz contribui fortemente para descorar os

pigmentos em geral, ligados aos cromossomos ou a qualquer outra estrutura. O meio de montagem e a temperatura elevada tambm contribuem para
descorar o Giemsa (corantes acticos so muito menos sensveis). Alguns
meios de montagem, como o Entellan, descoram menos o Giemsa. As lminas que se deseja guardar por muito tempo, podem ser melhor conservadas em uma caixa de lminas na geladeira.
7.7 - Observao de uma clula em diferentes microscpios
Para localizar em um microscpio as clulas observadas em outro microscpio, necessrio usar uma lmina acessria com a posio da clula
marcada, uma vez que as coordenadas do charriot so diferentes para
cada microscpio. Para isso, deve-se utilizar uma lmina branca ou similar.
A lmina branca uma lmina comum de microscopia com uma fita de
papel branco colada em cima.
Para marcar a posio de uma clula na lmina branca localize primeiro a clula no microscpio, substitua essa lmina pela lmina branca, feche
o diafragma do condensador (localizado logo abaixo da lmina) deixando
apenas um ponto de luz no papel e, com um grafite, faa um ponto no
centro da rea iluminada. Volte novamente para a preparao e certifiquese de que aquele ponto est corretamente marcado e que no houve deslocamento do charriot. Leve a lmina branca para outro microscpio, feche
o diafragma e coloque o ponto preto no centro da rea iluminada no papel
da lmina. Certifique-se, com a objetiva de menor aumento, de que o ponto
preto esteja exatamente no centro do campo. Nesse caso, substitua a lmina branca pela preparao com a clula, abra o diafragma do condensador
e localize a clula. Em todo esse procedimento, fundamental que a lmina tenha sido sempre colocada bem encostada no charriot, caso contrrio
ser difcil reencontrar a clula.
Cada lmina branca pode conter vrios pontos, identificados por letras
ou nmeros. Alternativamente, pode-se utilizar uma lmina especial, denominada England finder, contendo uma gravao no vidro com uma srie
de letras e nmeros muito pequenos. Substituindo-se a lmina da preparao pela England finder possvel fazer uma descrio segura da posio
da clula na lmina, a qual poder ser localizada em qualquer outro microscpio. Essa lmina tem como nica desvantagem o preo elevado. As lminas brancas podem ser preparadas utilizando lminas que no servem mais
para ser reutilizadas.
7.8 - Cuidados com a fotografia
Para fotografar em cores, principalmente clulas coradas com Giemsa,
prefervel fazer a foto no mesmo dia da colorao. Aps poucos dias as
cores podem ficar menos vivas ou mesmo descoradas. Fotos coloridas devem ser feitas com filtro neutro, azul-claro. Nunca use filtro verde ou de
outra cor para fotos coloridas. Fotos em preto e branco ficam geralmente
melhor contrastadas com filtro verde, especialmente quando os cromosso-
76
mos esto corados em vermelho ou uma cor prxima a esta. Se os cromossomos tiverem colorao azulada, o contraste com o filtro verde poder ser
inferior ao esperado. Nesse caso, o contraste dos cromossomos poder
ser melhorado utilizando um filtro amarelo ou alaranjado. Como o filme
tem sensibilidade diferente a cores diferentes, o tempo ideal de exposio
do filme dever ser testado, ajustando a mquina fotogrfica para diferentes valores de ASA, at obter o mesmo tom de preto e branco que obtinha
nas demais fotos. importante lembrar que o que aparece bem contrastado para a nossa vista no necessariamente o que produz melhor contraste no filme fotogrfico.
7.9 - A escolha dos filmes
Filmes de baixa sensibilidade (ASA 25 ou 32) produzem, em geral,
fotos mais contrastadas com qualquer tipo de colorao. Entretanto, trabalhando com fluorocromos que perdem o brilho rapidamente quando expostos luz ultravioleta, como por exemplo a cromomicina A, deve-se utilizar
de preferncia filmes com gros de prata mais grossos e mais sensveis
(ASA 400 ou mais), que exigem um tempo muito menor de exposio. A
imagem obtida com esses filmes pode ser um pouco granulada, mas o resultado quase sempre melhor do que com filmes de baixa sensibilidade.
O tempo de exposio ideal, para fotografia em ultravioleta, depende do
tipo de fluorocromo usado, da intensidade da colorao e do tamanho dos
cromossomos. Portanto, esse tempo geralmente tem que ser determinado
experimentalmente, usando o controle manual do sistema fotogrfico. Com
a prtica, se adquire uma noo do tempo aproximado para cada situao.
Os filmes coloridos, negativos (para impresso em papel) ou positivos (para
eslaides), mais comumente usados so os de ASA 100 e 400, para
microscopia de campo claro e fluorescncia, respectivamente. O tempo
ideal de exposio para uma determinada clula o mesmo com filme
preto-e-branco ou colorido, desde que a ASA seja a mesma.
7.10 - Organizao da documentao fotogrfica
fundamental que os resultados obtidos durante a pesquisa sejam constantemente organizados para permitir uma anlise final dos dados de maneira
fcil e correta. Para isso, certifique-se de que os filmes negativos estejam adequadamente guardados e identificados, protegidos de umidade e poeira. Faa
uma cpia pequena de cada negativo, cole as fotos numa folha de papel branco (de preferncia papel 40 kg) e anote todos os dados importantes do material, ao lado ou em cima de cada foto, destacando as particularidades enfocadas
(satlites, regies heteropicnticas, bandas, etc). mais rpido e mais econmico fazer uma cpia de todos os negativos de um filme em uma nica folha
de papel fotogrfico. Para isso, os negativos devem ser organizados em cima
de uma folha de papel fotogrfico, coberto com um vidro limpo e sem arranhes e exposto luz da ampliadora por um tempo previamente testado em
um dos negativos. Essa cpia lhe dar uma boa idia de suas fotos, embora
uma ou outra foto deva ser ampliada para visualizao de algum detalhe.
77
No acumule filmes que no foram revelados e/ou copiados. Observe

nas cpias se h alguma sujeira nas lentes do microscpio que deva ser
removida. Verifique nas fotos que tm grande chance de virem a ser
publicadas, se h alguma falha que possa ser evitada ou se seria possvel
melhorar o contraste ou a centralizao da clula. Algumas semanas aps,
poder ser impossvel refazer as fotos para corrigir pequenas falhas.
7.11- Seleo de fotos para publicao
Selecionar fotos para uma publicao pode parecer uma tarefa simples mas exige bastante ateno, uma vez que alm do contedo tcnico
as fotos devem apresentar tambm uma esttica prpria da citogentica. A
seleo de fotos deve se basear nos seguintes princpios: a) as fotos devem ilustrar claramente os resultados relatados; b) os cromossomos devem ter o mnimo de superposio e permitir visualizar bem as constries;
c) os cromossomos devem prioritariamente estar bem focados, ntidos e
bem contrastados contra um fundo branco ou gelo (fotos de fluorescncia
devem ter um fundo preto uniforme, mas o mais importante que os cromossomos e as bandas estejam bem visveis e contrastados); d) fotos que
apresentem algum tipo de sujeira (cromossomos de outra clula, poeira
nas lentes do microscpio, bolhas de ar, etc) devem ser sistematicamente
evitadas. Fotos com cromossomos desfocados ou fundo muito escuro,
embora possam ser devidas s condies tcnicas de que se dispe, desvalorizam muito o trabalho e so geralmente interpretadas como desleixo e
impercia do autor.
7.12 - Montagem de fotos em uma prancha
A montagem de uma prancha pode demorar horas e exige um certo
planejamento. Antes de cortar as fotos para a prancha considere as seguintes sugestes: a) desenhe numa folha de papel branco um retngulo da
prancha nas dimenses desejadas ou permitidas pelo veculo de publicao; b) divida a prancha no nmero de retngulos correspondentes s fotos
que pretende incluir, sempre que possvel, em espaos regulares, procurando preencher toda a prancha; c) use uma ampliao suficiente para mostrar bem seus resultados. Ampliaes excessivas, alm de freqentemente diminurem a nitidez das fotos, no so bem vistas pelos editores (a
reproduo fotoltica a parte mais cara da publicao); d) procure apresentar todas as fotos numa mesma ampliao, mesmo quando a revista no
impe essa restrio; e) evite cortar as fotos muito prximo aos cromossomos. Isso atrapalha a individualizao de cada foto dentro da prancha e
causa a sensao de que o autor procurou retirar no corte outros cromossomos ou imperfeies ao lado da clula; f) ao colocar a foto na prancha,
escolha a melhor posio da foto, certificando-se de que o canto onde aparecer a letra ou nmero da foto esteja limpo, garantindo sua perfeita
visualizao; g) sempre que possvel, utilize uma nica barra de escala
para toda a prancha. A barra de escala deve ter um tamanho prximo ao dos
cromossomos apresentados; h) letras, setas e outros acrscimos na foto
78
devem ter um tamanho discreto, que no chame mais a ateno para si do

que para os cromossomos. Evidentemente, nem sempre se consegue preencher todos esses requisitos.
Alguns peridicos solicitam que as fotos sejam enviadas soltas e no
montadas em pranchas. Mesmo assim, prefervel simular a montagem
completa das fotos e enviar as fotos soltas, cortadas no tamanho certo e
numeradas no verso.
Um bom truque para cortar as fotos, corretamente enquadradas e nos
tamanhos certos, utilizar como referncia a prpria folha de papel com as
divises em retngulos (itens a e b anteriores). Para isso, fixe a folha com
os retngulos no vidro de uma janela bem iluminada ou em um megatoscpio
(caixa com lmpadas fluorescentes coberta com uma tampa de vidro fosco)
e sobreponha a foto que deseja cortar em cima do retngulo correspondente, ficando o verso da fotografia voltado para o observador. O retngulo de
papel e a imagem dos cromossomos devem ficar simultaneamente visveis, permitindo enquadrar corretamente a foto no retngulo. Agora, com o
auxlio de pequenas etiquetas autocolantes ou fita adesiva, fixe a foto em
cima do papel, na posio ideal. Com a juda de uma rgua ou esquadro,
desenhe o retngulo no verso da foto. Leve a foto para a guilhotina e recorte-a com cuidado. Para produzir um corte absolutamente seguro com a guilhotina, coloque a foto com as marcas do retngulo para baixo e, com um
espelho debaixo do local de corte da guilhotina, ajuste as marcas da foto
precisamente em cima da linha de corte. Nas fotos de fluorescncia, com
fundo preto, impossvel visualizar as linhas do retngulo. Nesse caso,
prefervel sobrepor o retngulo em cima da foto e marcar os quatro cantos
do retngulo furando com uma agulha. A partir desses furos, possvel
reconstruir o retngulo e cortar corretamente.
79
PARTE II
CITOGENTICA
ANIMAL E HUMANA
8 - Como observar cromossomos

mitticos em insetos
Estudos citogenticos em insetos tm contribudo de forma significativa para o entendimento de diferentes aspectos envolvendo caractersticas
numricas, morfolgicas, estruturais, diferenciao e movimento cromossmico durante os processos de mitose e meiose, alm de esclarecer eventos cromossmico-evolutivos nesse grupo de organismos.
Entre os insetos, os gafanhotos oferecem um dos melhores materiais
para estudo de mitose e especialmente da meiose. Esses animais de fcil
obteno, so encontrados em qualquer rea com gramneas ou campos
abertos. So de fcil coleta, podendo ser capturados com redes entomolgicas ou mesmo manualmente. Seus cromossomos so grandes e a maioria das espcies possui cromossomos acrocntricos e nmeros diplides
de 2n=23 X0, nos machos, e 2n=24 XX nas fmeas. Alm disso, so portadores de diferentes tipos de rearranjos cromossmicos e muitas espcies
apresentam grande variabilidade de heterocromatina constitutiva. As tcnicas usadas para obteno de cromossomos meiticos de gafanhotos podem ser tambm utilizadas em outros grupos de insetos, como colepteros
e hempteros. A anlise de cromossomos mitticos de diferentes grupos
de insetos e de gafanhotos, em particular, pode ser feita a partir de clulas
de embries (material de melhor qualidade), clulas de cecos gstricos de
adultos, clulas de parede de ovarolos e tambm clulas espermatogoniais.
No caso de gafanhotos, para obteno de embries, fmeas e machos adultos devem ser coletados e mantidos em cativeiro.
8.1 - Manuteno de gafanhotos em cativeiro
Para manuteno dos animais, use caixa modelo de madeira (Figura
11a), onde se coloca um recipiente contendo areia ou vermiculita (material
de origem mineral micceo) para que a postura seja feita (Figura 11a-b). Na
seleo dos indivduos, exemplares machos podero ser reconhecidos com
auxlio de lupa, pela ausncia do ovopositor (modificao especial dos trs
ltimos somitos abdominais usados para a postura) (Figura 12a), existente
na fmea. conveniente deixar fmeas e machos adultos juntos para que
possam continuar cruzando (pode-se colocar um macho para cada duas fmeas) e, assim, facilitar a realizao de posturas (= ootecas). Devem ser
mantidos, em cada compartimento da caixa modelo (45 x 40 x 13 cm), um
mximo de 8 indivduos. Em geral, as posturas (envolvidas por uma camada de material espumoso) so feitas dentro do recipiente contendo
vermiculita, localizado no piso da caixa (Figura 11a). Eventualmente, em
cativeiro, as fmeas podem fazer a ovoposio nas paredes ou piso da
caixa e tambm na vegetao (folhas de couve, gramneas, etc), colocada
como alimento. Os ovos assim depositados tambm so usados para obteno de embries. As caixas, devem ser colocadas em local arejado e
ensolarado pelo menos por 3 a 5 horas por dia. Alm disso, devem ser
83
c
Figura 11 Caixa modelo (a) usada para manuteno de gafanhotos em cativeiro; (b e c) esquema
representativo da postura de fmea e diferentes formas de ootecas, respectivamente; Nota: medidas da
caixa modelo (42x40x13cm).
observadas diariamente, tanto para a realizao da limpeza, como para a

retirada e incubao dos ovos. Na maioria das espcies de acriddeos, os
ovos tm forma alongada e cor esbranquiada ou amarelo claro.
O conhecimento prvio da biologia reprodutiva da espcie escolhida
para a obteno de embries extremamente importante. Espcies cujos
perodos de incubao dos ovos so muito longos (mais de 60 dias) so de
difcil manejo, especialmente por proliferao de fungos e caros que atacam os ovos, afetando o desenvolvimento embrionrio. Para incubar os
ovos, use uma placa de Petri de tamanho mdio (10 cm de dimetro), contendo preferencialmente vermiculita. Os ovos devem ficar cobertos pela
vermiculita levemente umedecida e a placa de Petri colocada na estufa a 30
C. Experimentos realizados com espcies dos gneros Rhammatocerus,
Schistocerca e Abracris mostraram que ovos incubados numa temperatura
de 30 oC, aps um perodo de 10 a 13 dias fornecem embries (Figura 12c)
em bom estgio de desenvolvimento, sendo adequados para a realizao
das preparaes citolgicas.
84
c
Figura 12 Exemplo esquemtico da extremidade abdominal em gafanhotos fmeas e machos (a)
permitindo a distino do sexo. (b) Corte abdominal para a retirada do testculo ou ovrio. (c) Representao
esquemtica em diferentes estgios de desenvolvimento de embries de gafanhoto. Os estgios 3 e 4 so
mais adequados para fazer as preparaes citolgicas (td=tubo digestivo; te=testculo ou ovrio)
8.2 - Obteno de embries

As ootecas devem ser coletadas da vermiculita e transferidas imediatamente para uma placa de Petri. A vermiculita deve ser umedecida. Depois
de incubados por 10 a 13 dias a 30 C, transfira os ovos, em lotes de 5, para
uma pequena placa de Petri com 5 cm de dimetro. Use um pincel pequeno
de plos finos e delicados para retirar cuidadosamente os resduos de
vermiculita dos ovos. Depois de limpos (Figura 11c) os ovos so transferidos para outra pequena placa contendo 5 ml de soluo de Ringer. Use uma
pina de ponta bem fina para prender cada ovo por uma das extremidades
e faa um pequeno corte com uma tesoura de ponta fina na extremidade
85
oposta. Uma leve presso com a pina expulsar o embrio de dentro do

ovo, o qual ser facilmente reconhecido pela morfologia e cor esbranquiada, diferente do vitelo de cor amarelada. Repita esse procedimento para
obter os demais embries. Retire toda a soluo de Ringer usando uma
pipeta Pasteur. Retire tambm as cascas vazias dos ovos. Adicione 3 ml
de colchicina (0,01%) diluda em soluo salina para insetos. Deixe por 45
minutos temperatura ambiente. Retire a soluo de colchicina com uma
pipeta Pasteur. Adicione 3 ml de gua de torneira para fazer a hipotonizao.
Deixe por 5 minutos. Retire a gua de torneira usando pipeta Pasteur. Adicione 3 ml de fixador (etanol-cido actico 3:1). Aps 15 minutos de fixao
os embries ficam mais rgidos, o que facilita a manipulao. Transfira os
embries, em lotes de 10, para um pequeno tubo Eppendorf contendo 2 ml
de fixador novo. Nessa condio, podem ser estocados em freezer por um
perodo longo de tempo e utilizados para preparaes citolgicas sempre
que necessrio.
8.3 - Preparao de lmina a partir de embrio total
a) Coloque um nico embrio em uma lmina contendo duas gotas
de orcena actica a 2% (para a colorao convencional) ou duas gotas de
cido actico a 45% (caso a lmina se destine a algum tipo de colorao
diferencial - bandas C, colorao com nitrato de prata, etc).
b) Cubra o embrio com uma lamnula e bata levemente com a ponta
de um estilete. Verifique a qualidade da preparao no microscpio e, se
tiver clulas bem espalhadas, esmague cuidadosamente a preparao entre lmina e lamnula envoltas em papel de filtro.
c) Se a lmina j estiver corada, pode ser diretamente analisada. As
melhores clulas podem ser desenhadas ou fotografadas. As lminas assim coradas podem ser mantidas em caixas fechadas, colocadas no freezer
por um perodo de at 60 dias sem perder a qualidade de colorao.
d) Se a lmina for preparada com cido actico a 45%, a lamnula
deve ser retirada no nitrognio lquido, gelo-seco ou no freezer. A lmina
deve secar ao ar para ser utilizada posteriomente em diferentes tcnicas
de colorao diferencial.
Ateno:
Caso as lminas se destinem a coloraes especiais (bandas C, colorao com nitrato de prata, fluorocromos, etc.) devem ser mantidas
em estufa a 30 C por um perodo de 5 a 8 dias. Entretanto, lminas
recentemente preparadas (24 a 48 horas) podem ser usadas para essas coloraes. Esses procedimentos tambm so vlidos para as preparaes citolgicas obtidas de acordo com os itens 8.4 e 8.5.
Quando necessrio, os ovos podem permanecer incubados at que
ocorra a ecloso e o surgimento das ninfas de primeiro estgio. Estas
ninfas podem ser mantidas em cativeiro at atingirem a fase adulta.
86
8.4 - Obteno de cromossomos mitticos a partir de clulas de

parede de ovarolos
a) Para essa preparao injete colchicina nos animais (soluo a 0,1%
na proporo de 0,2 ml para cada 5 g de peso, por 6 horas).
b) Anestesie, com ter ou clorofrmio, fmeas adultas ou jovens, previamente colchicinizadas, para fazer as preparaes citolgicas.
c) Disseque a fmea, sob a lupa, fazendo um corte longitudinal na
regio dorsal (Figura 12b) do abdome, retirando os ovrios. No caso de
machos, os testculos se encontram na mesma posio. Esse procedimento deve ser realizado com o animal colocado numa placa de Petri de tamanho mdio (10 cm de dimetro), cujo fundo deve ser coberto com uma
camada de cortia. O animal deve estar preso com alfinetes e submerso
em soluo de Ringer.
d) Transfira os ovrios para uma pequena placa de Petri (5 cm de dimetro) contendo 5 ml de gua de torneira, para induzir a hipotonizao
durante 5 minutos.
e) Transfira os ovrios para uma pequena placa de Petri (5 cm de dimetro) contendo 5 ml de fixador (etanol-cido actico 3:1) durante 15 minutos. Para ovrios muito volumosos, conveniente lavar em novo fixador antes
de estocar no freezer. Isso ir melhorar as condies de fixao do material.
f) Transfira os ovrios para um pequeno frasco com tampa contendo
3 ml de fixador fresco e estoque no freezer.
g) Para preparar uma lmina use dois ovarolos. Descarte os ovcitos
mais desenvolvidos de cada ovarolo, visto que prejudicam a qualidade da
preparao pela presena do vitelo. Faa o esmagamento entre lmina e
lamnula, contendo duas gotas de orcena actica a 2%, caso a lmina se
destine colorao convencional, ou duas gotas de cido actico a 45%,
quando a lmina se destinar colorao cromossmica diferencial.
Ateno:
As lminas coradas com orcena podem ser mantidas em caixas
fechadas, colocadas dentro do freezer por um perodo de at 60 dias,
sem perder a qualidade de colorao. Esse procedimento tambm
vlido para as preparaes meiticas obtidas a partir de clulas de
folculos testiculares.
8.5 - Obteno de cromossomos mitticos a partir de clulas de
cecos gstricos (suspenso celular)
a) Disseque fmeas ou machos previamente colchicinizados (soluo de colchicina a 0,1% por 6 horas), sob a lupa, mantendo o animal
87
submerso em soluo de Ringer, de acordo com o item 8.4. a-c. Faa a

retirada dos cecos gstricos (Figura 13), transferindo-os para uma pequena
placa de Petri (5 cm de dimetro) contendo 3 ml de soluo de Ringer.
a
b
Figura 13 Diagrama do sistema digestivo de um inseto. Nota: b=boca; cg=cecos gstricos; tm=tbulos
de Malpighi; a=nus.
b) Limpe os cecos com auxlio de estilete e pina, e os transfira para

outra placa de Petri contendo 1 ml de Ringer. Corte os cecos em pequenos
fragmentos e macere com um basto de vidro at conseguir uma boa suspenso de clulas.
c) Transfira a suspenso de clulas obtida, para um tubo de centrfuga contendo 3 ml de soluo hipotnica (KCl 0,075M). Deixe hipotonizar
por 15 minutos.
d) Centrifugue o material a 900 rpm durante 5 minutos. Jogue fora o
sobrenadante e adicione 3 ml de fixador fresco. Centrifugue, jogue fora o
sobrenadante. Repita o processo de fixao por mais duas vezes.
e) Ressuspenda o material em 0,5 ml de fixador fresco. Coloque 2
gotas da suspenso sobre cada lmina limpa e seca.
f) Para a anlise convencional, core a lmina com Giemsa a 5%, durante 5 minutos. Seque a lmina e monte em blsamo do Canad ou Euparal.
88

mitticos humanos e
de pequenos mamferos
Em material humano e de outros mamferos como roedores, morcegos
e marsupiais, os cromossomos metafsicos mitticos so adequados para
anlise cariotpica, principalmente pelo seu alto grau de condensao e espalhamento em metfase. Isso facilita a contagem do nmero diplide, a
definio de morfologia e a identificao dos cromossomos sexuais (no caso
de heteromorfismo do par sexual). Cromossomos mitticos, obtidos por diferentes tcnicas de preparao citolgica, podem ser utilizados tanto para
anlise convencional como para as identificaes cromossmicas especiais.
9.1 - Cultivo de linfcitos humanos
A tcnica mais usada para estudo de caritipo humano o cultivo de
linfcitos de sangue circulante perifrico. Essa tcnica tem a vantagem de
oferecer grande nmero de metfases em apenas trs dias e de eliminar a
necessidade de bipsias, como no cultivo de fibroblastos. No cultivo de
linfcitos empregue um agente mitognico, a fitohemaglutinina, que estimula a atividade mittica e tem ao aglutinante sobre as hemcias. Nesse
cultivo, use apenas 1 ml de plasma. Para evitar contaminao do material,
todo o processo, desde a obteno do sangue at o tratamento com colchicina, deve ser feito sob a mais completa condio de assepsia. Toda a
manipulao com o meio de cultura, o soro bovino fetal e o sangue, deve
ser feita em fluxo laminar. No caso de cultivo de linfcitos de pequenos
mamferos, a diferena consiste apenas no tempo de cultivo (de 72 a 96
horas) devendo esse tempo ser testado para cada espcie.
Existem basicamente duas tcnicas para cultivo de linfcitos humanos: a macrotcnica e a microtcnica. A diferena entre elas, que na primeira coleta-se um volume maior de sangue (5 ml) e as hemcias so excludas por sedimentao, enquanto na segunda o volume de sangue menor
(0,2 ml) e trabalha-se com o sangue total. A microtcnica pode ser utilizada
para anlise cariotpica de recm-nascidos. O cultivo de linfcitos segue a
tcnica de Moorhead et al. 1960, com algumas modificaes.
9.1.1 - Macrotcnica para cultivo de linfcitos
a) Com uma seringa previamente umedecida de heparina, colete 5
ml de sangue.
b) Deixe a seringa em posio vertical com a agulha para cima at que
com a sedimentao das hemcias, os linfcitos sejam separados no plasma sobrenadante.
c) Transfira 1 ml do plasma, com a prpria seringa, para um frasco de
89
cultura contendo 10 ml de meio completo (meio RPMI 1640 da Sigma), contendo 0,2 ml de fitohemaglutinina (preparada conforme indicado pelo fabricante). Esse meio deve estar suplementado com 20% de soro bovino fetal.
Adicione os antibiticos Penicilina (10.000U/ml), Estreptomicina (10 mg/
ml) e, tambm, a Glutamina-A (29 mg/ml). Feche bem o frasco, coloque
etiqueta de identificao e deixe na estufa a 37 C, por 72 horas.
d) Aps 71 horas de cultivo, adicione 3 gotas de colchicina 0,0016%
e deixe por 1 hora.
e) Ao completar 72 horas de cultivo, transfira o material para um tubo
de centrfuga e centrifugue a 900 rpm durante 5 minutos. Elimine o sobrenadante sem agitar o sedimento celular.
f) Coloque 5 ml de soluo hipotnica (KCl 0,075M), homogeneize e
deixe na estufa a 37 C por 10 minutos.
g) Centrifugue o material por 5 minutos a 900 rpm, elimine o sobrenadante, coloque 5 ml de fixador (metanol-cido actico, 3:1) e homogeneize.
Repita este procedimento duas vezes.
h) Ressuspenda o sedimento em 0,5 a 1 ml de fixador fresco e pingue duas gotas da suspenso em cada lmina. Para obter uma lmina de
melhor qualidade, o material deve ser pingado, em lmina extremamente
limpa e inclinada, a uma distncia de mais ou menos 30 cm. Deixe secar
a lmina.
i) Identifique cada lmina com lpis diamante ou caneta para
retroprojetor.
j) Core cada lmina com Giemsa a 5%, durante 5 minutos, caso a
lmina se destine a anlise convencional. A Figura 14 e mostra uma metfase
mittica humana.
9.1.2 - Microtcnica para cultivo de linfcitos
a) Colete 0,2 ml de sangue capilar, atravs de puno na ponta do
dedo da mo ou na planta do p utilizando uma seringa de 3 ml heparinizada.
Previamente, faa uma assepsia da rea com lcool 70%.
b) Em condies de assepsia, transfira o sangue total colhido para o
frasco de cultura contendo 5 ml de meio de cultura completo. Misture o
sangue ao meio, agitando levemente.
c) Incube na estufa a 37 oC por 72 horas.
d) Decorridas 71 horas, adicione 3 gotas de colchicina na concentrao de 0,0016% e deixe por 1 hora.
90
Figura 14 Colorao convencional em clulas meiticas do gafanhoto Xyleus angulatus

(a=diplteno; b-c=anfase I e II, respectivamente) e mitticas do morcego Artibeus lituratus (d) e
humano (e). Fotos do autor.
e) A partir da, prossiga de acordo com a tcnica anteriormente descrita, a partir do item e para cultivo de linfcitos.
9.2 - Cultivo de fibroblastos em pequenos mamferos
O cultivo de fibroblastos uma tcnica bastante utilizada para obteno de cromossomos mitticos em mamferos. O procedimento para obteno de cromossomos mitticos pelo cultivo de fibroblastos consiste nas
seguintes etapas: obteno das bipsias, implantao do cultivo,
tripsinizao e preparo do material para estudo cromossmico. Tambm
91
sero descritos procedimentos para manuteno, congelamento e descongelamento de clulas.

Para o cultivo de fibroblastos, pode ser utilizado o meio DMEM
(Dulbeccos Modified Eagles Medium) da Gibco (preparado conforme indicado pelo fabricante). O meio deve ser enriquecido com 20% de soro bovino
fetal, com os antibiticos Neomicina (50 mg/ml) e Gentamicina (4 mg/ml) e
com soluo de Fungizon (= anfotericina A) (0,01 mg/ml). Em pequenos mamferos, o material comumente usado para cultivo de fibroblastos retirado
da orelha ou da cauda. Entretanto, tecido muscular tambm bastante utilizado para este tipo de cultivo. Para o cultivo de fibroblastos foram seguidos
os procedimentos tcnicos descritos por Freshney (1986) com modificaes.
9.2.1 - Obteno de bipsias
a) Depois de anestesiar o animal com ter, faa a assepsia da regio
escolhida, procedendo a limpeza com algodo embebido, na seguinte seqncia: gua, detergente neutro a 5% (Extran ou similar), gua, etanol 70%,
ter e soluo de merfene. Repita esse procedimento vrias vezes at que
a regio escolhida fique completamente limpa.
b) No caso de bipsia de orelha, corte na extremidade cerca de 0,3
ou 0,5 cm. No caso de cauda, conveniente garrotear acima do local do
corte para evitar sangramento. Seccione transversalmente a extremidade
da cauda e retire cerca de 0,5 a 0,8 cm. Use tesouras e pinas esterilizadas.
c) Imediatamente, transfira o material cortado para uma placa de Petri
estril contendo 3 ml de meio completo. Retire e despreze a pele, no caso
da cauda. Coloque o material em um pequeno frasco (capacidade para 5
ml) estril, contendo 3 ml de meio completo. Mantenha na geladeira a 4 C
por 24 horas. Esse tempo permite um acompanhamento do material para
deteco de possveis contaminaes. Mudana de colorao ou aparncia
trbida do meio de cultura pode ser indicativo de contaminao. Nesse
caso, o material deve ser desprezado.
Ateno:
O cultivo de fibroblastos tambm pode ser feito a partir de material
de embrio obtido de fmea prenhe em pequenos mamferos. Nesse
caso, as fmeas so sacrificadas e o tero inteiro retirado e colocado
numa pequena placa de Petri (5 cm de dimetro) contendo soluo de
Hanks estril, com Neomicina (50 mg/ml). No fluxo laminar, proceda
como segue:
Retire o embrio ou embries de dentro do tero, usando tesoura e
pinas estreis. Transfira para outra placa de Petri contendo 3 ml soluo
de Hanks com Neomicina (50 mg/ml).
Corte orelha, cauda ou membrana de asa (caso de morcegos) e
transfira os fragmentos para pequenos frascos estreis contendo 3 ml
de meio de cultura completo. Deixe na geladeira a 4 C por 24 horas,
como no caso do item 9.2.1 c.
92
9.2.2 - Implantao do cultivo

a) Corte o material obtido pela bipsia (cauda, orelha ou embrio) em
fragmentos de, no mximo 1 mm3 em placa de Petri pequena, estril, contendo 3 ml de meio de cultura completo. No caso de embries, pode-se
escolher fragmentos de cauda, orelha, tecido muscular ou rgos internos.
Para fragmentar esse material, use pinas e tesouras esterilizadas e trabalhe no fluxo laminar.
b) Para implantao do cultivo, use frascos de plstico (marca Corning,
Costar ou similar), com capacidade para 25 cm2. Umedea a face interna do
frasco, na qual ser feito o implante, com soro bovino fetal (Figura 15a).
b
Figura 15 Frasco modelo usado para o cultivo de fibroblastos (a). Em destaque (-) a distribuio
dos fragmentos de tecido de cauda de morcego. Em (b) crescimento tpico de clulas fibroblsticas.
c) Use pipeta Pasteur para transferir os fragmentos de tecido para o

frasco de cultura, colocando-os sobre a parede j umedecida com soro bovino fetal. Depois de distribuir os fragmentos no frasco, coloque no fundo
do mesmo 2 ml de meio de cultura completo, deixe o frasco em posio
vertical e em repouso durante 30 minutos na estufa a 37 C.
93
d) Vire o frasco com cuidado para que os fragmentos de tecido entrem em contato com o meio de cultura e no se destaquem da parede do
frasco. Deixe na estufa a 37 C durante 3 dias.
e) Quando as clulas iniciarem a proliferao, adicione 3 ml de meio
de cultura completo.
f) A partir desse momento, necessrio observar diariamente o desenvolvimento do cultivo. importante manter o pH do meio de cultura entre
7,2 e 7,6. Caso o meio apresente uma colorao amarelada (indicativo de
acidez), adicione algumas gotas de bicarbonato de sdio a 2,8%. Caso o
meio se apresente avermelhado (indicativo de alcalinidade), use algumas
gotas de HEPES (N-2-hidroxi-etil-perazina-N-2-cido etanossulfnico) a 2,5%
(todas as solues devem ser estreis). Com a proliferao celular (Figura
15b), o meio de cultura deve ser trocado diariamente ou, no mximo, a cada
dois dias, para retirada de produtos txicos e reposio de novos nutrientes.
Quando cerca de 90% da superfcie do frasco de cultura ficar coberta por uma
monocamada de clulas, necessrio fazer a tripsinizao para repicagem
das clulas. Esse procedimento visa evitar a interrupo do processo de diviso celular decorrente do grande nmero de clulas confluentes no frasco.
9.2.3 -Tripsinizao
a) Retire os frascos da estufa, despreze o meio de cultivo e adicione
2 ml de soluo de Hanks sem clcio e sem magnsio. Deixe o frasco em
repouso por 3 minutos e, em seguida, despreze a soluo de Hanks.
b) Adicione ao frasco de cultivo 2 ml de soluo de tripsina/EDTA (Etileno
Diamino cido Tetractico) (0,005 g de tripsina mais 0,002 g de EDTA em 10
ml de soluo de Hanks). Observe ao microscpio invertido o destacamento
das clulas que se caracteriza pelo arredondamento destas. Nesse momento, retire com pipeta Pasteur a soluo de Hanks com tripsina e EDTA.
c) Adicione 3 ml de meio completo e bata nas paredes do frasco para
desprender as clulas da superfcie do frasco. Acompanhe ao microscpio
invertido.
d) Divida o contedo do frasco para dois novos frascos de cultivo e
acrescente 3 ml de meio completo em cada um deles.
e) Coloque os frascos na estufa a 37 oC. Acompanhe o novo crescimento e proliferao celular diariamente, como descrito no item 9.2.2 e, f.
9.2.4 - Preparao do material para anlise cromossmica
a) Nas ltimas 24 horas antes da colheita do material, o meio de cultura deve ser trocado por um meio novo, para acelerar o processo de diviso celular.
94
b) Adicione 2 gotas de soluo de colchicina a 0,01% no frasco de

cultivo. Aps 40 minutos transfira o contedo do frasco para um tubo de
centrfuga e reserve. Acrescente ao frasco de cultivo 2 ml de soluo de
Hanks sem clcio e sem magnsio, deixe na estufa a 37 C por 5 minutos e,
em seguida, faa a transferncia para o mesmo tubo de centrfuga anterior.
A partir desta etapa at o item d, todo material celular e respectivos
sobrenadantes devem ser colocados em um mesmo tubo de centrfuga para
evitar maior perda de clulas.
c) Coloque 2 ml de soluo de tripsina / EDTA, conforme o item 9.2.3
b, no frasco de cultivo. Observe ao microscpio invertido para acompanhar
o arredondamento das clulas.
d) Transfira a soluo de tripsina mais EDTA para o tubo de centrfuga.
Coloque 2 ml de Hanks sem clcio e sem magnsio e solte as clulas com
batidas nas paredes do frasco. Transfira todo o material para o tubo de
centrfuga e, por ltima vez, adicione 2 ml de meio completo para fazer
uma retirada completa das clulas do frasco de cultura. Transfira esse meio
para o tubo de centrfuga.
e) Centrifugue o material a 1200 rpm durante 10 minutos. Despreze o
sobrenadante
f) Adicione 5 ml de soluo hipotnica (KCl 0,075M), homogeneize e
coloque a 37 C por 10 minutos.
g) Centrifugue, despreze o sobrenadante, adicione vagarosamente 5
ml de fixador (metanol- cido actico, 3:1) e homogeneize.
h) Centrifugue a 1200 rpm por 10 minutos. Repita o processo de fixao mais duas vezes.
i) Ressuspenda o material em 1 ml de fixador e pingue 2 gotas sobre
cada lmina que deve estar rigorosamente limpa.
j) Seque, core com soluo de Giemsa a 5% diluda em tampo fosfato
pH 6.8 durante 5 minutos. Lave em gua destilada, seque e monte em blsamo do Canad ou Euparal.
9.2.5 - Congelamento de clulas
a) Para iniciar o procedimento de congelamento de clulas proceda
inicialmente como nos itens a e b, da tripsinizao (item 9.2.3).
b) Coloque no frasco de cultivo 2 ml de meio de cultura completo
adicionando 1 ml de DMSO (dimetil-sulfxido) a 10%.
c) Bata nas paredes do frasco de cultivo para soltar as clulas. Adicione 2 ml de DMSO a 10%.
95
d) Transfira o material para frascos criognicos (por exemplo, da marca Nalgene) com capacidade para 1,8 ou 2,0 ml. Esses frascos devem ser
mantidos em cuba com gelo antes de receber o material.
e) Os frascos criognicos, depois de receberem o material, devem
ser submetidos a um congelamento progressivo na geladeira a 4 C (2 horas), no freezer a -20 C (5 horas), no gelo seco a -60 C (5 horas) e, finalmente, no botijo de nitrognio lquido (temperatura de -196 oC), onde podero ser mantidos por muito tempo.
9.2.6 - Descongelamento de clulas
a) Os frascos criognicos so retirados do botijo de nitrognio lquido e colocados em banho- maria a 37 oC. Espere o descongelamento completo (cerca de 5 minutos).
b) Leve os frascos criognicos ao fluxo laminar e antes de abr-los,
passe um algodo, embebido de lcool 70%, sobre os mesmos. Transfira o
material para um tubo de centrfuga estril contendo 5 ml de meio de cultura completo. Feche o tubo e centrifugue a 800 rpm por 10 minutos. Jogue
fora o sobrenadante.
c) Ressuspenda o material em 2 ml de meio de cultura completo e
transfira-o para um frasco de cultura, adicionando mais 3 ml de meio.
d) Mantenha o frasco na estufa a 37 C e acompanhe o desenvolvimento da cultura, como descrito no item 9.2.2 e, f.
9.3 - Observao de cromossomos mitticos em clulas de medula
ssea e de bao de pequenos mamferos
As duas tcnicas a seguir podem ser facilmente empregadas para
obteno de cromossomos mitticos de pequenos mamferos (roedores,
morcegos e marsupiais), sem necessidade de fazer cultivo de clulas. A
intensa atividade hematopoitica, tanto da medula ssea como do bao,
permite uma maior riqueza na quantidade de clulas em diviso mittica
nesses rgos. Para a preparao citolgica de medula ssea foi seguido
o mtodo de Ford e Hamerton (1956) e para bao Yonenaga (1972) com
modificaes.
9.3.1 - Utilizando clulas de medula ssea
a) Selecione o animal a ser estudado, bloqueie a diviso das clulas
em metfase com injeo subcutnea de colchicina a 0,2%, na proporo
de 1 ml para cada 100 g de peso do indivduo. Aps um perodo de 1 a 2
horas anestesie o animal com ter ou clorofrmio e disseque em seguida.
b) Retire os fmures e meros. Corte as epfeses e retire a medula
96
com lavagens repetidas do canal sseo, em 5 ml de soluo hipotnica

(KCl 0,075M), obtendo uma suspenso de clulas (use placa de Petri pequena, 5 cm de dimetro).
c) Transfira a suspenso de clulas para um tubo de centrfuga e leve
para a estufa a 37 C por 10 minutos.
d) Centrifugue a suspenso celular a 800 rpm durante 5 minutos e
jogue fora o sobrenadante.
e) Ressuspenda o material em fixador (metanol-cido actico, 3:1).
Centrifugue e elimine o sobrenadante. Esse procedimento deve ser repetido mais duas vezes.
f) Ressuspenda o material em fixador fresco e pingue duas gotas em
lmina limpa, conservada na geladeira. Passe a lmina rapidamente na chama para evaporar o fixador ou deixe secar temperatura ambiente.
g) Core o material com uma soluo de Giemsa a 5%, durante 5
minutos. Lave em gua corrente. Se o clima do Laboratrio for seco, deixe
secar ao ambiente. Caso seja muito mido, seque a lmina imediatamente com secador eltrico. Passe em xilol e monte em blsamo do Canad
ou Euparal. A Figura 14d, mostra uma metfase mittica do morcego
Artibeus lituratus.
9.3.2 - Utilizando clulas de bao
a) Depois de selecionar o animal, injete subcutneamente uma soluo de colchicina a 0,2% na proporo de 1 ml para cada 100 g de peso do
indivduo. Sacrifique o animal aps um perodo de 1 a 2 horas, utilizando
ter ou clorofrmio.
b) Retire o bao e coloque numa placa de Petri pequena (5 cm de
dimetro) contendo 5 ml de soluo hipotnica (KCl 0,075M).
c) Use uma seringa de 10 ml para injetar vrias vezes no rgo a
soluo hipotnica. Esse procedimento deve ser repetido at o rgo ficar
transparente e se obter uma suspenso celular a partir das clulas desprendidas.
d) Siga o procedimento descrito para a preparao de medula ssea a
partir do item 9.3.1 e.
Ateno:
Melhores resultados da anlise cromossmica so obtidos medida
em que se tem preparaes mais ricas em metfases. O ndice mittico
pode ser aumentado, em pequenos mamferos e mesmo em alguns
outros vertebrados, com o pr-tratamento dos animais, com uma solu-
97
o de fermento biolgico Fleischmam, ou similar, por um perodo de

18 a 24 horas. Esse procedimento acarreta o aumento da atividade
hematopoitica da medula ssea e do bao, desencadeando um aumento na freqncia de mitoses nesses rgos.
Nos animais mais resistentes, que suportam um perodo mais longo
de pr-tratamento com fermento biolgico, por exemplo, 48 horas,
o tempo de tratamento com colchicina pode ser reduzido para 1
hora. Esse procedimento permitir um acmulo de metfases
mitticas, com cromossomos menos condensados, que sero mais
adequados para diferentes tipos de anlises citogenticas. Isto
vlido tanto para as preparaes citolgicas de medula ssea como
de bao.
9.4 - Anlise do caritipo mittico
9.4.1 - Construindo um cariograma: o exemplo do cariograma
humano
Os cromossomos humanos e de outros mamferos podem ser melhor
analisados a partir de montagem de seus caritipos. Para isto, pode-se usar
fotomicrografias de metfases de diferentes espcies. Para analisar o
caritipo humano, esses cromossomos so alinhados de acordo com o tamanho e a morfologia (posio do centrmero) em sete grupos designados
pelas letras A at G. Os autossomos so numerados de 1 a 22 pela ordem
decrescente de tamanho e os cromossomos sexuais representados pelas
letras X e Y, conforme descrito abaixo:
GRUPO A - os trs maiores pares cromossmicos. O par 1 e 3 so
metacntricos, enquanto o par 2 submetacntrico.
GRUPO B - pares 4 e 5, submetacntricos. O tamanho de seus braos
curtos equivale a 1/3 de seus braos longos.
GRUPO C - pares 6 a 12. O cromossomo X includo neste grupo, ficando representado por apenas um cromossomo no caso do homem. impossvel a identificao individual dos cromossomos deste grupo pela anlise
morfolgica. Devem ser pareados em ordem decrescente de tamanho.
GRUPO D - pares 13, 14 e 15. So acrocntricos de tamanho mdio,
com satlites nem sempre visveis nos braos curtos. No so distinguveis
entre si pela anlise morfolgica.
GRUPO E - pares 16, 17 e 18. O par 16 metacntrico e os pares 17 e
18 so submetacntricos. O par 17 tem os braos curtos ligeiramente maiores que os do par 18.
GRUPO F - pares 19 e 20. So os menores metacntricos e no so
distinguveis pela anlise morfolgica.
GRUPO G - pares 21 e 22 na mulher, e mais o cromossomo Y, no
homem. Os pares 21 e 22 apresentam satlites nos braos curtos, nem
sempre visveis. No possvel a distino individual desses dois pares. O Y identificvel em muitos casos pela posio paralela dos braos longos, pela ausncia de satlites e localizao preferencial na periferia da metfase.
98
9.4.2 - A montagem do cariograma

a) Conte o nmero de cromossomos da metfase antes de iniciar o
trabalho. No caso de material humano, numere na foto, os pares de cromossomos, de acordo com a classificao descrita acima (grupos A at G mais
os cromossomos sexuais). No caso de material de outros mamferos, numere os pares cromossmicos em ordem decrescente de tamanho.
b) Depois de identificados na foto, recorte cada cromossomo e agrupe os pares segundo os critrios destacados acima. A Figura 16 mostra
uma metfase humana com seus cromossomos antes e depois do
pareamento.
Figura 16
Caritipo humano masculino normal (2n=46, XY). Foto do autor.
99
c) Para material de outros mamferos, a montagem de caritipo pode

obedecer ordem decrescente de tamanho dos cromossomos. Estes, por
sua vez, podem tambm ser agrupados por ordem de tamanho, porm levando em conta as caractersticas morfolgicas, por exemplo, metacntricos,
submetacntricos, acrocntricos, etc.
Ateno:
caritipo humano e de outros mamferos, pode tambm ser
representado esquematicamente por um idiograma. Para isso, pode-se
utilizar valores mdios da posio do centrmero e tamanho de cada
cromossomo. Alm disso, o idiograma pode mostrar a representao
de diferentes padres de bandeamento cromossmico. Na Figura 17
esto apresentados os idiogramas humanos, a partir da colorao
convencional acima e, tambm, a partir do padro de bandas G abaixo
visto em cromossomos metafsicos.
Figura 17 Esquemas representativos de idiogramas humanos. Colorao convencional e bandeamento

G. Nota: idiogramas do sexo masculino.
100

meiticos e
complexos sinaptonmicos
A meiose se caracteriza por apresentar duas divises sucessivas do
material hereditrio (diviso I e diviso II) precedidas de um nico perodo
de sntese de DNA (fase S). A prfase da primeira diviso meitica bastante ampla, podendo durar desde dias (em machos) at anos (geralmente em
fmeas de mamferos). Nos machos, o resultado final do processo a formao, por parte de cada uma das clulas que entraram na prfase I, de
quatro clulas haplides, que so as espermtides. Em seguida, por um
processo denominado espermiognese que se caracteriza por uma srie
de mudanas tanto citoplasmticas como nucleares, as espermtides se
transformam em espermatozides. Nas fmeas, ocorre eliminao de ncleos e a meiose termina com um nico gameta.
Nas tcnicas a seguir, so apresentados diferentes procedimentos para
obteno e anlise de cromossomos meiticos em insetos e pequenos mamferos. O procedimento muito mais simples para anlise da meiose masculina, por isso o estudo da meiose feito quase sempre nos machos. Por
fim, so descritas tambm algumas tcnicas para anlise de quiasmas e do
complexo sinaptonmico, que ocorre durante incio da prfase I da meiose.
H pelo menos duas tcnicas principais na preparao de lminas para
anlise meitica: por esmagamento e por suspenso de clulas testiculares. Essas duas tcnicas podem ser usadas tanto em insetos (gafanhotos,
colepteros, hempteros, etc.) como em pequenos mamferos. Entretanto,
a tcnica de esmagamento comumente usada em insetos e a tcnica de
suspenso celular em mamferos. A Figura 14a-c apresenta fases da meiose
do gafanhoto Xyleus angulatus. Para a obteno de cromossomos meiticos
e mitticos em gafanhotos foram seguidas a tcnicas clssicas de esmagamento e a de suspenso celular descrita por Souza (1991). Preparao
meitica de pequenos mamferos foi segundo Eicher (1966) e a obteno
de complexos sinaptonmicos segundo Pathak e Hsu (1979), Pathak et al.
(1979) e Albani e Jones (1984) com modificaes.
10.1 - Disseco de gafanhotos
a) Anestesie o animal usando um chumao de algodo embebido com
ter ou clorofrmio. Isso pode ser feito dentro de um pequeno recipiente
de vidro com tampa.
b) Disseque o animal, sob lupa, fazendo um corte longitudinal na parte dorsal do abdome, expondo assim os testculos. Ao dissecar o animal,
importante evitar rompimento da extremidade do abdome (parte externa da
genitlia), uma vez que esta estrutura importante no caso da identificao
taxonmica da espcie. Separe os testculos (Figura 12b) em soluo de
101
Ringer para no secar os rgos durante a disseco. Use placa de Petri

pequena (5 cm de dimetro).
c) Limpe bastante os testculos. Retire a membrana peritoneal e transfira os rgos para uma pequena placa de Petri, contendo 3 ml de fixador
(etanol-cido actico, 3:1). Deixe fixando durante 10 minutos. O material assim fixado pode ser estocado no freezer por um perodo de 2 ou mais anos.
10.1.1 - Preparao de lminas por esmagamento de folculos
a) Prepare cada lmina colocando 1 ou 2 folculos testiculares sobre
uma lmina limpa e seca. Adicione uma gota de cido actico 45%. Fragmente os folculos usando estilete ou pina de ponta fina, para facilitar o
espalhamento das clulas sobre a lmina. Coloque uma lamnula sobre o
material e deixe por 1 minuto.
b) Faa o esmagamento, entre lmina e lamnula envoltas em papel
de filtro, pressionando o dedo polegar firmemente sobre o papel. Deve-se
ter cuidado ao esmagar para no deslocar a lamnula e estragar o material.
c) Retire a lamnula no gelo seco ou nitrognio lquido. Coloque a
lmina para secar na estufa a 37 C.
Ateno:
As lminas assim preparadas podem ser usadas para diferentes
tcnicas de identificao cromossmica, tais como bandeamento C,
colorao com nitrato de prata e colorao com fluorocromos.
Se as lminas se destinarem a anlise convencional, no item
10.1.1 a. o cido actico deve ser substitudo pela orcena lcto
actica a 2%. Prosseguindo, coloque uma lamnula sobre o material
e deixe corando por 2 minutos. A colorao deve ser acompanhada
ao microscpio. Quando os cromossomos j estiverem corados, faa
o esmagamento. Lutar a lmina usando esmalte de unha para fixar
a lamnula sobre a lmina e impedir o ressecamento do corante.
Lminas assim coradas podem ser mantidas em caixa fechada e
colocadas no freezer ou congelador da geladeira. Nessa condio,
as lminas mantm um bom estado de colorao, durante pelo menos
2 meses.
Para fazer uma preparao permanente (no caso de colorao
convencional com orcena) proceda a retirada da lamnula, em gelo
seco, nitrognio lquido ou mesmo no freezer . Passe a lmina
rapidamente no lcool 70%. Em seguida, seque e faa a montagem em
blsamo do Canad ou Euparal.
Alternativamente, a lmina seca preparada como descrito acima,
pode ser corada diretamente com hematoxilina a 1%. Nesse caso,
coloque uma gota de hematoxilina na lmina, cubra com uma lamnula
e analise ao microscpio. Para tornar a lmina permanente, retire a
102
lamnula com um jato de gua, seque a lmina e monte em blsamo do

Canad ou Euparal.
10.1.2 - Preparao de lminas por suspenso de clulas
a) Anestesie o animal usando ter ou clorofrmio, como na tcnica
anterior.
b) Disseque o animal, separe os testculos usando uma soluo de
Ringer em placa de Petri pequena (5 cm de dimetro), para a retirada da
membrana peritoneal e limpe os testculos.
c) Transfira o material para uma pequena placa de Petri (5 cm de dimetro) contendo 1 ml de soluo hipotnica (KCl 0,075M). Use um pequeno
basto de vidro para macerar o material at que as clulas sejam liberadas
dos folculos.
d) Acrescente 3 ml de soluo hipotnica (KCl 0,075M), homogeneize
com pipeta Pasteur e deixe por 20 minutos temperatura ambiente.
e) Centrifugue a 900 rpm durante 5 minutos e elimine o sobrenadante.
f) Ressuspenda o material em 3 ml de fixador (etanol-cido actico,
3:1). Centrifugue e elimine o sobrenadante. Repita esse procedimento mais
duas vezes.
g) Ressuspenda o material em 0,5 a 1,0 ml de fixador e pingue duas
gotas por lmina. O material deve ser pingado na lmina a uma distncia de
30 cm. Isso permite um melhor espalhamento das clulas.
h) Seque a lmina em estufa a 37 C. Core com orcena lcto-actica a
2%, por 3 minutos ou com Giemsa a 5%, por 5 minutos. Lave com gua
destilada, seque e monte com blsamo do Canad ou Euparal.
10.2 - A meiose em pequenos mamferos (roedores, morcegos e
marsupiais)
a) Anestesie o animal e faa a retirada dos testculos, colocando-os
numa placa de Petri pequena (5 cm de dimetro) contendo 5 ml de soluo
de Hanks.
b) Retire a tnica albugnea que envolve os testculos fazendo um corte com o auxlio de uma lmina de bisturi para liberar os tbulos seminferos.
c) Transfira o material para outra placa de Petri contendo 3 ml de soluo de Hanks. Corte os tbulos seminferos repetidas vezes para liberar as
clulas. Um basto de vidro pode tambm ser usado para macerar o materi-
103
al e aumentar a quantidade de clulas ou, ainda, o material pode ser passado em seringa (sem agulha) repetidas vezes.
d) Transfira o material para um tubo de centrfuga e adicione 5 ml de
soluo de Hanks. Centrifugue a 1200 rpm por 10 minutos.
e) Despreze o sobrenadante e adicione 8 ml de soluo hipotnica
(KCl 0,075M). Deixe em banho-maria a 37 oC por 10 minutos.
f) A partir da, prossiga conforme o item 9.3.1.d, da tcnica de preparao cromossmica a partir de medula ssea.
Ateno:
Tanto testculos de indivduos jovens quanto de adultos, desses
mamferos podem fornecer material qualitativa e quantitativamente bons
para anlise da meiose.
10.3 - Anlise da freqncia e distribuio de quiasmas em gafanhotos
O estgio de diplteno se caracteriza pela aparncia dupla dos cromossomos e pela melhor visualizao dos quiasmas. Embora apaream no
diplteno, os quiasmas so formados no final do zigteno ou no paquteno,
quando as cromtides esto emparelhadas. Nos bivalentes meiticos os
quiasmas podem se localizar em posio proximal (P), intersticial (I) ou
distal (D), em relao ao centrmero.
Assim, a freqncia mdia de quiasmas por clula e a posio (P, I, D)
dos mesmos podem ser determinadas em clulas diplotnicas. Essa anlise pode revelar variao na taxa de recombinao meitica, que pode ser
provocada por cromossomos B, heterocromatina supernumerria, etc. Apesar dos quiasmas serem visualizados com a colorao convencional, eles
so melhor identificados quando as lminas so preparadas pela tcnica
de bandeamento C. Isto decorre do fato de que a heterocromatina constitutiva
freqentemente tem uma posio centromrica, servindo como um marcador
para delimitar essa regio e facilitar a localizao precisa do quiasma. Para
esta anlise, podem ser usados tanto desenhos quanto fotos. Para facilitar a
organizao dos seus dados considere os seguintes aspectos:
a) Use o espao direita do Quadro 1 para fazer o desenho ou para
colar a foto representativa da fase meitica em diplteno.
b) Numere, na foto ou no desenho, cada bivalente em ordem decrescente de tamanho, por exemplo, de 1 a 11, mais o cromossomo X
univalente (para as espcies com 2n=23,XO), que representa a maioria
dos acridodeos.
c) Analise 10 clulas usando o modelo do Quadro 1 para cada clula.
Os resultados obtidos permitiro calcular a freqncia mdia de quiasmas
por clula e por posio no cromossomo.
104
QUADRO 1 - Modelo para anlise da freqncia e distribuio de

quiasmas. (P) proximal; (I) intersticial; (D) distal
Bivalente
Quiasmas
P
Total
1
2
3
4
X
Totais
) (
) (
10.4 - Anlise de complexo sinaptonmico em insetos e pequenos

mamferos
O complexo sinaptonmico (CS) uma estrutura nuclear caracterstica
dos bivalentes cromossmicos em estgio de zigteno-paquteno organizando-se e desorganizando-se durante a primeira diviso meitica. Essa
estrutura tripartida e formada por dois elementos laterais e um elemento
central. Sua composio fundamentalmente protica, e forma um eixo no
bivalente, que vai de telmero a telmero, passando pela regio
centromrica. A zona compreendida entre o elemento central e os elementos laterais menos densa e est constituda por filamentos finos denominados fibrilas, sendo associados com os ndulos de recombinao. Nos
procedimentos a seguir, so mostradas duas diferentes tcnicas usadas
para anlise de complexos sinaptonmicos de pequenos mamferos: a tcnica de espalhamento (spreading) e a tcnica de suspenso celular de espermatcitos. Ambas as tcnicas usam colorao com nitrato de prata para
visualizar os CS. A diferena principal entre as mesmas que a primeira
usa o detergente Lipsol ou similar como soluo hipotnica e paraformaldedo como fixador, enquanto que a segunda tcnica usa citrato de sdio e
etanol-cido actico, 3:1, respectivamente, como soluo hipotnica e
fixador. As duas tcnicas, por sua vez, permitem analisar o CS identificando-o em toda a sua extenso, individualizando cada bivalente e localizando, por exemplo, centrmeros e RONs. Alm disso, so bastante teis para
analisar o comportamento citogentico associado s anomalias
cromossmicas estruturais como duplicaes, inverses, translocaes,
alm do par XY dentro da vescula sexual, no caso de mamferos.
105
10.4.1 - Anlise do complexo sinaptonmico em pequenos

mamferos (tcnica de disperso ou spreading)
a) Anestesie o animal, retire os testculos e coloque numa pequena
placa de Petri (5 cm de dimetro) contendo 3 ml de soluo salina de Hanks.
Com auxlio de uma lmina de bisturi, retire a membrana albugnea que
envolve os tbulos seminferos.
b) Transfira os testculos para outra placa de Petri contendo 1 ml de
soluo de Hanks. Corte os tbulos vrias vezes e macere com a ponta de
um basto de vidro para liberar as clulas. A suspenso testicular deve ser
bastante concentrada.
c) Transfira o material para um pequeno tubo de centrfuga. Mantenha
o tubo num becker com gelo.
d) Numa lmina limpa e seca, coloque 3 gotas do detergente Lipsol
(Lip. Ltd. Shipley, England) a 1% e, sobre estas, 1 gota da suspenso de
material testicular. Misture e observe ao microscpio em contraste de fase
ou abaixe o condensador do microscpio comum, para acompanhar o rompimento dos ncleos. Isto ocorre em 1 ou 2 minutos, em material de morcego ou roedor.
e) Adicione 4 gotas de uma soluo de paraformaldedo a 4% ao redor do material em lmina.
f) Passe um basto de vidro sobre a suspenso, sem tocar na lmina,
como se fosse um rolo, permitindo espalhar a suspenso pela superfcie
da lmina.
g) Coloque a lmina numa caixa fechada para secar durante 18-24
horas.
h) Lave as lminas com gua destilada em jarro de Coplin e seque-as
ao ar.
i) Hidrolise as lminas em HCl 1N a 60 C durante 20 minutos. Lave
com gua destilada e seque as lminas.
j) Coloque sobre cada lmina 2 gotas de soluo coloidal de gelatina
e 3 gotas de soluo de nitrato de prata a 50%. Com movimentos suaves
misture as duas solues sobre a lmina.
k) Cubra com lamnula e coloque em cmara mida a 70 C durante 5
minutos. Esse tempo deve ser determinado individualmente, checando a
lmina ao microscpio. Lave com gua destilada e seque.
l) Monte em blsamo do Canad ou Euparal.
106
10.4.2 - Anlise de complexo sinaptonmico de pequenos

mamferos (tcnica de suspenso celular)
a) Anestesie o animal, retire os testculos e coloque numa placa de
Petri (5 cm de dimetro) contendo 10 ml de soluo hipotnica de citrato de
sdio a 0,7%.
b) Separe os tbulos seminferos com auxlio de uma pina e despreze a tnica albugnea. Macere bastante os tbulos para liberao das clulas e obteno da suspenso celular.
c) Coloque a suspenso celular na estufa a 37 C durante 30-40 minutos.
d) Aspire lentamente o sobrenadante com uma pipeta Pasteur e coloque-o em um tubo de centrfuga.
e) Centrifugue o sobrenadante aspirado a 1200 rpm durante 7 minutos. Jogue fora o sobrenadante.
f) Ressuspenda o material em metanol e cido-actico 3:1 (fixador).
Centrifugue e elimine o sobrenadante. Repita essa operao trs vezes.
g) Ressuspenda o material em fixador fresco e pingue 2 gotas em
lmina limpa e seca.
h) Siga o procedimento usado para corar as RONs (item 11.6) em vertebrados, do item a at e.
A Figura 18 a-b mostra complexos sinaptonmicos do roedor
Thrichomys apereoides.
Ateno:
Outra maneira de corar as lminas pingando, em cada uma, 4 gotas
de uma soluo de nitrato de prata (diludo em gua destilada) a 50% e
cobrindo com uma lamnula. Incube na estufa a 70 oC, em cmara mida
de 2 a 4 horas. Esse tempo de incubao pode ser reduzido para 45
minutos, colocando-se na soluo de nitrato de prata (2 ml) 1 gota de
formol a 3%.
10.4.3 - Anlise de complexo sinaptonmico em gafanhotos
(tcnica de disperso ou spreading)
a) Anestesie o animal, disseque e limpe os testculos pelo mtodo
de rotina usando Ringer, como descrito no item 10.1 a-b.
b) Transfira os testculos para uma pequena placa de Petri (5 cm de
dimetro), contendo cerca de 1,5 ml de Ringer.
107
Figura 18 Complexo sinaptonmico no roedor Thrichomys apereoides. (a) zigteno e (b) paquteno.
As setas indicam a vescula sexual. Fotos do autor.
c) Separe um folculo testicular, esmague em orcena actica e verifique a qualidade do material. Caso o material esteja rico em paqutenos,
separe um dos testculos para anlise normal, fixando-o como de rotina.
Use apenas um testculo para a preparao de complexo sinaptonmico.
d) Macere bastante o material, em 2 ml de soluo de Ringer, at conseguir uma boa suspenso de clulas.
e) Limpe lminas de boa qualidade com lcool 70% e seque-as.
f) Coloque na lmina 4 gotas de detergente Lipsol (Lip. Ltd. Shipley,
England) a 1% e em seguida 1 gota da suspenso de clulas de testculos.
Misture bem e acompanhe ao microscpio para observar o aumento de
tamanho dos ncleos. Quando os ncleos comearem a romper, coloque 5
gotas de fixador (4 gramas de paraformaldedo em 100 ml de gua destilada
a 70 C, mais 3.4 g de sacarose. Evite os vapores), para interromper a ao
do detergente. Depois de adicionar o fixador, mexa a lmina para misturar o
material e, em seguida, passe um basto de vidro para fazer um filme sobre
a lmina.
g) Coloque as lminas numa caixa fechada, para evitar poeira, de 12 a
18 horas.
h) Lave as lminas com gua destilada, colocando-as dentro de uma
cuba de vidro. Deixe secar ao ar.
108
i) Core a lmina com uma soluo de nitrato de prata a 50%. Cubra

com lamnula e deixe por 30-50 minutos em estufa a 70 oC. A colorao
deve ser acompanhada ao microscpio para controlar o tempo.
j) Lave as lminas em jarro de Coplin com gua destilada, seque e
analise. A Figura 19 c-d apresenta complexos sinaptonmicos do gafanhoto Xyleus angulatus e do morcego Sturnira lilium, respectivamente.
Ateno:
Para obter uma melhor colorao pode-se substituir a lamnula do
item i por retalho de tecido de nylon, de tamanho idntico lamnula e
que contenha poros estreitos.
Esta tcnica tambm pode ser utilizada em outros grupos de insetos,
por exemplo colepteros, heterpteros, etc.
e
Figura 19 Colorao com nitrato de prata em clulas meiticas de gafanhoto e morcego. Em a
diplteno com marcao das RONs. Em b metfase I com marcao de cores e cinetcoros. Em c e
d complexos sinaptonmicos. Em e espermtides com centrolos adjuntos (CA) marcados. Em a, b, c e
e so mostradas clulas do gafanhoto X. angulatus. Em d clula do morcego Sturnira lilium. Setas em a
mostram remanescentes nucleolares dos cromossomos com RONs e em d a vescula sexual. Fotos do autor.
109
11 - Como corar diferencialmente

cromossomos mitticos, meiticos,
politnicos e cromatina sexual
A colorao convencional dos cromossomos permite apenas uma identificao grosseira do caritipo, no levando a uma caracterizao mais precisa do mesmo. Tcnicas de identificao cromossmica, como bandeamento G e R, fornecem uma diferenciao longitudinal dos cromossomos,
o que permite identificar individualmente os mesmos. Rearranjos estruturais e numricos tambm podem ser identificados usando essas tcnicas.
Outras tcnicas como bandeamento C e colorao com nitrato de prata,
permitem identificar, respectivamente, regies de heterocromatina
constitutiva e regies organizadoras de nuclolos (RONs).
O bandeamento C a tcnica mais amplamente utilizada para estudo da heterocromatina constitutiva em animais e plantas, desde o incio
da dcada de setenta. Os fluorocromos cromomicina A 3 (CMA3) e 4'-6diamidino-2-fenilindol (DAPI) tambm tm sido utilizados com o objetivo
de obter informaes sobre a natureza da heterocromatina constitutiva
com respeito sua composio de bases. Esses corantes coram preferencialmente seqncias de DNA ricas em pares de bases GC e AT, respectivamente.
Embora o bandeamento G seja o principal mtodo usado para evidenciar as bandas eucromticas em vertebrados, o bandeamento R (bandeamento reverso ao padro de bandas G) ainda bastante utilizado.
Existe um nmero de diferentes tcnicas para a produo de bandas R.
Essas tcnicas podem ser divididas em duas classes principais: aquelas
que usam o Giemsa como corante e as que usam fluorocromos, por exemplo, a acridina orange. Em geral, o bandeamento R tem sido aplicado em
material de cultivo de linfcitos ou fibroblastos onde se usa incorporao com 5-BrdU (5-bromodeoxiuridina). O 5-BrdU incorporado s reas
cromossmicas que esto replicando, bloqueia o ciclo celular na fase S.
A incorporao de 5-BrdU nos cromossomos induz padro de bandeamento que depende do momento da fase S durante o qual esse
nucleotdeo anlogo da timina foi incorporado ao DNA. Ento, essas bandas so denominadas bandas de replicao, indicando o padro de
replicao cromossmica.
J o uso da colorao com nitrato de prata, em geral, possibilita identificar nuclolos e regies organizadoras de nuclolos (RONs) em clulas
mitticas de vertebrados. Em cromossomos meiticos, especialmente em
gafanhotos, a prata permite detectar, alm de nuclolos (ou remanescente nucleolar) (Figura 19a), outras estruturas de cromossomos, como cinetcoros e core (Figura 19b) e o centrolo adjunto (CA) das espermtides
(Figura 19e). Vale destacar que em vrias espcies de insetos, gafanhotos em particular, o nuclolo (remanescente nucleolar) desintegra no incio (paquteno/diplteno) da prfase I da meiose. Tambm, nesses organismos, as RONs dificilmente so detectadas em cromossomos mitticos.
111
Para as diferentes tcnicas de colorao especiais apresentadas nesse

captulo foram seguidos os procedimentos descritos por Sumner (1990) e
Verma e Babu (1995) com algumas modificaes, adaptadas para cada grupo de organismos.
11.1 - Bandeamento C (para vertebrados e invertebrados,
especialmente insetos)
a) Lminas envelhecidas durante 3 ou 4 dias produzem bons resultados, entretanto, possvel usar lminas recentemente preparadas. Nesse
caso, basta que depois de preparadas fiquem na estufa a 40 C, por um
perodo de 3 horas.
b) Mergulhe a lmina em uma soluo de cido clordrico 0,1N por 30
minutos temperatura ambiente.
c) Lave com gua destilada.
d) Mergulhe a lmina em soluo de hidrxido de brio 5% a 60 C de
10 segundos a 3 minutos, dependendo da idade da lmina. Lmina mais
velha (a partir de 5 dias) requer maior tempo de tratamento com brio.
e) Lave em banhos rpidos (2 minutos em cada um) de HCl 0,2N e
gua destilada.
f) Mergulhe em soluo de 2 x SSC a 60 C por 45 minutos.
g) Lave com gua destilada.
h) Core com uma soluo de Giemsa a 2% em tampo fosfato pH 6,8
por 10 minutos. Acompanhe ao microscpio. Caso a colorao no fique
adequada, submeta a lmina novamente ao corante, por mais 5-10 minutos.
i) Lave com gua destilada, seque, passe no xilol e monte com blsamo do Canad ou Euparal.
j) Analise ao microscpio. Observe na (Figura 20 a-b) padres de
bandeamento C em clulas do gafanhoto X. angulatus e do roedor Clyomys
laticeps laticeps, respectivamente.
11.1.1 - Bandeamento C (colorao com acridina orange)
a) Para fazer essa colorao siga o pr-tratamento que foi descrito
para o bandeamento C (item 11.1 a-g).
b) Core a lmina com uma soluo de acridina orange na concentrao de 0,01%. Coloque sobre a lmina 5 gotas desta soluo e deixe por 1
minuto (esse tempo deve ser testado para cada material).
112
Figura 20 Bandeamento C (a, b) em meiose (diplteno) de gafanhoto X. angulatus e mitose

(metfase) de roedor Clyomys laticeps laticeps , respectivamente. Em c e d marcaes das RONs
coradas com nitrato de prata no roedor Thrichomys apereoides e no marsupial Marmosa sp,
respectivamente. Fotos do autor.
c) Lave a lmina com gua destilada e, em seguida, coloque duas

gotas de gua destilada e cubra com uma lamnula.
d) Analise ao microscpio de fluorescncia e fotografe as melhores
fases (mitticas ou meiticas).
e) Depois de fotografadas as fases a lamnula, pode ser retirada com
uma lavagem rpida com gua destilada e, a seguir, corada com Giemsa.
Proceda como foi descrito no item 11.1 h-j. Os mesmos pontos (fases)
fotografados aps a colorao com acridina orange podem ser tambm foto-
113
grafados aps a colorao com Giemsa e, assim, tm-se as mesmas clulas

analisadas com as duas coloraes. A (Figura 21 a-b) apresenta uma mesma metfase I do gafanhoto Phaeoparia megacephala pr-tratada para o
bandeamento C e corada com acridina orange e em seguida com Giemsa.
Figura 21 Metfase I de macho do gafanhoto Phaeoparia megacephala mostrando o padro de

bandas C corado com acridina orange (a) e em (b) a mesma clula corada com Giemsa. Em c e d
padro de bandas G no morcego A.lituratus e em humano, respectivamente. Fotos do autor.
Ateno:
Em geral, existe uma correspondncia entre os padres de
distribuio da heterocromatina constitutiva (bandas C) quando as
lminas so pr-tratadas para o bandeamento C, coradas com acridina
orange e a seguir, com Giemsa. Entretanto, uma das vantagens de usar
as duas coloraes que, quando os blocos de heterocromatina do
complemento so muito pequenos, eles aparecem com maior definio
na colorao com acridina orange.
114
11.2 - Anlise da heterocromatina constitutiva atravs da

colorao com os fluorocromos CMA3/DA/DAPI (trplice colorao).
a) Coloque duas gotas da soluo de CMA3 (0,5 mg/ml) sobre a lmina, cubra com lamnula e incube, no escuro e em caixa fechada. Deixe por
40 minutos (esse tempo deve ser ajustado para cada espcie).
b) Para retirada de lamnulas e excesso do corante lave as lminas
com gua destilada e seque temperatura ambiente.
c) Coloque duas gotas da soluo de Distamicina A (0,1 mg/ml) e cubra com lamnula. Deixe corar por 30 minutos (o tempo deve ser ajustado
para cada espcie) temperatura ambiente. Manter em caixa fechada.
d) Lave com gua destilada e seque.
e) Coloque duas gotas da soluo de DAPI (0,5 mg/ml) e cubra com
lamnula. Deixe corar por 30 minutos (adequar o tempo para cada espcie)
temperatura ambiente. Manter em caixa fechada.
f) Lave com gua destilada e seque ao ar.
g) Monte a lmina com meio de montagem com glicerol/tampo
MacIlvaine/MgCl2.
h) Examine em microscpio de fluorescncia e fotografe as melhores
fases. A (Figura 22 a-b) apresenta fases da meiose do gafanhoto Schistocerca
pallens e a (Figura 23 a-b) mitose do morcego Carollia perspicillata
marcadas pela trplice colorao CMA3/DA/DAPI.
Ateno:
Para cromossomos humanos, de pequenos mamferos e de insetos
esses fluorocromos podem ainda ser usados para fazer coloraes
duplas, em lminas diferentes, da seguinte maneira: CMA3 + Distamicina
A (CMA3/DA) ou DAPI + Distamicina A (DA/DAPI). O DAPI tambm pode
ser contracorado com actinomicina D (DAPI/AMD).
CMA3 e DAPI podem igualmente, ser usados em lminas prtratadas para o bandeamento C. Nesse caso, em vez de serem
coradas com Giemsa, so coradas com esses fluorocromos. Aps
serem fotografadas, as lminas so descoradas (colocadas no fixador
etanol-cido actico, 3:1 no caso de insetos, e metanol-cido actico
3:1, no caso de vertebrados, durante 18 horas) para a retirada do
fluorocromo e, em seguida, coradas com Giemsa. Desta maneira,
obtm-se uma colorao seqencial CMA3/DA/DAPI/bandas C na
mesma preparao.
Em vertebrados, particularmente em mamferos, a colorao com os
fluorocromos DAPI e CMA3 (trplice colorao CMA3/DA/DAPI) pode
induzir padres de bandeamento da eucromatina. Assim, a colorao
115
c
Figura 22 Trplice colorao CMA 3/DA/DAPI em clula meitica do gafanhoto Schistocerca pallens
(a, b) e colorao DA/DAPI em metfase mittica humana (c). Notar as regies CMA3 + em a e a
marcao dos cromossomos 1,9,16 e Y em c. Fotos do autor.
com DAPI mostra padro de bandas G (bandas de replicao tardia e

ricas em AT). Por sua vez, a colorao com CMA3 mostra padro de
bandas R (bandas de replicao precoce e ricas em GC).
11.3 - A colorao DA/DAPI em cromossomos humanos
a) Use lminas com envelhecimento de 3 a 5 dias
b) Coloque 3 gotas da soluo de Distamicina A (DA) (0,5 mg/ml) sobre a lmina. Cubra com lamnula e incube, no escuro e em caixa fechada.
Deixe por 15 minutos na temperatura ambiente.
c) Lave a lmina em gua destilada e seque temperatura ambiente.
116
Figura 23 Trplice colorao CMA3DA/DAPI em metfase mittica do morcego Carollia perspicillata

(a, b) e colorao sequencial AgNO3/CMA3 no morcego Artibeus lituratus (c, d). Notar em a os blocos
CMA3+ e o padro de bandas R (rico em GC ) e em b o padro de bandas G (rico em AT). Em c est
destacada a colorao CMA+ das RONs e em d a marcao das mesmas com nitrato de prata (Fotos:
Santos e Souza, 1998a, 1998b).
d) Coloque 3 gotas da soluo de DAPI (0,5 mg/ml) e cubra com

lamnula. Core no escuro durante 30 minutos temperatura ambiente.
e) Lave com gua destilada e seque temperatura ambiente.
f) Faa a montagem da lmina e retire o excesso do meio de
montagem.
g) Guarde a lmina no escuro em caixa fechada por um perodo
de 24 a 72 horas, para estabilizar a colorao, antes de analisar no
microscpio de fluorescncia. A (Figura 22c) , mostra a colorao DA/
DAPI em humano.
117
Ateno:
Cromossomos humanos corados com DA/DAPI mostram fluorescncia brilhante nas regies pericentromricas dos cromossomos 1, 9 e
16. Adicionalmente, a regio proximal do brao curto do 15 e distal do
brao longo do Y tambm so marcadas.
11.4 - Colorao seqencial AgNO3/CMA3
a) Coloque sobre a lmina 4 gotas da soluo coloidal de gelatina,
juntamente com 4 gotas da soluo de nitrato de prata a 50% e cubra com
lamnula.
b) Coloque a lmina em cmara mida e, em seguida, no forno temperatura de 70 C por 3 a 5 minutos.
c) Lave com gua destilada e monte a lmina usando 2 ou 3 gotas de
gua destilada.
d) Analise ao microscpio e fotografe as melhores clulas com RONs
marcadas.
e) Retire a lamnula com um leve jato de gua destilada.
f) Descore a lmina usando algumas gotas da soluo de hexacianoferrato de potssio (K3[Fe(NC)6]) a 1% recm-preparado e resfriado a 1 C.
Cubra com lamnula e deixe descorar por 20-60 segundos. Retire a lamnula
lavando com gua destilada.
g) Mergulhe a lmina numa soluo de tiossulfato de sdio pentahidratado a 20%, por 20 segundos. Lave a lmina e deixe secar temperatura ambiente e em repouso por dois dias.
h) Faa a colorao CMA3 /DA/DAPI conforme descrito no item 11.2 a-h.
i) Analise a lmina ao microscpio de fluorescncia e fotografe as
mesmas clulas (metfases, por exemplo) marcadas pelo nitrato de prata e
anteriormente fotografadas. A Figura 23 c-d mostra colorao seqencial
AgNO3/CMA3 no morcego Artibeus lituratus.
Ateno:
A colorao seqencial AgNO3/CMA3 pode tambm ser feita iniciando
pela colorao com CMA3 conforme o item 11.2 a-h. Depois de fotografar
as fases, descore a lmina mergulhando-a em fixador metanol actico,
3:1 por um perodo de 18 horas. A partir da, proceda a colorao com
AgNO3 de acordo com o item 11.4 a-d, fotografando as mesmas clulas
j fotografadas com a colorao CMA3. Em alguns materiais, com esse
procedimento, possvel diminuir o grau de precipitao do nitrato de
prata sobre a lmina.
118
11.5 - Observao de nuclolos , RONs, cores e cinetcoros de

insetos
a) Prepare as lminas por esmagamento (item 10.1.1) ou suspenso
(item 10.1.2) de folculos testiculares. Para essa colorao, as lminas no
precisam envelhecer, mas aps serem preparadas devem ficar por 3 horas
na estufa a 40 C.
b) Passe as lminas na soluo de 2 x SSC aquecido a 60 C, durante
10 minutos.
c) Lave com gua destilada.
d) Prepare uma cmara mida (uma placa de Petri forrada com papel
de filtro e umedecida com gua destilada). Deve-se colocar alguns bastes
de vidro para servir como suporte para as lminas e colocar na estufa at
atingir de 70 a 80 C.
e) Coloque uma gota da soluo de nitrato de prata sobre cada lmina. Cubra com lamnula e coloque em cmara mida previamente aquecida.
f) Aps 2 minutos, acompanhe ao microscpio at o material se apresentar corado.
g) Lave a lmina retirando a lamnula.
h) Seque, monte em blsamo do Canad ou Euparal. Analise e fotografe as RONs, cores, cinetcoros e centrolos adjuntos (CA).
Ateno:
A soluo de nitrato de prata AgNO3, nesse caso, deve ser preparada
da seguinte maneira:
Em 100 ml de gua destilada coloque uma gota de cido frmico.
Deve ser atingido o pH 3,0 a 3,5.
Dissolva o nitrato de prata na soluo acima, na proporo de 0,5
grama de AgNO3 para 1 ml de gua com cido frmico.
Os centrolos adjuntos (CA) corados pelo nitrato de prata podem
ser indicadores do nvel de ploidia das espermtides. As espermtides
normais (n) tem somente 1 CA e aquelas anormais (2n, 3n, etc)
mostram 2 CA, 3 CA, respectivamente. Esse padro tem sido usado
para analisar anormalidades relacionadas com baixos nveis de
fertilidade em algumas espcies de gafanhotos, portadores de
cromossomos B.
11.6 - Anlise das RONs em vertebrados
a) Coloque na lmina 4 gotas da soluo coloidal de gelatina, juntamente com 4 gotas da soluo de nitrato de prata (2 g de AgNO3 em 4 ml de
119
gua destilada). Misture as duas solues movimentando a lmina delicadamente. Cubra com lamnula.
b) Coloque as lminas numa cmara mida, conforme item 11.5 d.
c) Coloque em banho-maria a 70 C ou em forno na mesma temperatura, por 3 a 5 minutos. Acompanhe a colorao ao microscpio.
d) Lave com gua destilada, seque, passe no xilol e monte em blsamo do Canad ou Euparal.
e) Analise ao microscpio. A Figura 20 c-d mostra colorao AgNO3
no roedor Thrichomys apereoides e no marsupial Marmosa sp, respectivamente.
Ateno:
Lminas recentemente preparadas geralmente do bons resultados.
Nesse caso, depois de preparadas, as lminas devem ficar na estufa a
40 C por pelo menos 2 horas antes do momento da colorao.
11.7 - Bandeamento G e bandeamento R em humano e outros mamferos
11.7.1 - Bandeamento G para humano e outros mamferos
a) conveniente usar lminas com envelhecimento de 4 dias a 1 semana. Bons resultados, entretanto, podem ser obtidos com lminas recentemente preparadas. Nesse caso, coloque-as na estufa a 40 C por 24 horas
e reduza o tempo de tratamento com tripsina.
b) Dissolva 0,25 g de tripsina em 50 ml da soluo de cloreto de sdio
a 0,85%. A tripsina tambm pode ser diluda em tampo fosfato pH 6,8 ou
em Hanks.
c) Faa um filme da soluo de tripsina sobre a lmina e deixe de 10
segundos a 1 minuto dependendo da idade da lmina. Em lminas mais
velhas aumente o tempo de tratamento.
d) Lave com gua destilada.
e) Core com uma soluo de Giemsa a 5%, diluda em tampo fosfato
pH 6.8, durante 7 minutos.
f) Lave com gua destilada, seque, passe no xilol e monte em blsamo do Canad ou Euparal.
g) Analise ao microscpio e fotografe as melhores clulas. Observe
na Figura 19 c-d padres de bandeamento G no morcego Artibeus lituratus
e em humano, respectivamente.
120
Ateno:
Em mamferos, preparaes citolgicas provenientes de diferentes
tecidos respondem diferentemente quando tratadas com tripsina.
Cromossomos obtidos a partir de fibroblastos, linfcitos e medula ssea
reagem com aumento de sensitividade, nessa ordem, podendo,
portanto, ser tratados com diferentes tempos de tripsina.
11.7.2 - Bandeamento R por incorporao de 5-Bromodesoxiuridina
(5-BrdU)
a) Tanto para material a ser obtido por cultivo de fibroblastos como
de linfcitos, nas ltimas 6-12 horas, do cultivo celular, adicione 5-BrdU
numa concentrao final de 25 mg/ml. Envolva o frasco de cultura com
papel de alumnio e deixe-o na estufa a 37 C.
b) Aproximadamente 45 minutos antes da colheita do material, adicione 1 gota da soluo de colchicina (0,01%) para cada 5 ml de meio de
cultura contido no frasco. Devolva o frasco estufa a 37 C, durante 1 hora.
Prepare as lminas de acordo com o que foi descrito anteriormente para o
cultivo de fibroblastos (9.2.4. e-i) ou para cultivo de linfcitos (9.1.1 f-i).
c) Para iniciar o processo de colorao, mergulhe as lminas na soluo de Hoechst 33258 na concentrao final de 10 mg/ml, em jarro de Coplin
envolto com papel de alumnio, por 20 minutos. Lave em gua destilada.
d) Passe as lminas rapidamente na soluo de 2 x SSC temperatura
ambiente. Coloque 3 gotas de 2 x SSC sobre cada lmina e cubra com
lamnula.
e) Monte uma cmara mida com 2 x SSC, numa placa de Petri grande (10 cm de dimetro) forrada com papel de filtro. Disponha as lminas
sobre bastes de vidro (suporte) e cubra a placa com filme de PVC transparente (Plastic film). Coloque sob luz negra por duas horas. As lminas
devem ficar a uma distncia de aproximadamente 30 cm da lmpada.
Como luz negra pode ser utilizado a lmpada UVK 125-2 C4 da Phillips
ou similar.
f) Lave as lminas em gua destilada e deixe por 15 minutos em soluo de 2 x SSC a 60 C.
g) Lave as lminas em gua destilada e core com uma soluo de
Giemsa a 5%, diludo em tampo fosfato pH 6,8 por 5-8 minutos.
h) Lave as lminas em gua destilada, seque e monte com blsamo
do Canad ou Euparal. Analise em microscopia de luz visvel.
Ateno:
O padro de bandas R (bandas reversas ao padro de bandas G)
121
tambm pode ser obtido corando a lmina com uma soluo de acridina
orange. Inicie com a soluo me de 1mg/ml e dilua na proporo de
2,5 ml desta soluo em 50 ml de tampo fosfato pH 6,8. Core as lminas
por 20 minutos. Lave com tampo fosfato pH 6,8. Monte cada lmina
colocando 2 gotas de tampo fosfato pH 6,8 e cubra com lamnula.
Analise e fotografe usando microscpio de fluorescncia.
Usando as tcnicas de bandas R, tanto com a colorao com Giemsa
como com acridina orange possvel identificar o cromossomo X de
replicao tardia em fmeas de mamferos, diferenciando-o do X de
replicao precoce.
Uma grande vantagem do uso da tcnica de bandas R que ela
cora fortemente regies telomricas de vrios cromossomos do
complemento cujas marcaes so negativas pela tcnica de
bandas G.
11.8 - Anlise de cromossomos politnicos de drosfila e da cromatina
sexual humana
11.8.1 - Coleta de drosfila na natureza
As drosfilas so um grupo de insetos (dpteros) bastante usadas para
estudos de cromossomos politnicos. Os cromossomos politnicos podem ser vistos principalmente em clulas das glndulas salivares, bem
como em clulas de ceco gstrico e tbulos de Malpighi das larvas. Diferentes espcies de drosfila podem ser obtidas usando-se iscas de bananas, contidas em frascos de boca larga, colocadas em diferentes locais
(jardins, pomares, etc). As moscas faro a postura nas iscas permitindo,
assim, a posterior obteno de larvas. Tambm pode ser usado o prprio
meio de cultura.
Existem diferentes protocolos para preparao de meio de cultura para
drosfila. Um dos aspectos mais importantes em experimentos e manuteno destas culturas o cuidado com o material (frascos, tampas) usado na
preparao do meio de cultura, que dever ser limpo e esterilizado. Durante o seu ciclo vital, a drosfila passa pelas fases de ovo, larva, pupa e
mago (animal emergido da pupa). A durao do ciclo vital varia de acordo
com a temperatura e com a espcie. Na temperatura de 25 C, o ciclo de
Drosophila melanogaster ocorre com a seguinte cronologia: ovo-larva (3
dias), larva-pupa (5 dias) e pupa-mago (7 dias). Existem diferentes procedimentos para preparao de meio de cultura, obteno de cromossomos
politnicos, e tambm diferentes manejos para esse grupo de dpteros.
11.8.2 - Preparao de lminas para obteno de cromossomos
politnicos
a) Selecione as larvas maiores. Coloque cada larva em uma lmina
limpa e seca, acrescente uma gota de soluo de Ringer.
b) Com o auxlio de uma pina, segure a poro posterior do corpo da
122
larva (Figura 24a) e, com um estilete, firme a cabea de encontro com a

lmina. Um movimento firme dever romper a parte anterior do corpo e
expor as glndulas salivares.
c) As glndulas salivares devero ser transportadas para uma pequena cuba de vidro, onde sero mergulhadas no fixador (etanol-cido actico
3:1) durante 10 minutos.
d) As glndulas devem ser transferidas para uma lmina contendo
uma gota de cido actico 45%, por 2 minutos. Retire o excesso de cido
actico, usando uma tira de papel de filtro para absoro do mesmo.
e) Coloque uma gota de orcena actica a 2% e ponha uma lamnula
sobre o material. O tempo de colorao deve ser acompanhado ao
microscpio.
f) Faa o esmagamento entre lmina e lamnula. As lminas ricas
em clulas politnicas devem ser lutadas para evitar a evaporao do
corante.
Maiores informaes sobre tcnicas bsicas e mais avanadas para
Drosophila podero ser obtidas nos trabalhos de Shorrocks (1972) e Sullivan
et al.(2000).
A Figura 24 a - b apresenta um esquema para disseco de larvas e
um conjunto de cromossomos politnicos de Drosophila.
11.8.3 - Localizando a cromatina sexual humana
a) Usando uma esptula raspe a face interna da bochecha. Despreze
o primeiro raspado e raspe novamente. Faa um esfregao do material sobre uma lmina limpa e seca.
b) Mergulhe a lmina no fixador (ter-etanol a 95%, 1:1) por 10
minutos.
c) Mergulhe a lmina no etanol 79% e 50%, 2 minutos em cada.
d) Coloque duas gotas de orcena actica a 2% sobre a lmina, cubra
com lamnula e acompanhe a colorao ao microscpio.
e) Quando o material estiver corado faa o esmagamento, colocando
a lmina envolta no papel de filtro pressionando com o polegar.
f) Analise ao microscpio. Selecione os ncleos mais ntegros e identifique o corpsculo de cromatina sexual.
g) A orcena actica pode ser substituda pelo reativo de Schiff. Para
isso, as lminas so mergulhadas em um borel contendo o reativo, por um
123
b
Figura 24 Em a esquema usado para disseco de larva de Drosophila, visando obteno da glndula
salivar. (b) cromossomos politnicos de Drosophila malerkotiliana. gs=glndula salivar; gc=gnglio cerebral;
td=tubo digestivo (Foto: Tania T. Rieger/UFPE).
perodo de, pelo menos, 2 horas. A colorao feita no escuro (envolver o

borel com papel de alumnio). Essa colorao define o corpsculo de
cromatina com mais nitidez.
Ateno:
A cromatina sexual (corpsculo de Barr) representa um corpsculo
heteropicntico positivo observvel em ncleos interfsicos de clulas
somticas de fmeas de mamferos e que desaparece na mitose. Esse
corpsculo tem relao com o sexo do indivduo em cujas clulas ele
aparece. Existe uma relao entre os corpsculos e os cromossomos
X: o nmero de corpsculos de Barr observado igual ao nmero de
cromossomos X menos um. Portanto, no aparecem nas clulas
somticas do homem normal (XY) e nas clulas somticas de mulheres
normais (XX), aparece apenas um.
124
12 - Como preparar as solues e

meios de cultura
usados na citogentica animal.
12.1 - Soluo de Ringer (soluo fisiolgica de insetos) - 1000 ml
a) Use um bquer de 1500 ml e coloque 500 ml de gua destilada
estril. Dissolva 6,5 g de NaCl em seguida 0,25 g de KCl e nessa ordem,
0,20 g de NaHCO3 e 0,30 g de CaCl2. Para dissolver essas substncias use o
agitador magntico.
b) Complete para 1000 ml de gua destilada e deixe no agitador por
mais 5 minutos.
Ateno:
Dissolva as substncias na ordem descrita acima. Cada substncia
s deve ser colocada quando a precedente estiver completamente
dissolvida. Manter a soluo na geladeira.
12.2 - Soluo de Hanks (soluo salina balanceada) - 500 ml
estril. Dissolva 4,0 g de NaCl, em seguida 0,2 g de KCl e, nessa ordem,
0,024 g de Na2HPO4; 0,5 g de C6H12O6 e 0,17 g de NaHCO3. Dissolva essas
substncias usando agitador magntico.
b) Por ltimo, coloque 0,5 g de vermelho fenol.
c) Complete para 500 ml com gua destilada estril. Agite at completa dissoluo. Mantenha na geladeira.
12.3 - Soluo desinfetante de merfene - 75 ml
estril. Dissolva 0,025 g de borato de fenilmercrio. Adicione 25 ml de
etanol 95%.
b) Complete para 75 ml com gua destilada e mantenha na geladeira.
12.4 - Orcena actica a 2% -100 ml
a) Use um bquer de 250 ml e coloque 100 ml de cido actico 45%
b) Coloque o bquer no agitador magntico e adicione 2,0 g de orcena.
Deixe agitando por 10 minutos.
c) Filtre e guarde em frasco fechado, na temperatura ambiente.
12.5 - Orcena lcto actica a 1% - 100 ml
125
a) Dissolva 1,0 g de orcena em 25 ml de gua destilada estril. Adicione 25 ml de cido actico glacial. Ferva, acrescente 25 ml de cido ltico
a 85% e deixe ferver.
b) Acrescente 25 ml de gua destilada e ferva novamente por 3 minutos. Deixe esfriar.
c) Filtre e conserve na temperatura ambiente.
12.6 - Soluo de fermento - 25 ml
a) Dissolva de 2,0 a 3,0 g de fermento Fleischam biolgico seco em
25 ml de gua destilada aquecida (temperatura de 37 C).
b) Adicione de 2,0 a 6,0 g de dextrose. Misture com um basto de
vidro e deixe em repouso por 5 minutos.
c) Para injetar nos animais, use sempre soluo fresca, feita no momento do uso.
12.7 - Soluo coloidal de gelatina - 50 ml
a) Dissolva 1,0 g de gelatina p. a. em 50 ml de gua destilada aquecida
(temperatura de 30 C). Use agitador magntico.
b) Depois de dissolver a gelatina, acrescente 0,5 ml de cido frmico.
Mantenha na geladeira por at 3 semanas.
12.8 - Meio de cultura para drosfila
gar
gua
Fub
Mel de abelha
Fermento biolgico Fleischmann, fresco
Soluo de Nipagin a 10%
9g
630 ml
65 g
65 ml
25 g
5 ml
Para preparar o meio, dissolva o gar em 500 ml de gua fria, agite e

leve ao fogo. Adicione o mel de abelha mexa e deixe ferver. Em outro recipiente misture o fub e o fermento nos 130 ml de gua restantes. Adicione
esse contedo ao recipiente contendo mel e gar e ferva, mexendo, durante 10 a 15 minutos, para que o meio adquira uma boa consistncia. Retire
do fogo e deixe esfriar um pouco. Adicione 5 ml da soluo de Nipagin a
10%. Em cada frasco com capacidade para 200 ml distribuir uma camada
de meio com cerca de 2 cm de espessura. Tampe os frascos com tampa de
gase com recheio de algodo. Antes dos frascos serem usados deve-se
colocar uma tira dupla de papel de filtro embebida da soluo de Nipagin a
10%. Esse papel absorver o excesso de umidade do meio e servir como
suporte para as moscas e pupas.
Para preparar a soluo de Nipagin a 10% dissolva 10 gramas de Nipagin
em 100 ml de etanol a 96%.
126
12.9 - Meio de cultura para linfcitos - 120 ml

a) Prepare o meio RPMI 1640 conforme instruo do fabricante e em
condies estreis. Para preparar o meio use vidraria (bquer, pipeta, etc.)
estril e realize todo procedimento dentro do fluxo laminar. Em geral, prepara-se 1 litro de meio (soluo estoque). Filtre o meio, usando filtro Millipore
ou similar. Esse meio deve ser dividido em alquotas de 100 ml, e guardado
no freezer.
b) Preparo de meio para uso: em 100 ml de meio estril adicione 20
ml de soro bovino fetal; 1,3 ml de Penicilina (10.000 U/ml); 1,3 ml de
Estreptomicina (10 mg/ml) e 1,3 ml de Glutamina-A (29 mg/ml).
Ateno:
O meio de cultura RPMI 1640 pode ser substitudo por outros meios,
como, por exemplo, TC199, McCoy 5 A ou RPMI 1630 (preparar segundo
instruo do fabricante);
A fitohemaglutinina liofilizada deve ser dissolvida numa quantidade
apropriada de gua destilada estril (conforme sugesto do fabricante).
A soluo de uso pode ser estocada no freezer por algumas semanas.
A forma liofilizada pode ser estocada numa temperatura de 2 a 5 C por
vrios meses;
Cada frasco de cultivo deve conter 10 ml de meio completo. A
fitohemaglutinina (0,2 ml/10 ml do meio), entretanto, deve ser
adicionada no momento de iniciar o cultivo de linfcitos;
Todo preparo do meio completo ou de seus componentes
particulares deve ser realizado em condies estreis e dentro do fluxo
laminar.
12.10 - Meio de cultura para fibroblastos - 120 ml
a) Prepare o meio de cultura Dulbeccos, conforme instruo do fabricante, e em condies estreis. Em geral, prepara-se 1 litro (soluo estoque) de meio. Esse meio deve ser filtrado, dividido em alquotas de 100 ml
e mantido no freezer. Para preparar o meio completo para uso, descongele
cada alquota de 100 ml.
b) Em 100 ml de meio (estril/filtrado) adicione 20 ml de soro bovino
fetal; 0,6 ml de Neomicina (50 mg/ml); 0,0012 mg de Fungizon (=Anfotericina
A - 0,01 mg/ml) e 0,5 ml de Gentamicina A (4 mg/ml).
Ateno:
Para preparar a Neomicina, pese 0,5 mg da substncia e dissolva em
10 ml da soluo de Hanks estril (concentrao final 50 mg/ml);
coloque 0,6 ml dessa soluo em 120 ml de meio completo.
Para usar a Fungizon, pese 0,0012 mg desta substncia, coloque em
100 ml de meio e filtre antes de colocar o soro bovino fetal.
127
Referncias bibliogrficas
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Sumner, A.T. (1990). Chromosome Banding. London, Unwin Hyman, 434
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Yonenaga, Y. (1972). Polimofismos cromossmicos em roedores brasileiros. Tese de Doutoramento. Departamento de Biologia. Instituto de
Biocincias. Universidade de So Paulo. So Paulo, 214 pp.
Literatura recomendada
Fukui, K. e Nakayama, S., Eds. (1996). Plant Chromosomes: Laboratory
Methods. CRC Press, Boca Raton, 274 pp.
Trata-se de uma seleo muito objetiva de tcnicas usuais em
citogentica vegetal, descritas por diferentes autores. Cada captulo
apresenta tambm uma boa introduo terica sobre o tema. As tcnicas so descritas com bastante detalhes, excelentes ilustraes e extensa reviso bibliogrfica.
Freshney, R.I. (1986). Animal Cell Culture - A Practical Approach. Oxford,
Washington. 247 pp.
Este livro corresponde a um completo manual de tcnicas bsicas para
cultivo de clulas animais. O texto inclui consistente fundamentao
terica e prtica para o cultivo de diferentes tipos de clulas. Alm
disso, apresenta informaes detalhadas sobre equipamentos para laboratrios, tcnicas de esterilizao e diferentes meios de cultura
Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D. e Leitch, I. J. (1994) - In Situ
Hybridization: A Pratical Guide. Bios Scientific Publishers, Oxford, 118 pp.
130
Apresenta o protocolo para hibridizao in situ em vegetais, utilizado

pelos autores em numerosos trabalhos, alm de alguns outros procedimentos complementares. Cada etapa do protocolo precedida de
uma introduo clara e objetiva sobre a teoria relacionada quela etapa. O captulo final discute os principais tipos de falhas tcnicas e
indica sugestes de como corrigi-las.
Schwarzacher, T. e Heslop-Harrison, P. (2000). Pratical In Situ
Hybridization. Springer-Verlag, New York, 203 pp.
Trata-se de um manual prtico, com um roteiro semelhante ao de Leitch
et al. (1994), dividindo o procedimento em suas vrias etapas, com
uma pequena introduo terica para cada. Ao final, os autores discutem as falhas mais comuns da tcnica e sugerem alternativas para
solucion-las, indicam uma relao dos principais fornecedores de
reagentes e equipamentos e uma extensa lista de referncias bibliogrficas. Escrito em uma linguagem simples, apresenta ainda bons
esquemas e diversas fotos estimulantes.
Sullivan, W., Ashburner, M e Hawley, R. S. (2000). Drosophila Protocols.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 728 pp.
O livro apresenta diferentes protocolos relativos a estudos de biologia
clssica e molecular em Drosophila. Os diferentes captulos incluem uma
introduo terica, alm de excelentes ilustraes, figuras e tabelas.
Sharma, A.K. e Sharma, A. (1999). Plant Chromosomes - Analysis,
Manipulation and Engineering . Harwood Academic Publishers,
Amsterdam, 371 pp.
Uma reviso extensa sobre praticamente todas as principais tcnicas
tradicionais e modernas em citogentica vegetal. O texto inclui alm
das tcnicas tradicionais da citogentica, diversos protocolos sobre
manipulao de cromossomos e clulas, microscopia eletrnica e
confocal, mapeamento e seqenciamento de fragmentos de DNA, cultura de clulas, transformao gnica, etc. Os mesmos autores publicaram alguns outros livros anteriores mais extensos sobre tcnicas
em citogentica vegetal, as mais importantes das quais foram includas neste volume.
Sumner, A.T. (1990). Chromosome Banding. London, Unwin Hyman, 434
pp.
Um excelente livro, contendo um conjunto de tcnicas usuais de identificao cromossmica e de regies especficas, alm de um contedo terico para cada tcnica em particular. Muitas das diferentes tcnicas apresentadas podem ser utilizadas em diferentes grupos de organismos, desde invertebrados at vertebrados. Uma extensa reviso
bibliogrfica tambm consta do contedo do livro.
Verma, R.A e Babu, A. (1995). Human Chromosomes: Principles and
Techniques. Sec. Edition, McGraw-Hill, Inc. 419 pp.
Este livro apresenta uma relao de tcnicas clssicas e principalmente avanadas para o estudo de cromossomos humanos. Estas tcnicas
abrangem desde procedimentos para obteno de preparaes
citolgicas de cromossomos humanos, at os diferentes protocolos
para identificao cromossmica.
131
Este livro foi impresso pela Paym Grfica e Editora Ltda.

para FUNPEC-Editora em Outubro de 2002.
A fonte utilizada no texto foi Benguiat no corpo 10/12 e o
papel do miolo Alta Print 90 g/m2 fornecido pela
Cia. Suzano de Papel e Celulose.

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mento em nitrognio lquido e depois cor-las (tcnicas de esmagamento

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a) Pr-tratamento. Colete pontas de razes em crescimento ativo e

coifa e as capas mais externas da raiz procurando deixar apenas o meristema.

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h) Colorao com Giemsa. Coloque as lminas em uma cubeta e

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c) Retirar a lmina do borel, lavar rapidamente com um jato de gua

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lavada com um jato de gua destilada, seca e corada normalmente

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fragmentos de meristema. Verifique ao microscpio se as clulas esto

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b) Fixao. Transfira as razes para o fixador de Carnoy 3:1 por 2 a

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no nitrognio lquido ou gelo-seco por alguns minutos e com o auxlio de

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deve aparecer separado do restante do brao cromossmico por uma

h) Na ltima coluna da tabela acima, converta os tamanhos ampliados

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3 - Como analisar cromossomos meiticos

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podem tambm ser obtidos aquecendo-se inicialmente os botes

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A Figura 5a mostra uma clula de Nothoscordum cf pulchellum em

Figura 05 Observao da meiose. a, Final de diplteno de Nothoscordum pulchellum (n=5) corado

3.3 - Tcnica de esmagamento seguido de colorao

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