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E CLONAGEM
FERRAMENTAS UTILIZADAS NA
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE.
Clonagem de genes de
interesse para expresso e
produo de protenas
recombinantes: insulina,
hormnio de crescimento
genes de humanos
clonados em bactrias;
Plantas transgnicas;
Animais transgnicos.
PCR;
Bibliotecas genmicas;
Vetores;
Sequenciamento de DNA;
Hibridizao;
Eletroforese.
Clonagem independente de
clulas (PCR)
CLONAGEM CELULAR
CPIAS IDENTICAS!!
R=no virulentas
S=virulentas
Streptococcus pneumoniae.
PRINCPIO TRANSFORMANTE
O grande marco...
Cohen e Boyer (1973)
Formao de uma
molcula de DNA
recombinante
DNA exgeno
Ligao covalente
pela DNA ligase
ENZIMAS DE RESTRIO
Protenas que reconhecem e clivam o DNA em pontos
especficos, geralmente em sequncias de 4, 6 e 8 bases palndromas
CARACTERSTICAS
Enzimas de restrio so endonucleases;
Enzimas de bactrias;
Diferentes linhagens de bactrias expressam enzimas de
restrio;
O nome da enzima derivado do nome da linhagem e espcie
bacteriana em que foi isolada;
Cortam (hidrolisam) DNA em fragmentos definidos e
reproduzveis;
Ferramenta bsica em clonagem de genes.
NOMENCLATURA
As enzimas de restrio so chamadas de acordo com a bactria
que a produziu
Exemplo: EcoR I
Ordem de
descoberta
Gnero
Espcie
Escherichia
coli
Estirpe
RY 13
1 enzima a ser
descoberta nesta
bactria
ELETROFORESE
enzimas de restrio
DNA ligase
Vetores:
plasmdios
fagos (vrus de bactrias)
cosmdeos
cromossomos artificiais
vrus
Hospedeiros:
E. coli
levedura
clulas animais
clulas vegetais
DNA quimera
Fragmentos de DNA ligados a um vetor de clonagem
(DNA recombinante)
VETORES DE CLONAGEM
Gene de interesse cortado
usando enzimas de restrio
Plasmdeo - 0,1 a 10 Kb
Ex: pBR322; pUC; pGEM; pBluescript; pET
Fago lambda - ~0,1 a 20 Kb
Cosmdeo - ~35 a 50 kb
Cromossomos artificiais de bactrias e leveduras - fragmentos maiores
(BAC - ~100 kpb e YAC 2 Mpb)
plasmdeos
Diviso celular
cromossomo
plasmdeos
VETORES DE CLONAGEM
Poli-linker (stio mltiplo de clonagem)
EcoRI
EcoRI
DNA de interesse
EcoRI
Plasmdeo
Extremidades coesivas
Ligao
DNA recombinante
Escherichia coli
Curva de crescimento
CLULAS COMPETENTES
INCOMPETENTE!!!
Uma bactria diz-se competente quando tem a capacidade de aceitar DNA estranho.
Transformao qumica
Eletroporao
TRANSFORMAO QUMICA
Incubar 30 min
no gelo
Molculas de DNA
recombinante
Suspenso de clulas
competentes
Choque trmico
(42C/30 s)
TRANSFORMAO QUMICA
ELETROPORAO
Pulso eltrico
Cuveta
Eletroporador
Suspenso de clulas
Eletrodo
Eletrodo
Clones recombinantes
Transformao
Clula de E.coli
Meio seletivo
Ex: Meio com antibitico (ampicilina)
MC + ampicilina
Clulas transformadas
Clones resistentes a ampicilina
MC+X-gal+ampicilina
Perodo de incubao
12-16h / 37C)
DNA cromossomal
Inserto
Amp.
MC+X-gal+amp
Amp.
MC+X-gal+amp
MC+X-gal+amp
Sem plasmdeo
LacZ funcional
Colnias brancas
Colnias azuis
Sem crescimento
1.
CLONAGEM MOLECULAR
2.
3.
4.
REAO DE PCR
H2O + tampo
primers
DNA molde
A T C G
nucleotdeos
DNA polimerase
Thermus aquaticus
Thermus aquaticus uma espcie
de bactria que pode suportar
temperaturas elevadas, uma de
vrias bactrias termfilas. Esta a
fonte da enzimas resistente ao calor
como a Taq polimerase de DNA , um
dos mais importantes enzimas
na biologia molecular devido sua
utilizao na reao em cadeia da
polimerase (PCR), tcnica de
amplificao de DNA.
Thermus aquaticus
Step 1 desnaturao
1 minuto 94oC
Step 2 anelamento
45 segundos 55oC
Step 3 extenso
45 segundos 72oC
A AMPLIFICAO EXPONENCIAL!!
4o ciclo
Gene desejado
2o ciclo
1o ciclo
35 ciclos
DNA Molde
4 cpias
8 cpias
16 cpias
32 cpias
60 bilhes de cpias
TERMOCICLADOR
Geranylgeranyl diphosphate
Phytoene synthase
Phytoene
Problema:
Arroz faltam
estas enzimas
Phytoene desaturase
-carotene desaturase
Lycopene
Lycopene-beta-cyclase
Normal
Vitamin A
Deficiente
arroz
-carotene
(precursor de vitamina A)
Geranylgeranyl diphosphate
Daffodil gene
Phytoene synthase
Phytoene
via
Vitamina A
est completo
e funcional
1Gene de bactria;
Realiza as duas funes
Phytoene desaturase
-carotene desaturase
Lycopene
Daffodil gene
Golden
Rice
Lycopene-beta-cyclase
-carotene
(precursor de vitamina A)
O tomate transgnico
amadurece na planta,
ficando com mais sabor.
Mantm-se firme aps a
colheita.
Tomate tradicional
O tomate tradicional
vaporizado com
etileno para induzir a
maturao.
SUPERMERCADO
O tomate tradicional
tem de ser colhido
verde, para no ser
esmagado durante o
transporte.
Flavr Savr
Gene que amolece o
tomate (poligalacturonase)
DNA
RNA mensageiro
RNA inativado
ESTUDO DIRIGIDO
1. Principio da Tecnologia do DNA recombinante
2. Enzimas de restrio
3. Eletroforese
4. O que um vetor de clonagem?
5. Quais as caractersticas de um vetor de clonagem?
6. Qual a diferena entre plasmdeo e vetor de clonagem?