Resumo

O perfil enzimtico amiloltico de Macrocybe titans foi definido em cultivo com substrato

no compostado, bem como monitorou-se a produo de massa micelial. A produo das

enzimas a-amilase e glicoamilase foi determinada em meio contendo bagao de malte,

resduo do processo cervejeiro, suplementado com bagao de mandioca e trs tipos de

farelos: farelos de soja, trigo e arroz. O crescimento micelial axial do fungo foi avaliado

assim como determinados os parmetros de processo. A determinao das atividades

enzimticas acompanhou a cintica de produo das enzimas e protenas totais nos

tratamentos que apresentaram maior crescimento vegetativo. Verificou-se que nos meios

contendo o farelo de soja observou-se maior formao de hifas em relao aos demais

farelos, o que indica maior velocidade de crescimento fngico em substratos com alta

concentrao em nitrognio. As variaes de pH evidenciaram uma tendncia para

acidificao em todos os tratamentos, com pequena variao da umidade e da atividade de

gua. Tambm foi observada correlao entre as atividades a-amilase e glicoamilase com a

biomassa vegetativa, sendo os valores de atividade similares e decrescentes, porm superiores

no tratamento com menos concentraes em farelo de soja.

Palavras-chave: bagao de malte, Macrocybe titans, -amilase e Glicoamilase, farelo de soja.

Abstract

The production of Amylolytic Enzymes by Macrocybe titans in brewing residue.

The amylolytic enzymatic profile of Macrocybe titans it was defined in cultivation with a no

composted substrate, as well as monitored the production of mycelial mass. The production

of the enzymes was determined in a medium containing brewers spent grain, supplemented

with cassava bagasse and three kinds of meals: soybean meal, wheat brain and rice bran. The

axial mycelial growth of the fungus it was evaluated as well as in specific process parameters.
The determination of the enzymatic activities followed the kinetics of the production of

enzymes and total proteins in the treatments that presented the highest vegetative growth. In

the media containing soybean meal, there was a greater rate of formation of hyphae in

relation to other meals, which points out that the fungus grows faster in substrates with a high

concentration of nitrogen, with. The variations in the pH value evidenced a tendency for

acidification in all the treatments, with a low variation of moisture level and water activity. In

relation to the enzymatic activities of a-amylase and glucoamylase, there was correlation with

the vegetative biomass, and the activity values were similar between each other and

decreasing, however, greater in the treatment with lower concentrations of soybean meal.

Key-words: Bagasse of brewers spent grain, Macrocybe titans, -amylase and

Glucoamylase, soybean meal.

INTRODUO

Diferentes processos industriais produzem resduos que necessitam de destino

adequado, pois alm de criar potenciais problemas ambientais, representam perdas de

matrias-primas e energia, exigindo investimentos em tratamentos para controlar a poluio

(Pelizer et al., 2007). Das diversas tecnologias empregadas para reduzir ou minimizar esses

resduos, a utilizao de processos biolgicos so uma das alternativas j que estes podem

ser empregados como biomassa para cultivo de fungos de interesse econmico, podendo ser

para consumo alimentar (Tonini et al. 2007), para produo de extratos ativos para uso

teraputico e cosmtico (Mohorcic et al.2007), dentre outros.

Produtos da FES (Fermentao em Estado Slido) obtidos em sistemas empregando

reatores biolgicos ainda so limitados ao meio acadmico, sendo os principais empregados

para a produo de enzimas. Outros compostos como antibiticos, esterides, vitaminas,

cidos orgnicos e aminocidos tambm so mencionados (Souza et al., 2008). Das vrias

enzimas produzidas, as amilases so amplamente estudadas devido importncia na

hidrlise do amido (Spier et al., 2006) para aplicaes nas indstrias alimentcias, txtil e de

papel (Gupta et al., 2003; Pandey et al., 2005). As amilases hidrolisam os amidos e so

classificadas em vrias formas, dependendo de como atuam sobre as molculas de amido.

Quanto natureza das ligaes hidrolisadas, as amilases podem ser reunidas em cinco

classes: -amilases, -amilases, isoamilases, glicoamilases, ciclodextrina-glicanotransferase

(Cornelis, 1987).

Para o estudo de produo de enzimas em meio slido, os fungos so os organismos

usualmente empregados, sendo que os basidiomicetos esto sendo cada vez mais estudados

quanto capacidade de produo de enzimas (Faria et al., 2007). Souza et al. (2008), estudaram

a formao de halos enzimticos produzidos pela amilase em basidiomicetos cultivados em vrias

fontes de carbono, e verificaram que em amido de milho, maltose e farelo de trigo foi detectada a

produo de amilases em vrios isolados, particularmente em Daedalea sp.

Mas a classe dos fungos basidiomicetos mostra uma infinidade de espcies, mais de

25.000 (Putzke e Putzke, 2002), e a minoria estudada. Exemplo disso o fungo Macrocybe

titans, gnero encontrado no Brasil, a cerca de sete anos, pelo especialista em taxonomia de

macrofungos, Andr de Meijer, em Antonina (PR) (Sayka, 2008), e o qual apresenta poucos

registros no pas. A potencialidade deste fungo como produtor de enzimas ainda no encontra

registros na literatura. Alm disso, caractersticas fisiolgicas, condies de cultivo, potencial

biotecnolgico, ainda no esto documentados, tendo-se apenas conhecimento de estudos que

indicam ausncia de produo de toxinas clssicas (Stijve, 2004).

Na obteno de enzimas pelos basidiomicetos, sugere-se que a produo seja regulada

pela fonte de carbono ou substrato utilizado. O emprego de biomassa resultante do processo

de produo de cerveja um exemplo de biomassa para cultivo de fungos.

 A regio de Blumenau destaca-se no cenrio catarinense como o local de maior

incidncia de indstrias de cerveja. Alm disso, grandes indstrias esto estabelecidas em

Santa Catarina, contribuindo ainda mais para a gerao de resduos agroindustriais. Esse

processo industrial gera resduos que necessitam de destino adequado, pois alm de criar

potencias problemas ambientais, representam perdas de matrias-primas e energia, exigindo

investimentos em tratamentos para controlar a poluio (Pelizer et al., 2007).

O bagao de malte, resduo da filtrao do mosto (mistura do malte com gua) em

uma das etapas do processo cervejeiro, composto principalmente pela casca da cevada que

apresenta em sua composio hemicelulose, lignina e celulose, alm de protenas e cinzas. As

cinzas so representadas pelos minerais que atuam como cofatores enzimticos no

metabolismo celular. As protenas fornecem nitrognio orgnico para a multiplicao celular,

enquanto que a hemicelulose e a celulose, fontes de carbono, so convertidas em molculas

de gua e CO2 pelos fungos, que so dotados de um complexo enzimtico para tal fim

(Buswell et al. 1995; Vieira et al., 2008).

Em basidiomicetos, os requisitos nutricionais e ambientais no crescimento micelial

(fase vegetativa), podem evidenciar a capacidade degradativa e refletir diretamente na

produtividade enzimtica. Neste trabalho teve-se por objetivo estudar o crescimento micelial

e a produo de -amilase e glicoamilase de M. titans utilizando bagao de malte

suplementado com diferentes farelos (trigo, arroz e soja).

MATERIAL E MTODOS

Material biolgico

Os experimentos deste trabalho foram desenvolvidos nos Laboratrios de Engenharia

Bioqumica e de Processamento de Alimentos do Departamento de Engenharia Qumica do

Centro de Cincias Tecnolgicas da Universidade Regional de Blumenau (FURB). O fungo

utilizado M. titans, linhagem CNPF 131, foi proveniente do Laboratrio de Microbiologia da

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria - Centro Nacional de Pesquisa em Florestas -

EMBRAPA FLORESTAS, Colombo PR, conservado em tubos de ensaio contendo meio

Batata Dextrose-gar (BDA) a 4C 1C.

Em condies asspticas, aproximadamente 25mL de meio BDA foram colocados em

placas de Petri e inoculados fragmentos de miclio como discos de 7mm de dimetro

proveniente de cultura estoque, no centro de cada placa. Estas foram mantidas em estufa a

25C 1 C at completo preenchimento (Depcke et al., 2008). Estas placas, denominadas de

matrizes secundrias, foram utilizadas para a obteno do inculo.

Substratos para o crescimento micelial axial

O bagao de malte recm processado e proveniente da produo de cerveja Pilsen foi

obtido de uma cervejaria do Vale do Itaja (SC) na granulometria de 0,3cm 0,1 em junho de

2008. Como fontes de nitrognio foram empregados farelo de soja, trigo e de arroz. O farelo

de soja foi cedido pela Empresa Bngue Alimentos, unidade localizada em Mato Grosso.

Esse resduo foi triturado em liquidificador industrial e peneirado para obteno de um farelo,

obtendo uma granulometria de 2 mm a 5 mm. O farelo de trigo comercial foi adquirido em

agropecurias no municpio de Blumenau com uma granulometria aproximada de 1 mm

usado de forma original e o farelo de arroz, tambm com granulometria aproximada de 1 mm,

foi fornecido pela indstria Roza Cereais e Beneficiamento de Arroz da cidade de

Massaranduba SC. Como fontes de carbono foi utilizado o bagao de mandioca, fornecido

pela empresa Amafil de Cianorte (PR), j desidratado e com a granulometria de 1 a 2 mm.

A mistura de substratos resultou em nove tratamentos (Tab. 1) com cinco repeties

cada, umidificados (70% de umidade) e colocados em frascos cilndricos de 350mL fechados

com tampas metlicas com abertura de polegada na parte central e coberta com papel filtro.

Aps esterilizao dos frascos, fragmentos de miclio foram colocados por toda a superfcie e

incubados a 25 C. Duas fitas de papel milimetrado foram fixadas em posies opostas para

facilitar a medida da extenso do substrato ocupado pelas hifas no sentido axial (Tonini et al.,

2007).

Medida do Crescimento micelial axial

Iniciada a formao das hifas no substrato, foram realizadas medidas dirias do

crescimento micelial. A contagem foi interrompida quando o primeiro frasco apresentou

completa colonizao do substrato. A velocidade mdia de crescimento micelial axial foi

calculada pela equao 01:

Cf
Vm
Tf (01)

Na qual:

Vm = velocidade mdia de crescimento micelial axial (cm/dia)

Cf = medida do comprimento da disperso do miclio no tempo final (cm)

Tf = Tempo final (dias)

Para a comparao entre os diferentes tratamentos foram calculadas a mdia do

comprimento da disperso do miclio pela equao 02.

C
CT
10 (02)

Na qual:

CT = Mdia total dos frascos (cm) (5 repeties).

C = Somatria de todos os valores (cm)

10 = Nmero de leituras realizadas

A comparao dos resultados foi realizada por anlise de varincia (ANOVA) e teste de

mdia (Tukey) com nvel de significncia de 5 %, utilizando-se o programa Testes

Paramtricos com desenvolvimento em planilha Excel confeccionado pelo Professor Msc.

Carlos Efrain do Departamento de Matemtica (FURB).

Determinao das Atividades Enzimticas e Extrao das enzimas do meio slido

A determinao cintica das atividades enzimticas foram realizadas nos tratamentos

T4 e T7 (4,0g e 7,0g de farelo de soja) nos tempos 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 e 40 dias

de cultivo, aps a colonizao do miclio por todo o substrato.

Para a extrao da enzima foi adaptado o mtodo descrito por Maiorano (1990)

usando 1g de amostra para 15mL de gua destilada, sem agitao, durante 30 minutos. Aps

filtrao, o extrato resultante foi empregado para determinao da atividade das enzimas -

amilase e glicoamilase.

Atividade de -amilase

Foi empregado o mtodo proposto por Bernfield (1955) citado por Aiyer (2004). Em

um banho termostatizado a 37C, colocou-se um tubo de ensaio contendo 0,5mL de amido

solvel 1% (MERCK) juntamente com 0,2mL da amostra proveniente da extrao. O pH da

amostra foi ajustado para 5,2 e a reao ocorreu por 30 minutos. Em seguida foi levada a um

banho de gelo a fim de parar a atividade da enzima. Em tubos de Duran misturaram-se 15L

de amostra da hidrlise com 1,5mL de reagente enzimtico, agitou-se e deixou-se em repouso

por 10 minutos temperatura ambiente. A glicose liberada na reao de hidrlise descrita foi

analisada pelo mtodo da glicose-oxidase, conforme Silva et al. (2005), utilizando

procedimento descrito no Kit enzimtico Glicose Enz Color, adquirido do Laboratrio de

Anlises Clnicas Laborclin de Vargem Grande Pinhais - PR. As amostras foram lidas na

absorbncia de 500nm em espectrofotmetro UV-1650 PC, UV-Vis Shimadzu.

Uma unidade de atividade de -amilase foi definida como a quantidade de enzima

necessria para a liberao de 1mol de glicose por minuto, nas condies padronizadas,

sendo determinada de acordo com a seguinte equao (Dalsenter et al., 2005):

G VAmido PMg VE
Aa x x x
TR VA VR ME (03)

Na qual A = atividade de -amilase (U.g-1)

G = concentrao da glicose pelo mtodo glicose-oxidase (g.L-1)

Vamido = (volume do amido) (0,5mL)

VR = Volume de meio reacional (0,7mL)

VA = Volume de amostra utilizada (0,2mL)

PMg = Massa molecular da glicose (5,56mol.L-1)

TR = Tempo de reao (30 minutos)

VE = Volume da extrao (15mL)

ME = Massa seca da amostra utilizada (1g)

Atividade de Glicoamilase

A atividade de glicoamilase foi determinada pelo mtodo da glicose-oxidase, aps

reao de hidrlise (Dalsenter et al., 2005). Transferiram-se 5mL de soluo de amido 4%

(MERCK) para tubos de ensaio, em banho termosttico at atingir a temperatura de 60 C.

Adicionou-se 1mL da amostra proveniente da extrao, diluda conforme necessidade e a

reao ocorreu por 30 minutos. Em seguida os tubos foram para um banho de gelo. A medida

da glicose liberada foi determinada conforme descrito para a enzima -amilase.

 A medida da glicose livre foi feita pelo mtodo da glicose-oxidase usando 15 L da

amostra do extrato, com posterior leitura em espectrofotmetro UV-1650 PC, UV-Vis

Shimadzu na absorbncia de 500nm.

A atividade da enzima glicoamilase (Ag) em que uma unidade de atividade de

glicoamilase foi definida como a quantidade de enzima necessria para a liberao de 1mol

de glicose por minuto, nas condies padronizadas, foi determinada conforme a equao 03.

No entanto, a varivel G (glicose) foi a glicose livre e as variveis V amido (volume de amido),

VR (volume de meio reacional) e VA (volume de amostra) foram: 5 mL; 6 mL e 1 mL,

respectivamente.

Extrao das protenas do meio slido

A concentrao das protenas totais dos meios para quantificao da atividade

especfica das enzimas foi determinada em, 0,1g, de substrato, adicionando de 1mL de uma

soluo com 0,4g de NaOH em 10mL de gua destilada e de 1mL de gua destilada em tubo

Duran. Aps agitao, os tubos foram levados a gua fervente durante 5 minutos, resfriados

em banho de gelo e centrifugados por 15 minutos a 4000rpm. O sobrenadante foi usado para

dosagem de protenas totais pelo mtodo proposto por Bradford (1976).

Clculo das atividades enzimticas especficas

A atividade especfica (AS) de -amilase e de glicoamilase expressa em U.mg-1 de

protenas totais produzidas pelo fungo M. titans foi quantificada usando a equao abaixo:

AE
AS
PT

(04)

Onde:
AS = Atividade especfica (U.mg-1);

AE = Atividade enzimtica no tempo t (U.g-1);

PT = Protenas totais no tempo t (mg.g-1).

Determinaes Analticas

As determinaes analticas foram realizadas no incio e no trmino dos experimentos

de anlise do crescimento micelial.

O pH foi medido utilizando um potencimetro digital (DIGIMED, modelo DM 20).

As amostras (1g) foram suspensas em 10 mL de gua destilada. Esperaram-se 10 minutos

com agitao intermitente e procedeu-se a leitura em potencimetro digital.

A A.a. (atividade de gua), que representa a gua disponvel no meio, foi medida

utilizando o aparelho AQUALAB, que, de acordo com o manual, utiliza a tcnica de

determinao do ponto de orvalho em espelho encapsulado. Essa tcnica originria da

mdia de umidade relativa aprovada pelo AOAC (Associao de Qumicos Analistas).

Para determinao da umidade utilizou-se a adaptao feita por Maiorano (1990) do

mtodo n 14004 da A. O. A. C. (Association of Official Analytical Chemistry) de

determinao de umidade em cereais.

RESULTADOS E DISCUSSES

Efeito da concentrao dos suplementos no crescimento micelial axial de M. titans

Os fungos constituem um dos grupos de microrganismos mais importantes na

atividade de decomposio da matria orgnica em funo de sua capacidade especializada

de degradao. Esta atividade ocorre, sobretudo, na sua fase vegetativa ou micelial. Nas Fig.

1A, 1B e 1C so mostradas imagens do miclio de M. titans colonizado nos substratos dos 9

tratamentos. Miclio de cor branca prprio de basidiomicetos foi observado em todos os

tratamentos com odor fraco e indeterminado. O crescimento do miclio foi uniforme,

simtrico e denso, sendo proporcional ao teor de nitrognio, j que os tratamentos que

continham farelo mais rico em protenas, farelo de soja, 45% (Tonini et al. 2007), indicaram

mais intensamente estas caractersticas.

A colonizao inicial de M. titans (Brown-rot) no substrato foi muito lenta, tendo as

hifas se fixado aps sete dias da inoculao. A partir da a total colonizao dos substratos foi

obtida ao final de dezesseis dias de cultivo nos tratamentos T7, seguido do T4, que continham

maior quantidade de farelo de soja. Fungos da podrido branca, conhecidos como White-

rot, degradam todas as estruturas das paredes celulares vegetais, diferindo a velocidade com

que cada um destes constituintes degradado, ao contrrio dos fungos da podrido castanha

ou Brown-rot, que degradam seletivamente os carboidratos, com limitada degradao da

lignina, que resta em grandes quantidades nos substratos colonizados por estes fungos

(Pandey et al., 2005).

Quanto ao maior comprimento da disperso do miclio nos tratamentos T7 e T4, se

deve ao fato destes conterem farelo de soja que apresenta alta concentrao em nitrognio,

45%, conforme estudo de Tonini et al. (2007). Fernandes et al. (2008) tambm estudaram os

efeitos dos farelos de soja, arroz e trigo no crescimento micelial radial, estudo realizado em

placas de petri, em Lentinula boryana, obtendo a mesma resposta de maior eficincia da soja

comparativamente aos demais farelos para o aumento do comprimento da disperso do

miclio do fungo.

O efeito dos tipos e concentraes de suplementos visualizado no grfico da Fig. 2 e

Fig. 3. A velocidade mdia de formao das hifas foi superior nos tratamentos T7 e T4 com

cerca de 0,3 cm.dia-1, similar ao obtido por Depcke et al. (2008) em meio contendo gar

glicose com farelo de soja onde a velocidade mdia atingiu 0,36 cm.dia-1. Entre o farelo de
trigo e o de arroz no houve diferena estatstica entre a mdia do crescimento micelial total

do fungo.

A importncia do nitrognio no crescimento micelial foi observada por Kim et al.

(2002), que utilizaram fontes inorgnicas e orgnicas e concluram serem as ltimas,

melhores pra incrementar a produo de biomassa. Justifica-se a importncia da

suplementao em nitrognio no meio de cultura, j que este atua na sntese de aminocidos,

protenas, cidos nuclicos e de algumas vitaminas pelo fungo. No entanto, altas

concentraes inibem a sntese de enzimas lignolticas (Silva et al., 2005). Segundo Maziero

(1990), em elevada concentrao, o nitrognio reprime a degradao da lignina, retardando

ou at inibindo o desenvolvimento do fungo.

Variao do pH, umidade e atividade de gua dos substratos durante o crescimento

micelial axial

Os valores iniciais de pH dos 9 tratamentos entre 5,8 e 6,0 reduziram para 4,8 a 5,6 ao

final do crescimento micelial. Segundo Santos, Furlan e Gern (2000), o crescimento micelial

implica na secreo de exoenzimas, polissacardeos, antibiticos e cidos orgnicos, os quais

reduzem o pH. A reduo do pH por L. edodes conseqncia da produo de diversos

cidos orgnicos, como cido actico e succnico produzidos pelo fungo (Robbers et al.

1997). Zadrazil (1997) citado por Santos, Furlan e Gern (2000), relata que algumas espcies

de basidiomicetos possuem uma caracterstica auto-reguladora de pH, com tendncia a se

estabilizar no valor de pH timo para seu crescimento, independente do valor de pH inicial.

Este fato tambm foi constatado por Vieira et al. (2008) em estudo com Polyporus tricoloma

para produo de antibitico, o qual relata que o valor do pH inicial tambm no parece

influenciar no alongamento das hifas de M. tatins. Depcke et al. (2008) avaliaram os efeitos

dos valores de pH inicial (5, 6, 7, e 8) no crescimento micelial radial de M. titans em meio

BDA, e segundo os autores no houve influncia no crescimento micelial, tendo uma

velocidade mdia de crescimento radial em torno de 0,35 cm/dia.

Segundo Schisler (1982), variaes mais efetivas nos nveis de pH podem indicar

diferena na capacidade degradativa entre espcies e/ou estirpes, j que tais perfis podem ser

atribudos gerao de cidos orgnicos, resultantes da degradao de acares consumidos

como fonte de carbono para o crescimento vegetativo, embora no possa ser ignorada a

oxidao da lignina que acarreta na formao de derivados cidos.

Para fungos como Aspergillus niger, Spier et al. (2006), concluram que o melhor pH

para a produo de -amilase e glicoamilase foi entre 4,0 e 6,0, valores esses similares ao

deste estudo com M. titans. Outro estudo sobre o pH timo para a produo de -amilase e

glicoamilase foi realizado por Silva e Peralta (2000), que obteve como 5,0 o valor adequado

para a produo das enzimas pelo fungo Aspergillus fumigatus.

Parmetros fsicos como umidade e atividade de gua so importantes para a

formao de biomassa e enzimas. A umidade do meio necessria para a utilizao dos

acares, transformando o ambiente de crescimento. Este crescimento resulta no aumento da

temperatura pela atividade dos fungos, que utilizam acares e substncias prontamente

assimilveis no substrato. Os teores de umidade adequados ao crescimento de organismos

filamentosos promovem a sntese de uma variedade de enzimas extracelulares (Schisler,

1982).

No cultivo de M. titans, a umidade manteve-se em torno de 70%, com uma perda de

aproximadamente 4%. Bano et al. (1987), explicam que teores de umidade acima de 80%

podem levar a contaminao bacteriana, acompanhado de contaminao fngica. Alto teor de

umidade tambm diminui a porosidade, a difuso de oxignio e a eliminao de dixido de

carbono. Por outro lado um baixo teor de umidade pode levar a um menor crescimento

(Dalsenter et al, 2005).

 Quanto a atividade de gua (A.a) em cultivos em meio slido, esta deve ser a mnima

necessria para os processos metablicos e para evitar as contaminaes. O conhecimento do

teor da A.a. de um substrato em FES essencial para o acompanhamento da sua integridade,

preservao e manuteno do tempo de processo. Em substratos com A.a. a partir de 0,65

pode ocorrer proliferao de contaminantes, sendo que at A.a. 0,75, somente alguns tipos

microbianos tais como: bactrias halofilicas, leveduras osmoflicas e bolores xeroflicos

podem se desenvolver (Ferreira Neto, Figueiredo e Queiroz, 2005). Para basidiomicetos, a

A.a. deve apresentar valores acima de 0,89 para que ocorra produo de biomassa (Tavares,

2008). Em todos os tratamentos a A.a. do substrato esteve entre 0,991 e 0,999 (Tab. 2).

Atividades enzimticas de -amilase e glicoamilase

Considerando a cintica de produo de biomassa, observado nas figuras 2 e 3, onde

constatou-se que os tratamentos suplementados com farelo de soja, nas concentraes de

4,0 g e 7,0 g, foram mais efetivos no crescimento micelial quando comparado aos demais

tratamentos, promovendo o crescimento do miclio de M. titans em ambos os substratos,

integralmente (at o final do frasco), a anlise de atividade enzimtica e protenas foram

realizadas nos tratamentos T4 e T7 aps 22 dias de cultivo.

A dinmica de atividade enzimtica demonstrou que o fungo utilizou carboidratos

disponveis para formao de biomassa e colonizao do substrato (Fig. 4 e Fig. 5). Como as

determinaes enzimticas foram realizadas aps 22 dias de incubao, com o passar do

tempo, deve ter ocorrido reduo de carbono de fcil assimilao, permanecendo ainda em

altas concentraes as reservas em material lignocelulsico.

No bagao de malte, por se tratar de substrato que contm material lignocelulsico, o

fungo precisaria de nveis mais elevados de enzimas hidrolticas e oxidadativas no meio, pois

no houve processo prvio de degradao da lignina e da celulose do bagao. Por ser um

fungo de podrido marrom (fungo que utiliza a celulose e outros componentes afins da

parede da clula e deixa a lignina em condies praticamente idnticas) , M. titans pode

ter encontrado limitao em fonte de carbono assimilvel. Isso demonstra que o processo de

preparo do substrato, a formulao e o estgio inicial de degradao, podem ser fatores

determinantes nos nveis de atividade enzimtica.

As enzimas so de fundamental importncia para o crescimento micelial, pois so

responsveis pela despolimerizao da celulose, hemicelulose e do amido. Os acares

formadores destes polmeros constituem uma fonte de carbono necessria para a atividade

metablica (Buswell, Cai e Chang, 1995). M. titans deve utilizar a celulose e outros

componentes afins deixando a lignina em condies praticamente idnticas. Tambm

pode ter ocorrido limitao de acesso s fontes de carbono da celulose e hemicelulose.

Portanto, h necessidade do fornecimento de material de mais fcil assimilao para

promover a expresso ampliada de atividades amilolticas. Por outro lado, independente das

condies de otimizao, M. titans pode no apresentar estrutura gentica para produo de

enzimas amilolticas.

Quanto queda da atividade enzimtica de -amilase (Tab. 3), esta pode estar ligada

produo de proteases, uma vez que essa enzima converte protenas em aminocidos

(Schmidt e Sallas-Mellado, 2009).

Analisando os dados de atividade especfica de -amilase, constata-se que em meio

com maior concentrao de nitrognio (T7), a atividade inferior quando comparada ao meio

menos concentrado (T4). Concentraes mais elevadas em nitrognio inibem a sntese de

enzimas (Maziero, 1990), portanto, no T7, o fungo pode ter utilizado inicialmente o

nitrognio, que de fcil assimilao, para multiplicao das hifas em detrimento da sntese

de enzimas para degradao dos polmeros do substrato.

 Os dados de atividade enzimtica e atividade especfica de glicoamilase dos

tratamentos T4 e T7 esto representados por uma linha de tendncia na Fig. 6 e Fig. 7,

respectivamente. A atividade de glicoamilase mostrou perfil similar -amilase, onde os

maiores valores foram obtidos no incio do cultivo (Tab. 4). Isto pode ser decorrente do fato

da concentrao de amido no meio estar em maior concentrao no incio do cultivo. Com o

passar do tempo o amido foi sendo hidrolisado e resultou na sua diminuio que restringiu a

induo da sntese das enzimas. A presena de amido no meio pode ter sido o fator

determinante da produo de enzimas amilolticas, pelo menos neste caso.

Este fungo tambm mostrou atividade enzimtica pouco superior no substrato em que

a concentrao em nitrognio era menor, sendo a atividade ligeiramente maior para

glicoamilase em relao -amilase. Mesmo sendo um fungo de podrido marrom, h

necessidade do fornecimento de material de mais fcil assimilao para promover melhor

crescimento micelial. Tanto que fungos de podrido marrom so cultivados preferentemente

em material j compostado.

Outro fator importante sobre a produtividade de amilases sua relao com a baixa

concentrao de Ca2+, uma vez que Pires et al. (2002) verificaram que a atividade amilsica

dependente da presena de Ca2+, embora a -amilase aja sem nenhum tipo de metal para a sua

ativao. Sobre isso, Alexandrino et al. (2007), estudando o basidiomiceto Pleurotus

ostreatus, relatam que no foram detectadas amilases no meio de cultivo, mas sim lacase e

mangans peroxidase. Outro fator citado pelos autores, que a presena de metais pesados

tem mostrado poder de inibio da atividade amilsica, tais como o mercrio, a prata, o cobre

e o chumbo.

Os valores encontrados nesse trabalho para a produo de -amilase e glicoamilase,

so baixos, quando comparados com os obtidos por Spier et al. (2006) trabalhando com

fungos tais como Aspergillus nger: 530,55U.g-1 para -amilase e 770,66U.g-1 para
glicoamilase. No entanto, o conhecimento obtido sobre a sntese destas enzimas em M. titans

abre um caminho para estudos das necessidades fisiolgicas deste fungo.

O perfil enzimtico, a dinmica da atividade enzimtica e a correspondente produo

de biomassa vegetativa de M. titans, forneceram importantes informaes sobre a eficincia

na utilizao dos substratos.

Concluses

O bagao de malte como substrato lignocelulsico foi efetivo no crescimento micelial,

proporcionando ao fungo capacidade em produzir enzimas hidrolticas e oxidativas.

A maior formao de massa micelial em farelo de soja indicou alta capacidade de

metabolizao de nitrognio protico por M. titans.

As variaes de pH evidenciaram uma tendncia para acidificao em todos os

tratamentos.

Quanto produo das enzimas -amilase e glicoamilase, M. titans mostrou atividades

mais efetivas no incio da colonizao do substrato.

O fungo no um produtor proeminente de amilases.

REFERNCIAS

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LEGENDAS:

Tabelas

Tabela 1: Quantidades dos resduos e suplementos (gramas) para formao do substrato dos

diferentes tratamentos.

Tabela 2: Atividade de gua no tempo final nos diferentes tratamentos.

Tabela 3: Produo de -amilase pelo fungo Macrocybe titans

Tabela 4: Produo de glicoamilase pelo fungo Macrocybe titans

Figuras

Figura 1A, 1B e 1C: Frascos com miclio de Macrocybe titans colonizado nos substratos dos

9 tratamentos com 16 dias de cultivo a 25 C, descontando os dias de preenchimento da

superfcie superior do substrato com massa micelial.

T1 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de mandioca e 1,5 g farelo de soja, T2 = 30,0g bagao de

malte, 4,0g farelo de mandioca e 1,5g farelo de arroz; T3 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de

mandioca e 1,5g farelo de trigo; T4 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de mandioca e 4,0g farelo de

soja; T5 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de mandioca e 4,0g farelo de arroz; T6 = 30,0g bagao

de malte, 4,0g farelo de mandioca e 4,0g farelo de trigo; T7 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de

mandioca +e7,0g farelo de soja; T8 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de mandioca e 7,0g farelo de

arroz; T9 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de mandioca e 7,0g farelo de trigo.
Figura 2: Crescimento micelial de Macrocybe titans em diferentes tratamentos com substrato

base de bagao de malte, bagao de mandioca e farelos de arroz, soja e trigo. (Letras

diferentes representam diferena significativa a 5%).

T1 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de mandioca e 1,5 g farelo de soja, T2 = 30,0g bagao de

malte, 4,0g farelo de mandioca e 1,5g farelo de arroz; T3 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de

mandioca e 1,5g farelo de trigo; T4 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de mandioca e 4,0g farelo de

soja; T5 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de mandioca e 4,0g farelo de arroz; T6 = 30,0g bagao

de malte, 4,0g farelo de mandioca e 4,0g farelo de trigo; T7 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de

mandioca +e7,0g farelo de soja; T8 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de mandioca e 7,0g farelo de

arroz; T9 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de mandioca e 7,0g farelo de trigo.

Figura 3: Velocidade mdia do crescimento micelial axial de Macrocybe titans nos diferentes

tratamentos aps 16 dias de cultivo, com substrato base de bagao de malte, bagao de

mandioca e farelos de arroz, soja e trigo. Letras diferentes representam diferena significativa

a 5%.

T1 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de mandioca e 1,5 g farelo de soja, T2 = 30,0g bagao de

malte, 4,0g farelo de mandioca e 1,5g farelo de arroz; T3 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de

mandioca e 1,5g farelo de trigo; T4 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de mandioca e 4,0g farelo de

soja; T5 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de mandioca e 4,0g farelo de arroz; T6 = 30,0g bagao

de malte, 4,0g farelo de mandioca e 4,0g farelo de trigo; T7 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de

mandioca +e7,0g farelo de soja; T8 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de mandioca e 7,0g farelo de

arroz; T9 = 30,0g bagao de malte, 4,0g farelo de mandioca e 7,0g farelo de trigo.

Figura 4: Atividade Enzimtica de -amilase expressa em U.g -1 de meio slido pelo fungo

Macrocybe titans.
Figura 5: Atividade Especfica de -amilase expressa em U.mg -1 de protenas totais pelo

fungo Macrocybe titans.

Figura 6: Atividade Enzimtica de glicoamilase expressa em U.g -1 de meio slido pelo fungo

Macrocybe titans.

Figura 7: Atividade Especfica de glicoamilase expressa em U.mg-1 de protenas totais pelo

fungo Macrocybe titans.