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Dissert Katia Carvalho PDF
Dissert Katia Carvalho PDF
PIRACICABA
2009
i
FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
Bibliotecria: Marilene Girello CRB-8a. / 6159
ii
iii
AGRADECIMENTO
Aos meus filhos por fazerem dos seus sonhos a minha realizao. Que,
atravs de minha luta, puderam me dar oportunidade de concretizar este
objetivo, me incentivando a prosseguir na jornada, fossem quais fossem os
obstculos, principalmente por tantas vezes abrirem mo de momentos de
convvio quando o dever e o estudo me chamaram. Por isso e muito mais sou
grata e quero compartilhar esta conquista com vocs!
Aos meus pais, pois foi deles que recebi o dom mais precioso: a vida;
pela educao, coragem, amor e determinao para lutar pelos meus ideais.
iv
prosseguir a jornada acadmica. Profissional competente e de grande saber.
Exemplo de dedicao, abnegao e disponibilidade. Sempre pronta a ajudar,
com seu modo amvel e de grande simpatia. Agradeo oportunidade de
concretizar este objetivo.
v
ensinando-me que preciso acreditar nos ideais. Grande incentivador e
responsvel direto por todas as minhas conquistas profissionais, desde o
mestrado na UNICAMP, at a minha efetivao na rea acadmica. Sou grata
pelo auxlio e pela condio oferecida para a realizao dos exames de DNA. Com
certeza, sem a sua ajuda esse sonho jamais seria possvel. Parabns por ser um
profissional competente e de grande saber, voc sempre ser para mim um
exemplo de dedicao, abnegao e disponibilidade.
vi
Bibliotecria da FOP/UNICAMP Marilene Girello, pela confeco da
ficha catalogrfica.
vii
De tudo ficaram trs coisas: a certeza de que estamos
sempre comeando, a certeza de que preciso continuar e a certeza de
que podemos ser interrompidos antes de terminar.
Fazer da interrupo um caminho novo, fazer da queda um passo de
dana,
do medo uma escada, do sono uma ponte, da procura um encontro
Fernando Sabino
viii
RESUMO
ix
acenam com a possibilidade de interferncia de pequena monta, o que no
dificultaria as anlises de DNA. Raros so os estudos publicados e rarssimas as
avaliaes experimentais sobre o tema. Considerando que os exames de DNA
tem se tornado cada dia mais freqentes e mais acessveis s pessoas e ao
poder pblico, entendemos como importante o desenvolvimento de uma pesquisa
que possa estabelecer parmetros e rotinas a serem adotadas quando se busca
obter DNA em tecidos formolizados previamente. Neste trabalho foi proposto
analisar a ao do formaldedo nas concentraes de 5%, 10% e 20%, sobre
tecido muscular humano e seus efeitos na degradao do DNA nuclear e verificar
a validade de exames de perfis genticos de DNA em cadveres submetidos
conservao atravs da tcnica da formalizao. O grupo de estudo foi
constitudo de 40 (quarenta) cadveres no identificados. Com base nos
resultados obtidos, conclui-se que a fixao para tecido humano mais usado
universalmente na conservao de cadveres, no meio cientfico, jurdico e
acadmico o formaldedo ou aldedo frmico na concentrao de 10%. No
entanto, de acordo com os resultados obtidos conclumos que o fixador mais
adequado o formol a 5%, devido a sua ao eficaz e por apresentar uma
mnima degradao do DNA. Todas as amostras fixadas com 5% de formol foram
amplificadas e a validao dos alelos foi realizada com relativa facilidade. J as
amostras formolizadas 10% e 20% apresentaram a degradao do DNA em
100% (40) das amostras estudadas.
x
ABSTRACT
xi
of genetic analysis of DNA in cadavers submitted to conservation by techniques
using formalhydeide. The study group was consisted of 40 non-identified cadavers.
Based on the results we concluded despite formalhydeide 10% being universally
used in academic, judicial and scientific settings, the more adequate fixation
solution is the formalhydeide 5% due to its efficacy, low cost and simplicity of use.
All 40 samples fixated with formalhydeide 10 and 20% present degradation of DNA
(100%).
xii
LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS
IML Instituto-mdico-legal
IMLs Institutos-mdico-legais
AF Aldedo Frmico
xiii
SUMRIO
1. INTRODUO 1
2. REVISO DA LITERATURA 4
3. PROPOSIO 38
4. MATERIAL E MTODOS 39
5. RESULTADOS 44
6. DISCUSSO 50
7. CONCLUSO 55
REFERNCIAS 57
ANEXOS 62
xiv
1. INTRODUO
1
10% (dez por cento). O produto tambm usado como desinfectante de salas
cirrgicas.
2
de exposio (fixao) a que um determinado tecido submetido. Seus estudos
baseiam-se em reaes bioqumicas, sem a realizao de um estudo propositivo
de campo ou experimental. No entanto, assegurou que se faz necessria pesquisa
a respeito.
3
2. REVISO DA LITERATURA
4
sangue para confronto com vestgios de smen coletados do corpo das vtimas.
Estava assim inaugurada uma nova pgina no emprego da biologia molecular e
sua utilizao na identificao humana criminal.
5
Bezerra (2005) relatou que em um grau to avanado de carbonizao
somente possvel identificar com o uso da anlise de DNA.
6
Inwald (2001) esclareceu que no interior da clula o DNA organizado
numa estrutura chamada cromossomo e o conjunto de cromossomos de uma
clula forma o caritipo. Antes da diviso celular os cromossomos so duplicados
atravs de um processo conhecido como Replicao. Dentro dos cromossomos,
protenas as histonas compactam e organizam o DNA. Estas estruturas
compactas guiam as interaes entre o DNA e outras protenas, ajudando a definir
que regies do DNA devero ser transcritas.
7
Para este autor o DNA um longo polmero formado por unidades
repetidas chamadas nucleotdeos. A cadeia de DNA tem 2,2 a 2,4 nanometros de
largura, e um nucleotdeo possui aproximandamente 0,33 nanometros de
comprimento. Embora os monmeros (nucleotdeos) que constituem o DNA sejam
muito pequenos, polmeros de DNA pode ser molculas enormes com milhes de
nucleotdeos. Por exemplo, o maior cromossomo humano (cromossomo 1), possui
220 milhes de pares de bases de comprimento.
Watson (2007) mencionou que em 1978, Alec pela primeira vez usou a
genmica, cincia ainda emergente na poca, para pesquisar as alteraes no
DNA humano e descobrir abundantes variaes em determinadas regies do
DNA. A origem das variaes na seqncia do genoma humano assim comeou a
ser revelada.
8
Este autor descreveu que as alteraes genticas so provenientes de
dois processos: mutao e recombinao (crossover). A primeira pode induzir
mudanas hereditrias no DNA e a segunda pode produzir cpias maternal e
paternal de uma determinada regio de DNA pelo pareamento e mudar de local
estas informaes durante a formao dos espermatozides e dos vulos.
Segundo Matte (2007) para este tipo de experimento, cerca de dez mil
crianas teriam que ser utilizadas para detectar com segurana uma mutao ou
uma recombinao em um gene. Na poca, Alec Jeffreys, resolveu este problema
desenvolvendo processos alternativos para detectar estas alteraes, no em
crianas, mas pelo exame de milhes de espermatozide. Utilizando-se desta
estratgia, revelou o modo complexo pelo quais os minissatlites sofrem mutao.
9
2.1.2 Vida
Lewis (2004) citou que cada ser vivo que habita a Terra possui uma
codificao diferente de instrues escritas na mesma linguagem no seu DNA.
Estas diferenas geram as diferenas orgnicas entre os organismos vivos.
Figura 2:Diferentes nveis de condensao do DNA. (1) Cadeia simples de DNA . (2) Filamento de
cromatina (DNA com histonas). (3) Cromatina condensada em intrfase com centrmeros. (4)
Cromatina condensada em prfase. (Existem agora duas cpias da molcula de DNA) (5)
Cromossoma em metfase.
10
2.1.3 Funo biolgica do DNA
11
Figura 3: Fluxo da informao gentica
12
mutaes. Na luz do evolucionismo essa seqncia, denominas fosseis
moleculares, podem ser a matria-prima do processo evolutivo.
2.1.5 Evoluo
13
1869 - O suo Friedrich Miescher isola, a partir do pus humano e do esperma
do salmo, uma substncia com alto teor de fsforo que chama de "nuclena",
posteriormente denominada "cido desoxirribonuclico" (DNA).
14
1952 - A britnica Rosalind Franklin obtm imagens de DNA , por difraco de
raios X.
1980 - A Suprema Corte dos EUA decide que formas de vida alteradas podem
ser patenteadas.
15
Os NIH dos EUA aprovam directrizes gerais para a realizao de experimentos
com terapia gentica em seres humanos.
1988 - Nos EUA, Philip Leder e Timothy Stewart obtm primeira patente para
um animal geneticamente modificado, um camundongo.
16
2.3 Marcadores moleculares para a identificao humana
Para este autor uma regio VNTR tpica consiste de 500 a 1000 pb,
compreendendo principalmente unidades repetidas em seqncia, cada qual com
cerca de 15 a 35 pb de comprimento.
17
Para Watson (2007) os locos VNTR so particularmente convenientes
como marcadores para a identificao humana, pois possuem um nmero muito
grande de alelos diferentes e, sendo assim, provvel que no existam dois
indivduos no aparentados que compartilhem o mesmo gentipo .
18
Jobim (2006) afirmou que os mais abundantes e os melhor estudados
desse grupo so os SNPs. Cerca de 5,3 milhes deles foram encontrados no
genoma humano, o que corresponde a um SNP a cada 600pb.
19
2.4 Procedimentos de anlise
a) (1 FASE) - Extrao;
b) (2 FASE) - Amplificao;
20
2.4.2 FASE - AMPLIFICAO
Inventada em 1983 por Kary Mullis, a PCR uma das tcnicas mais
comuns utilizadas em laboratrios de pesquisas mdicas e biolgicas para
diversas tarefas, como o sequenciamento de genes e diagnstico de doenas
hereditrias, identificao de fingerprint gentico (usado em testes de paterninade
e na medicina forense), deteco de dianstico de doenas infecciosas e criao
de organismos transgnicos.
21
DNA, formando, desta maneira, um fragmento de DNA com seqncia idntica
do DNA a ser analisado, e previamente selecionado pelo par de primers .
I-) Procedimentos
Duarte (2001) relatou que a clonagem de DNA por PCR pode ser
realizada em poucas horas usando-se um equipamento relativamente simples,
cuja funo fundamental a variao de temperatura em cada passo da tcnica.
22
Este autor ainda citou que uma reao de PCR consiste de 30 ciclos
contendo as etapas de desnaturao, sntese e pareamento, com cada ciclo
individual levando em geral 3 a 5 minutos em um termociclador automatizado, o
que totaliza menos de trs horas para todo o processo. Evidentemente, algum
tempo tambm necessrio para a construo e a sntese dos oligonucleotdeos
que serviro como primers, mas isso foi simplificado pela disponibilidade de
programas de computador para projetar primers e pela sntese comercial rpida
dos oligonucleotdeos desejados.
23
extrado de algumas amostras, muito pequena, como em fios de cabelo ou
traos de saliva em tocos de cigarro.
24
Jobim (2007) descreveu que atravs da PCR, possvel a tipagem do
DNA em amostras que de outra maneira no poderiam ser analisadas, como
amostras antigas e j decompostas, restos mortais de vtimas de incndios ou
acidentes e corpos em decomposio.
Inwald (2001) descreveu que por meio dessa tcnica possvel separar
molculas em funo da sua massa (tamanho), forma e compactao. Trata-se de
uma tcnica rpida, sensvel e precisa.
Este autor ainda citou que a molcula do DNA, migra em suportes (gis
de agarose ou acrilamida) por ao de uma corrente eltrica, com diferentes
velocidades, dependendo do seu tamanho e forma.
25
luz UV e, assim, molculas de um mesmo tamanho so visualizadas em um
mesmo ponto do gel, formando uma faixa fluorescente.
26
2.5 O ALDEDO FRMICO (FORMOL)
De acordo com seus estudos, ainda este autor, descreveu que o fixador
mais utilizado o formol a 10% (aldedo frmico), devido ao seu baixo custo e
simplicidade de uso.
27
em concentraes superiores a 40%, portanto, recebendo esta soluo a
denominao de "formol puro".
28
Para este autores o aldedo frmico em concentraes elevadas tem
sido classificado com agente carcinognico humano e relacionado com cnceres
de vias areas superiores e de pulmo, leucemia e cncer no encfalo.
29
Gino et al. (2004) salientaram que qualquer afirmativa com relao aos
efeitos deletrios do formol na molcula do DNA depende de outros estudos
experimentais, recomendando que sejam utilizadas concentraes diferenciadas e
com grupo controle.
30
precipitao de protenas, no preserva gorduras livres, porm fixa lipdeos
complexos, provoca leve precipitao de outros constituintes celulares e no o
fixador de eleio para carboidratos.
31
2.5.2 Formaldedo
Conservao de cadveres
Laboratrios
32
Incompatibilidades: oxidantes forte, lcalis, cidos, fenis e uria
ANVISA
33
De acordo com a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Resoluo RDC n
306, de 07 de dezembro de 2004
34
A ANVISA classificou em grupo de risco, para exames de DNA segue a
seguinte nomenclatura:
35
Organismo Geneticamente Modificado (OGM), visando proteger a vida e a sade
do Homem, dos animais e das plantas, bem como o meio ambiente."
36
IV - propor o Cdigo de tica de Manipulaes Genticas;"
37
3. PROPOSIO
38
4. MATERIAL E MTODOS
39
Cumpre-nos informar que a coleta de amostra de tecido muscular faz
parte da rotina adotada pelo Departamento Mdico Legal de Vitria ES, quando
do sepultamento de corpos no identificados e tem por objetivo a anlise de perfis
genticos de DNA.
b. Extrao do DNA;
c. Quantificao do DNA;
d. Amplificao do DNA;
f. Clculos Estatsticos;
40
para tecido muscular.
1
Kit comercial multiplex para identificao humana, 16 regies, Identifiler, Applied Biosystems.
41
estatsticas pertinentes. Considerando o ineditismo da pesquisa, a falta de
referncias literrias a respeito, e ainda, a possvel inespecificidade dos resultados
achamos conveniente utilizarmos trs instrumentos estatsticos. Para a anlise
dos dados os seguintes testes estatsticos foram utilizados: anlise de varincia
para exemplo com um experimento (one-way ANOVA), teste de Pearson, e
coeficiente de correlao intra-classe (ICC).
Mtodo: CHELEX
42
CONSIDERAES TICAS E RELATIVAS BIOSSEGURANA
43
5. RESULTADOS
44
RESULTADO DA AMOSTRA CONTROLE
Amelogenina
100%
22,5%
45
Verificou-se que os nmeros de marcadores amplificados e extrados
foram em 100% (40) das amostras coletadas, aps formolizao a 5%.
Observou-se que estas amostras apresentaram mnima degradao do DNA e a
validao dos alelos foram realizadas com relativa facilidade, assim como,
verificou a presena da amelogenina em todas as amostras amplificadas,
permitindo a confirmao do gnero (sexo) do titular da amostra (tabela 2).
Tabela 2: Relao dos resultados obtidos da anlise das amostras formolizao a 5%.
46
Verificou-se que os nmeros de marcadores amplificados e extrados
foram em 100% (40) das amostras analisadas. Observou-se que as amostras
formolizadas a 10% apresentaram a degradao do DNA em 100% (40) das
amostras, pois obedecendo ao protocolo internacional preconizado pelo programa
CODIS do FBI, para assegurar uma identificao humana, se faz necessria uma
amplificao mnima de 13 marcadores e os resultados obteve-se uma quantidade
de marcadores amplificados inferior ao programa CODIS. Notou-se tambm que a
amelogenina no foi amplificada em seis (15%) amostras analisadas (tabela 3).
47
Verificou-se que os nmeros de marcadores amplificados e extrados
foram em 100% (40) das amostras coletadas, aps formolizao a 20%.
Tambm observou uma degradao maior que as formolizadas a 5% e 10%.
Obteve-se uma quantidade de amplificao inferior ao programa CODIS em 100%
(40). Portanto, cadveres formolizados 20% so descartados para uma possvel
identificao humana. Com relao amelogenina, nota-se a presena desse
marcador em apenas 23 (57,5%) das amostras (tabela 4).
01 6 e amelogenina 21 5
02 8 e amelogenina 22 6
03 10 23 6 e amelogenina
04 9 e amelogenina 24 5
05 8 25 7 e amelogenina
06 7 26 6 e amelogenina
07 9 e amelogenina 27 6
08 9 e amelogenina 28 6
09 10 29 5
10 9 30 6 e amelogenina
11 7 e amelogenina 31 6 e amelogenina
12 6 32 7 e amelogenina
13 9 33 5 amelogenina
14 10 e amelogenina 34 6 e amelogenina
15 6 e amelogenina 35 6 s e amelogenina
16 6 e amelogenina 36 7
17 6 e amelogenina 37 7 e amelogenina
18 6 e amelogenina 38 6 e amelogenina
19 5 39 6 e amelogenina
20 6 40 6
48
GRFICO COMPARATIVO DAS CONCENTRAES DE 5%, 10% E 20%
49
6. DISCUSSO
50
protocolo internacional preconizado pelo programa CODIS do FBI, para assegurar
uma identificao humana, se faz necessria uma amplificao mnima de 13
marcadores.
51
conservados em formol (como por exemplo, cordo umbelical) perdem todo o seu
material gentico, os resultados obtidos nesta pesquisa apontam no sentido de
que o DNA realmente sofre degradao quando em contato com o formol e que
uma concentrao maior de formol no tecido dificulta a amplificao do material
genmico e que esta dificuldade diretamente proporcional concentrao, ou
seja, a degradao maior quanto mais concentrada for a soluo de formol.
52
validade da indicao de concentraes de formol a 5% para realizao de
processo de formolizao, considerando que a degradao do formol mostrou-se
menor nos tecidos que foram expostos s menores concentraes.
53
instituies sanitrias, no adotando por conseguinte concentraes regulares e
padronizadas, entendemos que, diante da necessidade da anlise de perfis
genticos de DNA em tecidos que foram submetidos a este procedimento, mesmo
diante da comprovao de que o formol um agente que degrada o DNA,
54
7. CONCLUSO
a) As amostras formolizadas :
55
c) O formol ainda o produto mais usado universalmente para conservao
de cadveres, mediante as tcnicas de formolizao e de embalsamamento,
como meio de prevenir e retardar a putrefao.
56
8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
57
Formalin-Fixed Biological Samples in Natural History Collections.
National Research Council of the National Academies. 2006; 70: 1-70.
58
Karlsen, E; Kalantari, M; Chitemerere, M; Johannson,B; Hagmar,
B. Modifications of human and viral deoxyribonucleic acid by
formaldehyde fixation. Lab Invest. 1994; 71: 604-611.
59
2005; 333: 1-9.
60
Brasil. Scientific American Brasil. 51:87, 2006.
61
ANEXO 1
62
ANEXO 2
(Conforme Walsh,1991)
Procedimento
Observaes:
1. O chelex contm resina esfrica que precisa ser colocada na soluo das
amostras. O furo nos tubos para permitir sada de vapor, logo impedir abertura
dos frascos durante fervura.
2. Aps extrao do DNA dever ser congelado. No deitar os tubos antes do
congelamento total do produto extrado.
63
Extrao de DNA POR CHELEX
Tecido muscular
Procedimentos
64
o cuidado de no pipetar a fase protica, pois esta causa inibio da reao de
PCR; o precipitado rejeitado.
11. Colocar 600l de ETOH a 100% a frio (o qual deve ser previamente colocado
num copo esterilizado e no gelo) em cada amostra + controle (-).
12. Inverter suavemente e uma s vez cada tubo.
13. Colocar as amostras por 30 min a 20C para a precipitao do DNA.
14. Centrifugar inicialmente por 15 min a 14000 rpm para poder observar se h
formao de pellet; (Ateno: tubos com ala voltada para o lado de fora da
centrfuga para orientao do lado do tubo em que se forma o pellet).
15. Decantar cuidadosamente o etanol.
16. Secar o pellet temperatura ambiente at evaporar todo o etanol (mnimo
12h), colocar os tubos deitados, com a tampa aberta, dentro num armrio fechado
e voltados para o lado posterior.
17. Ressuspender as amostras com 25l de H2O desionizada e autoclavada.
18. Agitar e dar um pulso de centrifugao.
19. Colocar no banho Maria a 56C por 30 min.
Notas:
20. No esquecer que fundamental fazer um controle negativo (o qual contm
um tampo de Extrao e adicionar proteinase K e DTT-usados na extrao)
21. Na precipitao o ideal para obter DNA genmico humano centrifugar por 10
min a 13000x g 56000 rpm;
22. Aps a extrao o DNA dever ser congelado.No deitar os tubos antes do
congelamento total do produto extrado.fazer alquotas da extrao quando for
necessrio para evitar contaminao na sala de pr-PCR.
23. Todo o material a ser usado deve ser lavado com hipoclorito e gua MiliQ,
autoclavar (esterilizao e secagem) e colocar no mnimo 12h na UV.
65
AMPLIFICAO DE STRs AUTOSSMICOS
Identifiler
Volume final = 13 l
66