09 a 12 de setembro de 2012

Búzios, RJ

AVALIAÇÃO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE Brachiaria

brizantha UTILIZANDO COMPLEXO ENZIMÁTICO
COMERCIAL

T. D. MENDES1, T. F. PACHECO1, F. B. P. CARVALHO1, D. S. RODRIGUES1, C. M. M.

MACHADO1, M. A. CARVALHO2
1
Embrapa Agroenergia – Laboratório de Processamento de Matérias Primas Energéticas
2
Embrapa Cerrados – Genética e Melhoramento de Forrageiras
E-mail para contato: thais.demarchi@embrapa.br

RESUMO – A hidrólise enzimática é um dos principais fatores que elevam o

custo da produção de etanol celulósico. O objetivo deste trabalho foi caracterizar
um complexo enzimático e definir condições de hidrólise para um substrato
natural (Brachiaria brizantha), previamente tratado com ácido (1,5% v/v) e
hidróxido de sódio (4% m/v). As atividades enzimáticas foram determinadas em
papel, avicel, carboximetilcelulose e celobiose. A biomassa pré-tratada (94%
celulose), foi submetida à hidrólise em condições ótimas de temperatura e pH, até
variação não significativa de glicose no meio (8 h). Em seguida, o sólido
remanescente foi lavado e submetido novamente à hidrólise. Pôde-se observar que
toda a celulose do material é passível de hidrólise em três etapas (24 h), enquanto
o processo de hidrólise completa em uma etapa ocorre em 72 h, indicando efeitos
de inibição. Testes de hidrólise da biomassa (razão sólido:líquido, 1:10) variando
a concentração inicial de glicose (10 a 40 g/L) e a carga enzimática (30 a 240
FPU/g de material) foram realizados. Observou-se redução na velocidade inicial
de hidrólise com o aumento da concentração inicial de glicose e redução do tempo
de conversão com o aumento da quantidade de enzima. Os tempos para atingir
conversão da celulose superior a 80 % foram: 72 horas para 30 FPU, 56 horas
para 60 FPU e 48 horas para 120 e 240 FPU. Concluiu-se que a velocidade de
hidrólise é afetada pela carga enzimática e pela concentração de glicose no meio.

1. INTRODUÇÃO
O interesse acerca dos biocombustíveis aumentou de forma dramática nos últimos anos.
Não apenas em virtude do discurso da contenção dos danos ambientais; mas também
impulsionado pelo aumento da demanda de energia acompanhada do declínio da oferta de
combustíveis fósseis.

Os processos de obtenção de etanol a partir do caldo de cana-de-açúcar ou do amido do

milho já se encontram estabelecidos há muitos anos. O crescente interesse e demanda por
etanol tem direcionado as ações de PD&I para a viabilização da produção de etanol a partir de
biomassa lignocelulósica, o denominado etanol de segunda geração. Pesquisas têm sido
desenvolvidas visando o aproveitamento de biomassa, residuais ou não, como coníferas, feno,
 09 a 12 de setembro de 2012
Búzios, RJ

forrageiras, taxi branco,bagaço e palha de cana-de-açúcar, palha de trigo, de milho e de arroz,

resíduos da indústria de papel, entre outros.

A biomassa lignocelulósica é constituída principalmente por celulose, hemicelulose e

lignina. De maneira geral, a celulose, polissacarídeo composto por moléculas de glicose
unidas por ligações β-1,4-glicosídicas,é encontrada em maior proporção. Para que a biomassa
possa gerar açúcares fermentescíveis, via processo bioquímico, esta deve passar por duas
etapas: pré-tratamento e hidrólise enzimática.

A etapa do pré-tratamento é fundamental para o sucesso da ação das enzimas sobre a

biomassa. Nesse processo, por ação físico-química, ocorre a desestruturação do material
lignocelulósico, podendo ocorrer a extração da hemicelulose e/ou lignina. Como
conseqüência, as fibras de celulose ficam mais acessíveis à ação das enzimas celulolíticas
(OGEDA e PETRI, 2010).

Celulases são divididas, de acordo com seu local de atuação, em três grupos:
endoglucanases, que clivam as ligações glicosídicas internas das cadeias de celulose;
exoglucanases, que atuam nos terminais da cadeia, gerando celobiose; e β-glucosidades que
hidrolisam a celobiose à glicose (BHAT, 2000). Estes três grupos de enzimas agem em
sinergia e, em consórcio, são denominadas como complexo celulolítico.

O processo de hidrólise enzimática de biomassa ainda não se encontra estabelecido, mas

é uma tecnologia que vem sendo indicada como a mais promissora e incluída como parte do
processo modelo da produção de etanol de segunda geração. O entrave para sua aplicação
ainda é o alto custo das enzimas (TAYLOR, 2008).

Esforços em PD&I de empresas e instituições de diversos países têm como objetivos o

aumento da eficiência do processo de hidrólise e diminuição do custo de produção e
comercialização das enzimas. As empresas líderes no mercado de enzimas, Novozymes e
Genencor, têm focado na indústria de biocombustíveis. A Genencor possui o complexo
Accelerase® DUET, que apresenta alta quantidade de β-glicosidase (GENENCOR, 2010). Já
a Novozymes tem como atual produto o Cellic® CTec2, que apresenta altos níveis de
atividade β-glicosidase, é tolerante a inibidores, e compatível com diferentes matérias-primas
lignocelulósicas e processos de pré-tratamento (NOVOZYMES, 2010). O custo do emprego
de ambas as enzimas é o menor já alcançado pelas empresas, cerca de US$ 0,13 por litro de
etanol.

Um complexo celulolítico ideal, que proporcione alta eficiência de conversão, deve

apresentar as seguintes características: operação em temperatura e pH brandos; ajuste correto
na quantidade das diferentes enzimas componentes, garantindo uma ação sinérgica entre elas;
elevada especificidade; tolerância ao produto de hidrólise; alta estabilidade em pH e
temperaturas ótimos; alta atividade em substratos insolúveis (MAKI et al., 2009).

A eficiência dos complexos enzimáticos não pode ser determinada apenas sobre
substratos padrão. É de fundamental importância a avaliação da ação das preparações
enzimáticas sobre substratos naturais, como a parede celular vegetal (SINGHANIA et al.,
 09 a 12 de setembro de 2012
Búzios, RJ

2010). O objetivo deste trabalho foi caracterizar, quanto à atividade, o complexo enzimático
Cellic® CTec2 e avaliar a atuação deste na hidrólise de Brachiaria brizantha cv. Marandu.

2.MATERIAl E MÉTODOS

2.1. Material
Foi utilizado o complexo enzimático comercial Cellic® CTec2, gentilmente cedido pela
empresa Novozymes.

Como substrato, utilizou-se a forrageira Brachiaria brizantha cv. Marandu, cultivada

em campo experimental da Embrapa Cerrados. O material passou por secagem a 70°C por 48
horas e moagem em moinho de facas (granulometria máxima de 2mm).

2.2. Métodos
2.2.1. Caracterização da atividade do extrato enzimático: Foram determinadas as
atividades do extrato enzimático sobre os seguintes substratos: papel de filtro,
carboximetilcelulose (CMC) e celobiose de acordo com metodologia descrita por Ghoose
(1987) e em avicel, segundo Adriano (2008).

2.2.2. Pré-tratamento da biomassa: O substrato seco e moído passou por pré-tratamento

ácido seguido de alcalino. O pré-tratamento ácido consistiu em expor o material à solução de
ácido sulfúrico 1,5 % v/v, para cada grama de material seco foram utilizados 10 mL de
solução de ácido sulfúrico. A suspensão foi mantida em autoclave por 30 minutos a 121ºC.
Após a reação, a amostra foi filtrada e a fração sólida passou por dupla lavagem com água
destilada utilizando volume correspondente ao da solução ácida empregada. O sólido foi
então submetido ao tratamento alcalino.
Nesta etapa, para cada grama de material seco foram utilizados 10 mL solução de
hidróxido de sódio 4% (m/v). A suspensão foi então mantida em autoclave por 30 minutos a
121ºC. Imediatamente após a retirada da autoclave, o material foi filtrado e a fração sólida
lavada com água a 100ºC (cerca de cinco vezes o volume de solução de NaOH utilizado).
A amostra resultante do pré-tratamento passou por caracterização quanto à composição
de açúcares segundo método de Gouveia e colaboradores (2009).

2.2.3. Hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada: A biomassa pré-tratada, ainda

úmida, foi suspensa (na proporção 1:10, em base seca) em tampão citrato de sódio/ácido
cítrico0,1M pH 5.Para cada grama de material presente na biomassa pré-tratada (peso seco)
foi adicionado o correspondente a 30 FPU do complexo enzimático comercial. A hidrólise foi
realizada em erlenmeyers de 250 mL, em agitador orbital, sob agitação constante de 200rpm,
a uma temperatura de 50ºC por 72 horas.

2.2.4. Digestibilidade da celulose presente na biomassa pré-tratada: Para avaliar a

digestibilidade da celulose disponível na biomassa pré-tratada, esta foi submetida a três
hidrólises consecutivas. Cada etapa teve duração de 8 horas, as demais condições do processo
foram mantidas(item 2.2.3). Entre os sucessivos processos de hidrólise, o material sólido foi
lavado para a retirada dos açúcares e enzima livres provenientes da hidrólise anterior.
 09 a 12 de setembro de 2012
Búzios, RJ

2.2.5. Efeito da adição de glicose sobre a atividade enzimática: Para avaliar o efeito
inibitório do produto (glicose) sobre a atividade do complexo enzimático, ao início da
hidrólise enzimática foram adicionadas 10, 20, 30 e 40 g/L de glicose. As condições de
hidrólise foram as descritas no item 2.2.3 e a quantidade de glicose foi acompanhada durante
as 8 horas de hidrólise. A quantidade de glicose formada em cada uma das condições foi
comparada à formada na hidrólise controle, onde não houve a adição prévia de glicose.

2.2.6. Efeito do emprego de diferentes cargas enzimáticas: Para avaliar o efeito do

emprego de crescentes cargas enzimáticas sobre a velocidade de hidrólise foram empregados
30, 60, 120 e 240 FPU/g material seco. As condições de hidrólise foram as mesmas descritas
no item 2.2.3.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A caracterização do complexo enzimático Cellic® CTec2 quanto à atividade sobre
diferentes substratos está apresentada na Tabela 1. A atividade sobre papel de filtro Whatman
n°1 (UFP) é utilizada como referência para a atividade global das enzimas celulolíticas que
agem sinergicamente na hidrólise da celulose (GHOSE, 1987). Pode-se observar também alta
atividade em celobiose, o que indica que o extrato é rico em β-glicosidase. Segundo ficha
técnica da Cellic® CTec2, o diferencial do referido extrato é exatamente o enriquecimento
com β-glicosidase (NOVOZYMES, 2010). A atividade em avicel é muito reduzida se
comparada às atividades em CMC e celobiose. A baixa atividade em avicel indica que o
extrato é pobre em exo-celulases.

Tabela 1. Atividade do extrato enzimático Cellic® CTec2 –Novozymes sobre diferentes

substratos.

Substrato Atividade*.mL-1 de extrato

Papel de filtro (UFP) 583
CMC (UCMC) 4121
Avicel (UAvicel) 148
Celobiose (UCelobiose) 9991
*µmol/min

Para se avaliar a atuação do complexo celulolítico comercial na hidrólise de substrato

real, optou-se por realizar um pré-tratamento que resultasse em material rico em celulose e
baixos teores de hemicelulose e lignina. A forrageira B. brizantha passou, inicialmente, por
um tratamento ácido para a remoção da hemicelulose e, em seguida, por um tratamento
alcalino, para a extração da lignina. Ao final dos processos a biomassa pré-tratada apresentou
94% de celulose.
A cinética da hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada está apresentada na Figura 1.
Em reação contendo 10% de carga de sólido e 30 FPU/g de material lignocelulósico seco,
após 72 horas de hidrólise, o meio reacional atingiu uma concentração de 88,3g/L de glicose,
o que corresponde a 94% de conversão da celulose presente no material.
 09 a 12 de setembro de 2012
Búzios, RJ

Observa-se a diminuição da velocidade da reação depois de transcorridas 8 horas de

hidrólise, quando cerca de 45% da celulose disponível já havia sido convertida e a
concentração de glicose no meio era de 42,5 g/L (Figura 1).A diminuição na velocidade pode
ser resultante de diversos fatores, entre eles (i) o grau de cristalinidade e polimerização da
celulose no material residual (XIMENESet al.,2010); (ii) difusão das enzimas (transferência
de massa) no decorrer do processo hidrolítico (GAN et al., 2002); (iii) efeito da adsorção das
enzimas à celulose (GAN et al., 2002) e principalmente à lignina (TU, et al., 2009); (iv) e
inibição da enzima pela crescente concentração do produto (glicose e celobiose) no meio
reacional (GAN et al., 2002).

100
90
Concentração glicose (g/L)

80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80
Tempo (horas)
Figura 1. Cinética da hidrólise enzimática de B. brizantha pré-tratada em reação
contendo 10% de sólido e 30 FPU/g de material seco.

Para avaliar se há aumento gradativo da recalcitrância do material no decorrer da

hidrólise enzimática, após as primeiras 8 horas de reação, a hidrólise foi interrompida e a
fração sólida residual submetida à nova hidrólise. Foram realizadas três hidrólises sucessivas
e os resultados estão apresentados na Figura 2. As duas primeiras hidrólises apresentam
curvas sobrepostas, indicando que a celulose remanescente após as primeiras 8 horas
apresenta a mesma digestibilidade que a celulose presente no material no início da hidrólise.
Após a segunda hidrólise, cerca de 64% do material já havia sido convertido em glicose. Ao
final da terceira hidrólise, que gerou 20 g/L de glicose, 85% da celulose presente no material
havia sido hidrolisada. Estes dados mostram que a celulose disponível na biomassa pré-
tratada não oferece resistência gradativa à ação das enzimas celulolíticas. A sacarificação
ocorre em 24h quando realizada em três etapas, enquanto que a hidrólise completa, em apenas
uma etapa, ocorre em 72 horas, indicando a presença de fatores de inibição.
 09 a 12 de setembro de 2012
Búzios, RJ

35

Concentração glicose (g/L) 30

25
20 1a. Hidrólise
15 2a. Hidrólise
10 3a. Hidrólise

5
0
0 2 4 6 8 10

Tempo (h)

Figura 2. Hidrólise enzimática de B. brizantha pré-tratada em três etapas sucessivas.

O efeito inibitório do produto da hidrólise sobre a atividade do complexo celulolítico
foi avaliado adicionando-se, ao início da hidrólise, crescentes concentrações de glicose. Os
resultados estão apresentados na Figura 3. Pode-se observar que quanto maior a concentração
inicial da glicose no meio reacional, menor a velocidade de reação e a quantidade de glicose
gerada ao final de 8 horas. Quando a hidrólise iniciou-se em meio contendo 40 g/L de glicose,
apenas 13 g/L de glicose são gerados, o que corresponde a apenas 43% da glicose gerada no
processo sem a adição de açúcar. Os dados mostram que o complexo enzimático Cellic®
CTec2 é fortemente inibido na presença de glicose.

Para que a produção de etanol a partir de material lignocelulósico seja viabilizada

comercialmente, uma produção mínima de 50 g/L de etanol deve ser alcançada. Tal exigência,
implica em hidrolisados com concentração mínima de 100 g/L de glicose. Com o emprego do
extrato Cellic® CTec2 estes teores, utilizando a forrageira B. brizantha pré-tratada submetida
a tratamento ácido e alcalino, estão próximos de serem alcançados, porém em um tempo ainda
longo.

35
Concentração glicose gerada (g/L)

30
Sem adição
25
10g/L
20 20g/L

15 30g/L

40 g/L
10

0
0 2 4 6 8 10

Tempo (h)

Figura 3. Efeito da adição de glicose na hidrólise enzimática de biomassa pré-tratada.

 09 a 12 de setembro de 2012
Búzios, RJ

Para tentar se alcançar a conversão da celulose em glicose em um tempo menor, o efeito

da adição de crescentes cargas enzimáticas na hidrólise da forrageira B. brizantha foi avaliado
e os resultados estão apresentados na Figura 4. O nível máximo de conversão da celulose foi
de cerca de 94% em todos os casos. Entretanto, o tempo de reação para atingir essa conversão
foi diferente quando se utilizou diferentes quantidades do complexo enzimático. Com o
emprego de 30 FPU/g de material seco são necessárias 72 horas para a hidrólise (como já
mostrado na Figura 1), com carga de 60 FPU/g de material seco em 56 horas a mesma
conversão é atingida. Utilizando-se 120 e 240 FPU/ g de material seco, a conversão foi
atingida em 48 horas.
100

90
Concentração glicose gerada g/L

80

70

60 30 FPU/g material

50 60 FPU/g material
120 FPU/g material
40
240 FPU/g material
30

20

10

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (h)

Figura 4. Efeito da adição de diferentes cargas enzimáticas na sacarificação de B.

brizantha pré-tratada.

Fazendo o emprego de 120 FPU/g de material seco é possível alcançar o mesmo teor de
glicose gerado por 30 FPU/g de material seco em um tempo 24 horas menor. Porém, esta
carga enzimática é extremamente alta, cerca de quatro vezes a indicada pelo fabricante e
dificilmente poderia ser viabilizada comercialmente.

4. CONCLUSÃO
Concluiu-se que a hidrólise, utilizando como catalisador o complexo enzimático
Cellic® CTec2, da forrageira B. brizantha submetida a pré-tratamento ácido e alcalino pode
atingir 94% de sacarificação da celulose, gerando um meio reacional com 88g/L de glicose.

A adição de cargas enzimáticas superiores a 30 FPU/g material seco refletem no

aumento da velocidade de reação. Tal carga é limitada a 120 FPU/g material seco, acima deste
limite a adição de enzima não exerce efeito sobre a velocidade de formação de glicose.

A velocidade de hidrólise é negativamente afetada com crescentes concentrações de

glicose no meio reacional. Tendo em vista a necessidade de um hidrolisado com concentração
mínima de 100 g/L para a viabilização econômica, esforços devem ser investidos no
 09 a 12 de setembro de 2012
Búzios, RJ

desenvolvimento de formulações enzimáticas que sejam tolerantes à altas concentrações do

produto de hidrólise.

5. REFERÊNCIAS

ADRIANO, W. S. Preparação e Caracterização de Derivados de Enzimas Industriais em

Quitosana. 2008. Tese (Doutorado em Engenharia Química) – Universidade Federal de São
Carlos.
BHAT, M. K. Cellulases and related enzymes in biotechnology.Biotechnology advances¸v,
18, n. 5, p. 355-83, 2000.
GAN, Q.; ALLEN, S. J.; TAYLOR, G. Kinetic dynamics in heterogeneous enzymatic
hydrolysis of cellulose: an overview, an experimental study and mathematical modelling.
Process Biochemistry, v. 38, p. 1003-1018, 2003.
GENENCOR, 2010. Development of enzyme solutions for the biomass to ethanol
industry.Disponível em <http://ec.europa.eu/energy/renewables/events/doc/2010_10_13/
2_enzymes_bjarne_adamsen.pdf> Acesso em 15/02/2011.
GHOSE, T .K. Measurement of cellulase activities.Pure and Applied Chemistry, v. 59, p.
257-268, 1987.
GOUVEIA, R.; NASCIMENTO, R. T.; SOUTO-MAIOR, A. M; ROCHA, G. J. M.
Validação de metodologia para a caracterização química de bagaço de cana-de-açúcar.
Química Nova, v. 32, n. 6, 2009.
MAKI, M.; LEUNG, K. T.; QIN, W.The prospects of cellulase-producing bacteria for the
bioconversion of lignocellulosic biomass.International Journal of Biology Science, v. 5, p.
500-516, 2009.
NOVOZYMES.Cellic® CTec2 and HTec2 - Enzymes for hydrolysis of lignocellulosic
materialsDisponívelemhttp://www.scienceplease.com/files/products/overviews/cellicctec2.pdf
> Acesso em 15/02/2012.
OGEDA, T. L.; PETRI, D. F. S. Hidrólise enzimática de biomassa. Química Nova, v. 33, n. 7,
p. 1549-1558, 2010.
SINGHANIA, R. R.; SUKUMARAN, R. K.; PATEL, A. K.; LARROCHE, C. PANDEY, A.
Advancement and comparative profiles in the production technologies using solid-state and
submerged fermentation for microbial cellulases. Enzyme and Microbial Technology, v. 46,
p. 541-549, 2010.
TAYLOR, G. Biofuels and the biorefinery concept.Energy Policy. v. 36, p. 4406-4409, 2008.
TU, M, PAN, X., SADDLER, J. N. Adsorption of Cellulase on Cellulolytic Enzymr Lignin
from Lodgepole Pine. Journal Agricultural and Food Chemical, v. 57, p. 7771-7778, 2009.
XIMENES, E.; KIMA, Y.; MOSIERA, N.; DIEND, B.; LADISCH, M. Inhibition of
cellulases by phenols.Enzyme and Microbial Technology, v. 46, p. 170-176, 2010.