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09 a 12 de setembro de 2012 Búzios, RJ

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AVALIAÇÃO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE Brachiaria brizantha UTILIZANDO COMPLEXO ENZIMÁTICO COMERCIAL

T. D. MENDES 1 , T. F. PACHECO 1 , F. B. P. CARVALHO 1 , D. S. RODRIGUES 1 , C. M. M. MACHADO 1 , M. A. CARVALHO 2

1 Embrapa Agroenergia – Laboratório de Processamento de Matérias Primas Energéticas 2 Embrapa Cerrados – Genética e Melhoramento de Forrageiras E-mail para contato: thais.demarchi@embrapa.br

RESUMO – A hidrólise enzimática é um dos principais fatores que elevam o custo da produção de etanol celulósico. O objetivo deste trabalho foi caracterizar um complexo enzimático e definir condições de hidrólise para um substrato natural (Brachiaria brizantha), previamente tratado com ácido (1,5% v/v) e hidróxido de sódio (4% m/v). As atividades enzimáticas foram determinadas em papel, avicel, carboximetilcelulose e celobiose. A biomassa pré-tratada (94% celulose), foi submetida à hidrólise em condições ótimas de temperatura e pH, até variação não significativa de glicose no meio (8 h). Em seguida, o sólido remanescente foi lavado e submetido novamente à hidrólise. Pôde-se observar que

toda a celulose do material é passível de hidrólise em três etapas (24 h), enquanto

o processo de hidrólise completa em uma etapa ocorre em 72 h, indicando efeitos

de inibição. Testes de hidrólise da biomassa (razão sólido:líquido, 1:10) variando

a concentração inicial de glicose (10 a 40 g/L) e a carga enzimática (30 a 240

FPU/g de material) foram realizados. Observou-se redução na velocidade inicial de hidrólise com o aumento da concentração inicial de glicose e redução do tempo de conversão com o aumento da quantidade de enzima. Os tempos para atingir conversão da celulose superior a 80 % foram: 72 horas para 30 FPU, 56 horas para 60 FPU e 48 horas para 120 e 240 FPU. Concluiu-se que a velocidade de hidrólise é afetada pela carga enzimática e pela concentração de glicose no meio.

1. INTRODUÇÃO

O interesse acerca dos biocombustíveis aumentou de forma dramática nos últimos anos.

Não apenas em virtude do discurso da contenção dos danos ambientais; mas também impulsionado pelo aumento da demanda de energia acompanhada do declínio da oferta de combustíveis fósseis.

Os processos de obtenção de etanol a partir do caldo de cana-de-açúcar ou do amido do milho já se encontram estabelecidos há muitos anos. O crescente interesse e demanda por etanol tem direcionado as ações de PD&I para a viabilização da produção de etanol a partir de biomassa lignocelulósica, o denominado etanol de segunda geração. Pesquisas têm sido desenvolvidas visando o aproveitamento de biomassa, residuais ou não, como coníferas, feno,

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forrageiras, taxi branco,bagaço e palha de cana-de-açúcar, palha de trigo, de milho e de arroz, resíduos da indústria de papel, entre outros.

A biomassa lignocelulósica é constituída principalmente por celulose, hemicelulose e

lignina. De maneira geral, a celulose, polissacarídeo composto por moléculas de glicose unidas por ligações β-1,4-glicosídicas,é encontrada em maior proporção. Para que a biomassa possa gerar açúcares fermentescíveis, via processo bioquímico, esta deve passar por duas etapas: pré-tratamento e hidrólise enzimática.

A etapa do pré-tratamento é fundamental para o sucesso da ação das enzimas sobre a

biomassa. Nesse processo, por ação físico-química, ocorre a desestruturação do material lignocelulósico, podendo ocorrer a extração da hemicelulose e/ou lignina. Como conseqüência, as fibras de celulose ficam mais acessíveis à ação das enzimas celulolíticas

(OGEDA e PETRI, 2010).

Celulases são divididas, de acordo com seu local de atuação, em três grupos:

endoglucanases, que clivam as ligações glicosídicas internas das cadeias de celulose; exoglucanases, que atuam nos terminais da cadeia, gerando celobiose; e β-glucosidades que hidrolisam a celobiose à glicose (BHAT, 2000). Estes três grupos de enzimas agem em sinergia e, em consórcio, são denominadas como complexo celulolítico.

O processo de hidrólise enzimática de biomassa ainda não se encontra estabelecido, mas

é uma tecnologia que vem sendo indicada como a mais promissora e incluída como parte do processo modelo da produção de etanol de segunda geração. O entrave para sua aplicação ainda é o alto custo das enzimas (TAYLOR, 2008).

Esforços em PD&I de empresas e instituições de diversos países têm como objetivos o aumento da eficiência do processo de hidrólise e diminuição do custo de produção e comercialização das enzimas. As empresas líderes no mercado de enzimas, Novozymes e Genencor, têm focado na indústria de biocombustíveis. A Genencor possui o complexo Accelerase® DUET, que apresenta alta quantidade de β-glicosidase (GENENCOR, 2010). Já a Novozymes tem como atual produto o Cellic® CTec2, que apresenta altos níveis de atividade β-glicosidase, é tolerante a inibidores, e compatível com diferentes matérias-primas lignocelulósicas e processos de pré-tratamento (NOVOZYMES, 2010). O custo do emprego de ambas as enzimas é o menor já alcançado pelas empresas, cerca de US$ 0,13 por litro de etanol.

Um complexo celulolítico ideal, que proporcione alta eficiência de conversão, deve apresentar as seguintes características: operação em temperatura e pH brandos; ajuste correto na quantidade das diferentes enzimas componentes, garantindo uma ação sinérgica entre elas; elevada especificidade; tolerância ao produto de hidrólise; alta estabilidade em pH e temperaturas ótimos; alta atividade em substratos insolúveis (MAKI et al., 2009).

A eficiência dos complexos enzimáticos não pode ser determinada apenas sobre substratos padrão. É de fundamental importância a avaliação da ação das preparações enzimáticas sobre substratos naturais, como a parede celular vegetal (SINGHANIA et al.,

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2010). O objetivo deste trabalho foi caracterizar, quanto à atividade, o complexo enzimático Cellic® CTec2 e avaliar a atuação deste na hidrólise de Brachiaria brizantha cv. Marandu.

2.MATERIAl E MÉTODOS

2.1. Material

Foi utilizado o complexo enzimático comercial Cellic® CTec2, gentilmente cedido pela empresa Novozymes.

Como substrato, utilizou-se a forrageira Brachiaria brizantha cv. Marandu, cultivada em campo experimental da Embrapa Cerrados. O material passou por secagem a 70°C por 48 horas e moagem em moinho de facas (granulometria máxima de 2mm).

2.2. Métodos

2.2.1. Caracterização da atividade do extrato enzimático: Foram determinadas as

atividades do extrato enzimático sobre os seguintes substratos: papel de filtro, carboximetilcelulose (CMC) e celobiose de acordo com metodologia descrita por Ghoose (1987) e em avicel, segundo Adriano (2008).

2.2.2. Pré-tratamento da biomassa: O substrato seco e moído passou por pré-tratamento ácido seguido de alcalino. O pré-tratamento ácido consistiu em expor o material à solução de ácido sulfúrico 1,5 % v/v, para cada grama de material seco foram utilizados 10 mL de solução de ácido sulfúrico. A suspensão foi mantida em autoclave por 30 minutos a 121ºC. Após a reação, a amostra foi filtrada e a fração sólida passou por dupla lavagem com água destilada utilizando volume correspondente ao da solução ácida empregada. O sólido foi então submetido ao tratamento alcalino.

Nesta etapa, para cada grama de material seco foram utilizados 10 mL solução de hidróxido de sódio 4% (m/v). A suspensão foi então mantida em autoclave por 30 minutos a 121ºC. Imediatamente após a retirada da autoclave, o material foi filtrado e a fração sólida lavada com água a 100ºC (cerca de cinco vezes o volume de solução de NaOH utilizado). A amostra resultante do pré-tratamento passou por caracterização quanto à composição de açúcares segundo método de Gouveia e colaboradores (2009).

2.2.3. Hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada: A biomassa pré-tratada, ainda

úmida, foi suspensa (na proporção 1:10, em base seca) em tampão citrato de sódio/ácido cítrico0,1M pH 5.Para cada grama de material presente na biomassa pré-tratada (peso seco) foi adicionado o correspondente a 30 FPU do complexo enzimático comercial. A hidrólise foi realizada em erlenmeyers de 250 mL, em agitador orbital, sob agitação constante de 200rpm, a uma temperatura de 50ºC por 72 horas.

2.2.4. Digestibilidade da celulose presente na biomassa pré-tratada: Para avaliar a

digestibilidade da celulose disponível na biomassa pré-tratada, esta foi submetida a três hidrólises consecutivas. Cada etapa teve duração de 8 horas, as demais condições do processo foram mantidas(item 2.2.3). Entre os sucessivos processos de hidrólise, o material sólido foi lavado para a retirada dos açúcares e enzima livres provenientes da hidrólise anterior.

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2.2.5. Efeito da adição de glicose sobre a atividade enzimática: Para avaliar o efeito

inibitório do produto (glicose) sobre a atividade do complexo enzimático, ao início da hidrólise enzimática foram adicionadas 10, 20, 30 e 40 g/L de glicose. As condições de hidrólise foram as descritas no item 2.2.3 e a quantidade de glicose foi acompanhada durante as 8 horas de hidrólise. A quantidade de glicose formada em cada uma das condições foi comparada à formada na hidrólise controle, onde não houve a adição prévia de glicose.

2.2.6. Efeito do emprego de diferentes cargas enzimáticas: Para avaliar o efeito do

emprego de crescentes cargas enzimáticas sobre a velocidade de hidrólise foram empregados 30, 60, 120 e 240 FPU/g material seco. As condições de hidrólise foram as mesmas descritas no item 2.2.3.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A caracterização do complexo enzimático Cellic® CTec2 quanto à atividade sobre diferentes substratos está apresentada na Tabela 1. A atividade sobre papel de filtro Whatman n°1 (U FP ) é utilizada como referência para a atividade global das enzimas celulolíticas que agem sinergicamente na hidrólise da celulose (GHOSE, 1987). Pode-se observar também alta atividade em celobiose, o que indica que o extrato é rico em β-glicosidase. Segundo ficha técnica da Cellic® CTec2, o diferencial do referido extrato é exatamente o enriquecimento com β-glicosidase (NOVOZYMES, 2010). A atividade em avicel é muito reduzida se comparada às atividades em CMC e celobiose. A baixa atividade em avicel indica que o extrato é pobre em exo-celulases.

Tabela 1. Atividade do extrato enzimático Cellic® CTec2 –Novozymes sobre diferentes substratos.

Substrato

Atividade*.mL -1 de extrato

Papel de filtro (U FP )

583

CMC (U CMC )

4121

Avicel (U Avicel )

148

Celobiose (U Celobiose )

9991

*µmol/min

Para se avaliar a atuação do complexo celulolítico comercial na hidrólise de substrato real, optou-se por realizar um pré-tratamento que resultasse em material rico em celulose e baixos teores de hemicelulose e lignina. A forrageira B. brizantha passou, inicialmente, por um tratamento ácido para a remoção da hemicelulose e, em seguida, por um tratamento alcalino, para a extração da lignina. Ao final dos processos a biomassa pré-tratada apresentou 94% de celulose.

A cinética da hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada está apresentada na Figura 1. Em reação contendo 10% de carga de sólido e 30 FPU/g de material lignocelulósico seco, após 72 horas de hidrólise, o meio reacional atingiu uma concentração de 88,3g/L de glicose, o que corresponde a 94% de conversão da celulose presente no material.

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Observa-se a diminuição da velocidade da reação depois de transcorridas 8 horas de hidrólise, quando cerca de 45% da celulose disponível já havia sido convertida e a concentração de glicose no meio era de 42,5 g/L (Figura 1).A diminuição na velocidade pode ser resultante de diversos fatores, entre eles (i) o grau de cristalinidade e polimerização da celulose no material residual (XIMENESet al.,2010); (ii) difusão das enzimas (transferência de massa) no decorrer do processo hidrolítico (GAN et al., 2002); (iii) efeito da adsorção das enzimas à celulose (GAN et al., 2002) e principalmente à lignina (TU, et al., 2009); (iv) e inibição da enzima pela crescente concentração do produto (glicose e celobiose) no meio reacional (GAN et al., 2002).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60
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Concentração glicose (g/L)

Tempo (horas)

Figura 1. Cinética da hidrólise enzimática de B. brizantha pré-tratada em reação contendo 10% de sólido e 30 FPU/g de material seco.

Para avaliar se há aumento gradativo da recalcitrância do material no decorrer da hidrólise enzimática, após as primeiras 8 horas de reação, a hidrólise foi interrompida e a fração sólida residual submetida à nova hidrólise. Foram realizadas três hidrólises sucessivas e os resultados estão apresentados na Figura 2. As duas primeiras hidrólises apresentam curvas sobrepostas, indicando que a celulose remanescente após as primeiras 8 horas apresenta a mesma digestibilidade que a celulose presente no material no início da hidrólise. Após a segunda hidrólise, cerca de 64% do material já havia sido convertido em glicose. Ao final da terceira hidrólise, que gerou 20 g/L de glicose, 85% da celulose presente no material havia sido hidrolisada. Estes dados mostram que a celulose disponível na biomassa pré- tratada não oferece resistência gradativa à ação das enzimas celulolíticas. A sacarificação ocorre em 24h quando realizada em três etapas, enquanto que a hidrólise completa, em apenas uma etapa, ocorre em 72 horas, indicando a presença de fatores de inibição.

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Concentração glicose (g/L)

Tempo (h)

1a. Hidrólise0 0 2 4 6 8 10 Concentração glicose (g/L) Tempo (h) 2a. Hidrólise 3a. Hidrólise

2a. Hidrólise8 10 Concentração glicose (g/L) Tempo (h) 1a. Hidrólise 3a. Hidrólise Figura 2. Hidrólise enzimática de

3a. Hidróliseglicose (g/L) Tempo (h) 1a. Hidrólise 2a. Hidrólise Figura 2. Hidrólise enzimática de B. brizantha

Figura 2. Hidrólise enzimática de B. brizantha pré-tratada em três etapas sucessivas.

O efeito inibitório do produto da hidrólise sobre a atividade do complexo celulolítico foi avaliado adicionando-se, ao início da hidrólise, crescentes concentrações de glicose. Os resultados estão apresentados na Figura 3. Pode-se observar que quanto maior a concentração inicial da glicose no meio reacional, menor a velocidade de reação e a quantidade de glicose gerada ao final de 8 horas. Quando a hidrólise iniciou-se em meio contendo 40 g/L de glicose, apenas 13 g/L de glicose são gerados, o que corresponde a apenas 43% da glicose gerada no processo sem a adição de açúcar. Os dados mostram que o complexo enzimático Cellic® CTec2 é fortemente inibido na presença de glicose.

Para que a produção de etanol a partir de material lignocelulósico seja viabilizada comercialmente, uma produção mínima de 50 g/L de etanol deve ser alcançada. Tal exigência, implica em hidrolisados com concentração mínima de 100 g/L de glicose. Com o emprego do extrato Cellic® CTec2 estes teores, utilizando a forrageira B. brizantha pré-tratada submetida a tratamento ácido e alcalino, estão próximos de serem alcançados, porém em um tempo ainda longo.

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Concentração glicose gerada (g/L)

Tempo (h)

Sem adição4 6 8 10 Concentração glicose gerada (g/L) Tempo (h) 10g/L 20g/L 30g/L 40 g/L Figura

10g/LConcentração glicose gerada (g/L) Tempo (h) Sem adição 20g/L 30g/L 40 g/L Figura 3. Efeito da

20g/Lglicose gerada (g/L) Tempo (h) Sem adição 10g/L 30g/L 40 g/L Figura 3. Efeito da adição

30g/Lglicose gerada (g/L) Tempo (h) Sem adição 10g/L 20g/L 40 g/L Figura 3. Efeito da adição

40 g/Lgerada (g/L) Tempo (h) Sem adição 10g/L 20g/L 30g/L Figura 3. Efeito da adição de glicose

Figura 3. Efeito da adição de glicose na hidrólise enzimática de biomassa pré-tratada.

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Para tentar se alcançar a conversão da celulose em glicose em um tempo menor, o efeito da adição de crescentes cargas enzimáticas na hidrólise da forrageira B. brizantha foi avaliado e os resultados estão apresentados na Figura 4. O nível máximo de conversão da celulose foi de cerca de 94% em todos os casos. Entretanto, o tempo de reação para atingir essa conversão foi diferente quando se utilizou diferentes quantidades do complexo enzimático. Com o emprego de 30 FPU/g de material seco são necessárias 72 horas para a hidrólise (como já mostrado na Figura 1), com carga de 60 FPU/g de material seco em 56 horas a mesma conversão é atingida. Utilizando-se 120 e 240 FPU/ g de material seco, a conversão foi atingida em 48 horas.

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Concentração glicose gerada g/L

Tempo (h)

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50 60 70 80 Concentração glicose gerada g/L Tempo (h) 30 60 120 240 FPU/g material

50 60 70 80 Concentração glicose gerada g/L Tempo (h) 30 60 120 240 FPU/g material

50 60 70 80 Concentração glicose gerada g/L Tempo (h) 30 60 120 240 FPU/g material

30

60

120

240

FPU/g material

FPU/g material

FPU/g material

FPU/g material

Figura 4. Efeito da adição de diferentes cargas enzimáticas na sacarificação de B. brizantha pré-tratada.

Fazendo o emprego de 120 FPU/g de material seco é possível alcançar o mesmo teor de glicose gerado por 30 FPU/g de material seco em um tempo 24 horas menor. Porém, esta carga enzimática é extremamente alta, cerca de quatro vezes a indicada pelo fabricante e dificilmente poderia ser viabilizada comercialmente.

4. CONCLUSÃO

Concluiu-se que a hidrólise, utilizando como catalisador o complexo enzimático Cellic® CTec2, da forrageira B. brizantha submetida a pré-tratamento ácido e alcalino pode atingir 94% de sacarificação da celulose, gerando um meio reacional com 88g/L de glicose.

A adição de cargas enzimáticas superiores a 30 FPU/g material seco refletem no aumento da velocidade de reação. Tal carga é limitada a 120 FPU/g material seco, acima deste limite a adição de enzima não exerce efeito sobre a velocidade de formação de glicose.

A velocidade de hidrólise é negativamente afetada com crescentes concentrações de glicose no meio reacional. Tendo em vista a necessidade de um hidrolisado com concentração mínima de 100 g/L para a viabilização econômica, esforços devem ser investidos no

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desenvolvimento de formulações enzimáticas que sejam tolerantes à altas concentrações do produto de hidrólise.

5. REFERÊNCIAS

ADRIANO, W. S. Preparação e Caracterização de Derivados de Enzimas Industriais em

Quitosana. 2008. Tese (Doutorado em Engenharia Química) – Universidade Federal de São

Carlos.

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MAKI, M.; LEUNG, K. T.; QIN, W.The prospects of cellulase-producing bacteria for the bioconversion of lignocellulosic biomass.International Journal of Biology Science, v. 5, p. 500-516, 2009.

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OGEDA, T. L.; PETRI, D. F. S. Hidrólise enzimática de biomassa. Química Nova, v. 33, n. 7,

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TAYLOR, G. Biofuels and the biorefinery concept.Energy Policy. v. 36, p. 4406-4409, 2008.

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