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Purificação de Proteínas

Purificação de Proteínas

Finalidades

- Compreensão sobre estrutura e função de proteínas –


proteínas individuais!!

- Proteína pura - essencial para que suas propriedades e


atividades sejam determinadas
Fontes protéicas
Extração de proteínas
PRINCÍPIO BÁSICO DA PURIFICAÇÃO DE
PROTEÍNAS

Explorar diferenças nas propriedades físicas


e químicas das proteínas

Seqüência, número, tipo de


aminoácidos

Estrutura tridimensional
Desafio de uma purificação de proteínas:

Separar a Proteína de Interesse de todos os outros


componentes da mistura com

• Eficiência razoável

• Rendimento

• Rapidez
• Pureza

• Atividade biológica

• Integridade estrutural
1º passo: Obtenção do extrato bruto

Centrifugação
diferencial
(fracionamento)

Baseiam na diferença de
velocidades que as
partículas sedimentam no
fundo do tubo.
Centrifugação isopícnica – Organelas / membranas

Líquidos com diferentes


densidades.
2º passo: Fracionamento do Extrato bruto

Passos iniciais – diferenças de solubilidade => pH, T, 


• Salting out – Sulfato de amônio - (NH4)2SO4

Agregação e
precipitação

Centrifugação
Diferentes proteínas precipitam em
diferentes faixas de [(NH4)2SO4]

Log (solubilidade) (mg/mL)

A
-1
B
-2

50 60 70
[(NH4)2SO4] (% saturação)
Retirada de sal - diálise
3º passo: Fracionamento das Proteínas

Cromatografia em Coluna

•Carga
•Tamanho
•Afinidade de ligação
Cromatografia de Troca iônica

Explora as diferenças no sinal e magnitude da


carga elétrica final das proteínas em um
determinado pH
Carga Líquida Proteína ácida / básica

Carga dos grupos ionizáveis de uma proteína em função do pH

Grupo ionizável pKa pH2 < -------- pH 7 -------- > pH12


C-terminal (COOH) 4,0 0 0000 - - - - - - - - - - - - - - - -
Aspartato (COOH) 4,5 0 00000 - - - - - - - - - - - - - - -
Glutamato (COOH) 4,6 0 00000 - - - - - - - - - - - - - - -
Histidina (imidazol) 6,2 + +++++++ 0 0 0 0 000000 000
N-terminal (amino) 7,3 + +++++++ + + 0 0 000000 000
Cisteína (SH) 9,3 0 0000000 0 0 0 000 - - - - - - -
Tirosina (fenol) 10,1 0 0000000 0 0 0 00000 - - - - -
Lisina (amino) 10,4 + ++++ +++ + + + + ++ +++ 0 0 0 0
Arginina (guanidino) 12,0 + ++++ +++ + + + + ++ ++++ + + 0

D.R. Marshak, J.T. Kadonaga, R.R. Bugess, M.W. Knuth, W.A. Brennan Jr, S.H. Lin. Strategies for
protein purification and characterization – A laboratory course manual. 1996. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, USA.
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Grande carga líquida +
 Carga líquida +
 Carga líquida -
 Grande carga líquida -

Matriz sólida 
grupos negativos

• Efeito do pH
• Efeito da concentração salina
• Gradientes
Cromatografia por Exclusão Molecular
ou Filtração em Gel

Diferenças de tamanho e forma entre as


proteínas são a base da separação por
filtração em gel
Matriz
porosa
Cromatografia de afinidade

Interações específicas ligante-proteína são


a base da cromatografia por afinidade
Proteína de interesse
Ligante
Ligante ligado ao
polímero
Acompanhamento de um processo de purificação

• Atividade biológica

• Atividade enzimática

• Absorbância 280

• Pureza
Acompanhamento de um processo de purificação

• Absorbância 280

Cromatograma
Tirosina Triptofano

Atividade
9 Proteína 0,35
8
0,30

Absôrbancia (280 nm)


7
Atividade (U/mL)

0,25
6
5 0,20
4
0,15
3
0,10
2
1 0,05

20 40 60 80 100 120 140 160


Tubo
Absorção de luz

- A absorção da radiação eletromagnética é específica para cada tipo de molécula;

- Ocorre transferência de energia para a molécula e resulta em uma diminuição da


intensidade da radiação eletromagnética incidente = Transmitância

I0 I
Absorção de luz

- A Absorbância está relacionada com a Transmitância de forma logarítma = quanto


maior a absorbância de uma solução, menor a Transmitância

Lei de Lambert-Beer
- A absorbância é diretamente proporcional à concentração de uma espécie absorvente c e
do caminho óptico b do meio absorvente.

- a = absortividade molar (ε) = representa o máximo de absorção de uma espécie.


- B= caminho óptico do meio absorvente.
- C = concentração de uma espécie absorvente.
Lei de Lambert-Beer
- A absorbância é diretamente proporcional à concentração de uma espécie absorvente c e
do caminho óptico b do meio absorvente.

- ε = L/mol cm

- SEMPRE ZERAR O APARELHO


COM O BRANCO DO
EXPERIMENTO!!!!
Absorção de luz: Lei de Lambert-Beer
- Aminoácidos aromáticos
Análises de concentração de proteínas

Espectofotômetro
(aula de hoje)
Análise de pureza - Eletroforese
Aparato experimental

Todas as proteínas
tem carga -?

SDS – revestem
proteínas com carga
negativa
• Princípio

 = mobilidade eletroforética
Eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE)

1 SDS / 2 resíduos aa
• Géis
• agarose
• amido
• poliacrilamida
• Efeito de peneira molecular

• relação carga/massa
• tamanho
• forma
• pH
Vantagens do gel de poliacrilamida

• reprodutibilidade
• tamanho dos poros
• reatividade química
• pH
• T
• cor
Visualização das proteínas no gel

Monitoramento de uma purificação


Eletroforese e Determinação de propriedades
das proteínas

• PM

• No. de subunidades

• pI
Determinação do P.I. de uma proteína

 Focalização isoelétrica

Anfólitos - íons que se


comportam como ácido e
base
Aparato experimental

 Focalização isoelétrica
Mistura de
proteínas

Solução de anfólitos
incorporada no gel Coloração: proteínas
distribuídas de acordo
com o seu pI

Gradiente
estável de
pH
Eletroforese Bidimensional

2
1 3

Focalização
SDS-PAGE
isoelétrica
Proteoma
Medida da concentração de proteínas

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