Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

A técnica STED foi proposta por Hell e Wichman em 1994 1, baseada na idéia de
supressão da fluorescência através da emissão estimulada. A técnica STED se baseia em
dois feixes ópticos, um para excitar a molécula e o outro para suprimir a fluorescência
por emissão estimulada. O detalhe da técnica é usar um feixe de depleção, STED, na
forma “doughnut”, com um “buraco” no centro. Nesse caso, a emissão espontânea só
acontece na região central da superposição dos dois feixes onde a emissão estimulada não
atuou.

Figura 1. Princípio de funcionamento do STED.

http://physicsworld.com/cws/article/print/34322/1/PWshe3_06-08

A figura 1 esquematiza essas idéias. O feixe superior da esquerda excita os

elétrons para os níveis excitados com a resolução usual limitada por difração. Sem STED
a fluorescência teria o perfil do feixe inferior da esquerda. O feixe STED da direita
superior estimula o decaimento dos elétrons excitados, com exceção da região central
onde não há luz. A fluorescência por emissão espontânea, da direita inferior, só aparece
nessa região.
A Figura 2 mostra o esquema experimental utilizado pelos proponentes da técnica.
O feixe de excitação é sintonizado em 558 nm, correspondendo à seta verde no diagrama

1
S. W. Hell and J. Wichmann, “Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission”, Opt. Lett., 19 (11) 780 (1994)
e níveis à direita, e o STED em 766 nm, correspondendo à seta vermelha, para evitar
reexcitação da molécula. O feixe STED passa por uma placa cuja parte central contém
uma lâmina de /2 para criar interferência negativa no centro do feixe dando ao mesmo o
formato de “doughnut” mostrado à direita. O espelho-filtro do feixe de excitação é um
filtro passa-alta, refletindo o 558 nm, mas sem transmiti-lo. Já o filtro do feixe STED é
um filtro passa-banda entre 645-715 nm, que reflete o 766 nm mas só transmite na banda
da emissão espontânea, entre 645-715 nm, correspondendo a linha amarela no diagrama
de níveis. O fotodetetor, portanto, só detecta a emissão espontânea advinda do “buraco”
escuro do feixe STED. Varrendo uma molécula sobre a região iluminada com sistema de
alta resolução piezoelétrico pode-se medir a resolução obtida através dessa técnica.

Figura 2 (a). acima: esquema experimental Figura 2 (b): acima à esquerda: formato de
do STED; abaixo: feixe de excitação, STED “donut” do feixe STED, acima à direita: diagrama
e emissão com depleção saturada. de níveis da molécula utilizada, abaixo: “spot” do
STED comparado ao “spot” observado com
 microscopia confocal.

Figura 3 (a) mostra a resolução de 26 nm obtida anteriormente pelo grupo de

Stefan Hell e a última,com resolução de 16 nm, ambas publicadas em 2005.

Figura 3. Records da resolução obtida através da microscopia STED

Figura 4 mostra algumas imagens obtidas pelo grupo do Dr. Hell usando STED.

Figura 4. Comparação de imagens confocal e STED de neurofilamentos em

neuroblastoma humano. Barra da escala corresponde a 1000 nm.2 Embaixo, detalhe em
da comparação entre as técnicas confocal e STED dos neurofilamentos.

Quanto à questão essencial de natureza espectroscópica, o sistema sob

investigação deve possuir níveis de energia excitados a partir dos quais possam ocorrer,
simultaneamente, transições eletrônicas espontâneas e estimuladas para níveis inferiores
distintos, mediante a escolha adequada de feixes ópticos incidentes. Para tal proposta,
tem sido usado sistemas moleculares orgânicos.1-6 As condições espectroscópicas básicas
no caso de um sistema molecular orgânico típico para a ocorrência de excitação,
luminescência e supressão, necessárias para um experimento de STED, são mostradas
esquematicamente na figura 5.

2
3D STED Microscopy with Pulsed and Continuous Wave. Tese de doutorado de Benjamin Harke defendida em Göttingen 2008
 S1

Fluorescência
Absorção
Emissão Estimulada

S0 relax < 1ps

Figura 5: esquema da estrutura de níveis de energia e dos processos fotofísicos ocorrentes em

um típico experimento de STED.

No caso de um sistema orgânico típico (moléculas de camada fechada no estado

fundamental), as moléculas são, inicialmente, levadas a um nível vibrônico de um estado
excitado S1 por meio do feixe de excitação. Depois da relaxação vibracional, cujo tempo
de vida típico é da ordem 1 ps, o sistema molecular encontrar-se-á no estado vibracional
de mais baixa energia do nível eletrônico S1. Neste estado, o sistema pode retornar ao
nível eletrônico fundamental S0, mediante fluorescência ou processos não-radiativos, tais
como conversão interna direta ou cruzamento intersistema para um nível tripleto
intermediário (não indicado na figura 5). Na presença do feixe de supressão, alem desses
processos de decaimento, o sistema pode ser levado a um estado vibracional excitado do
nível eletrônico S0, mediante emissão estimulada. Desde que a taxa de decaimento deste
estado vibracional para outros de mais baixa energia seja significativamente maior que a
taxa de reabsorção, o processo de emissão estimulada promoverá o esgotamento
populacional do nível S1, suprimindo, desta forma, a fluorescência espontânea. A
população normalizada do nível S1, em função da intensidade do feixe de supressão ISUP,
pode ser dada aproximadamente por:
 1 
 

 S1  1
n S 1  I SUP    (3)
 1 I  I
   SUP  1  SUP
  S1 h  I SAT
onde S1,  e h são, respectivamente, o tempo de vida do estado S 1, a seção de choque
molecular para a emissão estimulada e a energia do fóton, enquanto ISAT = h(S1)-1 é a
intensidade de saturação. Quando ISUP >> ISAT ocorre supressão da luminescência do
nível S1, pois ns1  0 .

Se o feixe de supressão apresenta distribuição de intensidade centralmente nula,

não haverá supressão da fluorescência no centro da mancha focal gerada pelo mesmo.
Desta forma, será gerada uma mancha luminosa ilimitada por difração cujas dimensões
diminuem com o aumento de ISUP. Por exemplo, para o caso de um feixe de supressão
com distribuição de intensidade na direção x dada por I(x) = I0sen2(2x/), a menor
largura de banda a meio máximo não mais seria determinada pela equação 1, mas por:1

x I 0  
I0 (4)
n sen 
I SAT

que diminui com o aumento da intensidade máxima I0 do feixe de supressão. Na figura 6,

o processo de redução da largura de banda espacial (na direção x) de uma mancha
luminescente em função da itensidade I0 do feixe de supressão é demonstrado.
 I0 = 100 ISAT

iNTENSIDADE
I0 = 50 ISAT

I0 = 10 ISAT
I0 = 0

-200 -100 0 100 200

x (nm)

Figura 6: ilustração da quebra do limite de difração mediante a presença de um feixe de

supressão senoidal para I0 = 0, 10I0, 50I0, 100I0. As linhas cheias e as tracejadas correspondem,
respectivamente, às distribuições espaciais de intensidade de luminescência e do feixe de
supressão. Os valores de , n e  considerados foram, respectivamente, 400nm, 1,5 e 68o.

Conforme ilustrado na figura 6, para um caso em que , n e  são,

respectivamente, 400nm, 1,5 e 68o, seria possível reduzir a largura de banda de 144 nm
para 58 nm se a intensidade do feixe de supressão superar em 10 vezes a intensidade de
saturação e para 18 nm se esta última for superada pela a primeira em 100 vezes.
A partir do potencial da microscopia STED discutido acima, no que se refere à
resolução, pode-se esperar que importantes descobertas no estudo de processos celulares
podem ser feitas com o uso oportuno desta ferramenta. Os objetivos do presente trabalho,
que serão apresentados a seguir, estão focados nessa direção.
Referencias

Recent advances in optical physics have shown that the diffraction

barrier of far-field fluorescence microscopy can be broken by stimulated
emission depletion (STED)2,10,11. In fact, STED is just one
example of a family of microscopy concepts that, in spite of using
regular lenses, allow diffraction-unlimited resolution11–13. In a typical
STED microscope the excitation beam is overlapped with a doughnut-
shaped beam that is capable of de-exciting fluorophores by
stimulated emission. Co-alignment of the beams ensures that
fluorescence is allowed only in the central area of the excitation
spot where the doughnut beam is close to zero (Fig. 1a). Scanning
with a narrowed spot across the sample readily yields subdiffraction
images.With a sufficiently intense doughnut, the fluorescent spot of
a STED microscope can, in principle, be sharpened down to the
molecular scale2,11,12.