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INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO

Prof. Dr. Alvaro Galdos


alvarogaldos@alumni.usp.br
IMUNODIAGNÓSTICO DE DOENÇAS INFECCIOSAS

DIAGNÓSTICO DE CERTEZA DE
UMA INFECÇÃO

• Demonstração direta do patógeno


ou de seus produtos nos tecidos ou
fluidos biológicos dos hospedeiros
e/ou presença de sintomas clínicos
definidos
MÉTODOS IMUNOLÓGICOS
DIRETOS OU INDIRETOS

Amplamente usados na pesquisa de antígenos, anticorpos ou


imunocomplexos:

Rapidez
Simplicidade
Possibilidade de automação
Baixo custo operacional
ANTICORPOS NO DIAGNÓSTICO
INDIVIDUAL (#1)

• Elucidar processos patológicoscom sintomas e sinais


clínicos confundíveis
• Diferenciar a fase da doença
• Diagnosticar doença congênita
• Selecionar doadores de sangue
• Selecionar doadores e receptores de órgãos para
transplantes
ANTICORPOS NO DIAGNÓSTICO
INDIVIDUAL (#2)

• Avaliar o prognóstico da doença.


• Avaliar a eficácia da terapêutica e suspensão da
terapêutica.
• Avaliar a imunidade específica naturalmente adquirida ou
artificialmente induzida.
• Verificar o agravamento da doença.
ANTICORPOS EM INQUÉRITOS
SOROEPIDEMIOLÓGICOS

• Estabelecer a prevalência da doença


• Verificar a erradicação da doença
• Verificar a reintrodução de novos casos em áreas
consolidadas
PESQUISA DE ANTÍGENOS

• Como critério de cura


• Na definição da etiologia da doença
• Na seleção de doadores de sangue
• Em inquéritos epidemiológicos
LIMITAÇÕES DOS TESTE
SOROLÓGICOS (#1)

• Dependem da capacidade de resposta imune do hospedeiro


• Genética
• Estado de nutrição
• Integridade dos mecanismos de resposta imunológica
LIMITAÇÕES DOS TESTE
SOROLÓGICOS (#2)

• Ubiquidade dos determinantes antigênicos


• Reação cruzada (anticorpos heterófilos, antígenos
semelhantes, experiência imunológica do hospedeiro com
estímulos antigênicos variados)
LIMITAÇÕES DOS TESTE
SOROLÓGICOS (#3)

• Interferentes não específicos


• Detergentes
• Solventes orgânicos
• pH
• Cromógenos endógenos
• Inibidores enzimáticos
FATORES DO ANTÍGENO ALVO QUE
DEVEM SER CONSIDERADOS NA
PESQUISA DE ANTÍGENOS
• Não persistência na circulação na ausência do parasita
• Ser abundante
• Não apresentar grande diversidade genética
• Ser estruturalmente diferente de antígenos encontrados no
sangue
MANIFESTAÇÕES DAS
REAÇÕES Ag - Ac
• REAÇÃO PRIMÁRIA
• Ligação dos grupos da molécula antigênica com um de dois sítios
de combinação da molécula de anticorpo.
• REAÇÃO SECUNDÁRIA
• Visibilização direta ou com auxilio de lupas da precipitação ou da
aglutinação.
• REAÇÃO TERCIÁRIA
• Expressão biológica da interação Ag-Ac.
TESTES SOROLÓGICOS

• Os testes sorológicos ou imunoensaios são técnicas


para a detecção e a quantificação de antígenos e
anticorpos, ou outras substâncias que
desempenham o papel de antígeno no ensaio.
REAGENTES UTILIZADOS EM
TESTES SOROLÓGICOS

• Soro
• Antiglobulinas / Anti-imunoglobulinas (IgG, IgM, IgA)
• Anticorpos monoclonais
• Anticorpos policlonais específicos
• Antígenos
TESTES SOROLÓGICOS

DEPENDENTES DA REAÇÃO TERCIÁRIA


• Testes de complemento
• Teste de hemólise Compreendem os testes in vivo,
que mensuram o real efeito
protetor dos Anticorpos em
• Fixação de complemento cultivos celulares.

• Neutralização
TESTES SOROLÓGICOS

DEPENDENTES DA REAÇÃO SECUNDÁRIA


• Precipitação
• Aglutinação
TESTES SOROLÓGICOS
DEPENDENTES DA REAÇÃO PRIMÁRIA
(Técnicas com reagentes marcados)
• Reações / Ensaios / Imunofluorescência
• Reações / Ensaios / Testes imunoenzimáticos (ELISA;
Imuno-dot; Western-blotting; Imuno-Peroxidase (Imuno-
Histoquímica – IHC)
• Citometria de Fluxo
• Radioimunoensaio
• Enzimaimunoensaios
• Reações / Ensaios / Testes rápidos de imunocromatografia
SUBSTÂNCIAS QUE DESEMPENHAM
PAPEL DE ANTÍGENO

➢ Drogas.

➢ Hormônios.

➢ Ácidos nucleicos.

➢ Receptores de células.
IMPORTÂNCIA DA PESQUISA DE
ANTICORPOS E ANTÍGENOS
• Elucidar processos patológicos com sintomas e sinais confundíveis;
• Diferenciar a fase da doença;
• Diagnosticar doença congênita;
• Selecionar doadores de sangue;
• Avaliar o prognóstico da doença;
• Avaliar a eficácia da terapêutica e a suspensão da mesma;
• Avaliar a imunidade específica natural ou artificialmente induzida
• Verificar o agravamento da patologia.
FATORES QUE AFETAM AS
REAÇÕES Ag/Ac

• Afinidade
• Força de interação entre um único sítio de ligação Ag-Ac (em um
único epítopo).
• Avidez
• Força de interações total entre Ac e Ag.
• Soma das afinidades de todos epítopos envolvidos
• Reação cruzada
• Dois Ag diferentes apresentam um epítopo idêntico
• Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não
relacionado, mas com propriedades químicas similares.
APLICAÇÕES
• Pesquisa

• Diagnóstico

• Soroepidemiológicas
MÉTODOS

1) Reagentes não marcados


• Reação de precipitação
• Reação de aglutinação

2) Reagentes marcados
• RIA
• ELISA
• Imunofluorescência
• Western Blotting
AGLUTINAÇÃO
AGLUTINAÇÃO

• Durante o desenvolvimento de uma infecção humana por


algum agente microbiologicamente patogênico, uma
variedade de anticorpos são formados. Estes anticorpos são
chamados de aglutininas. Uma aglutinina quando combinada
com antígenos (aglutinogênio) sob condições controladas
apropriadas é capaz de causar aglutinação.
AGLUTINAÇÃO
1. ESTÁGIO: ligação dos Anticorpos aos Antígenos de
superfície, por meio de ligações não-covalentes.

2. ESTÁGIO: resulta das colisões que ocorrem entre as


partículas, de modo que os anticorpos ligados a uma
partícula se ligam a determinantes antigênicos de outra
formam pontes entre partículas.

Agregados visíveis a olho nu


FATORES QUE INTERFEREM NA
FORMAÇÃO DE AGREGADOS
A • Tipo de Anticorpo (IgM é 750X mais eficiente que IgG)
G
L • Eletrólitos
U • pH (ideal entre 6,0 – 8,0)
T
I
• Macromoléculas hidrofílicas (↓[ ] impedem a
autoaglutinação)
N
A • Enzimas (afastam reações inespecíficas)
Ç • Tempo
Ã
O • Temperatura
FENÔMENO DE PROZONA
A
G • Falsos resultados negativos em soros com
L elevado título de anticorpos aglutinantes
U
T
I • Esse efeito é eliminado empregando-se
N diluições seriadas do soro.
A
Ç
Ã
O
FENÔMENO DE PROZONA
A Efeito prozona no paciente 6
G
L
U
T
I
N
A
Ç
Ã
O
AGLUTINAÇÃO
• Leitura visual e rápida;

• Permite a utilização de antígenos purificados e


complexos fixados a micropartículas ou células;

• Mais sensível que a imunoprecipitação: permite a


detecção de pequenas quantidades de anticorpos;
AGLUTINAÇÃO
PRINCIPAL CARACTERÍSTICA
• Um dos componentes (antígeno ou anticorpo) é
apresentada na forma insolúvel em suspensão, de
forma natural em células, ou adsorvidos
artificialmente a micropartículas ou células.
AGLUTINAÇÃO
• Formação de agregados suficientemente grandes de
micropartículas ou células com múltiplos determinantes
antigênicos (ou anticorpos).

• Leitura rápida, visual a olho nu ou com auxílio de lupa com


luz indireta;
AGLUTINAÇÃO
VANTAGENS DESVANTAGENS

➢Elevada sensibilidade; ➢Reprodutibilidade dos lotes


➢Baixo custo; reagentes.

➢Leitura visual; ➢Estabilidade da ligação Ag-


Ac no suporte.
➢Facilidade de execução
AGLUTINAÇÃO
• A proporção ideal de concentração de antígenos e de
anticorpos é fator interferente no teste;

• Resultados falso negativos podem ocorrer por não haver


formação de agregados suficientemente grandes para serem
detectados;

• Pode ser realizada em tubo, lâmina ou em placas de


microcavidades;
Zona de equivalência: Ag-Ac se
ligam formando uma rede
estável.
Excesso de antígeno: Os
complexos podem ser dissolvidos
quando há excesso de Ag pois o
Ac fica livre para se ligar a novos
Ag adicionados diminuindo a
formação de complexos
insolúveis.
Excesso de Ac: Ocorre redução
de imunocomplexos pois todo o
Ag está precipitado e fica Ac
livre no sobrenadante.
Pró-Zona
COMPLEXO Ag-AC

A quantidade de um antígeno e de um anticorpo em uma solução é


fundamental para a formação de complexos Ag-Ac
TÉCNICAS DE AGLUTINAÇÃO
• Aglutinação direta;
• Inibição da aglutinação direta;
• Aglutinação indireta;
• Inibição da Aglutinação indireta;
• Microaglutinação - Hemaglutinação;
• Teste de Coombs;
• Floculação
AGLUTINAÇÃO DIRETA
• Ocorre com partículas que apresentam determinantes antigênicos
naturais em sua superfície (Ex: hemácias, bactérias, protozoários, fungos)

• O Ag faz parte naturalmente da célula e haverá aglutinação destas células


promovidas por Acs contra esses Ags:

Exemplos:

• Identificação de ags eritrocitários na Tipagem sanguínea;

• Aglutinação de hemácias revestidas com autoanticorpos (anemias autoimunes);

• Pesquisa de Anticorpos em amostras de soros de pacientes com leptospirose,


brucelose e Salmonelose utilizando células bacterianas como Ags;
AGLUTINAÇÃO DIRETA
• Hemácias com antígeno:
• Tipagem de grupos sanguíneos do sistema ABO e Rh (antígenos específicos)
• Reação de Paul-Bunnel-Davidson (antígenos heterófilos)

• Antígenos íntegros ou fragmentados de bactérias, espiroquetas,


protozoários:

• Teste de Widal (Salmoneloses – Febre tifoide)


• Teste de Wright (Briucelose)
• Teste de Weil-Felix (Rickettsiose)

• Teste de aglutinação para leptospirose, toxoplasmose e tripanossomáise


AGLUTINAÇÃO DIRETA
TIPAGEM SANGUÍNEA EM LÂMINAS (SISTEMA ABO)

Reagente (anticorpo anti-A, B):


AGLUTINAÇÃO DIRETA
Leitura do resultado:

• Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível


(aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima.

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AGLUTINAÇÃO DIRETA
Leitura do resultado:

negativo positivo

• Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível


(aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima.
AGLUTINAÇÃO DIRETA
Leitura do resultado:

negativo positivo

• Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível


(aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima.
AGLUTINAÇÃO DIRETA
TESTE DE WIDAL FEBRE TIFÓIDE
• Teste rápido em lâmina e teste em tubo para a detecção de
anticorpos

Teste de antígenos de Salmonella: LPS, flagelo Anti-Salmonella


INIBIÇÃO DE AGLUTINAÇÃO DIRETA

• Utiliza-se a propriedade de alguns antígenos virais


aglutinarem espontaneamente determinados tipos de
hemácias.

• Identifica a presença de anticorpos inibidores desta


aglutinação e que estão presentes no soro do paciente com a
infecção.

• Exemplos: anticorpos contra o vírus da rubéola, sarampo,


influenza e certos enterovírus.
AGLUTINAÇÃO INDIRETA
• Também chamados de PASSIVA;

• Adsorção de Acs ou Ags na superfície de micropartículas inertes (suporte),


que não interferem na ligação Ag-Ac;

• Aglutinação de partículas inertes (látex, poliestireno, bentonita,


sepharose, colódio, charcoal, etc.) ou células antigenicamente não
relacionadas (hemácias, bactérias, leveduras) sensibilizadas com antígenos
solúveis
AGLUTINAÇÃO INDIRETA
• Ag solúveis associados a outras superfícies

• (Partículas de látex)

+
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO INDIRETA

• Baseia-se na competição, pelos sítios de combinação do


anticorpo, entre o antígeno fixado à hemácia e o antígeno
solúvel ou o hapteno.

• O grau de inibição relaciona-se com a quantidade do


antígeno presente na amostra e, também, com a afinidade
pelos sítios de combinação do anticorpo
TESTE DE COOMBS DIRETO
• Este teste é empregado na pesquisa de anticorpos
(gamaglobulinas) já fixados às hemácias
• O teste de Coombs direto é usado no diagnóstico de doenças
autoimunes e doença hemolítica do recém - nascido. Ele
detecta anticorpos ligados à superfície das hemácias.
TESTE DE COOMBS INDIRETO
• Um soro que contenha anticorpos incompletos é incubado
com hemácias que contenham o antígeno correspondente
• As hemácias assim bloqueadas (sensibilizadas) serão
reveladas pelo soro de Coombs (soro antiglobulina humana).
Pesquisa-se a presença de anticorpos incompletos ou imunes
presentes no soro.
PRECIPITAÇÃO
REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO
• Interação: Ac - Ag solúvel forma uma rede que pode desenvolver
um precipitado visível.

PRECIPITADO
REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO
EM SOLUÇÕES

Reação quantitativa:

• Quantidade constante Ac
• Quantidade crescente Ag

Quantidade precipitina
REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO
EM GEL

• Utiliza uma matriz de ágar


• Ag + Ac = linha de precipitação visível

a) Imunodifusão radial
(Método de Mancini)
• Ag ou Ac fixos
• Dosagem de proteínas séricas
b) Imunodifusão dupla
• Identidade de Ags = Ac de
reatividade conhecida
REFERÊNCIAS

VAZ, A. J. Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. 2.


Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2018, 416 p.
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S.
IMUNOLOGIA: Celular e Molecular. 8. Ed. Rio de
Janeiro: ELSEVIER, 2018, 549 p.