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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS – UFT

CAMPUS DE PALMAS

NOTAS DE AULAS
ANÁLISE DE ALIMENTOS

Prof. Dr. Robert Taylor Rocha Bezerra

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SUMÁRIO

1 Umidade em alimentos .............................................................................................. 3

2 Teor de Cinzas em alimentos (RMF) ....................................................................... 12
3 Teor de Açúcares em alimentos .............................................................................. 15
4 Teor de lipídeos em alimentos ................................................................................ 34
5 Acidez ..................................................................................................................... 54
6 Determinação de nitrogênio (Proteínas) .................................................................. 74
7 Conservantes em alimentos (ácido Benzóico) ........................................................ 96
8 Preparo de soluções analíticas .............................................................................. 97
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DETERMINAÇÃO DE UMIDADE

1 INTRODUÇÃO

A determinação da umidade é uma das análises mais importantes,

utilizada na determinação da qualidade dos alimentos. Correlacionando-se com a
estabilidade físico-química e microbiológica dos alimentos além de indicar o teor de
sólidos nos mesmos.
O valor médio da umidade pode variar de acordo com a natureza dos
alimentos. Produtos lácteos fluídos possuem geralmente de 87 a 91% de umidade;
leite em pó, 4%, queijos, 40-75%, manteiga: 15%; creme de leite, 60-70%; sorvetes,
65%; frutas, 65-95%, macarrão, 9%, ovos, 74%; milho, máximo 14%; mel, máximo
20% e banha, máximo de 1%.
Outro importante parâmetro utilizado para a determinação da qualidade
dos alimentos é a determinação do teor de cinzas ou resíduo mineral fixo. Todos os
alimentos contêm elementos minerais formando parte dos compostos orgânicos ou
inorgânicos.
Resíduo por incineração ou cinzas é o nome dado ao resíduo obtido pela
incineração de um produto a uma temperatura próxima de 550ºC. Nem sempre este
resíduo representa toda a substância inorgânica presente na amostra, pois alguns
sais podem sofrer redução ou volatilização com o aquecimento. Existe ainda a
técnica de cinzas insolúveis em HCl a qual é utilizada com o intuito de verificar a
presença de sílica na amostra.
A determinação do teor de cinzas é muito importante por várias razões, a
presença em produtos como açúcar, amido e gelatina não é desejável, o alto teor
pode estar relacionado à adição de sais como o bicarbonato de sódio. Essa análise
representa o ponto de partida para a análise de minerais específicos para fins
nutricionais ou determinação de segurança do alimento, pois esse tipo de material
pode sugerir a presença de resíduos minerais metálicos provenientes de inseticidas,
fungicidas e outros defensivos ou estanho proveniente da corrosão de latas.
De acordo com alimento a ser analisado utiliza-se diferentes temperaturas
de incineração na mufla. Frutas e derivados, carne e derivados, açúcar e derivados e
vegetais são aquecidos a 525ºC. Cereais, produtos lácteos, peixes , produtos
marinhos, temperos, condimentos e vinhos são aquecidos a 550ºC; e os grãos e as
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rações devem ser incinerados a 600ºC. Atentar-se para evitar perdas durante o
processamento das amostra pois as cinzas são leves e higroscópicas.
As cinzas são constituídas de K, Na, Ca e Mg presentes em grandes
quantidades ou macroelementos; Al, Fe, Cu, Mn e Zn presentes em pequenas
quantidades ou microelementos; I, F e outros minerais que representam os
elementos traço. Esses minerais apresentam-se na forma de óxidos, sulfatos,
fosfatos, silicatos e cloretos. No entanto, a composição das cinzas varia segundo o
tipo de alimento. Desse modo, encontra-se cálcio em produtos lácteos, cereais,
nozes, peixes e vegetais; ferro em grãos, farinhas, cereais, nozes, carne e aves
sódio em frutas, cereais, nozes carne e peixe. Alguns valores médios para cinzas
são: produtos lácteos fluidos possuem, 0,7 a 6% de cinzas; cereais, 0,3 a 3,3%;
peixes, 1,2 a 3,9% e nozes, 1,7 a 3,6%.
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2- FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA SOBRE UMIDADE EM ALIMENTOS

2.1 Teor de Umidade

Dentre os itens mais freqüentemente analisados em alimentos, o teor de

umidade é um importante dado de composição, sendo também um indicador do teor
de sólidos de um produto e da sua perecibilidade. Quando o teor de umidade está
fora dos padrões observam-se prejuízos na estabilidade química, deterioração
microbiológica, alterações fisiológicas e qualidade geral dos alimentos. Sua
determinação é normalmente realizada por métodos gravimétricos, também
conhecidos como dessecação até peso constante; esses métodos são indiretos, e
determinam a umidade através da diferença de massa entre o alimento úmido e o
seco. De acordo com as "NORMAS ANALÍTICAS DO INSTITUTO ADOLFO LUTZ",
o aquecimento direto da amostra a 105 ºC é o processo mais utilizado para a análise
de alimentos de origem animal e vegetal.

2.1.1 Métodos utilizados para a determinação da Umidade

Os métodos utilizados para determinação da umidade em alimentos

classificam-se em diretos e indiretos. Nos métodos diretos a água é retirada do
produto, geralmente por processo de aquecimento, e o teor de umidade é calculado
pela diferença de peso das amostras no início e ao final do processo. Esta diferença
corresponde à quantidade de água retirada (INSTITUTO ADOLFO LUTZ,1985).
Devido à sua maior confiabilidade os métodos diretos são empregados como padrão
para a aferição de outros procedimentos. Enquadra-se nesta categoria os métodos
de estufa, destilação, infra-vermelho e Karl Fisher (PUZZI 1986).

Nos métodos indiretos, o teor de umidade é estimado em função das

propriedades elétricas do produto em uma determinada condição. Os dois princípios
empregados são o da resistência elétrica e o da capacitância. São métodos práticos
e rápidos, mas estão sujeitos a erros decorrentes da variação das propriedades
físicas do produto, da temperatura ou da distribuição da umidade no interior do
alimento. A aferição de equipamentos de determinação indireta de umidade é feita
em relação ao método padrão de estufa (SILVA, 1980). Vejamos algumas técnicas
que podem ser utilizadas para a determinação da umidade.
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2.1.1.1 Estufa de Secagem - Método Clássico

A amostra é seca através do ar quente e determina-se o conteúdo de

umidade pela diferença de massa final e inicial com auxílio de uma balança analítica.
Esse método de secagem é um procedimento de referência com boa
reprodutibilidade. Sua principal vantagem é a quantidade de amostras que podem
ser analisadas ao mesmo tempo e nas mesmas condições. Porém exige grande
trabalho manual devido às repetidas pesagens até estabilização do peso final. O
tempo de medição dura em média 4 horas (GARCIA & MURADIAN, 2002).

2.1.2 Analisador de Umidade por Infravermelho

A secagem da amostra é obtida por radiação de infravermelho direta, onde

a energia absorvida produz calor secando a amostra. As principais vantagens são o
princípio de funcionamento e a curta duração do processo de secagem, com
resultados disponíveis em poucos minutos. O princípio da análise baseia-se na
incidência de raios infravermelhos diretamente sobre a amostra (GARCIA &
MURADIAN, 2002).
Na balança de umidade por radiação infravermelha, existe um termostato
onde se regula a uma temperatura de 85°C por 20 min utos para produtos lácteos e
de 105°C por 30 minutos para os cárneos (GOMES, 199 9). A utilização desse
equipamento possui como vantagem de ser um método rápido em relação ao
tradicional, podendo ser adotado como método de triagem no controle de qualidade
de alimentos sólidos nas indústrias no fluxograma de produção. No entanto, ressalta-
se que as amostras podem sofrer decomposição, como em ocorre em outros
métodos de secagem e junto com a água evaporar outras substâncias (PUZZI, 1985;
GOMES, 1999; GARCIA & MURADIAN, 2002).
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2.1.3 Analisador por Halogênio

É um aperfeiçoamento do método de aquecimento por radiação de

infravermelho, com algumas vantagens. Com a utilização desse método, atinge-se a
temperatura desejada em um tempo menor e a regulagem do aparelho tem maior
precisão. Devido a melhor distribuição do calor, a homogeneidade de secagem da
amostra é garantida, evitando perdas de substâncias durante o processo de
secagem. Ideal para rotinas de análise devido ao curto tempo para a obtenção dos
resultados. No entanto, é necessário verificar o custo benefício para a utilização
dessa metodologia.

2.1.4 Método por destilação

Estes métodos são empregados principalmente para a determinação do

teor de umidade em grãos, o método mais comum é aquecer a amostra em óleo
mineral ou mesmo em óleo comestível até que água evapore da amostra, condense
e seja coletada em um aparato de medição, por exemplo, uma proveta graduada
(GOMES, 1999; GARCIA & MURADIAN, 2002). Também pode ser realizado o
aquecimento da amostra em um solvente imiscível que é destilado junto com a água,
separando as fases em um coletor apropriado. Esses métodos são classificados em
diretos, pois o volume de água é medido diretamente não sendo oriundo da perda de
peso da amostra. As vantagens do uso de solventes imiscíveis são a transferência
efetiva de calor e a atmosfera inerte gerada pela saturação do ambiente interno do
destilador com os solventes utilizados, o que impede a oxidação da amostra. No
entanto a precisão pode ser baixa. De modo geral pode ser aplicado a produtos
como leite em pó, carnes, frutas secas, doces e farinhas. (GOMES, 1999).

2.1.5 Determinação da umidade com o uso de ácido clorídrico

Este método se aplica em queijos, manteiga, margarina e produtos afins,

baseia-se também na perda de peso do produto submetido ao aquecimento.
Os materiais utilizados são:
Areia tratada e previamente tarada – secar a areia em estufa e calcinar em
forno mufla a 500°C. Esfriar. Tratar com ácido clor ídrico a 25%. Lavar com água
destilada até ausência de reação ácida. Secar em estufa a 105°C e guardar em
frascos fechados.
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Balança analítica
Bastão de vidro
Cápsula de fundo chato (de porcelana)
Dessecador
Estufa a 85°C.
O procedimento recomendado é o seguinte:
Secar uma cápsula de porcelana com cerca de 10g de areia tratada em
estufa a 105°C por 1h, esfriar em dessecador e tara r.
Pesar cerca de 5g de amostras, espalhando bem no fundo da cápsula com
auxílio de bastão de vidro.
Levar a todo o conjunto à estufa a 85°C por 2h.
Esfriar em dessecador e pesar.
Repetir as operações a cada 30min até o peso constante.
Obs: no caso de queijos moles, para facilitar a homogeneização com a areia, usa-se
uma mistura de acetona e éter etílico (1:1). Evaporar os solventes em banho-maria e
depois levar à estufa.

2.1.6 Determinação da umidade em carnes cruas, enlatados, pastas, alimentos

processados em geral, alimentos líquidos

Este método baseia-se na perda de peso do produto submetido ao

aquecimento.
Os materiais utilizados são:
• Areia tratada e previamente tarada – secar a areia em estufa e calcinar em
forno mufla a 500°C. Esfriar. Tratar com ácido clor ídrico a 25%. Lavar com
água destilada até ausência de reação ácida. Secar em estufa a 105°C e
guardar em frascos fechados.
• Balança analítica
• Bastão de vidro
• Cápsula de fundo chato (de porcelana)
• Dessecador
• Vidraria comum de laboratório
• Banho-maria
O procedimento recomendado é o seguinte:
• Secar uma cápsula de porcelana com cerca de 10g de areia tratada em
estufa a 105°C por 1h, esfriar em dessecador e pesa r
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• Pesar cerca de 10g de amostras, homogeneizar bem com a areia com
auxílio de bastão de vidro.
• Levar a cápsula com a amostra ao banho-maria, até evaporação completa
da parte líquida
• Secar em estufa (105°C por 3h)
• Resfriar em dessecador e pesar
• Repetir as operações de aquecimento e pesagem até peso constante.

2.1.7 Umidade e matéria volátil

Aplica-se em óleos e gorduras vegetais. Este método baseia-se na

determinação da perda de peso do alimento após este ter sido submetido a
aquecimento e evaporação de voláteis, inclusive água.

3 - Procedimento Geral de análise de umidade

Pesar massa adequada (2 a 5 g) num cadinho seco e tarado

Estufa com circulação

Estufa Simples Estufa a Vácuo 70ºC
de ar 90-150ºC
105ºC (mínimo de 3 h)
(por várias horas)
(mínimo de 5 h)

Resfriar em dessecador com secante

Reaquecer, resfriar e pesar

Pesar em balança analítica

Repetir até peso constante (±0.00005g)

3.1.2 Material

3.1.2.1. Equipamentos:

Balança analítica;
Placa aquecedora;
Estufa.
3. 1.2.2. Vidraria, utensílios e outros:
Bastão de vidro;
Béquer de 100mL;
Dessecador;
Espátula;
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Pesa filtro ou cápsula de alumínio, aço inox, porcelana ou níquel;
Tenaz metálico.
3. 1.3. Procedimento:

Colocar a cápsula (cadinho), em estufa a 102 ± 2ºC durante 1 hora. Esfriar

em dessecador e pesar. Para a manipulação do cadinho, utilizar garras ou pinças, a
fim de se evitar a absorção de umidade ou outras substâncias. Anotar o peso do
cadinho. Atenção: sempre tarar a balança antes e após a pesagem do cadinho.
Pesar a amostra com a ajuda de espátulas (amostras sólidas) ou pipetas (amostras
liquidas) as quais devem está devidamente homogeneizadas.
Após a pesagem anotar o peso final e levar à estufa a 102 ± 2°C durante
3h. Decorrido o tempo, retirar o material da estufa deixa-lo esfriar em dessecador e
prosseguir a pesagem, a qual deve ser realizada até o momento em que a massa
estiver constante. As operações de pesagem devem ser realizada o mais rápido
possível e a secagem deve ser conduzida sem que haja escurecimento da amostra.
Atenção: utilizar garras ou pinças para manipular os cadinhos, durante todo o
processo de análise.
Exemplo.
Amostra de Queijo.
Massa da amostra: 5g:
Temperatura da estufa: 102 ± 2ºC;
Tempo até a primeira pesagem: 3 horas;
Tempo, na estufa, entre pesagens até massa constante: 1 hora.
Após a realização das pesagens, realizar os cálculos para se determinar a
umidade da amostra
Cálculos:
Pi − Pf
Umidade%= x 100
Pi

Observações: A técnica descrita acima pode ser utilizada para amostras de

alimentos de origem animal e vegetal. Em caso de leite ou outros alimentos que a
gordura precipita-se na superfície, tomar o cuidado de não encher o cadinho até a
borda superior, a fim de se evitar a perda de amostra o que influenciará na obtenção
do resultado.
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3.1.4 Umidade determinada por meio do Refratômetro

Alguns alimentos exigem cuidados especiais, como é o caso do Mel. Para

este alimento deverá ser utilizado o refratômetro.

3.1.4.1 Procedimento

Homogeneizar a amostra de mel, em seguida colocar uma alíquota do

produto em um Becker, fazer aferição da temperatura do produto, retirar uma gota
do mel para análise, a qual será depositada no refratômetro. Observar qual será a
escala adequada para o procedimento da leitura, em geral para esse tipo de produto
é igual a “3”, proceder à leitura e os cálculos para obtenção dos resultados.
Obs: deve ser observada a temperatura da amostra, se estiver superior ou
inferior a 20ºC deve ser realizada a correção à temperatura do refratômetro.
Após estes procedimentos, fazer a correção considerando a temperatura
da amostra e do refratômetro e consultar o resultado na Tabela de Chataway

Ex. Análise de mel

Resultado da leitura: 82,2 Resultado final: 82+0,4+0,8= 83,2
Tabela= 16,6%Umidade
Temperatura da amostra: 25°C= 0,4
Temperatura do equipamento= 0,8
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TEOR DE CINZAS OU RESÍDUO MINERAL FIXO (RMF)

Os procedimentos de pesagem são os mesmos realizados para

determinação da Umidade. Após a pesagem da amostra (5 a 10g), levar o cadinho
para a placa aquecedora a fim de se proceder a carbonização da amostra, (pode ser
conveniente secar inicialmente em fluxo de vapor), pois em temperaturas elevadas
ocorre a perda de sólidos, principalmente gordura. Após esse procedimento, levar a
amostra para a Mufla a 550 – 600ºC até obtenção de cinzas brancas (3 horas no
mínimo). Esfriar sobre a bancada até temperatura ambiente. Proceder os cálculos
para a determinação do percentual de cinzas.
Cálculos:
Pi − Pf
% Cinzas= x 100
Pi

1 EXEMPLIFICAÇÃO DO CÁLCULO DE ALGUNS RESULTADOS.

Na Tabela I estão apresentados alguns exemplos da determinação do teor

de umidade em alguns alimentos.

TABELA 1 – Resultados da determinação do teor de umidade de amostras de

alimentos

Exemplo para discussão dos resultados:

Considerando os resultados obtidos das amostras de farinha de milho,

leite, queijo e mel, conclui-se que os valores apresentam-se em acordo com a
legislação vigente. Os valores preconizados pela legislação vigente são 12% de
umidade para a farinha de milho, 87% para o leite, 60% pro queijo e máximo de 20%
para o mel (RISPOA, 1997). Quanto à análise da Banha o RISPOA (1997)
estabelece nos Artigos 309 e 310 o teor de umidade máxima de 1% para o produto,
estando portanto de acordo com a legislação vigente.

Quanto à análise da carne mecanicamente separada (CMS) não há

legislação que contempla o quesito, no entanto o resultado médio obtido do teor de
umidade foi de 63,85%. Os resultados da análise de cinzas estão apresentados na
Tabela 2.
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TABELA 2 – Resultados referentes à análise de cinzas

Minerais

Produto % cinzas Cinzas P. cadinho P. amostra Peso Total P 500ºC P.F 500
Milho 1 4,2 -2464,167541 49,30060 2,0007 51,3013 -49,3006
Milho 2 4,1 -2344,594059 47,36080 2,02 49,3808 -47,3608
CMS 1 1,31 1,313555 48,06300 5,1235 53,1865 48,1303 0,0673
CMS 2 1,09 1,092844 45,14580 5,2615 50,4073 45,2033 0,0575
Mel -0,01 -0,016758 72,01540 10,7414 82,7568 72,0136 -0,0018
Leite 1 0,8 0,801114 48,19220 10,1234 58,3156 48,2733 0,0811
Leite 2 0,74 0,741135 56,97600 10,322 67,298 57,0525 0,0765

Considerando os resultados obtidos, para aqueles alimentos que possuem

legislação específica, ou seja, mel (máximo 0,6%); farinha de milho (máximo 8%) e
leite (0,7%), todos os produtos apresentaram-se dentro dos padrões estabelecidos
(SIPA, 1985; RISPOA, 1997). Para amostra de CMS não há regulamento específico.

2. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. ANFAR. Associação Nacional dos Fabricantes de Rações. Métodos Analíticos

de Controle de Alimentos para Uso Animal. Ministério da Agricultura e Reforma
Agrária. São Paulo. 1992.

2. BEHMER, M. L. A. Como aproveitar bem o leite no sítio ou chácara. 7. ed.

São Paulo: Nobel, 1986.

3. BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária.

Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus
ingredientes: métodos físicos e químicos. Brasília, DF, 1981. v. II, cap. 15, p. 1.

4. CASADA, M.E.; WALTON, L.R.; SWETNAM, L.D. e CASADA, J.H.. Moisture

content as a function of temperature rise under microwave radiation.
Transactions of the ASAE. ASAE, St. Joseph, MI, 907-911, 1983.

5. GOMES, J. C. Análise de alimentos. Viçosa: Universidade federal de Viçosa,

1999.

6. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz:

métodos físicos e químicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo, 1985.
533 p

7. MAPA. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Portaria n° 08,

1998.

8. MAPA. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Regulamentos

Técnicos de Identidade e Qualidade dos Produtos Lácteos. 1997.
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9. RIISPOA. Ministério da Agricultura. Serviço de Inspeção Federal. Regulamento
da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal. 1997.

10. SILVA, J.S. & CARVALHO, G.R. Amostragem e determinação de umidade de

grãos. Viçosa, Centreinar, 1980. 26 p

11. SIPA. Ministério da Agricultura. Secretaria de Inspeção de Produto Animal.

Portaria n° 06, 1985.
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DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES

1. INTRODUÇÃO

Glicídeos são os compostos mais abundantes e amplamente distribuídos

entre os alimentos. Formados por hidratos de carbono, incluem os monossacarídeos
(glicose), dissacarídeos (sacarose e lactose) e polissacarídeos (amido, dextrina e
celulose). Estes compostos são uma das principais fontes de energia da dieta
humana e são essenciais ao homem (LIMA, 2003).
A glicose é o açúcar mais amplamente distribuído na natureza, apesar de
ser raramente consumido em sua forma monossacarídica. Na forma de polímero,
está presente como amido e celulose e é encontrada em todos os dissacarídios
comestíveis. A glicose, como um monômero e ligada à frutose como o dissacarídeo
sacarose, constitui uma grande fração do conteúdo sólido total de frutas e vegetais
(MAHAN & ESCOTT-STUMP, 2002).
A lactose é o açúcar do leite que se transforma em glicose e galactose na
digestão. O açúcar do leite é produzido quase exclusivamente nas glândulas
mamárias da maioria dos animais lactantes. O leite é a única fonte de lactose, sendo
que o leite de vaca contém 4,5% e o leite materno 7,5%. Esta quantidade não é
suficiente para adoçar o leite, pois a lactose possui poder adoçante inferior a
sacarose (LIMA, 2003).
A sacarose é formada pela glicose e frutose unidas por seus carbonos
ativos. A sacarose da dieta pode ser hidrolisada em monômeros de glicose e frutose
em ácido diluído ou na presença da enzima invertase. Quando a sacarose é utilizada
na preparação de alimentos ácidos, por exemplo, para adoçar bebidas de frutas, ela
se torna invertida dentro de algumas horas. Observe que o mel também é açúcar
invertido (MAHAN & ESCOTT-STUMP, 2002).
O açúcar invertido é utilizado comercialmente porque é mais doce que as
concentrações iguais de sacarose. Glicose e frutose também produzem cristais
menores que a sacarose, mas o açúcar invertido é preferido com relação à sacarose
no preparo de confeitos delicados e glacês.
Os carboidratos podem ser classificados como glicídeos redutores e não
redutores. Os redutores, que são os mais comuns, podem sofrer oxidação devido à
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presença em sua molécula de grupos aldeídos ou cetonas livres ou potencialmente
livres(SOUZA et al., 2001).
Como os demais aldeídos, as aldoses são facilmente oxidadas aos ácidos
monocarboxílicos correspondentes, os chamados ácidos aldônicos. As al- doses
reagem com o reagente de Tollens (Ag+ em NH3 aquoso) levando à formação de
prata metálica que aparece como uma superfície espelhada brilhante nas paredes
de vidro do recipiente onde a reação se processa. Reagem também com os
reagentes de Fehling (Cu²+ em tartarato de sódio aquoso) e com o reagente de
Benedict (Cu²+ em citrato de sódio aquoso). Nos dois últimos casos, os íons Cu²+ ,
responsáveis pela cor azul das soluções, são reduzidos a Cu+ formando um
precipitado vermelho tijolo de Cu2O. As três reações servem como teste químico
simples para identificar os chamados açúcares redutores (SOUZA et al., 2001).
O teor de glicídeos presentes nos alimentos pode ser determinado pelo
valor resultante (100%) menos a soma de umidade, gorduras, proteínas e fibras,
sendo denominado de glicídeos por diferença. No entanto, na nossa aula prática,
determinou-se o teor de açúcares em alimentos utilizando o método de Lane-Eynon,
no qual baseia-se na redução de um volume conhecido do reagente de cobre
alcalino (Fehling) a óxido cuproso (como descrito anteriormente). O ponto final é
indicado pelo azul de metileno, que é reduzido a sua forma leuco por um pequeno
excesso de açúcar redutor (LIMA, 2003).
Mas existem outros métodos para identificação dos carboidratos, se
dividindo em métodos qualitativos e quantitativos. Os métodos qualitativos se
baseiam em reações coloridas provenientes da condensação de produtos de
degradação dos açúcares em ácidos fortes com vários compostos orgânicos, e
também nas propriedades redutoras do grupo carbonila.
E os métodos quantitativos utilizados incluem:
- Método gravimétrico baseado na redução de cobre pelos grupos redutores dos
açúcares – Munson-Walker.
- Método titrimétrico também baseado na redução de cobre pelos grupos redutores
dos açúcares – Lane-Eynon.
- Método microtitrimétrico baseado também na redução de cobre – Somogyi.
- Métodos cromatográficos.
- Métodos óticos.
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2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Açúcares

Os açúcares são os carboidratos mais importantes e abundantes

distribuídos na natureza, apresentam como fórmula geral: Cx(H2O)y, daí o nome
“carboidrato”, ou “hidratos de carbono” e são moléculas que desempenham uma
ampla variedade de funções, entre elas, a fonte de energia; reserva de energia;
estrutural; matéria-prima para a biossíntese de outras biomoléculas (LEHNINGER,
1995).
Na biosfera, há provavelmente mais carboidratos do que todas as outras
matérias orgânicas juntas, graças à grande abundância, no reino vegetal, de dois
polímeros da D-glucose, o amido e a celulose.

O carboidrato é a única fonte de energia aceita pelo cérebro, importante para

o funcionamento do coração e todo sistema nervoso. O organismo armazena
carboidratos em três lugares: fígado (300 a 400g), músculo (glicogênio) e sangue
(glicose).

Os glicídios, carboidratos ou sacarídeos são compostos aldeídicos ou

cetônicos com múltiplas hidroxilas. Constitui a maior parte da matéria orgânica na
terra, devido a suas múltiplas funções em todas as formas de vida.

Os termos glicídios e sacarídeos, vem do grego glýcis e do latim scacharum,

que significam doce. A afirmativa de que os carboidratos são “doces” é imprecisa,
pois nem todos são doces e há substâncias doces não glicídicas (STRYER ,1996).

2.1.1 Monossacarídeos

Os carboidratos são classificados como açúcares simples, denominados

monossacarídeos. Numa base molecular, os carboidratos sofrem hidrólise para
fornecer duas moléculas de monossacarídeos, são os dissacarídeos e os que dão
origem a três moléculas de monossacarídeos são os trissacarídeos e assim por
diante (JOSLYN, 1970).
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As moléculas mais simples, monossacarídeos, compostas de cinco a oito
carbonos, dão um sabor adocicado. São chamados oligossacarídeos (do grego
oligos, pouco) aquelas moléculas que apresentam de duas a dez unidades de
monossacarídeos ligadas entre si. O termo polissacarídeo é aplicado às moléculas
poliméricas que contém até alguns milhares de unidades de monossacarídeos
(FISHER, 1971).
Os monossacarídeos podem ser ainda subdivididos. Caso tenha um grupo
aldeído são chamados de aldoses; se um grupo cetona, denominado de cetoses. De
acordo com o número de átomos de carbono, os monossacarídeos são
denominados de triose, tetrose, pentose, hexose e etc. As pentoses e hexoses são
as mais encontradas na natureza (MAHAN 2000).

Existem várias maneiras de representar as estruturas desses compostos. Os

açúcares de cinco carbonos, D - ribose e D-2- desoxirribose, que encontramos nos
ácidos nucléicos, aparecem na forma de anéis de cinco membros.

Quimicamente são polihidroxialdeídos (aldoses) ou polihidroxicetonas

(cetoses), sendo os mais simples monossacarídeos compostos com no mínimo três
carbonos: o gliceraldeído, a dihidroxicetona e as trioses. Dentre as pentoses mais
importantes temos: ribose, arabinose, xilose. As hexoses mais importantes são:
glicose, galactose, manose, frutose. Glicose é abundante nas uvas e no mel e em
menor quantidade nas frutas em geral. Frutose ocorre nas frutas e no mel. Galactose
raramente ocorre no estado livre.

2.1.2 Dissacarídeos

Os dissacarídeos são açúcares mais complexos. São constituídos pela

união de dois monossacarídeos, por exemplo: sacarose (glicose + frutose) = açúcar
da cana e lactose (glicose + galactose) = açúcar do leite, sendo este o único
alimento natural que contém lactose (FISHER, 1971).
São também carboidratos ditos glicosídeos, pois são formados a partir da
ligação de dois monossacarídeos através de ligações especiais denominadas
“Ligações glicosídicas”. A ligação glicosídica ocorre entre o carbono anomérico de
um monossacarídeo e qualquer outro carbono do monossacarídeo seguinte, através
de suas hidroxilas e com a saída de uma molécula de água.
 19
Os glicosídeos podem ser formados também pela ligação de um
carboidrato a uma estrutura não carboidrato, como uma proteína, por exemplo.
As enzimas do corpo humano, mesmo podendo quebrar uma ligação α-
glicosídica, não conseguem quebrar a ligação β-glicosídica da celulose, por isso os
seres humanos não são capazes de digerir fibras vegetais constituídas de celulose.
Alguns microorganismos encontrados no sistema digestivo de animais herbívoros
possuem as enzimas necessárias para decompor a celulose em glicose sendo
assim, esses animais são capazes de metabolizar fibras vegetais (LEHNIGER ,
1995).
A molécula de amido é constituída por unidades de glicose, unidas por
uma ligação α-glicosídica entre os carbonos um e quatro de anéis sucessivos. A
hidrólise da ligação α-glicosídica é catalisada por enzimas secretadas pelas
glândulas salivares e pancreáticas humanas, conseqüentemente, o amido pode ser
utilizado como fonte energética pelos seres humanos.
Amidos de plantas diferentes divergem em estruturas, e amidos de uma
mesma planta podem ser diferentes. Uma forma de amido, a amilose, é composta de
250-300 unidades de glicose em ligações α-glicosídicas, entre o carbono um e o
carbono quatro da unidade seguinte, esses tipos de cadeias tendem a assumir
conformações helicoidais, como ocorre com a amilose (ALLINGER, 2000).
A amilo-pectina é mais complicada e contém, aproximadamente, 1.000
unidades de glicose em uma estrutura ramificada, que ocorrem nas ligações 1-6
(ALLINGER, 2000). A molécula de amilo-pectina tem ramificações a cada 25
unidades de glicose.
O polímero linear amilose possui considerável solubilidade em água
quente, o que não acontece com a amilo-pectina. Ambas as formas representam o
armazenamento de energia nos vegetais que podem ser utilizados diretamente pelos
humanos.
O glicogênio é o equivalente no tecido animal, da amilo-pectina dos
vegetais. O glicogênio é um polímero de glicose com ligações 1-4-α glicosídica com
considerável ramificação da cadeia nas ligações 1-6. A massa molecular do
glicogênio varia de 2x105 a 108g/mol. Embora todo tecido animal contenha
glicogênio, o fígado é o principal sítio de armazenamento (ALLINGER, 2000).
 20
2.1.3 Polissacarídeos

São carboidratos complexos formados por macromoléculas de milhares de

unidades monossacarídicas ligadas entre si por ligações glicosídicas, unidas em
longas cadeias lineares ou ramificadas. Os polissacarídeos possuem duas funções
biológicas principais, como forma armazenadora de combustível e como elementos
estruturais.
Os três polissacarídeos mais importantes são o amido, a celulose e o
glicogênio. O amido é um alimento produzido nas plantas, a celulose é matéria-prima
estrutural dos vegetais e o glicogênio é a forma em que a glicose é armazenada nas
células animais. Todas estas substancias são polímeros da glicose, que diferem
quanto à massa molecular, natureza da ligação entre as moléculas de glicose e
quanto a presença de ramificação no polímero.
O amido é utilizado principalmente na preparação de glicose e artigos de
confeitaria. O processo industrial para obtenção da glicose, consiste no aquecimento
durante algumas horas do amido com H2SO4 diluído. Quando a termina a hidrólise, o
ácido é neutralizado com óxido de cálcio, formando-se então um precipitado de
sulfato de cálcio que é filtrado e a solução é evaporada. A glicose é obtida como
uma massa cristalina, após o resfriamento (ALLINGER, 2000).
A celulose é um polímero de cadeia longa, as propriedades físicas deste
material resultam do peso molecular muito alto (cerca de 3.000 unidades de glicose)
e do fato que não há ramificações (ALLINGER, 2000).O algodão contém
aproximadamente 90% celulose, e a madeira é constituída de 50% celulose.

2.2 Açúcares redutores

Os hidratos de carbono que reduzem o reagente de Fehling, Benedict ou

Tollens são conhecidos por açucares redutores. As aldoses são açúcares redutores
porque contém o grupo aldeído, porém algumas cetoses também se comportam
como redutoras. A frutose, por exemplo, reduz os reagentes de Tollens, Benedict e
Fehling, embora apresente carbonila cetônica e não aldeídica. Isso ocorre porque,
em solução alcalina, a frutose estabelece um equilíbrio tautomérico com outras
formas. A maioria dos dissacarídeos também são açúcares redutores sendo a
sacarose uma exceção (MORRISON, 1990).
 21
Os carboidratos podem ser classificados como glicídeos redutores e não
redutores. Os redutores, que são os mais comuns, podem sofrer oxidação devido a
presença em sua molécula de grupos aldeídos ou cetonas livres ou potencialmente
livres (na forma de semi-acetal). As propriedades redutoras desses glicídeos podem
ser comprovadas in vitro por sua capacidade de reduzir íons metálicos,
especialmente cobre ou prata, em sua solução alcalina.
Como os demais aldeídos, as aldoses são facilmente oxidadas aos ácidos
monocarboxílicos correspondentes, os chamados ácidos aldônicos. As aldoses
reagem com reagente de Tollens (Ag+ em NH3 aquoso) levando a formação de prata
metálica que aparece como uma superfície espelhada brilhante nas paredes de vidro
do recipiente onde a reação se processa. Reagem também com os reagentes de
Fehling (Cu2+ em tartarato de sódio aquoso) e com reagente de Benedict (Cu2+ em
citrato de sódio aquoso). Nos dois últimos casos, os íons Cu2+, responsáveis pela
cor azul das soluções, são reduzidas a Cu+ formando um precipitado vermelho tijolo
de Cu2O. As três reações servem como teste químico simples para identificar os
chamados açúcares redutores (MORRISON, 1990).
Como soluções dos tartaratos cúpricos, ou dos citratos cúpricos, são
azuis, o aparecimento de precipitado vermelho é indicado nitidamente em seguida
de um ensaio positivo.
Os açúcares que resultam em teste positivo com as soluções de Tollens e
de Benedict, são conhecidos como açúcares redutores, e todos os carboidratos que
contem grupo hemi-acetal resultam em testes positivos. Em solução aquosa estes
hemiacetais estão em equilíbrio com concentrações relativamente pequenas, porem
não insignificantes, de aldeídos ou de alfa-hidroxicetonas acíclicos. São estas
formas que sofrem a oxidação e, deslocando o equilíbrio, provocam a formação de
mais aldeído, ou alfa-hidroxicetona, que sofrem oxidação até o esgotamento de um
dos reagentes (ALLINGER, 2000).
Os carboidratos que só têm grupos acetal, não resultam em testes
positivos com a solução de Benedict ou de Tollens, sendo chamados de açúcares
não redutores. Estes acetais não estão em equilíbrio com aldeídos, ou com alfa-
hidroxicetona, no meio aquoso alcalino do reagente de ensaio (SOLOMONS, 1996).

2.3 Métodos de análises

 22
Os monossacarídeos, glicose e frutose, são açúcares redutores por
possuírem grupo carbonílico e cetônico livres, capazes de se oxidarem na
presença de agentes oxidantes em soluções alcalinas. Os dissacarídeos que não
possuem essa característica sem sofrerem hidrólise da ligação glicosídica são
denominados de açúcares não redutores. A análise desses açúcares é uma
atividade rotineira nos laboratórios das indústrias alimentícias, nas quais pode-se
observar uma certa carência, no que se refere a técnicas padronizadas para
análises (SILVA, 2003).

Diversos reativos são utilizados para demonstrar a presença de grupos

redutores, em açúcares (VILLELA, 1973). De fato, os monossacarídeos podem ser
oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves, tais como, os íons férricos (Fe
3+
) e cúprico (Cu 2+).
Para se estimar o teor de açúcares redutores e açúcares redutores totais
em alimentos, existem vários métodos químicos não seletivos que fornecem
resultados, com elevado grau de confiabilidade, quando utilizados corretamente
após eliminação de interferentes (BORGES, 1987).
Outros métodos mais seletivos vêm sendo estudados e aplicados em
menor escala como a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), que identifica
uma maior variedade de carboidratos na amostra, por ser mais sensível, além de
possuir um tempo de análise pequeno (CANO, 1998) e as determinações
enzimáticas que sendo muito específicas, não vão sofrer ação de possíveis
interferentes com grupos redutores livres (FROST, 1984).
Os métodos químicos clássicos conhecidos para a análise de açúcares
redutores são na sua maioria fundamentados na redução de íons cobre em soluções
alcalinas (solução de Fehling), mas também existem aqueles fundamentados na
desidratação dos açúcares, por uso de ácidos concentrados, com posterior
coloração com compostos orgânicos, além da simples redução de compostos
orgânicos, formando outros compostos de coloração mensurável na região do visível
(MILLER, 1959).
Os métodos podem ser agrupados tanto em titulométricos como por
exemplo o de Lane-Eynon, EDTA e Luff-Schoorl (MATISSEK, 1998); gravimétricos
como o Musson-Walker (SPENCER, 1945) e espectrofotométricos como o ADNS,
Antrona, Fenol-Sulfúrico, Somogyi-Nelson (VILLELA, 1973).

2.3.1 Método Lane-Eynon

 23

O principio do método de Lane-Eynon, baseia-se na redução de um volume

conhecido do reagente de cobre alcalino (Fehling) a óxido cuproso. O ponto final é
indicado pelo azul de metileno, que é reduzido a sua forma leuco, por um pequeno
excesso de açúcar redutor. No método o cobre do reativo de Fehling (solução
alcalina de sulfato de cobre em tampão de tartarato duplo de sódio e potássio) é
reduzido a óxido cuproso (FISHER, 1971; LEHNINGER, 1995).

Este método é válido para os produtos ou subprodutos de origem vegetal,

rações, concentrados e produtos lácteos.
A solução de Fehling é padronizada primeiramente utilizando-se uma solução
de glicose a 1%. A partir disso, calcula-se o fator de conversão para ser usado como
parâmetro nas análises das amostras.

2.3.2 Método do ácido 3-5-dinitrossalicílico

A química da reação do ADNS com açúcares redutores está elucidada em

parte. O ADNS é reduzido para ácido 3-amino-5-nitrossalicílico, enquanto que, no
caso mais simples o grupamento aldeído parece ser oxidado a ácido aldônico.
Entretanto a equivalência entre o ácido aminonitrossalicílico produzido e a
quantidade do açúcar não é exata e diferentes açúcares produzem diferente
intensidade na cor desenvolvida. Isso sugere que a química da reação deva ser
mais complexa que a apresentada, podendo estar relacionada com as reações de
decomposição de açúcares em solução alcalina (MILLER, 1959).

2.3.3 Método de antrona

A reação de antrona se baseia na ação hidrolítica e desidratante do ácido

sulfúrico concentrado sobre os carboidratos. Quando a reação é levada a efeito com
carboidratos com ligações glicosídicas, estas são hidrolisadas e os açúcares simples
desidratados para furfural ou hidroximetilfurfural. Essas substâncias se condensam
com a antrona (9,10-dihidro-9-oxoantraceno) dando um produto de coloração azul
petróleo (VILLELA, 1973).

Material:

Equipamentos: Balança analítica; Banho-maria; Centrífuga;

Espectrofotômetro; Estufa; Placa aquecedora; Processador de alimentos.
 24
Vidraria, utensílios e outros: Balão volumétrico de 500mL; Cubeta de vidro
de 1cm de largura; Funil; Pipetas volumétricas de 2 e 10mL; Tubo de centrífuga de
25mL; Tubo de ensaio.
Reagentes: Solução de álcool etílico (C2H5OH) a 80% (v/v); Solução de
ácido sulfúrico (H2SO4) 0,5 N; Solução de antrona (C14H10O): Dissolver 0,1 g de
antrona p.a. em 100mL de solução fria de ácido sulfúrico (H2SO4) que contenha
76mL do ácido p.a. A solução é estável a 4ºC por vários dias, devendo ser
descartada quando se tornar verde.
Obs: Uma vez que a antrona reage com celulose e outros contaminantes,
é essencial lavar com álcool etílico todos os frascos de vidro que serão postos em
contato com ela;
Solução de D-glicose (C6H12O6) a 0,01%:
Esta solução é preparada diariamente por diluição da solução estoque a
1% (p/v) de D-glicose p.a. (a solução estoque pode ser preparada em uma solução
de benzoato de sódio (C6H5COONa) a 0,1% (p/v) ou ser mantida gelada).
Procedimento:
Pesar com exatidão cerca de 0,5g de amostra, perfeitamente
homogeneizada, diretamente para tubo de centrífuga e lavar com três porções
sucessivas de 5mL de éter etílico seguidas de duas porções sucessivas de 5mL de
solução a 80% (v/v) de álcool etílico à quente. Após a adição de cada alíquota de
solvente, agitar bem o tubo e centrifugar por 5 minutos a 1500 rpm. Após as
lavagens, secar o resíduo em estufa a 105ºC por 1 hora. Adicionar 10mL da solução
de ácido sulfúrico 0,5 N e colocar o tubo em banho-maria tendo o cuidado de manter
o nível da solução contida no tubo abaixo do nível do banho. Aquecer durante 1 hora
mantendo o nível da água do banho na posição original, agitando o conteúdo do
tubo ocasionalmente. Decorrido o tempo estabelecido, transferir quantitativamente o
conteúdo do tubo para balão volumétrico de 500mL e completar o volume com água.
Homogeneizar e decantar. Pipetar 2mL desta solução para um tubo de ensaio
previamente lavado com álcool etílico (a presença de sujeira ou poeira no tubo pode
produzir resultados errôneos). Adicionar 10mL da solução de antrona. Levar para
banho-maria por 10 minutos. Retirar do banho e deixar esfriar. Ler a cor
desenvolvida em espectrofotômetro a 620 nm.

2.3.4 Refratometria na escala Brix

 25
Constitui em um método físico para medir a quantidade de sólidos solúveis
presentes em uma amostra. Baseia-se em um sistema de graduação de aparelhos
especialmente para ser utilizado na indústria açucareira, mais precisamente na
análise de açúcares em geral que estejam em solução (SPENCER, 1945).

2.3.5 Cromatografia em camada delgada

A cromatografia em camada delgada (CCD) consiste na separação dos

componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada
delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana (MATISSEK, 1998).

2.3.6 Método fenol-sulfúrico

Baseia-se na determinação de açúcares simples, polissacarídeos e seus

derivados incluindo os metil-ésteres com grupos redutores livres, após a
desidratação dos mesmos pelo ácido sulfúrico e subseqüente complexação dos
produtos formados com o fenol. A mudança da cor da solução é medida na região
do visível e é proporcional à quantidade de açúcares presentes na amostra. A
reação é sensível e de cor estável (DUBOIS, 1956).

2.3.7 Método complexométrico de EDTA

Os açúcares presentes na amostra reagem com uma solução de cobre,

antes e depois da inversão. Os íons Cu2+ se reduzem a Cu +, que precipitará como
Cu2O. O excesso de cobre que não reagiu é determinado, posteriormente por
complexometria com EDTA (MATISSEK, 1998). Para as análises das amostras
primeiramente preparou-se uma solução alcalina de cobre (solução de Fehling) e
uma solução padrão de EDTA 0,01N, além de uma solução indicadora de murexida.
Para as determinações dos açúcares utilizar um fator de conversão calculado
titulando-se uma solução padrão de glicose a 0,1%.

2.3.8 Método de Luff-Schoorl

2+
O açúcar redutor se oxidará e os íons Cu se reduz a Cu +, que
precipitará como Cu2O. O excesso de íons Cu2+ se determina iodometricamente
(VILLELA, 1973). A determinação de açúcares é feita a partir de um fator de
conversão titulando-se uma solução de tiossulfato de sódio 0,1mol/L com uma
solução padrão de glicose 1%.
 26
2.3.9 Método Munson-Walker

Fundamenta-se na quantificação do precipitado de óxido cuproso formado

após a redução de íons cobre bivalentes, em meio básico, pelos açúcares redutores
(glicose e frutose) (SPENCER, 1945). A determinação das porcentagens de
açúcares é feita utilizando uma tabela de conversão.

2.3.10 Método de Somogyi-Nelson

Os glicídeos redutores aquecidos em meio alcalino, transformam-se em

enodióis que reduzem o íon cúprico presente a cuproso. O óxido cuproso assim
formado reduz a reação arsênio-molibídico a óxido de molibdênio de coloração azul
cuja intensidade de cor é proporcional a quantidade de açúcares redutores
existentes na amostra (SOMOGY, 1945). O teor de açúcares redutores é calculado
por espectrofotometria.

3. MATERIAIS E MÉTODOS UTILIZADOS

3.1 PRINCÍPIO

Os glicídios redutores em glicose são solubilizados em água e

separados por filtração. A sacarose é hidrolisada com ácido clorídrico, produzindo
duas moléculas de glicídios redutores. Após neutralização e filtração, todos os
glicídios redutores são determinados pelo método Lane-Eynon, onde os íons
cúpricos da solução de Fehling são reduzidos quantitativamente, sob ebulição, a
óxido cuproso por titulação com solução de açúcar redutor. O ponto final é
alcançado quando um pequeno excesso do açúcar redutor descolora o azul de
metileno (BRASIL, 1981).

3.2. MATERIAL

3.2.1. EQUIPAMENTOS

Balança analítica;
Banho-maria;
Placa aquecedora.

3.2.2. VIDRARIA, UTENSÍLIOS E OUTROS

 27

Balões volumétricos de 250 mL;

Béquer de 250 mL;
Bastão de vidro;
Bico de Bunsen;
Bureta de 25 mL;
Erlenmeyer de 250 mL;
Funil;
Papel de filtro qualitativo;
Pinça de metal;
Pipetas graduadas de 1 e 2 mL;
Pipetas volumétricas de 5 e 10 mL;
Proveta de 50 mL.

3.2.2 REAGENTES (MERCK, 2003)

Solução de azul de metileno (C16H18ClN3.3H2O) a 1 % (m/v);

Solução de ferrocianeto de potássio trihidratado (K4[Fe(CN)6].3H2O) a 15 % (m/v);
Solução de sulfato de zinco heptahidratado (ZnSO4.7H2O) ou acetato de zinco
dihidratado ((CH3COO)2Zn.2H2O) a 30 % (m/v).

Solução de Fehling A:

Dissolver 34,639 g de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O) p.a. em água.

Diluir a 1000 mL em balão volumétrico.

Solução de Fehling B:

Dissolver 173 g de tartarato duplo de sódio e potássio tetrahidratado

(C4H4NaO6.4H2O) p.a. (sal de Rochelle) e 125 g de hidróxido de sódio (NaOH) p.a.
em água. Diluir a 1000 mL em balão volumétrico;
 28
Solução Padrão de Glicose (C6H12O6):

Pesar exatamente cerca de 0,5 g de glicose p.a., previamente seca em estufa

a 70 ºC durante 1 hora. Transferir para balão volumétrico de 100 mL com auxílio de
água, dissolver e completar o volume. A solução padrão de glicose para titular a
solução de Fehling deve ser recentemente preparada. (O final da titulação será em
torno de 10 mL de glicose).

Determinação do Título da Solução de Fehling:

Colocar na bureta a solução padrão. Transferir com pipeta volumétrica 10

mL de cada uma das soluções de Fehling A e B para erlenmeyer de 250 mL.
Adicionar 40 mL de água e aquecer até ebulição. Gotejar a solução padrão, sem
agitação, até quase o final da titulação. Manter em ebulição. Adicionar 1 gota de
solução de azul de metileno a 1 % e completar a titulação até descoramento do
indicador. A titulação deve ser feita sob ebulição e não pode ultrapassar 3 minutos.

Título da Solução de Fehling:

T = Volume em mL gasto de glicose x 0,50

100

4. PROCEDIMENTO

Pesar 25 mL de amostra homogeneizada em béquer de 250 mL.

Adicionar 50 mL de água e aquecer em banho-maria por 10 minutos agitando
ocasionalmente. Adicionar 2 mL de ácido clorídrico p.a. e levar ao banho a 60 °C por
60 minutos. Transferir para balão volumétrico de 250 mL. Esfriar e neutralizar com
solução de hidróxido de sódio a 10%, usando papel indicador. A neutralização não
deve ultrapassar o pH 7. Adicionar 2 mL de solução de ferrocianeto de potássio a 15
% e 2 mL de solução de sulfato ou acetato de zinco a 30 %. Agitar, esfriar e
completar o volume. Filtrar em papel de filtro seco para erlenmeyer.
Colocar na bureta 25 mL do filtrado obtido. Pipetar volumetricamente 5 ou
10 mL de solução de Fehling A e 5 ou 10 mL de solução de Fehling B para
erlenmeyer de 250 mL. Adicionar 40 mL de água. Aquecer até ebulição e gotejar a
 29
solução da amostra até o líquido sobrenadante ficar levemente azulado. Mantendo a
ebulição, adicionar 1 gota de solução de azul de metileno a 1 % e continuar a
titulação sob ebulição, até descoloração do indicador. Esta titulação não deverá
ultrapassar 3 minutos, manter em ebulição durante toda a titulação.

4.1 CÁLCULOS

Porcentagem de Glicose:

% de glicídios redutores em glicose = 250 x 100 x T

Vxp

Onde:
250 = volume da solução;
100 = porcentagem;
T = título da solução de Fehling; se usar alíquotas de 5 mL da solução de Fehling A
e B, usar T/2;
V = volume da amostra gasto na titulação (mL);
p = massa da amostra em gramas.

Porcentagem de Sacarose:
% de glicídios totais = 250 x 100 x T/2
Vxp
% sacarose = (% glicídios totais - % glicose) x 0,95;

Onde:
0,95 = fator de transformação das hexoses em sacarose;
250 = volume da solução;
100 = porcentagem;
T = título da solução de Fehling; se usar 5 mL da solução de Fehling A e Fehling B,
usar T/2;
V = volume da amostra gasto na titulação (mL);
p = massa da amostra em gramas.

Porcentagem de Lactose:
 30

% glicídios redutores em lactose = 100 x 500 x T x 1,39

Vxp
Onde:
1,39 = fator de transformação das hexoses em lactose;
500 = volume da solução;
100 = porcentagem;
T = título da solução de Fehling; se usar 5 mL da solução de Fehling A e Fehling B,
usar T/2;
V = volume da amostra gasto na titulação (mL);
p = massa da amostra em gramas.

5. EXEMPLIFICAÇÃO DO CÁLCULO DE ALGUNS RESULTADOS.

Os resultados obtidos na análise dos alimentos utilizados em aula estão

relacionados na tabela abaixo juntamente com os valores de referência.

Tabela 1: Análise do teor de glicídios em mel e leite em pó em amostras de produtos

comerciais.

Alimento Análise Valor de Referência Resultados (%)

Mel Glicose Mín 60 – 65% 60,1
Mel Sacarose 5-10% 1,73
Leite em pó Lactose min. 38% 33

De acordo com a Portaria n. 367 de 4 de Setembro de 1997, o mel de

flores deve ter 60% de glicose, enquanto que o mel de melado deve ter 65% do
mesmo açúcar – valores mínimos. A mesma portaria determina o teor máximo de
sacarose para o mel de flores em 5% e para o mel de melado em 10%.

Sendo então o mel analisado do tipo mel de flores e, pode-se dizer que,
este produto comercial está dentro das especificações recomendadas pela Portaria
367.

Já o teor de lactose do leite em pó analisado está 5% abaixo das

especificações do ministério. Este resultado leva ao questionamento sobre a
 31
possibilidade de fraude no leite, como por exemplo, a adição de soro. Entretanto
para afirmar sobre a adição de soro, seria necessário fazer a análise para verificar a
presença do mesmo no produto.

Quanto à precisão da técnica Lane-Eynon, apesar de ser a preconizada

pelo Minitstério da Agricultura para a determinação de açucares nos alimentos, é
uma técnica extremamente passível de erro, pois tem caráter subjetivo e apresenta
vários pontos de estrangulamento no que diz respeito aos pontos de viragem
durante a titulação do filtrado e quanto à velocidade de descida do filtrado.

6. - REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALLINGER, N. L.; Química orgânica; Rio de Janeiro, R.J.; LTC – Livros Técnicos e
Científicos Editora S.A., 2 ed; 2000.

A.O.A.C. Official methods of analysis. Dairy products, p.17, 1195.

BOBBIO, P.A.; BOBBIO F. O. Química do processamento de alimentos, São Paulo,

S.P., Varela Editora e Livraria LTDA., p47-60, 2001.

BORGES, M.T.M.R.; PARAZZI, C.; PIEDADE, S.M.D.S. Avaliação de Métodos

Químicos de Determinação de Açúcares Redutores em Xaropes. Anais do 4o.
Congresso Nacional da STAB. VIII Convenção da ACTALAC, Olinda, Pe, Brasil,
8-13 novembro de 1987.

BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária.

Laboratório Nacional de Referência Animal. Métodos analíticos oficiais para
controle de produtos de origem animal e seus ingredientes: II – Métodos
físicos e químicos. Brasília, 1981. Cap.2,p.11-13:Salsicharia.

BRASIL, Portaria n 367 de 4 de Setembro de 1997, Ministério da Agricultura

CANO, C.B.; ALMEIDA-MURADIAN, L.B. Análise de padrões de carboidratos
normalmente encontrados no mel por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE)- Parte I. XVI Congresso Brasileiro de Ciências e Tecnologia de
Alimentos, "Alimento, População e Desenvolvimento", Rio de Janeiro, Brasil, 15-
17 de julho de 1998.
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v. 28, n. 3, p. 350 — 356, 1956.

FISHER, H, J, HART, F, L. Analisis Moderno de los alimentos. Ed. Acribia,

Zaragoza 1971.
 32
FROST, G.M. Industrial enzyme applications industrial. Biotechnology Wales, v. 3,
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JOSLYN, M., A. Food science and tecnology: methods in food analysis. New
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 34

Determinação de lipídeos

1 INTRODUÇÃO

O termo lipídio era inicialmente utilizado na literatura relacionando-se

apenas com gorduras e substâncias gordurosas presentes nos alimentos
(FELDMAN, 1967). Definia-se estes, como componentes de alimentos insolúveis em
água e solúveis em solventes orgânicos, refletindo sua característica hidrofóbica,
englobando, assim, ácidos graxos, álcoois de cadeia longa, fosfolipídeos e
esfingolipídeos. Os solventes usualmente utilizados na extração de lipídios incluem o
éter etílico, éter de petróleo, acetona, clorofórmio, benzina, álcoois e butanol
saturado em água (POMERANZ, 1978).
Possuem pelo menos três importantes funções nos alimentos: na culinária,
função fisiológica e nutricional (KUMMEROW, 1960). A habilidade em carrear odores
e sabores, e sua contribuição para a palatabilidade de carnes, maciez de produtos
assados, riqueza e textura de sorvetes são exemplos da primeira importância. Como
os lipídios são ótimos meios para a transferência de calor, são bastante usados em
frituras. Os lipídios na dieta representam a forma mais compacta de energia
disponível para o homem. Contêm duas vezes o valor calórico de um peso
equivalente em açúcar. São vitais para as funções biológicas e estruturais das
células. Fornecem ácidos graxos essenciais (linoléico) que tem ações estruturais e
funcionais nos tecidos animais e são carreadores de vitaminas lipossolúveis.
Os lipídios em sua maioria, possuem ácidos graxos como parte de sua
composição, entretanto, os esteróis, escalenos e carotenóides apresentam a
solubilidade dos lipídios mas não contém ácidos graxos. Os gangliosídeos já são
solúveis em água e insolúveis em solventes para extração de gordura. O teor de
gordura em margarina é aproximadamente 81%; molhos comerciais para saladas
40-70%; nozes e amêndoas 55%; castanha do Pará 67%; castanha de caju 46%;
amendoins 48%; semente de girassol 47%; soja 18%; leite fresco 3.7%; leite em pó
27,5%; em cremes varia de 20 a 38%; sorvetes é de aproximadamente 12%; pão 3 a
6%; bolos 15 a 30%; carcaça 16 a 25%; molhos 15 a 50%; salmão 4 a 16%; ovo
12%; gema de ovo 29%. A maioria das frutas e vegetais contêm pequena
 35
quantidade de lipídios, mas abacate contém 16%, azeitona em conserva 36% e
chocolate em pó 8, 24%.
Segundo o RIISPOA (BRASIL, I997), a farinha de carne e osso deve
apresentar um percentual de lipídio inferior a 10% e a CMS (carne mecanicamente
separada) superior a 30% (Brasil, 2000).
O chamado extrato etéreo, portanto, refere-se ao conjunto de substâncias
extraídas com éter etílico e é um exemplo de procedimento de extração sólido-
liquido. Depende da diferença de solubilidade em um determinado solvente de um
ou mais componentes presentes no material sólido ou semi-sólido.Fatores como:
quantidade suficiente de solvente, polaridade do componente, ação homogênea do
solvente sobre a amostra são fundamentais na obtenção de resultados fidedignos
(JOSLYN, 1979).
A origem da determinação do extrato etéreo se deu por pesquisadores de
centros de pesquisa agrícolas experimentais da Alemanha e depois por norte-
americanos e ingleses. Nestas pesquisas foi utilizado o éter etílico anidro onde
obtiveram muitos resultados da quantidade de gordura em alimentos para consumo
humano. Um método rápido, proposto por FOLCH et al (1957), baseava-se na
divisão gravimétrica de componentes, gerando fases, utilizando nesse estudo lipídios
de tecidos animais misturados a clorofórmio, metanol e água. Posteriormente, foram
realizados estudos comparativos entre diversas técnicas de extração de extrato
etéreo em peixes, com a utilização de acetona, éter e saponificação alcalina,
obtendo-se resultados positivos associados à utilização de éter e saponificação
alcalina (LEE et. al, 1966).
Atualmente a determinação do extrato etéreo é realizada em amostras
previamente desidratadas em estufa a fim de eliminar seu conteúdo de umidade.
Podem ser utilizados diversos tipos de extratores como por exemplo:- os contínuos,
entre os quais podemos citar os tipos Underwrites, Knorr, Goldfisch e Bailey-Walker
– os intermitentes como o Soxhlet e suas numerosas variações. Segundo
FISHER(1971) os intermitentes são mais eficientes,sua maior desvantagem seria a
utilização de grandes quantidades de solvente.
Recomenda-se que seja utilizado sempre o mesmo solvente e que ele seja
indicado para evitar qualquer tipo de diferença de resultado devido ao rendimento e
composição dos extratos resultantes. A própria diversidade estrutural dos lipídeos
torna impossível a determinação de um solvente ideal. Éter etílico e éter de petróleo
são os utilizados rotineiramente, dando preferência ao segundo, devido sua maior
 36
seletividade relativa a “lipídeos verdadeiros”, somado ao alto custo e risco de
explosão associados à utilização de éter etílico. Além disso, relata-se a ocorrência
de extração de componentes não – lipídicos ao se utilizar éter etílico (POMERANZ,
1978).
Existem algumas particularidades para cada tipo de alimento a ser
analisado que merecem devida atenção, no que diz respeito ao processamento das
amostras e escolha do solvente. Pode ser citado como exemplo o método
preconizado pela AOAC para carne que permite utilizar associação entre o éter de
petróleo e o éter etílico. Já para a salsicha não se deve utilizar o éter de petróleo.
Pode-se utilizar associações entre éter e álcool quando se trabalha com alimentos
ricos em componentes não-lipídicos que deverão ser separados subseqüentemente.
Para a análise de farinhas, as amostras devem ser misturadas com areia
seca e limpa antes de serem desidratadas. Utilização de solvente n-butanol,
saturado em água é indicada na extração de lipídeos de cereais e farinhas. Porém a
liberação de lipídeos nesses exemplos só ocorre mediante hidrólise ácida do
material. Foram relatadas desvantagens associadas a este solvente, tais como odor
forte, necessidade de utilização de altas temperaturas e demora na evaporação.
(POMERANZ, 1978)
A extração com sucesso requer que as pontes entre os lipídios e outros
componentes sejam quebradas e eles se tornem livres e solúveis.
Normalmente a solubilidade é obtida quando as polaridades dos solventes
e dos lipídios são semelhantes. Então, triglicerídios apolares são dissolvidos em
solventes apolares como hexano e éter de petróleo. Compostos polares como
glicolipídios são solúveis em álcool. Em alguns casos, a solubilidade é modificada
como um resultado de interações moleculares. Então, a fosfatidilcolina (lecitina)
comporta-se como uma base devido ao seu grupo de amônia quaternária da colina
de sua composição que se dissolve em solventes ácidos fracos como o álcool. A
fosfatidil serina é estruturalmente similar à fosfatidil colina, mas é um ácido polar
relativamente forte. É então insolúvel em ácidos fracos, mas se dissolve em
clorofórmio que se liga prontamente a compostos ácidos polares. A presença de
outros lipídios também afeta a solubilidade.
 37

3. REVISÃO DE LITERATURA

3.1 Preparação da amostra para a extração de lipídios

Não existe um método único para a extração de lipídios. O método a ser

utilizado irá depender do tipo de alimento a ser analisado e da natureza do problema
analítico subseqüente.
A extração de lipídios do leite é relativamente simples comparada a
extração de lipídios de plantas ou tecidos animais. Estes podem necessitar de algum
tipo de fragmentação, como trituração mecânica, desintegração por ondas sonoras,
homogeneização ou compressão – descompressão. Durante estes processos será
necessário manter a degradação química, física ou enzimática em um nível mínimo,
o que é conseguido pelo controle de temperatura, ambiente químico e o tempo de
exposição do material a cada solvente.
Se os lipídios são incompletamente extraídos ou alterados durante a
extração, os resultados serão imprecisos, independente da precisão do método
utilizado. Para melhores resultados, especialmente se os lipídios extraídos forem
identificados,os seguintes cuidados devem ser tomados: 1)todos os procedimentos
devem ser realizados em uma atmosfera de nitrogênio; 2) o(s) solvente(s)
utilizado(s) devem ser purificados e livres de peróxido e devem ser usados na
relação solvente : soluto correta; 3) o tecido deve ser removido da amostra e
subdividido o mais rápido possível; 4) o calor deve ser evitado; 5) o extrato deve ser
purificado para remover os compostos não lipídicos e 6) os lipídios purificados
devem ser estocados sob condições que minimizam as alterações.
A umidade é um importante fator a ser observado durante a extração.
Apenas uma parte dos lipídios pode ser extraída com éter de material úmido, pois o
solvente não pode penetrar nos tecidos e o extrator se torna saturado com água e
ineficiente para a extração de lipídios. Secagens a elevadas temperaturas são
indesejáveis, pois alguns lipídios se ligam a proteínas e carboidratos e se tornam
impossíveis de serem extraídos. A liofilização afeta menos a extratibilidade e
aumenta a superfície da amostra. Por outro lado, na liofilização, mais lipídios serão
extraídos de uma amostra contendo 11% de umidade do que outra com teor de
umidade muito baixo.
 38
A extração de materiais secos depende do tamanho das partículas,
consequentemente, a trituração eficiente é muito importante. O método clássico de
determinação de gordura em oleaginosas envolve a retirada da parede com um
solvente determinado após repetidas triturações em recipiente com areia. Materiais
macios como o amendoim, devem ser triturados em recipiente com ausência de
óleo. Para promover a rápida extração, a amostra e o solvente devem ser
misturados juntos num misturador de alta velocidade. Quando o corte é realizado em
alta velocidade, o tamanho das partículas é rapidamente reduzido e a extração de
gordura é acelerada.
Existe uma dificuldade de se extrair lipídios de vegetais devido à
porosidade reduzida da parede destas células e sua sensibilidade aos agentes
desidratantes. A extração pode ser acelerada e se tornar representativa se as
células de vegetais forem quebradas automaticamente por agitação em recipiente de
vidro (TREVELYAN, 1966). Para reduzir a modificação metabólica de lipídios
durante a desintegração mecânica, a suspensão de vegetais deve ser pré-aquecida
rapidamente a 90ºC.

3.2 Extração com solvente a quente

O método está baseado em três etapas:

A- Extração da gordura da amostra com solvente.
B- Eliminação do solvente por evaporação.
C- Quantificação da gordura extraída por pesagem.

3.2.1 Características

· A escolha do solvente dependerá dos componentes líquidos existentes

no alimento.
· A extração com solventes é mais eficiente quando o alimento é seco
antes da análise, pois existe maior penetração do solvente na amostra. Pode-se
utilizar a amostra que foi usada na determinação de umidade.
· A preparação da amostra para determinação de gordura deve ser
cuidadosa, de maneira a evitar a sua degradação. Em muitos alimentos
processados, como em produtos derivados do leite, pães, produtos fermentados,
açucarados e produtos animais, a maior parte dos lipídios está ligada à proteína e
 39
carboidratos, e a extração direta com solventes não polares é ineficiente. Estes
alimentos precisam ser preparados para a extração de gordura por hidrólise ácida ou
básica, ou outros métodos.
· É necessário um controle da temperatura e tempo de exposição do
material no solvente.

3.22 Eficiência da extração a quente

Depende de uma série de fatores:
1- Natureza do material a ser extraído.
2- Tamanho das partículas: quanto menor, mais fácil a penetração do
solvente.
3- Umidade da amostra: a água presente na amostra dificulta a
penetração do solvente orgânico por imiscibilidade.
4- Natureza do solvente.
5- Semelhança entre as polaridades do solvente e da amostra.
6- Ligação dos peptídeos com outros componentes da amostra.
7- Circulação do solvente através da amostra.
8- A velocidade do refluxo não deve ser nem muito alta nem muito baixa,
porque pode haver pouca penetração do solvente em velocidade muito alta.
9- Quantidade relativa entre solvente e material a ser extraído: quanto
mais solvente, maior é a extração, porém não se deve usar em excesso devido ao
alto custo do solvente.

3.2.3 Tipos de solventes

Os dois solventes mais utilizados são o éter de petróleo e o éter etílico. O
éter etílico é um solvente de extração mais ampla, pois pode extrair também
vitaminas, esteróides, resinas e pigmentos, o que constitui um erro quando se deseja
determinar somente gordura (triacilglicerídeos). Porém, estes compostos aparecem
geralmente em pequenas quantidades, o que daria um erro aceitável. Por outro lado,
ele é menos usado porque é mais caro, perigoso e pode acumular água durante a
extração que vai dissolver materiais não lipídicos. Portanto, o éter de petróleo é mais
comumente utilizado. Em alguns casos, é conveniente utilizar mistura de solventes,
como no caso de produtos lácteos. Os solventes (e misturas de solventes) usados
para extração de gordura incluem: éter, éter de petróleo, acetona, clorofórmio,
álcoois de benzeno e butanol saturado em água.
 40
Combinações de extrações alternativas com éter etílico e éter de petróleo
são usadas frequentemente na extração de lipídios de produtos lácteos. Misturas de
álcool e éter são empregadas para remover gordura de certos materiais biológicos,
entretanto, o extrato é rico em componentes não lipídicos que devem ser
subseqüentemente separados. O tratamento com álcool facilita a remoção de
gordura de alguns materiais.
O n-butanol saturado em água foi o mais efetivo na extração de gordura
de trigo, farinhas e polvilhos e glúten (MECHAM & MOHAMMAD, 1955). O butanol
saturado em água é muito utilizado para a extração de lipídios de cereais. Mesmo
assim, ainda existem lipídios que somente são liberados após hidrólise ácida. Além
disso, o solvente tem um forte odor e requer temperaturas relativamente altas para
evaporação no vácuo. Um método rápido para a extração de lipídios foi proposta
originalmente por FOLCH et al. (1957) para isolamento e purificação de lipídios totais
de tecidos animais por meio de partição de fase de uma mistura de água – metanol –
clorofórmio.
Dois tipos de complexos de lipídios e proteínas são conhecidos:
lipoproteínas e proteolipídios que se diferem na quantidade relativa de lipídios e
proteínas. A Lipoproteína é composta principalmente por proteína, enquanto os
proteolipídios são compostos por partes praticamente iguais de ambos com caráter
de solubilidade de lipídios.
Misturas de clorofórmio e metanol estão entre os mais efetivos e
relativamente brandos extratores; os proteolipídios extraídos podem ser prontamente
quebrados para liberar os lipídios por repetidas evaporações do extrato ou por
evaporação seca após a formação de um sistema de duas fases com a água. Esta
quebra é baseada na razão de clorofórmio: metanol durante a evaporação. A razão
original de 2:1 (v/v), ou de 1:1 numa base molar é útil na extração de proteolipídios
intactos, pois a alta concentração de clorofórmio reduz em muito a capacidade do
metanol em formar ligações de hidrogênio e previne a quebra das pontes
eletrostáticas dos proteolipídios. Durante a evaporação, a concentração de
clorofórmio cai mais rapidamente do que a de metanol. À medida em que mais
metanol se torna disponível para atacar e romper as ligações entre proteínas e
lipídios, a proteína é gradualmente desnaturada e precipitada.
Purificação dos extratos: substâncias não lipídicas solúveis em água são,
invariavelmente, extraídas de tecidos juntamente com os lipídios. Os não lipídios
devem ser removidos para a determinação gravimétrica dos lipídios totais e para
 41
prevenção de contaminação durante o subseqüente fracionamento do extrato total.
Vários procedimentos de partição têm sido usados. Os métodos mais comuns
empregam água pura ou soluções aquosas. Os métodos falham em remover
fosfatos inorgânicos e com extratos ricos em fosfatos pode produzir emulsões que
podem ser quebradas apenas por centrifugações ou repouso na vertical por muito
tempo. Alguns lipídios são apreciavelmente solúveis em água e a lavagem
excessiva pode causar perdas de lipídios.
A remoção de contaminantes pode ser obtida parcial ou completamente por
evaporação dos extratos por secagem a vácuo com nitrogênio e reextração com
um solvente apolar. A separação por diálise, eletrodiálise, eletroforese e
cromatografia são alguns métodos opcionais. O gel de dextrano por ligação
cruzada pode ser útil para a separação cromatográfica de colunas de lipídios de
substâncias não lipídicas solúveis em água.

3.3 Tipos de equipamentos

3.3.1 Soxhlet

A extração direta é muitas vezes realizada em um extrator do tipo Soxhlet.

A amostra é colocada em um dedal de filtro de papel ou Alundum,(cartucho) coberta
por algodão livre de gordura e embebido em éter para prevenir a perda de pequenas
partículas para o frasco. Então este frasco é colocado no centro do aparelho e
preenchido com o solvente. As três partes do aparelho são conectadas; o
condensador é ligado a uma mangueira e o aquecimento do solvente no interior do
frasco é iniciado. Os vapores de condensação preenchem o frasco do meio por uma
ação sifonante a cada vez que o topo do sifão é atingido. Ao fim de exaustivas
extrações, o aparelho será desconectado, o solvente do frasco tarado é evaporado e
o aumento de peso é calculado. Os extratores mais eficientes para a maioria dos
materiais são os tipos de percolação contínua.

Características
· É um extrator que utiliza refluxo de solvente.
· O processo de extração é intermitente.
· Pode ser utilizado somente com amostras sólidas.
 42
· Tem a vantagem de evitar a temperatura alta de ebulição do solvente,
pois a amostra não fica em contato com o solvente muito quente, evitando assim a
decomposição da gordura da amostra.
· A quantidade de solvente é maior porque o volume total tem que ser
suficiente para atingir o sifão do equipamento.
· Tem a desvantagem da possível saturação do solvente que permanece
em contato com a amostra antes de ser sifonado, o que dificulta a extração.
Existe, desde 1974, nos Estados Unidos, uma modificação do extrator de
Soxhlet que extrai gordura com éter em 30 minutos ,ao contrário das 4 horas
habituais: a amostra seca é imersa diretamente no éter em ebulição, dentro de um
copo feito de tela de arame, no equipamento em refluxo. Após 10 minutos, o copo
com a amostra é suspenso e o éter condensado é utilizado para lavar a amostra por
20 minutos. A determinação completa leva 2 horas e 15 minutos, e podem ser feitas
até 80 determinações por dia num extrator múltiplo comercial. A precisão é
equivalente ao método Soxhlet.

3.3.2 Goldfish
Características
· É um método que também utiliza refluxo de solvente para extração.
· O processo de extração é contínuo e, portanto, mais rápido.
· Pode ser utilizado somente com amostras sólidas.
· Tem a desvantagem do contato do solvente muito quente com a
amostra, o que pode acarretar degradação da gordura.
· Tem a vantagem de utilizar menos solvente e ser mais rápido, pois o
método, sendo contínuo, faz com que a amostra esteja permanentemente em
contato com o solvente.

3.4 Extração com mistura de solventes a frio. Método de Bligh-dyer.

BLIGH & DYER (1959) sugeriram um método de extração de gordura a

frio que utilizava uma mistura de três solventes, clorofórmio-metanol-água.
Inicialmente, a amostra é misturada com metanol e clorofórmio que estão
numa proporção que forma uma só fase com a amostra. Em seguida, adiciona-se
mais clorofórmio e água de maneira a formar duas fases distintas:uma de
clorofórmio, contendo os lipídeos, e a outra de metanol mais água, contendo as
 43
substâncias não lipídicas. A fase de clorofórmio com a gordura é isolada e, após a
evaporação do clorofórmio, obtem-se a quantidade de gordura por pesagem.
O método tem uma série de vantagens em relação à extração a quente:

1- Extrai todas as classes de lipídeos, inclusive os polares que

representam um alto teor em produtos de trigo e soja e são importantes para
avaliações dietéticas. Isso ocorre em função do clorofórmio ser um solvente orgânico
para qualquer classe de lipídeos e o metanol facilitar o embebimento da amostra e
desfazer as ligações lipo-protéicas (LOVEM, 1965).

2- Os lipídeos são extraídos sem aquecimento e os extratos podem ser

utilizados para avaliação de deterioração dos lipídeos através dos índices de
peróxidos e ácidos graxos livres, além da determinação do teor de carotenóides,
vitamina E e composição de ácidos graxos e esteróis.

3- Pode ser utilizado em produtos com altos teores de umidade, além dos
produtos secos. É, então aplicável a qualquer tipo de alimento que contenha até
10% de umidade.

4- A determinação completa pode ser realizada em tubos de ensaio, não

necessitando de equipamentos especializados e sofisticados.

5- É baseado na distinção de fases de um sistema formado pela amostra,

metanol, clorofórmio e água.

3.5 Extração da gordura ligada a outros compostos por hidrólise ácida e

alcalina.

Em alguns produtos como pão e leite, a gordura está ligada à proteína e

carboidratos e, portanto, deve ser liberada para a quantificação. A liberação da
gordura é feita por uma hidrólise ácida ou alcalina.

3.5.1 Hidrólise ácida

3.5.1.1 Processo de Gerber

É um método de rotina utilizado somente para leite e produtos lácteos. A

gordura no leite está presente em forma de emulsão de óleo e água, cercada de um
filme de proteína. É necessário quebrar este filme para conseguir a extração da
 44
gordura. Para isto a amostra é tratada com ácido sulfúrico. Este método é baseado
na propriedade que o ácido sulfúrico tem de dissolver a caseína do leite, sem atacar
a matéria gorda, quando em concentração determinada. É também adicionado
álcool isoamílico para facilitar a separação da gordura e reduzir o efeito de
carbonização do ácido sulfúrico sobre ela, ou seja, diminuindo-se a tensão na
interfase, entre a gordura e a mistura em reação (ácido sulfúrico e leite), é facilitada
enormemente a ascensão dos glóbulos de gordura pequenos durante a
centrifugação.
É de suma importância, antes de se retirar a amostra, agitar bem o leite
para que a porção retirada seja representativa do total. A gordura, sendo menos
densa que os outros componentes, tem a tendência de ocupar a fração superior da
amostra em repouso (ROCHA et. al).
Após a digestão, a amostra é centrifugada num tubo chamado
butirômetro, já calibrado com uma escala volumétrica. A gordura separada da fase
aquosa com a proteína é medida volumetricamente diretamente no butirômetro.
Existem vários tipos de butirômetros com escalas diferentes para medir diferentes
produtos lácteos, como creme de leite e queijos, e até para alguns produtos não
láteos, como produtos processados de carne e peixe.
O método possui dois requisitos muito importantes para obtenção de bons
resultados: densidade e temperatura
Gerber comprovou que a coluna de gordura separada não era anidra e
que sua hidratação dependia da densidade do ácido sulfúrico empregado. Assim
sendo, deve ser usado um ácido com uma densidade de 1,82 e, portanto, o ácido
concentrado que possui uma densidade de 1,84 deve ser diluído. A leitura final da
gordura no butirômetro deve ser feita a 71ºC.

3.5.1.2 Processo de Babcock

Utiliza, como no processo de Gerber, ácido sulfúrico (d=1.8-1.83) para

hidrólise da proteína. A diferença com o processo de Gerber está nas quantidades
de leite e ácido sulfúrico adicionados, e na adição de água quente em vez de álcool
isoamílico. O método é também volumétrico, e a medida é feita igualmente num tubo
graduado. O método de Gerber é mais utilizado na Europa e o de Babcock nos
Estados Unidos.Ambos os métodos não determinam os fosfolipídeos, mas não há
 45
problemas com o leite integral que tem apenas 1% de fosfolipídeos na gordura total.
A manteiga tem cerca de 24% de fosfolipídeos e, portanto, deve-se utilizar os
métodos de Goldfish ou Soxhlet. O método de Gerber é 2 a 3 vezes mais rápido que
o de Babcock.

3.5.2 Hidrólise alcalina – Método de Rose-Gottlieb e Mojonnier

No processo de Rose-Gottlieb e Mojonnier, a amostra é tratada com

hidróxido de amônia e álcool para hidrolisar a ligação proteína-gordura, e a gordura
separada é então extraída com éter de petróleo e éter etílico. O álcool precipita a
proteína que é dissolvida na amônia e a gordura separada pode ser extraída,
repetidas vezes, com éter e éter de petróleo. Os extratos combinados são secos,
purificados por extração com éter de petróleo e pesados. No método de Mojonnier,
os extratos são pesados sem purificação. Consequentemente, os resultados são
ligeiramente mais altos do que no método de Rose-Gottlieb.
A extração com éter de petróleo é eficiente em amostras com muito
açúcar como, por exemplo, leite condensado. De uma maneira geral, o método é
bastante empregado para laticínios.
Se necessário, pode-se diluir a amostra com água e aquecer para facilitar
a dispersão.

3.6 Testes indiretos

Estão disponíveis para aproximar a determinação de conteúdos lipídicos.

3.6.1 NMR – wide line nuclear magnetic resonance spectroscop:

Usado para análises de óleo em sementes. O método é não destrutivo,

rápido e pode ser usado para determinar o conteúdo oleoso de uma única semente
ou de um pool de sementes. O NMR calculado está relacionado ao hidrogênio total
na fração oleosa da semente, independente do conteúdo de hidrogênio da fração
não oleosa. O óleo é calculado por tabelas ou curvas de calibração.Os resultados
são afetados pela umidade da amostra e sua distribuição. Tem sido usado com
sucesso em sementes de milho, soja e várias outras oleaginosas.
 46
O método pode também ser utilizado para determinar simultaneamente a
umidade e a gordura das sementes,separadamente,com NMR de alta
resolução,desde que a freqüência ressonante para prótons na água seja
ligeiramente diferente do que aquela dos prótons da gordura.

3.6.2 Infravermelho próximo:

Baseia-se na absorção diferencial de ondas infravermelhas pelos

diferentes componentes do leite. São utilizados 40ml de leite armazenados em
frascos especiais a partir do final da ordenha. Após ser automaticamente pipetada
para dentro do equipamento, uma alíquota da amostra será exposta primeiramente a
uma radiação infravermelha que possibilita determinar a concentração de gordura. A
alíquota colhida pelo instrumento passa por um sistema óptico que mede a energia
absorvida em um comprimento de onda específico no meio da região infravermelha.
Moléculas de gordura, proteína, lactose e demais componentes dos sólidos totais
absorvem a luz infravermelha por diferença, na estrutura das moléculas que vibram
em comprimento de onda característico. O processo para quantificar o componente
requer a medida e o uso de dois comprimentos de onda: comprimento de referência
e comprimento de leitura (medida). Para cada componente, as amostras serão
irradiadas no comprimento de onda de referência e no comprimento de onda de
leitura. O equipamento emitirá um feixe de luz sensitiva de radiação infravermelha,
colhida por um detector. Os sinais serão detectados e passados a uma placa do
equipamento que converterá a concentração do componente específico para
percentuais através do software gerenciador. Este calculará o resultado final
comparando as medidas de referência com as medidas da amostra.

3.6.3 Ultra som:

Determina os sólidos totais e sólidos desengordurados do leite e se

baseia na velocidade das ondas sonoras no leite a várias temperaturas.

3.6.7 Turbidimetria:

Determina a gordura do leite e se baseia na medição espectrofotométrica

da luz transmitida e conversão de valores por um gráfico de valores. É bastante
preciso e reproduzível em variações entre 0 e 4% de gordura e não é afetado pela
adição de conservantes. Utiliza reagentes não corrosivos e permite testar 75
amostras/hora/operador.
 47
3.6.8 Colorimetria para a determinação de óleo:

O extrato lipídico é tratado com uma solução alcalina de ácido

hidroxamico e deixado reagir por tempo determinado. Após acidificação com ácido
clorídrico e adição de cloridrato de ferro uma cor relativamente estável com
absorbância máxima de 540nm é formada.Também pode ser usada para
determinação de gordura do leite.

3.6.9 Refratometria:

É usado para determinação de gordura de vegetais, carne, peixe e

derivados. O método rápido de refratometria também é usado para a determinação
de gordura de chocolate.

Alterações dielétricas de solventes como resultado da presença de

gordura.

Usado para estimar o óleo de sementes oleaginosas. Baseia-se na

trituração da amostra em moedor de alta velocidade. A medição da alteração
dielétrica é feita na mistura solvente / soluto e a leitura é traduzida em um mapa que
relaciona a leitura com o teor de gordura.
 48
4 - MATERIAL E MÉTODOS UTILIZADOS

4.1 Extração de gordura-método quantitativo

4.1.1 PRINCÍPIO

Fundamenta-se na solubilidade dos lipídios em solventes apropriados (éter

de petróleo ou n-hexano ou éter etílico anidro). Os lipídios extraídos são
posteriormente determinados por gravimetria.

4.1.2 MATERIAL

4.2.2.1 EQUIPAMENTOS:
Balança analítica;
Banho-maria;
Estufa;
Extrator de Soxhlet com aquecimento elétrico ou banho-maria.

4.1.2 VIDRARIA, UTENSÍLIOS E OUTROS:

Algodão desengordurado;
Bastão de vidro;
Béquer de 250mL;
Cartucho de extração;
Dessecador com sílica gel ou cloreto de cálcio anidro;
Funil;
Papel de filtro qualitativo;
Pérolas de vidro;
Proveta de 25mL.

4.2 - PROCEDIMENTO

Pesar amostra conforme com massas representativas, secar em estufa a

105 ºC durante 2 horas ou usar a amostra após a determinação da umidade.
 49
Transferir a substância seca e fragmentada para um cartucho de extração com
auxílio de um bastão de vidro e uma porção de algodão desengordurado. Cobrir a
amostra no cartucho com o algodão. Aquecer o balão de Soxhlet por 1 hora em
estufa a 105 ºC, esfriar em dessecador e pesar. Colocar o cartucho no extrator de
Soxhlet e extrair com solvente por um período mínimo de 6 horas (de acordo com o
teor de lipídios pode ser de 8 a 12 horas). Evaporar o solvente em banho-maria a 65
ºC e colocar o balão com resíduo em estufa a 105 ºC por 1 hora. Esfriar em
dessecador e pesar. Repetir as operações até obter peso constante.

4.2.1 PRODUTOS DE SALSICHARIA, ENLATADOS, CHARQUE E OUTROS

PRODUTOS CURADOS:
Pesar exatamente cerca de 5 g de amostra homogeneizada.

4.2.2. EXTRATO DE CARNE:

Utilizar a amostra da determinação de umidade, transferindo
cuidadosamente as pérolas de vidro, envoltas pela amostra para o cartucho de
extração de Soxhlet.

4.2.3 CÁLCULOS

% lipídios = 100 x p
p'
Onde:
p = massa de lipídios extraídos em gramas;
p' = massa da amostra em gramas.

4.3 Método quantitativo por Butirômetro

4.3.1 PRINCÍPIO

Fundamenta-se no ataque seletivo da matéria orgânica por meio de ácido sulfúrico

com exceção dos lipídios, que são separados por centrifugação com auxílio do
álcool isoamílico que modifica a tensão superficial.
4.3.2 MATERIAL
 50

4.3.2.1 EQUIPAMENTOS:
Balança analítica;
Banho-maria;
Centrífuga de Gerber.

4.3.2.2 VIDRARIA, UTENSÍLIOS E OUTROS:

Bastão de vidro;
Béquer de 50 mL;
Butirômetro de Gerber para leite;
Papel absorvente;
Pipetas graduadas de 5 e 10 mL ou pipetador automático;
Pipeta volumétrica de 1 mL.

4.3.2.3 REAGENTES:
Solução de ácido sulfúrico (H2SO4) d=1,820:
Adicionar com cuidado 925 mL, de ácido sulfúrico d=1,840 sobre 120 mL de água.
Homogeneizar, esfriar e conferir com o densímetro;
Álcool isoamílico (C5H12O) p.a..

4.3.3 PROCEDIMENTO

Pesar em balança analítica 1 a 3g de amostra homogeneizada de acordo

com seu teor de gordura. Adicionar 4mL de água quente, homogeneizar, adicionar
7mL de ácido sulfúrico d=1,820. Homogeneizando com bastão de vidro de tal forma
que não sobrem resíduos de carne. Passar cuidadosamente para butirômetro de
leite sem perda da amostra com auxílio de bastão de vidro. Lavar 2 vezes o béquer
com 2mL de água quente e 1,5mL de solução de ácido sulfúrico d=1,820. Adicionar
1mL de álcool isoamílico. Enxugar a boca do butirômetro com papel e arrolhar bem.
Colocar em banho-maria a 65 ºC por 10 minutos. Centrifugar durante 5 minutos a
1500rpm. Recolocar no banho-maria, fazer a leitura após 10 minutos e calcular a
porcentagem de gordura.
 51
4.3.4 CÁLCULOS

% lipídios = leitura no butirômetro x 11,33

p
Onde:
p = massa da amostra em gramas;
11,33 = massa em gramas do leite, se utilizarmos o método de Rose Gottlieb:
d = m/v;
densidade média do leite = 1,030;
V = volume da amostra (11mL);
m = d x V = 1,030 x 11 = 11,33 g.

5 - EXEMPLIFICAÇÃO DO CÁLCULO DE ALGUNS RESULTADOS.

Na Tabela I estão expostos os resultados da determinação do teor de

lipídios em duplicata, de CMS, FCO e polvilho, realizadas pelo método de Soxhlet.

TABELA 1. Resultados da determinação do teor de lipídios das amostras de

alimentos.

Produto P. amostra*(g) R. vazio* (g) R. cheio (g) % lipídios

CMS 1 6,2197 146,5091 148,0860 25,35
CMS 2 5,3628 149,9763 151,4063 26,66
FCO 1 5,0127 146,2294 147,1129 17,62
FCO 2 5,0095 148,2877 149,1155 16,52
Polvilho 1 5,0289 147,6386 147,6643 0,51
Polvilho 2 5,0783 147,2448 147,2756 0,61
*P = Peso; R = Reboiller

Observando os resultados obtidos, se comparados com os padrões

estabelecidos pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, temos que
os valores calculados para CMS estão de acordo com o permitido, de no máximo
30% de gordura (BRASIL, 2000). E para FCO (Farinha de Carne e Osso), as
percentagens encontradas também estão conforme o esperado, num índice mínimo
de 10% (BRASIL, 1997). E quanto ao polvilho, apesar de ter sido encontrada alguma
 52
taxa lipídica, para este não existe padrão estabelecido em vigor, pois é um produto
onde não se apresenta gordura significativa em sua composição. Portanto esses
teores irrisórios aparentes analisados podem ser devido a outros compostos
inerentes ao polvilho, como pigmentos e carotenóides por exemplos, nos quais são
expelidos juntamente no extrato etéreo.

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. BLIGH, E. G.; DYER, W. J. A rapid method of total lipid extraction and

purification. Can. J. Biochem. Physiol. v.37, p. 911-917. 1959.

2. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Regulamento

Técnico para Fixação de Identidade e Qualidade de Carne Mecanicamente
Separada (CMS) de Aves, Bovinos e Suínos. Instrução Normativa n° 04 de 31 de
março de 2000.

2. CECCHI, H, M. Fundamentos Teóricos e Práticos em Análise de Alimentos.

editora da Unicamp.

3. FELDMAN, 1967

4. FISHER, H, J, HART, F, L. Analisis Moderno de los alimentos. Ed. Acribia,

Zaragoza 1971.

5. FOLCH, J.; LEES, M.; STANLEY, G. H. S. A simple method for the isolation and
purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. v.226, p.497-509. 1957.

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz: métodos

físicos e químicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo, 1985. 533 p.

6. JOSLYN, M., A. Food science and tecnology: methods in food analysis. New
York: Academic Press Inc, 1979

7. KUMMEROW, F. A. Fats on human nutrition. J. Am. Oil Chemists Soc. v.37, p.

503-509. 1960.

8. MECHAM, D. K.; MOHAMMAD, A. Extraction of lipids from wheat products. Cereal

Chem. v.32, 405-415. 1955.

MERCK. Reactivos,diagnóstica, productos químicos.1992/93. Darmstadt, 1993.

1584p.

9. POMERANZ, Y.; MELOAN, C. E. Food Analysis: Theroy and Parctice.

Connecticut: Avi Publishing Company, Inc., 1978

10. RIISPOA. Ministério da Agricultura. Serviço de Inspeção Federal. Regulamento

da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal. 1997.
 53

11. ROCHA C, SOUSA, C, A, S. Aulas Práticas da Disciplina de Química

Analítica do curso de Engenharia de Alimentos. Universidade Católica de Goiás.

12. TREVELYAN, W. E. Determination of some lipid constituents of baker’s yeast.

J. Inst. Brewing. v.72, p.184-192. 1966.
 54

DETERMINAÇÃO DE ACIDEZ EM ALIMENTOS

1 - INTRODUÇÃO

Os ácidos orgânicos presentes em alimentos influenciam o sabor, odor,

cor, estabilidade e a manutenção de qualidade. A acidez titulável de frutas varia de
0,2 a 0,3% em frutas de baixa acidez como maçãs vermelhas e bananas, 2,0% em
ameixas e acima de 6% em limão. Ácido cítrico pode constituir até 60% dos sólidos
solúveis totais no limão. Os tecidos vegetais, com exceção do tomate, são
consideravelmente mais baixos em acidez, variando de 0,1 % em abóbora a 0,4%
em brócolis. Produtos marinhos, peixes, aves e produtos cárneos são
consideravelmente menores em acidez e o ácido predominante é o ácido láctico. A
acidez total em relação ao conteúdo de açúcar é útil na determinação da maturação
da fruta.
Sua aplicação relaciona-se com determinação do valor nutritivo,
através da manutenção do balanceamento ácido-base no organismo, indicador de
pureza e qualidade em produtos fermentados, como vinhos, como indicador de
deterioração por bactérias com produção de ácido, indicador de deterioração de
óleos e gorduras pela presença de ácidos graxos livres provenientes da hidrólise dos
glicerídeos, na caracterização dos ácidos graxos presentes e na avaliação da
estabilidade do alimento/deterioração, pois produtos mais ácidos são naturalmente
mais estáveis quanto à deterioração.
A acidez pode ser proveniente de compostos naturais dos alimentos ou
formados ou adicionados durante o processamento. Estes compostos também
podem ser resultado de deterioração do alimento.
Os principais ácidos orgânicos que são encontrados em alimentos são:
cítrico, málico, oxálico, succínico e tartárico. Existem outros menos conhecidos, mas
de igual importância, que são: isocítrico, fumárico, oxalacético e cetoglutárico.
O ácido cítrico é o principal constituinte de várias frutas como: limão,
laranja, figo, pêssego, pêra, abacaxi, morango e tomate. O ácido málico é
predominante em maçã, alface, brócolis e espinafre. O ácido tartárico foi encontrado
somente em uvas e tamarindo. A proporção relativa de ácidos orgânicos presentes
em frutas e vegetais varia com o grau de maturação e condições de crescimento.
Por exemplo, o ácido málico predomina na uva verde e diminui de concentração na
 55
uva madura, enquanto o conteúdo de ácido tartárico aumenta inicialmente como
ácido livre e mais tarde como tartarato ácido de potássio.
A acidez total representa os teores de dióxido de carbono livre, ácidos
minerais e orgânicos e, ainda, sais de ácidos fortes, os quais por dissociação liberam
íons hidrogênio para a solução. Pode ser dividida em acidez orgânica, pela presença
de CO2, e a acidez mineral, devido a ácidos orgânicos e minerais oriundos de
resíduos industriais
Os métodos mais utilizados na análise de acidez de alimentos são:
1- Acidez total titulável, através da utilização de um indicador ou através da
utilização de um Phmetro, em amostras coloridas;
2- Acidez volátil, feita por evaporação (em banho-maria), destilação direta e
destilação a vapor.
Existem algumas substâncias interferentes na titulação dos ácidos
orgânicos, como, por exemplo, a presença de CO2 em bebidas carbonatadas. O
CO2 pode aumentar o valor da acidez dos ácidos orgânicos, pois ele forma ácido
carbônico em meio ácido. Sua eliminação antes da titulação da amostra é importante
e pode ser feita de várias maneiras, tais como: por agitação, por aquecimento ou por
adição de água quente.
O conteúdo em acidez volátil pode ser determinado pela separação dos
ácidos voláteis presentes, principalmente ácidos acético e traços de ácido fórmico. A
determinação é feita por titulação do destilado ou do resíduo, com uma base padrão
até o ponto final, usando fenolftaleína como indicador.
A separação dos ácidos voláteis pode ser feita por evaporação, destilação
direta e destilação a vapor. Utilizando-se o método de evaporação, observa-se um
sério inconveniente, que é a perda de ácidos menos voláteis, como o ácido láctico,
juntamente com os ácidos voláteis.
Em cerveja e vinho, a acidez volátil indica se a fermentação ocorrida é a
desejada e ainda demonstra a necessidade de adição de SO2 ou pasteurização (ou
ambos), quando a acidez volátil é muito alta.
Às vezes é necessário, além da determinação quantitativa, uma
determinação qualitativa. Antes do aparecimento de métodos cromatográficos, a
análise qualitativa dos ácidos orgânicos era trabalhosa e demorada. A partir de
1955, com o aparecimento das modernas técnicas cromatográficas, como camada
delgada, troca iônica, gasosa e líquida de alta eficiência, a identificação dos ácidos
orgânicos foi facilmente realizada após a separação cromatográfica.
 56
Esses e outros métodos de determinação de acidez serão discutidos
de foma mais detalhada no decorrer deste trabalho.

2. Revisão de Literatura

2.1. Análise Volumétrica

A análise volumétrica consiste, essencialmente, em determinar o volume

de uma solução de concentração exatamente conhecida, o qual é requerido para
reagir quantitativamente com a solução da substância a ser determinada. Aquela
solução de concentração exatamente conhecida é denominada “solução padrão”.
Se o reagente é conseguido em estado puro, uma solução de definida
concentração é preparada simplesmente pela pesagem e dissolução do mesmo, em
um solvente, usualmente água, e levando-se a solução a um volume conhecido.
A análise volumétrica é conduzida e maneira que a adição da solução
padrão à solução contendo o constituinte possa ser interrompida ao verificar-se que
todo o constituinte acabou de reagir. A partir do volume da solução padrão gasto na
operação é, então , calculado o peso do constituinte. Cuidados especiais devem ser
considerados no preparo de solução padrão, uma vez que qualquer erro na
determinação do título de uma solução padrão aparecerá em todas as análises que
se seguirem.

2.2. O ponto final de titulação

O ponto final da titulação é denominado “ponto de equivalência”. Este

ponto poderá ser detectado por algum sinal, evidente aos olhos, produzido pela
própria solução padrão, como por exemplo mudança de coloração ou, mais
comumente, pela adição de um indicador. A titulação ideal é aquela em que a
viragem do indicador coincida com o fim teórico. Na prática, contudo, uma pequena
diferença ocorrerá usualmente, o que representa o “erro da titulação”.
 57
Devemos sempre procurar um indicador e condições experimentais
adequadas, para que a diferença entre o fim visível e o fim dado pelo ponto de
equivalência seja o menor possível. Em titulações potenciométricas, essa diferença
é bastante reduzida.
Para análises volumétricas uma reação deve satisfazer às seguintes
condições:
• Simples, do modo que possa ser expressa por uma equação
condições:
• A substância a ser determinada deve reagir completamente com
o reagente de maneira estequiométrica.
• A reação deve ser praticamente instantânea ou se processar
com grande rapidez, a maioria das reações iônicas satisfazem a esta condição.
• Deverá ocorrer uma mudança em alguma propriedade física ou
química da solução no ponto de equivalência.

2.3. Teoria da titulação ácido-base

Uma reação entre uma solução alcalina e uma solução padrão de um

ácido, ou vice-versa, é a determinação da quantidade do ácido quimicamente
equivalente da base presente. O ponto onde ocorre a reação total, que culmina com
a formação de um sal, mais água, é chamado “ponto de equivalência”, “ponto
estequiométrico” ou “ponto final teórico”. Se as soluções ácida e alcalina são de
eletrólitos fortes, como o HCl e o NaOH, por exemplo, a solução resultante deverá
ser neutra, com pH próximo a 7.0 daí o termo “reação de neutralização”.

HCl + NaOH ↔ NaOH + H 2O

Por outro lado, se o ácido ou a base é um eletrólito fraco, o sal será

hidrolizado a um certo grau, e a solução do ponto de equivalência será levemente
alcalina ou levemente ácida. O pH exato da solução neste ponto poderá ser
determinado com base na constante de ionização do ácido ou da base fraca, e na
 58
concentração da solução. Por exemplo, na reação entre hidróxido de sódio e ácido
acético o ponto de equivalência situará na região alcalina, devido à seguinte
hidrólise:

HoAc + NaOH ↔ NaOH + H 2O

HOH ↓↑
HoAc + OH −

Sendo o ácido acético um ácido fraco, uma parte permanecerá não

ionizada (HOAC) o que resulta em valores de pH acima de 7 devido a presença de
hidroxilas (OH-).
A escolha do indicador ideal depende, entre outras coisas, da faixa do pH
e do desenvolvimento da cor característica, e deve ser feita rigorosamente de modo
a permitir um menor erro de titulação.
O Quadro 1 contém uma lista dos indicadores comumente utilizados em
análises titulométricas e em determinações colorimétricas do pH.
Algumas vezes para facilitar a observação da mudança visual de cor,
utiliza-se artifícios como da inclusão de um corante junto ao indicador. O exemplo
disto é a utilização do indicador vermelho de metila com adição de azul de metileno.
A viragem do vermelho de metila, é de vermelho para amarelo, transição difícil de
observar . A presença de azul de metileno forma um fundo azul onde a mudança de
cor ocorrerá do vermelho para verde.
As mudanças de cor de um indicador são provocadas mudanças em sua
estrutura química. Isto pode ser observado nas modificações sofridas pela
fenoltaléina, quando em meio alcalino. O Quadro 1 contém os dados relativos aos
diversos indicadores e suas respectivas faixas de viragem de cor.
 59

Quadro 1 – Mudanças de Cor e Faixa de pH de alguns indicadores.

Indicador Nome Químico Faixa de pH Cor em solução PK
Ácida Alcalina ino
Vermelho Cresol Cresolsulfonoftaleína 0.2→1.8 Vermelho Amarelo -
Azul de timol Timol-sulfonaftaleína 1.2→2.8 Vermelho Amarelo 1.7
Tetrabromofeno-
Azul de bromotimol 3.0→4.6 Amarelo Azul 4.1
sulfonoftaleína
Amarelo de Metila Dimetilamina-azobenzeno 2.9→4.0 Vermelho Amarelo 3.3
Dimetilamina-
Alaranjado de
azobenzenofulfonato de 3.1→4.4 Vermelho Alaranjado 3.7
Metila
sódio
Verde de Tetrabromo-m-
3.8→5.4 Amarelo Azul -
Bromocresol cresolsulfonaftaleína
O-Carboxibenzenoazo-
Vermelho de Metila 4.2→6.3 Vermelho Amarelo 5.0
dimetilamilina
Vermelho de Dibromofenol-
5.2→6.8 Amarelo Vermelho -
Bromofenol sulfonoftaleína
Azul de Bromotimol Dibromotimol-sulfonoftaleína 6.0→7.6 Amarelo Azul 7.1
Azul de Timol Timol-sulfonaftaleína 8.0→9.6 Amarelo Azul 8.9
O-cresolftaleína Di-O-cresolftaleína 8.2→9.8 Incolor Vermelho -
Fenolftaleína Fenolftaleína 8.3→10.0 Incolor Vermelho 9.6
Timolftaleína Timolftaleína 8.3→10.5 Incolor Azul 9.3
Amarelo de Ácido-p-nitrobenzeno- Vermelho
10.1→12.0 Amarelo -
Alizarina R. azosalicílico Alaranjado

2.4. Indicadores Ácido-Base Naturais.

Extratos de furtas que contém antocianinas em sua composição podem

ser titulados através de observação da propriedade de mudança de coloração que
possuem estes pigmentos.
Essa propriedade pode ser utilizada na estimativa de coloração e a faixa
de pH em que ocorre esta mudança durante a determinação da acidez de diferentes
frutos, ocasionada pela presença dos indicadores naturais.
 60
Quadro 2 – Mudança Natural de cor e faixa de pH de alguns frutos
Frutos Mudanças de cor Faixa de pH
Maçã Vermelho para verde-amarelado 6.2→ 7.2
Amora/ Cereja Vermelho para púrpura-azulado 6.0→7.2
Uva Vermelho para Púrpura 5.0→6.5
Ameixa Vermelho para verde-amarelado 6.2→7.2
Morango Vermelho para verde-amarelado 6.2→7.2

2.5. Determinação de Acidez em Alimentos

A acidez em alimentos pode ser estimada facilmente , através da titulação

de amostras devidamente preparadas com soluções de hidróxido de sódio
padronizadas.
Para a determinação titulométrica da acidez, existem dois métodos
básicos; Acidez total titulável e Acidez volátil. Os resultados são sempre expressos
em termos do ácido predominante no alimento que está sendo analisado.

Acidez Total Titulável

O procedimento usual de determinação de acidez total consiste na

titulação de uma alíquota da amostra por uma base forte de concentração
conhecida. O final da titulação é determinado por um indicador ou pelo uso de um
pHmetro.
Fenolfateína é o indicador mais recomendado. Quando se faz uso do
pHmetro, o ponto final também é entre pH 8 e 10, dependendo do ácido
predominante no material em análise. Algumas vezes, o uso de indicadores é
inconveniente, devido ã presença de pigmentos, principalmente antocianinas. Estes
pigmentos mudam de cor com a alteração do pH. Neste caso, a melhor opção é o
uso do pHmetro, uma vez que, conhecendo o ácido predominante e o valor do pKa ,
pode-se calcular o pH final da titulação.
A acidez total é determinada em diversos alimentos, tais como
refrigerantes, sucos, vinhos, farinhas, leite, creme, iogurtes etc. A seguir , veremos
 61
alguns procedimentos práticos para determinação da acidez titulável nestes
alimentos.

Acidez total em Farinhas

É importante, nesta determinação, ter o material finamente moído e

homogêneo. No caso de farinhas compostas, deve-se reduzir todo o produto a pó
bem fino, para melhor representar o sistema, favorecer a difusão das substâncias
tituláveis, resultando em melhores exatidão e precisão da determinação.
Este índice representa o estado de conservação das farinhas envolvendo
tanto aspectos químicos como microbiológicos, pois o crescimento microbiano
envolve produção de ácidos orgânicos e hidrólise de proteínas e carboidratos.

Acidez álcool-solúvel

Para extração dos ácidos presentes, por exemplo, em uma farinha é

necessário o contato desta com um solvente por muitas horas. Se este for a água
haverá, por certo , fermentação o que resultará na produção de ácido,
superestimando a acidez real da farinha. O uso de álcool etílico inibe o
desenvolvimento de microrganismos, resultando assim em níveis de acidez mais
confiáveis. Tanto na acidez álcool e aquo solúvel os resultados são expressos em
mililitros de solução normal por cento.

Calcular o índice de acidez pela equação:

VxNxf
x100 = ml de sol. N%
P

N = concentração da solução de hidróxido de sódio.

f = fator de correção da solução
P = peso da amostra.
 62
Sendo a solução de hidróxido de sódio 0.01 N, a equação acima se torna:
Vxf
ml de sol. N% =
P
Se a solução de hidróxido de sódio for 0.05 N, tem-se
ml de sol N% = Vxf

Acidez aquo-solúvel

Pesar 1 g da amostra e transferir para um erlenmeyer de 125 ml . Agitar

por 2 horas e adicionar 2-3 gotas de fenolftalína. Titular com solução de NaOH 0.01
N ou 0.05N até viragem do indicador. Deve-se Ter uma idéia inicial do grau de
acidez da amostra, para que se possa escolher a concentração ideal do hidróxido de
sódio. Em caso de gastar menos de 5 ml da soluÇào titulante, repetir a determinação
utilizando uma solução de hidróxido de sódio de menor concentração. Caso haja
pigmentos no material, deve-se usar um pHmetro, adicionando-se a solução titulante
até pH 8.0.
A resolução 12/78 de 30/03/78 da antiga Comissão Nacional de Normas e
Padrões para Alimentos de Ministério da Saúde estabeleceu os seguintes limites
para acidez em farinhas.
Quadro 3 – Valores Máximos de Acidez em Farinhas.
Tipo de Farinha Acidez (ml sol. N%)
Amendoin 3.0
Arroz 3.0
Fubá 5.0
Mandioca 2.0
Milho 2.0
Soja desengordurada 2.0
Soja parcialmente
2.0
desengordurada
Farinha de trigo especial 2.0
Farinha de trigo comum 3.0
Farinha de trigo integral 4.0
Sêmola 2.0
 63

Acidez total em refrigerantes.

As amostras de refrigerantes deverão ser diluídas, e todo o dióxido de

carbono (CO2) eliminado, a fim de que não haja interferência.

Procedimento.

Medira 10 ml do refrigerantes em uma pipeta, colocar em um balão de

100 ml e completar o volume. Transferir a solução para um erlenmeyer de 125 ml .
Agitar bastante a solução, com ligeiro aquecimento em banho-maria, a fim de
eliminar o CO2 presente. Retirar uma alíquota de 25 ml, adicionar algumas gotas de
fenolftaleína, e titular com solução de NaOH 0.1 N padronizada, até coloração
levemente rósea.
Para refrigerantes, do tipo cola a acidez é expressa em percentagem de
ácido fosfórico (H3PO4, PM = 98) , predominante neste tipo de alimento. Outros são
tipicamente ácido cítrico ou ácido tartárico.

Cálculos

Como o ácido em questão e a base reagem estequiometricamente,

podemos aplicar o princípio da equivalência, ou seja:
Miliequivalentes de ácido fosfórico = miliequivalentes de hidróxido de
sódio
mg
= VxNxf
PE

mg de ácido fosfórico = V x N x f x PE do ácido fosfórico

mgH 3 PO4 VxNxfxPE ( H 3 PO4 )
Teor de ácido fosfórico (%) = x100 = x100
Vamostra Vamostra
100 100
Logo, % H3PO4 = V x N x f x PE x x
10 25
Onde, V, N e f são, respectivamente, o volume (ml), a normalidade e o
fator da solução de NaOH padronizada e , PE, o peso equivalente do ácido fosfórico.
Convém salientar que, no ponto final de titulação com fenolftaleína
ocorreu a neutralização de apenas dois H+ e, portanto, o peso equivalente do ácido
fosfórico será igual ao seu peso molecular dividido por dois. Os fatores 100/10
 64
correspondem à primeira diluição de 10 ml do refrigerante para 100 ml e da alíquota
de 10 ml retirada do balão de 100 ml.

Acidez Total em Sucos

As amostras de suco devem ser diluídas de modo análogo ao

procedimento anterior, utilizando alíquotas de 10 ml. Os sucos de maracujá e limão
têm teores mais elevados de ácidos, por isto podem ser diluídos mais 10 vezes, isto
é , retirar 10 ml do suco diluído e completar para 100 ml em balão volumétrico. Levar
esta diluição em consideração nos cálculos . Multiplicar por 100/10.
A acidez, expressa em % acidez deverá ser calculada de modo análogo
ao anterior. No entanto, como os sucos são provenientes de frutos diferentes, cada
tipo deverá Ter seu próprio ácido predominante, tais como os apresentados no
Quadro 4.

Quadro 4 – Principais ácidos predominantes em alguns sucos de frutas

Sucos Ácido Predominante – Peso Equivalente
Laranja Cítrico (PM = 192.2) – PM/3
Limão Cítrico
Maçã Málico – (PM = 134.1) – PM/2
Maracujá Cítrico
Tomate Cítrico
Uva Tartárico – (PM = 150.1) – PM/2

Acidez em Vinhos

A acidez dos vinhos é proveniente dos ácidos presentes, naturalmente,

nos furtos, por exemplo, ácido tartárico em uvas, e de contaminações de mosto
durante a fermentação. Estas contaminações resultam tipicamente na produção de
ácido acético no vinho.
Para separar a acidez natural da indesejável deve-se proceder uma
destilação por arraste e vapor do vinho.
 65
Para determinar a acidez total dos vinhos deve-se tomar uma alíquota de
10 ml, diluir com água (± 100 ml) e titular com uma solução NaOH 0.1 N
padronizada..
Para determinar a acidez volátil, transferir para o balão de destilação 100
ml da amostra. Proceder a destilação por arraste de vapor, recolhendo o mesmo
volume de amostra do destilado. Adicionar gotas de fenolftaleína e titular com NaOH
0.1N.
1000
Meq de ácido acético / litro de vinho = VNaOH xNxf
100
A portaria nº 410 do Ministério da Agricultura (Diário Oficial da União de
08/10/1974) estabelece a faixa de 50 a 130 meq/l para acidez total e máximo de 20
meq/l para acidez volátil em vinhos de frutas.
As provas de álcool e do alizarol constituem processos rápidos
conduzidos na plataforma dos laticínios, e dão uma idéia aproximada da acidez do
leite.

Determinação de Acidez total no Leite

A acidez do leite é bastante variável, sendo maior em leites com teores

mais elevados de extrato seco desengordurado, refletindo no poder tampão do
produto, no intervalo comprometido entre o pH da amostra de viragem da
fenoltaléina.
A acidez titulável do leite varia de acordo com o seu teor sais minerais,
proteínas , com o volume do indicador adicionado e com a tonalidade adotada como
ponto de viragem de indicador.
O leite , ao sair do úbere, apresenta-se ligeiramente ácido, devido em
parte a alguns de seus componentes , tais como proteínas, fosfato, citratos, CO2,
etc, e em parte à reação interna que ocorre durante a titulação com solução alcalina
até a viragem do indicador. Esta acidez ligeira, normalmente compreendida entre 15
e 20º Dornic ou 0.15 e 0.20 g de ácido láctico por 100 ml de leite, é denominada
“acidez titulável inicial ou natural”.
Da ordenha ao consumo ocorre um tendência de aumento da acidez,
proveniente do desdobramento da lactose em ácidos, dos quais o mais importante é
ácido lático provocado pela multiplicação das bactérias no leite. Este aumento de
acidez denomina-se “acidez titulável adquirida”.
 66
1
Para avaliação da acidez pode-se utilizar NaOH 0.1N ou 0.1111= N,
9
este último já levando em consideração ao peso equivalente do ácido lático que é
90.

Expressão dos resultados.

100 1
Acidez em % p/v de ácido lático = Vxfx90x x
10 1000

Acidez em Graus Dornic (ºD) = V1 x 10 ou acidez em % p/V x 100.

Onde V é o volume (ml) de NaOH 0.1N e
V1 e o de 0.1111 N necessários para neutralizar 10 ml de leite.
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas, para
uma mesma amostra, não deve exceder 0.3 ºD.
No leite fresco há pouco ácido lático. A acidez em leite fresco varia de
0.12 a 0.23%. De modo geral, a acidez aumenta com o teor de sólidos não
gordurosos (SNG) do leite. Quando o teor de gordura é elevado, a acidez do leite
também se eleva sensivelmente, por causa do conteúdo de SNG que acompanham.
A contribuição destes componentes no Quadro 5, abaixo na acidez do
leite fresco são:

Quadro 5 – Componentes que contribuem para acidez do leite.

Componentes %
Caseína 0.05
Albumina (proteínas do soro) 0.01
CO2 0.01-0.02
Citratos 0.01
Fosfatos 0.06-0.12

2.6. ACIDEZ VOLÁTIL

O conteúdo em acidez volátil pode ser determinado pela separação dos

ácidos voláteis presentes, principalmente ácidos acético e traços de ácido fórmico. A
determinação é feita por titulação do destilado ou do resíduo, com uma base padrão
 67
até o ponto final, usando fenolftaleína como indicador. A separação dos ácidos
voláteis pode ser feita por evaporação, destilação direta e destilação a vapor.

Evaporação em banho-maria

É o método mais simples, onde a amostra é titulada antes (acidez total)

e após a evaporação (acidez não volátil ou fixa), e por diferença entre as titulações
tem-se a % de acidez volátil (acidez volátil = acidez total - acidez fixa). Porém esta
determinação tem um sério inconveniente, que é a perda de ácidos menos voláteis,
como o ácido láctico, juntamente com os ácidos voláteis.

Destilação direta

A amostra é aquecida diretamente e o destilado recolhido será titulado

com uma base padronizada, e fenolftaleína como indicador.

Destilação a vapor

É o método mais utilizado para produtos fermentados. Existem vários

tipos de equipamentos de destilação, como, por exemplo, o destilador de Kjehldal.
Os resultados obtidos por destilação são muito discordantes pelo mesmo motivo das
perdas ocorridas no método por evaporação. Em cerveja e vinho, a acidez volátil
indica se a fermentação ocorrida é a desejada e ainda demonstra a necessidade de
adição de SO2 ou pasteurização (ou ambos), quando a acidez volátil é muito alta.

4. MATERIAIS E MÉTODOS UTILIZADOS

MÉTODOS QUANTITATIVOS
Os métodos de determinação da acidez podem ser os que avaliam a
acidez titulável ou fornecem a concentração de íons de hidrogênios livres, por meio
do pH. Os métodos que avaliam a acidez titulável resumem-se em titular com
 68
soluções de álcali-padrão a cidez do produto ou de soluções aquosas ou alcoólicas
do produto e , certos casos, os ácidos graxos obtidos dos lipídeos. Pode ser
expressa em mL de solução normal por cento ou em gramas do componente ácido
principal. Os Processos que avaliam o pH são colorimétricos ou eletrométricos, Os
primeiros usam certos indicadores, que produzem ou alteram sua coloração em
determinadas concentrações de íons de hidrogênio. São processos de aplicação
limitada, pois as medidas são aproximadas e não se aplicam às soluções
intensamente coradas ou turvas, bem como às soluções coloidais, que podem
absorver o indicador, falseando os resultados. Nos processos eletrométricos
empregam-se aparelhos que são potenciômetros especialmente adaptados e
permitem uma determinação direta, simples e precisa do pH (INSTITUTO ADOLFO
LUTZ, 1985).
Os produtos a serem analisados incluem: vinho, refrigerante, leite,
iogurte (bebida láctea) e farinha de carne e osso (FCO).

4.1 Princípio
Fundamenta-se na neutralização dos íons hidrogênio livres, até o ponto de
equivalência, pelo hidróxido de sódio na presença do indicador fenolftaleína.

4.2 Reagentes
Álcool etílico (C2H5OH) a 95% (v/v) neutralizado a pH 7;
Solução alcoólica de fenolftaleína (C20H14O4) a 1% (p/v);
Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,1 N.

4.3 Procedimento

Titular a amostra previamente preparada (itens 4.3.1 a 4.3.5) com solução

de hidróxido de sódio 0,1 N usando solução alcoólica de fenolftaleína a 1% como
indicador. Ponto de viragem: aparecimento de leve coloração rósea persistente por
30 segundos, exceto no vinho (roxo-violeta).
O vinho e a bebida láctea são realizados através do método
potenciométrico, ou seja, pela aferição do pH a 8,3. E o restante dos produtos, pelo
método titulável.
 69
4.3.1. Vinho:
Transferir com o auxílio da pipeta, 10 mL da amostra para um Erlenmeyer de 250
mL. Adicionar 20 mL de água e 2 mL de indicador fenolftaleína. Titular com solução
de hidróxido de sódio 0,1 N até coloração roxo-violeta, quando se atinge no
potenciômetro pH 8,3.

4.3.2. Refrigerante:
Pipetar 10 mL da amostra em um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Adicionar 100 mL
de água. Agitar freqüentemente durante 15 minutos para eliminar o dióxido de
carbono. Adicionar 2 gotas de indicador, e titular com a solução de hidróxido de
sódio 0,1 N até coloração rósea persistente.

4.3.3. Leite:
Tranferir, com o auxílio da pipeta, 10 mL da amostra para um béquer de 100 mL.
Adicionar 5 gotas de fenolftaleína. Titular com solução de hidróxido de sódio 0,1 N
até coloração rósea tênue.

4.3.4. Bebida Láctea:

Pesar 5 g da amostra em um erlenmeyer de 250 mL. Adicionar 50 mL de água e 2
mL de fenolftaleína. Titular com solução de hidróxido de sódio 0,1 N até coloração
rósea, quando se atinge no potenciômetro pH 8,3.
4.3.5. Farinha de carne e osso:
Pesar 5 g da amostra em um erlenmeyer de 250 mL. Adicionar 50 mL de álcool
neutral. Deixar em repouso por 15 minutos e filtrar em filtro seco. Após, transferir
com uma pipeta, 20 mL do filtrado para um erlenmeyer de 250 mL. Adicionar 2 gotas
de indicador fenolftaleína e titular com solução de hidróxido de sódio 0,1 N até
coloração rósea.

4.4. Cálculos

4.1. Acidez em solução alcalina normal

Fórmula = V x fc x 10
V’ ou P
 70
Onde:
V = mililitros de solução de hidróxido de sódio gastos na titulação;
V’ = mililitros da amostra utilizada (vinho e refrigerante – 10 mL);
P = massa da amostra em gramas (FCO – 5 g);
fc = fator de correção da solução de hidróxido de sódio 0,1 N;

4.2. Acidez em ácido láctico

Fórmula = V x fc x 0,9
V’ ou P
Onde:
V = mililitros de solução de hidróxido de sódio gastos na titulação;
V’ = mililitros da amostra utilizada (leite – 10 mL);
P = massa da amostra em gramas (no caso da bebida láctea 5 g);
f c= fator da solução de hidróxido de sódio 0,1 N (1,03419696);
0,9 = fator de conversão do ácido láctico.

5. EXEMPLIFICAÇÃO DO CÁLCULO DE ALGUNS RESULTADOS.

A determinação de acidez pode fornecer um dado valioso na apreciação

do estado de conservação de um produto alimentício. Um processo de
decomposição, seja por hidrólise, oxidação ou fermentação, altera quase sempre a
concentração dos íons de hidrogênio (INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 1985).
Na Tabela 1, tem-se os dados e resultados calculados das análises de
acidez, nos quais se seguem abaixo.

TABELA 1. Resultados da determinação de acidez das amostras analisadas.

Produto P¹. amostra(g) V². amostra (mL) V³. gasto (mL) Acidez
Leite ____ 10,0 1,9 0,18 %
Bebida Láctea 5,7790 ____ 4,7 0,76 %
FCO 5,0270 ____ 0,5 1,0286
mEq/100g
Refrigerante ____ 10,0 4,5 0,2978 %
Vinho ____ 10,0 5,7 58,94meq/L
¹P = peso; ²V = volume; ³V. gasto = volume gasto na titulação de NaOH.
 71

As amostras com menores tempos de redutase, ou seja, portadoras de

altas cargas microbianas, apresentaram maiores valores de acidez titulável,
provenientes do desdobramento da lactose em ácidos - principalmente ácido lático -
resultantes da multiplicação da flora bacteriana, comum no leite De acordo com a
Instrução Normativa n° 51 (BRASIL, 2002), onde se e stabelecem os valores padrões
para análises de leite e seus derivados, percebe-se que a taxa de acidez de 0,18%
para o leite está dentro do limite permitido, que é de 0,14 a 0,18%. Isso demonstra o
bom estado de conservação do leite analisado.
A determinação da acidez no leite tem um importante papel como indicador
indireto de fraude. Isto pode ser realizado inclusive pela correlação inversa
encontrada entre as variáveis: acidez x índice crioscópico. Esta correlação pode ser
explicada estequiometricamente, devido ao fato de que os microorganismo, ao
realizarem a fermentação, transformam uma molécula de lactose em 4 moléculas de
ácido lático, aumentando assim a quantidade de partículas dissolvidas e provocando
uma diminuição no valor do índice crioscópico.(FONSECA et al., 1995). Seguindo
esse mesmo raciocínio, pode-se explicar o fato de que valores altos que o permitido
para IC, como ocorre em caso de adição de água ao leite, são acompanhados de
baixos valores de acidez, devido à diluição dos componentes dissolvidos, onde se
inclui o ácido lático. Outro fato freqüentemente observado é o aumento da acidez em
amostras de leite com elevado EST. Em determinadas épocas do ano,
principalmente no período de seca e de frio, a alimentação fornecida ao gado é mais
concentrada em componentes sólidos, resultando num aumento dos valores de EST,
que pode vir acompanhada de um aumento na acidez do leite (RODRIGUES et al.,
1995). No entanto, através dos dados apresentados na Tabela 5, verifica-se que,
neste trabalho, não se constatou correlação relevante entre acidez e EST, estando
os valores, em geral, muito próximos de zero.
Para a farinha de carne e osso (FCO), o valor esperado de acidez
conforme BRASIL (1997), é de no máximo 1,0 mEq/100g de produto. Como o valor
obtido foi de 1,0286, consideramos que ainda está dentro do teor previsto, pois é um
valor muito próximo. Os índices mínimos previstos por lei fundamentam-se
basicamente na premissa de forte correlação entre os níveis de acidez e segurança
alimentar, traduzida nos níveis de contaminação microbiológica. Produtos com
elevado teor de proteínas como o FCO tem elevado risco de contaminação
bacteriana, apesar da umidade relativamente baixa.
 72
Segundo BRASIL, 1998, O refrigerante com a denominação “guaraná”
deve possuir no mínimo 0,1% de acidez expressa em ácido cítrico. A análise da
acidez titulável realizada na amostra de guaraná, apresentou um percentual de
0,2978 g de ácido cítrico/100 ml de refrigerante de guaraná, estando portanto
atendendo à legislação específica.
Já para a bebida láctea (iogurte) e o vinho, há ausência de legislação
específica que regulamenta os padrões de identidade e qualidade para o referido
produto.
Segundo MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E
ABASTECIMENTO. SECRETARIA DE DEFESA AGROPECUÁRIA, portaria nº 55,
de 27 de 2004 o Vinho de mesa é o vinho com graduação alcoólica de 10 a 13%Vol
a 20ºC. A Acidez total em vinhos pode ter um máximo expresso em meq/l
compreendido entre 55 a 130,0. Pode-se observar que a amostra de vinho analisada
apresenta-se dentro das especificações previstas em lei. A determinação do ponto
de viragem de produtos naturalmente coloridos devido à presença de pigmentos
naturais, tornou difícil a visualização do ponto de viragem pela visualização
titulométrica com fenolftaleína. Portanto, a utilização do pH-metro permitiu uma
leitura do ponto de viragem do modo analógico, minimizando o erro de observação
por mudança de cor.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BRASIL. Ministério da Agricultura. Serviço de Inspeção Federal. Regulamento da

Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal - RIISPOA. 1997.

BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Regulamento técnico para

fixação dos padrões de identidade e qualidade para refrigerantes. Portaria nº 544 de
16 de novembro de 1998.

BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Divisão de Inspeção

de Leite e Derivados (DILEI). Programa Nacional de Melhoria da Qualidade do Leite
(PNQL). Regulamento Técnico para Fixação de Identidade e Qualidade do Leite e
seu Transporte no País. Instrução Normativa n° 51 d e 18 de setembro de 2002.

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz: métodos

físicos e químicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo, 1985. 533 p.

FONSECA, L. M: RODRIGUES, R; SOUZA, M.R. Índice crioscópico do leite. Cad.

Téc.Esc. Vet. UFMG, n. 13, p. 73
 73

RODRIGUES, R.: FONSECA L.M.; SOUZA, M.R. Acidez do leite, CAD. Téc. Esc.
Vet. UFMG. N. 13, P. 63 - 72, 1995.
 74

DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO (PROTEÍNAS)

INTRODUÇÃO

As proteínas são polímeros de alto peso molecular cujas unidades

básicas são os aminoácidos, ligados entre si por ligações peptídicas.
As proteínas são os maiores constituintes de toda célula, são
componentes essenciais às atividades vitais e podem atuar como catalisadores de
reações (enzimas), são necessárias nas reações imunológicas e indispensáveis para
o crescimento e reprodução.
Uma proteína é constituída de carbono (50 a 55%), hidrogênio (6 a
8%), oxigênio (20 a 24%), nitrogênio (15 a 18%), enxofre (0,2 a 0,3%) e fósforo.
O valor médio de proteína nos alimentos de origem animal é: leite
integral 3,5%, carne assada 25%, ovo 13%, nos alimentos de origem vegetal a
porcentagem de proteínas é: arroz 7,5 – 9,0%, farinha de trigo 9,8 - 13,5%, milho 7,0
– 9,4, soja 33 – 42% e batata 10 – 13%.
Os métodos para identificação de proteína nos alimentos baseiam-se
na determinação de um elemento (carbono ou nitrogênio) ou de um grupo
(aminoácidos e ligações peptídicas) pertencente à proteína. Sendo que o teor de
proteínas é obtido através de fatores porque se dosa os elementos químicos.
As análises elementares como a análise de carbono possui como
vantagem à digestão mais fácil e o fator de correção mais constante do que para o
nitrogênio, possui menores erros nos resultados, devido a maior concentração na
amostra e como desvantagens, uma maior dificuldade em separar os carbonos
pertencentes à proteína dos carbonos de outros compostos. A análise de nitrogênio
é a mais utilizada, considera-se que as proteínas têm 16% de nitrogênio em média,
obtendo fator geral de 6,25.
Para o MAPA, a proteína bruta (macro) baseia-se na transformação do
nitrogênio da amostra em sulfato de amônio por digestão ácida, e em nitrogênio
amoniacal por destilação em meio alcalino, aplicando-se em amostras nitrogenadas
de origem orgânica e inorgânica, com exceção de nitratos e nitritos (BRASIL, 1991).
A proteína bruta (semi-micro) baseia-se na transformação do nitrogênio
da amostra em sulfato de amônio, por digestão ácida, e em nitrogênio amoniacal por
 75
destilação em meio alcalino, aplica-se em amostra de nitrogenadas de origem
orgânica e inorgânica, com exceção de nitratos e nitritos ((BRASIL, 1991).
A digestibilidade em pepsina 0,2% fundamenta-se na digestão da amostra
por ação da pepsina, aplica-se em produtos ou subprodutos protéicos de origem
(BRASIL, 1991).
A proteína digestível em pepsina 0,2% fundamenta-se na determinação
indireta da fração nitrogenada da amostra digerida por ação da pepsina, aplica-se a
produtos e subprodutos protéicos de origem animal (BRASIL, 1991).
A proteína solúvel em KOH baseia-se na extração e determinação da
fração nitrogenada da amostra, solúvel em solução de KOH de concentração
conhecida, aplica-se a grãos de oleaginosas e seus derivados (BRASIL, 1991).
O método KJELDAHL (1883) (AOAC,1984) é o método-padrão de
determinação do teor de nitrogênio orgânico total (protéico e não-protéico). Isto é,
em proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos, sais de amônio, etc. As etapas do
método de análise se dividem em três passos básicos: digestão da amostra onde a
decomposição da matéria orgânica da amostra é realizada por ácido sulfúrico
concentrado, a quente, com o auxílio de um catalisador, destilação da amônia em
uma solução receptora e quantificação da amônia por titulação com uma solução
padrão.
O método de DUMAS (1831) determina o nitrogênio total. Baseia-se na
combustão completa da amostra a 700-8000C, catalisada por óxido de cobre. O
nitrogênio liberado é medido volumetricamente.
O método por BIURETO (1914) é baseado na observação de que
substâncias contendo duas ou mais ligações peptídicas formam um complexo de cor
roxa com sais de cobre em soluções alcalinas. O complexo formado é medido em
um colorímetro.
O método por FENOL (1912), baseado na interação das proteínas com
o fenol e cobre em meio alcalino. O complexo formado é medido em um colorímetro.
O método TURBIDÍMETRO é baseado na turbidez causada pela
proteína precipitada por ácido tricloroacético, fenicianeto de potássio e ácido
sulforalisílico.
O método de WARRENTRAPP e WILL (1841) é baseado no
aquecimento da amostra, misturada com Na2 CO3. A amônia liberada é recolhida em
ácido cloroplatínico. O cloroplatinato de amônio é seco e pesado.
 76
OBJETIVOS

Considerando os aspectos mencionados, a aula teve como objetivo

determinar o teor de proteína em amostras de alimentos, utilizando o método de
referência para a determinação do teor de proteína total denominado método de
KJELDHAL, além de discutir os métodos utilizados em aula e outros métodos
existentes para a determinação deste parâmetro.

REVISÃO DE LITERATURA

As proteínas são compostas de aminoácidos e têm a função de reparar os

tecidos, participam no equilíbrio entre os fluidos do corpo, de acordo com sua
estrutura molecular, tem uma função biológica associada às atividades vitais. São
encontradas em carnes vermelhas, frangos, peixes, ovos, leites e derivados, entre
outros.

Nos alimentos, além da função nutricional, as proteínas têm propriedades

organolépticas e de textura. Podem vir combinadas com lipídeos e carboidratos.

O procedimento mais comum para determinação de proteína é através da

determinação de um elemento ou um grupo pertencente à proteína. A conversão
para conteúdo de proteína é feito através de um fator. Os elementos analisados
geralmente são carbono ou nitrogênio, e os grupos são aminoácidos e ligações
peptídicas.

Análises Elementares

Análise de carbono
· A digestão é mais fácil do que para o nitrogênio;
· Possibilidades menores de erros no resultado, por causa da maior quantidade
em relação ao nitrogênio;
· Fator de correção é mais constante do que para o nitrogênio;
· Maior dificuldade em separar os carbonos pertencentes à proteína dos carbonos
de outros componentes.

Análise de nitrogênio

· É a determinação mais utilizada;

· Considera que as proteínas têm 16% de nitrogênio em média - vai depender do
tipo de proteína;
 77
· Fator geral na transformação de nitrogênio para proteína é de 6,25.

16g N→ 100g proteínas

n g N→ x g proteínas
x= n. 100 = n. 6,25 g proteínas
16
Este fator de conversão dá erros quando o conteúdo em N de um
alimento é muito diferente de 16%. Nestes casos, existem os fatores de conversão
específicos para cada alimento, como por exemplo:

- trigo: 5,70;

- leite: 6,38;

- gelatina: 5,55.

Determinação de Proteína pelo Método Kjeldahl

Histórico

Em 1883 o então diretor da seção de química do laboratório Carlsberg,

em Copenhagen, (no período de maio de 1875 a julho de 1900), J.K.T. Kjeldahl,
após dois anos de intensos trabalhos, desenvolveu o mais seguro método para
determinação de nitrogênio, divulgado com amplo sucesso na época. O referido
trabalho foi entitulado "En Ny Methode til Kvaelstofbestem Melse i Organiske
Stoffer", na oportunidade publicado no Danish Journal Medelelser Fra Carlsberg
Laboratoriet. Kjeldahl descreveu na época que aquecera suas amostras, proteínas
de grãos utilizadas na indústria de fermentação, em presença de ácido sulfúrico
fumegante, até a obtenção de uma solução clara. Descreveu ainda que a completa
digestão foi conseguida com a adição de Permanganato de potássio em pó. A
solução digerida teria sido então diluída em presença de base forte e os vapores de
amônia produzidos foram condensados e conduzidos por arraste de vapor a um
tubo contendo padrão ácido de iodeto de potássio de volume conhecido. Após a
destilação, por meio de iodometria, determinou a quantidade de nitrogênio presente
nas amostras analisadas, titulando o iodo liberado com uma solução padrão de
tiossulfato de sódio LILLEVIK (1970).
Com o passar dos anos a iodometria caiu em desuso, devido a inúmeras
desvantagens, inclusive pela sua menor sensibilidade em comparação a outras
técnicas (SILVA, 1989).
 78
Segundo JEFFERY et. al (1992), nas titulações ditas iodométricas
apresentam duas principais fontes de erros, que são:
A) Perda de iodo em virtude de sua significativa volatilidade.
B) Oxidação do iodeto em soluções ácidas pelo oxigênio atmosférico
representada pela reação a seguir.
 + O2 + 4H +
4I 2 I2 + 2H2O (1)
Em presença de excesso de iodeto, ocorre uma substancial diminuição da
volatilidade, em virtude da formação do íon triiodeto. Numa solução com
concentração de iodeto de pelo menos 4%, a perda de iodo por volatilização é
desprezível, desde que a titulação não se prolonge muito.
Kjeldahl observou no decorrer de seus trabalhos que o permanganato não
reduzia completamente o nitrogênio orgânico sob diversas formas em sais de
amônio.
Wilfarth (1885), citado por LILLEVIK(1970) demonstrou que o uso de
KMnO4 não seria mais necessário por ter descoberto que óxidos metálicos, como os
de: mercúrio, cobre, ferro, etc, aumentavam o ponto de ebulição do ácido sulfúrico e
com isso produzia-se uma maior taxa de conversão de nitrogênio orgânico em
sulfato de amônio.
Em 1955 um comitê composto por A.O.A.C e American Oil Chemists
Society, recomendou a não utilização de cobre, como catalizador em métodos
oficiais. Esta recomendação foi aprovada pela A.O.A.C. 10a ed. (1965) CHANG
(1994).
GUNNING (1889) citado por POMERANZ & MELOAN (1994), introduziu o
uso do sulfato de potássio visando a elevação do ponto de ebulição do ácido
sulfúrico na mistura de digestão. Além disso, propiciou um aumento da taxa de
eliminação de água, o que resultou numa otimização do tempo no processo de
digestão, contribuindo para o aumento da taxa de conversão do nitrogênio a sais de
amônio.
Arnold em 1889, reinvestigou a técnica desenvolvida por Kjeldahl e
aperfeiçoada por Wilfarth, e concluiu que o mercúrio seria um eficiente catalisador do
processo, superior aos outros até então testados. Anos mais tarde Arnold sugeriu
ainda o uso do ácido benzóico e açúcar com o intuito de digerir substâncias
aromáticas de análise mais difícil, adotou ainda o uso da combinação do cobre com
o mercúrio no processo de digestão. Nesta mesma época, A. E. Paul e E. H. Berry,
demonstraram que o uso conjunto de cobre e mercúrio, não resultava em uma
 79
digestão mais rápida do que aquela feita mediante o uso do mercúrio isoladamente
HART & FISCHER, (1971).
SIRIWARDENE (1966), descreveu o uso de automação da técnica de
Kjeldahl na deteminação de nitrogênio em material biológico. Este procedimento
seria capaz de analisar 20 amostras por hora, reduzindo trabalho e mantendo ainda
um alto nível de exatidão e reproducibilidade.
Essencialmente várias contribuições não puderam deixar de ser
incorporadas ao longo do tempo ao método original desenvolvido pelo Dr. Kjeldahl,
objetivando sobre maneira a excelencia do método, Kjeldahl - Wilfarth- Gunning,
descrito por A.O.A.C Methods of Análysis HORWIRTZ (1965).
Os mais recentes avanços no método Kjeldahl envolve melhorias nos
blocos digestores e em analises de fluxo contínuo de amônia em digeridos.
Destacam - se nesta linha de semi-automação equipamentos como o Rapid Still I, II
e III da Lab-conco Corp.. Estes equipamentos são capazes de efetuar digestões em
25-45 min. (450°C), e destilações automáticas de micro ou macro amostras em
cerca de 4 minutos (POMERANZ & MELOAN, 1994).

Princípio do Método KJELDAHL.

Embora sejam hoje conhecidos os regimes, Macro, Semi micro e Micro

Kjeldahl, na determinação de nitrogênio total (NT) e ainda ocorram variações
segundo os reagentes utilizados(método modificado ou oficial), o princípio do
método continua praticamente inalterado.

No método Kjeldahl, ocorre a exposição das proteínas, além outros

compostos nitrogenados não protéicos ao ácido sulfúrico concentrado, que sob
elevadas temperaturas, promove a oxidação destes compostos à sulfato de amônio.
A adição dos chamados "catalisadores", tem por finalidade aumentar a performance
do método, através da otimização da etapa de digestão. O sulfato de amônio
resultante do processo de digestão é então induzido a reagir com uma solução de
NaOH(40% p/v), resultando na liberação de amônia (NH3). A amônia é então
destilada, e por meio de arraste de vapor, é transferida a um erlenmayer contendo
uma solução de ácido bórico (método modificado), onde é então titulada com uma
solução padrão de HCl.
 80
Premissas do método KJELDAHL.

O Método de kjeldahl fundamenta-se em duas premissas básicas. A

primeira é que todo material orgânico nitrogenado é convertido a sulfato de amônio
durante a digestão. A segunda é de que todo nitrogênio presente na amostra,
convertido a sais de amônio durante a etapa de digestão, é de origem protéica
GOMES (1995).

Etapas envolvidas no método

Digestão da Amostra

A ação do ácido sulfúrico e dos catalisadores sob elevadas temperaturas

implica na conversão do nitrogênio presente no material orgânico, à sulfato de
amônio (sistema fechado). Gases como SO2 e CO2 são gradativamente expelidos
durante a digestão ácida da amostra. O ponto final da etapa de digestão pode ser
facilmente identificado pela diminuição acentuada da turbidez da mistura de digestão
(inicialmente escura), tornando-se uma solução clara de tom azul esverdeado
(LILLEVIK, 1970; POMERANZ e MELOAN, 1994; SILVA, 1981).
O material a ser digerido deverá ser pesado e embrulhado em papel
manteiga impermeável sendo então acondicionado no balão de Kjeldahl. Neste
momento faz-se a adição do ácido sulfúrico e dos catalisadores (LILLEVIK, 1970;
FERREIRA e GOMES, 1995).
O processo de digestão requer elevadas temperaturas conseguidas por
intermédio de blocos dotadas de resistências elétricas, onde introduz-se os tubos
Kjeldahl, ou por aquecimento a gás. A primeira opção é a mais utilizada, tendo em
vista a disponibilidade no mercado de equipamentos desenvolvidos com esta
finalidade, estando inclusive disponível nos regimes macro, semi-micro e micro
Kjeldahl
Os aparatus utilizados no processo de digestão permitem a utilização de
sistemas abertos ou fechados. Segundo SILVA (1981) a vantagem do sistema
fechado está na não necessidade do uso de catalizadores. No sistema aberto, faz-se
necessário o uso de exaustores devido à toxicidade dos vapores expelidos durante a
digestão LILEVIK (1970). Este sistema é o mais utilizado e requer o uso de
catalisadores ao contrário do sistema fechado.
 81
Reações Químicas Envolvidas na Etapa de Digestão
Podem ser representadas por (2) etapas ou ainda na forma de equação

H2SO4
Mat. Orgânica SO2 + CO 2 + H 2O + R - NH 2

H2SO4
R - NH 2 + H 2O R - OH + NH 3

O + O
[H ]
R C + H 2O R C + NH 3
NH2 OH

2NH 3 + H 2SO4 (NH 4)2SO4 (2)

H 2SO 4 ; K 2SO 4 ; Na 2SO 4

Amostra (NH 4)2SO 4 + CO 2 + SO 2 + SO 3 + H 2O

(3)

Uso de catalisadores
A performance das reações envolvidas no processo de digestão em
sistemas fechados, estão diretamente relacionadas ao uso dos catalisadores, pelo
simples fato de serem aceleradores das reações, concorrendo para o aumento da
eficiência com que o mateial orgânico é digerido. Estas propriedades explicam
inequivocamente a importância dada por vários pesquisadores no decorrer dos
anos, ao estudo do uso de compostos químicos isolados ou combinações destes,
objetivando a otimização da performance da etapa de digestão (SILVA, 1981;
POMERANZ e MELOAN, 1994; CHANG, 1994).

A evolução dos estudos sobre o uso de catalisadores na digestão ácida

do método Kjeldahl, contribuiu significativamente sobre importantes aspectos
práticos, são eles:

- Aumento do Ponto de Ebulição do Ácido Sulfúrico.

GUNNING (1889); citado por MACKENZIE (1970) propôs que a taxa de

digestão poderia ser acelerada pelo aumento do ponto de ebulição do ácido
sulfúrico, através do uso de sulfato de potássio.
 82
A adição de sulfato de sódio ou potássio eleva o ponto de ebulição do
ácido sulfúrico de 180 ºC para aproximadamente 400ºC, além de contribuir na
formação de S2O7 tornando a etapa de digestão mais rápida (SILVA 1981).

- Aumento do Poder Oxidativo.

O sulfato de cobre e (ou) selênio confere ao processo de digestão maior

poder oxidativo pela formação de oxigênio ativado SILVA (1981). Poderemos
compreender este fato pela observação da seguinte reação química:

Se + 2H2SO4 2 SO2 + H2SeO3 + H2O

H2SeO3 Se + H2O + 2 [O] ( O2 Ativo ) (4)

De forma similar o sulfato de cobre tem ação catalizadora denotada

também pela formação de O2 ativado.

2 H2SO4 2 SO2 + 2 H2O + O2

O2 + 2 Cu++ 2 CuO

2 CuO 2 Cu++ + 2 [ O ] ( O2 ativo ) (5)

MERCÚRIO

O Mercúrio foi um agente catalisador muito usado e por algum tempo

demonstrou através de experimentos, ser um eficiente agente catalisador.
Entretanto, apresentou dois grandes inconvenientes que contribuiram em muito para
o seu desuso, quais sejam:

- Sublimar-se nas paredes do balão de Kjeldahl, quando reage com grandes

quantidades de sais de cloro contidos na amostra (caso exista),
- Tendência de formar um complexo mercúrio-amoniacal durante a digestão ácida.
Neste caso, faz-se necessário uma decomposição prévia dete complexo com
tiossulfato de zinco, antes do inicio da etapa de destilação.
Parece não haver perda de nitrogênio com o uso do mercúrio como
catalisador. Além da formação do cloreto de mercúrio citado, o fato de ser um metal
 83
pesado concorreu negativamente ao seu uso, haja visto não ser biodegradável,
sendo portando causador de poluição ambiental(POMERANZ & MELOAN, (1994).

SELÊNIO METÁLICO (Se)

Sobre este catalisador existem algumas controvérsias quanto ao seu uso.

É fato indiscutível que apresenta melhor efeito sobre a velocidade da digestão
(reação 4). Apresenta ainda melhor efeito sobre a velocidade de reação do que o
mercúrio, e ao contrário deste, não requer pré tratamento antes da titulação. No
entanto, uma perda significativa de nitrogênio pode ocorrer se o selênio em demasia
for adicionado à mistura digestora, ou se não houver um controle efetivo da
temperatura de digestão. Estas condições são mais críticas do que com cobre ou
mercúrio POMERANZ & MELOAN (1994).

AGENTES OXIDANTES

Agentes oxidantes como água oxigenada (H2O2) e ácido perclórico, podem

ser utilizados objetivando uma maior taxa de conversão do material orgânico a
sulfato de amônio. Entretanto foi observado que o uso destes agentes podem vir a
ocasionar perdas de nitrogênio, concorrendo para uma subestimação do teor deste
elemento, e consequentemente de proteína no material digerido.
A água oxigenada tem apresentado bons resultados em amostras que
contém elevado teor de carbono, sobretudo na forma de lípedes e carboidratos.
Apresenta ainda a propriedade de ser um potente agente anti-espumífero. Esta
importante propriedade evita que durante a ebulição da mistura digestora, a
formação excessiva de espuma, ocasione à aderencia de material orgânico nas
paredes do tubo de digestão, dificultando o contato direto com a mistura digestora,
consequentemente diminuindo a performance da etapa. Diversas avaliações sobre o
uso de peróxido de hidrogênio na digestão do méto Kjeldahl foram feitas por SINGH
et al (1984). Segundo este pesquisador, o uso de peróxido de hidrogênio é preferível
aos métodos que empregam altas concentrações de catalisadores tóxicos, como
mercúrio e selênio.

Pontos Críticos de controle que antecedem a digestão ácida

 84
Antes de especificarmos quais são os pontos críticos de controle (PCC),
pertinentes à etapa de digestão ácida, é necessário definir resumidamente o que
seria um (PCC) aplicado às técnicas analíticas.
FERREIRA e GOMES (1995), definiram ponto crítico de controle, como
uma “operação” pela qual se aplicam medidas preventivas com o intuito de manter
uma determinada etapa sob controle com o objetivo de prevenir, reduzir ou eliminar
uma probabilidade de falha em um processo analítico. Sendo denominado operação
qualquer prática ou procedimento realizado em um laboratório, um reagente, um
local, uma temperatura, uma concentração, uma pesagem etc.
Segundo TAYLOR (1981), citado por FERREIRA & GOMES (1995), o
procedimento analítico a ser usado necessita ser cuidadosamente relatado, dando
bastante ênfase aos pontos críticos de controle.
Os pontos críticos de controle existem em todo sistema de medida.
Certamente qualquer laboratório que trabalha objetivando a perfeição em suas
análises, necessita obter resultados confiáveis, para tanto é imprescindível identificar
e manter sob controle os PCC (GARFIELD, 1984; citado por FERREIRA & GOMES,
1995).
Estimativa e pesagem da amostra, são dois importantes procedimentos
que antecedem a digestão ácida da amostra. Identificados como pontos críticos de
controle, tem influência direta sobre a precisão dos resultados de análise.
Nos alimentos, a disposição geral de seus constituintes na maioria das
vezes não é homogênea, isto é, podem existir frações de composições diferentes
que não estão distribuídas uniformemente pela massa total do alimento.
Sabemos que ao pesarmos um material a fim de se proceder uma análise
química, faz-se necessário cuidados com a representatividade que esta amostra
deverá apresentar em relação à massa total da qual foi retirada. Neste caso, para
que os procedimentos analíticos sejam significativos é importante que adequados
procedimentos de amostragem sejam adotados.
É importante esclarecer, que em nossa análise de PCC a amostragem
não é um ponto crítico de controle, embora esteja sendo tratada nesta seção. Isto se
deve pelo simples fato de que uma vez tomada a amostra, seja a técnica de
amostragem correta ou não, o resultado da análise diz respeito à aquela amostra,
tomada naquelas condições de amostragem, não tendo portanto influência sobre o
desenvolvimento prático do método analítico.

Erros de Pesagem
 85

A medida precisa de uma determinada massa amostral com o objetivo de

posterior digestão ácida no método Kjeldahl, concorre para a obtenção de resultados
também precisos que define o percentual de proteínas em materiais orgânicos.
Segundo JEFFERY et. al (1992), as duas principais fontes de erros de
pesagem são: Modificações sofridas pelo recipiente ou pela amostra, entre 2
pesadas sucessivas e erros de registro de pesagem das amostras.
A primeira fonte de erro é debitada à alteração do peso do recipiente de
pesagem em função principalmente de três fatores:
- Absorção ou perda de umidade
- Diferenças de temperatura em relação à da caixa da balança.
- Eletrificação superficial, em razão de atrito.
Com o objetivo de evitar a segunda fonte de erro, qual seja, registro dos
pesos, recomenda-se a anotação destes a medida em que forem sendo adicionados
e retirados da balança analítica (JEFFERY et. al, 1992).

Estimativa da quantidade de amostra

Não menos importante que uma pesagem precisa, a definição prévia da

quantidade de amostra, visa a significativa redução de erro analítico na posterior
etapa de titulação com o ácido clorídrico (Kjeldahl modificado).
A estimativa da quantidade de amostra visa a redução do erro analítico. A
possibilidade de estimativa decorre do desenvolvimento de estudos que
proporcionaram a elaboração de tabelas de composição percentual de nitrogênio,
segundo as várias fontes distribuidas na natureza CRAMPTON E HARRIS (1969).
Além disto, a experiência própria de pesquisadores também é importante, quando
não se tem uma definição prévia do teor de nitrogênio. O somatório desta série de
conhecimentos, servem de base para os cálculos de estimativa.
Sabe-se que para reduzir o erro analítico na determinação de proteína
pelo método Kjeldahl, dever-se-a gastar numa bureta de 50ml, em torno de 20-25ml
de HCl 0,05 N. Em torno deste volume, observa-se uma diminuição da probabilidade
de erro analítico.
 86

Regimes: MACRO, SEMI-MICRO E MICRO KJELDAHL

Segundo Wolfschoon, 1980, frações nitrogenadas tais como, nitrogênio

total (TN), nitrogênio não protéico (NPN), nitrogênio protéico, proteína bruta e
proteína verdadeira, podem ser determinadas pelo método de Kjeldahl em função do
teor de nitrogênio esperado na amostra, o qual define o regime a ser empregado.
Todos os regimes tem as mesmas etapas em comum, quais sejam:
digestão, destilação e titulação. Tendo em vista a manutenção do princípio, diferem
entre sí apenas na quantidade de nitrogênio disponível ou necessário às análises.
A possibilidade de variações da massa amostral ocasionarão
obrigatoriamente mudanças nas dimensões dos equipamentos requeridos, vidrarias,
e nas concentrações de alguns reagentes participantes do processo. Estas
variações poderão ser observadas através da simples consulta a um bom catálogo
técnico de equipamentos e vidrarias.
Ao analista, cabe a definição do regime a ser utilizado em seu
laboratório (macro, semi-micro ou micro). Fatores como, disponibilidade de
amostra, reagentes, material e custo de análise devem ser levados em
consideração, procurando adequa-los aos objetivos pre-estabelecidos, sem que
com isso haja comprometimento da acuracidade do método.
JEFFERY et al (1992), classificou os regimes micro e semi-micro de
acordo com a quantidade de amostra a ser pesada e a sensibilidade à qual a
balança deverá apresentar.
Quadro 1 - Regimes do método Kjeldahl
Regimes Kjeldahl Quantidade de Nitrogênio na amostra
Macro 10 - 30 mg
Semi-micro 0,1 - 2 mg
micro 1 - 15 µg
Ultra-micro 20 - 100 ρg
Fonte: Wolfschoon-Pombo (1980).
 87
Quadro 2 - Determinação do regime de análise em função da
disponibilidade de amostra e sensibilidade da balança analítica.
QUANTIDADE DE SENSIBILIDADE DA
REGIMES
AMOSTRA BALANÇA ANALÍTICA
MACRO 100mg ou mais 0,01mg
SEMI-MICRO 10 - 100 mg 0,01 mg
MICRO 1 - 10 mg 0,001 mg
Fonte: JEFFERY et al (1992)

Procedimento de Digestão

A pesagem da amostra como vimos anteriormente, é fator

importantíssimo que deve ser monitorado, haja visto ser ponto crítico de controle. Ao
chegar neste ponto, o técnico já deverá ter definido a metodologia a ser empregada,
e a quantidade de amostra a ser digerida com base no que foi descrito até o
momento.
A amostra deve ser colocada em tubo apropriado e este deverá ser
acoplada ao bloco digestor, sendo então colocado com uma pipeta graduada, 10 ml
da mistura catalisadora previamente preparada. Podem ser usadas quantidades
maiores da mistura catalisadora, em caso de amostras contendo um elevado teor de
material orgânico.

O tubo contendo a amostra mais a mistura catalisadora deverá ser

submetido à gradativo aumento de temperatura em capela, havendo portanto a
liberação de gases tóxicos como CO2 e SO2. Inicialmente o termostato, deverá ser
ajustado para atingir uma temperatura entre 150 - 200°C permanecendo por cerca
de 30 minutos. Decorrido este tempo, ajustar novamente o termostato a fim de que a
mistura digestora atinja entre 250 e 300 °C, permanecendo a esta temperatura por
mais 30 minutos. Ao término deste intervalo o aparelho deverá ser ajustado à
temperatura final que será por volta de 350 - 450°C, permanecendo a esta
temperatura até que o material anteriormente escuro e opaco torne-se uma solução
verde clara e até certo ponto translúcida. Alguns tipos de amostra podem requerer o
uso de peróxido de hidrogênio, por razões citadas no início deste capítulo. Na
prática usamos o H2O2 quando se presume que a amostra a ser digerida contém
elevada concentração de matéria orgânica e nitrogênio. Para tal procedimento faz-se
 88
necessário a interrupção da digestão do material para efetuar-se a adição, em
seguida retoma-se o aquecimento até o ponto final acima citado. O procedimento de
aumentarmos gradativamente a temperatura deve-se ao fato de que algumas
amostras quando submetidas a elevadas temperaturas de forma abrupta, espumam
excessivamente, causando a aderência de parte do material nas paredes internas do
balão. Este material aderido não estará portanto, sujeito a ação do ácido sulfúrico
concentrado e dos catalisadores, havendo então uma substimação da concentração
real de nitrogênio na amostra, pelo simples fato de parte do material não ter sido
oxidada e consequentemente transformada à sulfato de amonio. É importante
salientar que o termostato é dotado de uma luz indicadora que apaga -se, assim que
a temperatura ajustada ajuste for alcançada, sendo o procedimento correto a
contagem do tempo a partir deste momento.

Terminada a digestão, deve-se deixar o material esfriar ainda dentro da

capela, pois em razão da elevada temperatura alguns gases tóxicos ainda podem
ser liberados para o ambiente interno do laboratório.

Destilação

A etapa de destilação pode ser diferenciada apenas pela possibilidade de

uso como solução receptora de ácido bórico ou ácido sulfúrico, de acordo com a
metodologia titulométrica posterior que será empregada (Oficial ou Modificado)
(SILVA, 1981).
Esta etapa caracteriza-se basicamente pela alcalinização dos sais de
amônio formados durante a digestão, culminando na formação de amônia. A amônia
liberada é conduzida por meio de arraste de vapor a uma solução ácido bórico (4%
p/v), formando-se o metaborato de amônia (Modificado). Se ao invés do uso da
solução de ácido bórico, usarmos uma solução de ácido sulfúrico padronizada em
excesso, verificaremos a formação de (NH4)2SO4, caracterizando-se então como
método oficial INSTITUTO ADOLFO LUTZ (1993)
Esta etapa caracteriza-se essencialmente pela necessidade de
hermeticidade do sistema de destilação, a qual constitui-se um ponto crítico de
controle. Este cuidado deverá ser proporcional à quantidade de encaixes presentes
no aparelho de destilação, por razões óbvias de possibilidade de perda de amônia
através destes encaixes, se não bem fixados (FERREIRA & GOMES, 1995).
 89

Reações Químicas Envolvidas na Destilação.

A etapa de destilação segundo o método modificado, pode ser entendida

pela observação das seguintes reações:

(NH4)2SO4 + NH4HSO4 + 2 NAOH Na2SO4 + 2 NH3 + H2O

H3BO3 H2O + HBO2 + Indicador(Roxo)

2NH3 + HBO2 + H2O NH4BO2 (Verde) + H2O ( 5)

Ponto Crítico de Controle.

Na etapa de destilação ocorre a volatilização da amônea, podendo

portanto ser perdida para o ambiente externo do destilador. Isto ocorrerá se a saída
do condensador não estiver imersa na solução ácida receptora.

Titulação

O procedimento de titulação pode ser desenvolvido segundo dois

procedimentos distintos, quais sejam, segundo o método oficial ou modificado.
O método oficial utiliza uma solução padrão de ácido sulfúrico para
recolher a amônea, liberada pela reação do sulfato de amônio com o hidróxido de
sódio, na etapa de destilação vista anteriormente. Sendo o ácido sulfúrico um ácido
forte, há uma maior eficiência na protonação da amônea, ao passo que com a
solução de ácido bórico ocorre uma maior possibilidade de perdas, em vista da fraca
ligação formada.
O procedimento de titulação oficial é utilizado em análises onde uma
maior acuracidade é necessária, ou em casos de exigência por parte do requerente
da análise.
No método de titulação oficial, a diferença de equivalentes de ácido
sulfúrico na solução receptora de amônea, é igual aos equivalentes de nitrogênio
presentes na amostra. Portanto a titulação segundo o método oficial consiste em
titular o ácido sulfúrico em excesso com uma solução padrão de hidróxido de sódio,
 90
anotando em seguida o volume de hidróxido gasto na neutralização, visando os
cálculos posteriores.

Reações Químicas envolvidas nas Titulação

(6)
Titulação Kjeldahl Modificado

NH4BO2 + H2O + HCl NH4Cl + HBO2 (Roxo)

Titulação Kjeldahl Oficial

*
NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 (Incolor)

H2SO4(excesso) + 2NaOH(padronizada) Na2SO4 + 2H2O (VERMELHA)

*
(Produto da destilação Kjeldahl oficial)
(7)

3.2.9.2 Pontos Críticos de Controle na etapa da titulação

Controle rígido da(s) concentração(ões) e do(s) volumes da(s)

solução(ões) padrão utilizadas na titulação respectivamente( método oficial ou
modificado)

O procedimento modificado é mais empregados em análises de rotina,

apresentando boa reproducibilidade. Existem algumas vantagens do uso do método
modificado. Observe que no caso do método oficial devemos controlar o peso da
amostra, bem como as concentrações e volumes das soluções de ácido sulfúrico e
hidróxido de sódio. Já no método modificado, observe que deveremos controlar
apenas o volume e a concentração do ácido clorídrico. Um fato concreto decorrente
da opção pelo método modificado, é a economia de reagentes.

Conforme comentado anteriormente, poderemos ter um maior ou

menor número de PCC’s em função do método escolhido. Este cuidado deve-se ao
simples fato deste(s) valor (es) participarem diretamente da equação que define o
percentual de proteínas.
 91
3.2.10 - Cálculo do Percentual de Proteína Total.

Definição do Fator de Conversão apropriado

Conforme comentado anteriormente, ocorrem variações do % de

nitrogênio em função do substrato ou matriz protéica distribuída nos compostos
orgânicos em geral. Como média, o fator de conversão usado é 6,25, de forma que
para cálculos mais precisos, deve-se verificar o tipo de proteína que predomina no
material amostral, aplicando então um fator de conversão apropriado que melhor
represente sua constituição protéica FERGUSON e DePETERS (1992).

O fator de conversão de nitrogênio de uma amostra para proteína,

pode ser facilmente determinado através do % médio de nitrogênio presente na
amostra CHANG (1994); ROBYT e WHITE (1987); LILLEVIK (1970). Uma
exemplificação deste cálculo está representado logo abaixo.

Suponhamos que baseado em conhecimentos prévios do teor de nitrogênio

de soja em grãos, deseje-se determinar o fator de conversão desta para proteínas.

Se o % de nitrogênio na soja é conhecido, e é de 17,51%, isto implica

obviamente que, para cada 100g de proteínas de soja teremos 16g de nitrogênio.
Através de simples regra de três define-se o fator de conversão da seguinte forma:

100g de proteínas 16g de nitrogênio

X 1g de nitrogênio

Sendo o fator de conversão representado por X, igual a 5,71 para a soja em

grãos.
É de fácil compreensão a importância do conhecimento prévio do teor de
nitrogênio das diversas fontes protéicas, por razões bem conhecidas como as
exemplificadas no Quadro 3 (erro de uso constante do fator médio 6,25
 92
QUADRO 3. Teor protéico de alguns alimentos.(mostra os erros de uso constante
do fator 6,25)

% de N na % de N no Fator
Alimentos N x 6,25 N x Fator
proteina alimento específico

Trigo
17,5 1,39 8,7 5,70 7,9
(endosperma)
Trigo (farelo) 15,8 2,45 15,3 6,31 15,5
Trigo (grão) 17,2 2,06 12,9 5,83 12,0
Aveia (grão) 17,2 1,68 10,5 5,83 9,8
Milho (grão) 16,0 1,54 9,6 6,25 9,6
Farelo
18,9 5,82 36,4 5,30 30,8
algodão
Amendoim 18,3 4,13 25,8 5,46 22,5
Leite 15,8 0,53 3,3 6,38 3,4
Ovo, carne 16,0 - - 6,25 -
Gelatina 18,0 1,46 9,1 5,55 8,1
Fonte: Crampton & Harris. Aplied Animal Nutrition. 1969.(6)

Expressão dos Resultados.

Uma vez definido o fator de conversão apropriado, deveremos agora com

base no método utilizado (Modificado ou Oficial), proceder os cálculos utilizando uma
das seguintes equações.

Segundo o método Modificado teremos:

(5)
[ (Va -Vb) x NHCl x FHCl x 1,4 ]
% PT = x FCN
Peso da amostra
Onde:

%PT = porcentagem de proteínas totais

VA = mililitros de HCl gastos na titulação da amostra.
VB = mililitros de HCl gastos na titulação do branco
N = normalidade do ácido clorídrico
 93
fc = fator de correção da normalidade do HCl (Normalidade exata -> fc = 1)
FCN = fator de conversão de nitrogênio para proteína (deverá ser usado um fator
específico).
P = peso (em g ) ou volume (em ml) empregado da amostra.

Segundo o Método Oficial AOAC. (1984), teríamos:

%N=[(N acid )(mL acid ) - (mL br )(N NaOH ) - (mL NaOH )(N NaOH )][1400.67]/mg de amostra

Onde: (6)
mLNaOH = mL de padrão básico necessário à titulação da amostra.
mLácid = mL de padrão ácido utilizado.
mL br = mL gastos na titulação do branco.
NNaOH = normalidade do padrão de NaOH.
Observações:
1- Se a amostra analisada foi pesada, o resultado deverá ser expresso como
gramas de proteínas por 100g de amostra.
2-Caso a amostra tenha sido tomada em termos de volume exato de amostra,
medido por uma pipeta volumétrica, o resultado deverá ser expresso em gramas de
proteínas por 100ml de amostra.
3-Se o interesse for o de medir o teor de nitrogênio ao invés do teor de
proteínas totais, retira-se da fórmula o fator FCN, expressando então o resultado
como percentagem de nitrogênio total.
Visando dar confiabilidade aos procedimentos realizados é necessário que se
faça a aferição do método. Para tal deveremos repetir todo os procedimentos feitos
com as amostras, utilizando um padrão de proteínas de concentração exatamente
definida. Desta forma teremos uma boa idéia do grau de precisão com que foram
feitas as análises, dando subsídios suficientes para a correção de eventuais erros de
procedimento FERREIRA e GOMES (1994).

Determinação de proteína pelo método de Biureto

As técnicas de análises colorimétricas além da facilidade de manipulação,

são rápidas, de baixo custo, e permitem a aplicação em quantidades de microescala.
Os aspectos quantitativos das várias técnicas em análises colorimétricas, e em
específico na técnica de BIURETO, dependem de uma padronização, observando-se
 94
um intervalo de máximo e mínimo de concentração no qual a linearidade da lei de
Beer é válida.
Quando uma proteína solúvel é colocada em uma solução contendo
hidróxido de sódio, sulfato de cobre, tartarato de sódio e potássio, e iodeto de
potássio, uma cor violeta é formada. Esta cor é devida à reação de complexação
entre pelo menos duas ligações peptídicas de uma proteína e o cobre
divalente(Cu2+) em solução fortemente alcalina. A reação de complexação dá-se
entre o íon Cu2+, com quatro átomos de nitrogênio, sendo que dois átomos, são de
cada um dos peptídeos envolvidos. A finalidade do meio fortemente alcalino é de
converter o complexo formado em um sal solúvel de sódio.

Princípio do Método

O método baseia-se na formação de um complexo entre a ligação

peptídica da proteína e os íons de cobre do reagente denominado de biureto. A
absorbância da cor produzida pela reação de complexação deverá ser lida em
540nm, onde a intensidade da cor formada é proporcional ao conteúdo de proteína
na amostra analisada. Observa-se de acordo com a figura 3.1 que o hidrogênio do
grupo amida da ligação peptídica é substituída pelo cobre II, sendo necessário a
existência de pelo menos duas ligações peptídicas e consequentemente quatro
átomos de nitrogênio.

Figura.1- Reação de biureto.

O C O C C O
H N H N N H
Cu++
H C R OH-
H C R ++ H C R
Cu
O C O C C O
H N H N N H
 95
Pontos Críticos de Controle

Verificar a translucidez do reagente de biureto, isto é, a ausência de

precipitado, o que compromete a eficácia do método.
A amônia, ou íons de amônia poderão interferir na análise devido a
possibilidade de formação de complexo com o íon Cu2+ do reagente de biureto
(complexo tetraamina de cobre), que apresenta uma cor azul intensa conforme fig.
abaixo.

Etapas envolvidas no método

Preparo ou monitoração dos reagentes

Para iniciar a metodologia de determinação de proteínas através deste

método, é necessário que seja preparado o reagente de biureto. Feita uma
quantidade suficiente para as análises subsequentes, é necessário apenas o
controle da qualidade desse reagente através da observação da presença de
precipitado na solução.

Incubação

A formação de complexo de cor púrpura necessita de um tempo mínimo

para que ocorra a reação entre ligação peptídica e reagente de biureto. O tempo
ideal de incubação deverá estar entre 20 e 30 minutos.

Elaboração da curva padrão

A curva padrão deverá ser elaborada preferencialmente utilizando uma

proteína idêntica à qual objetiva-se determinar, caso contrário, é necessário que pelo
menos apresente propriedades semelhantes.
Para a construção de uma curva padrão, é necessário anotarmos os
valores correspondentes às concentrações dos padrões, com seus respectivos
valores de absorbância obtidos no espectrofotômetro UV-VIS.
 96
ISOLAMENTO E DETERMINAÇÃO DE ÁCIDO BENZÓICO COMO
CONSERVANTE.

Procedimento:

Transferir para um bequer 100 ml de refrigerante. Adicionar 5 ml de NaOH

10%; homogeneizar bem. Adicionar 10 ml de sulfato de cobre a 35% agitar e ecer
até a ebulição. Agitar bem e filtrar de urna só vez para um funil de aração. Esfriar.
Adicionar 5 ml de HCI concentrado. Agitar. Adicionar 75 ml éter etílico. Agitar
diversas vezes invertendo o funil, tendo a precaução de abrir torneira do firnil para
saida de vapores do éter etilico. Descartar a fase aquosa e var a fase etérea com 5
ml de água. Descartar a fase aquosa. Transferir a fase érea para um erlenmeyer de
125 ml e evaporar o éter etílico em banho maria (o ponto de ebulição é
aproximadamente 240C). Adicionar aproximadamente 10 ml de 4ua, agitar e titular
com NaOH 0,01 N padronizada, utilizando fenolftaleína como indicador. Quando
houver viragem do indicador, esperar uns 2-3 minutos; se a cor desaparecer,
continuar a titulação até a viragem. Expressar o teor de ácido benzóico em gramas
por 100 ml de refrigerante.

Reações:

Inicialmente, a soda reage com o ácido fosfórico ou outro ácido do

refrigerante e com o ácido benzóico presentes na amostra de refrigerantes.
H3P04+3NaOH—* Na3PO4+ 311,0
UOII \aOH ‘oONa

O excesso do NaOH reage, então, com o sulfato de cobre, de acordo

com a equação:
2NaOH+CuSO4 Cu(OH)2 + Na2SO4
O sulfato de cobre precipita também gomas e pigmentos presentes nos
refrigerantes.
A função do hidróxido de sódio no inicio da reação é formar o sal benzoato de
sódio, o que impede a evaporação do ácido benzóico.
 97

QUÍMICA ANALÍTICA
PREPARO DE SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE ALIMENTOS
Análise Quantitativa
PROF. ROBERT BEZERRA

Abril 2011
 98
1. CONCEITOS BÁSICOS

Concentração

Chama-se concentração de uma solução a toda e qualquer maneira de expressar a

proporção existente entre as quantidades de soluto e de solvente, ou então as
quantidades de soluto e de solução.
Obs.: Utiliza-se uma convenção de índice 1, para as quantidades de soluto
Utiliza-se índice 2 para as quantidades do solvente
Não utiliza-se índice quando se refere a solução

 Concentração comum

Concentração é o quociente da massa de soluto (em gramas) pelo volume da

solução (em litros). Na maioria dos casos, a massa do soluto é expressa em gramas e o
volume da solução, em litros. Nesses casos, a concentração será expressa em
gramas/litro.
C = m1
V(l)

 Densidade

Densidade é o quociente da massa da solução pelo volume da solução, sendo

representado por :
d = m/ V

 Massa molecular

Massa molecular é igual a soma das massas atômicas dos átomos que formam a
molécula (expressa também em unidades de massa atômica (u)
H2O =18u , uma molécula de água é dezoito vezes mais pesada que 1/12 da
massa do 12C.

 Mol : expressa a massa molecular em g

4. Calcule o mol das seguintes substâncias :

H2SO4, NaOH, Al2(SO4)3, K4[Fe(CN)6, CaCl2, AlCl3, H3PO4, HCl

 Número de moles

É a razão entre a massa do soluto e o mol do soluto

n = m1
M1

 Molaridade

Molaridade é o quociente do número de moles do soluto pelo volume da solução

(em litros), ou seja, indica quantos moles de soluto existem em cada litro de solução.
M = n1 / V(l)
n1 : numero de moles do soluto
 99
V : volume da solução em litros

 Fração molar
n1 n2
x1 = x2 =
n1 + n2 n1 + n2
Fração molar do soluto :
É a razão entre o número de moles do soluto e o número de moles da solução
Fração molar do solvente :
É a razão entre o número de moles do solvente e o número de moles da solução

Em qualquer solução, a soma das frações molares do soluto e do solvente é

sempre igual à unidade :
x1 + x2 = 1

 Equivalente grama

Equivalente grama dos ácidos

É definida como o quociente da molécula grama (mol) do ácido pela valência total
dos hidrogênios ionizáveis
Ex : HCl, H2SO4, H3PO4, ácido carbônico, ácido acético, ácido oxálico, HNO3

Equivalente grama de bases

É definida como o quociente da molécula grama (mol) da base pela valência total
das hidroxilas.
Ex: NaOH, Ca(OH)2, Al(OH)3

Equivalente grama de sais

É definida como o quociente da molécula grama (mol) do sal pela valência total do
cátion ou do ânion
Ex: NaCl=58,5, AlCl3, Cr2(SO4)3 ,CuSO4.5H2O, Al2(SO4)3 =57g,

Número de equivalentes grama

É definida como o quociente de sua massa (m) pelo seu equivalente grama (E)

 Princípio da equivalência

Equivalentes grama sempre reagem ou se substituem na proporção de um

para um, este é chamado o princípio da equivalência, por exemplo, 0,5 equivalente
grama de um ácido neutraliza 0,5 equivalente grama de uma base.

 Normalidade ou concentração normal

Normalidade é o quociente do número de equivalentes grama do soluto pelo

volume da solução em litros

N = e1/ V(l) ou N = m / E. V(l) unidade : eq-g / litro

A relação entre Molaridade e Normalidade é dada por N = M . valência
 100

16. Qual a normalidade de uma solução que tem 7,3g de ácido clorídrico conc. dissolvido
em 250ml de solução ? (H=1, Cl=35,5) R: 0,8N
17. Qual a normalidade de uma solução que contém 11,2g de KOH em 200ml de solução
? R: 1N
18. Qual a massa de H2SO4 concentrado presente em 250ml de solução 0,1N ? R: 1,225g
19. Qual o volume de ácido sulfúrico conc. com densidade 1,84g/ml, necessária para
preparar 250ml de uma solução 0,1N, sabendo que a pureza do ácido concentrado é de
98%. R: 0,68ml

 Variação da concentração por adição e retirada do solvente

A adição de solvente a uma solução (do mesmo solvente) produz uma diminuição
de sua concentração, tornando a solução mais diluída.
Diluir uma solução é acrescentar-lhe solvente.
A relação usada é normalmente Concentração1 x Volume1 = Concentração 2 x
Volume2

20. Resolva : 300 ml de água são adicionados a 200ml de solução aquosa de NaCl de
concentração igual a 50g/l. Qual é a concentração em g/l da solução após a diluição ? R:
20g/l
21. Tem-se em um recipiente 200 ml de uma solução de sacarose com concentração de
13g/l . Qual a quantidade de água a ser adicionada no recipiente para que a
concentração caia para 7,5 g/l ? R: 146,66ml

 Mistura de soluções sem reação química

A adição de uma solução a uma outra solução de mesmos reagentes, produz uma
solução com concentração que leva em conta as duas soluções envolvidas.
A relação usada é: ConcNova x VolTotal = Conc inicial1 x Volumeinicial1 + Conc inicial 2 x
Volumeinicial2
101
 102

38. Calcule o volume de HCl conc. necessário para preparar 250ml de uma solução 0,25N
? R: 5,17ml

2. ERROS E TRATAMENTOS DOS DADOS ANALÍTICOS

A medida experimental de uma quantidade física está sempre sujeita a uma

incerteza e quando se faz uma medida procura-se manter esta incerteza em níveis baixos
e toleráveis. Os algarismos significativos assumem importância quando é necessário
expressar o valor de uma grandeza determinada experimentalmente, valor este que pode
ser obtido diretamente (pesagem ou volume) ou indiretamente (concentrações).
A precisão de uma medida é expressa através dos algarismos significativos, de
modo que nos dígitos do número que representam um resultado experimental, apenas o
último algarismo é duvidoso.
Por exemplo se a massa de um corpo é determinada com a balança analítica, deve
ser representada como 11,1213g uma vez que a incerteza da medida é ± 0,0001g, não
sendo correto expressar como 11g, 11,1g, 11,12g e 11,121g.

2.1 ERROS DE UMA MEDIDA

a) Erro absoluto
É definido como a diferença entre o valor medido e o valor verdadeiro de uma
grandeza.
Eabs = valor medido - valor verdadeiro

b) Erro relativo
É um valor adimensional, expresso em partes por cem ou mil
Er = Erro absoluto / valor verdadeiro

2.2 TIPOS DE ERROS

a) Erros determinados ou sistemáticos
Possuem valor definido e podem ser medidos e computados no resultado final, e
podem ser :

• Erros de método
Quando da realização de uma análise costuma-se seguir determinado método
indicado na literatura, mas certos métodos podem induzir a erros, mesmo que se trabalhe
 103
cuidadosamente. Se por um exemplo usa-se um indicador inadequado comete-se um
erro, que só será corrigido, trocando o indicador.
Estes erros são mais difíceis de serem detectados e os mais sérios dos erros
determinados.
Muitas vezes um método é indicado para certas análises e não especifica as
concentrações em que ele é viável e usa-se o método para qualquer concentração e
comete-se o erro.

• Erros operacionais
São aqueles detectados nas manipulações realizadas durante a análise. Não
dependem das propriedades físicas ou químicas do método, do instrumento, mas apenas
da capacidade técnica do analista. Estes erros podem ser consequência de aquecimento
brando em um recipiente aberto quando da filtração, não remoção completa do
precipitado, uso de materiais instrumentais sujos entre outros.

• Erros pessoais
Conseqüência do analista que faz observações inadequadas como verificação do
ponto de viragem (uso do indicador), forçar resultados em uma análise repetida.

• Erros devido a instrumentos e reagentes

São os relacionados com as imperfeições dos instrumentos, reagentes ou
aparelhos volumétricos. É o caso de equipamentos volumétricos mal calibrados (bureta,
pipetas....) que acarretam maiores erros nas análises quantitativas além do uso de
reagentes com impurezas.

b) Erros indeterminados
Não possuem valor definido, não são mensuráveis e oscilam aleatoriamente.
Mesmo não existindo erros determinados, se uma mesma análise for efetuada duas vezes
por uma mesma pessoa, possivelmente haverá variações nos resultados, e estas
variações são consequência dos erros indeterminados, os quais não podem ser
localizados ou corrigidos.
Mas estes erros podem ser submetidos a um tratamento estatístico onde é possível
determinar o valor mais provável, com mais precisão, através de uma série de medidas.

3. VOLUMETRIA OU TITULOMETRIA

Na titulometria o constituinte desejado é determinado medindo-se a capacidade

de reação com relação a um reagente adequado, usado na forma de uma solução de
concentração conhecida, chamada solução padrão. Esta solução padrão é
adicionada gradualmente a solução que contém o constituinte até completar-se a reação
da solução em questão, esta operação realizada com o auxílio de bureta é denominada
titulação.
Um método para detectar ou sinalizar o fim da titulação, consiste em adicionar ao
sistema um reagente auxiliar ou indicador capaz de produzir uma coloração,
precipitação ou turvação que ocorrerá nas proximidades do ponto de equivalência.

3.1 TIPOS DE VOLUMETRIA

A volumetria de neutralização pode ser analisada em termos de potenciais de pH

e ocorrerá titulação de ácidos fracos, fortes, sais, bases, etc..
 104
A volumetria de precipitação envolve processos de argentometria,
ferrocianometria e envolve evidentemente formação de precipitados. Em relação aos
indicadores, eles são, em geral, também formadores de precipitados, porém formados
antes de atingir o volume equivalente.
A volumetria de oxi-redução divide-se por sua vez em vários processos como
permanganometria, dicromatometria e iodometria onde cada processo recebe o nome do
titulante, ou seja, da solução padrão utilizada.

3.1.1 Volumetria de Neutralização

A volumetria de neutralização compreende titulações de espécies ácidas com

solução padrão alcalina e titulações de espécies básicas com solução padrão ácida.
Tem-se assim duas espécies de volumetria de neutralização : a alcalimetria onde o
titulante é uma base e acidimetria onde o titulante é um ácido. O reagente titulante é
sempre um ácido ou uma base forte com o ponto final sendo detectado pelo uso de
indicadores.

Solução padrão

É a solução utilizada para uma determinação volumétrica e cujo consumo servirá

de base para o cálculo da concentração ou porcentagem desejada.
A concentração mais comum para uma solução padrão é 0,1N, mas também
são utilizadas soluções com maiores ou menores concentrações.
Raramente estas soluções são preparadas com muita exatidão, devido a
dificuldade exprimir a pureza ou impurezas dos reagentes, daí a necessidade de
determinar o fator de correção das soluções padrões, utilizado para corrigir o volume
gasto na titulação, comparado ao volume teórico.

Vt
f=
Vp

onde f : fator de correção Vt : volume teórico Vp :

volume prático

Padrão primário

As características principais para uma substância ser escolhida para um padrão

primário são :
. Facilidade de obtenção, de purificação, e, ao secar, não deverá ter sua
composição modificada;
. Facilidade de ser testada quanto as impurezas;
. Permanecer sem modificações, durante a pesagem e de preferência permanecer
estável, por períodos mais longos, de modo que possa ser armazenada;
. Ter um peso equivalente elevado para reduzir os erros de pesagem;
. Reagir com a solução padrão de maneira completa e com reações bem definidas.

Indicadores ácido-base

Na titulações de um ácido com uma base ou de uma base com um ácido, os

indicadores de pH apresentam uma função primordial. Essas substâncias sofrem uma
 105
mudança de coloração dentro de uma faixa de pH, que deve ser bastante restrita e deve
coincidir com a equivalência de volumes na titulação. Os indicadores ácido-base são
usualmente compostos orgânicos que se comportam em solução aquosa como ácidos
fracos (indicador ácido) ou como base fraca (indicador básico) e mudam gradualmente de
coloração dentro de uma faixa relativamente estreita na escala de pH, chamada zona de
transição.

3.1.2 Soluções Padrões Ácidas e Básicas

Solução Padrão Ácida

Objetivo : Preparação de 250 ml de HCl 0,1N para posterior padronização com o seu
padrão primário correspondente.

Procedimento :
• Medir ,em uma pipeta graduada, utilizando a capela, a quantidade de HCl concentrado
necessária (d : 1,19 g/ml , conc : 37%) “verificar a densidade e concentração no frasco se
possível “
• Transferir o ácido para o balão volumétrico de 250ml, que já deve conter
aproximadamente 50ml água deionizada ou destilada
• Agitar e adicionar água para completar o volume até a marca de 250ml.
• Homogeneizar bem
• Colocar em frasco apropriado usando a identificação abaixo:

Equipe :

HCl 0,1 N fc:

Data : / / pipeta com

HCl conc.
Turma :

1)Cálculos para determinar a quantidade de HCl concentrado:

HCl 0,1N
f:

H 2O

2) Cálculos para determinar a quantidade padrão primário para consumir um determinado

volume da solução de ácido preparada. O volume padrão é de 25 ml, mas esta
quantidade pode variar a seu critério.
Obs: O padrão primário para o HCl é o Na2CO3
Utilize o princípio da equivalência

Nsolução HCl. Vsolução HCl = mpadrão primário / Eq padrão primário

 106
3) Padronização
• Pesar a quantidade necessária de Na2CO3 (seco em estufa à 105ºC) em um becker
• Diluir com aproximadamente 30 ml de água deionizada
• Transferir para um erlenmeyer de 250ml
• Completar com água até aproximadamente 75ml
• Adicionar 3 gotas metilorange 0,1%
• Titular com HCl 0,1N, preparado anteriormente, até viragem
• Anotar volume gasto (titulante)
• Calcular o fator de correção

4) Cálculos para determinar o fator de correção após a titulação com o padrão primário

m1: massa de Na2CO3 pesada

a) m1 Eqg : equivalente do Na 2CO3
Np =
Eqg . Vp Vp : volume de HCl (em litros)
Np : normalidade prática Titulante
(ácido ou
base forte)

Bureta

Titulado

b) Np
fc = Np : normalidade prática
Nt Nt : normalidade teórica

Tire suas dúvidas e anote abaixo :

 107
Solução Padrão Básica utilizando um padrão primário

Objetivo : Preparação de 250 ml de NaOH 0,1N (Verificar a pureza da base no rótulo)

Procedimento :
• Pesar a quantidade necessária de NaOH em um becker de 100ml
Obs. : A pesagem deve ser rápida, pois NaOH é higroscópico. H2O

• Diluir com água destilada NaOH

• Transferir para o balão volumétrico com o auxílio de um bastão de vidro

• Completar o volume com água até a marca de 250ml
• Agitar até a completa homogeneização
• Colocar em frasco apropriado.

1)Cálculos para determinar a quantidade de NaOH :

2) Recálculo da Normalidade Teórica após pesagem

3) Cálculos para determinar a quantidade padrão primário para consumir um determinado

volume da solução de base preparada. O volume padrão é de 25 ml, mas esta quantidade
pode variar a seu critério.
Obs: O padrão primário para o NaOH é o biftalato de potássio (KHC8H4O4 “
hidrogenoftalato de potássio”)
Utilize o princípio da equivalência

Nsolução NaOH. Vsolução NaOH = mpadrão primário / Eq padrão primário

O
C
OH
O
C
OK H + ionizável
Biftalato de potássio
Este composto tem Equivalente Grama
semelhante a um ácido pois tem
1 hidrogênio ionizável (Vide figura)
 108
4) Padronização :
• Pesar a quantidade de biftalato de potássio (KHC8H4O4 “ hidrogenoftalato de
potássio”) em um becker de 50ml
• Diluir com 30 ml de água deionizada
• Transferir para um erlenmeyer de 250ml
• Completar com água até aproximadamente 75ml
• Adicionar 3 gotas de fenolftaleína ou azul de bromotimol
• Titular com NaOH 0,1N, preparado anteriormente até viragem
• Anotar volume gasto (titulante)
• Calcular o fator de correção

5) Cálculos para determinar o fator de correção após a titulação com o padrão primário
m1: massa de Biftalato
a) m1 Eqg : equivalente do Biftalato
Np =
Eqg . Vp Vp : volume de NaOH (litros)
Np : normalidade prática

b) Np
fc = Np : normalidade prática
Nt Nt : normalidade teórica

Tire suas dúvidas e anote abaixo :