Curso 169110 Aula 19 Prof Ana Cristina v1 Grifado

Sumário
Biologia Molecular: Métodos de análise do DNA .......................................................................................... 2
1 - Considerações Iniciais .......................................................................................................................... 2
2 – Sequenciamento de DNA .................................................................................................................... 3
2.1 - Uma breve revisão da estrutura e função do DNA ......................................................................... 3
2.2 - Definição de sequenciamento de DNA .......................................................................................... 6
2.3 - Sequenciamento de primeira geração ........................................................................................... 8
2.4 - Sequenciamento de nova geração .............................................................................................. 16
2.5 - Aplicações do sequenciamento de DNA ...................................................................................... 19
3 - Teste de Paternidade ......................................................................................................................... 21
4 – Considerações Finais ......................................................................................................................... 27
Lista de Questões ....................................................................................................................................... 28
Questões Comentadas ............................................................................................................................... 39
Gabarito ..................................................................................................................................................... 56
Referências................................................................................................................................................. 57
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BIOLOGIA MOLECULAR: MÉTODOS DE ANÁLISE DO DNA
1 - Considerações Iniciais
Na aula de hoje vamos estudar sobre métodos de análise do DNA, com ênfase no sequenciamento
do DNA e no teste de paternidade. O objetivo principal desta aula é entender como os métodos de análise
do DNA podem ser empregados na investigação de variantes genéticas associadas a doenças e na
identificação de indivíduos.
Para compreender os temas que serão abordados nesta aula é fundamental ter um bom
entendimento da estrutura e funcionamento do DNA e de técnicas básicas de biologia molecular (como a
eletroforese e a reação em cadeia da polimerase - PCR). Se for preciso, faça uma revisão destes conteúdos
antes de iniciar o estudo da presente aula.
"O conhecimento das sequências pode contribuir muito para a nossa compreensão da matéria viva."
Frederick Sanger
Boa aula!
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2 – Sequenciamento de DNA
2.1 - Uma breve revisão da estrutura e função do DNA
O DNA (ácido desoxirribonucleico) é uma molécula presente em todas as células do corpo (com
exceção das hemácias) e contém o código genético utilizado para regular a síntese de proteínas. A unidade
básica do DNA é o nucleotídeo, que contém uma base nitrogenada que pode ser de quatro tipos diferentes:
adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T).
Legenda: Estrutura dos quatro nucleotídeos de DNA.

Fonte: Griffiths. Introdução à Genética 11a ed.
O genoma humano contém aproximadamente 3 bilhões de pares de bases, sendo que cada célula
diploide (2n) do corpo contém 2 cópias do genoma: uma cópia herdada da mãe e uma cópia herdada do pai.
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O DNA serve de molde para a síntese do RNA (ácido ribonucleico) durante um processo denominado
transcrição. As sequências de DNA que controlam a transcrição encontram-se na região 5 'do gene. Durante
a transcrição, as regiões codificantes, denominadas éxons, são unidas para formar o RNA mensageiro
maduro (mRNA). O mRNA é então traduzido em proteína através de um processo chamado tradução.
Legenda: Visão geral básica da transcrição e tradução. (A) Estrutura básica do gene no DNA. (B) Pré-mRNA antes do splicing. (C)
mRNA maduro pronto para tradução. (D) Proteína sintetizada pela maquinaria ribossomal durante a tradução do mRNA maduro.
Fonte: adaptado de Jalali et al. Basic Science Methods for Clinical Researchers.
A tradução do mRNA é realizada pelo RNA ribossômico (rRNA) e RNA de transferência ou

transportador (tRNA). Durante a tradução, códigos de três bases, denominados códons, são usados para
produzir uma proteína adicionando sequencialmente aminoácidos na extremidade de uma cadeia
polipeptídica crescente.
Existem 64 códons, no entanto, apenas 61 códons codificam um aminoácido, enquanto os três

códons restantes sinalizam que o processo de tradução deve parar e, consequentemente, terminar a síntese
proteica.
O primeiro esboço de um genoma humano foi concluído em 2001, tendo levado mais de uma década
e cerca de US$2,7 bilhões para ser finalizado. Aproximadamente 25.000 genes foram identificados no
genoma humano, muito menos do que o previsto dada a complexidade das células humanas. A região do
genoma que contém genes, chamada de região codificadora, ocupa apenas cerca de 1–2% de todo o
genoma humano. Milhões de variações genéticas (polimorfismos e/ou mutações) foram identificadas no
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genoma humano, consistindo principalmente de polimorfismos de nucleotídeo único (do inglês single
nucleotide polymorphisms - SNPs) e pequenas inserções ou deleções (InDels) de um ou mais nucleotídeos.
Legenda: Classificação básica das variações genéticas nas regiões codificadoras do DNA. (A) Mutação sinônima ou silenciosa muda
a sequência de DNA, mas não a sequência da proteína. (B) Mutação de sentido trocado ou não-sinônima muda o DNA e a sequência
da proteína. (C) Mutações sem sentido introduzem um códon de parada prematura que resulta no término prematuro da síntese de
proteínas. (D) A inserção/exclusão altera a sequência de DNA adicionando ou removendo nucleotídeos, alterando, assim, a
sequência do peptídeo após o ponto de inserção ou exclusão.
O genoma de cada indivíduo contém cerca de 2–3 milhões desses polimorfismos, sendo que uma
pequena fração destes são variações "de novo" (novas) que não são herdadas de nenhum dos pais, pois
surgem durante o desenvolvimento embrionário.
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2.2 - Definição de sequenciamento de DNA
O DNA de cada organismo consiste em uma sequência única de nucleotídeos. O sequenciamento

de DNA é o processo de determinação da sequência de nucleotídeos dentro de uma molécula de DNA.
Dessa forma, ao se sequenciar um trecho de DNA, é possível saber a ordem em que as quatro bases
nitrogenadas (adenina, guanina, citosina e timina) ocorrem dentro daquela molécula de ácido nucleico.
A ordem dos ácidos nucleicos nas cadeias polinucleotídicas contém as informações sobre as
propriedades hereditárias e bioquímicas dos organismos vivos. Portanto, a capacidade de medir ou inferir
tais sequências é fundamental para diversas áreas da ciência, uma vez que a determinação da ordem dos
resíduos de ácido nucléico em amostras biológicas possui uma ampla variedade de aplicações na pesquisa,
na medicina e na identificação forense.
Nas últimas décadas, vários pesquisadores se dedicaram ao desenvolvimento de metodologias para

facilitar esse processo, sequenciando moléculas de DNA e RNA. No princípio, era possível sequenciar apenas
trechos curtos de oligonucleotídeos e o primeiro sequenciamento do genoma humano custou cerca de 3
bilhões de dólares. Atualmente é possível sequenciar milhões de bases e até genomas completos de forma
rápida e com um custo relativamente baixo (aproximadamente US$ 1.000 por genoma).
Metodologias de sequenciamento de DNA
Existem dois tipos principais de sequenciamento de DNA. Um dos métodos mais antigos
e clássicos é o método de terminação em cadeia, também chamado de método Sanger,
que foi usado para sequenciar o primeiro genoma humano. Os métodos mais recentes,
capazes de processar um grande número de moléculas de DNA rapidamente são
chamados coletivamente de métodos de sequenciamento de alto rendimento (High
Throughput Sequencing - HTS) ou métodos de sequenciamento de nova geração (Next
Generation Sequencing - NGS). Os princípios de sequenciamento Sanger e NGS serão
estudados nesta aula.
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(CESPE - SEDUC-AL - 2018 - Professor - Ciências) Com relação ao projeto genoma (humano e outros) e
às estratégias de sequenciamento disponíveis, julgue o item seguinte.
O projeto genoma humano dividiu-se em duas frentes: uma pública, que utilizou uma abordagem mais
meticulosa, e outra de interesse privado, que se propôs a realizar tal análise de maneira rápida,
empregando intensamente a computação.
Certo
Errado
Comentários:
O projeto Genoma Humano contou com a participação de instituições públicas, como National Institutes
of Health (NIH) e vários outros laboratórios do mundo todo. Posteriormente, a iniciativa privada,
representada pela Celera Genomics, se uniu ao projeto, utilizando a metodologia de sequenciamento por
shotgun, com uma abordagem mais rápida, porém menos precisa.
Gabarito: Certo.
Nesta aula estudaremos a evolução das metodologias de sequenciamento do DNA ao longo dos
anos e as características que definem cada geração de metodologias de sequenciamento.
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2.3 - Sequenciamento de primeira geração
Os métodos de sequenciamento de primeira geração envolviam a separação de polinucleotídeos por

comprimento via eletroforese em géis de poliacrilamida. Esta técnica foi usada em dois protocolos
complexos em meados da década de 1970: o sistema "plus and minus" (mais e menos) de Alan Coulson e
Sanger em 1975 e a técnica de clivagem química de Allan Maxam e Walter Gilbert.
A técnica de plus and minus usava DNA polimerase para sintetizar novos nucleotídeos a partir de
um primer, incorporando nucleotídeos marcados radioativamente, antes de realizar duas segundas
reações de polimerização: uma reação "mais", em que apenas um único tipo de nucleotídeo estava
presente, de forma que todas as extensões terminavam com essa base, e uma reação "menos", na qual três
nucleotídeos eram usados, o que produzia sequências até a posição antes do próximo nucleotídeo faltante.
Ao correr os produtos em um gel de poliacrilamida e comparar entre as oito canaletas, era possível inferir
a posição dos nucleotídeos na sequência em análise. Foi usando essa técnica que Sanger e colaboradores
sequenciaram o primeiro genoma de DNA, pertencente a um bacteriófago.
Embora também usasse géis de poliacrilamida para analisar fragmentos de DNA, a técnica de
Maxam e Gilbert diferiu significativamente em sua abordagem. Em vez de usar uma DNA polimerase para
gerar fragmentos, o DNA radiomarcado era tratado com produtos químicos que clivam as fitas em bases
específicas. Após correr em um gel de poliacrilamida, o comprimento dos fragmentos clivados (e, portanto,
a posição dos nucleotídeos específicos) podia ser determinado e com base nesses dados era possível inferir
a sequência. Esta foi a primeira técnica a ser amplamente adotada e é considerada o marco inicial do
sequenciamento de DNA de primeira geração.
No entanto, a metodologia que teve o maior impacto na tecnologia de sequenciamento de DNA

surgiu em 1977, com o desenvolvimento da técnica de terminação em cadeia de Sanger ou método
didesoxi. A técnica de terminação em cadeia usa DNA polimerase, primers e análogos químicos dos
desoxirribonucleotídeos (dNTPs), que são os monômeros das fitas de DNA. Esses análogos químicos dos
dNTPs são chamados de didesoxinucleotídeos (ddNTPs). Os ddNTPs não possuem o grupo hidroxila 3' que
é necessário para a extensão das fitas de DNA, logo, não podem formar uma ligação com o fosfato 5' do
próximo dNTP. A mistura de ddNTPs radiomarcados e dNTPs normais em uma reação de extensão de DNA
resulta na síntese de fitas de DNA de vários comprimentos, pois os didesoxinucleotídeos são incorporados
aleatoriamente conforme a fita se estende, interrompendo a extensão posterior.
Eram realizadas quatro reações paralelas contendo cada uma das bases ddNTP, seguidas da corrida
dos produtos em quatro canaletas de um gel de poliacrilamida. Dessa forma, através de uma
autorradiografia, podia-se inferir qual era a sequência de nucleotídeos na amostra, pois havia uma banda
radioativa na canaleta correspondente naquela posição do gel. A precisão, robustez e facilidade de
execução levaram o sequenciamento Sanger a se tornar a tecnologia mais usada para sequenciamento de
DNA nos anos após o seu desenvolvimento.
Uma série de melhorias foram feitas no sequenciamento de Sanger nos anos seguintes, o que
envolveu principalmente a substituição da radiomarcação por detecção baseada em fluorometria (o que
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permitiu que a reação ocorresse em um único tubo em vez de quatro) e o aprimoramento da detecção por
eletroforese capilar. Essas duas melhorias contribuíram para o desenvolvimento de máquinas de
sequenciamento de DNA cada vez mais automatizadas, que foram usadas para sequenciar os genomas de
espécies cada vez mais complexas.
Essas máquinas de sequenciamento de primeira geração eram capazes de realizar leituras com
comprimentos ligeiramente inferiores a um quilobase (kb). Para analisar fragmentos mais longos, os
pesquisadores usavam técnicas como o sequenciamento shotgun, em que fragmentos de DNA
sobrepostos eram clonados e sequenciados separadamente e, em seguida, montados em uma longa
sequência contígua (contig) in silico.
Inicialmente, no método Sanger, a molécula de DNA era amplificada usando um primer

marcado e depois dividida em quatro tubos separados, cada um contendo apenas um
tipo de ddNTP. Dessa forma, cada mix de reação tinha apenas um tipo de nucleotídeo
modificado que poderia causar a terminação da cadeia. Depois que as quatro reações eram
concluídas, a mistura de fragmentos de DNA produzidos era submetida à eletroforese em
gel de poliacrilamida e era separada de acordo com seu comprimento.
Esse método foi posteriormente modificado para que cada ddNTP tivesse um marcador
fluorescente diferente. O primer não era mais a fonte do da marcação radioativa ou
fluorescente. Esse método foi conhecido como sequenciamento dye-terminator, pois usa
quatro corantes com espectros de emissão não sobrepostos, um para cada ddNTP, o que
permite que toda a reação seja realizada em um único tubo.
O desenvolvimento de técnicas como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e tecnologias de DNA

recombinante representou um grande auxílio para a revolução genômica, pois forneciam meios de gerar
altas concentrações de amostras de DNA puras para o sequenciamento. O surgimento de sequenciadores
didesoxi mais novos (como a linha ABI PRISM produzida pela Applied Biosystems) permitiu o
sequenciamento simultâneo de centenas de amostras. Esses sequenciadores passaram a ser usados no
Projeto Genoma Humano.
A figura a seguir traz uma representação gráfica dos dois métodos de sequenciamento de primeira
geração. Vamos entender como eles funcionam.
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Legenda: Tecnologias de sequenciamento de DNA de primeira geração.
Fonte: Heather; Chain, 2016.
A figura acima representa as tecnologias de sequenciamento de DNA de primeira geração. A

amostra de DNA a ser sequenciada (a) é ilustrada passando pelo sequenciamento de Sanger (b) e Maxam-
Gilbert (c).
b) Sequenciamento de terminação em cadeia de Sanger: os nucleotídeos ddNTP marcados com

radiação ou fluorescência (que uma vez incorporados evitam extensão adicional) são incluídos nas reações
de polimerização de DNA em baixas concentrações. Consequentemente, em cada uma das quatro reações,
fragmentos da sequência são gerados com truncamentos em 3' à medida que os ddNTPs são incorporados
aleatoriamente em pontos específicos das fitas sintetizadas (caracteres terminais 3' sublinhados).
c) Método de sequenciamento químico de Maxam e Gilbert: primeiramente, o DNA deve ser

marcado, o que é feito geralmente pela inclusão de P32 radioativo na porção 5' (mostrado na figura por Ⓟ).
Diferentes tratamentos químicos são usados para remover seletivamente a base de uma pequena
proporção de sítios do DNA. A hidrazina remove as bases pirimídicas (citosina e timina), enquanto a
hidrazina na presença de altas concentrações de sal só consegue remover as citosinas. Posteriormente, um
ácido é usado para remover as bases púricas (adenina e guanina), com o sulfato de dimetila sendo usado
para atacar as guaninas (o que também pode afetar a adenina, mas em uma extensão muito menor). Em
seguida, a piperidina é usada para clivar o esqueleto fosfodiéster no sítio abásico (sem base nitrogenada),
produzindo fragmentos de comprimento variável.
d) Os fragmentos gerados a partir dessas duas metodologias podem ser visualizados por meio de
eletroforese em gel de poliacrilamida de alta resolução. As sequências são inferidas pela leitura do gel, uma
vez que os fragmentos de DNA mais curtos migram mais rapidamente. No sequenciamento Sanger (à
esquerda), a sequência é inferida ao encontrar a canaleta em que a banda está presente para um
determinado sítio, pois o ddNTP marcado com terminação 3' corresponde à base nessa posição. O
sequenciamento Maxam-Gilbert requer uma pequena etapa adicional: Ts e As podem ser inferidos
diretamente de uma banda nas canaletas de pirimidina ou purina, respectivamente, enquanto Gs e Cs são
indicados pela presença de bandas duplas nas canaletas G e A + G, ou canaletas C e C + T, respectivamente.
2.3.1 - Análise de Sequenciamento Sanger por Eletroforese Capilar
A tecnologia de sequenciamento Sanger de última geração usa eletroforese capilar (uma pequena
fibra de vidro oca preenchida com uma resina) para separar os fragmentos de DNA. Os terminadores
ddNTPs são marcados com quatro corantes fluorescentes, que emitem luz em um comprimento de onda
específico quando iluminados com um laser, conforme os fragmentos de DNA passam por um capilar de
vidro. Cada tipo de ddNTP é marcado com um corante fluorescente diferente, o que permite que os quatro
tipos sejam empregados em uma única reação e os fragmentos sejam analisados juntos. As sequências de
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fragmentos de DNA variando de 50–100 bp até 1000 bp podem ser analisadas em um único capilar. À
medida que os detectores de luz coletam as informações de cor dos fragmentos de DNA que passam pelo
capilar, elas são traduzidas em um cromatograma que pode ser visualizado usando um software de análise
de DNA e são interpretadas com as letras A, C, G e T. O gráfico que representa o resultado do
sequenciamento de DNA é denominado eletroferograma.
Legenda: Diagrama básico do sequenciamento Sanger realizado em um sequenciador de DNA capilar.

A figura a seguir demonstra como interpretar o resultado do sequenciamento pelo método de

Sanger realizado por eletroforese capilar.
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Legenda: Análise de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) usando sequenciamento de Sanger. (A) Único pico “A” é indicativo de
um genótipo homozigoto A. (B) Pico “C” único é indicativo de um genótipo homozigoto C. (C) Presença de ambos os picos “A” e “C” é
indicativa de um genótipo heterozigoto A/C.
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(INSTITUTO AOCP - ITEP - RN - 2018 - Perito Criminal - Farmácia Bioquímica) Preencha as lacunas e
assinale a alternativa correta. A eletroforese capilar em solução livre é um dos modos de separação
eletroforética mais usados na prática, provavelmente em razão da facilidade de sua implementação e
otimização das condições experimentais. A separação ocorre como resultado de duas estratégias:
____________ as diferenças entre as mobilidades efetivas dos solutos e _______________ as causas de
alargamento das zonas.
A) alcalinizar / acidificar
B) acidificar / alcalinizar
C) minimizar / maximizar
D) maximizar / minimizar
E) estacionar / maximizar
Comentários:
Por ser um método de separação, é esperado que na eletroforese capilar as diferenças entre as mobilidades
efetivas dos solutos sejam maximizadas e as causas de alargamento das zonas sejam minimizadas, o que
promoverá um resultado com melhor resolução.
Logo, a frase ficará da seguinte forma:
"A separação ocorre como resultado de duas estratégias: maximizar as diferenças entre as mobilidades
efetivas dos solutos e minimizar as causas de alargamento das zonas".
Gabarito: alternativa D.
(IBFC - POLÍCIA CIENTÍFICA-PR - 2017 - Químico Legal) O sequenciamento tradicional de DNA (ácido
desoxirribonucleico) utiliza o método de terminação de cadeia. Sobre esse procedimento, analise as
afirmativas abaixo.
I. As fitas complementares de DNA podem ser separadas pelo aquecimento, que quebra as ligações de
hidrogênio entre as bases.
II. Fragmentos de polinucleotídeos, que terminam em posições correspondentes a cada um dos quatro
nucleotídeos, são formados.
III. O primeiro passo nesse procedimento é a obtenção de fitas duplas de polinucleotídeos.
Assinale a alternativa correta.
A) Está correta a afirmativa I, apenas
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B) Estão corretas as afirmativas I e III, apenas
C) Está correta a afirmativa III, apenas
D) Estão corretas as afirmativas I e II, apenas
E) Estão corretas as afirmativas I, II e III
Comentários:
Vamos analisar cada uma das afirmativas:
I: certa. O calor é capaz de desnaturar a molécula de DNA, levando à quebra das ligações de hidrogênio que
unem as duas fitas. Este procedimento é empregado na técnica de sequenciamento Sanger, para obter fitas
simples de DNA.
II: certa. O sequenciamento Sanger leva à formação de fragmentos de DNA de vários comprimentos
diferentes, devido à presença de ddNTPs no mix, que impedem que a extensão da fita continue.
III: errada. O primeiro passo nesse procedimento é a obtenção de fitas simples (e não fitas duplas) de
polinucleotídeos.
Logo, estão corretas as afirmativas I e II, apenas.
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2.4 - Sequenciamento de nova geração
Os métodos de sequenciamento de nova geração (Next Generation Sequencing - NGS) ou métodos

de sequenciamento de alto rendimento (High Throughput Sequencing - HTS) são tecnologias mais
recentes, amplamente empregados quando genomas inteiros precisam ser sequenciados.
Esses métodos são capazes de executar milhões de reações de sequenciamento em paralelo, o que
representou um grande avanço em relação aos métodos de primeira geração. O desenvolvimento do NGS
permitiu a diminuição do custo e do tempo das reações de sequenciamento.
Os métodos de NGS podem ser divididos em duas categorias: sequenciamentos de segunda

geração e sequenciamentos de terceira geração, sendo que algumas fontes também consideram uma
quarta geração de sequenciamento. Esses métodos não são comumente cobrados em provas de concurso,
então veremos apenas os mais conhecidos e de forma breve.
2.4.1 - Sequenciamento de segunda geração
Ao mesmo tempo que o sequenciamento Sanger era aprimorado, cientistas começaram a

desenvolver uma nova metodologia de sequenciamento que não utilizava dNTPs ou primers marcados com
radiação ou fluorescência para inferir a sequência dos nucleotídeos. Em vez disso, era utilizado um método
luminescente para medir a síntese de pirofosfato, método que consistia em um processo que envolvia duas
enzimas, no qual a ATP sulfurilase é usada para converter o pirofosfato em ATP, que é então usado como
substrato para a luciferase, produzindo luz proporcional à quantidade de pirofosfato. Esta abordagem foi
usada para inferir a sequência medindo a produção de pirofosfato à medida que cada nucleotídeo é
adicionado ao sistema sobre o DNA molde afixado a uma fase sólida.
É importante ressaltar que, apesar das diferenças metodológicas, tanto o método de Sanger quanto
esse método de pirossequenciamento são técnicas de sequenciamento por síntese (sequence-by-
synthesis - SBS), pois ambos requerem a ação direta da DNA polimerase para produzir um resultado
passível de ser analisado, o que não ocorre na técnica de Maxam-Gilbert.
Esta técnica de pirossequenciamento, iniciada por Pål Nyrén e colaboradores, apresentava uma
série de características positivas: poderia ser realizado usando nucleotídeos naturais (em vez dos dNTPs
modificados usados no método de terminação de cadeia) e o resultado podia ser observado em tempo real
(dispensando as eletroforeses demoradas). Outras melhorias posteriores foram: anexar o DNA a esferas
paramagnéticas e degradar enzimaticamente dNTPs não incorporados para remover a necessidade de
etapas de lavagem. A principal desvantagem apresentada por esta técnica é determinar quantos do mesmo
nucleotídeo existem em sequência em uma determinada posição, uma vez a intensidade da luz liberada não
é linear acima de quatro ou cinco nucleotídeos idênticos.
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O pirossequenciamento foi posteriormente licenciado pela 454 Life Sciences (mais tarde adquirida
pela Roche), e se tornou a primeira grande tecnologia comercial de sequenciamento de nova geração de
sucesso. As máquinas de sequenciamento produzidas pela 454 representaram uma grande evolução, pois
permitiram o processamento paralelo massivo das reações de sequenciamento, aumentando muito a
quantidade de DNA que pode ser sequenciado em uma única corrida.
Várias outras técnicas de sequenciamento massivo paralelo surgiram após o sucesso da 454, com
destaque para o método de sequenciamento Solexa, que mais tarde foi adquirido pela Illumina. Em vez de
usar esferas, esta técnica emprega moléculas de DNA anexadas a adaptadores que servem para fixar essas
moléculas a uma placa de vidro. Em seguida, uma PCR em fase sólida produz aglomerados clonais de cada
uma das fitas de DNA ligadas à placa de vidro. A etapa de sequenciamento é realizada por SBS
(sequenciamento por síntese) usando dNTPs fluorescentes terminadores reversíveis, que não conseguem
se ligar a outros nucleotídeos, pois o fluoróforo ocupa a posição hidroxila 3'. Este fluoróforo é clivado antes
que a polimerização continue, o que permite que o sequenciamento ocorra de maneira síncrona. Em cada
ciclo, a identidade do nucleotídeo incorporado pode ser monitorada por um sensor que detecta a excitação
dos fluoróforos com lasers, antes da remoção enzimática das porções fluorescentes.
Juntamente com o sequenciamento 454 e Solexa/Illumina, uma terceira opção de sequenciamento

de segunda geração foi o sequenciamento por ligação e detecção de oligonucleotídeo (sequencing by
oligonucleotide ligation and detection - SOLiD) do sistema da Applied Biosystems (que se tornou Life
Technologies após uma fusão com a Invitrogen). O sequenciamento SOLiD não é realizado por síntese (não
é catalisado com uma polimerase), mas por ligação, usando uma DNA ligase.
Outra tecnologia baseada na sequência por ligação (SBS) que merece atenção é a técnica de
sequenciamento por nanoesfera de DNA (DNA nanoball Sequencing) da Complete Genomic. A geração da
população de DNA clonal é promovida por uma amplificação circular que é usada para gerar longas cadeias
de DNA que consistem em unidades repetidas da sequência molde ligada a adaptadores, que se
automontam em nanoesferas e posteriormente são fixadas em uma lâmina para serem sequenciadas.
A última plataforma de sequenciamento de segunda geração que merece ser mencionada é a Ion
Torrent (outro produto da Life Technologies), que foi a primeira tecnologia chamada de sequenciamento
pós-luz, pois não usa fluorescência nem luminescência. De uma maneira análoga ao sequenciamento 454,
esferas contendo populações clonais de fragmentos de DNA (produzidas por meio de uma PCR em emulsão)
são adicionadas a uma placa contendo picopoços (poços muito pequenos), em seguida são adicionados os
nucleotídeos. Porém, a incorporação dos nucleotídeos não é medida pela liberação de pirofosfato, mas pela
diferença de pH causada pela liberação de prótons (íons H+) durante a polimerização, o que é possível
devido à tecnologia de semicondutor de óxido metálico (metal-oxide-semiconductor - CMOS) usada na
fabricação de chips microprocessadores.
Como se pode perceber, as várias tecnologias de sequenciamento de segunda geração apresentam

uma grande diversidade de metodologias. Contudo, nos últimos anos, a plataforma de sequenciamento da
Illumina tem sido a mais utilizada, sendo considerada uma grande contribuição para a segunda geração de
sequenciadores de DNA.
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2.4.2 - Sequenciamento de terceira geração
Apesar de não existir um consenso entre diferentes autores, nessa aula consideraremos como
tecnologias de terceira geração aquelas capazes de sequenciar moléculas únicas, não necessitando de
amplificação anterior do DNA.
A primeira tecnologia de sequenciamento de molécula única (single molecule sequencing - SMS) foi
comercializada pela Helicos BioSciences, e apresentava um funcionamento semelhante à Illumina. Na
plataforma HelisCope, os moldes de DNA são anexados a uma superfície plana e, em seguida, dNTPs
fluorescentes terminadores reversíveis são adicionados uma base por vez e imagens são capturadas antes
da clivagem e do ciclo da próxima base. Esta foi a primeira tecnologia a permitir o sequenciamento de DNA
não amplificado. Contudo, a Helicos entrou em falência no início de 2012.
Outra tecnologia de terceira geração é a plataforma em tempo real de molécula única (single
molecule real time - SMRT) da Pacific Biosciences, disponível na linha de máquinas PacBio. Durante a
execução do SMRT, a polimerização do DNA ocorre em matrizes de nanoestruturas microfabricadas,
chamadas guias de onda de modo zero (zero-mode waveguides - ZMWs), que são pequenos orifícios em
um filme metálico recobrindo um chip. Esses ZMWs exploram as propriedades da luz que passa por
aberturas de diâmetro menor que seu comprimento de onda, o que faz com que ela decaia
exponencialmente, iluminando exclusivamente o fundo dos poços. Isso permite a visualização de moléculas
únicas de fluoróforo perto da parte inferior do ZMW, devido à zona de excitação do laser ser tão pequena,
mesmo com a presença de moléculas próximas em solução. A deposição de moléculas únicas de DNA
polimerase dentro dos ZMWs as coloca dentro da região iluminada. Com a adição da biblioteca de DNA de
interesse e de dNTPs fluorescentes, a extensão das cadeias de DNA por nucleotídeos únicos pode ser
monitorada em tempo real, uma vez que o nucleotídeo fluorescente é incorporado e emite fluorescência
detectável, após a qual o corante é clivado, cessando o sinal. Este processo pode sequenciar moléculas
únicas em um período de tempo muito curto.
A linha PacBio possui uma série de características vantajosas. Como o sequenciamento ocorre na
velocidade da atuação da polimerase, ele produz dados cinéticos, permitindo a detecção de bases
alteradas. Além disso, máquinas PacBio também são capazes de produzir leituras extremamente longas,
podendo exceder 10 kb de comprimento, sendo uma ferramenta útil para montagem de genomas de novo
(novos genomas).
Por fim, merece destaque a tecnologia de sequenciamento em nanoporo (NanoPore) da Oxford,

que usa nanoporos para a detecção e quantificação de vários tipos de moléculas biológicas e químicas. A
passagem das moléculas através de canais iônicos bloqueia o fluxo de íons, diminuindo a corrente por um
período de tempo proporcional ao comprimento do ácido nucleico. Os equipamentos de sequenciamento
em nanoporo apresentam um tamanho compacto e um baixo custo em relação às outras plataformas NGS.
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2.5 - Aplicações do sequenciamento de DNA
De uma forma geral, o sequenciamento de DNA está se tornando cada vez mais comum,
apresentando muitas aplicações em diferentes contextos. Vejamos alguns exemplos.
2.5.1 - Diagnóstico
O sequenciamento genômico pode ser muito útil para investigar doenças de etiologia genética. A
análise do exoma, que compreende todos os genes expressos de um organismo, mostrou-se promissora na
identificação dos alelos causais para muitas doenças hereditárias. Além disso, o NGS tem desempenhado
um papel importante na evolução da compreensão de neoplasias. Compreender as bases genéticas de um
câncer faz com que os médicos tenham um direcionamento melhor para tomar decisões sobre o manejo do
paciente, o que inclui opções de tratamento ideais para cada indivíduo e para cada tipo de câncer. Um
exemplo conhecido envolve os genes BRCA1 e BRCA2, cujas variantes patogênicas têm um enorme impacto
na probabilidade de desenvolver câncer de mama. Mulheres portadoras de alguns alelos patogênicos
podem até optar por cirurgias preventivas, como mastectomias duplas.
2.5.2 - Pesquisa
O sequenciamento do DNA já se tornou parte integrante da maioria dos laboratórios de pesquisa,

sendo usado para verificar os resultados de experimentos de clonagem e para entender o efeito de genes
específicos. As tecnologias NGS são usadas para estudar variações nas composições genéticas de
plasmídeos, bactérias, leveduras, nematoides e até mesmo mamíferos usados em experimentos científicos.
O sequenciamento de DNA fornece informações sobre os elementos regulatórios do genoma de

cada célula e as variações em sua atividade em diferentes tipos de células e indivíduos. Como exemplo, um
determinado gene pode estar permanentemente desativado em alguns tecidos, enquanto é expresso
constitutivamente em outros. Da maneira semelhante, indivíduos com suscetibilidade para desenvolver
uma determinada doença podem apresentar genes regulados de maneira diferente em comparação com
indivíduos que são imunes para a mesma doença. Essas diferenças nas regiões regulatórias do DNA podem
ser demonstradas por meio de sequenciamento e podem fornecer informações que ajudam a elucidar
determinados fenótipos.
2.5.3 - Forense
A capacidade de usar pequenas quantidades de DNA para obter resultados de sequenciamento

confiáveis tem sido extremamente útil para o campo da ciência forense. De particular importância é a
19
possibilidade de sequenciar diferentes DNAs em uma amostra com vários doadores, pois cenas de crime
frequentemente contêm material genético de várias pessoas. O NGS tem sido adotado em muitos
laboratórios forenses para identificação humana. Além disso, avanços recentes permitem o
sequenciamento post mortem do exoma de um indivíduo, o que pode ser útil para ajudar a esclarecer a
causa da morte. Por exemplo, uma morte causada por envenenamento pode estar associada a alterações
no exoma dos órgãos afetados. Além disso, o sequenciamento do DNA também pode determinar se o
indivíduo tinha uma doença ou uma predisposição genética preexistente.
20
3 - Teste de Paternidade
O exame genético para determinação da paternidade é um teste extremamente confiável,

atingindo 99,9% de acurácia nos seus resultados, e que permite excluir ou confirmar com alta precisão a
paternidade biológica de alguém pela análise comparativa do DNA do filho com o do suposto pai.
No genoma humano existem regiões do DNA que são compostas por sequências repetitivas
altamente polimórficas, ou seja, sequências que são muito variáveis entre indivíduos diferentes. Sendo
assim, é altamente improvável que duas pessoas que não possuam parentesco apresentem o mesmo
genótipo nessas regiões. O exame de paternidade se baseia na análise de diversas regiões polimórficas
repetitivas espelhadas pelo genoma a fim de determinar a compatibilidade dos alelos entre o filho e o
suposto pai. Sabendo-se que todos os indivíduos herdam 50% do DNA da mãe e 50% do DNA do pai, os
alelos que não forem maternos são necessariamente paternos. Assim, quando há compatibilidade de alelos,
pode-se afirmar com pelo menos 99,9999% de certeza que existe uma relação de paternidade e, da mesma
forma, quando os alelos não são compatíveis, pode-se excluir a paternidade com o mesmo nível de certeza.
O método de biologia molecular utilizado para os testes de paternidade é a PCR, que permite
amplificar os fragmentos a serem analisados. Ao final da técnica, as amostras são aplicadas em um gel para
eletroforese e a análise é realizada através da comparação das bandas. Como veremos no exemplo a
seguir.
A figura abaixo mostra um resultado no gel de eletroforese. A posição das bandas é correspondente
ao tamanho da sequência de DNA analisada. Como as sequências avaliadas são repetitivas, a variabilidade
está no tamanho das repetições. Assim, os alelos são compatíveis se estiverem na mesma “altura” no gel,
ou seja, se apresentarem o mesmo tamanho.
21
Fonte: https://www.citocamp.com.br/paternidade/pcr.html
Sabemos que um dos alelos do filho é de origem materna e o outro é de origem paterna. Na figura
acima podemos ver que a segunda coluna mostra os alelos maternos, a terceira coluna os alelos do filho
e a quarta coluna os alelos do suposto pai. A banda superior do filho (o primeiro alelo) é compatível com a
banda superior da mãe, ou seja, estão na mesma altura no gel, ou em outras palavras, os fragmentos de
DNA apresentam o mesmo tamanho. Assim, se sabemos que a primeira banda do filho veio da mãe, a
segunda banda, a mais inferior tem que ser igual a um dos alelos do pai. Na figura, podemos observar que a
banda mais inferior (o segundo alelo) do filho combina com a banda mais superior do suposto pai,
portanto, podemos afirmar a paternidade.
Vamos ver abaixo um outro exemplo:
22
Fonte: http://sites.ffclrp.usp.br/laife/teia/Arquivos/Apostilas/10%20-%2008-10-05/Turma%20I/Paternidade/Apostila%20-
%20Paternidade.pdf
A figura acima mostra um outro exemplo de teste de paternidade, mas dessa vez temos dois
supostos pais representados nas colunas P1 e P2. Começamos a análise, então, vendo qual dos alelos do
filho veio da mãe. Ao observarmos o gel, fica fácil afirmar que a banda superior do filho é compatível com a
banda superior da mãe, portanto, a banda inferior (o segundo alelo) tem que ser obrigatoriamente
compatível com um alelo paterno. Dentre os dois supostos pais, vemos que apenas o P1 apresenta uma
banda na mesma altura que a banda inferior do filho e, portanto, ele é o pai biológico. É importante
observar que o P2, também apresenta uma banda na mesma altura que a do filho, só que já sabemos que
esse alelo específico foi herdado da mãe, portanto, P2 não é o pai biológico e temos um caso de exclusão
da paternidade.
Além da análise em gel, atualmente a PCR em tempo real permite a análise com marcadores de
fluorescência. Nesse método, a intensidade do sinal corresponde à quantidade de material amplificado.
Os testes de paternidade podem ser realizados ainda no pré-natal, através da coleta de materiais
que tenham DNA do feto, como líquido amniótico ou vilo corial. As amostras de vilo podem ser coletadas
a partir da 10ª semana de gestação através de uma aspiração de células da placenta. Já a coleta de líquido
amniótico pode ser feita a partir da 14ª semana de gravidez.
23
A mesma metodologia empregada para investigação de paternidade pode ser utilizada
em outros tipos de análise de parentesco.
Também é possível utilizar esta metodologia para identificação de indivíduos, como por
exemplo, a partir da comparação de uma amostra desconhecida obtida em uma cena de
crime com uma amostra de um indivíduo suspeito de ter cometido tal crime.
(CESPE - POLÍCIA CIENTÍFICA - PE - 2016 - Perito Criminal - Ciências Biológicas e Biomedicina) A

respeito de eletroforese, uma metodologia amplamente empregada para separação, isolamento,
análise e manipulação dos ácidos nucleicos, assinale a opção correta.
A) A quantificação de DNA em gel de agarose é uma técnica de menor precisão, comparada a eletroforese
em acrilamida, sendo utilizada como instrumento para averiguação de êxito na etapa de extração.
B) A eletroforese em gel de agarose é usada para separar proteínas de tamanhos diferentes, que podem ser
detectadas por fluorescência.
C) A identificação dos fragmentos amplificados de DNA não pode ser realizada em gel de poliacrilamida.
D) A eletroforese consiste na migração das partículas de uma solução coloidal sob a influência de um campo
magnético onde a polaridade negativa atrai as moléculas.
E) Os ácidos nucleicos possuem uma carga geral total positiva, devido aos seus grupamentos fosfato do
arcabouço e, consequentemente, quando aplicados em um gel de agarose ou poliacrilamida, migram em
direção ao ânodo.
Comentários:
Letra A: correta. A eletroforese em gel de poliacrilamida é capaz de separar fragmentos menores,
apresentando, portanto, uma melhor resolução em comparação à eletroforese em gel de agarose, que
geralmente é empregada na análise de fragmentos maiores de DNA. Este é o nosso gabarito.
24
Letra B: errada. A eletroforese em gel de agarose não pode ser usada para separar proteínas, porque seus
poros são muito grandes.
Letra C: errada. A identificação dos fragmentos amplificados de DNA pode (e é) realizada em gel de
poliacrilamida.
Letra D: errada. O DNA possui carga negativa, logo é atraído pelo polo positivo.
Letra E: errada. Os ácidos nucleicos possuem uma carga geral total negativa (e não positiva).
Gabarito: alternativa A.
(INSTITUTO AOCP - ITEP - RN - 2018 - Perito Criminal - Farmácia Bioquímica) Marido entra na justiça
para pedir teste de paternidade para comprovar se todos os 3 filhos que ele tem com sua esposa são
mesmo dele. A partir da figura a seguir, baseada nos marcadores genéticos compartilhados ou não por
pai, mãe e filhos, avalie se algum dos 3 filhos realmente não é dele.
A) Filho 1 e 3 não são dele.

B) Filho 2 e 3 não são dele.
C) Filho 1 e 2 não são dele.
D) Nenhum é filho dele.
E) Todos são filhos dele.
Comentários:
25
Vamos comparar as bandas nas canaletas correspondentes aos 3 filhos (3 últimas colunas à direita) com as
bandas das canaletas da mãe, do marido e do outro homem (primeira, segunda e terceira colunas,
respectivamente).
Filho 1: Duas das bandas apresentadas pelo filho 1 (bandas 3 e 6 de cima para baixo) estão presentes apenas
no "outro homem", não sendo encontradas nem na mãe, nem no marido. Logo, podemos afirmar que o
filho 1 não é filho do marido.
Filho 2: Todas as bandas do filho 2 também estão presentes na mãe e no marido. Além disso, nenhuma das
bandas do filho 2 pode ser detectada no "outro homem". Logo, podemos excluir a paternidade do "outro
homem" em relação ao filho 2, mas não podemos excluir a paternidade do marido em relação ao filho 2.
Filho 3: Três das bandas apresentadas pelo filho 3 (bandas 3, 4 e 7 de cima para baixo) estão presentes
apenas no "outro homem", não sendo encontradas nem na mãe, nem no marido. Logo, podemos afirmar
que o filho 3 não é filho do marido.
Em conclusão, a partir da análise das bandas eletroforéticas, podemos afirmar que o filho 1 e o filho 3 não
são dele.
Encerramos aqui a parte teórica da nossa aula.
26
4 – Considerações Finais
Chegamos ao final da aula de Biologia Molecular: métodos de análise do DNA. Este é um tema
complexo, porém de grande relevância para concursos na área de perícia criminal. Então, não deixem de
estudar bastante e praticar com questões sobre o tema.
A seguir eu listei algumas questões que considero difíceis, pois exigem que o candidato tenha um
conhecimento aprofundado da genética e da biologia molecular como um todo. Portanto, não fiquem
chateados se não conseguirem resolvê-las na primeira tentativa. E se precisarem de ajuda, podem contar
comigo.
Se tiverem alguma dúvida, estou disponível no fórum de dúvidas e no meu Instagram.
Ana Cristina Lopes
Instagram: https://www.instagram.com/prof.anacristinalopes/
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LISTA DE QUESTÕES
1. (INSTITUTO AOCP - ITEP - RN - 2018 - Perito Criminal - Farmácia Bioquímica) Preencha as lacunas
e assinale a alternativa correta. As duas técnicas mais importantes para o sequenciamento de DNA
são o método ____________________ desenvolvido por Allan Maxam e Walter Gilbert, em 1977, e o
método ____________________ de Fred Sanger e colaboradores, de 1978. Os dois métodos são
baseados na produção de um conjunto de fitas simples de DNA que são separadas pelo princípio de
eletroforese.
A) físico de degradação / desoxi ou terminação de cadeia
B) químico de degradação de bases / didesoxi ou terminação de cadeia
C) químico de depleção de bases / didesoxi ou terminação de cadeia
D) físico de depleção de bases / desoxi ou terminação de cadeia
E) físico de depleção de bases / didesoxi de iniciação de cadeia
2. (NUCEPE - PC-PI - 2018 - Perito Criminal – Biologia) O IBAMA recebeu uma denúncia de que Sr. João
mantinha em cativeiro exemplares de canários que haviam sido capturados na reserva florestal
próxima a sua residência. Ao chegar à residência do Sr. João foram encontrados quatro canários
todos identificados com anilhas, mas quando perguntado sobre onde fica o criadouro que os
venderam, Sr. João se enrola. Desconfiados os fiscais coletam amostras de penas e levam ao
laboratório para a comparação do DNA com os possíveis pais do criadouro indicado pelo Sr. João.
Análise o fingerprint do possível pai (P), mãe (M) e dos canários (C1, C2, C3 e C4) e assinale a
alternativa CORRETA.
28
A) Todos os canários são filhotes do criadouro indicado pelo Sr. João.
B) Apenas C2 e C3 são filhotes do casal.
C) Nenhum dos canários são filhotes do criadouro indicado
D) Apenas C1 e C4 são filhotes do criadouro
E) Certamente um dos canários não é filhote do criadouro indicado.
3. (INSTITUTO AOCP - ITEP - RN - 2018 - Perito Criminal - Ciências Biológicas) Considerando as

técnicas de sequenciamento do DNA, a respeito das características desse tipo de procedimento,
assinale a alternativa correta.
A) O método de dideoxinucleotídeos utiliza o grupo 3-hidroxila.
B) O método Sanger também é conhecido como sequenciamento de nova geração.
C) A presença de ddNTPs na reação dispensa a adição de desoxinucleotídeos trifosfato normais.
D) Os fragmentos resultantes são separados eletroforeticamente e submetidos à autorradiografia.
E) A utilização de vetores plasmidiais, em técnicas de subclonagem de fragmentos de DNA, é denominada
“pirossequenciamento”.
4. (CESPE - SEDUC-AL - 2018 - Professor - Ciências) Com relação ao projeto genoma (humano e outros)
e às estratégias de sequenciamento disponíveis, julgue o item seguinte.
29
As tecnologias de sequenciamento de nova geração se baseiam na química de Sanger, em que se
observa o término da síntese de DNA com a incorporação de sondas fluorescentes.
Certo
Errado
As técnicas de sequenciamento genômico se baseiam na tradução da dupla fita de DNA em

moléculas de fita simples.
Certo
Errado
O projeto genoma humano teve como objetivo o sequenciamento das moléculas de desoxirribose
presentes no genoma humano.
Certo
Errado
No projeto genoma humano, foi empregado o método de Sanger, que adicionava nucleotídeos
modificados, os didesoxirribonucleotídeos, para impedir o crescimento de um fragmento de DNA
em replicação pela DNA polimerase.
Certo
Errado
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8. (UPENET/IAUPE - UPE - 2017 - Biólogo) Observe as pentoses abaixo:
Fonte: www.google-imagens.com (Adaptado)
Sobre elas, é CORRETO afirmar que

A) a pentose 1, juntamente com o grupamento fosfato e uma base nitrogenada, irá formar um nucleosídeo
que irá compor o ácido desoxirribonucleico durante a replicação, a recombinação gênica e o reparo.
B) a pentose 2, em conjunto com uma das bases nitrogenadas púricas uracila ou adenina, irá formar o
nucleotídeo que irá compor o ácido ribonucleico durante a transcrição.
C) a pentose 3, juntamente com o grupamento fosfato e uma base nitrogenada, irá formar um nucleotídeo,
que poderá ser utilizado em reação de sequenciamento, visto não possuir uma 3‟OH livre para a ação da
DNA polimerase.
D) os carbonos 1‟ e 2‟ indicam o tipo da pentose, se esta é uma ribose ou uma desoxirribose, enquanto o
carbono 4‟ de uma pentose é o local de inserção da base nitrogenada.
E) o carbono 3‟ é o local onde o grupamento fosfato se liga e o carbono 5‟; é o sítio onde as polimerases
atuam, sendo os carbonos da ligação fosfodiéster responsáveis pelo sentido da síntese 5‟-3‟ nos processos
de replicação, transcrição e tradução.
9. (FUNCERN - IF-RN - 2017 - Professor - Biologia) Entre as técnicas usadas na biotecnologia,

A) na reação em cadeia da polimerase (PCR), utiliza-se a DNA helicase para separar as fitas de DNA a 94° C.
B) na técnica do DNA recombinante, utilizam-se as endonucleases e a TAq polimerase para unir as duas fitas
de DNA.
C) a biobalística usa microprojéteis revestidos com DNA para identificar trechos que se repetem no DNA.
D) a eletroforese é usada para separar fragmentos de DNA de tamanhos diferentes a partir de corrente
elétrica.
31
10. (IBFC - POLÍCIA CIENTÍFICA-PR - 2017 - Químico Legal) Em todos os organismos, a fonte original de
informação biológica são os ácidos nucleicos. Os ácidos nucleicos podem ser fracionados com base
no tamanho, na composição e na sequência, por meio de ____________________. Assinale a
alternativa que preenche corretamente a lacuna do texto.
A) eletroforese e luminescência
B) espectrografia e cromatografia
C) cromatografia e eletroforese
D) cromatografia e luminescência
E) luminescência e espectrografia
11. (IBFC - POLÍCIA CIENTÍFICA-PR - 2017 - Químico Legal) Analise os itens abaixo referentes a
conceitos e definições.
1. DNA Minissatélite.
2. Eletroforese.
3. Primer.
4. Hibridização.
5. Renaturação do DNA.
J. Método de separação de macromoléculas.
K. Pequeno segmento de DNA ou RNA que, anelado à fita simples de DNA, permite a sintetização
da segunda fita pela DNA polimerase.
L. Quando duas fitas complementares de DNA voltam a se unir por meio de pontes de hidrogênio,
para formar a dupla hélice.
M. Ligação de fitas simples de DNA e/ou RNA por pontes de hidrogênio para formar uma cadeia de
fita dupla.
N. Contém múltiplas repetições em tandem representadas por uma sequência de tamanho

moderado.
Assinale a alternativa cuja correlação entre os itens apresenta-se corretas.

A) 1N – 2M – 3K – 4J – 5L
B) 1K – 2L – 3M – 4J – 5N
32
C) 1N – 2J – 3K – 4M – 5L
D) 1M – 2J – 3K– 4L– 5N
E) 1K – 2M – 3N – 4L – 5J
12. (CCV-UFC - 2016 - Engenheiro Agrônomo) O resultado do sequenciamento de DNA é apresentado

sob a forma de uma gráfico denominado:
A) Rede neural
B) Cladograma
C) Dendrograma
D) Eletroferograma
E) Árvore filogenética
13. (CCV-UFC - 2016 - Engenheiro Agrônomo) A determinação da sequência nucleotídica de uma região
do genoma é o resultado do sequenciamento de DNA. Qual reagente é adicionado em uma reação
de PCR para sequenciamento de DNA que não está presente em uma PCR convencional?
A) Deoxinucleotídeo.
B) Dideoxinucleotídeo.
C) Cloreto de magnésio.
D) Dodecil sulfato de sódio.
E) Ácido desoxirribonucléico.
14. (FCM - IF Farroupilha - RS - 2016 - Engenheiro Agrônomo) A análise de DNA engloba uma série de
procedimentos, sendo a eletroforese uma das técnicas utilizadas para separação dos seus
fragmentos. Analise as afirmativas abaixo:
( ) Bandas podem ser observadas na luz ultravioleta.
( ) Enzimas de restrição cortam o DNA em sítios específicos.
( ) DNA é extraído e purificado, eliminando proteínas e RNA.
( ) Padrões de tamanho conhecido são inseridos para comparação.

33
( ) Fragmentos de DNA, com carga negativa, migram para o polo positivo.
( ) Amostras são colocadas em um gel no qual se aplica um campo elétrico.
A sequência da realização da etapa de eletroforese é

A) 6, 2, 1, 4, 5, 3.
B) 6, 4, 3, 2, 5, 1.
C) 5, 1, 4, 2, 3, 6.
D) 5, 2, 3, 1, 4, 6.
E) 1, 2, 3, 5, 4, 6.
15. (IBFC - POLÍCIA CIENTÍFICA-PR - 2017 - Químico Legal) As chamadas impressões digitais do DNA
(ácido desoxirribonucleico) são objeto de análise nos estudos forenses. A respeito disso, analise as
afirmativas abaixo.
I. A técnica de impressão digital genética, iniciou-se pela descoberta por Kary Mullis, em 1983, da
reação em cadeia da polimerase (PCR), juntamente com a descoberta nos finais da década de 80 de
repetições pequenas em série (STRs) - sequências repetitivas de 2-9 pb, também designadas por
microssatélites.
II. Testagem forense de DNA aproveita as variações de sequência do DNA ou polimorfismos que
ocorrem entre indivíduos. Há métodos que examinam sequências de DNA repetitivas não
codificantes em amostras que foram ampliadas por PCR (reação em cadeia pela polimerase).
III. Aleatoriamente, sequências de DNA repetitivas ocorrem pelo genoma humano e incluem STR
(repetições pequenas em tandem), as quais contêm números variáveis de segmentos de repetição
de pares de bases.

34
16. (IESES - IGP-SC - 2017 - Perito Médico Legista) A análise de DNA tem revolucionado as ciências
forenses desde a sua introdução, em meados dos anos 1980, tendo tido seu grande avanço na
década de 1990, continuando a revolucionar as perícias laboratoriais em consequências dos
adventos tecnológicos constantes. A partir da análise das sentenças abaixo, assinale a alternativa
que lista todas as sentenças verdadeiras.
I. O marcador genético usado como padrão ouro nas análises periciais, para gerar os perfis de DNA,
são os do tipo SNP (Single Nucleotide Polymorphism, ou Polimorfismo de uma única base), por
apresentarem maior poder de discriminação, repetições sequenciais de 3-5 pares de bases e por
serem de fácil amplificação no laboratório.
II. A grande revolução da Genética Forense se deu na década de 1990 com o advento da técnica de
PCR, que permitiu também a análise de materiais e amostras armazenados, que não continham
suficiente quantidade de DNA para serem avaliados pela metodologia vigente na época.
III. A análise de DNA mitocondrial (mtDNA) tem sido de grande auxílio em algumas situações onde
não é possível gerar o perfil genético padrão como, por exemplo, amostras degradadas e fios de
cabelo sem raiz (ou bulbo).
IV. Vestígios coletados em locais de crime (amostras questionáveis) só podem ser processados para
obtenção de perfil de DNA quando houver(em) amostra(s) referência(s) para comparação. Caso
contrário, os mesmos devem ficar armazenados.
V. A análise de DNA, por ser uma prova técnica, que utiliza protocolos e kits comerciais validados
para identificação humana e baseada em cálculos estatísticos, pode ser considerada infalível e,
portanto, como a mais importante das provas, e ser usada como prova única.
Alternativas:
A) I, II e V
B) II e V
C) II e III
D) I, III, IV e V
17. (IESES - IGP-SC - 2017 - Perito Criminal Bioquímico) O genoma humano é constituído por grande
quantidade de DNA que contém na sua estrutura as informações necessárias para especificar as
características essenciais que fazem dos seres humanos organismos funcionais. Sobre a
organização do genoma humano analise qual(ais) afirmação(ões) a seguir está(ão) corretas:
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I. Os genes são organizados em ordem linear no cromossoma, e cada um possui uma posição precisa
denominada loci.
II. No conceito de autossomas estão incluídos os 23 pares de cromossomas, havendo diferença nos
homens (XY) e nas mulheres (XX) em apenas um par.
III. Além do genoma nuclear, o genoma da mitocôndria integra o genoma humano. E cada célula
pode conter centenas ou milhares de mitocôndrias.
IV. Considerando o número de indivíduos da espécie humana, se espera que ocorram diversas
variações genômicas, por esse motivo no projeto genoma humano os genomas sequenciados são
considerados como “referência” da espécie.
V. Dos bilhões de pares de base que compõem o DNA humano em cada genoma, apenas 1,5% ou
menos codificam proteínas.
Assinale a alternativa que representa a sequência correta:

A) II, III, V.
B) III, IV, V.
C) I, II, IV, V.
D) I, IV, V.
18. (CEPERJ - SEDUC-RJ - 2015 - Professor Docente I - Ciências) Certas bactérias, para se defenderem
do ataque de vírus, produzem enzimas especiais conhecidas como enzimas de restrição. Elas agem:
A) clonando o DNA do vírus e o incorporando
B) causando mutações no DNA do vírus e o matando
C) fragmentando o DNA do vírus e impedindo sua reprodução
D) traduzindo a sequência das bases do RNA para as proteínas
E) produzindo plasmídeos que têm a capacidade de atacar o vírus
19. (CESPE - POLÍCIA CIENTÍFICA - PE - 2016 - Perito Criminal - Odontologia) Três anos depois de ter
sido criado por lei, o banco de amostras de DNA de criminosos brasileiros possui apenas 569
condenados cadastrados, de acordo com relatório do Ministério da Justiça elaborado com dados
coletados em todo o país. Embora no documento tenha sido destacado que o número de
36
cadastrados representa menos de 1% do total de condenados por crimes hediondos e contra a
pessoa — que, em todo o Brasil, corresponde a cerca de 60 mil detentos —, o uso desse banco pela
justiça tem sido fundamental na elucidação de alguns crimes.
O Globo, 16/8/2015 (com adaptações).
Com relação aos métodos utilizados para a composição de um banco de dados de DNA semelhante
ao mencionado no texto, assinale a opção correta.
A) Todo o genoma do indivíduo é sequenciado e armazenado em bancos como o citado no texto.
B) As informações cadastradas no banco se referem ao padrão de polimorfismos do tipo STR para lócus
predeterminados.
C) A base de dados que compõe o tipo de banco mencionado no texto é oriunda do padrão de polimorfismos
do tipo RFLP.
D) Apenas os cromossomos sexuais de uma amostra de DNA são sequenciados para a formação desse tipo
de banco.
E) Somente o DNA mitocondrial dos indivíduos é sequenciado para a formação desse tipo de banco.
20. (INSTITUTO AOCP - UFRB - 2019 - Farmacêutico - Bioquímico) Um microrganismo gram-positivo

foi observado em amostras de tecido obtidas de um paciente com uma doença previamente não
diagnosticada. Qual, dentre as seguintes técnicas, seria mais útil para identificar esse
microrganismo?
A) Eletroforese em gel com poliacrilamida.
B) Espectrofotometria de absorção atômica.
C) Eletroforese com enzimas poliavançadas.
D) Amplificação por PCR e sequenciamento de DNA.
21. (UFU-MG - 2018 - Biomédico) Em relação às principais aplicabilidades das diferentes técnicas de
eletroforese, é correto afirmar que eletroforese
A) capilar é utilizada para técnicas de sequenciamento automático de DNA.
B) em agarose é indicada para análise qualitativa de misturas de proteínas.
C) em gel de poliacrilamida é indicada para medir atividade enzimática.
D) nativa é utilizada principalmente para separação de ácidos nucleicos.
37
22. (CESPE - PC-MA - 2018 - Médico Legista) Com referência à tecnologia do DNA recombinante,
incorporada na rotina forense, assinale a opção correta.
A) A tecnologia de sequenciamento do DNA atualmente utilizada na área forense baseia-se no método
químico conhecido como método de Maxam-Gilbert.
B) Comparativamente à PCR (reação em cadeia da polimerase), a técnica de RFLP (restriction fragment
length polymorphism) tem sido adotada com maior eficiência na análise forense, porque utiliza menor
quantidade de DNA.
C) A PCR (reação em cadeia da polimerase) em uso na área forense utiliza a enzima de restrição DNA
polimerase obtida da bactéria Termophilus aquaticus.
D) Na PCR (reação em cadeia da polimerase), comumente se utiliza didesoxinucleotídios (ddNTPs).
E) Na PCR (reação em cadeia da polimerase), comumente utilizam-se primers ou iniciadores.
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QUESTÕES COMENTADAS
1. (INSTITUTO AOCP - ITEP - RN - 2018 - Perito Criminal - Farmácia Bioquímica) Preencha as lacunas
e assinale a alternativa correta. As duas técnicas mais importantes para o sequenciamento de DNA
são o método ____________________ desenvolvido por Allan Maxam e Walter Gilbert, em 1977, e o
método ____________________ de Fred Sanger e colaboradores, de 1978. Os dois métodos são
baseados na produção de um conjunto de fitas simples de DNA que são separadas pelo princípio de
eletroforese.
A) físico de degradação / desoxi ou terminação de cadeia
B) químico de degradação de bases / didesoxi ou terminação de cadeia
C) químico de depleção de bases / didesoxi ou terminação de cadeia
D) físico de depleção de bases / desoxi ou terminação de cadeia
E) físico de depleção de bases / didesoxi de iniciação de cadeia
Comentários:
Conforme estudamos, as duas técnicas mais importantes para o sequenciamento de DNA são o método
químico de degradação de bases desenvolvido por Allan Maxam e Walter Gilbert, em 1977, e o método
didesoxi ou terminação de cadeia de Fred Sanger e colaboradores, de 1978. Os dois métodos são baseados
na produção de um conjunto de fitas simples de DNA que são separadas pelo princípio de eletroforese.
Gabarito: alternativa B.
2. (NUCEPE - PC-PI - 2018 - Perito Criminal – Biologia) O IBAMA recebeu uma denúncia de que Sr. João
mantinha em cativeiro exemplares de canários que haviam sido capturados na reserva florestal
próxima a sua residência. Ao chegar à residência do Sr. João foram encontrados quatro canários
todos identificados com anilhas, mas quando perguntado sobre onde fica o criadouro que os
venderam, Sr. João se enrola. Desconfiados os fiscais coletam amostras de penas e levam ao
laboratório para a comparação do DNA com os possíveis pais do criadouro indicado pelo Sr. João.
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Análise o fingerprint do possível pai (P), mãe (M) e dos canários (C1, C2, C3 e C4) e assinale a
alternativa CORRETA.
A) Todos os canários são filhotes do criadouro indicado pelo Sr. João.

B) Apenas C2 e C3 são filhotes do casal.
C) Nenhum dos canários são filhotes do criadouro indicado
D) Apenas C1 e C4 são filhotes do criadouro
E) Certamente um dos canários não é filhote do criadouro indicado.
Comentários:
Ao analisarmos o resultado da eletroforese, percebemos que:
C1 possui uma banda que não está presente nem na mãe, nem no pai. Logo, não é filhote do criadouro.
C2 possui uma banda que é igual à do pai e uma banda que é igual à da mãe. Logo, não podemos descartar
os vínculos de maternidade e paternidade com os progenitores do criadouro.
Em conclusão, certamente um dos canários (C1) não é filhote do criadouro indicado.
40
Gabarito: alternativa E.
3. (INSTITUTO AOCP - ITEP - RN - 2018 - Perito Criminal - Ciências Biológicas) Considerando as

técnicas de sequenciamento do DNA, a respeito das características desse tipo de procedimento,
assinale a alternativa correta.
A) O método de dideoxinucleotídeos utiliza o grupo 3-hidroxila.
B) O método Sanger também é conhecido como sequenciamento de nova geração.
C) A presença de ddNTPs na reação dispensa a adição de desoxinucleotídeos trifosfato normais.
D) Os fragmentos resultantes são separados eletroforeticamente e submetidos à autorradiografia.
E) A utilização de vetores plasmidiais, em técnicas de subclonagem de fragmentos de DNA, é denominada
“pirossequenciamento”.
Comentários:
A alternativa A está incorreta. Dideoxinucleotídeos são nucleotídeos modificados que não possuem o
grupamento 3' hidroxila.
A alternativa B está incorreta. Método de Sanger e sequenciamento de nova geração são metodologias
diferentes.
A alternativa C está incorreta. Para a realização do sequenciamento de Sanger é necessário adicionar

desoxinucleotídeos normais (dNTP) e modificados (didesoxinucleotídeos - ddNTP).
A alternativa D está correta e é o gabarito da questão. A eletroforese e autorradiografia são utilizadas para
análise dos resultados do sequenciamento.
A alternativa E está incorreta. A técnica de pirossequenciamento é um método de sequenciamento de

segunda geração, e não uma técnica de subclonagem.
As tecnologias de sequenciamento de nova geração se baseiam na química de Sanger, em que se

observa o término da síntese de DNA com a incorporação de sondas fluorescentes.
41
Certo
Errado
Comentários:
O método de Sanger é uma técnica de sequenciamento de primeira geração, e não uma tecnologia de
sequenciamento de nova geração.
Gabarito: Errado.
As técnicas de sequenciamento genômico se baseiam na tradução da dupla fita de DNA em

moléculas de fita simples.
Certo
Errado
Comentários:
As técnicas de sequenciamento genômico se baseiam na determinação da sequência de nucleotídeos do

DNA, e não na tradução do DNA.
Gabarito: Errado.
O projeto genoma humano teve como objetivo o sequenciamento das moléculas de desoxirribose
presentes no genoma humano.
Certo
Errado
Comentários:
42
O projeto genoma humano teve como objetivo o sequenciamento das bases nitrogenadas presentes no
genoma humano. As moléculas de desoxirribose fazem parte do arcabouço da molécula de DNA, e são
iguais em todos os nucleotídeos.
Gabarito: Errado.
No projeto genoma humano, foi empregado o método de Sanger, que adicionava nucleotídeos
modificados, os didesoxirribonucleotídeos, para impedir o crescimento de um fragmento de DNA
em replicação pela DNA polimerase.
Certo
Errado
Comentários:
O método de terminação em cadeia, também chamado de método Sanger, foi usado para sequenciar o
primeiro genoma humano. Esse método usa ddNTPs para gerar fragmentos de DNA de tamanhos
diferentes e, assim, poder inferir a sequência dos nucleotídeos.
Gabarito: Certo.
8. (UPENET/IAUPE - UPE - 2017 - Biólogo) Observe as pentoses abaixo:
Fonte: www.google-imagens.com (Adaptado)
Sobre elas, é CORRETO afirmar que

A) a pentose 1, juntamente com o grupamento fosfato e uma base nitrogenada, irá formar um nucleosídeo
que irá compor o ácido desoxirribonucleico durante a replicação, a recombinação gênica e o reparo.
43
B) a pentose 2, em conjunto com uma das bases nitrogenadas púricas uracila ou adenina, irá formar o
nucleotídeo que irá compor o ácido ribonucleico durante a transcrição.
C) a pentose 3, juntamente com o grupamento fosfato e uma base nitrogenada, irá formar um nucleotídeo,
que poderá ser utilizado em reação de sequenciamento, visto não possuir uma 3‟OH livre para a ação da
DNA polimerase.
D) os carbonos 1‟ e 2‟ indicam o tipo da pentose, se esta é uma ribose ou uma desoxirribose, enquanto o
carbono 4‟ de uma pentose é o local de inserção da base nitrogenada.
E) o carbono 3‟ é o local onde o grupamento fosfato se liga e o carbono 5‟; é o sítio onde as polimerases
atuam, sendo os carbonos da ligação fosfodiéster responsáveis pelo sentido da síntese 5‟-3‟ nos processos
de replicação, transcrição e tradução.
Comentários:
A alternativa A está incorreta. A pentose 1 é uma ribose, monômero do RNA, pois possui uma hidroxila no
carbono 2'.
A alternativa B está incorreta. A pentose 2 é uma desoxirribose, monômero do DNA, pois não possui uma
hidroxila no carbono 2'.
A alternativa C está correta e é o gabarito da questão. A pentose 3 é um didesoxinucleotídeo (ddNTP),

usado nas reações de sequenciamento. Ele difere do desoxinucleotídeo normal por não possuir uma
hidroxila no carbono 3'.
A alternativa D está incorreta. Apenas o carbono 2 indica o tipo da pentose. E a base nitrogenada se liga ao
carbono 1.
A alternativa E está incorreta. O grupamento fosfato se liga ao carbono. As polimerases se ligam ao

carbono 3, para sintetizar uma fita complementar no sentido 5'-3'.
Gabarito: alternativa C.
9. (FUNCERN - IF-RN - 2017 - Professor - Biologia) Entre as técnicas usadas na biotecnologia,

A) na reação em cadeia da polimerase (PCR), utiliza-se a DNA helicase para separar as fitas de DNA a 94° C.
B) na técnica do DNA recombinante, utilizam-se as endonucleases e a TAq polimerase para unir as duas fitas
de DNA.
C) a biobalística usa microprojéteis revestidos com DNA para identificar trechos que se repetem no DNA.
D) a eletroforese é usada para separar fragmentos de DNA de tamanhos diferentes a partir de corrente
elétrica.
44
Comentários:
A alternativa A está incorreta. Não se usa DNA helicase na PCR. O DNA é desnaturado pela alta
temperatura.
A alternativa B está incorreta. Não se usa DNA polimerase na técnica do DNA recombinante.
A alternativa C está incorreta. A biobalística é um método de transferência de genes, usado para criação de
organismos geneticamente modificados (OGMs).
A alternativa D está correta e é o gabarito da questão. A eletroforese é um método de separação

comumente empregado na análise de DNA.
10. (IBFC - POLÍCIA CIENTÍFICA-PR - 2017 - Químico Legal) Em todos os organismos, a fonte original de
informação biológica são os ácidos nucleicos. Os ácidos nucleicos podem ser fracionados com base
no tamanho, na composição e na sequência, por meio de ____________________. Assinale a
alternativa que preenche corretamente a lacuna do texto.
A) eletroforese e luminescência
B) espectrografia e cromatografia
C) cromatografia e eletroforese
D) cromatografia e luminescência
E) luminescência e espectrografia
Comentários:
Dentre as alternativas apresentadas, são métodos de separação a eletroforese e a cromatografia.
11. (IBFC - POLÍCIA CIENTÍFICA-PR - 2017 - Químico Legal) Analise os itens abaixo referentes a
conceitos e definições.
1. DNA Minissatélite.
2. Eletroforese.
45
3. Primer.
4. Hibridização.
5. Renaturação do DNA.
J. Método de separação de macromoléculas.
K. Pequeno segmento de DNA ou RNA que, anelado à fita simples de DNA, permite a sintetização
L. Quando duas fitas complementares de DNA voltam a se unir por meio de pontes de hidrogênio,
para formar a dupla hélice.
M. Ligação de fitas simples de DNA e/ou RNA por pontes de hidrogênio para formar uma cadeia de
fita dupla.
N. Contém múltiplas repetições em tandem representadas por uma sequência de tamanho

moderado.
Assinale a alternativa cuja correlação entre os itens apresenta-se corretas.

A) 1N – 2M – 3K – 4J – 5L
B) 1K – 2L – 3M – 4J – 5N
C) 1N – 2J – 3K – 4M – 5L
D) 1M – 2J – 3K– 4L– 5N
E) 1K – 2M – 3N – 4L – 5J
Comentários:
A correlação correta de definições é:
1. DNA Minissatélite: N. Contém múltiplas repetições em tandem representadas por uma sequência de
tamanho moderado.
2. Eletroforese: J. Método de separação de macromoléculas.
3. Primer: K. Pequeno segmento de DNA ou RNA que, anelado à fita simples de DNA, permite a sintetização
4. Hibridização: M. Ligação de fitas simples de DNA e/ou RNA por pontes de hidrogênio para formar uma
cadeia de fita dupla.
46
5. Renaturação do DNA: L. Quando duas fitas complementares de DNA voltam a se unir por meio de pontes
de hidrogênio, para formar a dupla hélice.
Logo, a sequência correta é 1N – 2J – 3K – 4M – 5L.
12. (CCV-UFC - 2016 - Engenheiro Agrônomo) O resultado do sequenciamento de DNA é apresentado

sob a forma de uma gráfico denominado:
A) Rede neural
B) Cladograma
C) Dendrograma
D) Eletroferograma
E) Árvore filogenética
Comentários:
Conforme estudamos, o gráfico que representa o resultado do sequenciamento de DNA é denominado

eletroferograma.
13. (CCV-UFC - 2016 - Engenheiro Agrônomo) A determinação da sequência nucleotídica de uma região
do genoma é o resultado do sequenciamento de DNA. Qual reagente é adicionado em uma reação
de PCR para sequenciamento de DNA que não está presente em uma PCR convencional?
A) Deoxinucleotídeo.
B) Dideoxinucleotídeo.
C) Cloreto de magnésio.
D) Dodecil sulfato de sódio.
E) Ácido desoxirribonucleico.
Comentários:
Dentre as alternativas apresentadas, o único reagente que é utilizado no sequenciamento, mas não na PCR
convencional, é o dideoxinucleotídeo.
47
14. (FCM - IF Farroupilha - RS - 2016 - Engenheiro Agrônomo) A análise de DNA engloba uma série de
procedimentos, sendo a eletroforese uma das técnicas utilizadas para separação dos seus
fragmentos. Analise as afirmativas abaixo:
( ) Bandas podem ser observadas na luz ultravioleta.
( ) Enzimas de restrição cortam o DNA em sítios específicos.
( ) DNA é extraído e purificado, eliminando proteínas e RNA.
( ) Padrões de tamanho conhecido são inseridos para comparação.
( ) Fragmentos de DNA, com carga negativa, migram para o polo positivo.
( ) Amostras são colocadas em um gel no qual se aplica um campo elétrico.

A sequência da realização da etapa de eletroforese é
A) 6, 2, 1, 4, 5, 3.
B) 6, 4, 3, 2, 5, 1.
C) 5, 1, 4, 2, 3, 6.
D) 5, 2, 3, 1, 4, 6.
E) 1, 2, 3, 5, 4, 6.
Comentários:
Ao numerar a relação apresentada no enunciado de acordo com a sequência da realização das etapas de
eletroforese, temos:
(6) Bandas podem ser observadas na luz ultravioleta.
(2) Enzimas de restrição cortam o DNA em sítios específicos.
(1) DNA é extraído e purificado, eliminando proteínas e RNA.
(4) Padrões de tamanho conhecido são inseridos para comparação.
(5) Fragmentos de DNA, com carga negativa, migram para o polo positivo.
(3) Amostras são colocadas em um gel no qual se aplica um campo elétrico.
48
Logo, a sequência correta é 6, 2, 1, 4, 5, 3.
15. (IBFC - POLÍCIA CIENTÍFICA-PR - 2017 - Químico Legal) As chamadas impressões digitais do DNA
(ácido desoxirribonucleico) são objeto de análise nos estudos forenses. A respeito disso, analise as
afirmativas abaixo.
I. A técnica de impressão digital genética, iniciou-se pela descoberta por Kary Mullis, em 1983, da
reação em cadeia da polimerase (PCR), juntamente com a descoberta nos finais da década de 80 de
repetições pequenas em série (STRs) - sequências repetitivas de 2-9 pb, também designadas por
microssatélites.
II. Testagem forense de DNA aproveita as variações de sequência do DNA ou polimorfismos que
ocorrem entre indivíduos. Há métodos que examinam sequências de DNA repetitivas não
codificantes em amostras que foram ampliadas por PCR (reação em cadeia pela polimerase).
III. Aleatoriamente, sequências de DNA repetitivas ocorrem pelo genoma humano e incluem STR
(repetições pequenas em tandem), as quais contêm números variáveis de segmentos de repetição
de pares de bases.

Comentários:
I: certa. A descoberta dos microssatélites e o desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase foram

conquistas científicas que possibilitaram o surgimento da técnica de impressão digital genética (genetic
fingerprint).
II: certa. Existe uma grande variabilidade genética entre indivíduos, representada principalmente por
polimorfismos localizados em regiões não codificantes do DNA.
III: certa. Os microssatélites, também chamados de repetições curtas em tandem (STRs), são um tipo de
sequência repetitiva que consiste em repetições de 2 a 9 nucleotídeos.
49
Logo, estão corretas as afirmativas I, II e III.
16. (IESES - IGP-SC - 2017 - Perito Médico Legista) A análise de DNA tem revolucionado as ciências
forenses desde a sua introdução, em meados dos anos 1980, tendo tido seu grande avanço na
década de 1990, continuando a revolucionar as perícias laboratoriais em consequências dos
adventos tecnológicos constantes. A partir da análise das sentenças abaixo, assinale a alternativa
que lista todas as sentenças verdadeiras.
I. O marcador genético usado como padrão ouro nas análises periciais, para gerar os perfis de DNA,
são os do tipo SNP (Single Nucleotide Polymorphism, ou Polimorfismo de uma única base), por
apresentarem maior poder de discriminação, repetições sequenciais de 3-5 pares de bases e por
serem de fácil amplificação no laboratório.
II. A grande revolução da Genética Forense se deu na década de 1990 com o advento da técnica de
PCR, que permitiu também a análise de materiais e amostras armazenados, que não continham
suficiente quantidade de DNA para serem avaliados pela metodologia vigente na época.
III. A análise de DNA mitocondrial (mtDNA) tem sido de grande auxílio em algumas situações onde
não é possível gerar o perfil genético padrão como, por exemplo, amostras degradadas e fios de
cabelo sem raiz (ou bulbo).
IV. Vestígios coletados em locais de crime (amostras questionáveis) só podem ser processados para
obtenção de perfil de DNA quando houver(em) amostra(s) referência(s) para comparação. Caso
contrário, os mesmos devem ficar armazenados.
V. A análise de DNA, por ser uma prova técnica, que utiliza protocolos e kits comerciais validados
para identificação humana e baseada em cálculos estatísticos, pode ser considerada infalível e,
portanto, como a mais importante das provas, e ser usada como prova única.
Alternativas:
A) I, II e V
B) II e V
C) II e III
D) I, III, IV e V
Comentários:
50
I: errada. O marcador genético usado como padrão ouro nas análises periciais, para gerar os perfis de DNA,
são os do tipo STR ou microssatélites.
II: certa. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica que permite a amplificação do DNA e foi
uma das maiores revoluções da história da biologia molecular.
III: certa. O DNA mitocondrial é mais resistente a condições adversas do que o DNA nuclear.
IV: errada. Vestígios coletados em locais de crime podem ser processados para obtenção de perfil de DNA.
Os resultados devem ser armazenados em um banco de dados de perfis de DNA, onde estarão disponíveis
para uma eventual comparação futura.
V: errada. Mesmo sendo uma técnica altamente confiável, não podemos dizer que a análise de DNA é uma
técnica infalível, pois, mesmo que raramente, erros podem acontecer durante a execução da técnica.
Logo, estão corretas as afirmativas II e III.
17. (IESES - IGP-SC - 2017 - Perito Criminal Bioquímico) O genoma humano é constituído por grande
quantidade de DNA que contém na sua estrutura as informações necessárias para especificar as
características essenciais que fazem dos seres humanos organismos funcionais. Sobre a
organização do genoma humano analise qual(ais) afirmação(ões) a seguir está(ão) corretas:
I. Os genes são organizados em ordem linear no cromossoma, e cada um possui uma posição precisa
denominada loci.
II. No conceito de autossomas estão incluídos os 23 pares de cromossomas, havendo diferença nos
homens (XY) e nas mulheres (XX) em apenas um par.
III. Além do genoma nuclear, o genoma da mitocôndria integra o genoma humano. E cada célula
pode conter centenas ou milhares de mitocôndrias.
IV. Considerando o número de indivíduos da espécie humana, se espera que ocorram diversas
variações genômicas, por esse motivo no projeto genoma humano os genomas sequenciados são
considerados como “referência” da espécie.
V. Dos bilhões de pares de base que compõem o DNA humano em cada genoma, apenas 1,5% ou
menos codificam proteínas.
Assinale a alternativa que representa a sequência correta:
51
A) II, III, V.
B) III, IV, V.
C) I, II, IV, V.
D) I, IV, V.
Comentários:
I: errada. A posição de um gene no genoma é denominada lócus. Loci é o plural de lócus.
II: errada. No conceito de autossomas estão incluídos apenas 22 pares de cromossomos, pois os
cromossomos X e Y são considerados cromossomos sexuais.
III: certa. O DNA pode ser encontrado no núcleo das células (DNA nuclear) ou nas mitocôndrias (DNA
mitocondrial).
IV: certa. Apesar de existir genomas de referência para várias espécies, sabemos que existe variabilidade
genética entre os indivíduos.
V: certa. A região do genoma que contém genes, chamada de região codificadora, ocupa apenas cerca de
1–2% de todo o genoma humano.
Logo, estão corretas as afirmativas III, IV, V.
18. (CEPERJ - SEDUC-RJ - 2015 - Professor Docente I - Ciências) Certas bactérias, para se defenderem
do ataque de vírus, produzem enzimas especiais conhecidas como enzimas de restrição. Elas agem:
A) clonando o DNA do vírus e o incorporando
B) causando mutações no DNA do vírus e o matando
C) fragmentando o DNA do vírus e impedindo sua reprodução
D) traduzindo a sequência das bases do RNA para as proteínas
E) produzindo plasmídeos que têm a capacidade de atacar o vírus
Comentários:
As enzimas de restrição agem fragmentando o DNA do vírus e impedindo sua reprodução. Elas também
podem ser empregadas em técnicas de biologia molecular, quando se necessita realizar a clivagem do DNA.
52
19. (CESPE - POLÍCIA CIENTÍFICA - PE - 2016 - Perito Criminal - Odontologia) Três anos depois de ter
sido criado por lei, o banco de amostras de DNA de criminosos brasileiros possui apenas 569
condenados cadastrados, de acordo com relatório do Ministério da Justiça elaborado com dados
coletados em todo o país. Embora no documento tenha sido destacado que o número de
cadastrados representa menos de 1% do total de condenados por crimes hediondos e contra a
pessoa — que, em todo o Brasil, corresponde a cerca de 60 mil detentos —, o uso desse banco pela
justiça tem sido fundamental na elucidação de alguns crimes.
O Globo, 16/8/2015 (com adaptações).
Com relação aos métodos utilizados para a composição de um banco de dados de DNA semelhante
ao mencionado no texto, assinale a opção correta.
A) Todo o genoma do indivíduo é sequenciado e armazenado em bancos como o citado no texto.
B) As informações cadastradas no banco se referem ao padrão de polimorfismos do tipo STR para lócus
predeterminados.
C) A base de dados que compõe o tipo de banco mencionado no texto é oriunda do padrão de polimorfismos
do tipo RFLP.
D) Apenas os cromossomos sexuais de uma amostra de DNA são sequenciados para a formação desse tipo
de banco.
E) Somente o DNA mitocondrial dos indivíduos é sequenciado para a formação desse tipo de banco.
Comentários:
A alternativa A está incorreta. Apenas algumas regiões do genoma (que possuem polimorfismos) são
sequenciadas.
A alternativa B está correta e é o gabarito da questão. Os polimorfismos STR são o padrão ouro utilizado
na identificação de indivíduos.
A alternativa C está incorreta. A base de dados que compõe o tipo de banco mencionado no texto é oriunda
do padrão de polimorfismos do tipo STR (ou minissatélites).
A alternativa D está incorreta. São sequenciados polimorfismos STR localizados em vários cromossomos
diferentes.
53
A alternativa E está incorreta. O DNA mitocondrial na área forense é utilizado em casos nos quais não é
possível obter DNA nuclear, ou quando se investiga uma linhagem de herança materna.
20. (INSTITUTO AOCP - UFRB - 2019 - Farmacêutico - Bioquímico) Um microrganismo gram-positivo

foi observado em amostras de tecido obtidas de um paciente com uma doença previamente não
diagnosticada. Qual, dentre as seguintes técnicas, seria mais útil para identificar esse
microrganismo?
A) Eletroforese em gel com poliacrilamida.
B) Espectrofotometria de absorção atômica.
C) Eletroforese com enzimas poliavançadas.
D) Amplificação por PCR e sequenciamento de DNA.
Comentários:
A análise da sequência de DNA da bactéria é o método mais preciso para sua identificação. Tal
procedimento pode ser realizado por meio da amplificação por PCR seguida pelo sequenciamento de DNA.
21. (UFU-MG - 2018 - Biomédico) Em relação às principais aplicabilidades das diferentes técnicas de
eletroforese, é correto afirmar que eletroforese
A) capilar é utilizada para técnicas de sequenciamento automático de DNA.
B) em agarose é indicada para análise qualitativa de misturas de proteínas.
C) em gel de poliacrilamida é indicada para medir atividade enzimática.
D) nativa é utilizada principalmente para separação de ácidos nucleicos.
Comentários:
A alternativa A está correta e é o gabarito da questão. Conforme estudamos, a técnica de eletroforese

capilar é usada no sequenciamento tipo Sanger.
A alternativa B está incorreta. A eletroforese em gel de agarose é usada na análise de fragmentos de DNA.
54
A alternativa C está incorreta. Não é possível medir atividade enzimática por métodos de eletroforese, pois
estes são métodos de separação.
A alternativa D está incorreta. Ácidos nucleicos podem ser separados por eletroforese em gel de agarose e
poliacrilamida.
22. (CESPE - PC-MA - 2018 - Médico Legista) Com referência à tecnologia do DNA recombinante,
incorporada na rotina forense, assinale a opção correta.
A) A tecnologia de sequenciamento do DNA atualmente utilizada na área forense baseia-se no método
químico conhecido como método de Maxam-Gilbert.
B) Comparativamente à PCR (reação em cadeia da polimerase), a técnica de RFLP (restriction fragment
length polymorphism) tem sido adotada com maior eficiência na análise forense, porque utiliza menor
quantidade de DNA.
C) A PCR (reação em cadeia da polimerase) em uso na área forense utiliza a enzima de restrição DNA
polimerase obtida da bactéria Termophilus aquaticus.
D) Na PCR (reação em cadeia da polimerase), comumente se utiliza didesoxinucleotídios (ddNTPs).
E) Na PCR (reação em cadeia da polimerase), comumente utilizam-se primers ou iniciadores.
Comentários:
A alternativa A está incorreta. Atualmente, o principal método de sequenciamento utilizado é o

sequenciamento de nova geração (NGS).
A alternativa B está incorreta. A técnica de RFLP é considerada obsoleta no contexto da análise forense.
A alternativa C está incorreta. DNA polimerase não é enzima de restrição.
A alternativa D está incorreta. Didesoxinucleotídios (ddNTPs) são usados na técnica de sequenciamento, e

não na PCR convencional.
A alternativa E está correta e é o gabarito da questão. Os primers são responsáveis por fornecer um "ponto
de partida" para que a DNA polimerase inicie a extensão da nova fita.
55
GABARITO
1. B 9. D 17. B
2. E 10. C 18. C
3. D 11. C 19. B
4. Errado 12. D 20. D
5. Errado 13. B 21. A
6. Errado 14. A 22. E
7. Certo 15. E
8. C 16. C
56
REFERÊNCIAS
Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P. Molecular biology of the cell. New York:
Garland Science, 2002.
Encyclopaedia Britannica. Biotechnology. 2019. Disponível em:

<https://www.britannica.com/technology/biotechnology>.
Griffiths, A.J.F.; Miller, J.H.; Suzuki, D.T. et al. An Introduction to Genetic Analysis. 7th edition. New York:
W. H. Freeman; 2000. Making recombinant DNA. Disponível em:
<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21881/>.
Griffiths, Anthony J,F.; Wessler, Susan R.; Carroll, Sean B.; Doebley, John. Introdução à genética. 11. ed. –
Rio de Janeiro: Guanabarra Koogan, 2016.
Heather JM, Chain B. The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics. 2016
Jan;107(1):1-8. doi: 10.1016/j.ygeno.2015.11.003. Epub 2015 Nov 10. PMID: 26554401; PMCID: PMC4727787.
Jalali et al. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Elsevier, 2017.
McDonnell, W.M.; Askari, F.K. The Emerging Role of DNA Vaccines. MedGenMed v. 1, n. 3, 1999.
Disponível em: <http://www.medscape.com/viewarticle/408733>.
Nature. Recombinant vaccine. Disponível em: < https://www.nature.com/subjects/recombinant-vaccine>.
NIH - National Human Genome Research Institute. Recombinant DNA (rDNA). Disponível em:
<https://www.genome.gov/genetics-glossary/Recombinant-DNA>.
Nussbaum, Robert L.; McInnes, Roderick R.; Willard, Huntington F.; Hamosh, Ada. Thompson &
Thompson Genética Médica. 7. ed. - Rio de Janeiro: Elsevier, 2008.
57
Scitable by Nature Education. Disponível em: <https://www.nature.com/scitable/>. Acesso em: 10 abr
2020.
58

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Sumário

Biologia Molecular: Métodos de análise do DNA .......................................................................................... 2

1 - Considerações Iniciais .......................................................................................................................... 2

2 – Sequenciamento de DNA .................................................................................................................... 3

2.1 - Uma breve revisão da estrutura e função do DNA ......................................................................... 3

2.2 - Definição de sequenciamento de DNA .......................................................................................... 6

2.3 - Sequenciamento de primeira geração ........................................................................................... 8

2.4 - Sequenciamento de nova geração .............................................................................................. 16

2.5 - Aplicações do sequenciamento de DNA ...................................................................................... 19

3 - Teste de Paternidade ......................................................................................................................... 21

4 – Considerações Finais ......................................................................................................................... 27

Lista de Questões ....................................................................................................................................... 28

Questões Comentadas ............................................................................................................................... 39

2.1 - Uma breve revisão da estrutura e função do DNA

Legenda: Estrutura dos quatro nucleotídeos de DNA.

A tradução do mRNA é realizada pelo RNA ribossômico (rRNA) e RNA de transferência ou

Existem 64 códons, no entanto, apenas 61 códons codificam um aminoácido, enquanto os três

O DNA de cada organismo consiste em uma sequência única de nucleotídeos. O sequenciamento

Nas últimas décadas, vários pesquisadores se dedicaram ao desenvolvimento de metodologias para

Metodologias de sequenciamento de DNA

Os métodos de sequenciamento de primeira geração envolviam a separação de polinucleotídeos por

No entanto, a metodologia que teve o maior impacto na tecnologia de sequenciamento de DNA

Inicialmente, no método Sanger, a molécula de DNA era amplificada usando um primer

O desenvolvimento de técnicas como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e tecnologias de DNA

A figura acima representa as tecnologias de sequenciamento de DNA de primeira geração. A

b) Sequenciamento de terminação em cadeia de Sanger: os nucleotídeos ddNTP marcados com

c) Método de sequenciamento químico de Maxam e Gilbert: primeiramente, o DNA deve ser

2.3.1 - Análise de Sequenciamento Sanger por Eletroforese Capilar

Legenda: Diagrama básico do sequenciamento Sanger realizado em um sequenciador de DNA capilar.

A figura a seguir demonstra como interpretar o resultado do sequenciamento pelo método de

Os métodos de sequenciamento de nova geração (Next Generation Sequencing - NGS) ou métodos

Os métodos de NGS podem ser divididos em duas categorias: sequenciamentos de segunda

2.4.1 - Sequenciamento de segunda geração

Ao mesmo tempo que o sequenciamento Sanger era aprimorado, cientistas começaram a

Juntamente com o sequenciamento 454 e Solexa/Illumina, uma terceira opção de sequenciamento

Como se pode perceber, as várias tecnologias de sequenciamento de segunda geração apresentam

Por fim, merece destaque a tecnologia de sequenciamento em nanoporo (NanoPore) da Oxford,

O sequenciamento do DNA já se tornou parte integrante da maioria dos laboratórios de pesquisa,

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A capacidade de usar pequenas quantidades de DNA para obter resultados de sequenciamento

O exame genético para determinação da paternidade é um teste extremamente confiável,

Vamos ver abaixo um outro exemplo:

(CESPE - POLÍCIA CIENTÍFICA - PE - 2016 - Perito Criminal - Ciências Biológicas e Biomedicina) A

A) Filho 1 e 3 não são dele.

Encerramos aqui a parte teórica da nossa aula.

Se tiverem alguma dúvida, estou disponível no fórum de dúvidas e no meu Instagram.

Ana Cristina Lopes

3. (INSTITUTO AOCP - ITEP - RN - 2018 - Perito Criminal - Ciências Biológicas) Considerando as

As técnicas de sequenciamento genômico se baseiam na tradução da dupla fita de DNA em

Fonte: www.google-imagens.com (Adaptado)

Sobre elas, é CORRETO afirmar que

9. (FUNCERN - IF-RN - 2017 - Professor - Biologia) Entre as técnicas usadas na biotecnologia,

J. Método de separação de macromoléculas.

N. Contém múltiplas repetições em tandem representadas por uma sequência de tamanho

Assinale a alternativa cuja correlação entre os itens apresenta-se corretas.

12. (CCV-UFC - 2016 - Engenheiro Agrônomo) O resultado do sequenciamento de DNA é apresentado

( ) Bandas podem ser observadas na luz ultravioleta.

( ) Enzimas de restrição cortam o DNA em sítios específicos.

( ) DNA é extraído e purificado, eliminando proteínas e RNA.

( ) Padrões de tamanho conhecido são inseridos para comparação.

( ) Amostras são colocadas em um gel no qual se aplica um campo elétrico.

A sequência da realização da etapa de eletroforese é

Assinale a alternativa correta.

Assinale a alternativa que representa a sequência correta: