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Epigenética
Início da epigenética
Temos diferentes enzimas, moléculas
envolvidas no funcionamento das marcas
epigenéticas.
Para a metilação temos 3 grandes famílias: a)
DNMTs, que vão promover e catalisar a
metilação do DNA; b) MBDs, que funcionam
como interpretadores da existência da
metilação; c) TETs, que fazem o contrário das
DNMTs.
Cromatina
No interior do núcleo temos porções de
cromatina diferencialmente condensada:
 Heterocromatina ou Falsa cromatina –
cromatina mais condensada e não é
passível de ser transcrita;
 Eucromatina ou Verdadeira cromatina –
menos condensada e é passível de ser
transcrita.
Eucromatina
 Encontra-se ligeiramente relaxada.
 Ocorre em zonas ricas em genes.
 Esta localizada nos braços dos
cromossomas, exceto nos telómeros e
centrómeros.
 E esta associada a uma transcrição ativa.
Heterocromatina
 Encontra-se mais compactada.
 Ocorre nos centrómeros e telómeros
 Contem sequencias repetitivas no
genoma.
 Encontra-se em áreas pobres em genes.
 Associada à repressão da transcrição.
Encontra-se dividida em dois tipos:
 Cromatina constituitiva -
transcripcionalmente inerte, ou seja,
encontra-se permanentemente silenciado
e expressa altos níveis de HP1
(Heterochromatin protein 1) nos
centrómeros e telómeros.
 Cromatina facultativa - dependendo da
fase que se encontra pode estar ou não
expressa, por exemplo, existem genes que
são expressos durante o desenvolvimento
e diferenciação e que mais tarde são
silenciados por complexos polycomb.
Mecanismos Epigenéticos
São importantes para a compactação da
cromatina, imprinting genómico (genes
sujeitos a imprinting estão expressos
monoalélicamente e a sua expressão esta
relacionada com a sua origem parental, ou
seja, existem genes que nas células adultas só
são expressos se tiverem origem materna e
outros só são expressos se tiverem origem
paterna), silenciamento de sequências
repetitivas (por exemplo, sequencias ALU são
sequencias que existem em grande
quantidade e são reconhecidas pela enzima
ALU) e a inativação do cromossoma X (ocorre
no sexo feminino, serve para evitar excessos
de doses dos genes associados ao
cromossoma X).
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Metilação do DNA Readers – são os que interpretam ou

Acontece nas citocinas que pertencem aos
dinucleótidos CpG (Cytosine phosphate
Guanine).
Código das histonas – atua de forma a regular
a expressão génica que afeta a estrutura e a
remodelação da cromatina, consiste em
modificações químicas que acontecem nos
resíduos aminoácidicos das caudas das
histonas, tendo sido mapeadas cerca de 50
marcas epigenéticas.
NOTA: Uma proteína tem um terminal Carboxil
e um terminal Amina na cauda, que esta
virada para o exterior.
reconhecem a existência destas
modificações especificas.
Estas modificações acontecem pela
desregulação das enzimas, o que dá origem
a marcas epigenéticas. As marcas pós-
transducionais (PTMs) são marcas que estão
associadas a ativação da transcrição
(H3K9ac, H3K14ac, H3K4me3) ou marcas
associadas à repressão da transcrição
(H3K9me3, H3K27me3).
As histonas que compõem o nucleossoma são
2H3, 2H4, 2H2A e 2H2B, e a H1 que funciona
como linker, ou seja, tem a capacidade de
‘’soldar’’ o DNA em torno do nucleossoma.
Para além destas histonas clássicas, a H3 e H2
apresentam na sua composição variantes
das histonas, que são codificadas por genes
independentes.
Genes variantes de histonas
 Não alélico.
 Contém frequentemente intrões.
 São expressos na maioria das vezes
durante o ciclo celular numa forma
independente da replicação, para
permitir a deposição da cromatina
quando e onde necessário.

Remodeladores da cromatina

São complexos proteicos que tem imensas

proteínas e desempenham um papel
As modificações consideradas mais importante no posicionamento dos
importantes são a acetilação, metilação e nucleossomas e na remoção dos
fosforilação. Estas alterações químicas vão nucleossomas sempre que necessário.
regular o grau de ligação entre os A zona do promotor é rica ou pobre em
nucleossomas e o DNA, e afinidade destas nucleossomas?
ligações é condicionada por modificações
nas histonas. Mais pobre em nucleossomas para facilitar a
ligação.
Remodeladores de cromatina
 Subunidades de remodeladores de
Writers – são quem adiciona metilação, cromatina exibem uma taxa de mutação
acetilação, enzimas que adicionam muito alta e encontram-se inativados em
fosforilação. vários tipos de cancro.
Editors ou Erasers – são quem faz o contrário,  Vários processos epigenéticos afetados:
ou seja, desmetilam, desacetilam e ligação de fatores modificadores de
desfosforilam.
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histonas, posições de nucleossomas e
padrões de metilação do DNA.
 A verdadeira ação das alterações do
remodelador de cromatina durante a
iniciação e proliferação do cancro
permanece desconhecida.
O complexo mais importante é SWVSNF, que
é o mais associado a cancro e apresenta
genes com função oncogénica.
RNA não codificantes
 Apenas 2% do genoma codifica proteínas,
sendo > 80% RNA não codificante.
correlaciona-se com a proporção de
ncRNAs. O grau de complexidade do
organismo
 Razão ncRNAs: cRNA é de 50:1 (C.elegans
3:1).
 São classificados de acordo com o seu
tamanho: ncRNA pequenos (<200 bp) e
ncRNA longos (>200 bp) e a transcrição
pode ser feita RNA polimerase I, II e III.
 RNA que não é usado para a produção
de proteínas (RNA não codificante) pode
ser clivado e usado para inibir RNAs
codificadores de proteínas.
microRNAs (miRNAs)
Os microRNAs são originados sobre a forma
de primicroRNAs e tem que sofrer um
processo de maturação para poderem
desempenhar a sua função de regulação
pós-transcrição.
O microRNA funcional leva à clivagem de
transcritos convencionais ou a repressão
transiente, porque que vai inibir a ação dos
ribossomas, ou seja, não vai haver tradução
devido ao facto do microRNA estar ligado ao
complexo RISC.
 Partilham mecanismos de regulação com
genes convencionais, ou seja, os
microRNAs que regulam negativamente
genes supressores tumorais funcionam
como oncogenes.
 Os mecanismos que levam a inativação
de microRNAs com funcionalidade
supressora tumoral, são os mesmos que
inativam os genes supressores tumorais.
 Cerca de 70% dos genes que codificam
miRNAs encontram-se em porções
intergénicas e 30% partilham o promotor
de um ‘’gene hospedeiro’’.
Metilação do DNA
Ocorre preferencialmente nos dinucleótidos
CpG, contudo recentemente verificou-se que
pode ocorrer em citocinas que pertencem a
tripletos que envolvem guaninas.
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Composição de um gene

 70-80% destas CpGs no genoma humano

estão metiladas, enquanto as CpGs que
se encontram nas ilhas CpGs
normalmente não estão metiladas.
 A alteração deste padrão está
geralmente associada a doenças.

Temos a adição do grupo metil ao carbono 5

das citosinas, e esta adição é feita pelas DNA
metiltransferases à custa dos dadores (S-
adenosilmetionida e a S-adenosil-
Homocisteina).

Ou seja, quem catalisa são as DNMTs e Moléculas importantes para a metilação

quem fornece os grupos metil são os
dadores universais.  DNA metiltransferases (DNMTs) –
composta por duas grandes classes: DNMT
TETs fazem o mecanismo contrário, vão I, associada à manutenção da metilação
remover a metilação de forma direta. e a DNMT 3a e 3b estão associadas à
metilação de novo e são importantes
Onde estão localizados os dinucleótidos
após a fecundação e na formação dos
CpG?
gâmetas.
 20% deles estão localizados nas ilhas DNMT 2 não tem qualquer efeito no DNA,
CpGs, que são locais que contem uma apenas no RNA.
grande quantidade de CpGs, DNMT 3L não metila mas potencializa a
normalmente estão localizadas no função da DNMT 3a e 3b.
promotor dos genes (60%), nos primeiros  Methyl-CpG Binding Proteins (MeCPs) –
exões e têm tamanho variável deste 0.5 a envolvida na leitura das marcas de
4 kb. metilação e reconhecem a existência de
 80% noutras regiões: metilação.
CpG shores – são regiões que ladeiam as  Ten-Eleven-Translocation methylcytosine
ilhas, podendo ser upstream ou dioxygenases (TETs) – converter a 5-metil
downstream, com menos densidades de citosina (5mC) em 5-hidroximetilcitosina
CpGs (<60) e é o local preferencial onde (5hmC) ou noutras formas de citosina e
se localizam os potenciadores da promovem a desmetilação ativa.
transcrição).
Em cancro para que haja uma diminuição da
Regiões codificantes.
metilação global das células é preciso que
Sequencias repetitivas.
haja mutações ou deleções de ambas as
DNMTs, o que leva a crer que as DNMT 1, 3a e
3b possam ter funções redundantes.

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A desmetilação pode ocorrer de forma ativa,
pelas TET ou de forma passiva, quando há
diminuição da quantidade das DNMT
existentes.
Diminuição das DNMTs
durante a divisão celular
Não ocorre
restabelecimento do padrão
normal da metilação
Número crescente de
porções do genoma e
células com hipometilação
Estudos em vivo:
A DNMT 1 e DNMT 3b são importantes para o
desenvolvimento embrionário, uma vez que
sem ele, a embrião morre.
Ratinhos com deleção no DNMT 3a
aparentam ser normais até ao nascimento,
mas acabam por morrer após 4 semanas.
Síndromes humanos que resultam em
mutações no DNMT 3b
Síndrome ICF (immunodeficiency-
centromeric instability-facial DNA methylation
and histone modifications anomalies) -
uma doença autossómica recessiva,
carateriza-se por ter alterações
maturação dos linfócitos B, hipometilação na
heterocromatina das regiões centroméricas
do cromossoma 1, 16 e 9.
 Leva à hipometilação das repetições
pericentroméricas, que pode resultar em
anomalias cromossómicas e expressão de
RNA não codificantes.
 Foram encontradas cerca de 50 pessoas
com ICF.
 Diagnostico pré-natal.
 Crianças aparentam fisionomia facial
muito distinta do normal.
 Redução ou deficiência na IgA/IgG.
 Tratamentos: infusões regulares de
imunoglobulinas.
MeCPs
A capacidade de reconhecer locais
metilados CpG é mediado por:
 Methyl-CpG binding domain (MBD) – tem
níveis aumentados e associados à
proliferação.
 SET and Ring-associated (SRA) domain.
 Zinc finger (ZnF) motifs.
Síndrome Rett
Causado por mutações no gene MeCP2
localizado no cromossoma Xq28, associado a
distúrbios neurológicos no sexo feminino e
normalmente no sexo masculina ocorre a
morte logo após o nascimento.
Existem mais de 200 mutações diferentes
(missense, deleção frameshift, nonsense,
intragenic) encontrados no gene MeCP2 e a
maioria é encontrada em oito "hot spots"
diferentes.
MeCP2 – esta associada à compactação da
cromatina na sequência da metilação do
DNA, mas também pode ocorrer em
determinados genes ativos.
Methyl-CpG binding domain (MBD)
MBD2 – associado à repressão da metilação,
é nos ratinhos é requerida para que ocorra
tumorigénese.
na
MBD4 – o seu papel principal é iniciar a
reparação de resíduos 5-metilcitosina
desaminados, ou seja, recruta enzimas que
removem a citosina que está metilada e que
é lida como timina e vai voltar a colocar a
citosina.
Ratinhos com deficiências nesta enzima
apresentam um aumento do número de
mutações em locais metilados no genoma, e
maior predisposição para cancro.
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TETs
 5hmC é abundante em neurónios Purkinje
e células embrionárias. Está relacionada
com genes altamente transcritos.
Corresponde a 0.1% de todas as bases e
está associada à perecibilidade para a
transcrição.
 20% de todas as bases de citosina do
nosso genoma são 5mC, sendo que cerca
60% das CpGs são 5mC.
Desmetilação ativa
Passa pela transformação de 5mC em vários
componentes que depois são transformados
em 5 citocina. Isto acontece devido ao
funcionamento da timina DNA glicosilase
mediada por BER (base excision repair).
Desregulação da hidroximetilação do DNA
em cancro
Vários genes que têm influência na
hidroximetilação encontram-se mutados no
cancro:
 TET2 é afetado por mutações em
diferentes doenças hematológicas.
 TET afetam os níveis de outras enzimas,
como, IDH1, IDH2, SDH e FH. Ao haver
mutações nestas enzimas vai
desencadear-se uma competição pelo
co-factor αKG (importante para o
funcionamento da TETs) o que causa um
aumento da metilação.
 Mutações da TET, IDH1 ou IDH2 são
mutuamente exclusivas: a) não
funcionamento das TET promove
hipermetilação; b) mutações da IDH1 ou 2
vai haver uma competição pelo co-
factor, o que causa hipermetilação.
Quais os tumores onde estão descritas
mutações de IDH?
Melanomas, gliobastomas secundários e
leucemia mieloide aguda.
Porque é que as células somáticas
apresentam padrões de metilação
específicos?
Aquando formação do zigoto, vai haver uma
desmetilação global do componente
genómico materno e paterno. Como a
desmetilação paterna ocorre de forma mais
abrupta esta associada à desmetilação ativa
feita pelas TET, enquanto a desmetilação
materna ocorre de forma mais gradual e
lenta sendo feita à custa desmetilação
passiva à medida que ocorre a divisão das
células.
Na fase de morula vamos ter o completo
apagar das marcas epigenéticas do
genoma, onde são apagados todos os genes
excetuando aqueles que estão sujeitos a
imprinting. Esta deleção é reposta à custa da
memória epigenética que permanece nas
células (à custa de RNA não codificante).
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Rita Fialho l IPO

Esta eliminação permite o estabelecimento

de novos padrões de metilação do DNA que
são específicos para o sexo do embrião.

Os padrões de metilação são estabelecidos

apenas quando os dois conjuntos parentais
de cromossomas estão nos gametas.

1 – Depois da fertilização, a informação dos

genes sujeitos a imprinting é mantida sendo
apagado todo o restante.

2 – Na linha germinativa do feto, todos os

padrões de metilação do DNA são
apagados.

3 – O imprinting da metilação é estabelecido

durante a gametogénese de acordo com o
sexo o embrião.

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Rita Fialho l IPO

Continuação da aula ‘’Inicio da epigenética’’

Padrões de metilação do DNA em células hipermetilação, portanto, sabe-se muito

normais e em células tumorais pouco sobre eles.

Em células normais, os intrões e outras áreas

estão metiladas para evitar a ligação
inespecífica de fatores. Enquanto no cancro,
temos exatamente o oposto, temos
metilação tanto nas CpG shores como nas
ilhas CpG e a desmetilação no corpo dos
genes.

NOTA: 5 a 10% da metilação em cancro

ocorre nos promotores das ilhas CpGs.

Nas sequências repetitivas temos alterações

do padrão, no sentido de promover a
instabilidade genómica e a possibilidade de
haver transposições da porção genómica → Hallmarks do cancro
aumentando o risco de mutações.

Silenciamento dos genes pela metilação do

DNA ocorre por vários mecanismos:

 Prevenir a ligação do fator de transcrição.

 Impedir a ativação de ligação histone
methyltransferase (HMT).
 Recrutar MBDs.
 Regular a ocupação do nucleossoma –
através dos complexos reguladores da
cromatina.

Como é que os genes supressores tumorais

são classificados?
Relativamente aos genes hipermetilados,
podem ser caracterizados como:
 Genes supressores tumorais, como, a
caderina-E, P16, APC, Stk4, MLH1.
 Genes candidatos a genes supressores
tumorais, mas ainda não foram
classificados como tal, porque o seu
mecanismo de regulação é a metilação.
No caso do FHIT, Rass, GATA4/5 são genes
regulados por hipermetilação e DAP-
kinase está associada à apoptose.
 Genes que só foram identificados por
screenings de metilação aberrante de
promotores ou por screnning de
São vias com alterações genéticas, contudo
há um paralelismo para as alterações
epigenéticas: genes envolvidos na mesma via
(não sendo exatamente os mesmos genes)
são regulados negativamente por metilação.
Nas mutações ocorre sobretudo a formação
de proteínas truncantes (que são muito
curtas) ou a aquisição mutações indel (que
alteram a grelha de leitura), que levam a
alterações substanciais nas proteínas → a
proteína deixa de existir ou deixa de ter
funcionalidade.
Na hipermetilação vai haver uma aquisição
gradual da metilação – spreendig - o que vai
fazer com que o mesmo clone tumoral possa
ter células com quantidades de proteínas
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diferentes → Heterogeneidade de metilação Causas da Hipometilação do DNA

tumoral.

Ou seja, enquanto num tumor as mutações

são predominantes (temos vários clones
tumorais com o mesmo tipo de mutações).
Na hipermetilação temos clones com graus
diferentes de metilação.

A metilação pode ocorrer quer na versão

esporádica como na versão hereditária,
sendo que na versão hereditária precisa de
ocorrer num dos alelos.

 Cerca de 50% dos genes que causam
cancros hereditários passam por
silenciamento associado à metilação nos
genes, como, MLH1, BRCA1 e APC.
A presença de mutações ou de alterações
genéticas que levam à perda de função são
mutuamente exclusivas porque em termos
biológicos, se a metilação leva à perda da
expressão devido à regulação negativa da
transcrição, não é necessário que haja
mutações nesses mesmo genes.
Excetuando mutações que não sejam
patogénicas, pois aí termos em linha de
conta os polimorfismos.
Onde é mais passível acontecer a falha do
fenómeno eraser na desmetilação ativa ou
passiva?
Desmetilação passiva pois pode não ocorrer
a metilação dos dinucléotidos específicos.
Por exemplo, mutações MLH1 resultam da
transmissão de mutações maternas.
Hipometilação
Os efeitos da hipometilação e hipermetilação
são muito sobreponíveis, ambas as situações
levam ao desenvolvimento da tumorigénese.
Em locis específicos ocorre a hipermetilação
do promotor e noutras regiões ocorre a
hipometilação.
 Desregulação da atividade das DNMTs.
 Alterações nas modificações pós-
trasducionais das histonas.
 Efeito do ambiente, o ambiente causa
alterações da disponibilidade de grupos
metil.
 RNAs não codificantes.
 Incapacidade de corrigir danos no DNA,
há um aumento da hipometilação se
houver desregulação de enzimas
importante para corrigir a existência de
citocinas noutras formas que não na
forma convencional.
A hipometilação ocorre em 4% dos 2 a 3% de
todas as citocinas.
Em cancro, a hipometilação encontra-se
concentrada em blocos extensos do genoma
(até 10 megabases).
Efeitos da hipometilação
Permitir a mobilidade dos elementos
transposáveis (Alu, LINE e LTR) → ativação de
oncogenes, desregulação de RNA não
codificantes, instabilidade genómica
alterações ao nível da transcrição.

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Rita Fialho l IPO
NOTA: Os elementos transposáveis também
podem ter impacto nos cromossomas,
nomeadamente nos rearranjos
cromossómicos, deleções, duplicação
estando associados a várias neoplasias.
Tudo isto resulta de alterações do meio
ambiente, nomeadamente stress celular,
inflamação crónica, exposição a radiações,
etc.
Muitas vezes, estas alterações estão na
génese das alterações citogenéticas que são
características dos tumores.
Cancro colorretal
Concomitantemente com a metilação
especifica de alguns genes, temos as
alterações da metilação nas vias de
tumorigénese.
Metiloma – perfil de metilação aberrante
para cada modelo tumoral.
As vias principais desreguladas:
 Instabilidade genómica.
 Via WNT.
 Sinalização KRAS, TGF-beta, PI3K.
 Ciclo e diferenciação celular
Após a desregulação destas vias vamos ter
um conjunto de genes que estão metilados e
associados a transformação neoplásica, mas
juntamente com esta hipermetilação
aberrante temos também a hipometilação
das duas sequências comuns mais frequentes
no genoma, a LINE-1 e a sequência ALU
(ambas as sequencias encontram-se em
regiões críticas que condicionam a
transformação neoplásica).
Perda de Imprinting
Leva a que haja uma sobredosagem de
determinados genes que deviam ser
silenciados em função da sua origem
parental.
Exemplos: Insulin-like growth factor 2 (IGF2),
que está silenciado a forma materna e este
silenciamento é feito à custa de metilação no
seu promotor e de modificações pós-
transducionais das histonas.
A perda de imprinting neste fator de
crescimento está associado a uma
frequência muito elevada de cancro
colorretal.
H19, que é um RNA não codificante que está
silenciado no genoma que é herdado via
paterna.
Tumor de Wilms ou Nefroglastoma, tumor
pediátrico que resulta de duas situações
distintas:
 A criança teve perda de imprinting IGF 2
→ aumento IGF 2 → aumento
generalizado do tamanho dos órgãos
abdominais. Neste caso designa-se de
Síndrome de Beckwith-Wiedemann.
 Na versão esporádica é um evento mais
raro. A criança nasce com um rim imaturo
e é necessário que ocorra um segundo
evento para que se manifeste o
Nefroblastoma.
Existem outros genes onde a perda de
imprinting leva à aquisição de cancro:
 P57 ou CDKN1C – está associado ao
cancro pancreático.
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 TP73 – cancro gástrico.
 PEG1/MEST – no cancro do pulmão.
Forma alternativa da metilação associada a
cancro
As citosinas estão metiladas nas regiões
codificantes dos genes e podem funcionar
como hot spots (locais preferenciais de
mutações). Este mecanismo encontra-se
muito bem descrito para genes supressores
tumorais clássicos, nomeadamente para o
TP53 e carcinoma colorretal.
Cerca de 50% das mutações que ocorrem
no gene TP53 ocorrem em citosinas
metiladas.
Mutações e a metilação não são
mutuamente exclusivas?
As mutações e metilação são mutuamente
exclusivas quando se trata de regiões
promotoras do gene. Neste caso, estamos a
falar de regiões codificantes dos genes, estas
regiões por norma têm metilação das
citosinas e é esta metilação que pode
promover mutações genéticas.
Isto pode acontecer porque por um lado as
citosinas metiladas estão mais suscetíveis a
desaminação espontânea (ocorre a 
transição da Citosina → Timina). Citosinas têm
maior capacidade de absorção da radiação
UV (indutor de danos no DNA) e as guaninas
dos dinucleotidos CpG são mais suscetíveis a
carcinogénios. Não havendo mecanismos de
reparação adequados temos a indução de
mutações.
Outra das situações onde ocorre a promoção
de alterações genéticas é quando temos a
hipermetilação da região promotora de
genes responsáveis pela reparação do DNA,
isto pode acontecer em diferentes contextos,
como BRCA1, MLH1, MGMT.
Epimutações
São alterações herdadas que regulam a
atividade génica, mas que nada tem haver
com a sequência do DNA.
 Constitucional – derivado da linha
germinativa e esta presente em todos os
tecidos do individuo.
Somático – são as que acontecem
normalmente nos tecidos.
 Epimutações Primárias – é uma alteração
epigenética inicial que é
subsequentemente propagada, por meio
de herança sem alterações associadas.
Estas podem ser transgeracionais ou não
transgeracionais (se resolvidas em duas
gerações).
 Epimutações Secundárias – é uma
mudança genética inicial que leva a
subsequentes alterações epigenéticas,
propagadas por herança genética ou
epigenética, ou ambas. Estas são
tipicamente transgeracionais com base
na genética de transmissão.
 Epimutações Terciárias – é uma alteração
epigenética inicial que leva a alterações
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genéticas subsequentes. Essas influenciados pela nutrição materna e por

epimutações seriam inicialmente fatores ambientais durante o
propagadas por meio de herança desenvolvimento embrionário. Os padrões de
epigenética, mas os efeitos poderiam ser metilação aleatórios durante a
propagados posteriormente por meio de embriogénese resultam na reprogramação
herança genética também. Uma de marcas epigenéticas, o que origina
epimutação terciária inicial pode ou não fenótipos distintos em indivíduos
ser transgeracional, mas as alterações geneticamente idênticos.
genéticas subsequentes devem continuar
Experiências:
a ser propagadas transgeracionalmente
por meio de transmissão genética, Ratinho Agouti (pelagem preta), em que a
assumindo que sejam na linha metilação do gene Avy se relaciona
germinativa. inversamente com a expressão do gene
Agouti.
Variabilidade transcricional da epigenética
 Wild-type codifica uma molécula de
 Existe em diferentes indivíduos e entre
sinalização parácrina que produz
diferentes células.
eumelanina (pelagem preta) ou
 As principais fontes de variabilidade são
feomelanina (pelagem amarela).
fatores individuais intrínsecos e
 A transição da pelagem traduz
ambientais.
diretamente o grau de metilação do
Fatores ambientais: Os agentes ambientais promotor.
podem levar a desregulação da atividade  Numa mesma ninhada podemos ter graus
epigenética, o que causa epimutações. Estas de metilação diferentes nas CpGs do
alterações podem ocorrer em células gene, o que leva à variação da
somáticas ou germinativas durante o período coloração. Sendo que a coloração
fetal, perinatal, juvenil e adulto. Sendo que as amarela não tem metilação e a
principais causas destas alterações são: coloração preta tem metilação.
dietas pobres em ácido fólico, má nutrição e
Este método tem sido usado para verificar a
álcool.
influencia da dieta na pelagem do animal.
NOTA: Variabilidade de metilação entre Verificou-se que os diferentes dadores do
gêmeos homozigóticos aumenta com idade grupo metil são muito importantes para dar
– Epigenetic drift. origem a ratinhos preto que têm um tamanho
menor, menor risco de desenvolver cancro e
maior tempo de vida.

Por outro lado, se a mãe tiver exposta a

Bisfenol A, vamos ter uma ninhada de ratinhos
amarelos que apresentam maiores
dimensões, obesos, menor esperança media
de vida.

Exemplo clássico do efeito do ambiente nas

ninhadas de ratinhos.

Epialelos metaestáveis adquirem padrões de

metilação aleatórios e que são altamente

12
Rita Fialho l IPO

Agentes quimiopreventivos do cancro  A acumulação de metilação dos

promotores de genes supressores tumorais
Na natureza, existem compostos naturais que
durante o envelhecimento, esta
levam à inibição de algumas destas enzimas,
associado com maior predisposição para
como chá verde, frutos vermelhos, etc.
desenvolver cancro.
 Contudo, não há evidencias
experimentais concretas de uma relação
direta entre esses genes e o
envelhecimento.

Pacientes com Síndrome de Werner

apresentam uma maior incidência para
carcinomas e sarcomas e a inativação
epigenética dos genes dos progenitores
pode contribuir diretamente para a
transformação maligna.
Nestes compostos, ocorre a inibição de
moléculas que vão possibilitar a existência ou
não de cromatina aberta ou de cromatina
fechada.

A idade e a injuria crónica promove

alterações no ambiente das células, que vão
Verduras, cereais, nozes e peixe causam o
ter precursões no programa epigenético e
aumento da metilação.
que podem promover por um lado a
Alterações epigenéticas e a Idade paragem da diferenciação das células e por
outro lado, pode levar à expansão aberrante
 Aumenta o ganho de metilação nas ilhas
dos clones tumorais.
CpGs.
 Promove a perda de metilação nas não-
ilhas CpGs.

13
Rita Fialho l IPO

Código de histonas e remodeladores de cromatina

Modificações pós-traducionais das histonas Diferentes classes de modificações

identificadas nas histonas
Atua como uma camada de regulação
epigenética da expressão do gene que afeta
a estrutura e remodelação da cromatina.

As modificações da cauda da histona são as

mais variáveis e mais 50 marcas já foram
mapeadas.

As repercussões induzidas por modificações A hipótese do ‘’código de histonas’’ engloba

das histonas são diferentes dependendo do combinações distintas de modificações pós-
resíduo onde vão atuar. tradução covalentes de histonas que
influenciam a estrutura da cromatina e levam
 Resíduos de histona lisina distintos têm
a resultados de transcrição variados.
papeis diferentes e por vezes opostos.
 Diferentes graus de metilação (mono, di e Modificação cross-talk das histonas
trimetilação) no mesmo resíduo podem
dar origem a diferentes funções.

Exemplo: Ao passo que a trimetilação da

lisina 4 da histona 3 está associado a um gene
passível de ser transcrito, a dimetilação e
trimetilação da lisina 9 da histona 3 está
associada à repressão, o que significa que
concomitantemente com a avaliação dos
status de metilação do DNA se queremos ver
a efetividade da regulação epigenética
temos que fazer a analise do promotor dos Se estamos perante uma cauda com resíduos
genes para estas histonas. aminoacidícos e modificações químicas é
natural que haja comunicação da existência
 A dimetilação e trimetilação da lisina 4
destas modificações. E, portanto, há um
está associada a cromatina ativa e a
cross-talk entre as modificações químicas,
genes ativos.
com o objetivo de regular de forma mais
 A acetilação está sempre associada a
eficiente a transcrição.
genes ativos independentemente do
local onde ocorrem. Este cross-talk ocorre de diferentes formas:
 Trimetilação da lisina 9 esta associada a
 Dentro da mesma histona ou em histonas
repressão e ao silenciamento de genes.
diferentes.
 Trimetilação da lisina 27 está associada à
 As modificações podem ser dependentes
diferenciação e organogénese.
umas das outras, ou seja, um primeiro
 Perda da acetilação da histona 4 da lisina
evento condiciona ou não a existência de
16 (loss of H4K16ac) está associada a
eventos seguintes.
instabilidade genómica.
 Pode haver antagonismo competitivo se
 A acetilação da lisina 56 da histona 3
as diferentes modificações têm o mesmo
(H3K56ac) está associada à estabilidade
local alvo.
genómica.
 A ligação de uma proteína a uma
modificação especifica pode ser

14
Rita Fialho l IPO

interrompida por uma modificação no corpo do gene. As marcas são sempre as

adjacente. mesmas o que muda é a distribuição destas
 A atividade da enzima pode ser afetada marcas ao longo do corpo do gene.
devido à modificação do substrato.
 Pode haver cooperação entre
modificações para recrutar de forma
eficiente fatores específicos.
 Tudo isto ocorre devido à existência de
enzimas especificas e de substratos. O mesmo acontece com os enhancers.

Modificações das histonas: afinar elementos No caso dos grandes blocos de repressão,
genómicos temos dimetilação e trimetilação da lisina 9,
temos as regiões LADs e LOOCKs e metilação
do DNA.

Exemplo: Metilação do DNA - mecanismo

usado com frequência na inativação do
cromossoma X.

LADs (lamina associated domains)

Nos promotores quando temos marcas, como

H3K27me3, H3K9me3 e metilação do
promotor → inativação dos genes.
Contrariamente, quando temos a H3K4me2,
H3K4me3, acetilação H2A.Z → ativação de
genes.

E existe também promotores num estado

intermédio, ou seja, são promotores que são
suscetíveis de promover a diferenciação
porque temos o mesmo genoma em todas as
células e dependendo destas marcas vamos
Regiões difusas marcadas por metilação H3K9
ter genes que estão diferencialmente
e parecem estar em contato com a lamina
expressos dependendo dos tecidos.
nuclear.

Regiões com baixas densidades de genes,

baixa atividade de transcrição e não têm
modificação da cromatina.

Polycomb

Com trimetilação da histona 3 lisina 27, mas

são zonas preferencialmente reprimidas em
células diferenciadas; Metilação da H3K27
Relativamente ao corpo dos genes, também associa-se à cromatina compactada;
temos associadas à inatividade e à atividade, Trimetilação da H3K27 promove o
mas há sobreposição destas marcas, ou seja, recrutamento de PrC1.
não temos marcas que sejam inativas no
promotor e que passem a mostrar atividade
15
Rita Fialho l IPO

Zonas de replicação  Domínios Chromodomain – que

reconhecem a existência de metilação
Regiões associadas a marcas especificas,
das lisinas.
dependendo se são regiões inicialmente
 Sant domain – que reconhecem as
sujeitas à replicação ou zonas onde a
histonas.
replicação acontece mais tardiamente.
NOTA: A maioria das modificações pós-
O genoma tem momentos de replicação
transcrição ocorrem nas lisinas, porque os
distintos (em média 1mb) que tendem a sofrer
aminoácidos existem em maior quantidade
síntese de DNA em momentos coordenados.
nas caudas das histonas.
Os padrões de cromatina parecem estar
Mutações nos genes que codificam as
relacionados com o tempo de replicação do
enzimas necessárias para a regulação de
DNA:
modificações pós-transcrição, vão ter
 Zonas de replicação inicial: H3K4me1, repercussões em termos de tumorigénese.
H3K4me2, H3K4me3, H3K36me3,
Acetilação – neutraliza os resíduos de lisina
H4K20me1, H3K9ac e H3K27ac.
carregados positivamente causando uma
 Zonas de replicação tardia: H3K9me2,
redução na afinidade das interações histona-
H3K9me3.
DNA, levando a um maior acesso a fatores de
 Limites entre zonas de replicação:
transcrição. Sendo a marca mais facilmente
H3K4me1, H3K4me2, HeK4me3, H3K27ac e
interpretada.
H3K36me3.
Remodeladores de cromatina: Enzimas
Para cada marca temos os writers, erasers ou
modificadoras de histonas
editors e readers, que são importantes para o
estabelecimento de marcas nas diferentes
regiões do genoma.

Principais readers

Existem 3 famílias das acetiltransferases

(GNAT, GNAT e MYST), que estão associadas
a ativação transcricional pois causam níveis
aumentados de acetilação da histona
(hiperacetilação) na eucromatina, na qual a
transcrição é mantida num estado ativo.

As HDACs (histone deacetylases) vão

provocar a repressão da transcrição, pois
níveis diminuídos de acetilação são
encontrados na heterocromatina, que está
associada a regiões genómicas
transcricionalmente silenciosas. Mas também
 Domínios Bromodomain – que podem desacetilar outras moléculas que não
reconhecem a existência de acetilação as histonas, como fatores de transcrição e
das lisinas. proteínas citoplasmáticas.

Existem 4 grupos de HDACs:

16
Rita Fialho l IPO

Porque é que existem várias se atuam nos

mesmo resíduos?

Os tecidos têm diferentes níveis basais destas

enzimas, tendo função redundante
dependendo da sua expressão.

Classificação dos remodeladores de

cromatina

Existem várias já descritas, pertencem a

Classe I, II e IV são dependentes de Zinco para diferentes famílias, mas todas elas
a sua função e a classe III é dependente de apresentam domínio 7, esta região vai
NAD+ e inibidas por nicotinamida. permitir que haja modificações, como por
exemplo, adição de grupos metil.
SAHA – aprovado para o tratamento de
linfomas cutâneos. KDMS (Lisina desmetilases) e ciclo celular

Substratos não histonas para HDACs de

classe I e classe II

Exemplos onde as HDACs vão remover a

acetilação e alterar a função das proteínas.

A TP53, além de ser regulada geneticamente Os níveis de expressão das lisinas

também pode ser regulada desmetilases varia ao longo do ciclo celular,
epigeneticamente através de modificações portanto é necessária uma regulação muito
na sua bioquímica. precisa das moléculas expressas para cada
uma das fases do ciclo celular.
O mesmo acontece com algumas proteínas
citoplasmáticas como a HSP90, que é uma
proteína importante para a homeostasia das
células.

Relativamente a outras classes de enzimas:

Histona lisina metilases e desmetilases

Existem várias enzimas metiltransferases e

desmetilases, e que atuam no mesmo no
mesmo resíduo.

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Rita Fialho l IPO

Funções emergentes de remodeladores da apresentam uma quantidade imensa destes

cromatina remodeladores desregulados.

Alterações das histonas no cancro

 Hipermetilação das ilhas CpG, associado

a esta modificação temos:
A desacetilação das histonas H3 e H4;
A perda da trimetilação de H3K4;
Ganho de trimetilação de H3k9 e de
H3K27.
 Hipometilação de sequências repetitivas:
Perda de monoacetilação de H4K16;
Perda de trimetilação de H4K20;
Ganho de trimetilação de H3K4.

O que sabe é que há um paralelismo entre as

alterações especificas do DNA e as
modificações pós-transcricionais.

Remodeladores de nucleossomas: SWI/SNF

a) Desmetilação das não histonas.
Complexo de remodelação de nucleossomas
b) Hidroxilação de proteínas e de ácidos
químico que hidroliza ATP em ADP o que
nucleicos.
permite movimentar os nucleossomas ao
c) Atividade enzimática adicional.
longo do DNA. Juntamente com a histonas
d) Ação de outras enzimas.
acetiltransferases que tem função de
Acredita-se que estes modeladores não desimpedir o promotor dos genes e por sua
funcionam apenas como catalisadores das vez, possibilitar a ligação dos fatores de
modificações pós-transdução das histonas, transcrição.
mas também atuam diretamente na
regulação e função das proteínas, que não
sejam especificas das histonas.

Existe um grande número de remodeladores

epigenéticos estão frequentemente
mutadas no cancro.

Carcinoma da bexiga, cancro do pulmão e

Ao ligar-se este complexo, vai haver a
cancro uterino são alguns dos cancros que
promoção do deslizamento e injeção dos

18
Rita Fialho l IPO
nucleossomas. Vai recrutar enzimas que
permitem a libertação do HP1 (histona linker)
o que promove a remoção
nucleossomas.
Componentes dos nucleossomas
SWI/SNF é o componente mais complexo,
sendo aquele que apresentam maior
quantidade de moléculas.
Com este complexo de remodelação vamos
conseguir a movimentação do octâmero e
assim, promover a ativação da transcrição ou
recrutar octâmeros para consolidar a
repressão da transcrição.
dos
Estes complexos no individuo wild type
funcionam como inibidor dos complexos
repressores proteicos, permitindo a
diferenciação dos genes.
Há um equilíbrio entre a diferenciação dos
genes e a capacidade de auto-renovação.
Quando há alterações no complexo SWI/SNF,
quer por mutações quer por deleções, vamos
ter desregulação → perda de diferenciação
e aumento da capacidade de renovação →
propensão para tumorigénese e expansão
das células progenitoras indiferenciadas.
NOTA: estes complexos trabalham em
paralelo com complexos mais específicos do
promotor do gene, ou seja, são muito
importantes para a regulação macro (Higher-
order chromatin structure – empacotamento
da cromatina ao nível 3D) e também são
importantes para o estabelecimento e
manutenção das assinaturas epigenéticas.
Resumindo, a um nível mais local vão
condicionar a função ou disponibilidade dos
promotores para transcrição, mas a um nível
mais abrangente vai promover graus de
empacotamento do DNA → influenciando o
funcionamento dos genes.
Conjunto de proteínas Polycomb (PcGs)
Complexos repressivos multiproteicos que
consistem em dois complexos centrais que
modificam a cromatina: Polycomb repressive
complex 1 e polycomb repressive complex 2.
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Rita Fialho l IPO

 Juntamente com o polycomb repressive 1

provoca ubiquitinação do resíduo 119 da
histona 2A.
 Inibição da transcrição.

EZH2 – descrita em vários tumores sólidos e

Polycomb repressive complex 1, composto leucemias.
por BMI (histona metiltransferase que
promove a repressão). SMYD3 – associado ao carcinoma da
próstata.
Polycomb repressive complex 2, é constituído
por EZH2 (histona metiltransferase, promove a EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2)
trimetilação da lisina 27, que está associada à  Também tem capacidade de interagir
diferenciação). com as DNA metiltranferases recrutando-
Estes complexos vão trabalhar em paralelo as para a região reguladora de certos
com o SWI/SNF mas também com a genes alvo, que levam à repressão.
existência de metilação do DNA e com as  Proteína do grupo polycomb, que
modificações pós-tradução das histonas. adiciona em grupos metil às histonas,
principalmente à lisina 27 da histona 3.
São reguladores por excelência dos genes  Composta por várias regiões: Domínio I,
HOX (importantes durante o desenvolvimento domínio II (importante na interação com
embrionário e são reguladores importantes DNMT3A, DNMT3B e DNMT1), domínio rico
da linha do tubo neural → diferenciação e em cisteínas e o domínio SET (relevante
organogénese do embrião). para promover a metilação).
 Está sobreexpressa em várias
Estão muitas vezes desregulados ao nível do
neoplasias, pois leva a inativação de
cancro, onde regulam a estaminalidade das
genes supressores tumorais
células.
importantes.
O conjunto de proteínas polycomb estão  Disrupção de EZH2 leva a alterações
associados à repressão dos genes supressores na fase G2/M da divisão celular.
tumorais.
Estudos com EZH2: Mostraram a função de
Consequências da dimetilação e EZH2 como oncogene, sendo estas
trimetilação da lisina 27 – marca importante experiências feitas em células sem
nas células neoplásicas. propriedades de malignidade, onde
adquiram não só capacidade de
proliferação, mas também a formação de
colónias.

Funções de EZH2 no cancro

 Recrutamento de DNMTs.
 Aumento da compactação da
cromatina.
20
Rita Fialho l IPO

A sua forma canónica de funcionamento é Genes variantes de histonas são:

através da histona metiltransferase, ou seja, a
 Não alélicos.
sua capacidade de promover trimetilação
 Frequentemente contém intrões.
da lisina 27, mas estudos mais recentes
 São expressos na maioria das vezes
mostram que esta proteína quando
durante o ciclo celular, de forma
fosforilada têm a função oposta, isto é,
independente da sua replicação para
promove a ativação da transcrição.
permitir a deposição da cromatina
Adicionalmente as EZH2 também tem a quando e onde for preciso.
capacidade de promover a metilação de
NOTA: Com alguma frequência temos
outros substratos, que não as histonas,
substituição dos promotores dos genes H3.3
nomeadamente as STAT3 e RORalfa.
por H2.AZ (na fase antes da transcrição),
Vários fármacos foram desenvolvidos com o durante a transcrição este fenómeno
intuito de inibir a ação das EZH2. Uma das também ocorre provocando a mudança de
ações desta proteína é estabelecer a H3.3 para H2A e H2B.
trimetilação da lisina 27, esta por sua vez, é
Sobrexpressão de promotores da
feita à custa do dador universal (SAM),
proliferação celular no cancro da mama
recentemente verificou-se que existem
fármacos, nomeadamente o DZNep e outros Quanto maior o grau do carcinoma da
que são competidores do SAM, que vão inibir mama → menor diferenciação → tumores
atividade canónica das EZH2. Contudo, mais mais agressivos.
tarde foi descoberto que DZNep, atua tanto
nas EZH1 como nas EZH2. H2A.Z foi usado como marcador para
neoplasias mais agressivas.
SMYD3 (SET And MYND Domain Containing 3)
No carcinoma da próstata resistente à
Desempenha um papel oncogénico no castração, há um aumento do transcrito de
cancro da próstata, é considerado um H2A.Z pelo que está associado a maior
biomarcador para a doença clinicamente agressividade do cancro.
agressiva e a sobreexpressão desta proteína
também pode construir um alvo terapêutico
atraente no cancro da próstata, uma vez,
que as suas propriedades promotoras de
tumor são principalmente devidas à
atividade das histonas metiltransferases.

Variantes das histonas

 Histonas centrais ou canónicas (H3, H4,

H2A e H2B), região de ligação H1 e as
variantes das histonas são H3 e H2A.

21
Rita Fialho l IPO

Mudanças no RNA não codificaNTE em cancro

Grande diversidade de RNA não codificante, Anti-sense

contudo a sua expressão é mais baixa do que
os transcritos convencionais. Podem ser
transcritos de várias formas: sense, antisense,
bidirecionais. Isto indica-nos que a forma
como estes ncRNA são formados é bem mais
diversa do que os transcritos convencionais.
 lncRNAs iniciam-se na região 3’ de um
À exceção dos microRNAs e dos RNAs de gene que codifica uma proteína.
transferência (importantes para a síntese das  São transcritos na direção oposta dos
proteínas) os outros, nomeadamente os genes e encontram-se sobrepostos em
ncRNA longos podem regular a transcrição pelo menos um exão.
de genes.
ANRIL – reprime o locus supressor CDNK2B-
RNA não codificantes longos (lncRNA) CDNK2A por metilação da histona 3 lisina 27.

 Compostos por mais de 200 pb. Intrónicos

 Cap de metilguanosina, na região 5’
terminal e são poliadenilados.
 Partilham a mesma maquinaria de
transcrição que o RNA mensageiro – RNA
polimerase II.
 São expressões em quantidades menores.
 São regulados por mecanismos pós-  Iniciam-se no intrão de um gene que
transducionais das histonas (H3K4me3 – codificam proteínas, podem ter qualquer
promotor com marcas ativadoras e direção e terminam sem sobreposição de
H3K36me3 – corpo do gene). exões.

microRNA vs IncRNA PCA3 – oncogene dominante negativo que

suprime PRUNE2.
Diferenças:
Bidirecional
 Os lncRNA estão predominantemente
no núcleo, e alguns podem
desempenhar a sua função ao nível do
citosol.
 Os lncRNA estão em grande
quantidade (3 a 6x maior do que os
 Transcrições que se iniciam de forma
transcritos convencionais) mas os seus
divergente do promotor do gene que
níveis de expressão individuais são
codificam proteínas.
baixos a moderados, o que torna difícil
 O corte e a distância não está definido,
a sua deteção. mas geralmente está dentro de algumas
Forma de síntese dos RNA não centenas de pares de bases.
codificantes longos:
HOXA – é transcrito na região 5’ do locus
HOXA e partilha o promotor de um gene
(gene HOXA1) que codifica uma proteína.

22
Rita Fialho l IPO
Intregénicos
 São originados entre genes que codificam
proteínas.
 Tem que estar a 5kb de distância dos
genes que codificam proteínas.
SChLAP1 – promove o cancro da próstata
agressivo e antagoniza o complexo SWI/SNF.
Funções possíveis do lncRNAs
 Podem interferir na transcrição, ou seja,
funcionam como reguladores da
transcrição e expressão génica.
 Induzir a remodelação e formação da
cromatina.
 Podem dar origem a precursores mais
pequenos, como endo-siRNAs ou
precursores de RNA pequenos.
 Funciona como reguladores da atividade
das proteínas, através da localização das
próprias proteínas, deixando de estar no
seu local wild type e passam a despenhar
outras funções quando são
deslocalizadas.
Relativamente as funções destes lncRNA
genericamente, podemos dizer que
funcionam como reguladores epigenéticos,
reguladores da cromatina, da transcrição e
também atuam pós-transcricionalmente ao
nível do metabolismo das proteínas.
Muitos destes lncRNAs encontram-se no
núcleo e interagem com os complexos
remodeladores da cromatina para regular a
expressão de genes que estão na
proximidade da região original (-cis) ou
regular a expressão de genes que se
encontram longe do local onde foram
transcritos (-trans), com o objetivo de dar
origem à arquitetura do cromossoma.
NOTA: A ação trans está relacionada com a
proximidades dos locais do DNA quando este
se encontra ‘’enrolado’’, ou seja, em termos
de genoma estão longe mas na sua
conformação 3D estão perto.
Exemplos:
XIST – produzido por porções do cromossoma
X e vai recrutar complexos que inativam o
cromossoma X.
A sua transcrição facilita a inativação do
cromossoma X individual em mulheres,
através do recrutamento de PRC2.
HOTAIR – encontra-se na região PRC2
cromossoma 12 e por estar enrolado fica
próximo do HOXD do cromossoma 2,
silenciando a transcrição embrionária.
A supressão de HOTAIR no cancro, provoca a
relocação de PRC2 e o silenciamento
epigenético dos genes supressores de
metástases, que impulsionam a progressão
tumoral.
Outra das funções possíveis é funcionar como
Scaffold (agregadora) de várias proteínas
para formar estruturas de
ribonucleoproteinas, impulsionando assim a
atividade destas proteínas.
23
Rita Fialho l IPO

HOTAIR RNA de pequenas dimensões

 É reprimido pelos androgénios, no caso de

tumores da próstata resistentes à
castração não androgénicos encontra-se
aumentado.
 Bloqueia a atividade da ubiquitina que
leva à degradação dos recetores de
androgénio.
 Aumenta o target da cromatina para os
recetores de androgénio.
 Mas sobretudo, encontra-se na génese da
ativação da via que leva à resistência à
castração.

Transcritos Anti-sense

Reconhecem a existência de sequências

complementares, sejam elas DNA ou RNA e
também se podem ligar a complexos de Small RNAs
proteínas para modular a expressão génica.

Exemplo de lncRNA: PTENP1 homólogo de

PTEN (gene supressor tumoral), este vai
funcionar como ‘’isco’’ para a regulação
negativa dos microRNAs. PTENP1 (é também
competing endogenous RNAs ou ceRNAs) vai
funcionar como competidor endógenos,
facilitando a existência de níveis maiores dos
pseudogenes → microRNA vai ter como alvo
os pseudogenes → deixa de regular
negativamente o gene supressor tumoral
PTEN.  Existem mais de 7000, cerca de 85% destes
correspondem a snRNAs, snoRNAs, miRNAs
Existem duas formas de PTENP1: PTENP1-AS e e tRNAs.
PTENP1-C, estas têm funcionalidades muito  snoRNAs encontra-se no núcleo.
semelhantes.  miRNAs e tRNAs no citosol.
 snRNAs são encontrados tanto no citosol
como no núcleo.

snoRNAs

 Pequenos RNAs com 60-300 nucleótidos

de comprimento.
 Funcionam como guide RNAs na fase pós-
transcricional na modificação de RNA
ribossómicos.
 A maioria dos snoRNAs em mamíferos são
codificados em regiões intrónicas.

24
Rita Fialho l IPO

exportado para o citoplasma onde vai

completar a sua maturação.

A sua maturação está completa quando

temos separação sendo o microRNA maturo
composto por uma cadeia guide (vai
desempenhar a sua função no complexo
RISC) e uma passenger (que mais tarde é
degradada). O microRNA maturo → induz a
repressão e a clivagem dos transcritos.

Quais são as moléculas importantes para

 Por norma, tem dois dominos hairpins com biogénese dos microRNAs?
regiões complementares a flanquear a
uridina e a convertê-la no rRNA alvo.  Drosha.
 Envolvido no Síndrome Prader-Willi,  Exportina (Exp) – sem esta molécula os pré-
provocada por deficiência na expressão microRNAs ficam aprisionados no núcleo.
da CD box → défice na cópia paterna.  DICER e TRBP – são importantes para
Como a cópia materna está sujeita a completar a maturação do microRNA.
imprinting, ou seja, está silenciada vai
haver a dupla ausência da região 15q11-
q13 → provocando o Síndrome.
 Podem ser precursores de microRNA, que
vão ter capacidade de regular pós-
transcricionalmente.

microRNA (miRNAs)

 Existem nas várias células, estão

mapeados em diferentes localizações
dos cromossomas (excluindo o
cromossoma Y).
 Estão localizados na vasta maioria em
regiões intergénicas, portanto, tem
autonomia genómica.
 Um miRNA pode regular vários transcritos, Como se distingue a cadeia guide da
atuando em diferentes vias tumorais e por cadeia passenger?
outro lado, um transcrito pode ser
regulado por vários microRNAs. Esta principalmente relacionado com a
representatividade nos tecidos, porque o que
 30-60% dos genes humanos são regulados
vai acontecer a passenger vai ser
por miRNA.
 A regulação por miRNAs garante direcionada para vias de degradação e fica
apenas a cadeia guide, e esta vai
mudanças rápidas na síntese de proteínas,
desenvolver a sua função no P-body.
sem alterar a transcrição e é refinada pelo
tecido, pela expressão dependente do Drosha/DGCR8 control
tempo e da funcionalidade de miRNA.
Importantes para o processamento dos pri-
Biogénese e Função miRNAs microRNA em pré-microRNA, se ocorrer
No caso de ser autónomo, vai ser alterações nestas proteínas vamos ter uma
menor eficiência no processamento dos
transformado na forma de pri-microRNA → é
microRNAs, sendo esta uma das causas da
transformado em pré-microRNA → este vai ser
25
Rita Fialho l IPO

sobreexpressão que se verifica nos tumores. No microRNA a cadeia passenger é

Para além disso, o aumento da degradada e a cadeia guide vai para o
sobreexpressão destas proteínas leva a complexo RISC, neste complexo verifica-se
modificações na localização do núcleo e que dependendo da ligação ao transcrito (se
modificações na estabilização. o grau de complementaridade é maior ou
menor que 95%).

Quando este valor é maior que 95% ocorre a

clivagem do transcrito devido à ação
endonucleotídica do complexo RISC.

Quando não há complementaridade total

vai haver uma repressão transitória ou
mecanismos de desadeninação que leva a
uma diminuição da transcrição, mas neste
caso não ocorre clivagem.
O caso de haver uma fosforilação e a ligação
NOTA: Relativamente ao microRNAs há uma
à MeCP2 vai haver uma inibição do
redundância no targeting, que está
funcionamento de DGCR8, o que provoca
relacionada com o pequeno tamanho dos
uma diminuição regulação da deste
microRNAs logo é normal haver vários
complexo.
transcritos com uma sequência similar.
Outra das alterações que pode acontecer é
MicroRNA que vai regular vários transcritos
mutações ou deleção da EXP5, levando a um
aprisionamento dos pré-microRNAs no núcleo
evitando a passagem para o citoplasma, que
é onde ocorre a finalização da maturação.

Processamento dos pré-microRNAs no

citoplasma

As proteínas mais importantes são as DICER e

TRBP, uma vez que a DICER vai-se ligar ao pré-
microRNA juntamente com a TRBP vai permitir
a continuação da maturação. Diferentes microRNAs que vão regular um só
transcrito
Deficiências nestas proteínas leva a
deficiências na maturação do microRNA, pois
não ocorre a clivagem do pré-microRNA pela
DICER, portanto, o microRNA originado não é
eficaz de induzir a degradação dos
transcritos.

Competing endogenous RNAs.

Podem ter características especificas,

nomeadamente os circulares, pseudogenes.

26
Rita Fialho l IPO
MicroRNA – mediador da regulação
 Podem mediar a repressão através da
destabilização do transcrito ou quando
interferem com os ribossomas, e ao
impedir a ligação aos ribossomas vai
provocar uma diminuição efetiva da
tradução.
Características dos microRNAs
 MicroRNA podem ir para o núcleo, o que
reforça a ideia de que os microRNAs
funcionam como mecanismos
epigenéticos de regulação.
 Podem ter targets não clássicos,
nomeadamente regiões específicas do
DNA, o que corrobora a funcionalidade
dos DNAs ao nível do núcleo.
 Na maioria das situações promove a
desregulação, mas há alguns mecanismos
que mostram que podem promover da
tradução.
 Carga especifica das vesiculas
extracelulares é importante para as várias
características biológicas das neoplasias,
pois as vesiculas funcionam como
transportadores mensageiros para a
metastização e para a interação com
tecidos e células adjacentes.
 Podem funcionar como agonistas dos TLRs
(responsáveis pelo reconhecimento de
patogénicos) e assim dar origem de vias
de downstream.
Resumindo: Existe um conjunto de microRNA
que são oncogenes sendo que a maioria dos
microRNA tem função de supressora tumoral,
esta função encontra-se diminuída nos
tumores o que ocorre devido ao aumento da
atividade dos oncogenes.
MicroRNAs e a sua associação com
hallmarks of cancer
Alguns destes microRNAs existem em
circulação e estão associados a
características mais agressivas e por isso são
importantes para o prognóstico da doença.
No caso do cancro da mama foi possível
associar desregulação ao aumento da
expressão de determinados microRNAs (ER,
PR ou HER2).
Outro dado importante é que estes
microRNAs estão associados a regulação de
várias enzimas associadas à transição
epitélio-mesenquima, nomeadamente a
regulação da caderina-E, metaloproteinases.
Os microRNAs com função supressora tumoral
são regulados da mesma forma que os
oncogenes, seja por alterações genética ou
por alterações epigenéticas.
27
Rita Fialho l IPO

Ex: Enoxacina.

NOTA: Também podemos ter o aumento da

atividade de miRNAs com função de
oncogenes que vão regular negativamente
transcritos de genes, cujas proteínas têm
função de supressora tumoral.

Funcionalidades dos microRNAs

MicroRNAs com função supressora tumoral

podem ser regulados por metilação e por
modificações pós-tradução das histonas.

Carcinoma da próstata

Existem vários microRNAs que são

downregulated nesta neoplasia e como visto
anteriormente a hipermetilação da região
promotora dos genes causa a diminuição da
 Antisense-microRNA. expressão. Foram encontrados 3 microRNAs
 MicroRNA masking. que são regulados por metilação no
 MicroRNA sponges. carcinoma da próstata.

Estes são reguladores negativos nas diferentes

fases da biogénese dos microRNAs, ao passo
que os microRNAs mimics vão mimetizar a
forma matura.

Terapêutica baseada em microRNAs

MicroRNAs replacement: Esta metilação pode silenciar a expressão dos

transcritos seja microRNAs transcritos em
MicroRNA mimics – introdução de microRNAs regiões intergénicas, regiões
não existentes nas células. intrónicas/exónicas e em regiões
Ganho de função dos MicroRNAs: policistrónica:

Antagonistas de microRNAs – moléculas  ncRNAs são importantes para a regulação

simples que se ligam por complementaridade genómica nos diferentes níveis e na
aos microRNAs resultando numa imparidade aquisição de propriedades inerentes ao
entre os miRNAs e os mRNAs. cancro, nomeadamente a pluripotência.
 lncRNAs são moléculas que interagem
Moléculas que restauram a expressão de com várias proteínas e com várias porções
microRNAs: do genoma, e que apresentam a

28
Rita Fialho l IPO

capacidade de recrutar complexos

remodeladores da cromatina e que
atuam como fatores de transcrição.

29
Rita Fialho l IPO
Técnicas para o estudo de alterações epigenéticas
Metilação do DNA:
 Bisulphite sequencing.
 Pyrosequencing.
 MSP e QMSP.
 MLPA.
Modificações pós-traducionais (PTMs):
 ChiP-PCR.
 ChiP on Chip.
 Chipseq.
Vantagem da análise da hipermetilação
 Alteração comum em cancro.
 Ocorre em fases precoces das alterações,
podendo haver alterações moleculares
que surge antes de haver um fenótipo de
malignidade das células.
 Padrão de hipermetilação parece ser
específico de determinadas neoplasias.
 São alterações quantificáveis e têm
características qualitativas com as células
normais.
 Fáceis de fazer screen, pois a localização
é restrita ao promotor do gene.
 Dificilmente mascarado pela existência
de células normais.
 Mais estáveis do que o RNA.
 Requer pequenas quantidades de DNA.
 Várias amostras clínicas podem ser fonte
de DNA e como tal podem ser sujeitas à
análise da metilação.
Sequenciação Bissulfito
Modificação das citosinas que não estão
metiladas em uracilo, isto acontece por vários
processos químicos, que inclui a sufonação,
desaminação hidrolítica e a desofunização
alcalina. A vantagem deste procedimento é
que permite distinguir as citocinas metiladas
das que não estão metiladas.
Para este procedimento é necessário:
 Modificação de bissulfito.
 Desenhar primers para ladear as ilhas
CpG. É importante que os primers não
estejam dependentes da metilação, ou
seja, escolhe-se regiões que sem CpGs e
dependendo das ilhas pode-se desenhar
mais do que um par de primers.
 Sequenciação normal, esta pode colocar
algum ruido pelo que se recorre à
clonagem e sequenciação do produto
PCR, o que permite avaliar as moléculas
individualmente.
Na clonagem identifica-se cada
sequência de cada um dos clones, tendo
diferentes clones com níveis de metilação
em dinucleótidos diferentes.
Fornece informação detalhada da região
amplificada, faz-se a comparação desta
região no tumor e em tecido normal e é um
método tecnicamente exigente.
Quando se realiza sequenciação bissulfito?
 Quando não se conhece o padrão de
metilação de um promotor.
 Para determinar o papel da metilação em
mecanismos reguladores específicos,
neste caso é importante saber o status de
metilação dos dinucleótidos individuais.
NOTA: Aplicado a conjuntos pequenos de
amostras ou linhas celulares e usa-se valores
>300pb num ensaio.
Vantagem da sequência bissulfito
Conseguimos mapear os dinucleótidos CpGs,
permitindo a formação de primers específicos
para sequenciação.
Pyro Sequenciação
Funciona de forma semelhante à
sequenciação de Sanger, contudo neste usa-
se amplicones mais pequenos permitindo
calcular o rácio específico ou frequência
especifica de cada um dos nucleótidos e a
percentagem de citosinas (C/C+T). No
entanto, está a cair em desuso pois ocorre
muito time consuming e como referido só
permite ver pequenos amplicones de cada
vez.
30
Rita Fialho l IPO
Methylation Specific PCR (MSP)
Os primers tem que se ligar dinucléotidos
metilados ou não metilados.
Na sequência wild type não há mutações nos
primers, na sequência metilada temos as
citosinas que são lidas como citosinas e na
sequência não metilada as citosinas passam
a timinas quando estas não estão metiladas
NOTA: O número de amplicones não pode ser
muito grande, pois a reação vai ser especifica
do número de dinucleotidos CpG incluídos
nos primers.
Normalmente temos sempre uma banda de
não metilação, pois os tumores são
heterogéneos, ou seja, vamos ter sempre
algum grau de desmetilação.
Vantagens de MSP:
 Técnica especializada no screening da
metilação.
 Técnica muito sensível.
Desvantagens de MSP:
 Não permite quantificar.
 Problemas normais associados ao PCR.
Real time PCR
Não apresenta as mesmas desvantagens,
pois:
 Toda a reação é feita num tubo
completamente fechado, o que diminui o
risco de contaminação.
 Não é preciso correr em eletroforese
sendo todo o procedimento realizado
pelo software.
 Usa fluorocromos.
PCR normal - Tem a grande vantagem de
determinar o número de alelos metilados na
fase exponencial.
Real time PCR as bandas traduzem o número
de cópias, ou seja, quando há uma
amplificação cedo significa que existe um
grande número de cópias e quando a
amplificação ocorre tardiamente significa
que há um baixo número de cópias.
Fluorescentes químicos
TaqMan/MGB – vai aumentar a
especificidade da reação, porque para além
dos primers existe uma sonda que têm a
necessidade de ser complementar ao target
que se vai usar. E à medida que a polimerase
vai funcionando vai clivar o reporter, a
ligação do reporter ao quencher permite que
este último absorva a fluorescência. Ou seja,
31
Rita Fialho l IPO

só quando ocorre clivagem é que o quencher Gena de referência (endógeno ou exógeno)

deixa de absorver fluorescência e esta passa
Importância da análise semi-quantitativa da
a ser emitida e absorvida pelo software.
metilação?

Podemos ter duas situações diferentes:

SYBR Green – é um agente intercalante e vai

ligar-se a tudo o que apresente dupla cadeia.

Quantitative Methylation Specific PCR (QMSP) Observa-se que a quantidade do input (2) é
Permite a quantificação dos níveis de reduzida, mas o rácio é grande porque temos
metilação em relação a um controlo, numa metade da referência endógena. Quando
única amostra. temos o dobro da referência endógena o
rácio vai ser menor.
 Modificação bissulfito.
 Quantificação relativa pelo método da Isto é importante para os cálculos de
curva padrão TaqMan PCR em tempo metilação.
real. Retas de calibração
 Primers específicos para o gene alvo:
Controlo interno – desprovido de CpGs
pois queremos ter um controlo do DNA.
Alvo – os primers e as sondas hibridam
com M DNA.

O nível de metilação é dado pelo rácio entre

a quantidade de M e a quantidade do
controlo interno.

Referência passiva ou ativa

Usada para normalizar os resultados
experimentais, para normalizar diferenças na
quantidade de DNA total adicionado a uma
reação (CpGmetilação alvo/Referência) x 1000,
serve também para compensar os diferentes
níveis de inibição de PCR, e as diferentes
eficiências de PCR.
Referência passiva:
Este declive deve estar entre -3.1 e -3.4 o que
corresponde a uma eficiência de 100%.
Os pontos representam os controlos positivos,
ou seja, DNA completamente metilado e
diluído que permite o desenho da reta. É com
base nestes pontos que são calculados os
valores das amostras em estudo.

ROX – usado para estabilizar flutuações de

sinal de fluorescência que não tem nada a
ver com o próprio PCR.

Referencia ativa:

32
Rita Fialho l IPO

falibilidade e pouca reprodutividade no

método.

Multiplex Ligation-Dependent Probe

Amplification (MLPA)

Reação inespecífica que está relacionada

com o primer dimer, porque alguns dos casos
são negativos e ao serem negativos
possibilitam a existência de primer dimer.

Vantagens QMSP

 Sensível.
 Com boa precisão ou acuidade.
 Permite realizar muitas amostras (384
poços de cada vez).

Desvantagem QMSP  Kit com várias sondas.

Só usa um gene de cada vez, mas com o
desenvolvimento de diferentes fluorocromo
podemos fazer multiplex até 4-5 genes,
dependendo sempre do comprimento de
onda dos fluorocromo que estão a ser usados
na reação.
Sandas TaqMan
 Cada sonda contém um local de restrição
Hhal na sequência de reconhecimento do
alvo.
 Se o local não for metilado, a digestão de
Hhal vai prevenir a amplificação
exponencial da sonda MS-MLPA.
 As sondas requerem apenas 50-60pb para
hibridização e ligação.

Devido ação da polimerase ocorre a

clivagem do reporter e quencher, portanto o
sinal passa a ser reconhecido pelo software.

Esta sonda apresenta um design e síntese fácil

o que reduz o risco de falsos positivos.

Sondas primer Scorpions

Que incluíam reporter, quencher e primers,

impede a formação de dímeros de primer e
produtos PCR não específicos e expressão um
sinal fluorescente mais forte, no entanto, há
Baseia-se em enzimas de restrição, ou seja,
quando há metilação a enzima de restrição
(Hhal) não corta, mas quando não há
33
Rita Fialho l IPO
metilação a enzima de restrição corta, ao
haver o corte do local não há amplificação.
O nível de metilação é determinado através
da razão da área relativa do pico de cada
sonda alvo da amostra digerida e da amostra
não digerida.
Com este kit consegue-se ver vários genes,
sobretudo genes associados a mismatch
repair.
Vantagens de MLPA
 Análise semi-quantitativa.
 Permite analisar várias sequências ou
genes em simultâneo.
 Permite determinar o número da cópia
dos genes supressores tumorais.
Desvantagens de MLPA
Avalia apenas os genes para os quais o kit foi
projetado.
Histone Post-translational Modifications
(PTMs)
As mais estudadas são a acetilação,
fosforilação e metilação. O método por
excelência é Chromatin Immunoprecipitation
(ChIP) mas existem outros como, ChIP on Chip
e ChIPSeq.
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
 Identifica os parceiros de ligação das
histonas ou da sequência de DNA à qual
uma determinada proteína se liga.
 Fator principal – anticorpos de alta
qualidade, especificidade e eficiência de
fragmentação do DNA (sem fragmentos
muito pequenos nem fragmentos muito
grandes).
 Deve incluir um controlo positivo (RNA
polimerase II ou uma histona central) e um
controlo negativa (IgGs não específicas)
para avaliar a eficácia e especificidade
da precipitação de anticorpos.
 É composto por dois tipos principais: cross-
linking ChIP (X-ChIP) e native ChIP (N-
ChIP).
Native ChIP (N-ChIP)
Condições celulares nativas (clivagem
enzimática)
 Estuda parceiros fortes de ligação ao
DNA, como precipitações de histonas.
 O DNA recuperado pode ser quantificado
diretamente, a especificidade da ligação
do anticorpo às proteínas naturais da
cromatina é mais confiável.
Cross-linking ChIP (X-ChIP)
Condições fixas (Cross-linking químico)
 Pequenos números de células.
 Pequenas quantidades de anticorpos
cruzam-se entre o DNA e as proteínas.
 Permite estudar os fatores de transcrição
que estão fracamente ligados à
especificidade comprometida do DNA
pela recuperação insuficiente de
proteínas.
Primeiramente faz-se um cross-linking entre o
DNA e as histonas → promove-se a lise celular
e sunitação → imunoprecipitação com
anticorpos específicos → purificação do DNA,
obtendo-se o DNA ligado a cada um dos
anticorpos que foi usado → pode realizar-se
PCR, qPCR, Microarray ou sequenciação.
34
Rita Fialho l IPO

Análise ChIP

É um PCR barato, importante desenhar-se

corretamente os primers.

ChIP-PCR:

 Eficiência de tempo e custo.

 Estuda rapidamente as modificações
epigenéticas num locus específico.

ChIP on chip:

 Estuda as modificações pós-tradução das

histonas na genómica individual ou por
matrizes personalizadas.

ChIP-seq:

 Identifica regiões genómicas enriquecidas

entre o DNA imunoprecipitado.
 Não se restringe a uma espécie.

35
Rita Fialho l IPO

Papel dos marcadores epigenéticos no diagnóstico e

prognóstico do cancro

A desregulação epigenética ocorre durante para identificar os pacientes com maior

a oncogénese risco de recorrência da doença.
 Recorrência – deteção precoce da
recorrência de forma a permitir maior
oportunidade para o tratamento com
intenção curativa (antes que se manifeste
através de sintomas clínicos ou exames de
imagem).

Biomarcador é molécula biológica

encontrada no sangue, fluidos corporais ou
tecidos que é um sinal de um processo normal
ou anormal de uma doença. É muito
importante haver parâmetros de
Papel dos biomarcadores epigenéticos nos classificação do biomarcador.
pacientes

 Deteção precoce do cancro – as

alterações epigenéticas geralmente
surgem antes de haver um fenótipo
maligno.
 Screnning de populações de risco –
permite determinar indivíduos
potencialmente com cancro, os quais
devem ser acompanhados por exames de
rastreamento tradicionais. Elevado valor preditivo negativo, significa que
 Triagem – após resultados indeterminados se não tem marcador positivo o doente tem
de imagem ou biópsia, usa-se um teste uma possibilidade baixa de ter patologia e
adicional para decidir o tipo de portanto, não precisa de follow-up nem de
acompanhamento do doente. exames adicionais.
 Marcadores prognóstico ou diagnóstico –
nos quais um resultado está relacionado NOTA: Os ratios são menos utilizados pois são
com a eficácia de um tratamento muito dependentes das outras variáveis, pois
específico. apenas com as outras 6 variáveis
 Escolha da terapia – podem prever a conseguimos avaliar se se trata de um bom
resposta a um medicamento específico. biomarcador ou não.
 Resposta à terapia e falha do tratamento –
Relativamente aos biomarcadores
medição para monitorizar a resposta
epigenéticos podem ser usados em qualquer
inicial à terapia e detetar um aumento
tipo de material clínico basta depois se
consistente relacionado com a resistência
conseguir recolher os ácidos nucleicos
à terapia.
pretendidos.
 Monitorização da doença residual – para
determinar a doença residual mínima No caso da metilação do DNA, ainda é mais
após o tratamento de primeira linha e fácil pois a metilação que é critica para a
regulação de um dado gene é especifica no
36
Rita Fialho l IPO
promotor, sendo muito fácil identificar o status
de um gene.
 Trata-se de um sinal positivo com menos
probabilidade de ser mascarado por DNA
normal contaminante.
 Mais estável e mais fácil de manipular do
que o RNA.
 Requer quantidades muito pequenas de
DNA.
A grande preocupação dos biomarcadores
passa pela quantificação, ou seja, determinar
o rácio ou o número de cópias metiladas.
Fluxograma de um teste IVD (teste de
diagnostico in vitro)
Após passar os testes de diagnóstico in vitro é
que pode ser aplicado na clínica.
Biopsias Líquidas
Podem representar várias situações, desde
células tumorais necróticas ou apoptóticas,
exossomas ou vesiculas extracelulares, DNA
tumoral circulante, CTCs, biomoléculas
(proteínas, produtos de metabolismo, DNA
livre de células, RNA circundante) e plaquetas
com formação de tumor (TEPs).
 1948 – A primeira descrição de cfDNA de
células no sangue humano.
 1977 – Cientistas identificaram a presença
de níveis anormalmente elevados de
cfDNA no plasma e soro de pacientes
com cancro em relação aos pacientes
‘’normais’’.
Vantagens:
 Menos invasivo.
 Morbilidade reduzida.
 Fornece medições em diferentes pontos
no tempo.
 Pode refletir melhor o perfil molecular de
todos os subclones do tumor.
 Não pode ser diretamente correlacionado
com a histologia e características do
tumor.
Biópsias líquidas juntamente com as Biópsias
tecidulares
Fornece informação sobre:
 Tipo do tumor e locais metastáticos.
 Estágios da doença.
 Heterogeneidade do tumor.
 Tempo de amostragem.
 Avaliação de diferentes clones tumorais.
37
Rita Fialho l IPO

 Resultados positivos-negativos podem ser

introduzidos devido à presença de
material de várias fontes.

NOTA: Apesar das amostras das biopsias

líquidas terem uma menor quantidade de
DNA pode usar-se uma grande quantidade
de métodos para analisar o DNA.

cfDNA (Circulating free DNA) vs ctDNA

(Circulating tumor DNA)

 Os ctDNAs são geralmente pequenos

fragmentos de DNA na faixa de 140-170
pb.
 ctDNA representa <0,01% a 10% de cfDNA.
 Embora o cfDNA e o ctDNA sejam
mensuráveis nas amostras de sangue, a
deteção de ctDNA é clinicamente mais
relevante do que cfDNA, que é derivado
de tumores, bem como de origens não
tumorais.
 A quantidade de ctDNA depende de
vários fatores, incluindo a natureza do
Ivy gene e GRAIL – teste que tenta detetar
tumor primário, grau do tumor e
malignidade.
vascularidade.
 Para pacientes com doença avançada, Teste Epi proCOLON
os resultados do teste de ctDNA parecem
mais confiáveis quando realizados na A adesão à colonoscopia ou pesquisa oculta
progressão da doença, em vez de de sangue nas fezes é muito baixa, pelo que
durante a resposta à terapia. houve a necessidade de desenvolver outro
teste que tenha maior adesão.
Biópsias Líquidas - ctDNA
Caso haja um resultado positivo neste teste, o
É importante garantir que existem paciente é sujeito a colonoscopia.
características pré-analíticas que não vão
interferir na análise que vai ser feita.  Sensibilidade de 73% e especificidade de
82%.
Aspetos pré-analíticos:  A sensibilidade deste teste não pareceu
ser afetada pela localização do tumor ou
 A amostra ideal para ctDNA é plasma e
pela idade ou sexo do paciente.
não soro.
 Comparativamente ao FIT (teste
 Tubos ideais para coleta: anticoagulante
imunoquímico fecal) – sensibilidade de
até 6h (EDTA) ou estabilização do celular.
68% e especificidade de 97%.
 Extração do plasma, havendo um
protocolo de centrifugação em duas SHOX2/PTGER4
etapas.
 Armazenamento de frações de uso único Para a validação dos biomarcadores é
são guardadas de -20 a -80ºC por cerca necessário uma série de testes, é preciso uma
de 9 meses. grande quantidade de casos e de controlos,
 Extração de ctDNA. sendo usado muitas vezes nos controlos
pacientes com outras patologias, de forma a

38
Rita Fialho l IPO
entender se o biomarcador consegue
distinguir uma patologia maligna de uma
patologia não maligna.
(A) Cancro do pulmão vs Controlos
saudáveis.
(B) Cancro do pulmão vs Doenças não
malignas.
(C) Cancro do pulmão vs Controlos
saudáveis outra série.
(D) Doenças não malignas vs controlos
saudáveis.
Observa-se que no gráfico D a curva diminui
bastante, o que significa que o incremento
face a esta população é diminuído.
ConfirmMDX
Ao fazer a analise da metilação dos GSTP1,
RASSF1, APC por PCR em tempo real, permite
que os indivíduos suspeitos de ter carcinoma
da próstata quando são negativos neste teste
fazem apenas vigilância ativa. Entanto que os
pacientes com teste positivo têm que
repetição da biópsia e ressonância
magnética.
Valor preditivo negativo superior a 95%
GynTect
Projeção de desempenho do teste de
metilação (pontuado como teste positivo se
pelo menos 2 de 5 marcadores foram
metilados) em mulheres HPV positivas com
idades superiores a 30 anos.
CIN3 – displasia grave.
Biomarcadores de gestão de doenças
Gene MGMT – é um gene de reparação do
DNA, reparando alterações induzidas por
agentes alquilantes. Se houver metilação do
gene MGMT não havia haver reparação,
portanto, os pacientes reagem melhor
agentes alquilantes.
Therascreen – ajuda a identificar doentes
com carcinoma da mama que vão
beneficiar do tratamento com antraciclina.
Metilação do promotor MGMT no
glioblastoma
 Tumores com alelos MGMT silenciados são
predispostos a mutações de transição G
→ A em genes-chave, como TP53 e K-RAS.
 Resgata células tumorais de danos
induzidos por agentes alquilantes, e isso
leva à resistência à quimioterapia com
agentes alquilantes.
 O silenciamento epigenético do gene
MGMT por metilação do promotor resulta
na diminuição da expressão da proteína
MGMT, redução da atividade de reparo
do DNA e potencial aumento da
sensibilidade à terapia.
 A metilação do promotor MGMT ocorre
em 35% –45% dos gliomas malignos (graus
39
Rita Fialho l IPO
III e IV da OMS) e em ~ 80% dos gliomas
grau II da OMS.
 Em glioblastomas recentemente
diagnosticados (OMS graus III e IV), a
metilação do promotor MGMT é um fator
prognóstico favorável independente e um
forte preditor de responsividade à
quimioterapia alquilante (isto é,
temozolomida).
 Em pacientes idosos (>60 anos), apoia-se
que pode ser uma estratégia terapêutica
alternativa:
 Metilação do promotor MGMT:
monoterapia com temozolomida.
 Metilação do promotor MGMT:
radioterapia.
 O status de metilação MGMT é um
biomarcador valioso para orientar a
tomada de decisão terapêutica para
glioblastoma recém-diagnosticado em
pacientes idosos, evitando toxicidades e
custos de tratamento desnecessários.
PITX2
Metilação do promotor do fator 2 de
transcrição do homeodomínio pareado
prediz risco de metástase à distância em
cancro de mama positivo para recetor de
hormonas negativo.
O valor PMR do ensaio therascreen PITX2
pode ajudar os médicos a identificar os
pacientes que têm maior ou menor
probabilidade de se beneficiarem da
quimioterapia adjuvante à base de
antraciclina.
Biomarcadores de monitorização pós-
tratamento
Permite identificar a existência de
recorrência ou de doença residual
mínima.
COLVERA – usa dois marcadores específicos
para a pesquisa em plasma.
Bladder Epicheck – com um score de
metilação de 15 genes e que permite
monitorização e detetar precocemente a
existência de recorrência.
Marcadores de cancro de RNA não
codificante
PCA3 – detetado na urina de pacientes
com suspeição de ter cancro da próstata,
porque têm níveis de PSA elevados, toque
retal negativo e biopsias tecidulares
negativas.
Este teste permite ver se o doente precisa
de repetir biópsia ou se precisa apenas de
vigilância ativa.
Rosette Lung Cancer Teste
Deteta vários micro-RNAse e a grande
utilidade deste teste passa identificação
do tipo de cancro logo na análise.
Contudo nem sempre as células
cancerígenas estão presentes nos lavados
brônquicos e nem sempre os tumores
podem ser submetidos a biopsia
40
Rita Fialho l IPO
histológica. Sendo muito importante a
procura de testes que nos indiquem o tipo
histológico do tumor para que os doentes
sejam mais rapidamente encaminhados
para o tratamento certo.
Biomarcadores epigenéticos em
oncologia
Cancro da Próstata
 É o segundo cancro mais comum nos
homens (15% de todos os novos casos).
 70% ocorre em regiões desenvolvidas.
 E é a quinta causa principal de
mortalidade relacionada com o cancro.
 A maioria do cancro da próstata
encontra-se confinado no órgão e
tratamento ideal para esses pacientes
permanece um desafio.
 Parâmetros clinico-patológicos sozinhos
não conseguem diferenciar com precisão
o cancro da próstata indolente do
agressivo.
As questões centrais são:
Os biomarcadores podem prever melhor o
comportamento CaP localizado?
Os biomarcadores podem ajudar no
tratamento planeado?
Pensa-se que conseguimos arranjar
epimarcadores que podem ajudar na
deteção de cancro da próstata,
nomeadamente testes na urina que indicam
se o doente precisa de biopsias prostáticas.
 O gene Glutationa-S-transferase P1
(GSTP1) codifica para uma enzima de
desintoxicação de fase II (GST-π),
envolvido na proteção do DNA,
nomeadamente em danos devido à
exposição a agentes cancerígenos e
espécies que reagem ao oxigênio.
 A perda frequente da expressão GSTP1 foi
amplamente documentado no cancro da
próstata.
 A metilação GSTP1 do era mais
informativa do que as biópsias e do que o
PSA, contudo a sensibilidade não
ultrapassava os 91% e a especificidade
era de 100%. Quando era positivo tinha
mesmo tumor.
Para aumentar a sensibilidade dos genes
analisou-se novos genes que estejam
41
Rita Fialho l IPO

relacionados com a patologia, identificou-se MethylBiom4Can

o APC, RASSF1A e CRBP1.
Permite a avaliação e validação de um
painel de Biomarcadores baseados em
metilação em DNA livre de células para
deteção de primeiro cancro primário
recorrente (RFPC) e segundo cancro primário
(SPC).

Objetivo é detetar os 4 cancros mais

frequentes na população.

Altos níveis de metilação do promotor APC

identificam um subconjunto agressivo de
CaP, em um ambiente pré-terapêutico.

Tumores urológicos: Fatores de risco

 Globalmente, o cancro renal é

responsável por aproximadamente 4% de
todos os tipos de cancro.
 São morfológica e geneticamente
heterogéneos.
 Os tumores renais são assintomáticos e
não palpáveis nos estágios iniciais.
 O uso generalizado de técnicas de
imagem (principalmente ultrassonografia)
aumentou a deteção de suspeitas massas
renais.
 Biópsia renal – 20% são inconclusivos e as
características morfológicas têm alguma
sobreposição entre os subtipos de tumor:
chRCC vs. Oncocitoma

42
Rita Fialho l IPO

fármacos Epigenéticas

Normalmente os alvos de tratamento incidem

naqueles que reconhecem as alterações
genéticas, os que eliminam essas alterações
epigenéticas ao nível do DNA ou das histonas.

As alterações epigenéticas são reversíveis,

potencialmente mais plásticas e dinâmicas
do que as alterações genéticas.

Terapia Epigénica

Tem como objetivo reverter o genótipo e

induzir a diferenciação das células tumorais.

4ª vaga

A ação deste tipo de fármacos, baseia-se na:

 Capacidade destes fármacos reverterem

o padrão das modificações induzidos
pelas DNA metiltransferases e pelas
modificações das histonas.
 Corrigir os níveis de expressão destes
players.
 Corrigir mutações epigenéticas.

Podemos descrever 4 vagas da descoberta

dos fármacos epigenéticos:

Existe uma grande interação entre as

diferentes fases porque não só se tem que
fazer um screening em linhas celulares e
estudos pré-clinicos como se tem que definir
muito bem qual a forma de se sintetizar estas
inibidores de pequenas dimensões.

Recorre-se a livrarias de forma a ter

informação sobre os resultados enzimáticos e
avaliação da especificidade e capacidade
de docking dos inibidores às moléculas alvo.
De seguida é importante realizar os estudos
em animais, ver o efeito off target. Pode-se
iniciar em qualquer uma das etapas, mas é
importante ter em consideração qual a
43
Rita Fialho l IPO
etapa ideal a seguir e a capacidade de
redefinição dos alvos caso os resultados não
sejam os esperados.
Potenciais alvos terapêuticos
Inibidores da metilação do DNA
Inibidores das DNMT: uma das marcas
associadas à neoplasia é o facto de haver
hipermetilação do promotor dos genes,
portanto, uma das formas de ver a eficácia
destes fármacos é verificar se têm a
capacidade de desmetilar estes genes que
são patogenicamente hipermetilado.
Adicionalmente outro dos efeitos desta
neoplasia é a hipometilação global do DNA,
sendo importante ter a certeza que estes
fármacos têm como local preferencial de
ação aquelas porções do genoma que estão
patogenicamente hipermetiladas.
Contudo, se não forem administrados
frequentemente perdem o seu efeito.
Existem duas grandes classes dos inibidores
das DNMT:
 Pequenas moléculas ou não nucleosídeos
– não se ligam ao DNA, mas sim a locais
catalíticos impedindo a ação das DNMTs.
 Análogos dos nucleosídeos – substituem as
citosinas presentes no DNA, ligam-se
covalentemente as DNMTs e vão ser
aprisionadas deixando de ser funcionais, o
que causa acumulação dos danos no
DNA devido à ausência de atividade das
DNMTs. Estes compostos apresentam
maior toxicidade porque vão interferir
com a cadeia dos ácidos nucleicos.
Análogos dos nucleosídeos
Azanucleosides:
 5-azacytidine – nucleotídeo ribose
especialmente incorporado no RNA e
DNA, interferindo na síntese de proteínas.
 5-aza-2’-deoxicytidine – é
preferencialmente incorporado no DNA.
NOTA: É importante que as células estejam
em divisão e que haja a síntese de DNA para
que as DNMTs possam ser incorparadas.
Sendo apenas os tumores com elevada taxa
de proliferação celular que podem beneficiar
deste tipo de fármacos.
Entre 1970 – 1980, eram usadas altas doses de
5-azacitidina e 5-aza-2desoxicitidina para
tratar a leucemia, contudo as suas
propriedades de hipometilação ainda não
eram conhecidas.
Em 2000, foram usadas baixas doses destes
fármacos com o intuído de indução a
diferenciação celular e a interrupção do
crescimento do cancro através da re-
expressão de genes supressores tumorais
silenciados por metilação do DNA.
NOTA: Síndrome mielodisplásico, uma vez que
induz a diferenciação, impede que haja a
transformação em leucemia mieloide aguda,
prolongando a esperança média vida dos
pacientes.
Foi demonstrado que o tratamento com
azacitridina (AZA) prolonga a sobrevida geral
em pacientes com SMD de alto risco,
aumentando a sobrevida em cerca de 10
meses.
44
Rita Fialho l IPO
Vidaza (5-azacitidina) e Decitabina (5-aza-2-
desoxicitidina) apresentam respostas em
cerca de 13-18% dos pacientes com SMD.
Ambos os agentes apresentam:
 Taxas de respostas mais altas: resposta
parcial e maior taxa de remissão.
 Maiores taxas de sobrevivência.
 Transformação mais retardada em
leucemia mieloide aguda.
 Morte retardada.
 Aumento do bem-estar em geral.
Em 2014 a FDA aprovou o uso de Vidaza para
o tratamento de todos os subtipos de SMD e
LMA:
 Dose inicial de 75mg por dia durante 7
dias, ciclos repetidos a cada 4 semanas.
 Administrado por injeção subcutânea ou
intravenosa.
Decitabina foi aprovada apenas em 2006
pela FDA:
 Administrar cerca de 15mg por infusão
intravenosa durante 3h, repetida a cada
8h por 3 dias. Depois repetir o ciclo a cada
6 semanas.
 Administrar cerca de 20mg por infusão
venosa durante 1h, repetida diariamente
durante 5 dias. Repetir o ciclo a cada 4
semanas.
 Mínimo de 4 ciclos.
Ambos os fármacos têm um papel bem
estabelecido e importante em primeira linha
para o tratamento de Síndrome
Mielodisplásico e Leucemia mielocítica
cronica.
Estes fármacos aumentam a suscetibilidade
aos agentes quimioterápicos convencionas,
reativando vários genes apoptóticos.
A principal limitação está relacionada com a
exigência de incorporação de DNA e só
funcionam em tumores altamente
proliferativos.
Fármacos aprovados pela FDS para doenças
não neoplásicas (Drug repurposing):
 Hidralazina.
 Procaína.
 Procainamida.
 Nanomicina A.
 Rg108.
Hidralazina
É um vasodilatador arterial usado para tratar
a hipertensão, inibe a metilação do DNA
estabelecendo interações entre átomos de
nitrogénio e o local ativo das DNMTs.
Procaina e Procainamida
Procaina é um anestésico local e a
procainamida é um anti-arrítmico, ligam-se a
sequencias ricas em CpGi interferindo na
ligação das DNMTs.
Inibe especificamente as DNMT1.
Nanomicina A
É um antibiótico, inibidor seletivo de DNMT3b
com capacidade de reduzir a metilação e
induzir a expressão de genes supressores
tumorais.
2ª vaga
Refere-se a modificações de outros fármacos
similares aos de primeira geração, mas eram
feitas modificações químicas no sentido de
potenciar a ação desmetilante e aumentar a
estabilidade.
Zebularina – Inibe a citidina desaminase,
DNMTs e alta estabilidade em ph ácidos e
neutros.
CP-4200 – É um pró-fármaco de ester de
ácido elaídico com maior biodisponibilidade,
pois não depende apenas de
transportadores de nucleosídeos para a
absorção do fármaco.
SGI-110 – É um dinucleotídeo CpG
mimetizador contendo decitabina em vez de
desoxicitidina, não é um substrato da citidina
desaminase e, portanto, não está sujeito a
esta via de degradação metabólica.
Não nucleosídeos VS Nucleosídeos
45
Rita Fialho l IPO

 Não nucleosídeos são menos citotóxicos, Inibidores HDAC

mas parecem ser menos eficazes na
A vasta maioria destes inibidores tem uma
inibição da metilação do DNA e
forma de atuação muito abrangente (Pan), a
reativação da expressão génica.
sua forma de avaliação de eficácia consiste
 No entanto, os dados relativamente à
na avaliação dos de acetilação de H3 e H4 e
toxicidade dessas moléculas são reduzidos
ver a atividade enzimática dos diferentes
e a maioria destes agentes nunca foi
HDACs.
testado em humanos.
 Ácidos gordos de cadeia longa.
Pitfalls
 Ácidos hidroxâmicos.
 A hipometilação induzida por terapia  Benzamidas.
pode promover a formação de tumor a  Péptidos cíclicos.
longo prazo.
 Usar hipometilação global e, portanto,
aumentar a regulação dos agentes Inibidores HDACs de segunda geração
envolvidos na metástase.
 Também pode causar a ativação de
genes silenciados.

Contudo, parece que estas drogas

administradas em baixas doses ativam
preferencialmente genes que mais tarde se
tornam anormalmente silenciados no cancro
e a estrutura da cromatina associada a um
gene patologicamente silenciado é mais
suscetível à reativação do estado de
cromatina altamente compactado induzido
por silenciamento fisiológico.

 Apresentam toxicidade para células

normais, pois vai interferir com síntese de
DNA e induzir o dano DNA.
 Pacientes que respondem a estes agentes
mostram uma diminuição na metilação
do DNA, mas tem todos mostram redução
do tumor e estes fármacos não mostram
qualquer eficácia em tumores sólidos.
Os DNMTs apresentam 2 substratos: o cofator
SAM e a citosina, ao projetar análogos para
cada substrato é possível obter inibidores mais
potentes.
INQOVI
Composto formado pela associação entre
decitabina e cedazuridina. A cedazuridina é
um inibidor de citidina desaminase, ou seja,
evita a degradação da decitabina →
aumentado a sua biodisponibilidade e
eficácia.
Ácidos Hidroxâmicos
 SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid)
ou Vorunostat - é um inibidor de
panHDAC, inibindo as 11 formas. É bem
tolerado, induz acetilação de histonas e
tem atividade anti-tumoral em tumores
sólidos e hematológicos.
 Foi aprovado em 2006, pela FDA para o
tratamento de Linfoma cutâneo de
células T e Linfoma periférico de células T.
 Atualmente é a terceira linha de terapia
para o Linfoma cutâneo de células T.
 Belinostat – análogo do Vorinostat e foi
aprovado para o Linfoma periférico de
células T.
 Panobinostat – foi aprovado para mieloma
múltiplo refratário, destinado a pacientes

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Rita Fialho l IPO

que receberam pelo menos duas terapias
anteriormente e é usado em combinação
com bortezomibe e dezametasona.
Péptidos cíclicos
estabilidade do composto e efeitos colaterais
limitantes da dose.
Regulação positiva da expressão génica

 Depsipeptide/Romidepsin – apresenta
atividade contra a HDACs classe I, foi
aprovado em 2009 pela FDA para Em conjunto com DNMTi funcionam como
pacientes com Linfoma cutâneo de inibidores do checkpoint imunológico
células T como segunda linha de
tratamento. A 3ª onde de descobertas de drogas
epigenéticas
Benzamidas
 Inibidores de histonas metiltransferases.
 Entinostat – atuam contra as HDACs classe  Inibidores das desmetilase de lisina.
I, ensaios de fase III em conjunto com  Inibidores de Bromodomains.
quimioterapia para cancro da mama.
 Chidamide/Epidaza – inibe HDACs 1, 2, 3 e Inibidores de histonas metiltransferases
10 da classe II, aprovado para o
tratamento de recidivas de Linfoma
periférico de células T

Ácidos carboxílicos de cadeia curta

 O ácido butírico foi o primeiro composto

usado para inibir a desacetilação de
histonas.
 Acido fenilbutirico aprovado para
distúrbios do ciclo da ureia.
 Acido valpróico aprovado para o
tratamento de epilepsia.

Nenhum foi aprovado para terapias contra o

cancro.
Os inibidores das histonas metiltransferases
Inibidores de HDAC em geral como só atuam em alvos específicos tem
uma toxicidade menor.
 Reduz a proliferação celular e
angiogénese e induz a diferenciação
celular e apoptose.
 Apresentam várias subclasses com
algumas funções ainda desconhecidas.
 A atividade das HDACs também têm
como alvo várias proteínas.

HDACi não são drogas epigenéticas

especificas!
 Inibidores das EZH2 – Um dos primeiros
A baixa eficácia como agentes usados no inibidores foi 3-deazaneplanocina-A
tratamento de tumores sólidos é devido à (DZNep) que promove a degradação do

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Rita Fialho l IPO
complexo PRC2 para reativar genes
silenciados.
 EPZ-6438 (Tazemetostat) e GSK126 são
inibidores de EZH2 altamente seletivos.
 DS-3201b e CPI-1205 – atualmente usados
em ensaios clínicos para pacientes com
linfomas.
 Inibidores DOT1L – está envolvido na
patogénese de MLL, a supressão de DOT1L
levou a uma menor expressão do gene de
fusão MLL-AF9 e à diferenciação de
blastos.
 EPZ-5676 (Pinometostat) e EPZ004777 –
assemelha-se ao co-substrato natural SAM
para metilação, mas é seletivo para
DOT1L.
Inibidores das desmetilase de lisina
 Inibidores LSD1 – com local ativo bem
definido o que é benéfico para o
desenvolvimento de inibidores seletivos de
pequenas moléculas com alta afinidade.
Inibidores de Bromodomains
 Liga-se a um bromodominio hidrofóbico,
de forma a prevenir a interação com
resíduos de acetil-lisina → interromper a
ligação de BET à cromatina.
 Demonstrou-se que a depleção e inibição
de proteínas BET inibem o crescimento de
Linfomas, LMA, Mieloma múltiplo,
Neuroblastoma, cancro da mama,
próstata, ovário e cancro do pulmão de
não pequenas células.
 JQ1 e Molibresib/GSK525762/I-BET762
(triazolodiazepines).
4ª vaga de descoberta de fármacos
epigenéticos
 CRISP/Cas o interesse por esta técnica
aumentou exponencialmente por ser uma
ferramenta usada para corrigir mutações
genéticas, mas também por apresentar
várias formar de inativar um gene.
 Se a perda de função for causada por
silenciamento epigenético, o CRISP/Cas
pode ser reaproveitado para direcionar os
efetores para o locus genómico e re-
expressar o gene silenciado.
Terapia epigenética
Sensilizador de
quimioterapia
Superação da
resistência
Ressensibilizar
células tumorais
 Azacitidina e agentes quimioterápicos
(docetaxel e cisplatina) convencionais
provocam o aumento da resposta ao
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Rita Fialho l IPO

cancro da próstata refratário em 13% dos

pacientes.
 Vorinostat e agentes quimioterápicos
(carboplatina e paclitaxel) provocam o
aumento da resposta do carcinoma do
pulmão de não pequenas células em 22%
dos pacientes.
 Combinação de decitabina e LBH586
(Inibidor de HDAC) provoca um efeito
sinérgico em células tumorais de pulmão.
 Decitabina e radioterapia em células de
cancro da mama mostrou um aumento
da taxa de 33% na taxa de resposta.

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Rita Fialho l IPO

Imunidade e Epigenética

Tanto no processo de eliminação como no

processo de escape o sistema imune tem um
papel importante na defesa contra tumores,
contudo, no processo de escape há uma
população de células que pode ser
enriquecida no interior do tumor e promover
este escape tumoral.
Não acontece apenas o reconhecimento do
péptido pelo TCR específico, mas também há
o reconhecimento do próprio MHC.
Reconhecimento péptido/MHC

O que distingue a imunidade inata é uma TAP1 e TAP2 são importantes para que a
resposta rápida e inespecífica as células apresentação antigénica possa acontecer
tumorais e estimula o desenvolvimento da no contexto de MCH classe I.
resposta adaptativa, consiste numa resposta
mais lenta que requer uma apresentação Localização espacial destes processos
antigénica às células naive, seguida de uma
expansão clonal e só após 7 dias é que temos
células efetoras.

50
Rita Fialho l IPO
A apresentação de antigénios ocorre nos
gânglios linfáticos.
Proliferação e diferenciação das células T
Para esta fase acontecer é necessário a
apresentação do antigénio via MHC-TCR,
mas também outros dois sinais co-
estimuladores: o sinal de co-estimulação ou
de sobrevivência (B7-CD28) e o sinal de
diferenciação mediado por citocinas.
Diferenciação das CD4
No contexto de uma resposta anti-tumoral, é
preciso ocorrer a diferenciação em células
Th1, ou seja, o terceiro sinal acima
representado deve ser IL-12 e IFN-γ de forma
a induzir a diferenciação das células CD4+
em células Th1.
Th2 – são importantes para a resposta
humoral.
Importância da formação de Th1?
Porque é necessário o IL-2 e IFN-γ, produzidos
pelas Th1, para que uma célula naive CD8 se
torne numa célula citotóxica capaz de
reconhecer e eliminar um tumor.
Para além disso, as células CD4 ajudam ativar
as APCs, tornando as APCs mais estimuladas
e ativadas de modo a estimulação das
células CD8 se torne mais eficaz.
Células NK
Estas células expressam recetores inibitórios à
sua superfície e que ao encontrar células
MHC classe I recebe um sinal inibitório. Ou
seja, na falta de MHC classe I não existe este
sinal inibitório.
51
Rita Fialho l IPO
Hoje em dia sabe-se que uma célula NK
expressa recetores ativadores e inibidores a
sua superfície. Os recetores inibidores
reconhecer MHC ou moléculas semelhantes
ao MHC e ao mesmo tempo reconhecem
ligando ativadores na superfície de células
tumorais.
Função efetora
Grânulos citotóxicos – são compostos por
perfurinas e granzimas, nunca funcionando
uma sem a outra. As perfurinas perfuram a
membrana de modo que as granzimas
consigam ativar as caspases, provocando a
apoptose da célula tumoral.
IFN-γ
Não tem apenas influência nas células do
sistema imune, mas também nas células
tumorais, pois levam à supressão da
proliferação, aumento de complexos MHC à
superfície e têm um papel anti-angiogénico.
Nas células imunes a presença desta citocina
aumenta o número de células NK e
consequentemente as células CTL, aumenta o
complexo MHC classe II nas células
apresentadoras de antigénio e promove a
diferenciação de CD4+ em células Th1.
Inibidores de checkpoint: CTLA-4 e PD-1
Normalmente não se encontram em todas as
células T no tumor, mas começa a existir um
enriquecimento deste tipo de expressão nos
linfócitos intratumorais. Contudo o grande
problema não são estes componentes, mas
sim as células do microambiente produzirem
os ligandos destes recetores.
Ou seja, as células tumorais expressam
elevados níveis de PD-L1 levando à inibição
das células T intratumorais.
NOTA: Estas células T intratumorais
apresentam grande expressão de PD-1
porque foram ativadas no contexto de
resposta anti-tumoral.
52
Rita Fialho l IPO

que este deixe de estar disponível para a

diferenciação das células CD4+ em células
CTL e podem expressar níveis de CTLA-4 que
podem contribuir para a inativação de APCs.

Atualmente já existem terapias para controlar

este mecanismo, por exemplo, Anti-CTLA-4
antibody, este composto liga-se ao CTLA-4
para que este não receba os sinais inibitórios
aquando ligação com o seu ligando.

Ambiente imunossupressor apresenta níveis

aumentados de T reg, macrófagos M2, MDSCs
o que promove o enriquecimento do
ambiente em TGF-β e IL-10 → promovendo
uma atração de células MDSCs,
transformação dos macrófagos de M1 para
M2 e aumento de células T reg.
Quando o tumor começa a aumentar em Infiltração do tumor
tamanho, há uma acumulação de células T
reguladoras que são marcadas pela
expressão do fator FOXP3. A acumulação
destas células T reguladoras leva à supressão
da ação das células T efetoras (células Th1) →
promovendo a existência de um
microambiente imunossupressor, devido à
produção de TGF-β induzindo a
diferenciação das células T CD4 em células T
reg. Ao mesmo tempo, TGF-β e IL-10 vão
atrair outras células imunossupressoras para o
tumor.

Quando maior a quantidade de células

imunossupressoras no tumor, menor será a
sobrevida do paciente.

As células T reguladoras são também capazes

de matar através da expressão de granzimas
e perforinas, através do recrutamento de IL-2 ↑ quimiocinas → atração de células imunes
presente no microambiente fazendo com
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Rita Fialho l IPO
Mecanismos de escape
H3K27me3 – repressiva
H3K4me3 – permissiva
 Metilação do antigénio tumoral,
provocando ausência de expressão de
antigénios
 Metilação da β-2-microglobulina, não
ocorre o folding de MHC, não havendo
expressão de MHC classe I.
 Hipermetilação de TAP1 e TAP2, não
havendo apresentação antigénica.
Na presença de algumas drogas
epigenéticas (DNMT, EZH2i e HDACi) vai
promover a acetilação das histonas, o que
leva ao aumento da apresentação
antigénica.
Recentemente descobriu-se que ao usar
inibidores das DNMTs consegue-se aumentar
a imunogenicidade de células tumorais
através de ERVs (retrovírus endógeno) (são
inseridos no nosso genoma, mas encontram
silenciados por hipermetilação). Ao tratar as
células tumorais com DNMTs → os ERVs
passam a ser expressos → a células tumoral
passa a reconhecer como vírus os ERVs, ou
seja, a células tumoral acha que esta a ser
infetada por um vírus → passando a expressar
IFN-1 → Aumenta a concentração de células
imunes (CD8 e NK) e aumentar os níveis
endógenos de MHC classe I e a produção de
antigénios.
Pelo uso de drogas epigenéticas podemos
aumentar a expressão de MICA/MICB, que
são ligandos ativadores das células NK →
aumentando a maquinaria epigenética, mas
também os ligandos ativadores reconhecidos
pelas células NK.
A concentração de quimiocinas também
pode aumentar perante o uso de drogas
epigenética, ou seja, o aumento de
CXCL9/CXCL10 leva ao aumento da atração
e ação de células CD8+ e células NK.
As células imunes são extremamente
plásticas, sendo esta plasticidade controlada
por eventos epigenéticos, por exemplo, uma
célula CD8 naive a acessibilidade da
cromatina é mais reduzida e tem menos
transcrição de genes. Quando se tentam
terapias de bloqueio de checkpoint, as
células T continuam a não estar funcionais
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Rita Fialho l IPO

pois as não funcionalidade das células T não

ocorre apenas devido a expressão deste
recetor inibitório, mas sim a todo o
silenciamento das células T.

↑TCF7 e TBX21 são importantes para a função

efetora, nomeadamente na produção de
granzimas e perforinas.

A produção de IFN-γ é controlada

epigeneticamente pela metilação, ao usar
inibidores de DNMT podemos aumentar o
nível de IFN-γ produzido pelas células NK. Ao
mesmo tempo, com inibidores de EZH2
aumentamos a produção de NKG2DL e
NKG2D, portanto parece que o uso de
inibidores DNMT favorece o reconhecimento
por parte das células imunes.

As células CD4 têm capacidade de se

diferenciar em diferentes células e por essa
razão apresentam uma elevada plasticidade
e são muito moduladas por mecanismos
epigenéticos.

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