1-Introdução Sinalização Molecular

[Transdução de Sinal entre células e tecidos]

Transdução Intercelular- Transmissão de um sinal produzido e secretado por uma célula
sinalizadora para uma célula alvo.

Transdução Intracelular

• Envolve a descodificação de um sinal recebido pela célula alvo

• Envolve cascatas de sinalização e proteínas sinalizadoras (complexos) que sofrem
regulação de forma a alterarem a sua atividade.

Desta forma é possível que as células de um órgão/tecido sejam capazes de responder a

alterações na função em células de outros órgãos/tecidos- Homeostasia do Organismo.

[Sinalização intercelular]
Sinalização Justacrina- Ocorre entre duas células em contacto direto. Estas células são capazes
de comunicar através de:

• Gap junctions- Regiões da membrana que estão em contacto direto e permitem a

passagem direta de moléculas pequenas (iões, metabolitos, mensageiros secundários)
entre células vizinhas- Sinais elétricos (cérebro e coração)
• Interação de proteínas expressas na superfície (sinal) com recetores expressos à
superfície da célula alvo.

Moléculas secretadas- Envolve moléculas sinalizadoras são libertadas na corrente sanguínea ou

no meio extracelular e viajam até à célula alvo interagindo com proteínas recetoras de forma a
altera a sua atividade.

Exemplos são Hormonas, Neurotransmissores e fatores de crescimento.

Podem ser classificadas em 4 categorias diferentes de acordo com:

• Distância entre a célula que envia o sinal e a célula alvo

• Natureza bioquímica das moléculas secretadas
Sinalização Endócrina- Sinalização entre células separadas por distâncias curtas ou longas.

Envolve a síntese (em células especializadas de tecidos glandulares) e secreção de hormonas na

corrente sanguínea para que estas sejam transportadas até às células alvo em vários tecidos.
Este recetor pode ser intra ou extracelular.

Apenas as células alvo possuem os recetores específicos para a hormona. Estes recetores
possuem elevada afinidade e seletividade de forma a serem capazes de detetar e ligar as
hormonas que se encontram altamente diluídas na corrente sanguínea ou no espaço intersticial.

Sinalização Parácrina- Célula que envia sinal secreta as moléculas no ambiente local, desta
forma a célula alvo é uma célula vizinha.

As moléculas secretadas são designadas de mediadores locais.

A concentração destas moléculas (comparativamente à sinalização endócrina) é muito superior,

desta forma os recetores têm baixa afinidade e dissociam-se rapidamente quando a
concentração extracelular do mediador diminui de forma a permitir a terminação do sinal.

Sinalização Sináptica- Tipo extremo de sinalização parácrina onde neurotransmissores são

secretados nas sinapses entre um neurónio e a célula alvo (geralmente outro neurónio ou célula
muscular).

A concentração dos neurotransmissores é elevada pelo que também aqui os recetores também
tenham baixa afinidade e se dissociem para terminar rapidamente a neurotransmissão. Pode
ocorrer recaptação dos neurotransmissores.
Sinalização Autócrina- Outro tipo de sinalização parácrina em que a célula que envia o sinal é a
célula alvo.

Ligando- Consiste em qualquer molécula capaz de se ligar a um recetor e pode ser classificado
de acordo com o seu efeito e natureza.

• Agonista- Ativa a transdução do sinal.

• Antagonista- Inibe transdução de sinal

• Fisiológico
• Farmacológico- Molécula sintética

[Sinalização intracelular- Ativação e Inibição]

Este tipo de sinalização envolve múltiplos sinais:

• Ativação da proteína em resposta a um determinado sinal (sinal 1)

• Inibição da proteína sinalizadora de forma a reverter ao estado basal (sinal 2)
O output desta via de sinalização vai depender da integração de ambos os sinais.

O processamento de múltiplos sinais é complexo e isto tem algumas implicações:

• A ativação completa de proteínas sinalizadoras requer frequentemente a receção

de vários sinais. Desta forma envolve proteínas com diferentes domínios de
sinalização capazes de reconhecer sinais diferentes. O output é dependente do
contexto.
• Permite uma regulação fina da sinalização

Mecanismos de ativação de proteínas sinalizadoras

• Ligação de outras moléculas sinalizadoras

• Alterações conformacionais
• Modificações covalentes (fosforilação de proteínas)
• Associação a lípidos membranas (sinalização e recrutamento para a membrana)
• Eliminação de inibidores

Mecanismos de inibição de proteínas sinalizadoras

• Ligação de inibidores
• Modificações inibitórias
• Eliminação de modificações ativadoras

Diferentes tipos de células podem expressar subtipos ou isoformas de proteínas sinalizadoras.

Este fenómeno é muito importante no que diz respeito à variabilidade de sinalização.

• Estas subtipos/isoformas têm propriedades de sinalização semelhantes, mas não

idênticas pois diferem no reconhecimento do substrato e na regulação.
• São codificados por genes específicos e podem formar-se por splicing alternativo

Um exemplo deste fenómeno é o que ocorre com neurotransmissores (acetilcolina, serotonina

e dopamina) que reconhecem diferentes subtipos de recetor.

Cada subtipo de recetor pode ser diferencialmente expresso em diferentes tecidos/células ou

co-expresso no mesmo tecido/célula e o output pode até ser completamente oposto.
 • Acetilcolina causa o relaxamento do musculo cardíaco (proteína G como recetor).
• Acetilcolina causa a contração do musculo estriado esquelético (canal iónico).

Estas respostas diferentes são, não só, a explicação para os efeitos secundários nocivos de
determinados fármacos, como também para a dificuldade de uso de fármacos sintéticos.

[Recetores de sinalização]
Recetores para moléculas Secretadas

Existem diferentes tipos de recetores para as moléculas sinalizadoras secretadas assim como
proteínas adaptadoras de interação entre proteínas e outras moléculas (diferentes domínios de
interação).

Quando a molécula secretada chega a célula alvo tem de ocorrer a transdução de sinal. A
primeira etapa consiste então na ligação da molécula sinal (hormona, fator de crescimento…)
ao um recetor. Este recetor pode ser:

• 1. Recetor Intracelular (nuclear)- Ocorre para moléculas hidrofóbicas (lipofílicas) de

pequenas dimensões. Estes recetores podem ter diferentes localizações no interior da
célula.

o Localização Citoplasmática- Dá se a ligação da molécula sinal ao recetor no

citosol para que ocorra posterior transporte para o núcleo para promove a
transcrição dos genes alvo.
o Localização Nuclear- O recetor já se encontra no núcleo e é aí que se dá a ligação
do sinal. Apesar de já estar no núcleo, é incapaz de iniciar a transcrição dos
genes alvo até que a ligação com o sinal ocorra.
• 2. Recetor Extracelular (membranares)- Importantes para a transdução de sinais de
moléculas incapazes de entrar na célula, como é o exemplo de moléculas hidrofílicas e
de maiores dimensões.
 1. Recetores Intracelulares (nucleares)
Os ligandos naturais deste tipo de recetores são:

• Hormonas esteroides (cortisol, estradiol, progesterona, aldosterona)

• Derivados de aminoácidos (hormona T3)
• Vitamina D e derivados do ácido retinóico

O complexo hormona-recetor liga-se a elementos

específicos no promotor de genes regulados para
controlar a sua taxa de transcrição (resposta
genómica). A este complexo é dado o nome de
elementos HRE (Hormone-Responsive Element) e
consistem em 2 cópias de um hexâmero de
sequência específica.

Para além desta resposta genómica, estes

recetores também estão envolvidos em respostas
não genómicas envolvendo outras proteínas
sinalizadoras como cinases capazes de induzir
respostas não genómicas ou levar à interação com
outros recetores membranares iniciando cascatas
de sinalização.

Os recetores para estas hormonas também podem

induzir respostas em modo dependente de
ligando.

Estrutura dos domínios dos recetores Nucleares

Possuem uma série de domínios conservados.

Possuem dois domínios relacionados com activation function que possuem locais de ligação a
co-ativadores e co-repressores:

• AF-1 (activation function-1) - Presente no N terminal (região A/B) estão envolvidos na

transativação independente de ligando. Possui locais de fosforilação que representa
um mecanismo importante na regulação da sua atividade (MAP cinases).
 • AF-2 (activation function-2) – Localizado na região C-terminal (Região E e F) e estão
envolvidos na transativação dependente de ligandos.

Possuem também um local de ligação ao DNA (Região C) - Ligam-se aos elementos HRE.

Possuem também um local de ligação ao ligando perto do C-terminal perto do AF-2.

Para além disso o recetor pode interagir com ubiquitinas (marcação para degradação dos
recetores para controlar os níveis da proteína) e a interação com outros ativadores de
transcrição e proteínas sinalizadoras.

[Regulação de sinalização por recetores nucleares]

Existem vários níveis de regulação.

1- Regulação da concentração do ligando

• Biossíntese
• Secreção e transporte
• Modificação e degradação

2- Regulação do recetor por fosforilação

Ocorre em resíduos de Serina, Treonina e Tirosina presentes principalmente na região AF-1.
Esta fosforilação é catalisada por proteínas cinases como MAPK, AKT, JNK.

A fosforilação modula o comportamento do recetor ao nível de:

• Ligação ao DNA e atividade de transativação

• Necessidade de ligando- Pode permitir ação independente do ligando.
• Distribuição nuclear/citoplasmática
• Localização membranar- Importante no modo não genómico onde é necessária
interação com outras proteínas (recrutamento de diferentes proteínas)

3- Regulação do recetor por Co-ativadores e Co-repressores

Co-ativadores- Proteínas que favorecem ativação da sinalização

• Recrutam outras proteínas envolvidas na remodelação da cromatina, que libertam

estruturas repressoras, tornando-as competentes para o início da transcrição.

• Recrutam enzimas modificadoras necessárias para descompactar a cromatina

(metilases (CARM)- Remoção de grupos metilo em citosinas; histona acetilases (p300)
– Acetilam as histonas de forma a descompacta-las.

Quando os Co-ativadores recrutam as proteínas que libertam estruturas repressoras ou as

proteínas capazes de descompactar a cromatina, a maquinaria basal da transcrição do
complexo TRAP/mediador é recrutado para a região de forma a que ocorra a transcrição dos
genes.

Co-repressores- Proteínas que inibem a sinalização

• Recrutam histona deacetilases (HDACs) e metiltransferases- adição de grupos metilo,

promovendo a compactação da cromatina e repressão da transcrição

Imagem relativa à compactação/descompactação das histonas.

4- Interação com outros ativadores da transcrição

Alguns genes possuem na sua região promotora (para além dos elementos HRE) elementos AP-
1 (elementos de ligação ao fator AP-1 (dímero)).

5- Regulação por Ubiquitinação

Interação com proteínas envolvidas na ubiquitinação para que sejam marcadas para degradação
proteossomal.

Também os Co-repressores e os Co-ativadores são regulados por fosforilação e ubiquitinação.

Como já foi dito, dependendo do tipo de ligando, o seu recetor pode estar presente no citosol
ou no núcleo e a sua ativação desencadeia uma resposta genómica.

No caso das hormonas esteroides os recetores no estado basal encontram-se no citosol sob a
forma de um complexo inativo (Aporecetor) associado a proteínas como Hsp90, Hsp56 e p23.

A ligação da hormona ativa o recetor fazendo-o dissociar-se dessas proteínas permitindo a sua
translocação para o núcleo e expõe o local de ligação ao elemento HRE permitindo a ligação ao
DNA com recrutamento de co-ativadores e da maquinaria necessária para a transcrição do
gene alvo.

[Nota] A Heat Shock Protein (Hsp90) quando ligada ao recetor bloqueia o local de ligação ao
DNA.
Os recetores de a ácido retinóico, hormona T3 e vitamina D encontram-se no núcleo, ligados
ao seu HRE.

Quando não estão associados ao ligando estes recetores

tendem a associar-se com co-repressores compactando a
cromatina e inibindo a transcrição.

A ligação do ligando induz uma alteração conformacional

levando a que os co-repressores se dissociem e são expostos
os locais de ligação a co-ativadores.

[Nota] TRE (T3- responsive elemento) é a designação dada ao

HRE da hormona T3.

Relativamente à resposta não genómica o modo de ação é diferente.

No caso do recetor de estrogénio (ER), este pode funcionar sob a forma de ligando
independente. A ativação deste modo de funcionamento ocorre por fosforilação de resíduos
de serina do domínio AF-1 do recetor por proteínas cinases (PKA, PKC, ERK, Src) como resposta
a sinais ativadores de:

• Recetores de tirosina cinase (RTK)

• Recetores acoplados à proteína G (GPCR)
A hormona esteroide 17β-estradiol (E2) pode iniciar sinalização via o GPCR Gp30 (família de
recetores acoplados à proteína G capazes de atuar como mensageiros secundários) ou via o seu
recetor (ER).

A ligação de E2 ao ER estimula transcrição de genes ou ativa de modo não genómico outras

proteínas sinalizadoras (proteína cinases, recetores transmembranares como o recetor tirosina
cinase).

Estes recetores podem ativar por exemplo:

• PI3 Cinase- Cinase de lípidos de inositol que leva à ativação da AKT e promover sinais
de proliferação celular e anti-apoptóticos (desregulada em vários tipos de cancro)

O crosstalk com outras vias de sinalização pode requerer proteínas adaptadoras (Shc ou MNAR)

[Hormonas Esteroides e Cancro]

A desregulação de vias de sinalização envolvendo hormonas é responsável por diferentes tipos
de cancro.

• Androgénios podem aumentar o crescimento de tumores da próstata

• Estrogénios estimulam o crescimento de tumores do endométrio e da mama. Recetores
do estrogénio são sobreexpressos em 70% de cancros da mama (ER+)

[Nota] HRE do estrogénio é denominado ERE.

A hiperativação do recetor de estrogénio e consequente ligação à região promotora ERE induz

uma maior sobrevivência de genes associados a proliferação celular

• Ciclina D1 (CCND1) – Promove a transição G1/S (início do ciclo celular)

• MYC- Proto-oncogene que induz a expressão de vários reguladores positivos do ciclo

celular (Ciclina D, Ciclina A, Ciclina B e respetivas CDKs) e reprime inibidores do ciclo
celular (p21, p53, p27, RAS)
Fármacos anticancerígenos usados no tratamento do cancro da mama

• Tamoxifeno - modulador do recetor do estrogénio de forma a inibir a via de sinalização

o Antagoniza a ação do estrogénio (compete com o estrogénio na ligação ao ER)
o Complexo ER/tamoxifeno liga-se ao DNA e recruta co-repressores

• Inibidores da aromatase- A aromatase é uma enzima que converte androgénios em

estrogénios. Ao inibir a enzima o objetivo é diminuir a concentração de estrogénios
(tratamento não relacionado com vias de sinalização).

2. Recetores extracelulares (de membrana)

São recetores expressos à superfície da célula (proteínas transmembranares) estando
acoplados a vias ou cascatas de transdução de sinal. Quando estes recetores são ativados por
ligação de moléculas que estão no exterior da célula transmite um sinal para o interior da célula
de forma a iniciar algum tipo de processo/resposta celular (por exemplo, o aumento da síntese
de mensageiros secundários).

Como já foi dito, são recetores para moléculas sinalizadoras que são demasiado grandes
(proteínas ou hormonas polipeptídicas) ou hidrofílicas e por isso não são capazes de atravessar
a membrana plasmática da célula alvo.

A imagem à direita representa o esquema geral da

forma como se processa um sinal após este alcançar o
recetor membranar. Após a ligação do ligando ao
recetor, são necessárias proteínas transdutoras (por
exemplo Proteína G) para a transdução do sinal. Existem
também diferentes proteínas associadas à amplificação
do sinal, nomeadamente enzimas:

• Nucleótido ciclase (p.e. Adenil Ciclase)

• Fosfolipases
• Cinases de lípidos
• Cinases ou fosfatases de proteínas

Devido a esta sinalização são produzidos mensageiros

secundários que por sua vez são capazes de ativar outras proteínas em cascatas de sinalização
que envolvem sensores e efetores resultando numa resposta celular.
Podemos dividir os recetores de membrana em diferentes classes:

I. Recetores de membrana acoplados à proteína G- Funcionamento muito

semelhante ao descrito acima.

II. Recetores da família das Tirosina Cinases- Podem ter várias estruturas (p.e.
Diméricos) e de uma forma geral a ligação do ligando ao recetor causa a ativação
dos domínios intracelulares do recetor de 2 formas:
• Autofosforilação de resíduos de tirosina do recetor
• Associação a outra proteína com atividade de tirosina cinase capaz de
fosforilar o recetor.

A resposta celular induzida pode ser uma resposta genómica onde são ativados
fatores de transcrição (translocados para o núcleo) de forma a se ligarem à
região promotora dos genes e induzir a sua expressão.

III. Canais Iónicos- Ativados em resposta a um ligando sinal ou alterações no potencial

de membrana e envolvem a entrada e saída de iões nas células. O cálcio entra nas
células desta forma e têm um papel essencial na regulação de proteínas
sinalizadoras.

II III
I

[Estrutura dos recetores de membrana]

Estes recetores podem existir na forma monomérica, dimérica ou oligomérica e podem associar-
se a outras subunidades nos domínios extracelular ou citosólico através de pontes dissulfureto
ou interações não covalentes.

Um exemplo de um recetor tetramérico com duas subunidades intracelulares e duas

subunidades transmembranares ( e ), como é o caso do (3) é o recetor da insulina. No espaço
extracelular as subunidades  e  ligam-se entre si através de pontes dissulfureto ou interagir
com outras proteínas de forma não covalente.
Domínio Extracelular
• Locais de ligação ao ligando
• Locais de glicosilação importantes para o endereçamento proteico para a membrana
• Locais para associação a outras subunidades/proteínas importante para interação
proteica e formação de complexos.

Domínio Transmembranar
• Constituídos por uma  hélice transmembranar
• Constituídos por 7  hélices ligadas por loops citosólicos (3) e extracelulares (3)
(característico de recetores acoplados à proteína G).

A região presente no interior da membrana é constituída por 20-30 aminoácidos

hidrofóbicos e alguns aminoácidos polares na interface com meio aquoso intra/extracelular.

Várias subunidades de uma proteína transmembranar podem associar-se numa estrutura

oligomérica (típico nos canais iónicos)

Domínio Intracelular
• Regiões de interação com proteínas efetoras e vias de interação proteína-proteína
• Possui atividade enzimática / está associado a enzimas

[Terminação da transdução do sinal]

Falhas nesta terminação podem resultar em situações patológicas.

O fluxo do sinal deve ser controlado e afinado de forma a que seja coordenado com a sinalização
por outras vias.

A terminação da transdução do sinal impede que haja a ativação inapropriada de funções

celulares e permite às células regressar ao estado basal.

Existem vários mecanismos de terminação da transdução do sinal:

2 2 3
 1. Diminuição da disponibilidade do agonista
• Por difusão
• Reacumulação/recaptação (sinapses)
• Metabolização/degradado por enzimas na superfície da célula.

2. Internalização e degradação do complexo recetor-agonista por endocitose

3. Modificação do recetor que passa a estar inativo ou dessensibilizado apesar de

permanecer na membrana. Isto pode ser feito por fosforilação no domínio intracelular

[Complexos de Sinalização]
A formação de complexos de sinalização tem um papel fundamental a nível da Fidelidade e da
velocidade da cascata de sinalização.

A formação destes complexos envolve a interação entre proteínas mediado por proteínas
adaptadoras capazes de recrutar proteínas efetoras e outros componentes.

Os domínios de interação entre proteínas:

• Controlam a atividade de enzimas

• Permitem a formação de complexos de sinalização
• Ligam-se a:
o Lípidos da membrana (I)
o Sequências especificas (por exemplo sequências ricas em prolinas) (II)
o Péptidos modificados (proteínas fosforiladas) (III)

I. Domínios de interação com Lípidos

PH (Pleckstrin Homology). Permite a interação entre domínios contendo a proteína PH e lípidos.

• Ligam-se a fosfatidilinositóis (PI (4,5) P2; PI (3,4,5) P3)

• Regulam a associação de proteínas à membrana plasmática pois a formação dos lípidos
referidos leva ao recrutamento de proteínas contendo o domínio PH para a membrana

C1
• Ligam-se ao diacilglicerol (lípido sinalizador importante)
• Presentes em PKCs clássicas e novas

C2
• Ligam-se a fosfolípidos (fosfatidilserina; ácido fosfatídico) de maneira dependente de
Ca2+
 • Apenas presentes em PKCs clássicas

II. Motivos (padrão de sequência de aminoácidos)

SH3 (Src-Homology type 3)
• Ligam-se a sequências com cerca de 10 aminoácidos ricas em prolina
• Presentes em muitas proteínas envolvidas em vias de sinalização mediadas por Tyr
cinases
• Ocorrem frequentemente em proteínas associadas ao citoesqueleto ou à membrana
plasmática

III. Péptidos modificados

SH2 (Src-Homology type 2)
• Reconhecem fosfo-tirosinas (P-Tyr) (geralmente nas sequências no N-terminal)
• Ligam P-Tyr em recetores Tyr cinase (RTK) ou recetores associados a Tyr cinases (p.e
recetores de citoquinas, e recetores de células T (TCR))

PTB (phospho-tyrosine binding)

• Reconhecem P-Tyr (geralmente em sequências no C-terminal)
• Encontram-se principalmente em proteínas que atuam em membranas e têm uma
função de acoplamento ou de adaptador
• Também podem ligar a lípidos como fosfatidilinositóis

Proteínas 14-3-3
• Reconhecem P-Ser e P-Thr (serinas e treoninas fosforiladas)
• Envolvidas no controlo de funções celulares críticas como ciclo celular, apoptose,
transcrição de genes, replicação do DNA e remodelação da cromatina e regulação da
atividade enzimática.

A imagem seguinte descreve uma situação genérica que serve de exemplo, onde estes
diferentes componentes interatuam para garantir a transdução do sinal.

Neste caso, o recetor tirosina cinase recebe o ligando. Este recetor possui no seu domínio
intracelular tirosinas que é capaz de fosforilar (Autofosforilação).

A tirosina fosforilada recruta proteínas Sinalizadoras que possuem domínios SH2 (que
reconhecem esta fosforilação). Esta interação como recetor pode ser neste caso estabilizada
porque esta proteína sinalizadora 1 também possui um domínio PH capaz de interagir com
fosfatidilinositóis da membrana.
Através do domínio PTB esta proteína liga-se a uma segunda proteína sinalizadora 2 quando
esta é fosforilada nas tirosinas. Esta fosforilação pode ocorrer pelo domínio cinase da própria
proteína sinalizadora 1.

Por sua vez as tirosinas fosforiladas desta proteína sinalizadora 2 podem ser reconhecidas por
uma proteína adaptadora contendo o domínio SH2. O domínio SH3 desta proteína adaptadora
reconhece uma terceira proteína sinalizadora que possui uma sequência rica em prolinas. O
recrutamento da proteína sinalizadora 3 faz com que esta seja fosforilada (pode ocorrer por
ação da proteína sinalizadora 2) e desta forma o sinal continua a ser propagado.

2- Recetores acoplados à proteína G (GPCR)

2.1 Estrutura e regulação dos recetores acoplados a proteínas G
[Estrutura dos GPCR]
Os recetores acoplados à proteína G são recetores transmembranares, sendo constituídos por
7 domínios transmembranares, ligados por 3 loops extracelulares (e1, e2 e e3) e 3 loops
intracelulares (i1, i2 e i3).

O seu domínio N terminal (NH2) encontra-se virado para fora da célula (terminal amino
extracelular), enquanto que o C terminal (COOH) se encontra virado para dentro da mesma
(terminal carboxilo intracelular).

Quer o terminal carboxilo, quer o loop intracelular i3, são muito importantes no
reconhecimento e na ativação de uma proteína G:
 • Domínio C terminal: contém locais envolvidos no reconhecimento/ativação de
proteínas G e resíduos de Serina e Treonina, que podem ser fosforilados por proteínas
cinase para terminação da sinalização, dessensibilizando o recetor;
• Loop intracelular i3: contém sequências críticas para a interação seletiva com
proteínas G.

[Ativação dos GPCR]

Estes recetores podem ser ativados por diferentes tipos de ligandos. Dependendo das
propriedades do ligando em causa, este irá ligar-se a regiões específicas do recetor:

• Ligandos grandes, como proteínas, (ex. hormonas polipeptídicas) ligam-se a loops

extracelulares;
• Ligandos pequenos, como aminoácidos, nucleótidos e péptidos, (ex. acetilcolina e
epinefrina) ligam-se a um bolso formado pelos 7 segmentos transmembranares.

Dentro da família de recetores acoplados a estas proteínas G, existem diferentes recetores para
diferentes ligandos, mas todos eles têm como mecanismo de ação a cascata de sinalização
representada:

1. Recetor é ativado;
2. Recetor ativado liga-se a uma proteína G heterotrimérica (subunidades α, β e γ);
3. Subunidade Gα é ativada (troca de GDP por GTP);
4. Efetor é ativado (pode ser uma enzima ou um canal iónico, que formam mensageiros
secundários que irão regular outras proteínas sinalizadoras e assim a resposta celular);
5. Proteína G dissocia-se das subunidades β e γ e do recetor, o qual volta a um estado
inativo ou ativa outras proteínas G.
Nota: Existem vários tipos de proteínas G, que podem ser monoméricas ou triméricas. As
proteínas G envolvidas neste tipo de cascata de sinalização são triméricas, sendo formadas pelas
subunidades α, β e γ, todas elas ativadas por GTP. Quando o recetor acoplado à proteína G é
ativado, o GDP (inativo) ligado à proteína G tem de ser libertado e trocado por GTP (ativo), para
que a proteína G seja ativada e capaz de ativar a proteína efetora.

Diferentes mecanismos de terminação da sinalização por dessensibilização do GPCR

1. [Dessensibilização de GPCR por PKA/PKC]
A fosforilação do recetor é um mecanismo importante de dessensibilização do mesmo, que pode
ocorrer num loop de feedback negativo. Por exemplo, a fosforilação de recetores GPCR
catalisada por PKA ou PKC suprime a ativação de proteínas G, através do seguinte mecanismo:

1. Recetor GPCR é ativado;

2. Proteína Gα é ativada por ligação de GTP;
3. Adenil ciclase é ativada, produzindo AMP cíclico (cAMP) com consumo de ATP;
4. cAMP ativa a proteína cinase A (pkA), que por consumo de ATP fosforila resíduos de
serina e treonina de outras proteínas, regulando a sua atividade e induzindo respostas
celulares;
5. pkA fosforila ainda o próprio recetor no seu domínio C terminal, importante para a sua
dessensibilização, terminando a sinalização.

2. [Dessensibilização de GPCR por GRK (GPCR kinases)]

Outro tipo de mecanismo envolvido na terminação da sinalização é a endocitose do próprio
recetor GPCR:
 1. Recetor é fosforilado no seu domínio C
terminal pela cinase GRK;

NOTA: O recrutamento das GRK para a

membrana e sua associação é estimulada
ou por ligação ao dímero de subunidades
βγ, que se forma quando a proteína G é
ativada, permitindo a interação de GRK
com a membrana na proximidade do
recetor; ou por ligação a fosfatidilinositóis
trifosfato, através de domínios PH.

2. A fosforilação de GPCR por GRK não só

o dessensibiliza, suprimindo a sua interação
com proteínas G, como gera um local de
ligação com alta afinidade para arrestinas;

3. Arrestinas promovem a internalização

do recetor por endocitose, formando uma
vesícula;

4. Recetor pode ser mantido nessa vesícula e reciclado, por novo endereçamento para a
membrana celular, ou então degradado por fusão da vesícula em que se encontra com
um lisossoma.

2.2. Proteína G heterotrimérica

Proteína G trimérica
As proteínas G triméricas são constituídas pelas subunidades α, β e γ. Estas proteínas associam-
se à membrana plasmática através de lípidos que funcionam como âncoras.

• Isoforma α associa-se à membrana através de

miristoil ou palmitoil (é miristoilada ou plamitoilada);
• Isoforma γ associa-se à membrana através de
um grupo prenil (é prenilada);
• Isoforma β associa-se à membrana por ligação
à isoforma γ.
[Classificação de proteínas G heterotriméricas e principais efetores]
As proteínas G são classificadas de acordo com o tipo de subunidades Gα que possuem.
Dependendo das vias de sinalização em que se encontram envolvidas, estas podem ser:

• Subunidades Gαi: envolvida na regulação de

canais iónicos e na via inibitória do cAMP, tendo
efeito oposto ao da Gαs;

• Subunidades Gαs: envolvida na via de

sinalização clássica melhor conhecida, em que
participa o mensageiro secundário cAMP;

• Subunidades Gαq: envolvida na ativação da

fosfolipase C;

• Subunidades Gα12: envolvida na ativação de

GEFs para proteínas Rho.

Nota: pode haver crosstalk entre a via da Gαs e a

via da Gα12.

A figura seguinte mostra o crosstalk envolvendo diferentes tipos de recetores acoplados a

diferentes tipos de subunidades Gα, em resposta à integração de diferentes estímulos celulares.

Na esquerda da figura, temos o envolvimento da subunidade Gαs na ativação da Adenil ciclase

promovendo a formação de AMP cíclico. Já na esquerda da figura, temos a subunidade Gαi a
inibir a Adenil Ciclase, diminuindo assim os níveis celulares de AMP cíclico.
[Sinalização por proteína G]
As proteínas G encontram-se
ligadas a GDP no seu estado basal.
Para serem ativadas, tem de
existir uma proteína GEF (Guanine
Nucleotide Exchange Factors)
responsável pela permuta de GDP
por GTP. Uma vez ligada ao GTP, a
proteína G ativa pode sinalizar
através de cAMP, de lípidos de
inositol trifosfato e diacilglicerol,
etc. dependendo do tipo de
proteína G envolvida.

A sinalização da terminação deste tipo de proteínas é realizada por proteínas GAP (GTPase-
Activating Factors), que promovem a hidrólise do GTP. Na verdade, as próprias proteínas G
possuem ação intrínseca de GTPase. Assim, as GAP atuam na ativação da porção GTPase das
proteínas G, e por ligação ao GDP esta regressa ao seu estado basal.

A sinalização por proteína G é necessária para regular esta via. Quando tal não ocorre, surgem
consequências neste contexto, por exemplo, a intoxicação pela toxina da cólera.

A toxina da cólera promove a modificação da subunidade Gαs com ADP-Ribose. Esta

modificação bloqueia a hidrólise do GTP, impedindo que a proteína G regresse ao seu estado
basal. Assim, esta subunidade fica constitutivamente ativa, ativando persistentemente a Adenil
ciclase. Quando isto acontece, por exemplo a nível do epitélio intestinal, temos o aumento do
transporte ativo de iões, o que provoca diarreias devido ao efluxo excessivo de água e ião sódio.
2.3. Efetores e mensageiros secundários
[Mensageiros Secundários]
Após ativados diferentes tipos de proteínas G, dá-se a formação celular de diferentes
mensageiros secundários, que podem ser:

• Iões Cálcio;
• AMP cíclico;
• GMP cíclico;
• Diacilglicerol;
• Inositol Trifosfato.

Iremos focar-nos no AMP cíclico, e na enzima que o produz, Adenil ciclase.

2.3.1. Via da Adenil Ciclase-cAMP-pkA

Adenil ciclase
[Estrutura da Adenil ciclase]
A família de proteínas Adenil ciclase é constituída pelo menos por 9 tipos de Adenil ciclases em
mamíferos. Estes diferentes tipos contêm aspetos conservados na sua estrutura,
nomeadamente:

• São proteínas transmembranares constituídas por 2 domínios homólogos, cada um

contendo:
1. um domínio transmembranar com 6 α-hélices (M1 ou M2);
2. um domínio citoplasmático (C1 ou C2).
• Globalmente, o seu local ativo é formado pelos resíduos de C1 e de C2.

[Síntese e degradação de cAMP]

A enzima Adenil ciclase tem como função converter ATP em cAMP.
Para esta via de conversão ser regulada, a fosfodiasterase tem de destruir o AMP cíclico,
convertendo-o em AMP, permitindo assim a regulação dos níveis intracelulares de cAMP. Para

tal, a fosfodiasterase é ativada pela própria cascata de sinalização abaixo do cAMP, para que
depois de ser induzida a resposta celular as células regressem ao seu estado basal, terminando
assim a sinalização.

Proteína cinase A (pkA) cAMP-dependente

O cAMP ativa a proteína cinase A (pkA) cAMP-dependente. A pkA é uma proteína tetramérica
constituída por 2 subunidades catalíticas (C) e 2 subunidades reguladoras (R). Para cada um
destes tipos de subunidades existem várias isoformas, nomeadamente:

• 3 genes para subunidades catalíticas: Cα, Cβ e Cγ;

• 4 genes para subunidades reguladoras, que podem pertencer a duas classes:
1. Subtipo RI (RIα, RIβ) – citoplasmáticas;
2. Subtipo RII (RIIα, RIIβ) – associadas a frações subcelulares específicas.

NOTA: para ser ativada, a pkA tem de sofrer fosforilação na sua subunidade catalítica.

1. [Relativamente às subunidades catalíticas]

A pkA pode ser:

• miristoilada no N-terminal (modificação pós-traducional);

• fosforilada numa serina da região C-terminal (através de autofosforilação)
• fosforilada numa treonina presente no loop de ativação (fosforilação mediada por outra
PKA ou pela PDK1 (3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1));
• só quando se encontra duplamente fosforilada é que esta proteína tem a sua máxima
ativação.
2. [Relativamente às subunidades reguladoras]
As subunidades reguladoras da pkA também possuem domínios conservados:

• Domínio Dimerização/Docking (D/D) na região N terminal, sempre presentes em

dímeros;

• Domínios CNB (Cyclic Nucleotide Binding) em tandem na região C terminal, que podem
ser CNB A ou CNB B. É nestes domínios que ocorre a ligação de cAMP;

• Linker flexível (intrinsicaly disordered region) a ligar domínio D/D aos domínios CNB.
Esta região intrinsecamente desordenada, e por isso mais flexível, contém o local
inibidor semelhante a um péptido substrato. É através deste local inibidor que estas

subunidades se ligam ao centro ativo da subunidade catalítica na holoenzima

tetramérica.

As subunidades reguladoras, RI e RII, são ligeiramente diferentes:

1. Subunidades RI possuem alanina ou glicina no local inibidor – são pseudosubstratos;

2. Subunidades RII possuem serina no local inibidor – são substratos. Estas subunidades
estão particularmente envolvidas na ligação a proteínas ancora, responsáveis pelo
recrutamento da pkA para uma região específica da célula

3. [Ativação da pkA pelo cAMP]

A proteína pkA encontra-se inativa na sua forma tetramérica, ligada a proteínas ancora. Quando
o cAMP se liga às suas subunidades reguladoras, estas dissociam-se das subunidades
catalíticas, e a pkA passa a encontrar-se livre no citoplasma. Cada subunidade reguladora tem
dois domínios de ligação ao cAMP, sendo necessárias 4 moléculas de cAMP para provocar esta
dissociação, resultando num dímero de subunidades reguladoras e em duas subunidades
catalíticas livres.

Após a dissociação, esta proteína tem de ser ativada pela dupla fosforilação mencionada
anteriormente. Quando completamente ativa, esta irá fosforilar outras proteínas alvo em
resíduos de serina e treonina das subunidades catalíticas livres, regulando a sua atividade ao
nível de:

• Metabolismo;
• Transporte de iões;
• Diferenciação;
• Expressão genética (através da ativação do fator de transcrição CREB).

4. [Ativação da pkA permite ativação do fator de transcrição CREB]

Nesta figura pode observar-se a ativação

do recetor GPCR e consequente ativação
da proteína Gαs, por ligação de GTP.
Esta proteína por sua vez ativa a Adenil
ciclase, responsável por produzir cAMP,
que se liga às subunidades reguladoras
da pkA. Isto provoca na pkA a
dissociação das suas subunidades
catalíticas, passando esta enzima a
poder fosforilar proteínas na membrana
ou no citosol, fatores de transcrição, etc.
Um exemplo disto é a ativação do fator
de transcrição CREB, como resultado de
fosforilação por parte da pkA. Quando
fosforilado, CREB liga-se à proteína CBP
(CREB-binding protein), um coativador
com atividade de histona acetilase,
permitindo como o nome indica a
acetilação de histonas e a remodelação
da cromatina. Assim, é promovido o
descompactamento das histonas, e o
fator de transcrição passa a conseguir
interagir com a região promotora,
recrutando a maquinaria necessária ao
processo de transcrição, que culmina na
indução de respostas celulares.
5. [Regulação das pkA]

• Via cAMP
O mecanismo de terminação de sinalização das pkA
é feito por feedback negativo e regulado pela
própria pkA. Após a indução de resposta celular, a
pkA fosforila a fosfodiasterase (PDE), que passa a
encontrar-se ativa e converter cAMP em AMP.
Assim, por diminuição da concentração de cAMP,
vai terminar a ativação de novas moléculas de pkA,
através de um loop de feedback negativo,
impedindo a hiperativação da via.

• Via AKAP
As proteínas AKAP (A Kinase Anchoring Proteins) funcionam como âncoras, regulando a
localização subcelular das pKa, permitindo uma sinalização localizada.

Esta figura demonstra a estrutura das AKAP e os seus domínios principais:

1. Domínio targeting, através do qual se ligam a uma estrutura específica da célula;

2. Domínio hélice anfipática, através do qual se ligam às subunidades reguladoras das pkA;
3. Domínio PPI, através do qual se liga a outros tipos de proteínas.

Na região C terminal, as AKAP têm domínio targeting, que permite a sua interação com uma
determinada região da célula, seja com o citoesqueleto ou com organelos como o Golgi, a
mitocôndria, o núcleo, o RE, etc. Deste modo, as AKAP encontram-se ancoradas num dado local
da célula, para onde recrutam isoenzimas das pkA, que se ligam à sua hélice anfipática através
das suas subunidades reguladoras, ficando especificamente associadas a estruturas
subcelulares via AKAP. Nesta interação, a AKAP tem uma afinidade muito superior para
subunidades do tipo RII. Para além disso, a subunidade catalítica das pkA fosforila determinadas
proteínas nessa região subcelular, afinando alguns processos celulares de forma localizada.
Para além de se ligarem às pkA, as AKAP também possuem domínios de ligação a outras
proteínas, como cinases, fosfatases, recetores, canais iónicos, GTPases, PDEs. Assim, a AKAP
também pode recrutar a PDE para a proximidade da pkA, para que destrua o cAMP e termine a
sinalização de forma localizada.

Proteínas AKAP e cancro

3 AKAP podem encontrar-se desreguladas em situação de cancro: AKAP1, AKAP13 e AKAP12.

1. [AKAP1 e cancro]
A AKAP1 é regulada por c-Myc, a nível transcricional. c-Myc é uma proteína que se encontra
frequentemente sobreexpressa em cancro, levando a níveis aumentados de AKAP1 nestas
situações, que por sua vez se correlacionam com a malignidade e a baixa sobrevivência de
doentes com cancro.

• Qual o modo de atuação da AKAP1?

AKAP1 liga-se pelo domínio targeting a uma mitocôndria, para onde recruta pkA. Deste modo,
pkA pode realizar a sua via de sinalização na mitocôndria, tornando o ambiente mais favorável
ao desenvolvimento de um cancro, pela promoção da fosforilação de:

a. Proteínas da cadeia respiratória (IV e NDUF4), levando a um aumento da produção de

ATP, essencial ao crescimento e proliferação celular;

b. Proteínas BAD, uma família de proteínas pro-apoptóticas que quando fosforilada é

inibida, impedindo a sua interação com Bcl-2, e assim inibindo o processo de apoptose,
levando à sobrevivência de células tumorais;

c. Proteínas Sestrin2, inibidoras do complexo de proteínas mTORC1. Quando fosforiladas,

tornam-se incapazes de inibir mTORC1, levando assim à ativação de vias anabólicas e à
proliferação de células tumorais.
2. [AKAP13 e cancro]

Em situações de cancro também a AKAP13/AKAP-

Lcb se encontra hiperativada. Esta AKAP, ativada
pela Gα12, também funciona como uma proteína
âncora para a pkA e outras proteínas. A AKAP13
funciona como GEF para as GTPases RhoA e RhoC,
ligando-se a estas através do seu domínio DH e
promovendo a troca de GDP por GTP, ativando a
proteína Rho. Uma vez ativa, a Rho vai ativar
processos como proliferação e migração celular,
remodelação do citoesqueleto, alteração da
transcrição de genes, que de uma maneira geral
levam ao aumento da proliferação e da
sobrevivência celular, características de cancro.

• Proteínas Rho

Proteínas G monoméricas, com ação GTPases, envolvidas na regulação do citoesqueleto,

transcrição, ciclo celular, migração e invasão, possuindo um papel central em muitos tipos de
cancro.

A AKAP13 encontra-se sobreexpressa em muitos tipos de cancros, nomeadamente mama,

colorretal, leucemia mieloide, tiroide, carcinoma hepatocelular, esófago. Além de se encontrar
envolvida na regulação das proteínas Rho, esta AKAP13 interage ainda com outras proteínas,
como a KSR-1 e outras proteínas da cascata de MAP-cinases, como o complexo de proteínas
Raf, MEK1 e ERK, ativando assim a via da ERK que quando hiperativada favorece a proliferação
e a sobrevivência celular.

Esta interação entre AKAP13 e KSR é favorecida pela fosforilação de uma serina, mediada pela
pkA, que ativa o modulo da KSR e a via da ERK. No entanto, a pkA também fosforila a AKAP13
num outro resíduo de serina, permitindo inibição desta via de sinalização, por reconhecimento
da AKAP13 fosforilada por proteínas da família 14-3-3, proteínas que reconhecem resíduos de
serina e treoninas fosforiladas, envolvidas na regulação de muitos processos celulares. Quando
fosforilada, a atividade de GEF da AKAP13 é inibida, pois a sua ligação à proteína 14-3-3
impede a interação do domínio DH com as Rho-GTPases.

Na situação de Leucemia Mieloide Cronica:

Translocação cromossomal leva à ativação maligna constitutiva da AKAP13, em consequência

de as células passarem a expressar uma forma truncada da proteína (onco-Lcb), que não é capaz
de interagir com subunidades reguladoras RII da pkA, devido à perda do local de ligação a estas
subunidades (domínios PH e DH são mantidos).
Ao passar a encontrar-se constitutivamente ativa, a atividade da AKAP13 como Rho-GEF
aumenta, visto não existir regulação negativa pela pkA, havendo uma hiperativação de
proteínas Rho-GTPases e como consequência a transformação oncogénica e o
desenvolvimento de cancro.

É também desenvolvido o processo de migração, uma

vez que na extremidade das células tumorais a
AKAP13 regula a polimerização da actina, ativando a
RhoA e favorecendo a migração e malignidade das
células.

A sobreexpressão da AKAP13 parece ainda estar

associada a resistência a fármacos, o que ainda
complica mais a terapia oncológica.

3. [AKAP12 e cancro]
AKAP12 é uma proteína AKAP que funciona como um supressor tumoral, através da interação
com ciclina D1, PKC e Src. Por este motivo, níveis diminuídos desta proteína favorecem
processos de migração, proliferação e angiogénese, sendo por isso observados em muitas linhas
tumorais e cancros humanos.

A AKAP12 funciona como âncora, inibindo proteínas sinalizadoras. Pode interagir com:

• Ciclina D1, impedindo que esta promova o ciclo celular;

• PKC, limitando a ativação da via de sinalização da ERK e a sobrevivência celular;
• Src, inibindo-a, diminuindo assim os níveis de VEGF celulares, e impedindo a via da
angiogénese celular.
2.3.2. Via fosfolipase C-IP3/Ca2+ e DAG-PKC

Inicialmente, uma molécula sinalizadora de fosfatidilinositol é fosforilada pela enzima

fosfatidilinositol-4 cinase (PI-4K), em C4 do anel de inositol, gerando fosfatidilinositol 4-fosfato.
Este sofre uma fosforilação em C5, pela enzima PIP-5 cinase, dando origem ao PIP2.

As fosfolipases C, são proteínas que convertem fosfatidilinositol 4,5-

bifosfato (PIP2), obtido através de fosforilação de fosfatidilinositol, nos
mensageiros secundários diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5-trifosfato (IP3),
que promovem a ativação de pkC e o aumento dos níveis de cálcio na célula,
respetivamente. O DAG representa a parte hidrofóbica da molécula original
de PIP2, ficando na membrana. Já o IP3, uma molécula mais polar, é
fosforilado e difunde-se, promovendo libertação de CA2+ pelo RE.

[Fosfolipases C (PLC)]
As fosfolipases C são uma família de proteínas, que contém pelo menos 13 isoformas em
mamíferos. Estas proteínas apresentam vários domínios estruturais conservados, sendo que
todas possuem:

• Domínio PH (exceto em PLCζ): permitem a associação da enzima com o seu substrato

localizado na membrana, sendo importante na interação de proteínas com lípidos de
fosfatidilinositol (Fosfatidilinositol (4,5) Difosfato);
• Domínio EF: funcionam como módulos de ligação a cálcio, permitindo a regulação de
fosfolipases C por este ião;
• Domínio C2: o domínio de interação com fosfolípidos;
• Domínios catalíticos formados pelas regiões X e Y.

Diferentes isoformas destas proteínas apresentam diferentes arquiteturas destes domínios.

[Diferentes isoformas de PLC e sua regulação]

Fosfolipase β (PLC β)
A isoforma β desta proteína é ativada
especificamente pela ação de uma proteína Gαq,
mas também pelo dímero βγ, formado aquando da
dissociação da Gα após ligação a GTP, estimulada
pela ativação do recetor GPCR.

Fosfolipase ε (PLC ε)
A isoforma ε desta proteína é regulada também
pelo recetor GPCR, ao gerar proteínas Gα, que
ativam uma proteína Rho, responsável pela ativação
especifica desta isoforma, e os dímeros βγ, que
ativam proteína Rap, capaz de ativar a fosfolipase ε.

Adicionalmente, esta isoforma pode ser ainda

ativada pela ação de recetores de tirosina cinase
(RTK), ao ativar proteína Ras, responsável pela
ativação específica desta isoforma.

Fosfolipase C δ (PLC δ)
A isoforma δ é também ativada pela ação da proteína Gα, após a ligação a GTP, estimulada
pela ativação do recetor GPCR.

Fosfolipase γ (PLC γ)
A isoforma γ é ativada por fosforilação catalisada pelos próprios recetores transmembranares
com atividade intrínseca de tirosina cinase (RTK), ou associados a uma tirosina cinase. Esta
fosfolipase γ interage com uma fosfotirosina do RTK fosforilado através de domínios SH2 (mas
possui também domínios SH3), ativando-se.

• NOTA: mais uma vez, observamos o crosstalk entre diferentes vias de sinalização, que
envolvem dois tipos de recetores diferentes.

Uma vez ativadas estas proteínas, independentemente da sua isoforma, terão como função
clivar o PIP2, gerando o IP3, que promove a sinalização por Ca2+, e o DAG, responsável por ativar
alguns tipos de pkC. Globalmente, estas vias promovem diferenciação, crescimento e
migração.
 [Via fosfolipase C β-IP3/Ca2+ e
DAG-PKC]

Nesta figura verifica-se a ativação de um

recetor acoplado a proteína trimérica G,
com consequente ativação da proteína
Gαq (troca de GDP por GTP). Esta leva à
ativação da fosfolipase C β, que por sua
vez cliva PIP2 em IP3 e diacilglicerol. O IP3
promove a libertação de cálcio através da
sua ligação a canais de cálcio localizados
na membrana do RE. Quando ligado, os
canais de cálcio abrem e Ca2+ é libertado
de dentro do RE para o citosol.

Quando no citosol, CA2+ pode ativar

diferentes tipos de proteínas, como
proteínas cinases C, proteínas
dependentes de cálcio como calmodulina
ou mesmo as próprias fosfolipases C.

[Proteínas cinases C (PKC)]

Existem mais do que 10 isoformas de proteínas cinase C em mamíferos. Todas estas são Ser/Thr
proteínas cinase, com propriedades reguladoras distintas, envolvidas na regulação de muitos
processos celulares como migração, proliferação, apoptose.

A ativação de pkC pode ocorrer por ação de diacilglicerol e cálcio, apenas de diacilglicerol ou
de nenhum destes. Estas proteínas possuem uma alta afinidade para ésteres de forbol,
compostos relacionados com proliferação capazes de induzir a tumorigénese.

Estas proteínas estão frequentemente desreguladas em situação de cancro, sendo ainda

controverso se esta desregulação é uma causa ou uma consequência do cancro.
 Globalmente, a família das proteínas cinase C pode ser classificada em 3 subfamílias, em
função da sua regulação. Esta diferença na regulação das diferentes isoformas deve-se a
diferenças estruturais dos seus domínios N-terminal, responsáveis por determinar a sua
sensibilidade ao DAG e Ca2+:

• Clássicas (cPKC α, βI, βII e γ): ativadas por Ca2+, DAG e ésteres de forbol
• Novas (nPKC δ, ε, θ e η): ativadas por DAG e ésteres de forbol
• Atípicas (aPKC ζ, λ e ι): independentes de Ca2+ e DAG

NOTA: quando temos ativação por DAG, também teremos por ésteres de forbol, pois estes
imitam a função do diacilglicerol, ligando-se no mesmo domínio proteico.

As diferenças na regulação das diferentes subfamílias têm a ver com diferenças na estrutura
das proteínas, em particular no seu domínio regulador N-terminal, sendo a sua parte catalítica
mais conservada:

Todas estas subfamílias contêm uma sequência PS (pseudosubstrato), domínio que promove
autoinibição das PKC. Na ausência de cofatores e ativadores, a sequência PS presente na
região C1 liga-se ao local de ligação do substrato no domínio cinase, bloqueando-o e
estabilizando as proteínas numa conformação fechada, deixando de ser capazes de fosforilar
outras proteínas e exercer a sua função.

Para além do domínio PS existem outros domínios importantes.

1. [Estrutura do domínio regulador das PKC]

As proteínas das subfamílias clássicas (cPKC) e novas (nPKC) possuem 2 domínios C1 (CR ou
C1a/C1b), regiões ricas em cisteínas no domínio regulador N-terminal. Estas regiões são as que
possuem o domínio de ligação ao DAG e aos ésteres de forbol.
 Para além disso, as PKC clássicas possuem um domínio C2, de ligação a fosfolípidos de modo
dependente de cálcio, motivo pelo qual podem ser reguladas por este substrato, enquanto que
as isoformas da subfamília de PKC novas possuem um domínio C2 ligeiramente diferente,
fazendo com que estas isoformas sejam incapazes de serem reguladas por cálcio e de se
ligarem a fosfolípidos (PKCδ possui variante de C2, sendo capaz de se ligar a resíduos de
fosfotirosina).

Já as proteínas da subfamília atípica (aPKC) possuem apenas um domínio C1 atípico, região

rica em cisteína no domínio regulador N-terminal, sendo incapazes de se ligarem a DAG e a
ésteres de forbol, motivo pelo qual não são reguladas por estas moléculas. Para além disso, estas
também não possuem domínio C2, não sendo também capazes de ser reguladas de modo
dependente de cálcio.

2. [Regulação das PKC]

2.1. Inibição das PKC
Como vimos, a inibição das PKC pode ocorrer por ligação do domínio PS das próprias ao
domínio cinase catalítico, estabilizando a proteína numa conformação fechada e inativa.

2.2. Ativação das PKC

No que toca à ativação das PKC, primeiro tem de ocorrer a ligação de cofatores (como por
exemplo, a ligação de DAG ao domínio C1), para permitir a libertação de autoinibição
conseguida pelo domínio PS. Esta ligação vai estabilizar as PKC numa estrutura em que o centro
ativo fica acessível a substratos, e promover a associação das PKC à membrana, podendo estas
ser ativadas pelo DAG presente na mesma.

Para além de ser ativada pela ligação de cofatores, as PKC também são ativadas por
fosforilação e por interação com outras proteínas (por exemplo, proteínas RACK que funcionam
como âncoras, recrutando as PKC para uma determinada região e permitindo que estas atuem
de forma localizada).

• 2.2.1. Regulação das PKC por fosforilação do domínio cinase

Para serem ativadas por fosforilação, as PKC requerem dupla fosforilação, precisando de
ser fosforiladas em duas regiões distintas do domínio C-terminal:

1º Fosforilação ativadora inicial: fosforilação do loop de ativação do seu domínio catalítico,

catalisada por uma proteína PDK1, da família das Ser/Thr cinases.
 2º Autofosforilação: após fosforilação pela PDK1, as PKC necessitam de se autofosforilar
em dois aminoácidos, num segmento hidrofóbico perto do domínio C-terminal, induzindo
a sua dissociação da membrana, passando a encontrar-se ativa e poder difundir pela célula
e atuar noutra região celular.

[Ésteres de forbol (TPA)]

Os ésteres de forbol são moléculas muito hidrofóbicas, que à
semelhança do DAG se ligam ao domínio C1 das PKC, ativando-
as e recrutando-as para a membrana, à qual promovem a sua
ligação. Ao ativarem as PKC, estes induzem a formação de
tumores, ao desregularem o processo de proliferação celular.

[RACK (Receptor for Activated C-Kinase)]

As RACK permitem uma sinalização subcelular específica, funcionando como âncoras para PKC,
com recrutamento destas para uma determinada região da célula (estas não interagem apenas
com PKC, podendo servir de âncoras a proteínas como Src, cAMP-fosfodiesterase, integrinas,
etc., estando assim envolvidas na formação de complexos de proteínas envolvidos na regulação
de processos celulares).

A interação das PKC com as RACK ocorre pelo domínio C2 das PKC, como visto na seguinte
figura:

As RACK organizam complexos de sinalização (à semelhança das AKAP), permitindo a

sinalização subcelular localizada. Para além disso regulam a especificidade da resposta celular,
com subdomínios de RACK a recrutar diferentes isoformas de PKC para microdomínios
distintos, na proximidade dos seus ativadores e substratos.
NOTA: As PKC são também reguladas por AKAP, por exemplo AKAP12 (supressor tumoral
mantendo a via das PKC inativa) e AKAP79 (mantém as enzimas PKC num estado inativo,
permitindo apenas a dissociação e ativação destas por sinais de Ca2+/DAG).

De uma maneira geral, as diferentes vias de sinalização que culminam na ativação das PKC
encontram-se representadas na seguinte figura.

A ativação das PKC está ligada à:

• Via PLC β: ativada através da sinalização por recetores acoplados a proteína G (GPCR)
ou via PLC γ: ativada através da sinalização por recetores de tirosinas cinase (TKR), que
quando ativados geram sinais de cálcio e DAG, responsáveis pela ativação das PKC;

• Via PLC ε: ativada através da sinalização por Ras;

• Outras vias de produção de sinais de Ca2+, que resultem na alteração dos níveis
celulares de cálcio, no caso das cPKC.

Uma vez ativadas, as proteínas PKC regulam diversos processos celulares, nomeadamente:
proliferação, transporte subcelular, migração celular, reorganização do citoesqueleto,
sinalização por recetores imunológicos, apoptose, etc. Estes efeitos envolvem a fosforilação de
substratos das PKC, que incluem:

• Proteínas associadas ao citoesqueleto, importante para regulação do transporte

subcelular ou da migração celular, por exemplo;
• Recetores acoplados a proteínas G (GTPase);
• Recetores nucleares VDR (Recetor de Vitamina D3);
• Proteína Raf, envolvida na cascata das MAP cinases, muito importante a nível de
proliferação e sobrevivência celular.
[PKC e cancro]

A desregulação de diferentes isoformas da PKC tem sido fortemente implicada no

desenvolvimento de cancro, pela estimulação de processos como proliferação, invasão,
angiogénese ou resistência a terapias.

No entanto, nem todas as isoformas possuem funções oncogénicas. Por exemplo, na subfamília
das PKC atípicas (aPKC) podemos ver duas isoformas distintas desta proteína:

• PKC ζ: função de supressor tumoral, inibindo muitas proteínas, entre as quais o c-Myc
envolvido no ciclo celular, e, por conseguinte, inibindo a tumorigénese;
• PKC ι: função oncogénica, através de ativação de vias de sobrevivência, por exemplo
por ativação da proteína Bcl-XL, da família de proteínas Bcl-2, ou da proteína NFkB, e
de vias que levam à ativação da ERK, muito importantes na proliferação e crescimento
celular.

3- Recetores com atividade tirosina cinase (RTK)

Os recetores com atividade de tirosina cinase são uma família de proteínas composta por mais
de 90 recetores, dado que existem pelo menos 90 genes que codificam RTK no Homem. De
maneira gera, estes são ativados e regulados por sinais que controlam o crescimento e
diferenciação celular, e a sua sinalização pode funcionar de dois modos, que envolvem recetores
de tipos distintos:

• Recetores com atividade intrínseca de tirosina cinase (RTK) no domínio citoplasmático

(a): o próprio recetor membranar tem atividade de tirosina cinase no seu domínio
intracelular, ligando-se com o seu domínio extracelular a moléculas muito grandes ou
hidrofílicas, incapazes de atravessarem a membrana celular;
 • Recetores com atividade de tirosina cinase associada (permanente ou transiente) (b):
o recetor possui associado ao seu domínio regulador intracelular uma proteína com
atividade de tirosina cinase, e será esta por sua vez que irá permitir a sua regulação.

[3.1. Estrutura geral dos RTK]

Os aspetos estruturais gerais destas proteínas envolvem:

1. Domínio extracelular: local de ligação ao ligando e locais de glicosilação (importante no

tráfego intracelular de proteínas recrutadas para a membrana);

2. Domínio transmembranar: composto por uma α-hélice;

3. Domínio citosólico conservado: possui atividade de tirosina cinase ou interage com

proteína tirosina cinase, tendo ainda locais de ligação a efetores (proteínas adaptadoras
ou com atividade enzimática) e sequências reguladoras (locais de autofosforilação para
sua autoativação e locais de fosforilações/desfosforilações catalisadas por cinases
(PKC)/fosfatases).

[Ativação do recetor]
Na seguinte figura, temos a representação da ativação dos RTK, que como foi dito podem ser
ativados por autofosforilação:
 a) Recetor de tirosina cinase no seu estado inativo: na ausência de ligando,
o domínio cinase do RTK existe num estado não fosforilado autoinibido;

b) Autofosforilação do recetor de tirosina cinase: quando um ligando se

liga ao domínio extracelular do RTK induz a ativação do mesmo, por
autofosforilação. Esta autofosforilação do recetor ocorre in trans, com os
dois monómeros a fosforilarem-se mutuamente na região citosólica,
gerando fosfotirosina nos domínios cinase e sequências próximas, que
servirão para o RTK interagir com uma proteína efetora.

c) Ligação, fosforilação e ativação da proteína efetora: proteína efetora só

se consegue ligar ao recetor após este ter sofrido fosforilação e tem de
possuir um domínio SH2, que permite a interação desta com as
fosfotirosinas do recetor ativo. O RTK ativado fosforila tirosina em
efetores e/ ou as fosfotirosinas no RTK ativado associam-se a efetores,
permitindo assim a ativação destas proteínas.

[Mecanismos de ativação do RTK]

Também existem dois mecanismos de ativação do RTK:

a) Recetor monomérico na ausência de sinal: recetor

existe no seu estado inativo sob a forma de dois monómeros,
presença do ligando promove a sua dimerização e
autofosforilação mútua aquando da sua ligação;

b) Recetor dimérico na ausência de sinal: recetor

apresenta-se sob a sua forma dimérica mesmo na ausência
de sinal por parte do ligando, com os seus domínios
citosólicos com função de tirosina cinase muito afastados
para que não se possam autofosforilar. Quando estes
recetores se ligam ao ligando, este ativa alostericamente o
recetor, ao estimular a sua transativação.

[Proteínas efetoras de RTK]

Uma vez ativados por autofosforilação, estes recetores utilizam as fosfotirosinas para
recrutarem e se ligarem a proteínas efetoras, através de domínios SH2, PTB ou C2. Estas
proteínas efetoras de RTK podem ser:

• Enzimas que são ativadas por fosforilação em tirosinas (por exemplo, Fosfolipase C γ,
PI3K, etc.);
 • Proteínas adaptadoras, sem atividade enzimática, que passam o sinal a outros
componentes da via de sinalização (recrutadas para o complexo) (por exemplo, Grb2,
Shc, IRS, etc.).

[Vias de sinalização ativadas por RTK]

A partir dos recetores de tirosina cinase, diferentes cascatas de sinalização podem ser ativadas,
nomeadamente a via da fosfolipase C-IP3/Ca2+ e DAG/PKC; as vias da PI3K; a via Ras; a via STAT;
etc.

Iremos agora focar-nos nas vias de ativação da PI3K/PKB e na sua importância em vias de
proliferação e sobrevivência.

• [Vias de ativação da PI3K]

Figura mostra a ativação da PI3K por RTK. Esta proteína sinalizadora pode ser regulada por
diferentes mecanismos, inclusive por crosstalk com outras famílias de recetores, como é o caso
do GPCR, que origina o dímero βγ, responsável por ativar a PI3K. Para além disso, a PI3K pode
ainda ser ativada por uma proteína Ras, a qual também é ativada por recetores da família RTK.
Uma vez ativada, a PI3K tem como função fosforilar
lípidos de inositol, mais especificamente o
fosfatidilinositol (4,5) difosfato (PIP2) na sua posição 3,
gerando fosfatidilinositol (3,4,5) trifosfato (PIP3).
Quando esta cascata de sinalização é ativada, forma-se
então PIP3. É recrutada uma proteína reguladora para a
membrana, como a PKB ou PK1, que interage com este
lípido através do seu domínio PH. Esta sinalização é
reversível dado existir uma enzima, denominada de
PTEN, capaz de desfosforilar o PIP3, convertendo-o
novamente em PIP2, reduzindo assim os níveis de PIP3 na
célula e atenuando as vias de sobrevivência, proliferação
e crescimento celular. Por este motivo, a proteína PTEN
é considerada um supressor tumoral, com mutações em
PTEN a ser implicadas no aparecimento de diferentes
cancros.

[Ativação da PI3K e regulação de proteínas

sinalizadoras]
Para que ocorra a ativação de uma PI3K é
necessário que esta interaja com tirosinas
fosforiladas de um RTK ativo, através de domínios
SH2 na subunidade reguladora (p85). Para além da
subunidade reguladora p85 possui uma
subunidade catalítica (p110), que vai ser ativada e
catalisar a fosforilação de PIP2 em PIP3.

[Ativação da PKB/Akt]
Uma vez formado o PIP3, proteínas que possuam o domínio PH vão ser recrutadas para a
membrana. Este é o caso para as proteínas PDK1 e PKB, ativadas por ligação ao PIP3 gerado pela
PI3K. Este duplo recrutamento destas cinases é importante na ativação da própria via, dado que
a própria PKB, para ter a sua ativação completa, necessita de ser duplamente fosforilada:

• Numa tirosina do domínio

cinase pela proteína PDK1;

• Numa serina do domínio

regulador pela PDK2/ILK.
Os diferentes domínios da PKB estão ilustrados na seguinte figura:

• Domínio PH, importante na interação com PIP3 e no recrutamento da proteína para a

membrana;
• Domínio Cinase, importante para a fosforilação de uma tirosina de PKB na membrana
por PDK1;
• Domínio Regulador, importante para a fosforilação de uma serina de PKB, mediada por
cinases como ILK, PDK2 e mTORC2.

Uma vez ativada, a PKB exerce a sua função

de cinase, fosforilando outras proteínas alvo.
Os substratos da PKB/Akt estão
direta/indiretamente envolvidos na
promoção da proliferação celular e na
inibição da apoptose, estimulando vias de
sobrevivência celular. Em termos de vias de
sobrevivência, esta regulação envolve uma
série de proteínas, representadas na figura.

De uma maneira geral, pode haver uma regulação direta de proteínas envolvidas no processo
de morte celular por apoptose ou uma regulação indireta na qual a PKB, via regulação de fatores
de transcrição, é capaz de promover a alteração transcricional de genes relacionados com a
apoptose. Atendendo à função da PKB/Akt, a desregulação desta via por mutações nesta
proteína está frequentemente associada ao desenvolvimento de cancro (ex: os níveis de PTEN
(supressor tumoral) estão muitas vezes diminuídos em situação de cancro, aumentando os
níveis de PIP3, provocando maior ativação da PKB e promovendo a sobrevivência celular).

Vias de sobrevivência celular

[Via da NFkB: regulação e proteólise do fator de transcrição NFkB]
A via da NFkB promove a sobrevivência celular, através da regulação transcricional de genes
anti-apoptóticos. O NFkB é um fator de transcrição constituído por duas subunidades: a p50 e
a p65. Este fator pode ser inibido e retido no citoplasma por associação à proteína IkB (Inibidor
do NFkB). Para o NFkB ser ativado, a
proteína IkB tem de ser fosforilada, por
exemplo por ação da cinase IkK (IkB cinase),
permitindo a sua dissociação do NFkB, sendo
depois ubiquitinada e degradada no
proteossoma, enquanto que o dímero que
constitui a forma ativa da NFkB, agora livre,
é translocado para núcleo, onde promove a
transcrição de genes alvo.

A proteína PKB é capaz de inibir a IkB, e,

portanto, permitir a ativação do fator de
transcrição NFkB, com transcrição de genes
anti-apoptóticos.

[Via mitocondrial da apoptose]

A PKB está envolvida na regulação da morte
celular através da modulação de proteínas
envolvidas na apoptose, como as que pertencem
à família das Bcl2 (pró ou anti-apoptóticas). A
figura seguinte mostra como estas proteínas
promovem a morte celular por apoptose, seja em
resposta a diminuição de sinais de sobrevivência
e crescimento, ou em resposta a danos que
ocorrem no DNA das células e que ativam a
proteína p53, que por sua vez aumenta os níveis
de Bax.

Proteínas da família das Bcl2, como a Bax, a Bid e

a Bad, são proteínas pró-apoptóticas,
promovendo formação de canais na membrana
interna da mitocôndria, permeabilizando-a e
fazendo com que sejam libertadas moléculas
pró-apoptóticas como citocromo C, fator AIF
(Apoptosis-Inducing Factor), Endo G (endonuclease que se dirige para o núcleo, onde cliva o
DNA, degradando-o) e proteína Diablo/Smac (inibidora da proteína IAP (Proteína Inibidora da
apoptose)). A libertação do citocromo C pelas proteínas pró-apoptóticas mencionadas promove
formação do Apoptossoma, um complexo de três proteínas: citocromo C + Apaf1 + Caspase 9.
Uma vez ativada a Caspase 9, o Apoptossoma cliva a Procaspase 3, percursora da Caspase 3,
ativando-a a Caspase 3, responsável por degradar substratos celulares e promover a morte
celular.

Para além das proteínas pró-apoptóticas mencionadas, a família das Bcl2 também contem
proteínas anti-apoptóticas, nomeadamente a própria proteína Bcl-2. Esta proteína exerce a sua
ação anti-apoptótica através da inibição dos canais da membrana interna da mitocôndria que
são formados pelas proteínas Bax, Bid, Bad.
[Sinalização anti-apoptótica pela via da PI3K/Akt]
A PKB regula a morte celular envolvendo esta proteína, por um lado por fosforilar a proteína
Bad, promovendo a sua interação com a proteína 14-3-3, que reconhecem e se ligam a outras
proteínas fosforiladas em resíduos de Serina/Treonina. Quando a Bad é fosforilada pela PKB vai
criar um sinal reconhecido pelas 14-3-3, e a sua interação com esta promove a sobrevivência,
por impedir que proteína Bad forme os canais permeabilizadores da mitocôndria, que
levariam à libertação do citocromo C e de outras proteínas pró-apoptóticas.

Em termos de regulação de proteínas envolvidas na apoptose, temos na figura ainda

representada a via do NFkB. Quando temos ativação da Akt, o fator de transcrição NFkB é
ativado, promovendo o aumento da sobrevivência celular por aumentar a expressão do gene
que codifica para a proteína CIAP (Celular Inhibitor of Apoptosis Protein), uma proteína anti-
apoptótica.

O fator de transcrição CREB, também regulado pela PKA, regula a própria Bcl-2 anti-apoptótica,
aumentando a expressão desta e fazendo com que esta impermeabilize os canais da
mitocôndria e promova vias de sobrevivência.

[Regulação da via do mTOR]

A proteína mTOR é um outro tipo de Serina/Treonina Cinase, que de uma maneira geral
promove vias anabólicas e inibe vias catabólicas, estimulando assim a proliferação celular.
Esta proteína cinase também é ativada pela PKB promovendo a síntese proteica, através da
ativação do fator de iniciação da tradução eIF-4E, por fosforilação da proteína 4E-BP. A
proteína 4E-BP tem como função ligar-se ao fator eIF-4E, mantendo-o no seu estado inativo.
Quando fosforilada pela proteína mTOR, a 4E-BP agora fosforilada dissocia-se do fator eIF-4E,
permitindo que este passe a se associar a outros fatores (como o eIF-4G e o eIF-4A), formando
complexo que se liga ao ribossoma e ao mRNA, permitindo a síntese de proteínas e a ativação
de outras vias anabólicas.

A via de sinalização do mTOR, que é extremamente complexa, também pode ser ativada por
aminoácidos (os próprios aminoácidos ativam a mTOR), o que faz todo o sentido neste
contexto, pois precisa que existam aminoácidos no meio para conseguir exercer a sua função
de promover a síntese de proteínas.

• [Proteína TOR (Target of Rapamycin)]

Nesta figura é possível observar a via de ativação

da PKB/Akt e o envolvimento dos complexos
mTORC1 e mTORC2 na mesma: dupla fosforilação
da Akt, uma fosforilação no domínio cinase pela PDK1 e
outra fosforilação no seu domínio N-terminal pelo
complexo mTORC2. Assim, a Akt é um alvo do
complexo mTORC2 e um ativador do complexo
mTORC1.

Como dito anteriormente, de uma maneira geral a proteína TOR promove vias anabólicas
(estimulando proliferação) e inibe vias catabólicas:
 [Complexo mTORC1]

• Complexo constituído por mTOR e por várias outras proteínas, diferentes das proteínas
que fazem parte do complexo mTORC2;

• Este complexo, contrariamente ao mTORC2, é sensível à Rapamicina, um composto

isolado a partir de bactérias do solo, que apresenta propriedades antifúngicas e
antibacterianas, tendo vindo a ser associada ao aumento da longevidade em muitos
tipos de organismos A Rapamicina forma um complexo com a proteína FKBP12, que se
liga diretamente ao complexo mTORC1, inibindo-o. Dado que a via do TOR se encontra
aumentada em cerca de 70% dos cancros (por hiperativação da PKB/Akt), a
Rapamicina vem sendo descrita como uma molécula que apresenta propriedades
anticancerígenas, para além de propriedades imunossupressoras;

• O complexo mTORC1 é indiretamente ativado pela PKB/Akt. Quando o recetor de

Insulina/IGF-1 é ativado, este passa a ativar uma cascata de sinalização que envolve a
PI3K a PDK1 e a Akt, ativando a Akt. Como dito, a Akt não fosforila diretamente o
complexo mTORC1, mas sim o complexo da proteína TSC (constituído por duas
isoformas, TSC1 e TSC2). O complexo TSC é por sua vez um ativador da atividade de
GTPase da proteína Rheb (um tipo de proteína G, com atividade intrínseca de GTPase),
responsável pela ativação do mTORC1. Quando ativo, o mTORC1 ativa a síntese de
proteínas via fosforilação de S6K (S6K tem de ser duplamente fosforilada pelo mTORC1
e pela PDK1) e 4E-BP1, e inibe a autofagia.

[Complexo mTORC2]

• Complexo constituído por mTOR e por várias outras proteínas, diferentes das
proteínas que fazem parte do complexo mTORC1;

• Este complexo, contrariamente ao mTORC1, é insensível à Rapamicina;

 • É ativado pela via da PI3K, associando-se a ribossomas,
promovendo a proliferação e migração de células
através da regulação de proteínas Rho GTPase, PKC e
Ras, envolvidas na remodelação da actina do
citoesqueleto, importante nos processos celulares
mencionados.

[Recetores com atividade tirosina cinase: Proteínas efetoras- Via Grb2-

Sos/Ras/MAPK]

[Proteínas adaptadoras de RTK]

A ativação da via das MAP cinases envolve proteínas adaptadoras de RTK, que de maneira geral
não possuem atividade enzimática, mas são muito importantes na sinalização por permitirem
a ligação entre diferentes proteínas sinalizadoras, organizando módulos de sinalização que
depois culminam na ativação da proteína Ras e de MAP cinases.

Exemplos de proteínas adaptadoras de

RTK incluem Grb2, IRS-1 e Shc, que
apresentam domínios importantes para a
interação proteína-proteína, entre os
quais domínios SH3 (essenciais para a
interação de uma proteína com uma
proteína que contenha regiões ricas em
prolina), domínios SH2 (que permitem
interação com tirosinas fosforiladas),
domínios PH (necessários para interação
com fosfatidilinositois) e domínios PTB
(necessários para interação com tirosinas
fosforiladas).

• [Shc-Grb2-Sos e ativação da Ras]

Estas proteínas adaptadoras são importantes na sinalização a partir de recetores RTK para
proteínas Ras. A ativação da proteína Ras requere a ação de proteínas sinalizadoras e da proteína
mSos (proteína ativadora da Ras).

O modelo da função de Grb2-mSos e da proteína adaptadora Shc na via de ativação da Ras

está demonstrado na seguinte figura:
 (a) Após ativado por ligação ao
ligando, o RTK autofosforila-se
numa tirosina do domínio
citoplasmático, gerando
fosfotirosina que será
reconhecida pelo domínio PTB da
proteína adaptadora Shc, que é
assim recrutada para junto do
recetor, com o qual interage
apenas quando autofosforilado.
Uma vez recrutada para junto do
recetor, esta proteína Shc será ela
própria substrato do mesmo,
sendo fosforilada numa tirosina,
gerando uma outra fosfotirosina.
Esta nova fosfotirosina funcionará
como local de ligação da proteína
Grb2, através do domínio SH2. Através do seu domínio SH3, a Grb2 associa-se à região rica em
prolinas na proteína mSos. Deste modo, este complexo Grb2-mSos é recrutado para junto da
proteína adaptadora Shc, e quando isso acontece a proteína mSos presente neste complexo irá
ativar a proteína Ras, que por fazer parte da família das proteínas G será ativada por troca de
nucleótidos GDP por GTP, catalisada pela mSos.

(b) Neste esquema temos praticamente o mesmo processo descrito, mas com a ligação da Grb2
à fosfotirosina do RTK ativado, através do seu domínio SH2, de modo direto e independente
da proteína adaptadora Shc, e ligação à membrana através dos domínios PH da mSos.

A figura anterior mostra a ativação da proteína Ras, em que o GDP da sua forma inativa é
substítuido por GTP por ação da proteína mSos (Ras-activating protein), passando a Ras a
encontrar-se ativa e capaz de ativar outras proteínas sinalizadoras, como é o caso de proteínas
da cascata das MAP-cinases.
[Cascata de MAP cinases e o seu papel
durante a transdução de sinal intracelular]
Uma cascata de MAP cinases é constituída por 3
proteínas cinases que atuam sequencialmente,
por sucessivas fosforilações. A primeira cinase
desta cascata, que é ativada pela proteína Ras
mas tambem pode ser ativada por outras
proteínas, é a MAP-cinase-cinase-cinase (MKKK).
Quando ativada, esta proteína fosforila a MAP-
cinase-cinase (MKK), segunda proteína desta
cascata. Por sua vez, a MAP-cinase-cinase uma
vez ativada por fosforilação vai fosforilar a
terceira proteína desta cascata, que se chama
MAP-cinase (MK), ativando-a. Uma vez ativada, a
MAP cinase irá regular outras proteínas por
fosforilação, entre as quais temos proteínas
citosólicas, proteínas de membrana e ainda
fatores de transcrição (importante para regular
programas genómicos e promover alterações na
epressão de certos genes).

[Regulação da expressão genética pela insulina através da MAP-cinase ERK]

A seguinte figura mostra a ativação do fator de transcrição ERK por esta cascata de sinalização:

(1) O recetor de insulina, é um

recetor tetramérico da família dos
recetores de tirosina cinase,
aquando da ligação de insulina é
ativado por autofosforilação nos
resíduos de tirosina do seu domínio
C-terminal;

(2) O recetor de insulina ativado

recruta e fosforila a proteína
adaptadora IRS-1 através da
interação do domínio SH2 desta
proteína com as suas tirosinas
fosforiladas, ativando-a;

(3) Fosforilação da IRS-1 cria uma

fosfotirosina, que serve de local de
ligação ao Grb2 do complexo Grb2-
mSos, o qual então ativa proteína
Ras por troca de GDP por GTP;
(4) Ativação de uma cascata de MAP-cinases, comummente conhecida como via da ERK. A Ras
ativada liga-se à primeira proteína da cascata, uma MAP-cinase-cinase-cinase denominada de
Raf-1, ativando-a;

(5) A Raf-1 ativada, por sua vez, faz a dupla fosforilação da proteína MEK, uma MAP-cinase-
cinase, em dois dos seus resíduos de serina, ativando-a. A MEK ativada passa a ativar a proteína
ERK, a MAP-cinase terminal desta via, fosforilando-a num resíduo de treonina e num resíduo de
tirosina;

(6) Uma vez fosforilada, a proteína ERK é translocada para o núcleo, onde ativa por fosforilação
fatores de transcrição, entre os quais o fator Elk1;

(7) O fator Elk1 ativado por fosforilação liga-se a SRF para estimular a expressão de genes
específicos, que promovem o ciclo, o crescimento, a proliferação e a sobrevivência celular
(esta via encontra-se frequentemente desregulada em situações de cancro).

[Atenuação e terminação da sinalização por RTK]

Tendo já visto como ocorre a ativação desta via, iremos agora perceber como ocorre a
atenuação e terminação da sinalização por RTK desta, importante para retomar os níveis basais
da célula uma vez atingido o objetivo da resposta celular. Esta regulação do recetor pode ocorrer
por vários mecanismos distintos, entre os quais temos:

1. Desfosforilação do recetor catalisada por

fosfotirosina fosfatases (PTP);

2. Fosforilação por serina/treonina cinases

(por ex., a PKC);

3. Ubiquitinação e degradação;

4. Endocitose do recetor.

Para além da regulação do recetor, a regulação destas vias pode envolver a desfosforilação da
PKB/Akt por proteínas fosfatases da família das serina/treonina cinases (por ex., PP1, PP2A).

4- Cascatas de MAP-cinases
[4.1- Componentes e ativação das vias de MAP-cinases]
A via das MAP-cinases (mitogen activated protein kinases) é constituída por 3 proteínas cinases
ativadas sequencialmente numa cascata de fosforilações: MAPKKK (ou MEKK); MAPKK (ou
MEK=MAP/ERK kinase) e MAPK (ou ERK=extracelular signal-regulated kinase).
 Para além das 3 cinases referidas, que atuam
sequencialmente, nesta via de sinalização está envolvida
ainda uma outra proteína denominada de proteína scaffold.
Esta proteína permite organizar cinases em complexos
multiproteícos envolvendo 3 cinases, tendo importantes
funções na regulação e coordenação da transdução de sinal.

De uma maneira geral, estas cascatas respondem a muitos

tipos de estímulos extracelulares, como fatores de
crescimento que atuam via ativação de recetores,
hormonas, e stress químico e físico (como calor ou radiação
UV), que regulam a sobrevivência e proliferação celular,
motivo pelo qual a sua desregulação é frequente em
situações de cancro.

[Ativação das vias das MAP-cinases]

A figura mostra a ativação desta cascata de

forma um pouco mais pormenorizada.

Para além da MAPKKK (por ex., Raf) ser

ativada por proteínas Ras, esta proteína
também pode ser ativada por outras
GTPases da família Rho e da família Rac,
bem como por fosforilação por parte de
outra proteína cinase específica (MAPK4).
Uma vez ativada a MAPKKK, esta fosforila
MAPKK em 2 resíduos de serina (separados
por 3 aminoácidos).

MAPKK passa a estar ativa e a fosforilar a

MAPK terminal numa treonina e numa
tirosina, presentes num motivo Thr-X-Tyr
(facilita a formação de homodímeros,
necessários para a translocação para o
núcleo).

A MAPK ativa pode fosforilar outras

proteínas cinases, ou então fatores de
transcrição (por ex. fator Elk-1).

Globalmente, são conhecidas 5 cascatas de

MAP-cinases, denominadas de acordo com a
última cinase.
[Regulação das vias das MAP-cinases]
A regulação das vias das MAP-cinases ocorre por retroinibição. Nesta regulação, um dos
fatores de transcrição que é ativado pela própria MAPK promove a expressão de genes que
codificam para proteínas MAPK fosfatases e inibidores de MAPK, permitindo a atenuação
desta via de sinalização por feedback negativo.

As proteínas codificadas por estes genes são

recrutadas para o complexo de sinalização via ligação
a proteínas scaffold, podendo:

1. Inibir diferentes componentes da via MAPK

(no caso dos MAPK inhibitors);

2. Desfosforilar MAPK, em resíduos de tirosina,

ou serina/treonina, ou ambas (dupla
especificidade) inibindo-as (no caso das MKP-
MAP-Kinases Phosphatases), ou no
citoplasma impedindo a sua translocação
para o núcleo, ou no núcleo promovendo a
sua translocação para o citoplasma, de forma
a deixar de promover transcrição de genes.

[Proteínas Scaffold de MAPK]

As proteínas scaffold contribuem para a especificidade e

seletividade da sinalização via organização de cinases
distintas em módulos de MAPK distintos. Estas proteínas
podem ativar cinases alostericamente, aumentando a
eficiência da sinalização e impedir o crosstalk com outros
módulos de MAPK. Por vezes, a proteína scaffold é uma
das cinases da própria cascata MAPK.

Estas proteínas interagem com proteínas adaptadoras

ou efetoras específicas, permitindo o recrutamento do
complexo de MAP-cinases e uma regulação temporal e
espacial a nível subcelular, e podem recrutar proteínas
fosfatases, que regulam o fluxo do sinal através da
desfosforilação e inibição da MAPK.

Existem vários tipos de proteínas scaffold que organizam diferentes complexos de sinalização:

• Proteína JIP (JNK-Interacting Protein): proteínas scaffold na via da JNK;

• Proteína KSR (Kinase supressor of Ras-1) e Proteína MP1 (MEK partner 1): proteínas
scaffold na via da ERK;
• Proteína β-Arrestina 2: proteína scaffold nas vias ERK e JNK.
Uma das vias de MAPK frequentemente desregulada em situações de cancro é a via da ERK,
motivo pelo qual vamos ver os diferentes componentes dessa via e regulação dos mesmos:

(1) Proteínas Raf

As proteínas Raf são a primeira cinase da via da ERK e associam-se a várias proteínas, como
PP2A, 14-3-3, Hsp90 e Hsp50. Esta proteína contém na sua estrutura alguns domínios essenciais
na sua atividade e na sua regulação:

• Domínio regulador N-terminal: contém 3 regiões conservadas- CR1, que inclui RBD-Ras
Binding Domain e CRD-Cystein Rich Domain (semelhante ao domínio C1 de PKC, no
entanto não se liga a diacilglicerol, interagindo com outros lípidos como a ceramida e o
ácido fosfatídico), e CR2, rico em serina/treonina, que possui locais de fosforilação como
serina 259;
• Domínio catalítico C-terminal: CR3

Proteínas Raf-forma inativa

Existem várias proteínas na família das Raf. Os seus domínios N-terminal interagem com os
domínios catalíticos C-terminal, bloqueando-os e assumindo uma conformação fechada,
característica da sua forma inativa, como demonstrado na seguinte figura.

Esta estrutura fechada é estabilizada pela ligação de proteínas 14-3-3, sob a forma dimérica,
que interagem por ligação a serinas fosforiladas (ser-259 do domínio regulador e ser-621 do
domínio catalítico, cujas fosforilações podem ser promovidas pela Akt e pela PKA). Ao serem
fosforiladas, estas serinas permitem que as 14-3-3 interajam com as Raf e promovam a sua
autoinibição, ao não permitir a dissociação dos domínios catalítico e autoinibitório.
 Proteínas Raf-forma ativa
Para passarem a encontrar-se na sua forma
ativa, as proteínas Raf precisam de primeiro se
associar à Ras-GTP. Para que tal seja possível,
estas requerem uma desfosforilação dos
resíduos de serina (mediada por proteínas
fosfatases da família das PP2A e da PP1) e a
dissociação da proteína 14-3-3. Quando o
domínio regulador da Raf inativa se liga à Ras-
GTP, esta proteína sofre uma alteração
conformacional que permite que ocorram fosforilações e ativação do C-Raf.

Uma vez ativada, a Raf passa a ser capaz de fosforilar a cinase seguinte (MEK1), que por sua vez
fosforila e ativa a proteína ERK, promovendo a resposta celular.

(2) ERK
De uma maneira geral, a proteína ERK promove vias de sobrevivência celular, estimulando
processos como proliferação, crescimento, transcrição e síntese proteica, ativando por
fosforilação fatores de transcrição e cinases.

A ERK regula ainda a interação da proteína

scaffold KSR com a Raf, promovendo uma fina
regulação desta via de sinalização. A ativação
da ERK, para além de fosforilar fatores de
transcrição e outras proteínas também
fosforila a KSR no local de interação com a
proteína Raf, fazendo com que esta se dissocie
da proteína scaffold, com terminação do sinal.

5- Proteínas Fosfatases
As proteínas fosfatases são enzimas responsáveis pela desfosforilação de resíduos de
fosfoaminoácidos, principalmente fosfotirosina e fosfoserina/treonina, o que divide esta
classe de proteínas nas famílias PTPs (fosfotirosina fosfatases) e PPs (serina/treonina proteína
fosfatases).

[5.1- Fosfotirosina fosfatases (PTPs)]

As fosfotirosina fosfatases são uma família de proteínas com papel essencial na regulação de
vias de sinalização que dependem do balanço entre a fosforilação e desfosforilação de
resíduos de tirosina. A inibição deste tipo de fosfatases resulta numa ativação constitutiva de
RTK, mesmo na ausência de ligando, demonstrando que estas são um componente essencial
para manter os RTK na sua forma inibida desfosforilada quando o ligando não se encontra
presente.

As fosfotirosina fosfatases encontram-se envolvidas na regulação de vários processos celulares,

entre os quais:

• Interação entre células;

• Proliferação e ciclo celular;
• Respostas inflamatórias;
• Homeostasia de glucose.

De uma maneira geral, estas proteínas podem funcionar como supressores tumorais: mutações
em PTPs estão frequentemente associadas a cancros.

O genoma humano codifica para 107 PTPs distintas, agrupadas em 4 famílias que diferem no
resíduo catalítico do domínio fosfatase (cisteína nas fosfatases do tipo I a III ou aspartato nas
fosfatases do tipo IV).

À semelhança de proteínas cinases, estas fosfatases podem ser:

• PTPs Recetores: proteínas membranares que

funcionam como recetoras, possuindo um
domínio intracelular citoplasmático com
atividade de fosfatase e um domínio extracelular
aos quais se podem ligar ligandos, ativando-as;

• PTPs Não-Recetores: proteínas não-

membranares/citoplasmáticas que possuem um
domínio catalítico de fosfatase, mas também
vários outros domínios importantes que
determinam a sua localização subcelular, de
modo a que sejam capazes de regular
espacialmente a via de sinalização, e a sua
interação com outras proteínas (por ex. os
próprios recetores de tirosina-cinase).

[Função das PTPs contendo domínios SH2 na sinalização por RTK]

No seu estado basal, estas proteínas autoinibem-se por ligação intramolecular do domínio
SH2-1 ao domínio fosfatase, passando a assumir uma conformação fechada, incapaz de
desfosforilar proteínas-alvo.

Para que passem ao seu estado ativo, as fosfotirosinas fosfatases tem de ser fosforiladas por
proteínas cinases (por ex. PKA ou PKC), em resíduos de serina/treonina no seu domínio C-
terminal. Quando tal acontece, passam a
assumir uma conformação aberta, com os
domínios SH2 expostos e capazes de interagir
com fosfotirosinas do RTK, permitindo a sua
interação com o próprio recetor e a
desfosforilação e inibição de tirosinas cinases e
proteínas efetoras pelo seu domínio fosfatase.

Para além de regular o recetor, desfosforilando

as suas fosfotirosinas e levando à sua inibição,
estas fosfatases também regulam por
desfosforilação proteínas adaptadoras como a
Shc ou IRS-1, impedindo que estas se liguem a
outras proteínas que fazem parte da cascata de
sinalização, ou outras proteínas ativadas pela
fosforilação de tirosinas.

Um aspeto importante ao nível da regulação

das fosfotirosinas fosfatases, é que além de
serem ativadas por fosforilação e mediarem a
desfosforilação de diferentes tipos de
substratos, estas fosfatases também são
reguladas por oxidação, podendo ser inibidas
pela oxidação de cisteínas presentes no centro
ativo. Em situações de stress oxidativo, como
exposição a peróxido de hidrogénio e aumento
da oxidação celular, teremos uma modificação
pós traducional da PTP, ficando esta inativa por oxidação, por formação de ponte dissulfureto
ou outras ligações, passando a ser incapaz de atenuar as vias de sinalização que dependem da
sua regulação, como vias de sobrevivência, de proliferação e de crescimento celular, levando à
hiperativação destas. Existe uma proteína importante na redução da fosfotirosina fosfatase por
oxidação das suas próprias cisteínas, chamada de Tiorredoxina (Trx). Esta reduz a PTP,
permitindo que retorne ao seu estado ativo. Quando tal acontece a própria Trx fica oxidada,
necessitando depois de ser reduzida.

[5.2- Serina/Treonina Proteína Fosfatases]

Existem pelo menos 25 diferentes tipos de serina/treonina fosfatases em mamíferos,
classificadas em várias famílias, incluindo a PP1, PP2A e PP2B (calcineurina), entre outras. De
uma maneira geral, estas são constituídas por:

• Uma subunidade catalítica;

• Uma ou mais subunidades associadas à subunidade catalítica, que podem possuir
funções reguladoras ou de endereçamento (importante para regulação subcelular),
bem como determinar especificidade, seletividade e localização.
[5.2.1. PP1]
As PP1 regulam processos celulares tais como ciclo celular, contração muscular, metabolismo
de carboidratos, síntese de proteínas, transcrição e sinalização neuronal.

Estas proteínas possuem uma subunidade catalítica (denominada de PP1c), altamente

conservada nos eucariotas. Esta subunidade pode interagir com diferentes tipos de
subunidades reguladoras R:

• Subunidade reguladora R1: proteína moduladora da atividade, que interage com a

subunidade catalítica PP1c, levando à sua inibição;
• Subunidade reguladora R2: subunidade de endereçamento, que permite recrutar
substratos fosforilados para a própria fosfatase;
• Subunidade reguladora R3: o próprio substrato da PP1c.

[5.2.2. PP2A]
As PP2A regulam processos celulares tais como vias de sinalização, ciclo celular, apoptose,
replicação do DNA, transcrição e tradução. Estas são enzimas triméricas, globalmente
constituídas por uma subunidade catalítica C e duas subunidades reguladoras (A e B), que se
associam à subunidade catalítica. A figura mostra duas isoformas de subunidades catalíticas C,
duas isoformas de subunidades reguladoras A e várias isoformas distintas de subunidades
reguladoras B, pertencentes a 3 famílias (PR55/B; PR61/B’; PR72/B’’). A junção de diferentes
tipos destas subunidades permite a formação de um número extremamente elevado de
holoenzimas triméricas, com propriedades enzimáticas e reguladoras distintas e com
diferentes localizações celulares.

A subunidade catalítica C está envolvida na

desfosforilação de substratos, promovendo
a regulação de vários tipos de processos
celulares. A própria subunidade catalítica é
sujeita a diferentes tipos de regulação,
podendo ser fosforilada em resíduos de
treonina ou tirosina (que afetam a sua
atividade), ativada por ação de uma
ceramida, ou inibida por ação de ácido
ocadáico, que ao inibir este tipo de
fosfatases promove a formação de tumores
por hiperativação de vias de sobrevivência
celular.
Por este motivo, as subunidades reguladoras que se associam à subunidade catalítica C são
consideradas supressores tumorais com diferentes funções: a subunidade A permite a
interação com outras proteínas (importante para a localização subcelular do trímero e regula a
especificidade do substrato, e a subunidade B, para além de também regular a especificidade
do substrato, regulam ainda a atividade da fosfatase e a distribuição subcelular, permitindo
uma regulação espacial mediada por esta fosfatase.

[5.2.3. Calcineurina (PP2B)]

A calcineurina tem uma importante função na regulação do sistema imunológico (regulando a
ativação de linfócitos), e de processos celulares tais como desenvolvimento neuronal e
muscular. Esta proteína tem uma estrutura dimérica, formada por uma subunidade catalítica
(calcineurina A) e uma subunidade reguladora (calcineurina B).

Esta fosfatase é uma proteína identificada como sendo alvo de drogas imunossupressoras, dada
a sua importância em processos imunológicos. A calcineurina pode ser:

• Ativada por Cálcio (Ca2+) / Calmodulina;

• Inibida por Ciclosporina / Ciclofilina e por FK506/FK506BP.

Um dos alvos deste tipo de fosfatase é o fator de

transcrição NF-AT. Este fator de transcrição é
ativado por desfosforilação mediada pela
calcineurina (dado que a fosforilação do NLS-
Nuclear Localization Signal impede a sua
translocação para o núcleo, ao fazer com que este
deixe de ser reconhecido pela importina),
permitindo que este deixe de estar circunscrito ao
citoplasma e possa ser translocado para o núcleo,
onde irá exercer a sua função de promover a
transcrição de genes que codificam para
citoquinas (por ex. IL-2), canais iónicos, proteínas
da superfície celular e proteínas envolvidas na
apoptose.
Em linfócitos T ativados por ligação de um antigénio ao TCR, o NF-AT entra no núcleo e liga-se
ao DNA em cooperação com outros fatores de transcrição (por ex. AP1). As proteínas NF-AT,
para além de expressas em células do sistema imune, são ainda expressas por outros tipos
celulares, com adipócitos, pancreáticas, mamárias, cardíacas, etc. Estas proteínas regulam
importantes processos celulares:

Assim, por aumentarem a transcrição de genes envolvidos no ciclo celular, apoptose,

angiogénese e metástase, é fácil de perceber que estas proteínas se encontram
frequentemente desreguladas em cancro.

6- Proteínas 14-3-3
Nos mamíferos existem 7 isoformas de proteínas 14-3-3. Estas são proteínas acídicas (pH 4-5),
relativamente pequenas, que podem formar homo- ou heterodímeros, mas que de uma
maneira geral atuam como dímeros, dado estes apresentarem uma afinidade superior para as
proteínas alvo do que a sua forma monomérica. As 14-3-3 são altamente conservadas entre
espécies e geralmente atuam ligando-se a outras proteínas que tenham sido fosforiladas em
resíduos de serina/treonina.

Estas proteínas foram inicialmente descobertas no cérebro, onde representam cerca de 1% das
proteínas totais. Alterações nestas estão relacionadas com o surgimento de doenças
neurodegenerativas.

• Vermelho – 100% conservação entre diferentes

isoformas.
• Azul – alta conservação.
• Amarelo – regiões de baixa similaridade.
• Verde – sinal de exportação nuclear.
[Estrutura das proteínas 14-3-3]
• Proteínas constituídas por 9 alfa-hélices antiparalelas em cada monómero;
• A sua forma ativa é um dímero, e a fusão dos dois monómeros resulta numa molécula
rígida, que cria um canal enriquecido em aminoácidos carregados positivamente (Lys e Arg)
e Thr nas alfa-hélices 3 e 5, através do qual estas se ligam a proteínas fosforiladas. Para
além disso, este canal está enriquecido com resíduos hidrofóbicos (Val e Leu);
• A região C-terminal é a região mais flexível de toda a molécula e a que apresenta uma maior
variabilidade.

[Motivos de ligação às proteínas 14-3-3]

Aas 14-3-3 atuam ligando-se a proteínas fosforiladas, em resposta a uma fosforilação. De uma
maneira geral, estas proteínas podem reconhecer 3 sequências:

• Modo I (RSXpSXP);
• Modo II (RXY/FXpSXP);
• Modo III (C-terminal, -pS/Ptx1.2-CO2H), apenas descrito para 6 proteínas.

NOTA: X representa um qualquer aminoácido.

A afinidade da proteína 14-3-3 é muito superior quando existem dois motivos de ligação,
aumentado cerca de 30x quando a proteína alvo é duplamente fosforilada.

[Isoformas das proteínas 14-3-3]

As isoformas das proteínas 14-3-3 apresentam homologias bastante elevadas, mas também
algumas regiões de menor similaridade, o que permite que apresentem propriedades distintas.
Estas isoformas diferem:

• Nas propriedades físico-químicas;

• Na afinidade para ligandos;
• Na localização subcelular (citoplasma, núcleo, membrana, centrossomas);
• A nível de expressão (a transcrição dos genes que codificam 14-3-3 não é constante);
• Na regulação pós- traducional (por cálcio e fosforilação).

[Locais de fosforilação]
Estão descritas muitas proteínas cinases que fosforilam as proteínas 14-3-3, modificando a sua
afinidade para diferentes substratos.
Fosforilação mediada por:
• Akt;
• SDK1 (sphingosine dependent
protein kinase), ativada por
esfingosina, regula processos
de sobrevivência e morte
celular;
• CK1 (Casein Kinase 1);
• PKC;
• JNK.

[Funções das proteínas]

As proteínas 14-3-3 possuem diversas funções, entre as quais se incluem:

• Comunicação celular e transdução de sinal;

• Metabolismo e energia;
• Organização celular;
• Transporte;
• Síntese e processamento de proteínas;
• Síntese de ácidos nucleicos.

[Formas de atuação das proteínas 14-3-3]

• Alteram a conformação da proteína-alvo (por ex. serotonina N-acetiltransferase);
• Inibem a interação da proteína-alvo com outras proteínas (por ex. BAD, FOXO e outros
fatores de transcrição);
• Servem de âncora de forma a estimular a interação entre duas proteínas distintas (por ex.
Tau e GSK3β).

[Interação das proteínas 14-3-3 com BAD/Bcl-2]

Quando a proteína BAD é

fosforilada, esta associa-se à
proteína 14-3-3 e dissocia-se da
proteína Bcl-2, impedindo que ela
exerça a sua função anti-apoptótica.
Todas as isoformas da proteína 14-
3-3 são capazes de se ligar à BAD.
BAD pode ser fosforilada em resíduos distintos, que levam a diferentes implicações:

• Ser-112 e Ser-136: esta dupla

fosforilação é indispensável para que a
BAD interaja com proteínas 14-3-3,
levando à sua inibição;
• Ser-155: esta fosforilação vai favorecer a
dissociação da proteína Bcl-2;
• Ser-128: localizado entre a Ser-112 e a
Ser-136, se a BAD for fosforilada no neste
resíduo a 14-3-3 não se consegue ligar à
proteína BAD.

Quando a proteína BAD se

encontra ligada à proteína Bcl-
2, inibindo a atividade anti-
apoptótica desta. Porém,
quando a BAD é duplamente
fosforilada, passa a ser
reconhecida pela proteína 14-
3-3 e fosforilada na região C-
terminal, dissociando-se da
Bcl-2. A Bcl-2 libertada vai
exercer a sua ação anti-
apoptótica na mitocôndria, ao
impedir a impermeabilização
da sua membrana e a
libertação de fatores pró-
apoptóticos.

[Interação das proteínas 14-3-3 com fatores de transcrição]

Um importante fator de transcrição regulado pelas proteínas 14-3-3 é o FOXO (Forkhead Box
transcription-factor). Globalmente, estas proteínas atuam como mediadores de sinais de
crescimento, de stress e do controlo de transcrição.
Regulam aspetos relacionados com o desenvolvimento, proliferação, diferenciação,
resistência ao stress, apoptose e controlo do metabolismo.

[Interação das proteínas 14-3-3 com FOXO]

Este fator de transcrição apresenta vários
domínios, destacando o domínio DBD (domínio
de ligação ao DNA), o domínio TD (relacionado
com a promoção da transcrição dos genes alvo) e
duas sequências NLS (nuclear localization signal)
e NES (nuclear export sequence).
NLS - é importante para a translocação do fator
de transcrição do citoplasma para o núcleo, onde
vai desempenhar a sua função.
NES – sequencia da exportação nuclear, sendo
importante na exportação da proteína alvo do
núcleo para o citoplasma e terminar a transcrição
de genes alvo regulados por este fator de
transcrição.

O fator de transcrição vai ser fosforilado por Akt. Dado que a Akt promove a proliferação
celular e o FOXO é um fator pró-apoptótico, esta interação é importante para a inibição do
fator de transcrição. Quando FOXO é fosforilado e reconhecido pelas 14-3-3, a ligação destas
faz com que a sequência NLS fique bloqueada e a sequência NES continue exposta. Por este
motivo, a proteína que estiver no citoplasma deixará de ser translocada para o núcleo.
Contudo, como a NES continua exposta as proteínas que se encontram no núcleo, podem
continua a ser exportadas do mesmo.

A- Quando estamos perante um sinal de crescimento, PKB é ativada podendo regular alvos no
citoplasma ou fatores de transcrição no núcleo. Neste contexto, a PKB nuclear irá fosforilar o
fator FOXO, que quando fosforilado se dissocia do DNA e interage com a proteína 14-3-3.
Quando tal ocorre, NES fica exposta, permitindo que o FOXO seja reconhecido por exportinas,
que o translocam, juntamente com a proteína 14-3-3, do núcleo para o citoplasma.

B- Quando o sinal de crescimento é removido, o fator FOXO é desfosforilado e dissocia-se da

proteína 14-3-3. A sequência NES passa a encontrar-se novamente exposta, sendo reconhecida
por importinas, que levam o FOXO de volta para o núcleo, onde este se liga à região promotora
de genes-alvo, promovendo a sua transcrição.

[Importância do FOXO]
A principal função do FOXO requer sobre a morte celular, e por isso, não é de admirar que genes
regulados pelo FOXO se encontrem relacionados com o controlo do ciclo celular ou do processo
de morte.

[14-3-3 vs atividade catalítica da proteína-alvo]

TH (Tirosine hydroxilase)
• Atua na biossíntese das catecolaminas;
• Fosforilada em resíduos de serina,
fosforilação essa mediada por PKA;
• A ligação de proteínas 14-3-3 aumenta a
atividade e a estabilidade da enzima;
• Apresenta vários domínios importantes,
como o RD (domínio regulatório), o CD
(domínio catalítico) e o TD (domínio de
tetramerização).

Quando a proteína está desfosforilada encontra-se inativa, pois tem a sua ação inibida pela
ligação de catecolamina ao seu centro ativo.
Quando a proteína é fosforilada numa Ser40 pela PKA e em seguida por outra kinase, ou seja,
temos uma proteína que sofreu uma dupla fosforilação. Após esta dupla fosforilação a proteína
14-3-3 vai ligar-se e estabilizá-la → passando para a sua forma ativa, a catecolamina é libertada
deixando o centro ativo livre para catalisar a reação da hidroxilação da tirosina (uma das etapas
da biossíntese da catecolamina).
ASK1 (Apoptosis signal-regulating kinase 1)

• MAPKKK (atua em cascatas de MAP kinases).

• Inibida por ligação a proteínas 14-3-3 e tioredoxinas (Trx), quando a célula é sujeita a stress
oxidativo ou quando a oxidação intracelular aumenta.
• Na presença de espécies reativas de oxigénio, a Trx e a proteína 14-3-3 dissocia-se da ASK1,
nesta altura a ASK1 associa-se a outras proteínas formando um complexo que constitui a
forma ativa → ativa uma cascata de sinalização.
• A proteína 14-3-3 só têm capacidade de se ligar a ASK1 se for previamente fosforilada por
SOK-1 (kinase ativada por respostas a oxidantes).
• Para além de ser regulada pelas duas proteínas acima referidas é também regulada pela via
de ubiquitinação e degradação do proteossoma da proteína ASK1.

Após a ativação de ASK1, vai promover a morte celular por mais do que um mecanismo em
paralelo. Por exemplo, a MAPKKK ativa a cascata da MAPK da JNK → vai promover vias de morte
por fosforilação de proteínas 14-3-3.
A proteína ASK1 pode também inibir a via de Akt → fosforila o fator CREB → aumenta a
transcrição de proteínas envolvidas na sobrevivência celular. Ao inibir o Akt → desfosforila o
fator CREB → promove a morte celular.
JNK (c-Jun N-terminal kinase)
É um sub-grupo das MAP kinases ativadas por:
• UV e radiação gama.
• Ceramidas.
• Citoquinas inflamatórias.
• Choque osmótico.
• Fatores de crescimento (por vezes).

Apoptose
Neurodegeneração
Proliferação e diferenciação celular

Quando a 14-3-3zeta é fosforilada, vai dissociar-se das proteínas Bax → ocorre a translocação
de Bax para a mitocôndria → e vai permeabilizar a membrana interna da mitocôndria e criar
canais que permitem a libertação dos fatores pró-apoptóticos.
Por outro lado, quando ocorre a fosforilação de 14-3-3zeta pela JNK → dissociação de BAD →
BAD é translocado para a mitocôndria, onde se liga a proteínas anti-apoptóticas inibindo a sua
ação.
14-3-3 vs ciclo celular
Proteínas envolvidas em diferentes fases do ciclo celular, são reguladas por 14-3-3. Regulação
envolvendo a 14-3-3sigma, esta regula duas ciclinas kinases envolvidas na transição G1-S e G2-
M.

Aumento da expressão da proteína 14-3-3sigma em resposta a danos no DNA

Não é expressa constitutivamente, sendo apenas induzida por danos no DNA e é regulada por
p53 e BRCA1.

P53 – a p53 fosforilada associa-se a proteínas 14-3-3 e promove a transcrição da proteína 14-3-
3sigma.
Promove um loop de feedbazh positivo, porque a própria p53 é ativada pela 14-3-3sigma
BCRA1 – contribui para a indução da expressão de 14-3-3sigma.
Proteína 14-3-3sigma → associa-se a CDKs (ciclinas kinases) inibindo-as → provoca a paragem
do ciclo celular em G1 (CDK1) e G2 (CDC2).

14-3-3sigma e cancro
• Atua como um supressor tumoral, induzida por p53.
• Níveis diminuídos em diversos carcinomas:
Mama – 96%
Próstata – 45%
 Pulmão – 83%
Ovário – 60%
• Expressão baixa devido a hipermetilação do promotor.
• Inibe CDK2 e CDC2.
• Regula c-Myc → ubiquitinação e degradação pelo proteossoma.
14-3-3zeta e cancro
Uma das isoformas mais abundante em diversos tipos de tumores, como estomago, mama,
pâncreas e pulmão conferindo resistência à apoptose e aumento da invasão e metastização.
• Inativa supressores tumorais: p53 e p21.
• Inativa Bad e Bax.
• Liga-se a p85-PI3K → ativa da AKT.
• Liga-se ao FOXO3a → transporte para o citosol.