INTRODUÇÃO AO METABOLISMO CELULAR – ÁREA 2

O metabolismo é uma atividade celular dirigida e coordenada, com a cooperação

de diversos sistemas multienzimáticos. É a soma de todas as transformações
químicas que ocorrem em uma célula ou organismo.
O metabolismo possui 4 funções:
1. Obtenção de energia química do sol ou nutrientes do ambiente;
2. Conversão de moléculas dos nutrientes e da própria célula em precursores de
macromoléculas;
3. Polimerização de precursores em macromoléculas;
4. Sintetização e degradação de biomoléculas de acordo com necessidade celular;
O metabolismo é dividido em 2 grandes fases:
ANABOLISMO – fase consumidora de energia, biosintética. O anabolismo pega
moléculas precursoras e transforma-as em macromoléculas celulares.
CATABOLISMO – fase liberadora de energia, degradativa. Catabolismo pega
nutrientes energéticos e transforma em produtos sem energia.
Existem, ainda, 2 tipos de vias metabólicas:
1. Lineares, que partem de um substrato inicial que sofre alterações até se
transformar em um produto. As moléculas entre SUBSTRATO e PRODUTO se
chamam INTERMEDIÁRIOS METABÓLICOS.
2. Cíclicas, onde ocorre a regeneração do primeiro intermediário, a via cíclica
inicia com a ligação do substrato ao primeiro intermediário, e o produto sai da
via enquanto o intermediário se regenera (ciclo de Krebs e Ureia)
O Ciclo de Krebs é anfibólico, pois nele encontramos as 2 fases do metabolismo.
A síntese e a degradação de uma molécula não podem estar ativas ao mesmo
tempo, e não podem usar as mesmas enzimas, nem mesmo os compartimentos
celulares iguais. Além disso, toda rota tem pelo menos UMA enzima mercatória
(marcapasso), cuja atividade é regulada pelos fatores de regulação vistos
anteriormente.

INTRODUÇÃO AOS MECANISMOS DE TRANSDUÇÃO DE SINAL

Devemos tomar conhecimento de um mecanismo chamado SINALIZAÇÃO
CELULAR, pelo qual uma célula sinalizadora envia uma mensagem para outra, uma
célula-alvo, a fim de modificar a função dessa. Essa comunicação se dá através de
moléculas sinalizadoras (sinais químicos) que regularão a atividade das enzimas
marcapasso.
São 4 as etapas da sinalização celular:
1. Síntese e liberação da molécula sinalizadora, pela célula sinalizadora
2. Transporte da molécula sinalizadora até a célula-alvo
3. Detecção do sinal químico pela célula-alvo, por meio de receptor específico
4. Modificação do metabolismo, da função ou desenvolvimento celular, acionado
pelo complexo sinal-receptor.

São 5 os tipos de sinalização celular existentes:

1. Endócrina
a) A molécula sinalizadora é o HORMÔNIO.
b) O hormônio agirá numa célula-alvo distante do sítio de síntese.
c) A célula sinalizadora chama-se célula/glândula endócrina.
d) O hormônio chega até a célula-alvo pela corrente sanguínea.
e) Comunicação do tipo LENTA.

2. Sináptica
a) A molécula sinalizadora é o NEUROTRANSMISSOR.
b) O neurotransmissor agirá numa célula muito próxima do sítio de síntese.
c) A célula sinalizadora chama-se neurônio pré-sináptico, enquanto a célula-
alvo será a célula pós-sináptica (aqui, podemos ter outro neurônio, uma
célula muscular [formando a junção neuromuscular] ou uma célula
endócrina [formando a junção neuroendócrina])
d) O neurotransmissor chega até a outra célula quando é liberado da vesícula
sináptica, através da despolarização celular. A aproximação dessas 2
células é uma SINAPSE, e o espaço entre elas é a FENDA SINÁPTICA.
e) É a comunicação MAIS RÁPIDA que existe.

3. Parácrina
a) A molécula sinalizadora é um MEDIADOR LOCAL.
b) O mediador agirá em múltiplas células-alvo próximas do local de síntese.
c) Comunicação do tipo RÁPIDA.
d) Fatores de crescimento, citocinas, interleucinas e eicosanoides.
e) Alguns escritores incluem os neurotransmissores nessa categoria.

4. Autócrina
a) A molécula sinalizadora é um MEDIADOR LOCAL (sim, mesmo nome).
b) O mediador local responderá a substâncias liberadas por ela mesma.
c) Comunicação do tipo RÁPIDA.
d) Usada por neonatos e embriões no desenvolvimento e crescimento.
e) Usada por adultos na resposta imune e inflamatória.
5. Justácrina
a) Pode ser um canal proteico de junções comunicantes (gap junctions, por
onde passam íons e metabólitos) ou proteínas ligadas à membrana que
irão reagir com receptores de outra célula adjacente.
b) Não especificou a velocidade, mas pela proximidade das células,
assumimos que deve ser RÁPIDA.
c) O fator de crescimento epidérmico (EGF) se utilizam desse tipo de
comunicação.

Agora que a nossa célula-alvo detectou a presença do sinal, por meio da ligação
com o receptor, precisamos entender como ela irá TRADUZIR essa ligação feita
entre o sinal químico e o receptor. Para isso, existem 6 características da
transdução de sinal:

1. Especificidade – O receptor possui uma afinidade e especificidade pelo seu

ligante. A especificidade ocorre por meio de uma complementariedade
estereoquímica entre o ligante e o sítio de ligação do receptor. Ela é mediada
por ligações não-covalentes, e essa interação promove uma mudança
conformacional no receptor, que irá ativá-lo, mudando sua atividade biológica.
Por exemplo, a presença de um ligante em um receptor de canal iônico irá abrir
o canal para que haja a passagem de determinados íons!!
A medida da afinidade é dada por Kd (constante de dissociação, lembrar que é
metade da ocupação máxima dos ligantes nos sítios – Bmáx). Quanto MAIOR o
Kd = MENOR afinidade. MENOR Kd = MAIOR afinidade.

2. Amplificação do Sinal – Quando enzimas ativam enzimas, aumentando o

número de moléculas geometricamente na cascata. Como exemplo, pense num
ÚNICO sinal que ativará 1 enzima. Essa enzima ativará 3 enzimas, e cada uma
dessas enzimas ativará mais 3 enzimas, criando assim um ESQUEMA DE
PIRÂMIDA celular!

3. Modularidade – Proteínas sinalizadoras são MODULÁVEIS! Elas possuem uma

característica de AFINIDADE MULTIVALENTE (ou seja, podem reconhecer
diferentes proteínas e moléculas e interagir com elas, formando diversos
complexos de sinalização). Assim, a célula pode misturar e combinar um
conjunto de moléculas sinalizadoras, formando complexos proteicos e
multienzimáticos com diferentes FUNÇÕES ou LOCALIZAÇÕES dentro da
célula. Os pontos de contato dessas proteínas são os SÍTIOS FOSFORILADOS.
 4. Adaptação (Dessensibilização) – Esse efeito ocorre quando um sinal químico
está continuamente ligado ao seu receptor. A ativação do receptor por essa
ligação dispara um circuito de RETROALIMENTAÇÃO (feedback), que desliga o
receptor (inativa-o por modificação covalente, por exemplo) ou remove-o da
superfície celular (por internalização e degradação do complexo ligante-
receptor). Isso ocorre para que a célula continue sensível quando houver uma
nova liberação do sinal químico, e possa responder a esse sinal.

5. Integração – A capacidade do sistema de receber múltiplos sinais e produzir

uma resposta UNIFICADA, adequada as necessidades da célula ou organismo.
Pense que o sistema pode receber dois sinais diferentes, com efeitos opostos.
Ele irá unir os dois sinais, formando uma resposta homeostática.

6. Resposta Localizada – Quando os componentes de um sistema de sinalização

estão localizados numa mesma estrutura celular específica, a célula pode
regular o processo localmente, sem afetar outras regiões. A resposta é breve e
local pois o mensageiro é destruído pela enzima antes mesmo de se difundir
pela célula.

Existem 2 tipos de mecanismos de transdução:

1. Receptores Intracelulares, que interagem com pequenas moléculas
hidrofóbicas que conseguem se difundir na membrana e entrar na célula. Esses
receptores podem ser citoplasmáticos ou nucleares. No caso dos
citoplasmáticos, a ligação com o ligante ativa o receptor, deslocando o
complexo para dentro do núcleo. Quando ativados, ambos os receptores atuam
como fatores de transcrição gênica, junto ao DNA, regulando a expressão de
genes específicos. Como exemplo, os receptores citoplasmáticos para
glicocorticoides e os nucleares para a vitamina D.

2. Receptores de superfície de Membrana, que interagem com moléculas

hidrofílicas. São proteínas que geralmente possuem 1 domínio extracelular, 1
domínio de ligação para o ligante, 1 ou mais domínios intermembrana (em α-
hélice) e 1 domínio intracelular, que irá disparar a cascata de sinalização. Esses
têm efeito imediato a níveis de íons e ativadores/inibidores enzimáticos, mas
são lentos quanto à expressão gênica.

TRANSDUÇÃO DE SINAL E SÍNTESE DA INSULINA

A insulina é uma molécula hidrofílica, portanto, sabemos que seu receptor se
encontra na membrana celular. É uma proteína hormonal formada por 51 resíduos
de AA’s, distribuídos em 2 cadeias (cadeia A com 21 resíduos e cadeia B com 30
resíduos). Essas cadeias são unidas por 2 pontes dissulfeto. A insulina é produzida
 no Pâncreas, por 1 dos 3 agrupamentos de células endócrinas das ILHOTAS DE
LANGERHANS (células β-Pancreáticas), dessa maneira:
Passo 1) A pré-pró-insulina (precursor inativo) é convertida em pró-insulina, no
RER, através da remoção da SEQUÊNCIA SINALIZADORA (segmento amino-
terminal), e da formação de 3 ligações DISSULFETO.
Passo 2) No complexo de Golgi, um segmento correspondente ao PEPTÍDEO-C
(conector) é removido da molécula, formando a insulina MADURA.
Lembrando, a insulina começa como uma proteína com 4 partes (cadeia A, B,
sequência sinalizadora e peptídeo-c), e remove 2 partes por meio de proteólises.

EFEITOS GERAIS DA INSULINA

Esses podem ser agrupados em 4 grandes categorias:
1. Reversão da fosforilação estimulada pelo glucagon;
2. Estimulação da fosforilação de certas enzimas;
3. Ação como fator de crescimento, com efeito estimulador sobre a síntese
proteica;
4. Estimulação da captação de glicose e aminoácidos pelas células;

Lembrando, a ação da insulina é HIPOGLICEMIANTE, e responde a HIPERGLICEMIA.

Ela se dá em minutos após a exposição de células β-Pancreáticas ao aumento da
concentração da glicose. Quando o nível abaixa, ela é retirada do sangue pelo
fígado, onde será degradada.

CARREADORES DA GLICOSE (GLUT2 E GLUT4)

As células β-Pancreáticas expressam um carreador específico da glicose GLUT2,
que possui baixa afinidade por ela. Assim, a glicose só entrará numa célula β-
Pancreática quando estiver em ALTA CONCENTRAÇÃO no sangue. Além disso, as
 células β-Pancreáticas expressam a Glicoquinase (isoforma da Hexoquinase), uma
enzima que também tem baixa afinidade pela glicose. Essas enzimas são
responsáveis por prender a glicose no interior das células, adicionando um fosfato
no carbono 6 dela.
Já as células ADIPOSAS, MUSCULARES ESQUELÉTICAS E CARDÍACAS, expressam o
transportador de glicose GLUT4, que é sensível a insulina, ou seja, na presença
dela, o número de GLUT4 aumenta na superfície celular.
O recrutamento desse GLUT4 ocorre por meio da Cascata PI-3K, porém, a exocitose
desses transportadores é promovida por um mecanismo NÃO ESCLARECIDO.
Quando há um aumento na relação insulina-glucagon (jejum ou diabetes) há uma
endocitose do GLUT4, que ficará escondido nas vesículas membranosas da célula,
comprometendo a captação de glicose pelos tecidos. No diabético, esse fator
contribui para a HIPERGLICEMIA.

REGULAÇÃO DA SECREÇÃO DE INSULINA POR GLICOSE

A insulina é carreada de maneiras diferentes em determinadas células, e sua
regulação pode ser dada pela seguinte reação:
1. Ao aumentarmos a [glicose]1,o GLUT2 consegue colocá-la para dentro da
célula.
2. No interior da célula, ela é fosforilada pela Glicoquinase.
3. O produto GLICOSE-6-FOSFATO é direcionado para a via glicolítica (Ciclo de
Krebs), onde é oxidada (por fosforilação oxidativa), aumentando a [ATP]
dentro da célula.
4. O aumento de ATP bloqueia os canais de Potássio controlados por ele e
presentes na membrana plasmática da célula β-Pancreática, causando uma
despolarização.
5. Essa despolarização abre, então, canais de Cálcio que são voltagem-
dependentes, permitindo a passagem de Cálcio e aumentando a [Cálcio
citosólico].
6. O aumento desencadeará a liberação de insulina por EXOCITOSE.
(OBS) Existem drogas (sufunilureia e glinide) usadas no tratamento de diabetes do
tipo 2, que inibem o canal de K+, estimulando a liberação da insulina como vista
acima.

O RECEPTOR TIROSINA-CINASE (TyKR)

O receptor para a insulina é do tipo TyKR, que fosforila substrato em resíduos de
tirosina específicos.
Esse receptor é formado por 2 subunidades α e 2 subunidades β.

1
Os colchetes servem para denotar a concentração das substâncias.
 Subunidade α)
- Se projeta para fora da célula
- Possui o domínio de ligação para insulina
Subunidade β)
- Se entrelaçam nas subunidades α, atravessando a membrana em uma estrutura
de α-hélice
- Se projetam no interior da célula.
São os domínios intracelulares que possuem atividade CATALÍTICA do tipo TyKR.
Funciona assim: a insulina se liga na subunidade α, ativando as subunidades β.
Cada β irá fosforilar 3 resíduos de Tirosina C-terminal da outra subunidade
(AUTOFOSFORILAÇÃO). Isso expõe o sítio ativo da enzima, permitindo a
fosforilação dos resíduos de Tirosina das proteínas α.
Um substrato bastante estudado é o IRS (Insulin-receptor-substrate). Uma vez
fosforilado pelos domínios catalíticos das subunidades β, o IRS pode ativar 3
cascatas de transdução de sinal, dependendo das células e de sua necessidade. A
cascata que nos importa é da PI3-CINASE.

A CASCATA DA PI3-K E PKB

É importante ressaltar que essa cascata ocorre para que o Glicogênio possa ser
sintetizado. A seguir, veremos a sequência de reações:
1. O IRS, fosforilado, irá ligar-se a enzima PI3-K, ativando-a.
2. A PI3-K associa-se a um lipídio de membrana (PIP2), fosforilando-o e
transformando em PIP3.
3. As enzimas PDK1 e PKB irão ligar-se a esse PIP3, na membrana.
4. A PDK1 é ativada, e irá fosforilar a PKB.
5. Com a PKB ativada e fosforilada, ela pode passar a reação em diante dentro da
célula, ativando e fosforilando seus substratos.
6. A GLICOGÊNIO-SINTASE (enzima que regula a síntese do glicogênio, regulada
por fosforilação) é desativada pela GSK3. O problema é que ambas estão ativas
na forma defosforilada.
7. A PKB irá fosforilar justamente a GSK3, inativando-a.
8. Sem GSK3, A GLICOGÊNIO-SINTASE pode trabalhar normalmente, sintetizando
o glicogênio!!
O recrutamento dos GLUT4 para a membrana das células que descrevemos
anteriormente também ocorre por meio da cascata da PI3-K, porém, como falamos,
a PKB ativada utiliza um mecanismo não esclarecido para promover a exocitose.

TRANSDUÇÃO DE SINAL DO GLUCAGON

 O Glucagon é um hormônio peptídico, constituído por 29 resíduos de aminoácidos.
Sintetizado primeiramente como pré-pró-glucagon, sofre diversas clivagens
proteolíticas no Retículo Endoplasmático até se tornar glucagon.
Ele é sintetizado e secretado pelo Pâncreas, em 1 dos 3 conjuntos de células das
ilhotas de Langerhans (células α-Pancreáticas). Dessa maneira:
Passo 1) A baixa concentração de glicose sanguínea (<50mg%) afeta direta ou
indiretamente as células α-Pancreáticas, a partir do estímulo do SNAS2.
Passo 2) O stress hipoglicêmico estimula receptores hipotalâmicos, que
desencadeiam a resposta do SNAS. Assim, a medula adrenal e o pâncreas (que
recebem inervação simpática) liberam NORADRENALINA.
Passo 3) A noradrenalina irá estimular a liberação da adrenalina pela medula
adrenal e a liberação de glucagon pelas células α-Pancreáticas.
Além disso, a adrenalina pode também estimular a produção de glucagon, bem
como o hipotálamo, que, ao liberar ACTH pela hipófise, estimula a liberação de
cortisol pelo córtex adrenal, afetando a liberação de glucagon pelo pâncreas.

EFEITOS GERAIS DO GLUCAGON

Podemos dividir os efeitos com relação ao local onde se dão:
1. Fígado – aumenta a degradação do glicogênio (fornecendo glicose e
diminuindo a síntese do glicogênio, para que haja menos glicose armazenada
nessa forma). Aqui, ele também reduz o uso de glicose como combustível
energético. Há um aumento da cetogênese, que fornece fontes alternativas de
energia para o cérebro.
2. Tecido Adiposo – Aqui, haverá uma mobilização dos ácidos graxos, usando
menos glicose tanto no fígado quanto nos músculos.
Tudo isso se dá devido a atividade do Glucagon sobre as enzimas marcapasso
dessas rotas.

2
Sistema Nervoso Autônomo Simpático.
 Lembrando que a ação do Glucagon é HIPERGLICEMIANTE, e sua liberação ocorre
na HIPOGLICEMIA. O mecanismo de transdução ocorre via proteína G, que será
explicado em breve.

A ADRENALINA E A NORADRENALINA
Ambos os hormônios são sintetizados a partir do aminoácido Tirosina. A síntese de
noradrenalina ocorre nas fibras adrenérgicas e na medula adrenal. Na medula
adrenal, 80% da noradrenalina é metilada em adrenalina. Lembrando que a
noradrenalina também é conhecida como norepinefrina (e a adrenalina é a
epinefrina).
As catecolaminas são liberadas em resposta ao stress agudo (psicológico, frio,
exercício físico, cansaço, situações de luta ou fuga, baixa glicemia ou jejum
prolongado, além de diversas condições patológicas).
Existem, no total, 9 tipos diferentes de receptores adrenérgicos! Os principais são
os do tipo β.

EFEITOS GERAIS DA ADRENALINA

Podem ser divididos em efeitos metabólicos:
1. Aumenta a degradação de glicogênio (fígado e musculo)
2. Diminui a síntese do glicogênio (fígado e musculo)
3. Aumenta a gliconeogênese (fígado). Esses 3 efeitos servem para aumentar a
produção de glicose como combustível.
4. Aumenta o nível de glicose, por aumentar a produção de ATP no músculo
5. Aumenta a mobilização dos ac. Graxos no tecido adiposo, aumentando
disponibilidade de ac. Graxo como combustível.
 6. Aumenta secreção de glucagon e diminui secreção de insulina, reforçando os
efeitos metabólicos.
E fisiológicos:
1. Aumenta frequência cardíaca
2. Aumenta pressão sanguínea
3. Dilata as vias aéreas (para melhorar a concentração de oxigênio no corpo)

MECANISMO DE TRANSDUÇÃO DE SINAL VIA PROTEÍNA G

O glucagon e a adrenalina são moléculas HIDROFÍLICAS, e por isso possuem um
receptor de membrana. Tanto o receptor para o glucagon quanto o receptor
adrenérgico da adrenalina estão associados a proteína G, uma molécula trimérica,
formada por 3 subunidades (G-α, G-β e G-γ). Ainda assim, existem vários tipos de
proteína G (as que tratamos aqui estão associados a proteína G do tipo GS, que
estimula a enzima adenilato-ciclase a produzir o segundo mensageiro celular, o
AMPc [da outra aula]). Sendo assim, o trajeto se dá dessa maneira:

Passo 1) O sinal (adrenalina) liga-se ao seu receptor, gerando uma mudança

conformacional.
Passo 2) a ligação faz com que haja uma mudança na subunidade GS-alfa, que irá
trocar o GDP por GTP, tornando-se ativa.
Passo 3) Uma vez ativa, a subunidade GS-alfa se dissocia, ligando-se na adenilato-
ciclase mais próxima, ativando-a também.
Passo 4) A adenilato ciclase, uma vez ativa, irá sintetizar o AMPc a partir do
substrato de ATP.
 O AMPc E A PROTEÍNA QUINASE A (PKA)
Ele age sobre a PKA (Proteína Quinase Ativa) [qual a importância da PKA? Bom, ela
tem função regulatória na síntese do glicogênio, açúcar e metabolismo de lipídios]
A PKA é uma enzima alostérica, formada por 2 subunidades regulatórias, cada uma
com 1 sítio alostérico, e 2 subunidades catalíticas, cada uma com 1 sítio ativo. O
complexo é inativo pois há, em cada subunidade regulatória, um domínio
AUTOINIBITÓRIO, que bloqueia o sítio catalítico.
O AMPc é um ativador alostérico da PKA, ou seja, quando ele se liga nas
subunidades regulatórias, causa uma mudança conformacional que afasta o
domínio auto inibitório, liberando assim as subunidades catalíticas, que se
dissociam e ficam prontas para fosforilar os substratos intracelulares.
As subunidades catalíticas, uma vez dissociadas e ativas, irão atuar sobre
diferentes enzimas e proteínas-alvo citoplasmáticas. O complexo inativo da PKA
não está solto na célula pois existe uma família de proteínas de ancoragem da
QUINASE-A (a família se chama AKAP, a-kynasis anchoring protein), que mantém a
PKA próxima a uma região ou estrutura específica na célula. A AKAP5 mantém a
PKA sempre junto da adenilato-ciclase, do receptor adrenérgico e da proteína GS-
αβγ). Isso é importante para acelerar a transdução de sinal, e explica por que sinais
diferentes podem ser mediados por 1 único mensageiro celular. O único elemento
que se dissocia do arcabouço é a subunidade catalítica da PKA, quando está
ativada, podendo fosforilar proteínas-alvo citoplasmáticas.
Outra proteína alvo da PKA é o CREB (fator de transcrição genica). A subunidade
catalítica da PKA pode entrar no núcleo e fosforilar um fator CREB, estimulando a
expressão de certos genes, como os de enzimas marcapasso de rotas metabólicas
ativadas pelo glucagon.
Lembrar que a amplificação do sinal químico é uma característica importante na
transdução de sinal, e funciona como uma pirâmide (1 molécula de adrenalina se
liga à 1 molécula de receptor, que pode ativar 10 moléculas de proteína G, que
podem ativar 200 moléculas de AMPc, que ativarão....)

BIOENERGÉTICA
É o estudo quantitativo das transduções de energia que ocorrem nas células vivas,
bem como da natureza e da função dos processos químicos subjacentes dessas
transduções.
A bioenergética segue as leis da termodinâmica, relembrando:
Primeira Lei – princípio da conservação de energia. Em qualquer transferência
física ou química, a quantidade de energia permanece constante, mesmo que a
forma de energia mude.
Segunda Lei – o universo sempre tende ao caos. Em todos os processos naturais, a
entropia do universo aumenta. (conceito de universo = sistema reagente, ou seja,
conjunto de matéria que sofre processo químico ou físico, dentro de um arredor ou
meio ambiente).
Nós, seres humanos, somos um sistema reagente aberto. Retiramos a energia dos
nutrientes, uma parte dessa energia é resgatada como energia química, capaz de
realizar trabalho biológico, como síntese de biomoléculas, transferência da
informação genética, manter o gradiente osmótico, trabalho mecânico. A outra
parte dessa energia será dissipada como calor ou entropia. Apesar de trocar
matéria/energia com o ambiente, os seres vivos nunca estão em equilíbrio com o
ambiente. As membranas plasmáticas das células são o que mantêm a constituição
e manutenção celular, possibilitando a vida.
Existem 3 parâmetros para descrevem a transformação da energia em reações
químicas, são eles:
1. Energia Livre de Gibbs – expressa a quantidade de energia útil (capaz de
realizar trabalho). ΔG é a variação de energia livre do sistema. Quando ΔG é
negativo, ocorre LIBERAÇÃO DE ENERGIA pelo sistema (exergônica). Quando
ΔG é positivo, há GANHO DE ENERGIA pelo sistema (endergônica).
Para ocorrer, as reações que têm ΔG positivo acabam se acoplando a reações com
ΔG muito negativo, possibilitando a formação do produto da rota.
A variação de G é a diferença entre a energia livre dos produtos e dos reagentes.
Quando for negativa, quer dizer que os produtos têm MENOS energia livre que os
reagentes. Quando positiva, quer dizer que os produtos têm MAIS energia livre do
que os reagentes.
Todas as reações ocorrem na direção que resulta em um DECRÉSCIMO de energia
livre do sistema.
OBS: SE A REAÇÃO NÃO APRESENTAR ΔG NEGATIVO, ELA DEVE
OBRIGATORIAMENTE LIGAR-SE A UMA REAÇÃO QUE O TENHA, DE FORMA QUE O
SOMATÓRIO DOS ΔG’s SEJA NEGATIVO.
2. Entalpia – conteúdo de calor do sistema reagente. Reflete o tipo e o número de
ligações químicas nos reagentes e produtos. ΔH é a diferença entre a energia
do ambiente usada para romper uma ligação e a energia ganha pelo ambiente
na formação de uma ligação. Quando ΔH for positivo, a reação ABSORVE calor
(endotérmica). Quando for negativo, a reação LIBERA calor (exotérmica).
3. Entropia – expressão quantitativa da aleatoriedade do sistema. Medida de
energia devido a dispersão dos produtos. ΔS positivo significa que houve um
ganho de entropia, ou seja, os produtos são MENOS COMPLEXOS e MAIS
DESORDENADOS que os reagentes.
 Para entender o conceito de entropia: Os produtos da oxidação da glicose são
devolvidos ao ambiente. Este, por sua vez, sofre um AUMENTO na entropia.
Passamos de 7 moléculas (1 solida e 6 gasosas) para 12 moléculas (6 gasosas e
6 liquidas) que serão devolvidas ao ambiente, aumentando assim a entropia!

Organismos vivos são estruturas altamente ordenadas, ricas em informação e

pobres em entropia (dada a complexidade e a não-aleatoriedade). Para
preservar a ordem interna, os organismos vivos DESORGANIZAM o ambiente,
devolvendo para ele os produtos simples e pobres em energia (e calor)
aumentando a entropia do ambiente para poder organizar-se internamente.

A relação das mudanças de energia se dá por: ΔG = ΔH – T. ΔS.

Em bioquímica, utiliza-se o DeltaG0', que é a variação de energia livre padrão, onde

a [] dos componentes é = 1 molar e o pH = 7.0

A variação de energia livre padrão está diretamente relacionada a constante de

equilíbrio. Quando o sistema não está em equilíbrio, a tendência para se deslocar
em direção ao mesmo pode ser expressa por uma força, na qual a magnitude é ΔG.

A magnitude depende de quão afastado o sistema está do equilíbrio. Ou seja, o ΔG é

a expressão quantitativa do quão afastado o sistema está do equilíbrio químico
(dada direção das reações químicas, a posição exata do equilíbrio).

A variação de energia livre padrão de uma reação química é simplesmente uma via
matemática alternativa de expressar a sua constante de equilíbrio:

ΔG 0' = -R. T. Ln. K'eq

aonde R é constante de gases, T é temperatura absoluta, ln é logaritmo natural.

Quando a constante de equilíbrio for MAIOR do que 1, o valor de ΔG será negativo.

Quando a constante for MENOR que 1, o ΔG será positivo. Quando a constante for
IGUAL a 1, ΔG será 0.

Com ΔG negativo, a Keq > 1, pois a concentração de substrato será menor que a de
produto.

Com ΔG positivo, temos energia livre do produto maior do que do substrato, e

houve ganho de energia do sistema, assim, se processará naturalmente no
sentindo P > S, e a constante de equilíbrio Keq < 1.

ADENOSINA TRIFOSFATO (FAMOSO ATP)

Moeda energética, usada para:
1. Sintetizar biomoléculas
2. Transporte ativo
3. Contração muscular e locomoção
4. Neurotransmissão
5. Bioluminescência
A transferência de energia do ATP que possibilita tais processos é resultado da sua
conversão em ADP + Pi ou AMP + 2Pi (sendo Pi o fosfato inorgânico).
Os produtos, nesse caso, são muito mais estáveis do que o substrato.
O Pi é estabilizado por ressonância, enquanto o ADP é estabilizado por ionização
(se ioniza muito rapidamente, em um meio com concentração baixa de prótons
H+).
Outro fator que favorece a hidrólise do ATP é o MAIOR GRAU de hidratação do ADP
e do Pi, o que estabiliza ainda mais esses produtos.
O ΔG da hidrólise de ATP em ADP+Pi é = -30,5kJ/mol. Lembrar que a Acetil-CoA é
um tioéster com ΔG bem negativo.
A fosforilação em nível de substrato é exemplificada pelo 1,3-bifosfoglicerato e o
Fosfoenolpiruvato que são intermediários da glicólise que produzem ATP, eles
liberam energia a partir da hidrolise do seu fosfato, ou seja, eles entregam o fosfato
para formar ATP. Além disso, temos a FOSFOCREATINA, que é a reserva de fosfato
para produção de ATP em tecidos de alta demanda energética, como o músculo
esquelético, músculo cardíaco e o cérebro.
Ainda no caso da fosfocreatina, o Pi e a Creatina são produtos estabilizados por
ressonância.

O ATP pode fornecer energia nos sistemas biológicos por 2 maneiras, transferência
de grupos (a mais comum) e por hidrólise direta.
Quando por transferência, o ATP participa covalentemente na reação enzimática,
para qual ele deve fornecer energia livre. Essas reações têm ΔG positivo, e a
transferência pode se dar nos seguintes grupos:
1. Fosforil – nós temos o substrato A + substrato B, que se unem para formar o
produto AB. Essa é uma reação endergônica que necessita a hidrólise do ATP
para fornecimento de energia. Primeiro ocorre a hidrólise do ATP, gerando
ADP e liberando o FOSFORIL, que se une covalentemente ao A, aumentando o
nível de energia da molécula. O substrato B irá então se deslocar para o grupo
fosforil, ligando-se ao substrato A no seu lugar, formando o produto AB.
2. Pirufosforil – o ATP é quebrado, o PPi é incorporado ao substrato, e o AMP é
liberado. É o caso da síntese de PRPP, intermediário importante na formação
das bases púricas e pirimídicas.
3. Adenilil – é usada quando a hidrólise do ATP em ADP +Pi não libera energia
suficiente para impulsionar a reação. É o caso da ativação dos ácidos graxos. O
ácido graxo, para se ativar, precisa ser incorporado a CoA, formando o acilcoa-
graxo. Esse processo é muito endergônico, e precisa de energia extra.
Primeiramente, hidrolisamos o ATP entre os fosfatos alfa e β, liberando
pirufosfato e AMP, que será incorporado na estrutura do ácido graxo.
Posteriormente, a CoA desloca o AMP e se liga no lugar, formando o ácido
graxo ativado. A hidrólise entre o fosfato alfa e β libera muita energia, mas não
 suficiente para promover a incorporação da CoA, e deve ocorrer
concomitantemente a hidrólise do pirufosfato em 2 fosfatos inorgânicos, que
libera quantidade extra de energia, tornando a formação do ácido graxo
energeticamente favorável.
A contração muscular é um dos poucos casos em que a hidrólise do ATP será a
fonte de energia para o processo biológico. O ATP vai ligar-se a cabeça de miosina,
promovendo uma mudança conformacional, que se desliga da actina. Ela então
catalisa a hidrólise do ATP, mudando novamente a conformação e fixando-se a
actina. O Pi é deslocado, esse deslocamento causará outra mudança
conformacional na miosina, que vai mover o filamento de actina, e o ATP é
deslocado. Assim temos a contração muscular.

Todos os ribonucleosideos-trifosfato e os desoxiribonucleosideos-trifosfato são

ENERGETICAMENTE EQUIVALENTES ao ATP. O ATP pode gerar qualquer um
desses, e vice-versa, por meio da nucleosideo-difosfato-cinase. Isso é a
TRANSFOSFORILAÇÃO.

Ele transfere seu fosfato terminal p/ enzima, que transfere então o fosfato para um
nucleosideo difosfato, gerando um nucleosideo trifosfato, e vice-versa, ou seja, o
nucleosideo pode entregar o fosfato p/ enzima, que vai entregá-lo ao ADP, que vira
ATP. A célula muscular pode ainda contar com a Adenilato-ciclase, que forma ATP
a partir de 2 ADP gerados na contração muscular intensa.

REAÇÕES DE TRANSFERÊNCIA DE ELÉTRONS

Podem ocorrer entre moléculas ou íons. As moléculas doam ou recebem 1 PAR de
elétrons, enquanto os íons doam ou recebem 1 elétron.
Durante essa transferência, a molécula ou o íon doa os elétrons para um ACEPTOR
de elétrons. Quem doou o elétron é agora o ACEPTOR, e quem recebeu está agora
em sua forma DOADORA de elétron. Cada par de molécula ou íon doador ou
receptor, forma um PAR CONJUGADO REDOX. Quem doa elétron se OXIDA, e quem
recebe REDUZ. O doador é o AGENTE REDUTOR e o aceptor é o AGENTE
OXIDANTE.
Existem 4 formas de transferência de elétrons:
1. Diretamente como elétrons: Íon ferroso p/ íon cúprico (fe2+ + Cu2+ -> Fe3+ +
Cu+).
2. Na forma de átomos de hidrogênio (um próton H+ e um elétron e-).
Desidrogenases utilizam essa forma.
3. Na forma de Íon hidreto (um próton e 2 elétrons). Desidrogenases que usam
NAD utilizam essa forma.
4. Combinação de um redutor orgânico + oxigênio, resultando num produto no
qual o oxigênio está incorporado covalentemente.
 A transferência de elétrons de um par redox para outro ocorre de acordo com a
afinidade do par pelos elétrons, que é dada pelo POTENCIAL DE REDUÇÃO
PADRÃO.
Quando o potencial é negativo, o par tem tendência a perder os elétrons. Quando o
potencial é positivo, o par tem tendência a receber os elétrons.
Quando os elétrons fluem de um par para o outro, SEMPRE há liberação de energia.
Quanto maior a variação entre 2 pares, maior a quantidade de energia liberada
pela transferência de elétrons.
As desidrogenases catalisam a maior parte das reações de oxidação de carbonos, e
precisam de COENZIMAS para funcionar, como o NAD e o NADP. Essas proteínas
são importantes e têm origem na vitamina B3 (niacina), mas podem ser
sintetizados a partir do triptofano. Essas coenzimas transportam íons hidretos.

O par NAD+NADH participa do catabolismo celular, onde o NAD será aceptor dos
elétrons.

O par NADP+NADPH participa das reações de redução, anabolismo redutor. É o

NADPH que será o fornecedor de hidrogênio para as reações anabólicas redutoras.

Outras desidrogenases trabalham com o FAD (flavina adenina dinucleotídeo), ou a

FMN (flavina mononucleotídeo). Ambos são sintetizados pela vitamina B2
(riboflavina), e ambos transportam átomos de hidrogênio.

CICLO DE KREBS (CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO)

Também chamado de ciclo do ácido tricarboxílico, ele ocorre na matriz
mitocondrial. É um processo anfibólico que faz parte do final do catabolismo
celular. O produto comum das biomoléculas é a Acetil-CoA, e é no ciclo que ela será
totalmente oxidada. A partir dos intermediários do ciclo, é possível sintetizar
lipídios, proteínas e gorduras.
1º estágio do catabolismo – produção de Acetil-CoA pelos nutrientes.

2º estágio – degradação da Acetil-CoA pelo ciclo. Aqui, há a remoção de 4 pares de

elétrons, que serão transportados pelo NAD e FAD.

3º estágio – Formação do ATP. Os elétrons, carregados pelo NADH2 e FADH2 serão

entregues na membrana mitocondrial interna, para os componentes da cadeia
respiratória, e o último aceptor desses elétrons é o oxigênio molecular, que será
reduzido a água (a maior parte do oxigênio que inspiramos é usada AQUI). Durante
o fluxo desses elétrons, libera-se a energia que será usada para formar o ATP.

A ACETIL-COA
A coenzima A possui o ácido pantotênico (VITAMINA B5). O papel dessa vitamina é
a formação da CoA. Sua deficiência é rara e associada a desnutrição.
 A Acetil-CoA doa 8 elétrons e 2 carbonos para o Ciclo de Krebs, através da
descarboxilação oxidativa! A função do ciclo é conservar a energia dessa oxidação
(na forma de ATP a nível de substrato e pela transferência de elétrons). 1 par de
elétrons é transportado pelo FAD e 3 pares pelo NAD.
Ela não é gerada apenas por oxidação de ácidos graxos, açucares que geram
piruvato e aminoácidos que geram piruvato, mas também por ETANOL e CORPOS
CETÔNICOS (aminoácidos cetogênicos). Lembrar que a degradação de corpos
cetônicos nos tecidos extra-hepáticos gera a Acetil-CoA.
A Acetil-CoA possui mais destinos além do Ciclo de Krebs, como:
1. Produção de corpos cetônicos no fígado, em jejum.
2. Formação de esteróis (colesterol) no estado alimentado, quando a quantidade
de colesterol não é suficiente para suprir o organismo
3. Pode formar ácidos graxos, como uma forma de reservar a cadeia carbonada
que vem da glicose.

VISÃO GERAL E REAÇÕES DO CICLO DE KREBS!

O ciclo começa com a incorporação do substrato inicial (Acetil-CoA) e finaliza com
a regeneração do intermediário OXALOACETATO. Podemos também observar a
produção dos produtos (2 moléculas de CO2, eliminados na expiração), a formação
das 3 moléculas de NADH2, que juntamente do FADH2, farão o transporte dos
elétrons provenientes do Acetil da Acetil-CoA, e observamos o ATP, em nível de
substrato, produzido a partir da hidrólise dessa ligação tioéster de alta energia, do
SUCCINIL-COA!!

REAÇÃO 1: CONDENSAÇÃO DA ACETIL-COA COM OXALOACETATO

Aqui existe a formação de um intermediário Citroil-CoA (que terá sua CoA
removida) e a energia liberada pela hidrólise desse tio éster impulsionará a
formação do CITRATO.
Substratos: Acetil-CoA, Oxaloacetato e H2O (da hidrólise). Produtos: Citrato.

REAÇÃO 2: FORMAÇÃO DO ISOCITRATO

Catalisada pela Aconitase, essa reação ocorre em 2 etapas. Na primeira,

desidratamos a molécula, e na segunda nós a hidratamos. O que ocorre é uma
mudança de posição entre a hidroxila e o hidrogênio. Possui ΔG positivo, e é
impulsionada pelo acoplamento com a reação seguinte (lembrar da aula de
bioenergética e acoplamento de reações)

Substrato: Citrato. Produto: Isocitrato.

OBS: A aconitase é uma enzima que existe em 2 isoformas (mitocondrial, que

participa do ciclo, e a citosólica, que tem 2 funções, 1 pra biossíntese de ac. graxos
e a outra p regular o metabolismo do ferro), ela é uma HOLOENZIMA, com grupo
prostético bem complexo. Na falta de ferro, o centro Fe-S da aconitase citosólica se
desmancha, e a porção proteica (apoenzima) acaba formando uma proteína
reguladora de ferro, que vai reprimir a produção da Ferritina (proteína que se liga
ao ferro quando no meio intracelular, funcionando como armazenamento para o
excesso de ferro) enquanto aumenta a síntese da Transferrina (responsável pelo
transporte do ferro nos tecidos). Assim, o ferro fica disponível para síntese das
ferroproteínas. Quando a concentração de Fe volta ao normal, a apoconitase se
converte em aconitase.

REAÇÃO 3: FORMAÇÃO DO α-CETOGLUTARATO (primeiro carbono e par de e-

saem)
Catalisada pela enzima isocitrato-desidrogenase, é a primeira reação de
descarboxilação oxidativa do Ciclo. O carbono do isocitrato é perdido aqui como
CO2. É também a primeira reação de desidrogenação. Aqui, o primeiro par de
elétrons será entregue ao NAD! Possui ΔG negativo, impulsionando a formação do
isocitrato e, consequentemente, o citrato.
Substrato: Isocitrato. Produto: α-Cetoglutarato.
OBS: Lembrando que NAD é NICOTINAMINA ADENINA DINUCLEOTÍDEO,
coenzima da isocitrato-desidrogenase. É derivado da NIACINA (VITAMINA B3),
presente em vários alimentos. Pode ser sintetizada a partir do triptofano, mas não
supre a demanda. A deficiência de B3 causa PELAGRA (3d) – dermatite, diarreia e
demência.

REAÇÃO 4: FORMAÇÃO DO SUCCINIL-COA (segundo carbono e segundo par de e-)

Catalisada pela α-Cetoglutarato-desidrogenase (complexo). Aqui temos a segunda
descarboxilação oxidativa, com a saída do segundo e último CO2. Além disso, é
reduzida a segunda molécula de NAD. Possui ΔG negativo, favorecendo a produção
do Succinil-CoA e a descarboxilação do α-Cetoglutarato.
Substrato: α-Cetoglutarato. Produto: Succinil-CoA.
OBS: Lembrar que o complexo enzimático acima é semelhante aos complexos
Piruvato desidrogenase da via glicolítica e alfa-cetoácido desidrogenase, da
oxidação de aminoácidos como isoleucina, valina e leucina (aminoácidos
ramificados). Todos esses são proteínas homólogas com produtos tioéster:
Succinil-CoA, Acetil-CoA e Alfa-Metilbutiril-CoA. Todos eles realizam
descarboxilação e irão reduzir uma molécula de NAD. Todos esses complexos são
formados por 3 enzimas, e cada uma usará uma coenzima. A enzima 1 (α-
cetoglutarato descarboxilase) utiliza a Tiaminapirofosfato como cofator, que é a
forma ativa da VITAMINA B1, cuja deficiência pode causar beribéri (ocorreu em
regiões onde o arroz era comido polido, pois a B1 está na casca do arroz) e
Síndrome de Wernicke-Korsakoff (alcoolismo crônico, causado por insuficiência
dietética ou deficiência na absorção intestinal da vitamina), essa síndrome causa
apatia, perda de memória, paralisia em alguns músculos oculares. A enzima 2
(transacilase) utiliza como coenzima o Lipoato, que não é derivado de nenhuma
vitamina, e é sintetizado a partir de carboidratos e aminoácidos. O ARSÊNICO e o
MERCÚRIO ligam-se aos grupos sufidril do lipoato da enzima transacilase,
inibindo-a. A enzima 3 (dihiidrolipoil desidrogenase) possui 2 coenzimas como
ajudantes. A primeira é o FAD, que transporta os 2 elétrons na forma de átomos de
hidrogênio. O FAD é formado a partir da VITAMINA B2, cuja deficiência é associada
à deficiência de outras vitaminas, e pode causar dermatite, queilose e glossite. A
segunda coenzima é o NAD, que já conhecemos.

A enzima 1 está associada ao TPP e vai catalisar os passos 1 e 2. A enzima 2,

relacionada ao Lipoato, irá catalisar os passos 3 e 4. A última enzima, associada ao
FAD, irá receber o NAD no sítio ativo, e catalisa o passo 5.

REAÇÃO 5: FORMAÇÃO DO SUCCINATO

Catalisada pela Succinil-CoA-sintetase. Aqui se forma 1 ATP em nível de substrato.
Há a formação de um GTP a partir da hidrólise dessa ligação tioéster, que libera
uma quantidade de energia suficiente de energia para unir o GDP com o Pi,
formando um GTP. Possui ΔG negativo, favorecendo a formação do Succinato e do
GTP.
Substrato: Succinil-CoA. Produtos: Succinato e GTP.
A enzima Nucleosideo-difosfato-cinase é a responsável por transferir o fosfato
terminal do GTP para o ADP, formando assim o ATP em nível de substrato.

REAÇÃO 6: OXIDAÇÃO DO SUCCINATO À FUMARATO (terceiro carbono e terceiro

par de e-)
Catalisada pela succinato-desidrogenase (a terceira desidrogenase, removendo o
terceiro par de elétrons, que o FAD recebe, virando FADH2). O Fumarato segue
então, no ciclo de Krebs. Possui ΔG igual a 0, e o que impulsiona sua formação é a
reação seguinte.
Substrato: Succinato. Produtos: Fumarato e FADH2.

REAÇÃO 7: HIDRATAÇÃO DO FUMARATO EM MALATO

Catalisada pela Fumarase. Possui ΔG negativo, garantindo a produção do Fumarato
na reação anterior e sua transformação em Malato, que segue no ciclo.
Substrato: Fumarato. Produto: Malato.

REAÇÃO 8: OXIDAÇÃO DO MALATO A OXALOACETATO (último par de e-

removidos)
 Catalisada pela Malato-desidrogenase (último par de e- removidos, entregue ao
NAD, que será reduzido). Possui ΔG positivo, e o que garante a formação do
oxaloacetato é a próxima (primeira) reação.

Tudo isso que foi descrito acima consta como 1 volta no ciclo de Krebs. Cada volta
produz, então:
2 moléculas de gás carbônico (CO2)
3 moléculas de NAD reduzido
1 molécula de FAD reduzido
1 ATP em nível de substrato

A variação de energia livre total no ciclo é NEGATIVA, o que significa que a

conversão de substratos em produtos é energeticamente favorável.
Lembrar que, no ciclo, serão usadas 2 ligações tioéster de alta energia da CoA. A
energia liberada pela hidrólise da ligação tioéster da CoA será usada para
incorporar o grupo Acetil ao Oxaloacetato, formando o citrato, e claro que,
indiretamente também, ela força a formação do Oxaloacetato pela reação anterior,
que tem um ΔG positivo. E a energia de ligação tioéster do Succinil-CoA é usada
para formar 1 ATP em nível de substrato.

O ciclo foi apenas a forma que a célula encontrou de separar os carbonos do

Acetato e da Acetil-CoA e poder resgatar uma parte de sua energia na forma de
energia química.

INTERMEDIÁRIOS DE KREBS COMO PRECURSORES ANABÓLICOS

Sim, além de fazer parte do catabolismo, os intermediários do ciclo de Krebs são
precursores ANABÓLICOS, seguindo:
a) O citrato, no fígado e no tec. adiposo, é usado para formar ácidos graxos.
b) O α-cetoglutarato, no fígado, é usado para sintetizar aminoácidos, e no cérebro
para formar glutamato. Além disso, pode ser utilizado para formar bases
PÚRICAS.
c) O succinil-CoA, na medula e no fígado, é usado para formar o grupo Heme.
d) O malato, no fígado especialmente, é usado para formar glicose
(gliconeogênese).
e) O oxaloacetato, no fígado, é usado para sintetizar aminoácidos. Além disso,
pode formar as bases PIRIMÍDICAS.
Apesar disso, não há prejuízo quando os intermediários são desviados para a
formação de outros compostos, pois eles podem ser repostos através de REAÇÕES
ANAPLERÓTICAS (reações químicas que formam intermediários de uma via
 metabólica.). A reação anaplerótica principal é aquela catalisada pela PIRUVATO-
CARBOXILASE, e ocorre no fígado, rins e tec. adiposo.

CURIOSIDADES E ANÁLISE FINAL APONTADA EM AULA

1. Há evidências de que enzimas do ciclo de Krebs podem atuar em conjunto,
como complexos supramoleculares (METABOLONS).
2. A biotina é fundamental para que o ciclo aconteça, e é produzida pela FLORA
INTESTINAL (dificílimo ter deficiência). A clara do ovo possui uma
glicoproteína da AVIDINA, que impede a absorção intestinal da biotina, apesar
disso, seria necessários 20 ovos crus por dia para haver deficiência.
3. O ATP pode se acumular quando não for consumido, e isso funciona como
inibidor do Ciclo de Krebs. Quando a célula não precisa de energia, também, o
NAD não transfere os elétrons, funcionando como inibidor do ciclo.
4. Nas células musculares, o CÁLCIO serve como ativador do ciclo de Krebs.
5. Algumas mutações em enzimas do ciclo podem resultar em doenças
gravíssimas (como o câncer): Uma mutação da Fumarase leva ao
desenvolvimento de tumores no tecido muscular liso e nos rins. Uma mutação
na Succinato-desidrogenase leva ao desenvolvimento de tumores na
suprarrenal. Defeitos genéticos nessas enzimas promovem acúmulos dos
substratos, que são considerados ONCOMETABÓLITOS, pois induzem a
expressão de um fator de transcrição genica (HIF-alfa, hypoxia-induzed-
factor), podendo gerar um quadro de PSEUDOHIPÓXIA. Outro caso seria a
mutação da Isocitrato-desidrogenase. Nos tumores de células gliais
(sustentação metabólica dos neurônios) há uma mutação nessa enzima, que
assumirá OUTRA FUNÇÃO, convertendo o α-cetoglutarato em 2-
hidroxiglutarato. Esse composto se acumula nas células tumorais, e esse
acúmulo promove a inibição da enzima HISTONA-DESMETILASE, que faz a
regulação da expressão gênica, alterando assim a regulação gênica e levando a
tumores nas células gliais.

CADEIA RESPIRATÓRIA
A cadeia respiratória se encontra na membrana mitocondrial INTERNA, e estima-
se que os seres humanos tenham 14 mil metros quadrados dessa membrana!

Os componentes da cadeia são:

1. Complexo 1 (NADH-Ubiquinona oxirredutase), formado por 43 polipeptídios

(1FMN e 6 a 7 centros de Fe-S)

2. Complexo 2(FADH2-Ubiquinona oxirredutase), formado pela enzima succinato-

desidrogenase (1 FAD e 1 centro de Fe-S), o citocromo b560 e 1 proteína
contendo centro de Fe-S

3. Coenzima Q (CoQ) ou Ubiquinona (UQ)

4. Complexo 3 (Ubiquinona-citocromo-c oxirredutase), formado por 2 citocromos
b (1 citocromo b562 e 1 citocromo b566), 1 citocromo C1 e 1 proteína
contendo centro de Fe-S (proteína Rieske)

5. Citocromo C (proteína periférica de membrana, não funciona como enzima)

6. Complexo 4 (Citocromo C oxidase), formado por 1 citocromo a, 1 citocromo a3

e 2 átomos de Cu (CuA e CuB)

Citocromos são hemeproteínas, mas há outros grupos que podem transferir esses
elétrons. Heme A e Heme B (grupos prostéticos responsáveis pela transferência
dos elétrons) estão fortemente, porém não covalentemente, ligados à proteína,
enquanto a Heme C (também grupo prostético) está ligado covalentemente à
proteína.
A coenzima Q é o único componente não proteico da cadeia, sendo uma
benzoquinona solúvel em lipídios, que possui uma estrutura hidrofóbica e
pequena, permitindo sua livre difusão dentro da membrana.

Há evidências de que, nas mitocôndrias intactas, os complexos da cadeia se

associam firmemente uns com os outros na membrana interna, formando os
RESPIROSSOMOS.

Na cadeia, existem 3 formas de transferência de elétrons:

1 – Diretamente como elétrons

2 – Na forma de átomos de hidrogênio, uma desidrogenação com FAD e FMN

3 – Na forma de íons hidreto, uma desidrogenação com NAD

Existem algumas diferenças entre os elétrons que são transportados pelo NAD e os
que são transportados pelo FAD, como veremos a seguir:

Na esquerda, vemos o esquema dos elétrons transportados pelo NADH+H+,

enquanto na direita vemos o trajeto através do FADH2. Principais diferenças:
 - Os que são carregados pelo FADH2 passam do complexo 2 para a UQ, enquanto os
que são carregados pelo NADH+H+ vão do complexo 1 até a UQ.
- A Ubiquinona é a aceptora de elétrons, no segundo esquema, enquanto esse papel
é do complexo 1, no primeiro esquema.

OS 3 SÍTIOS DE FOSFORILAÇÃO
Existem 3 pontos específicos onde podemos notar a maior diferença entre o
potencial de redução padrão entre 2 pares redox, onde ocorre a maior energia
liberada pelo fluxo de elétrons. Um sítio fica no COMPLEXO 1, um no COMPLEXO 3
e outro no COMPLEXO 4.
A energia obtida por esse fluxo serve para impulsionar os prótons para o espaço
intermembrana, formando o gradiente eletroquímico utilizado na formação do
ATP.
Cada NADH + H+ vai entregar 1 par de elétrons para o COMPLEXO 1, e cada par irá
bombear energia de 4 prótons pelo complexo 1, 4 prótons pelo complexo 3 e 2
prótons pelo complexo 4. Isso tudo bombeado pela energia de 1 par de elétrons!!
No FAD, temos o bombeamento de 4 prótons pelo complexo 3 e 2 prótons pelo
complexo 4. Sabe-se que cada 4 PRÓTONS = 1 ATP. Portanto, cada NADH + H+ irá
formar 2,5ATP, e cada FADH2 formará 1,5ATP.

NÃO ESQUECER: Cada volta no ciclo de Krebs gerará 10 ATP = 7,5 dos NAD, 1,5 do
FAD e 1 do Succinil.

MONÓXIDO DE CARBONO E CIANURETO

A cadeia respiratória pode sofrer ação de alguns inibidores, como o monóxido de
carbono e o cianureto, por exemplo. Ambos se ligam no COMPLEXO 4 da cadeia,
bloqueando a passagem de elétrons para o oxigênio. Assim, o oxigênio fica na
forma oxidada e o resto da cadeia fica na forma reduzida, consequentemente,
impedindo a formação do ATP.

FORMAÇÃO DO NAD, FAD E A LANÇADEIRA DE ELÉTRONS

A formação do NAD e FAD reduzidos não ocorre apenas no ciclo de Krebs. As
desidrogenases que contém FAD como último aceptor de elétrons estão associadas
a membrana mitocondrial interna, daí o FAD reduzido doa os elétrons diretamente
para a Ubiquinona. No caso das desidrogenases que trabalham com o NAD, o NAD
reduzido doará os elétrons para o complexo 1 da cadeia, no entanto, o complexo só
aceitará elétrons produzidos no interior da mitocôndria, além disso, a membrana
interna mitocondrial é impermeável ao NADH.
Assim, para que os elétrons do NAD da glicólise possam passar (já que,
normalmente, não passariam), eles utilizam o sistema de lançadeira de elétrons.
Existem 2 sistemas assim:
1. Malato-desidrogenase, que ocorre no fígado e no coração, utilizando 2
isoformas da enzima (uma citosólica e outra mitocondrial). A primeira
converte o oxaloacetato em malato a partir dos elétrons da via glicolítica, então
o malato atravessa a membrana interna, para que em seguida a segunda
enzima oxide o malato em oxaloacetato novamente, produzindo o NADH
reduzido, que irá então entregar os elétrons.

2. Glicerol-3-Fosfato, que ocorre no músculo esquelético e no encéfalo. Nesse

sistema, o NADH da via glicolítica irá entregar os elétrons para um
intermediário da glicólise (diidroxiacetona fosfato), que será reduzida em
glicerol-3-fosfato. Uma vez possuindo os elétrons, essa enzima irá entregá-los
para sua isoforma mitocondrial, que tem 1 FAD como grupo prostético. Esse
FAD então ficará reduzido, e passará os elétrons para a Ubiquinona, que vai
percorrer o caminho normal.
 Quando falamos em uma quantidade de energia produzida pela glicólise aeróbica,
sempre existirá uma diferença de ~36-38 ATPs gerados, e isso se dá pelo tipo
diferente de sistema de lançadeira que será usado!

FORMAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DO OXIGÊNIO DURANTE Φe-

Entre 0,1 e 4% do oxigênio utilizado na respiração formam um radical superóxido,
que por sua vez é altamente reativo, podendo gerar um radical hidroxila.
Nós temos sistemas que trabalham em conjunto para impedir a ação desses
radicais, que comumente são formados na cadeia respiratória. Apesar disso,
problemas podem ocorrer quando há o STRESS OXIDATIVO, ou seja, quando há
mais elétrons disponíveis para entrar na cadeia do que o suficiente para reduzir o
O2 em água, gerando dano celular.
Em situações de hipóxia, há um desequilíbrio entre a entrada de elétrons e a
transferência deles para o oxigênio, levando a formação de espécies reativas. Além
dos sistemas enzimáticos, o corpo pode reagir de outras maneiras:

1. Quando em condições de baixa pO2, temos a síntese de um fator de transcrição

gênica induzível por hipóxia (HIF-1), que irá aumentar a transcrição de
enzimas e proteínas que levam a alguns ajustes metabólicos importantes:

➔ Aumento na captação de glicose pela célula; aumento da via glicolítica até o

lactato; diminuição na produção de Acetil-CoA, e consequentemente
➔ Aumento na produção de ATP pela glicólise anaeróbica; diminuição no
ciclo de Krebs e menor fluxo de elétrons pela cadeia;
➔ Indução da síntese da COX4-2, uma subunidade do complexo 4 que possui
mais afinidade pelo oxigênio, ou seja, está melhor adaptada a ele.
Assim, a HIF-1 reduz a formação de ERO (espécie reativa do oxigênio).

2. O Heme B, do complexo 2, também auxilia na proteção contra a formação de

EROS, porém, não está envolvido com transferência de elétrons. Ele protege
contra a formação de espécies reativas ao reduzir a frequência com que os
elétrons vazam para fora do sistema, movendo-se direto do succinato para o
02. Pacientes com mutação nas subunidades do complexo 2 perto do Heme B
ou no sítio de ligação da Ubiquinona sofrem de PARAGANGLIOMA
HEREDITÁRIO, que se caracteriza por um tumor benigno da cabeça e do
pescoço, resultando em maior quantidade de EROS e maior dano ao tecido
 Representação do Heme B atuando na
passagem dos elétrons do Succinato para
a Ubiquinona.

O PAPEL DO CITOCROMO C NA APOPTOSE

Sabemos que a apoptose ocorre em situações na qual a célula representa um
perigo ao organismo (stress oxidativo por exemplo). As mitocôndrias têm um
papel fundamental no apoptose, pois, quando é dado
o sinal para que o evento aconteça, há um aumento na
permeabilidade da membrana mitocondrial. Assim, os
citocromos C “vazam” para o citosol, onde irão reagir
com uma protease chamada APAF, formando uma
estrutura que conhecemos como APOPTOSSOMO.
Esse, por sua vez, irá ativar uma protease chamada
CASPASE-9, que promoverá a ativação de outras
caspases, enzimas proteolíticas que irão degradar
proteínas e, indiretamente, degradar o DNA da célula.
Esquema escrito e desenhado do papel do citocromo
C na célula em apoptose.
FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA
Aqui iremos tratar da formação do ATP na respiração celular. Como sabemos, a
liberação de energia para formação do ATP é proporcional a diferença do potencial
de redução entre os pares. Sabemos também da existência de 3 sítios de
fosforilação na cadeia respiratória: Complexo 1, 3 e 4.
Os prótons desses sítios acabam por gerar um gradiente ELETROQUÍMICO!!
Elétrico pois aumenta o número de cargas positivas no espaço intermembrana (a
matriz + membrana interna ficarão mais negativas) e químico pois a concentração
de prótons H+ é maior no espaço intermembrana, deixando-o mais ácido, à medida
que a membrana interna ficará mais básica.
A energia inerente a essa diferença de concentração representa uma forma de
conservar a energia do fluxo de elétrons da cadeia, e essa energia é chamada de
FORÇA PRÓTON-MOTRIZ, que será utilizada na formação do ATP.

A FOF1-ATP OU ATP-SINTASE OU COMPLEXO 5 DA CADEIA

É a enzima responsável pela síntese do ATP. É um complexo multiproteico integral
de membrana. Constituída por 2 componentes:
1. F1 – similar a uma maçaneta de porta, com diversas subunidades (aqui as
subunidades β contém o sítio ativo).
2. FO – possui o canal de prótons H+, por onde os prótons irão retornar para a
matriz mitocondrial, gerando o ATP.
O MODELO QUIMIOSMÓTICO
É o modelo mais aceito até hoje para explicar a formação de ATP através dos
componentes da cadeia respiratória. Segue a ideia:
O fluxo de elétrons libera energia devido ao potencial de redução dos
componentes, e essa energia é utilizada para bombear H+ da matriz para o espaço
intermembrana. O retorno dos prótons (força proton-motriz) se dá pelo
componente FO da enzima, quando a diferença eletroquímica é tão grande que
força o retorno dos prótons, liberando energia para síntese de ATP a partir de ADP
+ Pi.
F1 é formado por 3 pares de subunidades α-β alternados, como um gomo de
bergamota (vide a imagem acima). A subunidade γ é o eixo da berga, e contém um
domínio que interage com os sítios ativos (1 sítio pra cada β) existentes.
É possível que a subunidade β exista em 3 conformações:
1. β-vazio – sítio O, de baixíssima afinidade e cataliticamente inativo
2. β-ADP – sítio light, baixa afinidade e cataliticamente inativo
3. β-ATP – sítio tight, alta afinidade e cataliticamente ativo

A CATÁLISE ROTACIONAL
Para alternar entre os sítios, contamos com o mecanismo de catálise rotacional,
gerando a interconversão desses sítios!

Sítio O -> Sítio L -> Sítio T -> Sítio O, e assim funciona o esquema:
 O novo sítio T (antigo L) irá unir o ADP + Pi, formando o ATP, e ficará como sítio T
até que haja, novamente, o retorno de prótons, liberando energia e mudando
novamente os estados! O sítio O é o que libera o ATP, pois não tem afinidade
alguma por ele.

Bom, sabemos que 4 prótons formam 1 ATP, e vimos que são necessários 3
prótons voltarem na força motriz para gerar o ATP, então aonde está o quarto
próton? (perguntei por que exatos 4, Cyntia disse que foi papai do céu!!)
O quarto próton é necesário para transportar o Pi para a matriz mitocondrial. Esse
Pi foi gerado pela hidrólise do ATP em ADP + Pi lá no citosol. A membrana é
impermeável a moléculas polares, então possuimos a fosfato-translocase, que
permite o transporte do Pi junto do quarto próton. O Pi une-se ao ADP, quando
houver o retorno dos 3 prótons. O ATP então formado, é exportado para o citosol
juntamente com a importação de um ADP, que funcionará para a próxima junção
com Pi. Esse transporte é realizado pela adenina-nucleotideo-translocase.

A PRODUÇÃO DE GORDURA MARROM

Já pensou o que aconteceria com a energia armazenada no gradiente de prótons se
ela não fosse usada para sintetizar ATP ou realizar outro trabalho celular?
Ela seria liebrada em forma de calor! Temos algumas células que usam
especificamente o gradiente de prótons para gerar calor no nosso corpo.
A gordura marrom, que se caracteriza por ter adipócitos menores do que os da
gordura branca, além deles serem repletos de mitocôndrias, sendo um tecido mais
irrigado e mais inervado.
As mitocôndrias da gordura marrom possuem uma proteína chamada
TERMOGENINA, ou proteína desacopladora. A oxidação completa de ácidos graxos
nesse tecido irá formar NAD e FAD reduzidos, que irão entregar seus elétrons para
a cadeia respiratória, tudo normal até aqui. Acontece que, o retorno desses prótons
se dá pela termogenina ao invés de FO, e a energia do gradiente é dissipada como
calor, mantendo o corpo aquecido! Alguns dados:
1. No nascimento, a gordura marrom é igual a 1-5% da massa total. No adulto
jovem, esse valor não chega a 0,1% da massa corporal.
2. “Desacopladora” pois a termogenina desacopla a fosforilação oxidativa da
cadeia respiratória, desfazendo o gradiente eletroquímico de prótons gerado
pelo transporte de elétrons.
3. O 2,4-dinitofenol (DNP) é um ionóforo de função semelhante, que foi utilizado
nos EUA como remédio para perda de peso. Contudo, seu uso foi banido após
resultar em casos fatais.
 MUTAÇÕES NO GENE MITOCONDRIAL
Bom, o DNA mitocondrial possui 37 genes, 13 dos quais codificam para as
proteínas da cadeia respiratória e para a ATP-sintase, e os demais codificam rRNAs
e tRNAs. Cada célula possui centenas de mitocôndrias, e cada uma delas pode ter
até 5 cópias do DNA mitocondrial. Algumas mutações nesses genes podem causar
as seguintes doenças:
1. Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (LHON) – causada por um defeito no
gene ND4 (complexo 1), afetando o SNC e causando perda da visão bilateral
por falta de ATP para o metabolismo de neurônios.

2. Epilepsia Mioclônica e Doença das Fibras Vermelhas Dilaceradas (MERRF) –

causada por uma mutação no gene leucil-RNAt, gerando um defeito
generalizado nas proteínas com resíduo de Leucina, fazendo com que o
paciente apresente fraqueza muscular, alargamento e deterioração do
miocárdio, pelo formato anormal das mitocôndrias.

O CITOCROMO P450
Os sistemas não fosforilantes de transporte de elétrons existem com a finalidade
de hidroxilar diferentes compostos através da ativação do oxigênio por um
citocromo especializado, o P450!
O citocromo refere-se a uma família de hemeproteínas catalíticas presentes em
bactérias, fungos, plantas, insetos, peixes, mamíferos e primatas que catalisam a
monoxigenação, em uma série de substâncias endógenas ou exógenas.
CIP450 são proteínas integrais de membrana, encontradas no retículo
endoplasmático liso ou na membrana mitocondrial interna de mamíferos. Essas
proteínas contém um grupamento heme, e o ferro pode formar até 6 ligações
(como vimos no estudo de hemeproteínas, 4 ligações com Nitrogênios pirrólicos, 1
ligação com o SH da cisteína C-terminal e 1 ligação com O2 molecular, CO, NO ou
H2O. O CO se liga com mais afinidade que o 02, inibindo o CIP450).
O termo CIP450 existe pois quando o CO se liga à forma ferrosa da heme, o
espectro de absorção apresenta um pico de 450 nanômetros.

LOCALIZAÇÃO CELULAR E TECIDUAL

7 das 57 isoformas do CIP450 se encontram nas mitocôndrias, enquanto as outras
50 se encontram no REL. Isso serve para todas as células de mamíferos, exceto as
musculares e as hemácias, que não possuem CIP450.
 A maioria das isoformas se encontra no lado citoplasmático do REL de hepatócitos,
células renais e adrenocorticais, ovarianas e testiculares, além de células do trato
respiratório.

FUNÇÕES DO CIP450
1. Produção de hormônios esteroides (incluindo a forma ativa da vitamina D3)

2. Metabolismo de ácidos graxos, sais biliares, prostaglandinas, leucotrienos e

retinoides

3. Inativação ou ativação de agentes terapêuticos

4. Conversão de substâncias químicas ingeridas, inaladas ou absorvidas pela pele,

em moléculas altamente reativas, os quais produzem danos celulares
indesejados, como mutações e morte celular

5. Inibição e indução enzimática, resultando em interações droga-droga e efeitos

adversos.

Os sistemas CIP450 oxidam compostos lipofílicos, tornando-os mais polares e

solúveis no ambiente aquoso da célula e, se for o caso, facilitando sua excreção
pelo intestino, rins ou bile.

REAÇÃO GERAL E NOMENCLATURA

Segue a ideia:
NADPH + H+ + O2 + SH -> NADP+ + H2O + SOH
O NADPH está agindo como doador de elétrons, e o SH é substrato aqui. 1 átomo de
oxigênio está sendo incorporado ao substrato (monoxigenação).
Sabemos que podem ser diferentes os substratos, como:
1. Endógenos – colesterol, esteróis, prostaglandinas, ácidos graxos
2. Exógenos – compostos químicos, contaminantes ambientais, aditivos
alimentares que possuam grupos substitutivos para sítios de oxigenação
[alcano, alceno, anel aromático e anel heterocíclico])
Como existe um grande número de CIP450 já identificados, fizemos uma
nomenclatura específica baseada na sequência de aminoácidos. Funciona assim:

Família recebe = CYP + numeral arábico (para participar de família a sequência

deve ter identicidade >40%) CYP1, CYP2, CYP3.

Subfamília recebe = + LETRA MAIÚSCULA (identicidade >55¨%) CYP1A, CYP1B.

Membro recebe = + NUMERAL ARÁBICO, CYP1A1, CYP1A2.

 Lembrando que são 18 famílias e 41 subfamílias, e a principal envolvida no
metabolismo de fármacos é a CYP1A4.

COMPONENTES DO SISTEMA
Aqui, vamos dividir o sistema em duas partes:
1. Microssomal – aqui temos a CIP450-redutase, enzima que fará a transferência
de elétrons do NADPH para o CIP450, sendo que é preciso também uma ligação
com o substrato para que isso ocorra. Quando há a ligação, uma mudança
conformacional ocorre, junto do grupo Heme, tornando o potencial de redução
mais positivo (de -300mV para -230mV). Essa enzima possui 1 FAD e 1FMN
como grupos prostéticos. O FAD irá receber os elétrons e então passar 1 por
vez para o FMN, que vai transferir para o grupo Heme do CIP450 (lembrar, 1
elétron por vez!)

2. Mitocondrial – esse será formado pela Adrenodoxina-redutase, 2 cópias da

proteína Adrenodoxina (cada uma com um centro de Fe-S) e 1 CIP450. Os
elétrons do NADPH são transferidos para o FAD da Adrenodoxina-redutase,
que então passará 1 elétron por vez para as adrenodoxinas, que vão passá-los
adiante para o CIP450. As adrenodoxinas formam uma ponte entre a redutase
e o CIP450
SEQUÊNCIA DE REAÇÕES DO CIP450 MICROSSOMAL
1. O substrato vai se ligar ao CIP450, aumentando a afinidade do Heme pelo e-
2. O NADPH transfere o e- para a CIP450-redutase
3. O e- vai para o Heme do CIP450
4. Agora, o ferro no estado ferroso pode se ligar ao O2 molecular
5. O O2 recebe o elétron temporariamente, formando um radical superóxido
6. O FAD transfere o segundo elétron para o FMN e depois para o O2
7. A molécula se rompe, dando 1 oxigênio para o substrato, formando um
produto hidroxilado, e o outro oxigênio será reduzido à H2O
METABOLISMO DE XENOBIÓTICOS (SUBSTÂNCIAS EXÓGENAS) E
INTERAÇÃO DROGA-DROGA
A CYP3A4 metaboliza aproximadamente 50% dos fármacos, e está expressa no
sistema gastrointestinal e no fígado.
Como os CIP450 são de ampla especificidade, um composto pode ser metabolizado
por mais de 1 CIP, em diferentes locais e células.
Existem 2 vias para metabolizar xenobióticos:
1. Fase I - Funcionalização oxidativa – um grupo funcional como hidroxila é
introduzido em, ou exposto na droga, pelo CIP450 (ou outras enzimas como
desidrogenases, oxidases, redutases e hidrolases)

2. Fase II - Biosintética – esse grupamento funcional vai ser ligado a outro, como
o ácido glucurônico, sulfato, glutationa, aminoácidos ou acetato.

O CIP450 participa da primeira fase, e o xenobióticos pode ser metabolizado por

qualquer uma delas, ou por ambas. O resultado é tornar o composto mais solúvel
em água, facilitando sua eliminação pelos rins (geralmente), e pelos intestinos (via
bile)

O metabolismo pela CYP pode induzir 3 efeitos:

1. Inativação – a substância injetada, inalada ou ingerida, é inativada, diminuindo
sua biodisponibilidade (fármaco) ou efeitos adversos (quando o xenobióticos é
danoso ao sistema). Exemplo: Diazepam (Valium), que é convertido em
Oxazepam (sua forma inativa) ao passar pelo CIP.
2. Ativação – substâncias biologicamente inativas são convertidas na sua forma
ativa. Exemplo: a forma inativa do antialérgico terfenadina (SELDANE), que
vira Fexofenadina, sua forma ativa.
3. Formação do metabólito tóxico – forma-se como consequência inesperada do
processo. Exemplo: grandes doses de Paracetamol, que levam a produção do
NAPQI, um metabólito tóxico que lesa o hepatócito.

Temos ainda as interações droga-droga, que são efeitos indesejados quando os

níveis de CIP450 são induzidos ou inibidos por outras drogas.
- Substâncias indutoras formam os CIPS que as metabolizam (chamamos de
tolerância farmacocinética)
- Substâncias inibidoras irão inativar os CIPS
Se drogas indutoras ou inibidoras forem administradas com outras drogas que são
normalmente metabolizadas pelas CIPS, haverá uma alteração no tempo de vida
dessas drogas, ou seja, no seu metabolismo CIP. Isso gera uma preocupação
enorme em pacientes que tomam uma combinação de drogas, já que pode haver
efeitos adversos e inesperados.
Certas drogas são dependentes do mesmo CIP para seu metabolismo. Assim, a
inibição dele levaria a um acúmulo da droga original, tornando-a tóxica. Enquanto
isso, a indução levaria a um supermetabolismo da droga, gerando concentrações
pouco efetivas, e reduzindo o efeito terapêutico.
Alguns exemplos:
Indução - CYP2E1 é induzida pelo álcool, que é também seu substrato. Portanto, o
consumo de etanol interfere nesse metabolismo.

CYP3A4 é induzida pela erva de são João (fitoterápico). Quando associada a

antidepressivos de HIV, com o imunossupressor ciclosporina e com
anticoncepcionais, reduz a eficácia desses medicamentos.

Inibição – CYP3A4. A terfenadina é metabolizada por ele, no fígado. Indivíduos que

usam terfenadina associada com antibiótico eritromicina ou cetoconazol, que são
fortes inibidores do CIP, apresentam altos níveis plasmáticos de terfenadina. A
terfenadina inibe canais de potássio no coração, ocasionando problemas cardíacos.
A fexofenadina, metabólito ativo da terfenadina, é o princípio ativo do ALEGRA.