ANÁLISE INSTRUMENTAL

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

Profa. Dr. Jacir Dal Magro

 Cromatografia líquida de alta eficiência –
CLAE (ou HPLC)
HPLC é uma forma de cromatografia
líquida usada para separar compostos
que são dissolvidos em solução. Os
instrumentos de HPLC consistem em
um reservatório de fase móvel, uma
bomba, um injetor, uma coluna de
separação e um detector.

Varian® Pro-Star HPLC system

• A Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE) é uma
técnica de separação. É um dos
métodos analíticos mais
utilizados para fins qualitativos e
quantitativos.
 Cromatografia em coluna - um exemplo do equipamento usado em cromatografia líquida de
baixa performance

Solvente

Cabeça da coluna
Coluna

Empacotamento

Placa de vidro pososo

‚Amostra é geralmente aplicada no topo da coluna na forma de pastilha e a detecção é fieta

visualmente ou pela análise posterior de cada fração. Ex.: Separação e identificaçãode produtos
naturais
Cromatografia líquida de alta performance (HPLC)

- Métodos de LC que usam material de suporte pequeno, uniforme com diâmetro entre
3-10 mm
- Boa eficiência do sistema pequenas
alturas de pratos teóricos
- Colunas podem tolerar alta
pressões de operação e vazões mais rápidas
Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (CLAE ou
HPLC)
Cromatografia líquida de alta performance
vantagens:
- tempo de análise CURTO
- GRANDE automação
- bons limites de detecção
- escolha preferida para aplicações analíticas
- popular para o trabalho de purificação

desvantagens:
- Técnica cara
- Relativamente baixa capacidade de amostra
- Técnico especializado e treinado
Importância do dos eluentes na eficiência de separação

Retenção e eluição de solutos em CL depende das interações dos solutos com as

fases móvel e estacionária.

Fase móvel forte: um solvente que rapidamente elimina solutos da coluna (ou seja,
pequeno k ) (Quando a fase móvel é muito semelhante à fase estacionária em
suas interações intermoleculares com os solutos)
Ex.: Um solvente polar seria uma forte fase móvel para uma coluna contendo uma
fase polar estacionária, solvente fraco o inverso.

Uma separação pode ser feita em

mmiutos
Semelhante ao GC, os solutos podem ser eluídos de uma coluna usando condições de
coluna constantes ou eluição de gradiente

Eluição de gradientes: alteração da composição da fase móvel com o tempo, passando de

uma fraca fase móvel para uma forte.
Fase móvel fraca - solvente A
Fase móvel forte - solvente B
Mudança de solvente pode ser gradual, linear ou não linear
 Phosphoserine

Exemplo: Gradiente de
eluição de uma mistura
de 30 aminoácidos

Lysine
Tipos de Cromatografia Líquida

Assim como a CG classificada de acordo com o método de separação de solutos

Cromatografia de adsorção ‚Cromatografia de afinidade ‚Cromatografia de partição
Cromatografia por exclusão de tamanho e Cromatografia de troca iônica
Cromatografia de Partição é o mais importante entre os demais
Separa os solutos com base na sua partição entre uma fase móvel líquida e uma fase
estacionária líquida revestida em um suporte sólido.

Mobile phase

Material de suporte - normalmente é sílica, envolvida na fase estacionária líquida não

solúvel na fase móvel

Existem dois tipos principais de cromatografia de partição com base no tipo

de fase estacionária:

Cromatografia líquida de fase normal

Cromatografia líquida de fase reversa
Cromatografia líquida de fase normal (CLFN).

- Cromatografia de partição onde a fase estacionária é polar

Coluna de CLFN retém fortemente compostos polares
- Fase móvel fraca é um líquido não polar: solvente orgânico
- Forte fase móvel é um líquido polar: água ou metanol

Fases estacionárias comuns quimicamente ligadas ao suporte

Si CH2CH2CH2CN
CN Cianopropil

Si CH2CH2CH2NH2
NH2 Aminopropil

Si CH2CH2CH2NHCH2CH2NH2
PSA N-propiletilenediamina
 Cromatografia líquida de fase reversa (CLFR).
- Cromatografia de partição onde a fase estacionária é não polar
- Polaridade reversa da fase normal CL, retém os compostos não-polares mais
fortemente;

- Fase móvel fraca é um líquido polar: água;

- Fase móvel forte é mais líquido não polar: metanol ou acetonitrila

Comparison of RPLC & NPLC

Tipo Fase estaionária Fase móvle fraca Fase móvel forte
CLFR Não-polar Polar Não-polar
CLFN polar Não-polar Polar
Use fases estacionárias quimicamente anexadas ao suporte, C8 e
C18 são mais comuns

Si C18H37
C18 Octadecil

Si C8H17
C8 Octil

Si C2H5
C2 Etil

Si
CH Ciclohexil

Si
PH Fenil
Comparação entre CLFN e CLFR
Aplicações comuns de CLFR
- Purificação de compostos biológicos e orgânicos presentes em soluções aquosas
- Análise farmacêutica (quantificação de medicamentos e controle de qualidade)
- Mapeamento de proteínas e peptídeos
- Análises de amostras de solo e água – Ex. poluentes emergentes
- Análises clínicas de amostras de sangue e urina

http://www.sielc.com/Application-HPLC-Separation-of-Drugs.html
 Poluentes Emergentes na Região Oeste de Santa Catarina

Distribuição dos pontos de coleta de águas superficiais (pontos pretos) e subterrâneas (pontos brancos)
 4 RESULTADOS e DISCUSSÃO

Resumo geral poluentes emergentes

Frequência
Composto Sigla N N > LQ Mín μg/L Máx μg/L
(%)
Ibuprofeno IBU 117 2 0,30 0,35 1,7
Cetoprofeno KTP 117 13 0,27 1,80 11
Naproxeno NPX 117 16 0,60 3,0 14
Acetaminofeno ACM 117 8 0,42 13,5 6,8
Tetraciclina TC 117 8 0,47 4,12 6,8
Oxitetraciclina OC 117 79 0,12 4,68 68
Prednisona PRE 117 - - - -
Hexestrol HEX 117 - - - -
Estrona E1 117 13 0,18 53,85 11
Estradiol E2 117 23 1,28 79,81 20
Estriol E3 117 1 63,38 63,38 0,85
Etinilestradiol EE2 117 25 0,31 55,53 21
Cafeína CAF 117 54 1,64 1,70 46
Coluna por troca iônica
- Remoção ou substituição de compostos iônicos em amostras
(pré-tratamento da amostra)
- Separação de íons inorgânicos e íons orgânicos
- Análise / purificação de compostos biológicos carregados
‚aminoácidos, proteínas, peptídeos, ácidos nucléicos
Cromatografia por Exclusão: separa as moléculas de acordo com as diferenças de
tamanho

Aplicações comuns:
- Separação de Moléculas Biológicas (por exemplo, proteínas de peptídeos)
- Separação / análise de polímeros orgânicos
- determinação do peso molecular

https://www.sigmaaldrich.com/technical
-documents/articles/reporter-us/size-
exclusion-columns-biomolecule.html
Detectores
Tipos comuns de detectores para CL:
‚Detector de índice de refração‚ Detector de condutividade, Detector de Absorbância
UV / Vis‚ Detector Eletroquímico‚ Detector de Fluorescência

Detector Selectividade Sensibilidade Princípio

índice de refração Pobre Pobre Qualquer componente que difere no índice de refração do
eluente pode ser detectado, apesar de sua baixa
sensibilidade. Não pode ser usado para realizar análise
com gradiente de polaridade.
UV/Vis Moderado Bom É possível detectar uma grande variedade de substâncias
que absorvem luz de 190 a 900 nm. A sensibilidade
depende fortemente da molécula. Porque?

Fluorescencia Bom Muito bom Moléculas emissoras de fluorescência podem ser

detectados seletivamente com alta sensibilidade. Isso é
frequentemente usado para derivatização pré-coluna e pós-
coluna.
Conductividade Moderado Bom Componentes ionizados são detectados. Este detector é
usado principalmente para cromatografia de íons.
Eletroquímico Bom Muito bom São detectadas correntes elétricas que são geradas por
reações elétricas de oxidação-redução. Componentes
eletricamente ativos são detectados com alta sensibilidade.
Detector por índice de refração (RI)
Mede a capacidade geral da fase móvel e seus solutos para refratar ou dobrar a luz.
‚Um dos poucos detectores universais disponíveis para LC

Principal vantagem:
- Não destrutivo para a amostra e universal para detecção de qualquer soluto em CL.

desvantagens:
- limites elevados de detecção em relação aos demais
- Não se pode usar com gradiente solvente
Detector de Absorção UV / Vis
Mede a capacidade dos solutos de absorver luz em um determinado comprimento de onda na
faixa de comprimentos de onda ultravioleta (UV) ou visível (Vis). Juntamente com índice
de refração, é o detector mais comum na CL.

Três tipos comuns de detectores de absorbância UV / Vis

Detectores de comprimento de onda fixos (Usualmente 254 nm)
Detectores de comprimento de onda variável (190-900 nm)
Detectores de arranjo de fotodiodos
 Detector por arranjo de diodo - DAD
O pera monitorando simultaneamente a absorbância de solutos em vários
comprimentos de onda.
Espectro completo de cada analito pode ser obtido em um período mínimo de tempo
Possui maior confiabilidade na identificação do analito em virtude da possibilidade de
obtenção do espectro eletromagnético
 Aplicações para Detector UV-Vis

- Os detectores de absorbância UV / Vis podem ser usados para detectar qualquer

substância que absorva no comprimento de onda que está sendo monitorado;

- Comprimentos de onda comuns: - 254 nm para compostos orgânicos insaturados

- Os detectores de absorvância podem ser usados com eluição gradiente.

- Os limites de detecção para detectores de absorvância UV / Vis fixos e variáveis são de ~

10-8 Mol/L

- Os limites de detecção para detectores de arranjo de fotodiodos são ~ 10-7 Mol/L

Detector por Fluorescência

Pode ler moléculas eluidas que possuem fluorescencia em um determinado comprimento de

onda de excitação e emissão

Características:
- Fluorescência pode ser usada para detectar seletivamente qualquer composto que absorva e
emite luz no conjunto escolhido de comprimentos de onda de excitação e emissão
- Relativamente poucos compostos sofrem fluorescência
- Alta seletividade

- Aplicações típicas: Drogas, aditivos alimentares, poluentes ambientais......

Qualquer composto que possa ser convertido em um derivado fluorescente: álcoois, aminas
aminoácidos e proteínas, etc.

Requer fases móveis extremamente puras

Detector por condutividade elétrica
Utilizado em aplicações analíticas de cromatografia de troca iônica para a detecção de
compostos iônicos, o detector mede a capacidade da fase móvel de conduzir uma
corrente quando colocado em uma célula de fluxo entre dois eletrodos, corrente
conduzida dentro da célula dependerá do número e tipos de íons presentes na fase
móvel

Quando os íons fluem para a célula do sensor, a impedância entre

os eletrodos mudam produzindo um sinal

Aplicações:
Pode ser usado para detectar qualquer composto que seja iônico ou fracamente
iônico como componentes de alimentos, amostras de efluentes industriais e
amostras ambientais
Detector Eletroquímico
Usado para monitorar qualquer composto na fase móvel que pode sofrer uma oxidação ou
redução.
Possui eletrodos que monitoram a corrente que é produzida pela oxidação ou redução de
compostos eluentes a um potencial fixo.

Os detectores podem ser específicos para um determinado composto ou classe de compostos, escolhendo
adequadamente as condições nos eletrodos.
‚Alta seletividade, baixo ruido
Compostos que podem ser detectados por redução: Aldeídos, Cetonas, Ésteres e compostos
insaturados

Compostos que podem ser detectados por oxidação: Fenóis, Mercaptanas (RSH), Aminas aromáticas,
compostos di-hidroxi.

- Limites de detecção para um detector eletroquímico são ~ 10-11 Mol/L

 Ionização por Eletronebulização (ESI)
• Nesta técnica, uma pequena quantidade de mistura amostra-solvente (defácil volatilização) é percolada
num capilar (de aço inoxidável ou vidro) no qual se introduz um eletrodo.
• O alto campo elétrico criado na ponta do capilar causa a emissão de pequenas gotas carregadas.
• O solvente nessas gotas se evapora durante o "spray" formando uma camada seca de pequenas partículas
(≅ 1 μm de diâmetro) sobre o suporte metálico.
Espectrometria de massas – ESI

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Skoog, 2009
Quantificação:
Calibração Externa
 Quantificação:
Calibração Interna
Uma substância conhecida (Padrão Interno - PI) é adicionada em concentração definida
em todos os padrões e nas amostras e elui em tempo diferente da amostra.
A curva de calibração é baseada na relação entre as áreas e concentrações do PI e da
substância de interesse

Exemplo: Quim. Nova, Vol. 32, No. 5, 1338-1341,

2009
 Calibração Interna
Exemplo: Quim. Nova, Vol. 32, No. 5, 1338-1341, 2009