BEATRIZ PARZEWSKI NEVES

O uso da vagina artificial interna para a coleta de

sêmen de touros bubalinos (Bubalus bubalis) com
diferentes experiências sexuais

Trabalho apresentado à Escola de Veterinária da

Universidade Federal de Minas Gerais, como
requisito parcial para obtenção do grau de Mestre
em Ciência Animal.

Curso: Ciência Animal

Área: Reprodução Animal
Orientador: Prof. Marc Henry

Belo Horizonte
Escola de Veterinária - UFMG
2015

1
2
3
4
Dedico esse trabalho à minha família,
aos meus pais, Egberto e Rosangela,
meu porto seguro,
aos meus irmãos, Mariana e Pedro,
meus verdadeiros cúmplices.

5
6
 AGRADECIMENTOS

Aos meus pais pelo exemplo e pela dedicação, que me permitem continuar a sonhar. Aos meus
irmãos, que foram meu apoio e minha torcida mesmo na distância. Sem vocês eu não seria nada.

Ao Adriano, minha calmaria, por todo apoio, carinho e paciência, foi essencial.

Aos órgãos de pesquisa CNPq e INCT Pecuária pelo oferecimento de bolsa auxílio e
financiamentos de projetos.

Aos professores Marcelo Rezende e Marcelo Chacur pela participação na banca e pelas
sugestões oferecidas ao trabalho.

Aos professores do Setor de Reprodução, por dividirem seus conhecimentos e experiências.

Aos professores Francisco Lobato e Nivaldo da Silva, pela concessão do Laboratório para o
cultivo bacteriano.

Ao meu orientador, Marc Henry, pelo exemplo, pela determinação e pela exigência, sempre
querendo nosso crescimento, minha eterna gratidão.

Aos colegas de orientação, May e Pat, pelas trocas de ideias e auxílio, Pacote, pela ajuda nas
tabelas e nas coletas, Jaci, Gui e Marcus, pela ajuda nos dias de coleta. Aos que estiveram
comigo nas coletas nas fazendas e às que estiveram comigo no laboratório, muito obrigada, não
conseguiria sem vocês.

Ao Marcelino, por estar sempre com um sorriso no rosto, pela sua simplicidade e sua sabedoria,
tornando o dia de trabalho mais suave.

Aos demais funcionários da Fazenda Modelo de Pedro Leopoldo, por ajudar sempre que
necessário.

Aos senhores Marcelo, José Luiz, Márcio e Ronaldo, pela abertura de suas fazendas para nos
receber, e aos seus funcionários, pela fundamental ajuda.

Aos colegas de pós-graduação: Cíntia, Clarice, Hariany, Natália, Pamela, Dimitri, Filipe e
Carlos, pela companhia.

À Patrícia pelo auxílio estatístico, fundamental.

Às minhas amigas, Lala e Nat, pela boa companhia, entendendo meus dias de silêncio. Aninha,
Bah e Carlinha, por entenderem minha ausência.

E a todos que torceram e rezaram por mim, e que de alguma forma me auxiliaram para chegar
até aqui.

Muito obrigada!

7
8
 SUMÁRIO
RESUMO .... ………………………….......……………………………………….12
ABSTRACT .......................................................................................................... 13

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 14
2. OBJETIVO GERAL ............................................................................................ 14
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................. 14
3. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................ 15
3.1. COMPORTAMENTO SEXUAL DO MACHO .................................................... 15
3.1.1. Avaliação do comportamento sexual do macho ..................................................... 16
3.1.2. Fatores que influenciam o comportamento sexual do macho bubalino .................. 17
3.2. COLETA DE SÊMEN ........................................................................................... 18
3.2.1. Massagem das ampolas dos ductos deferentes ....................................................... 18
3.2.2. Coleta de espermatozoides da cauda do epidídimo ................................................ 19
3.2.3. Eletroejaculação ..................................................................................................... 19
3.2.4. Vagina artificial convencional ................................................................................ 20
3.2.5. Vagina artificial interna .......................................................................................... 21
3.3. QUALIDADE DO SÊMEN BUBALINO .............................................................. 23
3.4. CONTAMINAÇÃO MICROBIOLÓGICA DO SÊMEN ...................................... 24
3.4.1. Avaliação da contaminação bacteriana do sêmen .................................................. 25
4. EXPERIMENTO I – CARACTERÍSTICAS DO COMPORTAMENTO
SEXUAL DE TOUROS BUBALINOS NA COLETA DE SÊMEN COM VAGINA
ARTIFICIAL INTERNA E EFICIÊNCIA DO MÉTODO DE COLETA.............. 26
4.1. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 26
4.1.1. Localização e animais experimentais ..................................................................... 26
4.1.2. Vagina artificial interna .......................................................................................... 28
4.1.3. Comportamento sexual e coleta de sêmen .............................................................. 29
4.1.4. Análise estatística ................................................................................................... 29
4.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 29
4.2.1. Considerações gerais .............................................................................................. 36
5. EXPERIMENTO II – AVALIAÇÕES DA QUALIDADE SEMINAL, DA
CONTAMINAÇÃO BACTERIANA DO SÊMEN E DA EFICIÊNCIA DE
RECUPERAÇÃO DE ESPERMATOZOIDES DO MÉTODO DE VAGINA
ARTIFICIAL INTERNA............................................................................................. 37
5.1. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 37
5.1.1. Localização e animais experimentais ..................................................................... 37
5.1.2. Delineamento experimental .................................................................................... 37
5.1.3. Coleta de sêmen ...................................................................................................... 37
5.1.3.1. Vagina artificial interna ........................................................................................... 37
5.1.3.2. Vagina artificial convencional................................................................................. 37
5.1.4. Avaliação da qualidade seminal ............................................................................. 37
5.1.5. Avaliação da contaminação bacteriana do sêmen ................................................... 38
5.1.6. Avaliação da eficiência de recuperação de espermatozoides ................................. 38
5.1.7. Análise estatística ................................................................................................... 39
5.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 39
5.2.1. Avaliação da qualidade seminal ............................................................................. 39
5.2.2. Avaliação da contaminação bacteriana do sêmen ................................................... 41
9
5.2.3. Avaliação da eficiência de recuperação de espermatozoides ................................. 42
5.2.4. Considerações gerais .............................................................................................. 43
6. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 43
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 44

ANEXO 1 ...............................................................................................................52

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Escore numérico e descrição de libido para bovinos, segundo Hultnas (1959)...... 16
Tabela 2 - Tempo de reação (TR) e agressividade sexual (AS) de touros bubalinos............... 17
Tabela 3 - Características do ejaculado normal do bubalino.................................................... 23
Tabela 4 - Contagem de colônias bacterianas em amostras de sêmen de touros bubalinos
coletadas com vagina artificial convencional......................................................... 25
Tabela 5 - Médias e desvios padrão do tempo de reação (em segundos) de acordo com a
categoria de experiência sexual dos touros bubalinos estudados............................ 34
Tabela 6 - Eficiência do uso da vagina artificial interna para coleta de sêmen em búfalos......35
Tabela 7 - Ocorrências que impediram a coleta de sêmen com a vagina artificial interna.......36
Tabela 8 - Características do sêmen fresco puro de touros bubalinos coletado pelos métodos
de vagina artificial interna e vagina artificial convencional................................... 39
Tabela 9 - Valores médios de motilidade total, velocidade curvilínea (VCL), velocidade linear
progressiva (VSL), velocidade média da trajetória (VAP), linearidade (LIN) e
frequência de batimento flagelar cruzado (BCF) dos espermatozoides de búfalos no
sêmen fresco diluído coletado por vagina artificial interna e vagina artificial
convencional........................................................................................................... 41
Tabela 10 - Médias de Unidades Formadoras de Colônias por mL (UFC/mL) no sêmen fresco
puro e no sêmen fresco diluído de touros bubalinos coletado pelos métodos da
vagina artificil interna e convencional.................................................................... 41
Tabela 11 - Eficiência de recuperação de espermatozoides dos métodos de vagina artificial
interna e vagina artificial convencional.................................................................. 42

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Foto da Vagina Artificial Interna (Barth et al. 2004) mostrando seus
componentes............................................................................................................ 22

10
Figura 2 - Foto da Vagina Artificial Interna utilizada no estudo............................................. 28
Figura 3 - Proporção dos eventos (cheirar, lamber, reflexo de Flehmen, pressão de queixo,
cabeçada, contração do prepúcio, monta sem exposição, monta com exposição,
penetração no ânus, penetração sem galeio e cheirar o chão) do comportamento
sexual de cada touro bubalino do qual foi possível a coleta de sêmen com a vagina
artificial interna........................................................................................................ 32
Figura 4 - Proporção dos eventos (cheirar, lamber, reflexo de Flehmen, pressão de queixo,
cabeçada, contração do prepúcio, monta sem exposição, monta com exposição,
penetração no ânus, penetração sem galeio e cheirar o chão) do comportamento
sexual de cada touro bubalino do qual não foi possível a coleta de sêmen com a
vagina artificial interna. Categoria 2= búfalos sem experiência sexual; Categoria 3=
búfalos com experiência sexual............................................................................... 33

11
 RESUMO

O objetivo deste trabalho foi testar o uso da vagina artificial interna para a coleta de sêmen de
touros bubalinos. No Experimento I, 38 búfalos (Murrah e Mediterrâneo) foram avaliados
durante a tentativa de coleta de sêmen com a vagina interna, divididos em 3 categorias de
experiência sexual, Categoria 1: condicionados a coleta de sêmen com a vagina artificial
convencional (n=9), Categoria 2: sem experiência sexual (n=14) e Categoria 3: com experiência
sexual (n=15). No Experimento II, utilizando 6 búfalos Murrah, as amostras de sêmen da vagina
interna foram comparadas às da vagina convencional nas qualidades macro e microscópicas, nos
parâmetros do CASA, contaminação bacteriana (UFC/mL) e eficiência de recuperação de
espermatozoides. No Experimento I, o uso da vagina interna permitiu a coleta de sêmen de
100% dos touros da Categoria 1, de 78,57% dos touros da Categoria 2 e de 46,67% dos touros
da Categoria 3. No Experimento II, o volume do ejaculado e o número total de espermatozoides
foram menores na vagina interna. Nos parâmetros do CASA, apenas Linearidade foi diferente,
superior na vagina interna. O número médio UFC/mL nas amostras da vagina interna foi maior
que da vagina convencional. A eficiência de recuperação de espermatozoides foi igual nos dois
métodos. Recomenda-se a utilização da vagina artificial interna como método alternativo para a
coleta de sêmen de touros bubalinos.

Palavras-chave: Búfalo, vagina artificial interna, coleta de sêmen, comportamento sexual.

12
 ABSTRACT

The objective of this study was to test the use of internal artificial vagina to collect semen
buffalo bulls. In the first experiment, 38 buffaloes (Murrah and Mediterranean) were evaluated
while trying to semen collection with the internal vagina, divided into 3 categories of sexual
experience, Category 1: conditioned to semen collection with conventional artificial vagina (n =
9 ), Category 2: without sexual experience (n = 14) and Category 3: sexually experienced (n =
15). In Experiment II, using 6 Murrah buffalo, the internal vaginal semen samples were
compared to the conventional vagina in macro and microscopic characteristics in CASA
parameters, bacterial contamination (CFU / mL) and sperm recovery efficiency. In Experiment
I, the use of internal vaginal allowed semen collection 100% of the Category 1 bulls, of 78.57%
of Category 2 bulls and 46.67% of Category 3 bulls. In Experiment II, the semen volume and
the total number of sperm were lower in the internal vagina. The parameters of CASA, only
Linearity was different, higher in the interna vagina. The average number CFU / mL in the
internal vagina samples was higher than the conventional vagina. The sperm recovery efficiency
was similar in both methods. It is recommended the use of internal artificial vagina as an
alternative method for collecting water buffalo bulls semen.

Keywords: Buffalo bull, internal artificial vagina, semen collection, sexual behavior.

13
 1. Introdução
Em um sistema de produção como a bubalinocultura, onde o principal manejo reprodutivo é a
monta natural (Ohashi et al., 2011), a predição da fertilidade do touro torna-se mais importante
que a fertilidade individual das fêmeas, já que um touro é responsável pelo sucesso reprodutivo
de muitas fêmeas (Prince, 1985). Por isso, para a seleção de reprodutores, além das
características zootécnicas desejáveis, é importante a inclusão das avaliações da libido e da
qualidade espermática. Se um reprodutor falhar em executar a monta ou em produzir sêmen de
qualidade, ele deverá ser retirado do rebanho (Turner, 2010).

A realização do exame andrológico tem como princípio fundamental caracterizar o potencial

reprodutivo dos touros e atender ao diagnóstico da saúde sexual, saúde hereditária e saúde
reprodutiva, tanto no aspecto da capacidade de monta (potentia coeundi) quanto na capacidade
fecundante (potentia generandi) (Peña Alfaro, 2011). O exame andrológico deve ser indicado
para a seleção e preparação de touros antes da estação de monta ou para centrais de coleta, bem
como nos casos de histórico de infertilidade individual (Peña Alfaro, 2011). No exame
andrológico, no conjunto de exames específicos do aparelho reprodutor estão as avaliações do
comportamento sexual e da qualidade do sêmen. A qualidade do sêmen não é avaliada apenas
para predizer a fertilidade de um reprodutor, mas também para avaliar a melhor maneira de
processar o ejaculado no laboratório (Den Daas, 1992).

Em touros bubalinos, Ohashi (2008) relata sucesso de coleta de sêmen por eletroejaculação,
apenas em animais jovens. Segundo o autor, o animal adulto reage violentamente durante a
tentativa de coleta de sêmen por este método, mostrando-se bastante sensível ao estímulo
elétrico. O búfalo, apesar de ser uma das espécies mais facilmente condicionadas a servir na
vagina artificial (Sansone, 2000), pode se tornar relutante ao serviço artificial, causando
prejuízos na produção de sêmen (Prabhu e Bhattacharya, 1954; Prabhu, 1956). Muitas
alternativas foram testadas na tentativa de reduzir esta recusa do touro ao serviço artificial, mas
muitas vezes os animais voltam a refugar.

Considerando a frequente variabilidade de resposta de touros bubalinos à tentativa de coleta de

sêmen pelo método da vagina artificial convencional e a baixa resposta ao método da
eletroejaculação, este trabalho propõe testar um modelo adaptado do método de vagina artificial
interna para a coleta de sêmen destes touros.

2. Objetivo geral

Avaliar o uso da vagina artificial interna como método de coleta de sêmen de touros bubalinos.

2.1. Objetivos específicos

Experimento I:

- Caracterizar o comportamento sexual do macho bubalino durante a coleta de sêmen

com a vagina artificial interna.

- Avaliar a eficiência do método de vagina artificial interna para a coleta de sêmen de

touros bubalinos.

14
Experimento II:

- Comparar a qualidade do sêmen e a contaminação bacteriana das amostras coletadas

pelos métodos de vagina artificial interna e convencional.

- Comparar a eficiência de recuperação dos espermatozoides coletados pelos métodos

de vagina artificial interna e convencional.

3. Revisão de literatura

3.1. Comportamento sexual do macho

Muitos comportamentos das espécies domésticas estão relacionados à automanutenção,
principalmente os comportamentos não sociais, como a alimentação, a ruminação e o repouso.
O comportamento sexual, entretanto, está relacionado com a manutenção da espécie e da
genética (Shalash, 1984). O comportamento sexual de um touro inclui dois componentes: desejo
sexual ou libido e a habilidade de monta (Chenoweth, 1983b). A libido é definida como a
vontade e a ânsia para montar e para completar o serviço (Hultnas, 1959) e, a habilidade de
monta pode ser caracterizada pela postura do macho durante o salto, a ejaculação e a desmonta
(Chenoweth, 1981; Anzar et al., 1993).

Os eventos do comportamento sexual de um touro bubalino quando em contato com uma fêmea
seguem alguns padrões (Shalash, 1984). Ao se aproximar de uma fêmea em estro, o búfalo
realiza uma série de comportamentos que inclui o reflexo de Flehmen, os movimentos penianos
curtos e a projeção de poucos centímetros do pênis (Johari, 1960). Antes do salto, o touro
interage com a fêmea, realizando comportamentos classificados como estímulos táteis (Anzar et
al., 1993). Dentre estes estímulos, são citados os comportamentos de cheirar, lamber o períneo
da fêmea, cabecear e empurrar e apoiar o queixo (Anzar et al., 1993; Samo et al., 2005).

O reflexo de Flehmen foi descrito como o movimento de erguer a cabeça após cheirar a
genitália da fêmea, levantando o queixo com a boca aberta, com a língua plana e com eversão
dos lábios, fazendo com que as narinas fiquem parcialmente fechadas, possibilitando a inalação
do odor sui generis, oriundo da genitália da fêmea investigada (Reinhardt, 1983). Este reflexo é
descrito em diversas espécies domésticas (Henry et al.,1987; Santos et al., 2006; Oliveira et al.,
2007; Henry et al., 2009; Pacheco e Quirino, 2010) .

Em búfalos, a realização de repetidos reflexos de Flehmen durante a investigação de uma

mesma fêmea foi relacionada ao estádio do estro da fêmea (Rajanarayanan e Archunan, 2004).
A presença de 4-metilfenol e de trans-verbenol nas fezes de fêmeas em estro foram relacionados
com o maior tempo de duração do reflexo de Flehmen e o número de montas realizadas pelo
macho bubalino (Karthikeyan et al., 2013). Nesta espécie, o ato de monta é rápido, durando
poucos segundos, e o impulso ejaculador é menos marcante que em bovinos. Depois da
ejaculação, o búfalo desmonta vagarosamente e o pênis se retrai gradualmente para dentro da
bainha prepucial (Jainudeen e Hafez, 1995).

O tempo transcorrido entre a detecção de um estímulo apropriado, como a presença de uma

fêmea em estro, até a realização da monta completa é chamado de tempo de reação (Chenoweth,
1997). Na espécie bubalina, o tempo de reação pode variar de 1 a 15 minutos, e parece não

15
sofrer influência das estações do ano (Dixit et al., 1984; Bhosrekar et al., 1992; Singh et al.,
2001; Mandal et al., 2000; Samo et al., 2005).

3.1.1. Avaliação do comportamento sexual do macho

Para a seleção de um reprodutor de qualidade, a avaliação de sua capacidade reprodutiva deve
ser baseada na libido e na qualidade seminal, pois como não há correlação entre estes
parâmetros (Chenoweth, 1980) e a seleção por apenas um deles pode permitir a escolha de um
reprodutor com baixa capacidade de servir, tanto a campo quanto na vagina artificial.

Uma das primeiras propostas para avaliar o comportamento sexual do macho bovino, foi feita
por Hultnas (1959), que utilizou uma fêmea em estro contida e permitiu que o macho realizasse
três tentativas para a coleta de sêmen na vagina artificial, durante um período de 10 minutos.
Nesta proposta, o autor sugeriu que sejam avaliados: o cortejo sexual do touro diante da fêmea
contida, o desejo de realizar o serviço, o seu comportamento ao completar o serviço na vagina
artificial e o tempo de reação. A partir destas observações, Hultnas (1959) propôs a seguinte
avaliação em escores:

Tabela 1. Escore numérico e descrição de libido para bovinos, segundo Hultnas (1959).
Escore Descrição

0 Nenhum interesse ou ausência de desejo sexual.

Pouco interesse em montar, farejar o posterior da fêmea e fazer vagas tentativas de

1
monta, que podem esporadicamente levar ao serviço completo.

2 Montar depois de óbvias e repetidas hesitações, débil exploração e busca da vaca.

Monta comparativamente rápida, sem demonstrar ânsia, satisfatória exploração e

3
busca da fêmea.

4 Monta rápida e concentração apenas na fêmea, boa exploração e busca da fêmea.

5 Monta ansiosa, muito boa exploração e busca da fêmea.

Ansiedade extrema para a monta, exploração extremamente árdua e busca intensiva

6
da fêmea.

Fonte: Adaptado de Hultnas (1959).

A partir desta proposta, alguns pesquisadores (Osborne et al., 1971; Chenoweth, 1983a; Vale
Filho, 1994; Pineda et al., 1997; Chaves et al., 2002; Oliveira et al., 2007; Dias, 2009)
sugeriram outros modelos para a avaliação da libido do bovino.

Para a seleção de touros bubalinos, Anzar et al. (1993) propõem um modelo de avaliação do
comportamento sexual, que avalia a libido a partir do tempo de reação, da agressividade sexual
e dos estímulos táteis do touro diante de uma fêmea contida, por no máximo 5 minutos, durante
a tentativa de coleta de sêmen. Neste modelo a habilidade de monta do búfalo é avaliada pelo
comportamento durante o salto.

16
Tabela 2. Tempo de reação (TR) e agressividade sexual (AS) de touros bubalinos.
TR (seg) Escore AS Escore

<5 6 Agressivo 4

6-15 5 Ativo 3

16-30 4 Lento 2

31-60 3 Tímido 1

61-120 2

121-300 1

>300 0 (Recusa a monta)

Fonte: Adaptado de Anzar et al. (1993).

Em bubalinos, o tempo de reação (Dixit et al., 1984; Tomar e Singh, 1996 e Kumar et al., 2008)
e os comportamentos realizados durante o período de coleta (Bhosrekar et al., 1992; Singh et al.,
2001 e Samo et al., 2005) também são critérios de avaliação da libido. Taha et al. (1984)
utilizando apenas o tempo de reação para avaliação da libido de búfalos mestiços, classificaram
como reprodutores de boa libido animais que apresentaram tempo de reação próximo a 60
segundos, animais com tempo de reação próximo a 270 segundos foram classificados como
reprodutores de libido média, e como baixa libido os animais que apresentaram tempo de reação
próximo a 720 segundos.

3.1.2. Fatores que influenciam o comportamento sexual do macho bubalino

A fêmea bubalina se comporta como um animal poliestral sazonal de dias curtos, em regiões
mais distantes da linha do Equador, no sentido norte ou sul, apresentando interrupção da
ciclicidade durante o verão, quando o período de luz diário é maior (Vale e Ribeiro, 2005). Em
regiões mais próximas à linha do Equador, estas fêmeas apresentam comportamento poliestral
contínuo, ou seja, ciclam o ano todo (Vale e Ribeiro, 2005). Em machos bubalinos, a influência
da estação do ano sobre a capacidade reprodutiva do macho não está bem estabelecida. O tempo
de reação não variou entre as estações do ano para os reprodutores da raça Murrah testados em
um estudo realizado na Índia (Dixit et al., 1984). Contudo, neste estudo, a porcentagem de
búfalos que se recusaram a montar foi maior durante o verão se comparado ao inverno (Dixit et
al., 1984), estes autores sugerem que a alta temperatura da estação iniba o comportamento do
macho. Em outro estudo (Mandal et al., 2000), também realizado na Índia, o tempo de reação
dos touros Murrah variou entre as estações do ano, sendo maior durante o verão e menor
durante o inverno. A depressão sazonal na libido provavelmente pode ser atribuída a fatores
ambientais, como o estresse térmico, a escassez de pastagem e a diminuição da disponibilidade
de comida, ao invés de ser influenciada pelo aumento do foto-período no verão. Ohashi et al.
(1988) sugerem que a coleta de sêmen do búfalo aconteça nas horas mais amenas do dia, devido
a grande influência da temperatura sobre a libido deste animal.

Com o avançar da idade, o reprodutor bubalino aumenta a procura pela parceira e melhora sua
habilidade de monta, o que pode ser devido ao alto interesse sexual e ao melhor posicionamento

17
corporal para realizar a monta dos animais mais velhos (Bhosrekar et al., 1992). A experiência
sexual é um fator importante do comportamento sexual. Reprodutores bovinos e equinos
treinados a servir a vagina artificial aprendem a depender de estímulos táteis, e ao aprender os
padrões da cópula, o macho reduz a dependência dos centros sexuais neurais para o estímulo
endócrino (MacDonald, 1975). A receptividade sexual da fêmea utilizada como manequim para
a coleta de sêmen de búfalos condicionados parece não influenciar no tempo de reação destes
machos (Prabhu e Bhattacharya, 1954).

Algumas condições clínicas podem estar associadas à baixa libido de reprodutores bubalinos.
Casos de prolapso prepucial e degeneração testicular estão bem estabelecidos quanto a sua
relação com o comportamento sexual e a fertilidade (Kumar et al., 2008). A laminite, a
dermatite escrotal e o aumento patológico do volume escrotal também podem ser relacionados
com a baixa libido destes reprodutores (Kumar et al., 2008). Tanto a libido quanto a capacidade
de monta em touros bovinos são influenciadas por fatores genéticos, como a raça e a linhagem
(Chenoweth, 1983a).

3.2. Coleta de sêmen

Para a coleta de sêmen são adotados métodos diferentes para cada objetivo. Uma amostra de
sêmen para avaliação pode requerer apenas um pequeno volume, e o volume utilizado na
inseminação artificial pode variar entre os indivíduos e as espécies (Sorensen, 1979). Em
animais domésticos, o sêmen pode ser coletado por vagina artificial, eletroejaculação,
estimulação manual das glândulas acessórias, dentre outros métodos (Stafford, 1995).

Na espécie bubalina, o método indicado para a coleta de sêmen é a vagina artificial

convencional porque são animais facilmente condicionados ao serviço artificial (Sansone,
2000). Os métodos eletroejaculação e estimulação manual das glândulas acessórias são
desaconselháveis para bubalinos, pois os animais são muito sensíveis aos estímulos elétricos
(Ohashi, 2008) e a amostra de sêmen coletada pela massagem das glândulas acessórias
apresenta menor qualidade quando comparada aos métodos de vagina artificial convencional e
eletroejaculação (Ohashi et al., 2011).

Contudo, existem relatos de touros bubalinos de Centrais de coleta e processamento de sêmen,

condicionados à coleta com vagina artificial convencional, que se tornaram resistentes ao
serviço artificial (Prabhu e Bhattacharya, 1954; Prabhu, 1956; Cebran, 2012 - comunicação
pessoal). Dificultando, desta forma, a manutenção de touros em programas de coleta continuada.

3.2.1. Massagem das ampolas dos ductos deferentes

A massagem das ampolas dos ductos deferentes é um dos métodos mais simples de coleta de
sêmen em bovinos (Palmer et al., 2005), mas a obtenção de sêmen por este método em
bubalinos requer prática e muitos animais não respondem aos estímulos (Ohashi et al., 2011).
Este método de coleta tem baixa qualidade, baixa concentração espermática e alta
contaminação, servindo apenas para avaliação rápida, quando não se tem outra opção e se quer
ter uma ideia da qualidade espermática do reprodutor, não devendo ser aproveitado para o
processo de congelamento quando o uso é destinado para programas de inseminação artificial
(Ohashi, 2008).

18
Com a mão dentro do reto do touro as vesículas seminais são massageadas, com movimentos
craniocaudais, e um líquido turvo flui pelo prepúcio. Na maioria dos casos, este líquido contém
somente células epiteliais. De modo semelhante, as ampolas dos ductos deferentes são
massageadas e um líquido turvo escoa pelo prepúcio, contendo apenas espermatozoides, na
maioria dos casos. Em algumas situações, as ampolas são massageadas antes, mas melhores
resultados são obtidos quando primeiro se massageia as vesículas seminais. Isto porque se evita
que a vesícula libere células epiteliais diminuindo a qualidade da amostra coletada (Miller,
1934).

Palmer et al. (2005) demonstraram que amostras de sêmen coletadas de bovinos via massagem
das ampolas dos ductos deferentes obtiveram menor porcentagem de motilidade e de
espermatozoides vivos, quando comparadas às amostras de sêmen obtidas por eletroejaculação.
Os autores sugeriram que a incapacidade de estimular a ereção com a massagem das ampolas
estava relacionada com a menor qualidade da amostra de sêmen obtida por este método.

3.2.2. Coleta de espermatozoides da cauda do epidídimo

A coleta e a criopreservação dos espermatozoides da cauda do epidídimo podem ser a última

chance e opção para preservação de células germinativas de animais de alto valor genético,
reprodutores de idade avançada ou após a morte do animal (Barbosa et al., 2012).

Uma das técnicas proposta é de fluxo retrógrado (Garde et al., 1994). A cauda do epidídimo é
separada do tecido adjacente por dissecação, o ducto deferente é lavado com o uso de seringa e
cateter, injetando-se 5,0 mL de diluente à base de TRIS-gema de ovo, sem crioprotetor
intracelular, fazendo com que os espermatozoides sejam carreados pelo diluente, extravasando
pela incisão realizada na junção entre a cauda e o corpo do epidídimo. Todo procedimento é
realizado sobre uma placa aquecedora. Tal técnica permitiu a colheita de células viáveis e que
após a congelação poderiam ser utilizadas para inseminação artificial, sendo mantidas
características semelhantes ao sêmen ejaculado (Barbosa et al., 2012). Cary et al. (2004)
conseguiram maior motilidade pós-congelamento dos espermatozoides coletados da cauda do
epidídimo do que daqueles coletados do sêmen ejaculado pelos mesmos equinos anteriormente.

Além de ser uma técnica factível, contribuindo para a preservação de material genético de
reprodutores superiores (principalmente animais jovens, que poderiam contribuir muito com o
progresso genético e morrem precocemente), é economicamente viável, pois o valor de venda
das doses do sêmen tende a se valorizar após a morte (Barbosa et al., 2012).

3.2.3. Eletroejaculação

Eletroejaculação é a palavra geralmente utilizada para indicar a obtenção de sêmen por

estímulos elétricos através de eletrodos inseridos no reto. Apesar de já estar consagrada, a
palavra pode estar sendo usada de maneira errônea, já que o sêmen raramente ou nunca é
ejaculado no sentido estrito; ele escoa através do meato urinário externo sem a ajuda de
contrações dos músculos estriados envolvidos no mecanismo de ejaculação verdadeiro
(Brindley, 1981).

O eletroejaculador foi desenvolvido nos meados de 1940 (Bearden e Fuquay, 1984). O objetivo
do procedimento é estimular os centros ejaculatórios através do plexo mesentérico posterior e
gânglios simpático-parassimpáticos anatomicamente relacionados com mínima estimulação dos
19
nervos ciáticos e lombares (Barker, 1958). Os primeiros relatos do seu uso na veterinária foram
feitos por Dziuk et al. (1954), que o utilizaram na espécie ovina. A estimulação elétrica é um
dos métodos alternativos para a coleta de sêmen de reprodutores de alto valor genético que são
relutantes ou incapazes de servir a vagina artificial (Dziuk et al., 1954). Contudo, sua principal
utilização prática é a realização de exames andrológicos.

Em um estudo realizado com 18 touros bovinos, Dziuk et al. (1954) relataram sucesso na coleta
de sêmen por eletroestimulação de 94,74% dos touros testados. Enquanto Austin et al. (1961)
conseguiram sucesso na coleta com eletroejaculação de 100,0% dos touros testados, mas ao
utilizarem os mesmos animais para a coleta com vagina artificial, o sucesso de coleta caiu para
86,0%. Apesar de permitir a coleta do sêmen, o uso do eletroejaculador não permite a avaliação
da libido, uma das principais características reprodutivas (Ohashi, 2008).

O sêmen da eletroejaculação, quando comparado ao sêmen coletado com vagina artificial,

apresenta algumas variações quanto as suas qualidades físicas e químicas. Na eletroejaculação,
o volume do sêmen obtido e seu pH são maiores e sua densidade menor. Apesar do maior
volume coletado, o número total de espermatozoides por ejaculado, não difere entre os dois
métodos de coleta (Dziuk, 1954; Austin et al., 1961; Leon et al.,1991). A motilidade do sêmen
coletado por eletroejaculação é similar à do sêmen coletado com vagina artificial. Contudo, o
sêmen coletado por vagina artificial apresenta maior concentração antes do resfriamento e
melhor motilidade progressiva depois do congelamento (Leon et al., 1991).

Ohashi (2008) desencoraja o uso da eletroejaculação em touros bubalinos. Apesar de o autor

relatar sucesso de coleta por eletroejaculação nesta espécie em animais jovens, em búfalos
adultos, a reação durante a tentativa de coleta é violenta, visto como esta espécie mostra-se
sensível ao estímulo elétrico. Além disso, o sêmen coletado através da eletroejaculação
apresenta-se mais contaminado por bactérias e células de descamação do epitélio prepucial, em
função da maioria dos animais ejacularem dentro da bainha prepucial.

3.2.4. Vagina artificial convencional

A vagina artificial é o método universal para a coleta de sêmen de rotina (Mies Filho, 1982).
Neste método é utilizado um aparato que substitui a vagina da fêmea, e a coleta por ser realizada
com uma fêmea ou manequim. O dispositivo não é ligado à fêmea de nenhuma maneira, mas
manuseado pelo operador, que desvia o pênis para dentro do aparato no momento do coito,
antes que o macho o introduza na fêmea. Assim, o sêmen é recebido dentro deste aparato.
Algumas pequenas adaptações são feitas para as diferentes espécies de animais (Letard, 1935).

É um método definido como parafisiológico, isto é, ele permite que seja mantida a libido normal
do macho, a integridade do órgão reprodutivo externo, bem como as características biológicas
do sêmen (Bonadonna, 1969). Por ele se obtém o líquido seminal em estado de pureza relativa e
em condições de equilíbrio térmico e osmótico favoráveis ao processamento para sua aplicação
na inseminação artificial (Mies Filho, 1962).

A primeira vagina artificial foi utilizada para a coleta de sêmen de cão por G. Amantea,
professor de fisiologia humana na Universidade de Roma (Bearden e Fuquay, 1984). Os relatos
são que Amantea iniciou suas pesquisas com sêmen canino em 1914. A partir do modelo
proposto por Amantea, cientistas russos padronizaram vaginas artificiais adequadas para
garanhão, touro e carneiro (Bearden e Fuquay, 1984).
20
O modelo utilizado atualmente consiste basicamente em um cilindro rígido, de borracha ou
Policloreto de Vinila (PVC), aberto nas duas extremidades. Em seu interior se acomoda um tubo
flexível de borracha, que é fixado às bordas do tubo rígido por meio de tiras elásticas, formando
um compartimento entre ambos. Neste compartimento são introduzidos água morna e ar,
visando à obtenção de uma temperatura final de coleta entre 39,0 e 41,0°C. O volume e a
pressão no interior do compartimento são controlados com o auxilio de uma válvula no cilindro
rígido. Em uma das extremidades da vagina artificial convencional é acoplado um funil com um
tubo graduado, onde será coletado o sêmen. A segunda extremidade forma a porção vulvar da
vagina artificial convencional, na qual o pênis será introduzido (Reichenbach et al., 2008).

As dimensões da vagina artificial variam de acordo com a espécie sujeita a monta. Para bovinos,
ela possui em média 40,0 cm de comprimento e 6,5 cm de diâmetro. Para ovinos e caprinos, a
temperatura e método de coleta são os mesmos que indicados pra bovinos, mas a vagina
artificial possui menor comprimento variando de 22,0 a 25,0 cm (Bearden e Fuquay, 1984).
Para bubalinos, a vagina artificial deve ser mais curta que a utilizada para bovinos, com 25,0 a
30,0 cm para animais jovens e 30,0 a 35,0 cm para animais adultos acima de quatro anos, em
função do menor tamanho do pênis bubalino em relação ao bovino (Ohashi, 2008). Para garantir
que o equipamento utilizado não afete a qualidade do sêmen coletado, cuidados devem ser
tomados na preparação da vagina artificial. Devem receber atenção, principalmente, a
temperatura da água utilizada para preencher a vagina (Macmillan et al., 1966) e a composição
da mucosa artificial (Flick e Merilan, 1988).

A coleta de sêmen por este método exige participação ativa do macho e se assemelha muito à
situação de monta natural, permitindo a avaliação da libido e da habilidade de monta. Os
machos necessitam de treinamento para servir a vagina artificial. O treinamento requer tempo e
é desaconselhável para animais que não estão acostumados com a presença humana e sua
manipulação (Palmer, 2005).

O touro bubalino é, possivelmente, o animal doméstico mais facilmente condicionado à colheita

de sêmen através do método da vagina artificial, quando jovem (Sansone, 2000). Todavia,
relata-se dificuldade de coleta de sêmen de touros bubalinos adultos, pois muitas vezes os
animais se tornam bravios quando criados a campo. Os búfalos adultos que tenham sido
utilizados como reprodutores a campo são mais difíceis de serem condicionados à coleta de
sêmen com o uso da vagina artificial (Ohashi, 2008).

O búfalo pode se tornar relutante ao serviço artificial, dificultando a avaliação de sua fertilidade
e causando prejuízos na produção de sêmen. Alternativas como mudar o local de coleta, trocar a
manequim utilizada, utilizar fêmeas em estro ou fora do estro, utilizar machos como manequim,
mudar o operador da vagina artificial, entre outras, foram testadas na tentativa de reduzir esta
recusa do touro ao serviço artificial, mas muitas vezes os resultados positivos são transitórios e
os animais voltam a refugar (Prabhu e Bhattacharya, 1954; Prabhu, 1956).

3.2.5. Vagina artificial interna

Wulster-Radcliffe et al. (2001) desenvolveram um método de coleta de sêmen em ovinos que

consiste de um tubo de vidro que é inserido na vagina da ovelha e o macho é liberado para a
monta sem interferência do homem. Este método permitiu que os pesquisadores conseguissem
coletar sêmen de 31,0% dos carneiros não treinados a coleta de sêmen com a vagina artificial
convencional, enquanto que na vagina artificial convencional conseguiram coletar de 10,0% dos
21
carneiros não treinados. Em animais treinados à coleta de sêmen com a vagina artificial
convencional o sucesso de coleta foi de 100,0%, na vagina artificial interna. Os autores relatam
ainda, que a qualidade do sêmen obtido pela vagina de vidro foi semelhante a do sêmen
coletado pela vagina artificial convencional.

Barth et al. (2004) desenvolveram um modelo de vagina artificial interna para a coleta de sêmen
de touros bovinos (Figura 1). Além de evitar o uso do estímulo elétrico, a vagina artificial
interna permitiu avaliar a libido e a capacidade de monta do reprodutor.

Figura 1 - Foto da vagina artificial interna (Barth et al., 2004) mostrando seus componentes: suporte de
metal com uma das extremidades em forma de circulo; haste inferior de metal ligada ao tubo de látex;
tubo plástico flexível (a). As duas partes de metal conectadas pelo tubo plástico flexível (b). O tubo de
látex adaptado ao suporte circular de metal que o mantém aberto (c), e a vagina artificial interna com o
saco coletor acoplado (d).

No estudo de Barth et al. (2004) a vagina artificial interna foi utilizada para a coleta de sêmen
de 96 touros das raças Charolês, Aberdeen Angus e Hereford. O uso deste método permitiu
coletar sêmen de todos os touros que montaram e penetraram nas vacas (54,3% dos animais
com um ano e 69,6% dos touros com dois anos). Ainda neste estudo, a coleta de sêmen por
vagina artificial interna permitiu a detecção de problemas de monta em oito touros (4,8%) que
haviam sido determinados como reprodutores potencialmente satisfatórios quando o sêmen foi
coletado apenas por eletroejaculação.

No Brasil, o uso da vagina artificial interna desenvolvida por Barth et al. (2004) foi testado em
animais da raça Devon (Cruz, 2007). Neste estudo, 45 dos 52 (86,5%) touros testados tiveram o
sêmen coletado com o uso da vagina artificial interna, sendo que 31 dos 45 (69,0%) foram
considerados como potenciais reprodutores satisfatórios. Dos animais em que não foi possível
realizar a coleta do ejaculado com a vagina artificial interna, três não apresentaram interesse
sexual pela fêmea; um apresentava desvio do pênis, que não permitia sua introdução na vagina,
e outro, apesar de introduzir o pênis na vagina da fêmea, não conseguia realizar a ejaculação.
Este animal foi submetido a um novo teste de comportamento, sem a utilização da vagina
artificial interna, persistindo o comportamento. Tal resultado reforça a possibilidade de não
haver interferência da vagina artificial interna na coleta do sêmen destes touros. Finalmente, os
dois touros restantes não conseguiram realizar a monta na fêmea em virtude de problemas
aparentes nos membros posteriores. Quando foi utilizada a eletroejaculação nestes mesmos
22
animais, 11,1% dos touros seriam inadequadamente considerados aptos à reprodução, se apenas
o exame físico e de qualidade seminal fossem empregados, demonstrando a importância da
realização do exame funcional para a avaliação de um reprodutor (Cruz, 2007). Em touros
bubalinos não há relatos na literatura do uso da vagina artificial interna para a coleta de sêmen.

3.3. Qualidade do sêmen bubalino

O principal objetivo da avaliação das características seminais é predizer a fertilidade de um

reprodutor (Den Daas, 1992). As características do sêmen classicamente avaliadas são:
cor/aspecto, volume, concentração, viabilidade, integridade de membrana e morfologia
espermática (Sansone, 2000). As características seminais de touros bubalinos adultos, de acordo
com Vale (1994), estão listadas na Tabela 3.
Tabela 3. Características do ejaculado normal do bubalino.
Característica Padrão normal

-Cor branco, branco-leitoso, com estrias escuras-acinzentadas

-Volume (ml) 3,0 (2,0 a 8,0)

-Turbilhonamento (0-5) >3

-Motilidade (%) > 70

-Vigor (1-5) >3

-Concentração 6 x 105 a 12 x 105

-Células espermáticas vivas (%) > 70

-Defeitos espermáticos (%) < 30

-pH 6.7 a 7.5

Fonte: Vale (1994).

O volume do ejaculado, o turbilhonamento, a concentração espermática e a motilidade variam

com a idade. Búfalos da raça Murrah com idade menor que 36 meses apresentaram menores
valores para estes parâmetros quando comparados a animais com mais de 36 meses de idade
(Bhosrekar et al., 1992). O volume do ejaculado de touros jovens varia entre 1,0 e 3,0 mL, para
búfalos adultos, plenamente maduros, o volume pode ficar entre 4,0 e 8,0 mL (Ohashi et al.,
2011).

A motilidade é rotineiramente avaliada por estimação visual da porcentagem de células móveis.

Uma pequena gota é depositada entre lâmina e lamínula, a 37,0°C, e examinada em microscópio
óptico em aumento de 20 ou 40 vezes (Sansone, 2000). Vale (2011) classifica um ejaculado
com boa motilidade aquele que apresentar pelo menos 80,0% de espermatozoides móveis,
enquanto a motilidade pobre apresenta motilidade inferior a 20,0%.

Na rotina, são utilizadas duas técnicas para avaliação das características morfológicas dos
espermatozoides: esfregaços corados em microscópio de campo claro e preparação úmida com
microscópio de contraste de fase. Existem também sistemas automatizados que, além dos
23
aspectos físicos como motilidade espermática e concentração, realizam análises de morfologia
espermática (Freneau, 2011). A idade tem um efeito significante na incidência de anormalidades
espermáticas. Em média, a melhor qualidade seminal pertence a búfalos com idade entre três e
quatro anos (Saeed et al., 1990). O percentual aceitável de anormalidades espermáticas para
búfalos adultos é no máximo 30,0% (Vale, 1994; Vale, 2011). Os defeitos mais frequentemente
encontrados no sêmen de touros bubalinos são defeitos de cabeça (5,18±2,08%) e de cauda
enrolada (4,26±0,94%) (Saeed et al., 1990).

O pH do sêmen de búfalo, coletado através de vagina artificial varia entre 6,5 e 7,2. O sêmen do
bubalino tem uma maior tendência a se acidificar, devido a sua maior concentração de açúcares,
que quando são transformados em ácido lático, diminuem o pH do sêmen (Vale, 2011).

A influência da sazonalidade sobre a qualidade do sêmen de touros bubalinos ainda não está
bem estabelecida. Segundo Ohashi (1988), esta influência da sazonalidade sobre o macho
bubalino está relacionada com uma menor oferta de alimento, aumento de temperatura
ambiental e raios solares, podendo ser superada com melhor manejo e alimentação. Em búfalos
da raça Mediterrâneo, Castro et al. (2007) encontraram menor volume de ejaculado nos meses
do verão no Brasil. Em Cuba, Ferrer et al. (2010) também encontraram diferença entre as
estações do ano apenas para o volume do ejaculado, que foi maior no inverno. Em estudo
realizado com búfalos na Tailândia (Koonjaenak, 2006) não houve diferença entre as estações
do ano para nenhum dos parâmetros seminais avaliados (motilidade progressiva do sêmen
fresco e após o descongelamento, concentração, volume e morfologia). Koonjaenak et al. (2007)
encontraram diferença na congelabilidade do sêmen bubalino ao longo do ano, no inverno os
espermatozoides apresentaram melhor integridade e estabilidade de membrana, além de melhor
motilidade.

3.4. Contaminação microbiológica do sêmen

A coleta do sêmen não é um procedimento estéril e certo grau de contaminação bacteriana não
pode ser evitado (Akhter et al., 2008). Durante a coleta de sêmen com vagina artificial pode
ocorrer contaminação com bactérias da superficie do pênis e prepúcio, da área de coleta, com o
equipamento e com os manipuladores (Thibier e Guerin, 2000). Apesar de adotar as melhores e
mais adequadas condições de coleta, pode ser observada contaminação microbiana (Genovez et
al., 1999). O estado higiênico do sêmen é importante para a viabilidade do espermatozoide e
para a fertilidade da vaca inseminada (Jasial et al., 2000).

Na inseminação artificial é importante o controle eficiente da população de microrganismos no

sêmen, prevenindo, assim, a introdução de doenças em animais, rebanhos, regiões e países em
que ainda não estavam presentes. A contaminação com agentes não específicos pode ocorrer
durante o processamento e armazenamento do sêmen, e não apenas da atmosfera, mas também
de substâncias de origem animal adicionadas ao diluente do sêmen. Outras fontes de
contaminação incluem os equipamentos e materiais que têm contato direto ou indireto com o
sêmen, como os frascos em que é armazenado (Thibier e Guerin, 2000).

Estudos (Gangadhar et al., 1986; Brinda et al.,1994; Jasial et al., 2000) demonstram que o grau
de contaminação do sêmen fresco de bubalinos com flora saprófita pode ser maior que 104
UFC/mL. A fagocitose das bactérias presentes no sêmen aumenta a produção de espécies
reativas ao oxigênio (ROS) pelos macrófagos e pelos granulócitos naturais do sêmen
(Kessopoulou et al., 1992; Rana et al., 2012). O consequente aumento das ROS prejudica as
24
funções do espermatozoide e sua capacidade fecundante (Rana et al., 2012). Assim, é
fundamental a adoção de práticas higiênicas durante a coleta e o uso de antibióticos apropriados
no meio diluidor do sêmen.

3.4.1. Avaliação da contaminação bacteriana do sêmen

Existem numerosos métodos de contagem de colônias que diferem principalmente quanto aos
meios usados para obter colônias separadas para a contagem. Em contagem de superfície, o
inoculo é semeado na superficie da placa com ágar nutriente seco, enquanto em outros métodos,
como o de pour plate, o inoculo é misturado ao ágar nutriente fundido que é imediatamente
distribuído e mantido à temperatura ambiente antes da incubação (Meynell e Meynell, 1970).

A técnica preconizada pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) para a espermocultura
é a técnica de pour plate (Carvalho et al., 2012). Nesta técnica, quando o meio é vertido na
placa de Petri para ser misturado ao inoculo sua temperatura é de aproximadamente 45,0°C,
assim, as bactérias aeróbias que serão isoladas devem ser capazes de suportar temporariamente a
temperatura do ágar fundido (Gerhardt, 1994).

A microbiologia do sêmen de touros bubalinos se assemelha muito à de touros bovinos (Jasial et

al., 2000). Os principais microrganismos encontrados no sêmen de búfalos, em ordem de maior
frequência, são: Bacillus spp., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis,
Escherichia coli, Micrococcus spp., Staphylococcus aureus, Corynebacterium renale, Klebsiella
spp., Proteus spp., Enterobacter spp (Naidu et al., 1982; Bindra et al., 1994).

Os resultados de cinco trabalhos com contagem de colônias no sêmen de touros bubalinos que
foram publicados entre 1982 e 2012 estão resumidos na Tabela 4.
Tabela 4. Contagem de colônias bacterianas em amostras de sêmen de touros bubalinos coletadas com
vagina artificial convencional.
Referência Meio de cultura UFC/mL

Naidu et al., 1982 --- 9, 83 x 103

Bindra et al., 1994 PCA (ágar de contagem em 0,43 x 103

placas)

Shukla, 2005 --- 0,048 x 103

Akhter et al., 2008 Ágar triptose + extrato de 15,70 x 103

levedura

Panchal et al., 2012 Ágar nutriente 1,30 x 103

25
4. Experimento I – Características do comportamento sexual de touros bubalinos
na coleta de sêmen com vagina artificial interna e eficiência do método de coleta.

4.1. Material e métodos

Experimento aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal – UFMG sob o
Protocolo CEUA nº 129/2014.

4.1.1. Localização e animais experimentais

O comportamento sexual de reprodutores bubalinos foi estudado em quatro situações distintas.
A saber: na Fazenda A, foram utilizados quatorze tourinhos bubalinos, sem experiência sexual
prévia e três touros com experiência sexual prévia, todos da raça Mediterrâneo; na Fazenda B,
foram utilizados onze reprodutores, com experiência sexual prévia, sendo seis da raça Murrah e
cinco da raça Mediterrâneo; na Fazenda C, um búfalo Murrah foi observado, com experiência
sexual prévia e; na Fazenda D, uma Central de coleta e processamento de sêmen, onde os nove
animais já estavam condicionados a coleta de sêmen com a vagina artificial convencional, todos
da raça Murrah.

Fazenda A

Propriedade localizada no Estado do Espírito Santo (19°26’41,0’’S e 40°03’45,0’’O; altitude

média: 28 m). A região é caracterizada pelo clima tropical, e, durante os cinco dias do
experimento (17 a 21 de junho de 2014) a temperatura máxima foi 29,8°C e a mínima 18,9°C e
umidade relativa do ar entre 83,5 e 93,5%.

Foram utilizados búfalos Mediterrâneo, que eram mantidos em regime extensivo, em pastagem
de Brachiaria brizanta com suplementação de sal mineral ad libitum. Foram utilizados 14
tourinhos bubalinos com idade entre 19 e 30 meses. Os tourinhos foram selecionados de um
plantel de 45 animais, com base na idade (≥ 18 meses) e na circunferência escrotal (≥ 25,0 cm).
Estes animais não possuíam experiência sexual prévia. Os três animais adultos (≥ 9 anos e
circunferência escrotal ≥ 29,0 cm) utilizados nesta propriedade eram mantidos como
reprodutores e permaneciam com as fêmeas, em regime de pastejo rotacionado. Como
manequim, foram utilizadas oito fêmeas não gestantes, com boa condição corporal e porte
compatível aos reprodutores avaliados. Apenas para os animais com experiência sexual foram
utilizadas fêmeas em estro natural. O local utilizado para a coleta de sêmen era sombreado e não
possuía tronco específico para coleta, mas a fêmea foi contida de modo que permitisse ao macho
realizar o salto.

Cada touro foi observado pelo menos três vezes, durante os cinco dias, e observado em ordem
aleatória. Para a avaliação do comportamento, os animais receberam as seguintes identificações:
B1 a B17. Sendo que os animais B15, B16 e B27 possuíam experiência sexual prévia.

Fazenda B

Localizada no Estado de Minas Gerais (20°46’50’’S e 44°39’23’’O, altitude média: 982 m). Em
uma região caracterizada como clima temperado de altitude, nos dias 16 a 29 de junho de 2014,
houve temperatura máxima de 25,0°C e mínima de 8,5°C, com umidade relativa do ar entre 66,5
e 97,5%.
26
Os animais eram mantidos em regime intensivo, com dieta baseada em silagem de milho e
concentrado de fubá de milho, farelo de soja, caroço de algodão, farelo de trigo e mistura
mineral. Foram utilizados onze touros bubalinos, com idade entre 3 e 10 anos e circunferência
escrotal maior que 33,0 cm. Os touros possuíam experiência sexual prévia, e eram utilizados
como reprodutores. Destes reprodutores, quatro eram mantidos separados das fêmeas e contidos
individualmente, devido ao temperamento agressivo. Os outros sete reprodutores eram mantidos
junto com as fêmeas, com a distribuição de um touro em cada lote com média de 60 fêmeas,
com exceção dos dois touros mais novos, que eram mantidos no mesmo lote. Vinte fêmeas em
estro natural foram utilizadas como manequim. O tronco utilizado para conter a fêmea
manequim era específico para coleta de sêmen e estava em local não sombreado. Os búfalos
utilizados pertenciam à raça Murrah (n=6) e Mediterrâneo (n=5).

Cada touro foi observado pelo menos seis vezes, e era levado para o local de observação em
ordem aleatória. Os touros receberam as seguintes identificações para a análise do
comportamento sexual: B18 a B28.

Fazenda C

Propriedade localizada no munícipio de Sete Lagoas, no Estado de Minas Gerais (19°33'41.2"S

e 44°15'36.8" O). Região de clima tropical úmido, com registros de temperaturas máxima e
mínima nos dias do experimento 29°C e 10°C, respectivamente.

O búfalo Murrah utilizado nesta propriedade era mantido em regime extensivo, com
complementação com cevada durante o ano todo. O touro, com idade estimada de sete anos, era
mantido como reprodutor, e durante os dias do experimento foi separado do lote de fêmeas. As
observações aconteciam em dois períodos do dia: o primeiro iniciava de madrugada às
04h00min e encerrava às 07h00min, o segundo período começava às 11h00min e terminava às
12h00min. Às 03h00min o touro era levado ao lote de fêmeas para detecção de fêmea em estro,
da mesma maneira às 10h30min no segundo período de observação do dia. A fêmea identificada
em estro era utilizada como manequim para a coleta de sêmen.

O touro era observado por 20 minutos, em curral sombreado de aproximadamente 12m2, onde a
fêmea manequim com a vagina artificial interna era deixada solta. O animal foi observado em
dezesseis ocasiões. O animal recebeu a identificação de B29 para a análise do comportamento
sexual.

Fazenda D

Realizado na Central de coleta e processamento de sêmen, do Centro de Biotecnologia em

Bubalinocultura, no Estado de Minas Gerais (19°38’20’’S e 44°02’57’’O; altitude média: 902
m). A Central é localizada em região de clima tropical úmido, as temperaturas máxima e
mínima, durante o período do experimento, foram 30,0°C e 21,0°C, respectivamente, e a
umidade relativa do ar durante este período variou entre 35,5 e 94,0%.

Os nove búfalos eram mantidos em regime extensivo, com complementação de silagem de

sorgo, durante a época seca. No caso destes machos, eles estavam condicionados a coleta de
sêmen com vagina artificial convencional. Os touros tinham idade entre 3 e 5 anos e

27
circunferência escrotal maior que 27,0 cm. Foram utilizadas três fêmeas como manequim, fora
do estro, e a coleta acontecia em tronco específico para tal procedimento.

Os touros foram observados cinco vezes, e eram levados ao local de observação em ordem
aleatória. Para análise do comportamento, os animais receberam as seguintes identificações:
B30 a B38.

4.1.2. Vagina artificial interna

A vagina artificial interna é constituída por duas partes (Figura 2), uma é o anel de poliuretano
com diâmetro de 6,5 cm e com largura de 2,5 cm e a outra é uma haste de aço inox, as duas
peças se encaixam tornando possível o ajuste do comprimento do dispositivo de 24 a 30 cm. O
anel de poliuretano é revestido por uma mucosa artificial, a mesma utilizada em vagina artificial
convencional. As duas peças unidas são revestidas pelo saco plástico coletor estéril, que recebe
o sêmen no momento da ejaculação do touro. O dispositivo completamente montado tem peso
médio de 200g.

Para que seja introduzido na fêmea, o dispositivo deve ser completamente lubrificado em sua
porção externa, com lubrificante à base de água, não espermicida (K.MED, CIMED, Brasil).

Figura 2. Foto da Vagina Artificial Interna utilizada no estudo.

28
Antes da introdução do dispositivo, a fêmea tinha o reto esvaziado e a região perineal limpa
com papel-toalha seco. A vagina artificial interna era então introduzida para além do esfíncter
vestibular da fêmea. Após a monta, a vagina artificial é retirada da fêmea e o sêmen é
transferido de dentro do saco coletor para um tubo graduado estéril e prontamente avaliado.

4.1.3. Comportamento sexual e coleta de sêmen

Após a colocação da vagina artificial interna na fêmea, o macho era introduzido no espaço de
coleta. Os animais eram observados por tempo médio de dez minutos. Para os machos da
Fazenda B, o tempo de observação foi estendido para 40 minutos, devido a fatores de distração
no ambiente de coleta, como a passagem de lotes de fêmeas para a ordenha ou a presença de
bezerros no curral de coleta. Os machos que realizavam a cópula eram imediatamente retirados
do local de coleta, para retirada e substituição da vagina artificial interna e para a introdução de
um novo macho. Os búfalos eram levados para a coleta de sêmen em ordem aleatória. Na
fazenda C, onde a coleta acontecia semanalmente, caso o búfalo não ejaculasse na primeira
tentativa lhe eram concedidas no máximo mais duas oportunidades no mesmo dia.

As informações de sucesso ou falha na coleta, do tempo de reação e dos eventos do

comportamento sexual dos touros, durante o período em que permaneceram com a fêmea, foram
registradas. O tempo de reação foi considerado o tempo entre a apresentação do macho à fêmea
até a realização da monta completa. Os eventos do comportamento sexual do macho registrados
foram:

 Cheirar a fêmea;  Monta com exposição;

 Lamber a vulva;  Penetração sem o galeio;
 Dar cabeçada;  Penetração no ânus;
 Pressão de queixo;  Contração do prepúcio;
 Reflexo de Flehmen;  Cheirar o chão;
 Exposição do pênis (>10,0 cm);  Urinar;
 Monta sem exposição;  Cheirar/lamber urina da fêmea.
Estes eventos foram registrados quanto a sua frequência como sugerido por Altmann (1974).

4.1.4. Análise estatística

Os dados de comportamento sexual de cada touro foram analisados de forma descritiva,
utilizando a proporção de cada evento no conjunto de todos os comportamentos que o animal
realizou. Para a descrição dos comportamentos os animais foram divididos em três categorias:
Categoria 1: búfalos condicionados a coleta de sêmen com vagina artificial convencional (B30 a
B38); Categoria 2: búfalos sem experiência sexual (B1 a B14); Categoria 3: búfalos com
experiência sexual (B15 a B29). A eficiência do método de coleta foi analisada descritivamente,
avaliando a eficiência total de coleta de sêmen (nº de sucesso de coleta/ nº de tentativas);
eficiência quanto aos animais que testaram a vagina artificial interna (nº de sucesso de coleta/ nº
de animais que penetraram na vagina) e a eficiência quanto ao número de animais utilizados (nº
de sucesso de coleta/ nº de búfalos).

4.2. Resultados e discussão

Com o intuito de caracterizar o comportamento sexual dos búfalos no momento da coleta de
sêmen com a vagina artificial interna, os dados de comportamento foram descritos
29
separadamente para o grupo de búfalos dos quais foi possível coletar sêmen e para o grupo dos
quais não foi possível.

Na Figura 3, estão apresentados os eventos do comportamento sexual dos 27 touros dos quais
foi possível coletar sêmen com a vagina artificial interna. Os dados foram representados pela
proporção em que cada evento do comportamento era realizado por cada animal.

Os comportamentos de cheirar, lamber e reflexo de Flehmen estão relacionados com a

identificação da fêmea (Santos, 2001). Apesar de todos os animais realizarem comportamentos
de identificação, a intensidade com que cada um os realizou foi variável. Para o comportamento
de cheirar a máxima proporção de ocorrência foi de 28,57% e a mínima foi de 2,56%. O
comportamento de lamber apresentou a máxima proporção de ocorrência de 44,90%, enquanto
houve dois (7,41%) animais que não o realizaram. O reflexo de Flehmen não foi realizado por
outros dois (7,41%) animais, porém sua máxima proporção de ocorrência foi de 28,05%. Um
estudo (Samo et al., 2005) realizado com seis búfalos da raça Kundhi, observou que os
comportamentos mais frequentes dos búfalos ao se aproximarem da fêmea para a coleta de
sêmen com vagina artificial foram: fungar (38,19%), cheirar (17,36%), pressão de queixo
(37,5%) e reflexo de Flehmen (13,5%). No presente estudo, o comportamento de cheirar foi
realizado por 100,00% (n=27) dos touros dos quais foi possível coletar sêmen com a vagina
artificial interna. Ainda neste grupo de animais, os comportamentos de lamber e de reflexo de
Flehmen foram realizados por 92,59% (n=25) e o comportamento de pressão de queixo foi
realizado por 96,30% (n=26) destes animais, sendo que sua máxima proporção de ocorrência foi
de 28,57%. A realização dos comportamentos de cheirar, lamber e de reflexo de Flehmen por
uma grande porcentagem dos animais, 100,00%, 92,59% e 92,59%, respectivamente, demonstra
a importância dos comportamentos de identificação da fêmea realizados pelo macho durante o
cortejo sexual.

Os comportamentos de exposição do pênis (>10 cm) e de contração do prepúcio foram

realizados por uma grande porcentagem de animais dos quais foi possível coletar sêmen com a
vagina artificial interna, 88,89% (n=24) e 81,48% (n=22), respectivamente. A realização destes
comportamentos foi considerada como indicativo de excitação sexual do macho antes do salto.
A monta com exposição do pênis foi realizada por 96,30% (n=26) dos touros dos quais se
coletou sêmen com a vagina artificial interna, e a monta sem exposição foi realizada por 74,07%
(n=20) destes animais. Os comportamentos de monta com exposição do pênis e de monta sem a
exposição são classificados como pré-copulatórios (Santos, 2001). Os comportamentos pré-
copulatórios foram entendidos como os comportamentos que o macho realiza para avaliar o
grau de aceitação da fêmea à monta completa. Pôde-se perceber na Figura 3 que os animais que
pertencem a Categoria 1 (B30 a B38) apresentaram padrões de comportamentos similares, o que
pode ser consequência do condicionamento destes animais à coleta de sêmen com a vagina
artificial convencional. Estes animais além de apresentarem padrões similares de
comportamento, foram os únicos a apresentarem o comportamento de cheirar o chão do local de
coleta, 8 dos 9 (88,89%) touros desta categoria realizaram tal comportamento. Acredita-se que
este comportamento esteja relacionado com a identificação do local, assim como a identificação
de odores da fêmea e de outros touros que já haviam passado pelo local de coleta.

Nas tentativas em que ocorreu pelo menos uma vez o evento de penetração sem galeio, mas que
ao final resultaram em ejaculação (n=18), a ocorrência desse evento estava relacionada às

30
ocasiões em que a vagina artificial interna saiu da posição correta dentro da fêmea (33,33%) e
às ocasiões em que o dispositivo foi expulso pela fêmea após fortes contrações (66,67%).

O comportamento inesperado de penetração no ânus, observado em 11 (40,74%) animais do

grupo de sucesso de coleta e em 4 (36,36%) animais do grupo de não sucesso, também foi
relatado por Cruz (2007) ao testar o modelo canadense de vagina artificial interna em touros
bovinos da raça Devon. Segundo o referido autor, a ocorrência deste comportamento em
15,38% dos animais testados foi devida à falta de experiência sexual. No entanto, no presente
estudo animais com experiência sexual também realizaram este comportamento. No estudo do
pesquisador canadense Barth et al. (2004), detentor da patente da vagina artificial interna
utilizada por Cruz (2007), o comportamento de penetração no ânus não foi relatado em touros
das raças Charolês, Aberdeen Angus e Hereford. Provavelmente a ocorrência deste
comportamento nas três categorias de experiências sexuais estudadas (animais condicionados,
sem experiência e com experiência sexual) esteve relacionada com a inexperiência destes
animais no processo de coleta de sêmen. Assim como os animais sem experiência sexual
(Categoria 2), os animais condicionados (Categoria 1) não possuíam experiência de monta a
campo, não tendo realizado nenhuma penetração na vagina antes da coleta de sêmen com a
vagina artificial interna, este fato pode ter contribuído para que ocorressem penetrações errôneas
no ânus da fêmea durante a tentativa de penetração na vagina. Enquanto os animais da Categoria
3 que realizaram a penetração no ânus apesar de possuírem experiência sexual, não possuíam
familiaridade com o processo de coleta, sendo que o ambiente e a contenção da fêmea
representavam situação adversa ao momento da monta natural. Esta adversidade pode ter
causado insegurança no momento do salto, resultando em penetrações errôneas no ânus da
fêmea.

Os comportamentos dos 11 machos bubalinos, dos quais não foi coletado nenhum ejaculado
com o uso da vagina artificial interna, estão representados em proporções na Figura 4. Destes
animais todos cheiraram a fêmea manequim ao serem apresentados a ela. Contrações do
prepúcio foram consideradas indicativas de excitação sexual e apesar de ser observado certo
grau de excitação em oito (72,73%) destes animais, as tentativas de monta (monta com
exposição e monta sem exposição) foram pouco observadas. O animal B12 pareceu ser uma
exceção a esta afirmação, realizando grande proporção de montas com exposição. O não
sucesso de coleta de sêmen deste animal, apesar dos indicativos de interesse, pode ser resultado
de sua falta de experiência sexual prévia ou de condicionamento à coleta. Os animais da
Categoria 3 que demonstraram menor interesse pela fêmea (B15, B16 e B17) eram os animais
mais velhos do grupo de búfalos dos quais não foi possível coletar sêmen. Apesar do touro B16
demonstrar certo interesse pela fêmea, após realizar a monta sem exposição, não continuou o
cortejo. Acredita-se que estes animais por possuírem experiência sexual reconhecem melhor o
estádio do estro da fêmea e por isso se arriscam menos em tentativas de monta que os animais
com menos ou sem experiência sexual. Os animais com experiência sexual podem também ter
reconhecidos odores estranhos à uma fêmea em estro, oriundos da manipulação da fêmea para a
colocação do dispositivo, como a limpeza do reto, a aplicação de lubrificante no dispositivo e o
odor do técnico que manipulou a fêmea. A presença destes odores pode ter mascarado os odores
da fêmea em estro utilizada como manequim para os búfalos com experiência sexual, causando
o desinteresse observado nesta categoria de animais do grupo em que não foi possível coletar
sêmen com o uso da vagina artificial interna.

31
Figura 3. Proporção dos eventos (cheirar, lamber, reflexo de Flehmen, pressão de queixo, cabeçada, contração do prepúcio, monta sem
exposição, monta com exposição, penetração no ânus, penetração sem galeio e cheirar o chão) do comportamento sexual de cada touro
bubalino do qual foi possível a coleta de sêmen com a vagina artificial interna. Categoria 1= búfalos condicionados a coleta de sêmen com
vagina artificial convencional; Categoria 2= búfalos sem experiência sexual; Categoria 3= búfalos com experiência sexual.

32
Figura 4. Proporção dos eventos (cheirar, lamber, reflexo de Flehmen, pressão de queixo, cabeçada, contração do prepúcio, monta sem
exposição, monta com exposição, penetração no ânus, penetração sem galeio e cheirar o chão) do comportamento sexual de cada touro
bubalino do qual não foi possível a coleta de sêmen com a vagina artificial interna. Categoria 2= búfalos sem experiência sexual; Categoria
3= búfalos com experiência sexual.

33
O tempo de reação médio, em segundos, dos vinte e sete búfalos, foi apresentado (Tabela 5) de
acordo com as categorias de experiência sexual (condicionados a coleta de sêmen com vagina
artificial convencional, sem experiência sexual prévia e com experiência sexual).
Tabela 5. Médias e desvios padrão do tempo de reação (em segundos) de acordo com a categoria de
experiência sexual dos touros bubalinos estudados.
Experiência sexual Tempo de reação Tempo de reação Tempo de reação
(s) X ± DP máximo (s) mínimo (s)
Categoria 1 247,39 ± 106,70 423,63 100,00
Categoria 2 406,46 ± 181,50 609,00 149,33
Categoria 3 429, 65 ± 228,51 820.50 120,00
Categoria 1= Búfalos condicionados a coleta de sêmen com vagina artificial convencional; Categoria
2 = Búfalos sem experiência sexual; Categoria 3 = Búfalos com experiência sexual.

Os valores médios do tempo de reação encontrados para as três categorias de animais estão
dentro do intervalo de 60 a 900 segundos, relatado por Dixit et al. (1984) para touros Murrah.
Contudo, Pawar e Nagpaul (1994) e Tomar e Singh (1996) relatam valores médios mais baixos,
também para touros Murrah, de 32,6 e 66,10 segundos, respectivamente.

Nas fazendas (B e C) que possuíam os animais da categoria com experiência sexual, o local de
coleta era situado ao lado e no caminho da sala de ordenha, sendo rota de algumas rotinas das
fazendas, como passagem de bezerros e de lotes de búfalas para a ordenha. Em algumas
ocasiões, os outros reprodutores se encontravam muito perto do local de coleta representando
uma distração ou ameaça. Acredita-se que o valor médio do tempo de reação dos animais da
Categoria 3 (com experiência sexual), que foi alto, tenha sofrido influência destes fatores do
ambiente de coleta. Ohashi (2008) aconselha evitar a proximidade entre búfalos adultos, pois
estes machos não permitem a presença de outro macho na mesma área, podendo ocorrer brigas
violentas. A presença de odores estranhos à fêmea oriundos da manipulação para colocação do
dispositivo pode ter dificultado o reconhecimento do estro da fêmea utilizada como manequim,
aumentando o tempo de reação destes animais. Para os animais da Categoria 2 (sem experiência
sexual), acredita-se que o valor médio do tempo de reação encontrado seja consequência da
inexperiência sexual destes tourinhos. Segundo MacDonald (1975) touros que nunca tiveram
contato com uma fêmea demandam mais tempo para conseguirem realizar a monta.

Os resultados de eficiência do uso da vagina artificial interna para os 38 búfalos estudados estão
resumidos na Tabela 6.

34
Tabela 6. Eficiência do uso da vagina artificial interna para coleta de sêmen em búfalos.
Eficiência de Eficiência de Nº tentativas
Búfalos com
animais teste (nº coleta (nº sucesso/ até a 1ª coleta
sucesso de coleta
sucesso/ nº testes) nº tentativas) de sêmen
Categoria 1 100,00% (9/9) 100,00% (9/9) 57,75% (41/71) 1

Categoria 2 91,67% (11/12) 78,57% (11/14) 37,25% (19/51) 1–4

Categoria 3 87,50% (7/8) 46,67% (7/15) 14,39% (20/139) 2–8

Total 93,10% (27/29) 71,05% (27/38) 30,65% (80/261) 1–8

Categoria 1= Búfalos condicionados a coleta de sêmen com vagina artificial convencional; Categoria 2 =
Búfalos sem experiência sexual; Categoria 3 = Búfalos com experiência sexual.

Os resultados encontrados para animais que de fato testaram a vagina artificial interna, ou seja,
chegaram a penetrar na vagina da fêmea, demonstram que o modelo de vagina artificial interna
utilizado permite a coleta de sêmen de touros bubalinos com alta eficiência.

Ao testar a vagina artificial interna canadense em touros Devon, Cruz (2007) relata sucesso na
coleta de 86,5% dos touros testados (a experiência sexual era diferente entre os animais
testados). Valor mais baixo de sucesso foi relatado no estudo original (Barth et al., 2004) da
vagina artificial interna canadense. Os pesquisadores canadenses conseguiram coletar sêmen de
54,2% dos touros bovinos testados, quando os animais não possuíam experiência sexual e, de
69,6% quando os mesmos animais foram utilizados um ano depois, já com experiência sexual.
Apenas os búfalos da Categoria 1 apresentaram sucesso de coleta superior aos sucessos de
coleta dos reprodutores bovinos encontrados por Barth et al. (2004) e por Cruz (2007),
provavelmente por que os búfalos desta categoria eram condicionados a coleta com a vagina
artificial convencional. Os búfalos da Categoria 2 apresentaram resultados superiores aos do
estudo de Barth et al. (2004), quando estes bovinos também não possuíam experiência sexual.
No trabalho de Barth et al. (2004), cinco reprodutores bovinos eram colocados ao mesmo tempo
no local de teste, e o número de tentativas por animal durante o período de teste não foi relatado.
No estudo de Cruz et al. (2007), os machos bovinos eram colocados no local de coleta de dois
em dois e o número de tentativas por macho durante o período de teste também não foi relatado.
As diferenças de espécie e de metodologia podem justificar os resultados encontrados.

O condicionamento dos búfalos da Categoria 1 à coleta de sêmen com a vagina artificial

convencional provavelmente determinou o sucesso de coleta de 100,00%, que foi superior ao
das outras duas categorias estudadas. A Categoria 3 apresentou o resultado mais baixo
(46,67%). Como os búfalos desta categoria possuíam experiência sexual, possivelmente eles
eram mais exigentes quanto ao momento de realizar a cópula, seja pelo momento do estro em
que a fêmea manequim se encontrava, seja pelo ambiente que o rodeava. Outro fator que
poderia ter influenciado este resultado é o reconhecimento da presença da vagina artificial
interna pelo reprodutor, contudo dos oito animais desta categoria que não ejacularam apenas
dois (25,00%) chegaram a realizar a penetração na vagina. Porém estes animais podem ter
reconhecidos odores estranhos à uma fêmea em estro e por isto não tentaram a monta completa.

Na Categoria 1, após o primeiro sucesso de coleta de sêmen com a vagina artificial interna,
100,00% (n=9) dos búfalos ejacularam pelo menos mais duas vezes e 77,78% (n=7) ejacularam
35
mais quatro vezes. Na Categoria 2, dos dez búfalos que ejacularam, após o primeiro sucesso de
coleta, 54,54% (n=6) dos touros ejacularam pelo menos mais uma vez e 18,18% (n=2)
ejacularam mais duas vezes. Na Categoria 3, dos sete búfalos que ejacularam, após o primeiro
sucesso de coleta, quatro (57,14%) touros ejacularam pelo menos mais uma vez, um touro
(14,28%) ejaculou mais duas vezes e dois (28, 57%) ejacularam mais cinco vezes.

Em 10,34% (n=27) das tentativas não foi possível coletar sêmen com a vagina artificial interna
devido a acontecimentos relacionados ao dispositivo (Tabela 7). Acredita-se que a expulsão do
dispositivo pela fêmea foi consequência do posicionamento incorreto dentro da vagina (anterior
ao vestíbulo vagina) por inexperiência do operador ao colocá-lo, como também foi pela
utilização de novilhas bubalinas, com o diâmetro do canal vaginal estreito, impedindo o correto
posicionamento do dispositivo dentro da fêmea. Contrariamente, o desvio da posição dentro da
fêmea aconteceu quando se utilizou como manequim, fêmeas adultas, que já haviam parido pelo
menos uma vez. Nestas ocasiões, o canal vaginal da fêmea possuía um diâmetro maior, e, no
momento da colocação ou retirada do dispositivo, criava-se uma bolsa de ar no canal vaginal,
impedindo o correto posicionamento do dispositivo. A retirada do ar pela manipulação do
aparelho reprodutivo via retal, antes da introdução da vagina artificial interna, reduziu este tipo
de ocorrência.
Tabela 7. Ocorrências que impediram a coleta de sêmen com a vagina artificial interna.
Ocorrência Quantidade
Expulsão do dispositivo pela fêmea 10
Desvio da posição dentro da fêmea 12
Rompimento do saco coletor 5

4.2.1. Considerações gerais

 Sempre que apresentados à fêmea para a tentativa de coleta de sêmen com a vagina
artificial interna os touros realizaram pelo menos o comportamento de cheirar, tido
como comportamento de identificação. Houve variação aparente de intensidade e de
variedade de comportamentos realizados por búfalos que conseguiram sucesso na coleta
e por aqueles que não conseguiram.

 Com a utilização da vagina artificial interna foi possível coletar sêmen de 100% dos
touros condicionados à coleta com vagina artificial convencional, de 78,57% dos
tourinhos sem experiência sexual e de 46,67% dos animais com experiência sexual.

 As causas de falha na coleta não relacionadas aos animais foram: expulsão do

dispositivo pela fêmea, desvio da posição do dispositivo dentro da fêmea e rompimento
do saco coletor.

36
 5. Experimento II – Avaliações da qualidade seminal, da contaminação
bacteriana do sêmen e da eficiência de recuperação de espermatozoides do
método de vagina artificial interna.
5.1. Material e Métodos
Experimento aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal – UFMG sob o
Protocolo CEUA nº 129/2014.

5.1.1. Localização e animais experimentais

Este experimento utilizou seis dos nove touros da Fazenda D, descritos no item 4.1.1.

5.1.2. Delineamento experimental

Para comparar o sêmen coletado pela vagina artificial interna ao coletado pela vagina
convencional, o experimento foi delineado em blocos ao acaso, sendo o touro o bloco. Para
balanceamento entre os métodos de coleta, no dia da coleta, os animais foram sorteados entre os
dois métodos e as coletas aconteceram em ordem aleatória. Foram realizadas três coletas em
cada método para cada um dos seis animais, totalizando trinta e seis ejaculados. Foram
comparadas entre os dois métodos de coleta: as características macro e microscópicas,
contaminação bacteriana dos ejaculados e a eficiência de recuperação de espermatozoides.

5.1.3. Coleta de sêmen

Para a realização das coletas de sêmen, os dispositivos utilizados eram higienizados e os sacos
coletores dos dois métodos foram submetidos ao processo de esterilização por raio ultravioleta,
por 20 minutos a 20,0 cm da fonte (Alexandre et al., 2008).

5.1.3.1. Vagina artificial interna

A vagina artificial interna e o seu modo de utilização foram descritos no item 4.1.2.

5.1.3.2. Vagina artificial convencional

O modelo utilizado consistia em um cilindro rígido de 30,0 cm, de Policloreto de Vinila (PVC),
aberto em ambas as extremidades. Em seu interior era acomodado um tubo flexível de borracha,
fixado às bordas do tubo rígido por meio de tiras elásticas, formando um compartimento entre
ambos. Neste compartimento eram introduzidos água morna e ar, visando à obtenção de uma
temperatura final de coleta entre 39,0 e 41,0°C. O volume e a pressão no interior do
compartimento eram controlados com o auxílio de uma válvula presente no cilindro rígido. O
sêmen era coletado em um tubo graduado estéril, que se encontrava acoplado ao saco estéril que
envolvia o interior do cilindro.

5.1.4. Avaliação da qualidade seminal

Imediatamente após a coleta, cada ejaculado foi separado em duas alíquotas, uma para avaliação
da qualidade e a outra para a avaliação da contaminação do sêmen (item 4.2.5).

O sêmen foi avaliado macroscopicamente quanto ao volume (mL), cor e aspecto.

Microscopicamente o sêmen foi avaliado quanto ao turbilhonamento, motilidade total e vigor,
em microscópio de campo claro em aumento de 400 vezes.

37
A concentração espermática foi avaliada imediatamente após a coleta, diluindo uma alíquota do
ejaculado na proporção de 1:200 em solução de formol salina tamponada, com posterior
contagem dos espermatozoides em câmara de Neubauer, utilizando microscópio óptico em
aumento de 400 vezes.

Para a análise CASA, o sêmen era diluído em extensor comercial (Botu-Bov®, Botupharma,
Brasil), para a concentração final de 50 x 106 espermatozoides/mL. Gotas de 5,0 μL de cada
amostra foram colocadas entre lâmina e lamínula, previamente aquecidas a 37,0°C. O aparelho
utilizado foi o modelo Sperm Class Analyzer (SCA® v.4.0), os parâmetros para calibração do
sistema (setup) foram descritos no Anexo 1. Para a análise de cada amostra foram capturados
cinco campos, homogêneos, com um mínimo de 300 células espermáticas em cada um deles.

Para a avaliação da morfologia espermática, uma amostra de sêmen foi adicionada a 1,0 mL de
solução de formol salino tamponada de Hancock (1957) aquecida a 37,0ºC, até que o líquido
turvasse (CBRA, 2013). A avaliação foi realizada pela técnica de câmara úmida em microscópio
de contraste de fase, em aumento de 1000 vezes, sob objetiva de imersão, sendo analisadas 200
células, analisando as alterações de forma e estrutura e classificando-as em defeitos maiores e
defeitos menores de acordo com Bloom (1973).

5.1.5. Avaliação da contaminação bacteriana do sêmen

Para a avaliação da contaminação do sêmen, foram utilizadas as amostras separadas nos
microtubos autoclavados, logo após sua coleta. A partir de cada amostra, uma alíquota de sêmen
foi mantida pura e outra alíquota foi diluída em extensor comercial (Botu-Bov®, Botupharma,
Brasil), na concentração de 50 x 106 espermatozoides/mL, para avaliação da ação do antibiótico
(desconhecido) presente no extensor sobre a contaminação. A amostra diluída era deixada em
temperatura ambiente por trinta minutos, antes de ser colocada no isopor refrigerado (18ºC) para
transporte.

Para a realização da contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL), as duas amostras

de sêmen (puro e diluído) de cada animal eram transportadas (até uma hora e meia após a
coleta) em isopor com gelo reciclável, para o laboratório de rotina para cultivo e isolamento de
bactérias. Para o processamento da análise microbiológica, foi adotada a técnica de pour plate.
As amostras foram submetidas à diluição de 10-1 e 10-2 (500µL da amostra em 4500µL de
solução salina estéril 0,85%). De cada diluição de sêmen, 500μL foram transferidos para placas
de Petri estéreis em duplicata (uma do sêmen puro e a outra do sêmen diluído), e adicionados
15,0 mL de ágar padrão para contagem bacteriana total (PCA, Merck®, Alemanha) e incubada a
37,0°C. Após 48 horas de incubação, foi feita a contagem das colônias com o auxilio de uma
lupa.

5.1.6. Avaliação da eficiência de recuperação de espermatozoides

A avaliação da eficiência de recuperação dos espermatozoides foi realizada pelo método
proposto por Flick e Merilan (1986). Imediatamente após a coleta, a vagina artificial interna ou
a vagina artificial convencional eram levadas para o laboratório e o sêmen era recuperado de
dentro dos sacos coletores. Cada saco coletor era então lavado com 30,0 mL de soro ringer
lactato e o líquido resultante era recebido em tubo falcon de 50,0 mL. Subsequentemente, era
feita a contagem de espermatozoides do ejaculado e do lavado, em câmara hemocitométrica. A
eficiência de recuperação de espermatozoides para cada método de coleta foi calculado como se
segue:
38
 % eficiência = número total de espermatozoides no ejaculado x 100
nº total de sptz no ejaculado + nº total de sptz no lavado

5.1.7. Análise estatística

Foi utilizado o delineamento experimental em blocos ao acaso, sendo o animal o bloco. Para
cada tratamento (método de coleta), foram utilizadas 18 repetições, sendo três ejaculados por
animal. As variáveis paramétricas foram testadas quanto à normalidade e
homocedasticidade. Quando da violação desses pressupostos, os dados foram transformados em
Log(x) ou x . Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias
comparadas pelo teste de Fisher (entre os tratamentos). As variáveis não paramétricas e as
variáveis paramétricas que não respeitaram os princípios de normalidade e homocedasticidade
mesmo após a transformação foram analisadas pelo teste não paramétrico de Wilcoxon. Os
dados foram analisados com nível de probabilidade p<0,05.
5.2. Resultados e Discussão
5.2.1. Avaliação da qualidade seminal

Os valores médios das características seminais encontrados para o sêmen coletado com a vagina
artificial interna e com a vagina artificial convencional estão representados na Tabela 8. Estes
valores são condizentes com reprodutores bubalinos de boa qualidade seminal (Vale, 2011).
Tabela 8. Características do sêmen fresco puro de touros bubalinos coletado pelos métodos de vagina
artificial interna e vagina artificial convencional
Vagina Artificial Vagina Artificial
Interna Convencional

Volume (mL) 1,52 ± 0,24b 2,58 ±0,35ª

Concentração (x106) 952 ± 114a 1282 ± 180ª

Espermatozoides totais (x106) 1496 ± 254b 3982 ± 911ª

Motilidade subjetiva (%) 77,50 ± 3,95a 79,72 ± 4,19ª

Espermatozoides normais (%) 87,17 ± 0,81a 88,17 ± 0,92ª

Defeitos menores (%) 2,39 ± 0,40a 2,78 ± 0,46ª

Letras diferentes nas linhas indicam diferença estatística entre os métodos (p<0,05).

O volume de sêmen coletado com a vagina artificial interna foi menor do que o da vagina
convencional. O refluxo de sêmen durante a retirada do dispositivo de dentro da fêmea que
poderia causar a redução do volume de sêmen coletado foi registrado em apenas três ocasiões
(16,67%). No momento da monta natural dos bubalinos, o sêmen é depositado na parte cranial
da vagina, perto da abertura cervical (Johari, 1960). Nas ocasiões em que o refluxo aconteceu, o
sêmen havia sido depositado na porção mais caudal do dispositivo, e não na posição cranial,
como aconteceria na monta natural e o desejado que ocorra na vagina artificial interna. Outra
ocorrência que poderia causar redução do volume de sêmen coletado foi rompimento do saco
coletor. Entretanto foi registrada apenas uma (5,55%) ocorrência de rompimento do saco coletor
39
e recuperação parte do sêmen ejaculado. As baixas frequências dos dois acontecimentos não
permitem justificar o menor volume de ejaculado coletado na vagina artificial interna, não
havendo justificativa aparente para tal resultado. Por outro lado, sugere-se que alguns fatores
inerentes ao procedimento de coleta de sêmen com a vagina artificial interna possam ter
influenciado negativamente na excitação sexual do touro bubalino resultando em ejaculação
incompleta, com menor volume de sêmen ejaculado. Dentre estes fatores estariam o
reconhecimento, durante a penetração, da presença do dispositivo de coleta dentro da vagina, a
mudanças dos odores da fêmea pela manipulação para a colocação do dispositivo (lubrificante e
limpeza do reto), assim como a alteração da pressão dentro da vagina, uma vez que o dispositivo
mantém o canal vaginal aberto.

O número total de espermatozoides no ejaculado é dependente do volume do ejaculado

(concentração multiplicada pelo volume do ejaculado, (Henry e Loaiza-Echeverri, 2013)).
Como houve diferença no volume do ejaculado, o número total de espermatozoides também foi
menor na coleta com a vagina artificial interna. O número de espermatozoides normais e o
número de defeitos maiores dos espermatozoides foram iguais nos dois métodos de coleta,
permitindo chegar ao mesmo resultado de espermiograma.

De acordo Bloom (1973) o defeito de cauda enrolada do espermatozoide é classificado como

defeito menor e as principais causas do aumento anormal deste defeito no espermatozoide são o
choque de osmolaridade (Barth e Oko, 1989) e o choque térmico (Swanson e Boyd, 1962). A
média de defeitos menores das amostras de sêmen coletadas no presente estudo por vagina
artificial interna foi similar à das amostras coletadas pela vagina convencional (2,39% e 2,78%,
respectivamente). Este resultado permite inferir que o processo de coleta de sêmen com o uso da
vagina artificial interna não causou choque térmico no sêmen coletado. As médias de
espermatozoides normais (87,17% e 88,17%) estão acima do padrão mínimo (70,0%) proposto
por Vale (1994) para reprodutores bubalinos de boa qualidade seminal. Os valores médios de
defeitos maiores para os métodos de vagina artificial interna e convencional foram de 10,44% e
9,06%, respectivamente. Estes valores de defeitos maiores são inferiores ao proposto por Blom
(1973) para o sêmen de touros bovinos férteis normais (até 15,0%). Para reprodutores da raça
Murrah, Aguiar et al. (1996) e Garcia (2009) encontraram valores inferiores de defeitos maiores,
7,05% e 5,79%, respectivamente.

Os resultados do sêmen fresco diluído para as variáveis analisadas no CASA , estão listados na
Tabela 9. Além da motilidade total, foram listados os parâmetros relacionados à velocidade da
trajetória dos espermatozoides por unidade de tempo, que são: a velocidade curvilínea (VCL),
que relaciona a trajetória real percorrida; a velocidade linear progressiva (VSL), que relaciona o
primeiro e o último ponto captados na imagem; a velocidade média da trajetória (VAP) que
seria relacionada a uma trajetória média do espermatozoide; a linearidade, definida pela relação
de VSL com VCL (LIN = VSL/VCL x 100), que dita quão linear foi a trajetória percorrida pelo
espermatozoide; e a frequência de batimento flagelar cruzado (BCF), que é o número de vezes
que a cabeça do espermatozoide cruza a direção do movimento (Verstegen et al., 2002).

40
Tabela 9. Valores médios de motilidade total, velocidade curvilínea (VCL), velocidade linear progressiva
(VSL), velocidade média da trajetória (VAP), linearidade (LIN) e frequência de batimento flagelar
cruzado (BCF) dos espermatozoides de búfalos no sêmen fresco diluído coletado por vagina artificial
interna e vagina artificial convencional.
Vagina Artificial Vagina Artificial
Interna Convencional

Motilidade total (%) 86,97 ± 2,34a 84,89 ± 3,08a

VCL 68,54 ± 4,49a 73,79 ± 3,17a

VSL 49,92 ± 3,27a 50,60 ± 2,68a

VAP 56,99 ± 3,80a 58,38 ± 3,12a

LIN 72,93 ± 1,59a 68,31 ± 1,50b

BCF 10,68 ± 0,30a 11,59 ± 0,40a

Letras diferentes nas linhas indicam diferença estatística entre os métodos (p<0,05).

As amostras de sêmen coletadas por vagina artificial interna e por vagina artificial convencional
apresentaram qualidades similares nos parâmetros avaliados no CASA. Com exceção do
parâmetro de linearidade, que foi maior para o sêmen coletado por vagina artificial interna. A
linearidade está relacionada com a progressividade do espermatozoide e é uma característica
desejável para espermatozoides utilizados na inseminação artificial (Verstegen et al., 2002).
Para a avaliação do sêmen no CASA, foi utilizado o mesmo meio extensor para a diluição das
amostras de sêmen coletadas por vagina artificial interna e por vagina artificial convencional,
não havendo causa aparente para o prejuízo da progressividade do espermatozoide ocorrido nas
amostras de sêmen coletadas por vagina artificial convencional.

5.2.2. Avaliação da contaminação bacteriana do sêmen

Os números médios de Unidades Formadoras de Colônias por mL (UFC/mL) das amostras de
sêmen coletadas por vagina artificial interna e por vagina artificial convencional estão
sumarizados na Tabela 10.
Tabela 10. Médias de Unidades Formadoras de Colônias por mL (UFC/mL) no sêmen fresco puro e no
sêmen fresco diluído de touros bubalinos coletado pelos métodos da vagina artificial interna e
convencional.
Vagina Artificial Vagina Artificial
Interna Convecional
Sêmen fresco puro (UFC/mL) 7583 ± 2678 aA 2908 ± 1224 bA
Sêmen fresco diluído (UFC/mL) 247,2 ± 93,6 aB 72,2 ± 16,8 bB
Letras minúsculas diferentes nas linhas indicam diferença estatística entre os métodos (p<0,05).
Letras maiúsculas diferentes nas colunas indicam diferença estatística entre os tratamentos (p<0,05).

A contaminação bacteriana foi superior nas amostras de sêmen coletadas por vagina artificial
interna quando comparada à das amostras de sêmen coletadas por vagina artificial convencional.
O processo de recuperação do sêmen coletado por vagina artificial interna demanda maior
manipulação, desde a retirada do dispositivo da fêmea até a transferência do sêmen para o tubo
41
graduado. Acredita-se que maior manipulação seja a causa principal da maior contaminação das
amostras de sêmen coletas por vagina artificial interna. Há também a possibilidade de
contaminação com a microbiota autótone da mucosa peniana que durante o momento da
ejaculação entrava em contato direto com o saco coletor na vagina artificial interna, enquanto
que na vagina artificial convencional o sêmen o funil e o tubo graduado que recebem o sêmen
não entravam em contato com a mucosa do pênis.

Os valores de UFC/mL em ambos os métodos foram mais baixos que os encontrados por Bindra
et al. (1994) para as amostras de sêmen de touros da raça Murrah coletadas por vagina artificial
convencional. O número médio encontrado pelo referido pesquisador foi de 38 522,22 UFC/mL,
utilizando o mesmo meio e método de cultura bacteriana utilizado no presente experimento.

A ação do antibiótico presente no diluidor utilizado foi capaz de reduzir a contaminação

bacteriana nas amostras coletadas pelos dois métodos, mas não conseguiu eliminá-la por
completo. A contaminação das amostras de sêmen da vagina interna permaneceu maior após a
diluição, provavelmente devido à sua maior contaminação inicial. As amostras de sêmen
diluído, independente do método de coleta, apresentaram menor contagem de unidades
formadoras de colônia do que o relatado por Naidu et al. (1982) quando utilizou 500UI de
penicilina e 500µg de estreptomicina por mL de sêmen de touros Murrah coletado com vagina
artificial convencional. Após a diluição do sêmen coletado por vagina artificial interna a
contagem de unidades formadoras de colônias foi compatível com o número máximo de até
5000 UFC/mL preconizado pela OIE (2001) para sêmen processado. Permitindo que o método
de vagina artificial interna seja recomendado para a coleta de sêmen utilizado em inseminação
artificial.

5.2.3. Avaliação da eficiência de recuperação de espermatozoides

As porcentagens de eficiência de recuperação de espermatozoides dos métodos de vagina
artificial interna e de vagina artificial convencional estão apresentadas na Tabela 11. O dado
indica que a taxa de recuperação de espermatozoides dos dois métodos foi similar (89,79% na
vagina interna e 82,29% na vagina convencional). Os valores são menores que o encontrado
(92,39%) por Flick e Merilan (1986) ao utilizarem vagina artificial convencional de 51,0cm
para a coleta de sêmen touros bovinos. Foote e Heath (1963) sugerem que o principal fator de
prejuízo na eficiência de recuperação de espermatozoides durante a coleta de sêmen com a
vagina artificial convencional é a aderência destas células ao plástico utilizado no interior do
dispositivo como revestimento.
Tabela 11. Eficiência de recuperação de espermatozoides dos métodos de vagina artificial interna e
vagina artificial convencional.
Vagina Artificial Vagina Artificial
Interna Convencional
Eficiência de recuperação de
89,79 ± 2,05a 82,29 ± 3,08a
espermatozoides (%)
Letras diferentes nas linhas indicam diferença estatística entre os métodos (p<0,05).

A eficiência de recuperação de espermatozoides do método de coleta de sêmen utilizado

influencia no rendimento de doses de sêmen produzidas em cada coleta (Foote e Heath, 1963).
O resultado de eficiência de recuperação de espermatozoides encontrado para o método de
vagina artificial interna permite sugerir a utilização deste método para a coleta de sêmen de
42
touros bubalinos para a inseminação artificial, com alta eficiência e alto rendimento de doses de
sêmen. Para aumentar a eficiência de recuperação de espermatozoides do método de vagina
artificial interna sugere-se que durante o processo de transferência do sêmen do saco coletor
para o tubo graduado seja feita lavagem do saco coletor com diluidor seminal.

5.2.4. Considerações gerais

 A qualidade do sêmen coletado por vagina artificial interna foi similar na maioria das
características avaliadas ao do sêmen coletado por vagina artificial convencional.

 A contaminação bacteriana foi maior no sêmen coletado com a vagina artificial interna
quando comparado ao coletado por vagina artificial convencional. A utilização de
diluidor com antibiótico reduziu o número de unidades formadoras de colônias do
sêmen para padrões aceitáveis para o sêmen processado.

 A eficiência recuperação de espermatozoides foi similar nos dois métodos de coleta.

6. Conclusões

A utilização do modelo desenvolvido de vagina artificial interna permite a coleta de sêmen de

touros bubalinos em diferentes condições de ambiente, em diferentes faixas etárias e com
diferentes experiências sexuais.

O uso da vagina artificial interna foi eficiente para a coleta de sêmen dos touros bubalinos que
realizaram a monta completa.

O método de coleta de sêmen que foi proposto admite o acesso ao comportamento sexual do
reprodutor durante a coleta de sêmen, permitindo a avaliação de sua libido.

Para uso da vagina artificial interna não é necessário o condicionamento do reprodutor para a
coleta de sêmen, permitindo a sua utilização instantânea em animais de interesse comercial ou
em substituição do eletroejaculador para a realização de exame andrológico.

O processo de coleta de sêmen com a vagina artificial interna permite maior segurança para o
operador, já que não é necessária sua presença ao lado do macho durante a coleta. Há também
menor inibição do touro com a presença humana durante o procedimento.

O sêmen coletado com a vagina artificial interna tem qualidade semelhante àquele coletado com
a vagina artificial convencional, podendo ser utilizado para realização do espermiograma ou
para o processamento e inseminação artificial.

A contaminação bacteriana que ocorre durante a manipulação do sêmen coletado é controlada

pelo uso de antibióticos no diluidor seminal.

A recuperação de espermatozoides foi eficiente (89,79%), contudo sugere-se a lavagem do saco

coletor com o diluidor seminal para maximizar a recuperação.

Recomenda-se a utilização da vagina artificial interna como método de coleta de sêmen de

touros bubalinos.
43
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Technical note: Artificial vagina vs a vaginal collection vial for collecting semen from rams. J.
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51
 ANEXO 1

Setup utilizado para análise do sêmen da espécie bubalina no programa de análise

computadorizada da motilidade espermática – SCA®

Área da partícula: 20 a 70 microns2

VCL: 10 < SLOW < 25 < MEDIUM < 50 < RAPID
Progressividade: > 70% STR
Circular: < 50% LIN
Pontos para o VAP: 5; Conectividade: 12

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