i

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO

DOUGLAS DOS REIS RIVA

ALTERAÇÕES PULMONARES INDUZIDAS POR EXPOSIÇÃO

AGUDA A PARTÍCULAS FINAS

RIO DE JANEIRO

JULHO 2009
 ii
DOUGLAS DOS REIS RIVA

ALTERAÇÕES PULMONARES INDUZIDAS POR EXPOSIÇÃO

AGUDA A PARTÍCULAS FINAS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências

Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade

Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à

obtenção do grau de Mestre em Ciências.

ORIENTADOR: WALTER ARAÚJO ZIN

CO-ORIENTADORA: DÉBORA SOUZA FAFFE

RIO DE JANEIRO

JULHO 2009
 iii
ALTERAÇÕES PULMONARES INDUZIDAS POR EXPOSIÇÃO

AGUDA A PARTÍCULAS FINAS

DOUGLAS DOS REIS RIVA

ORIENTADOR: WALTER ARAUJO ZIN

CO-ORIENTADORA: DÉBORA SOUZA FAFFE

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas

(Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de
Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em
Ciências.

APROVADO POR:

_________________________________________________________________
Prof. Cristiane del Corsso
Prof. Adjunta, IBCCFº, UFRJ

________________________________________________________________
Prof. Marcelo Marcos Morales
Prof. Associado, IBCCFº, UFRJ

_________________________________________________________________
Prof. Paulo Hilário Nascimento Saldiva
Prof. Titular, Faculdade de Medicina, USP

_________________________________________________________________
Prof. Doris Rosenthal – Revisor/ Suplente Interno
Prof. Colaborador Voluntário, IBCCFº, UFRJ

_________________________________________________________________
Prof. José Henrique Leal-Cardoso – Suplente externo
Prof. Titular, Instituto Superior de Ciências Biomédicas, UECE

Rio de Janeiro
Julho de 2009
 iv

FICHA CATALOGRÁFICA

Riva, Douglas dos Reis

ALTERAÇÕES PULMONARES INDUZIDAS POR
EXPOSIÇÃO AGUDA A PARTÍCULAS FINAS /Douglas dos
Reis Riva. – 2009.

Dissertação de mestrado – Universidade Federal do Rio de

Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de
Pós-graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), Rio de
Janeiro, 2009.

Orientador: Walter Araújo Zin

1. Material Particulado. 2. Inflamação Pulmonar. 3. Mecânica

Respiratória. 4. Histologia. 5. Estresse Oxidativo. I. Zin, Walter
Araújo (Orient.) II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-
graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia). III. Alterações
pulmonares induzidas por exposição aguda a partículas finas.
 v

O presente trabalho foi realizado nos Laboratório de Fisiologia da Respiração do

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro

na vigência de auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico (CNPq), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do

Rio de Janeiro (FAPERJ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior (CAPES), e Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX-MCT,

PRONEX-FAPERJ).
 vi

Ao meu avô José do Espírito Santo Cavalcante dos Reis.

(In memorium)
 vii

AGRADECIMENTOS

Apesar de uma dissertação ser um processo solitário a que qualquer

pesquisador está destinado, reúne contribuições de várias pessoas e a elas registro
minha gratidão.
Ao Professor Walter Araújo Zin, meu orientador, pelos ensinamentos e
amizade.
À Professora Débora Souza Faffe, minha coorientadora, agradeço pelos
ensinamentos, conselhos e sugestões, fundamentais não somente para a realização
deste trabalho, mas para minha formação de modo geral.
Aos Professores dos Laboratórios de Poluição Atmosférica, Paulo Hilário
Nascimento Saldiva, Tatiana Lanças, Thais Mauad e Poluição Aérea Espacial,
Regiane Carvalho de Oliveira, pelos filtros cedidos para a realização deste trabalho
e pelas colaborações nas análises de metais e 8-isoprostano.
Ao Professor Olaf Malm, pela análise da composição dos hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos presentes na partícula.
Ao Professor Samuel dos Santos Valença e seus alunos, Alan Lopes e Akinori
Nagato, pela imensa colaboração nas análises de estresse e dano oxidativo,
macrófagos e neutrófilos. Serei eternamente grato aos ensinamentos, atenção e
paciência de vocês.
Agradeço imensamente a minha amiga Clarissa Bichara Magalhães, por
estar ao meu lado desde os tempos de faculdade. Juntos passamos alguns dos
melhores e piores momentos como graduandos, alunos de iniciação científica e
mestrandos. Cla, a você, meu muito obrigado!
Agradeço também ao auxílio técnico do Sr. Antônio Quaresma e do amigo
João Luiz Alves.
Apesar de não colaborarem neste trabalho especificamente, minha formação
científica com certeza não seria concretizada se não fosse a presença de outras
pessoas queridas:
À Renata Contador, pela paciência e ensinamento no início de minha
caminhada científica.
À Flavia Brandão, Halina Cidrini, Pedro Leme, Débora Xisto, Mariana
Genuíno, Patrícia Rocco pela amizade e ensinamentos durante minha formação
científica.
 viii

Às alunas de doutorado, Viviane Ramos Cagido, Giovanna Carvalho e Flávia

Mazzoli, pela carinho e amizade construída dentro e fora do laboratório.
Aos mestres, Douglas Fonseca e Silviane Fernandes, pelo exemplo de
pessoas que chegaram ao Rio de Janeiro e alcançaram a vitória.
Aos alunos de mestrado Vinícius de Oliveira e Mariana Ávila, pela amizade
construída.
Às alunas de iniciação científica e minhas sempre pequenas: Mariana
Machado, Natália Vasconcelos pelos momentos de descontração.
À Luis Paulo Cardoso e Denise Quarti Cardoso por terem colocado no mundo
uma pessoa linda que me conforta, nos momentos difíceis, e fortalece para
conquistar meus objetivos. Minha namorada Isabela Quarti Cardoso.
À meu pai, Ivo Riva, pela amizade, amor e pelos esforços para que eu
conseguisse chegar até aqui. À minha mãe, Norma Suely dos Reis Riva, pelas
orações, conselhos, amizade e amor. À meu irmão, Ikaro dos Reis Riva, pela
amizade e carinho.
À toda minha família pelas orações, amizade e carinho.
 ix

RESUMO
ALTERAÇÕES PULMONARES INDUZIDAS POR EXPOSIÇÃO AGUDA A
PARTÍCULAS FINAS.

Douglas dos Reis Riva

Orientador: Walter Araujo Zin
Co-orientadora: Débora Souza Faffe
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em
Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do grau de Mestrado em Ciências.

É conhecida a associação entre poluição do ar e aumento de morbi-mortalidade por

doenças respiratórias. No entanto, os mecanismos envolvidos nessa associação
ainda não estão completamente esclarecidos. Partículas finas (≤ 2,5 μm) podem
acessar o território alveolar, aumentando, assim, o risco de alterações pulmonares.
O presente trabalho objetiva testar a hipótese de que a exposição aguda a baixas
doses de material particulado fino (PM2,5) induz alterações funcionais, histológicas
pulmonares e é capaz de desencadear processo inflamatório e dano oxidativo.
Partículas finas foram coletadas do ar da cidade de São Paulo em filtro de
policarbonato, utilizando um impactador Harvard com fluxo de 10 L.min-1 durante 24
horas. O material particulado foi, posteriormente, extraído dos filtros em água
deionizada por agitação em um sonicador ultrassônico por 8 h. Metais e
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos foram determinados no material particulado.
Camundongos BALB/c receberam instilação intranasal de 30 μL de salina (CTRL),
30 μL de água destilada (FILTRO) ou de PM2,5 nas doses de 5 (P5) ou 15 μg (P15)
diluídos em 30 μL de salina. Vinte e quatro horas após a instilação, os camundongos
foram anestesiados e ventilados mecanicamente com fluxo (1 mL/s) e volume (0,2
ml) constantes. A mecânica pulmonar foi analisada pelo método de oclusão ao final
da inspiração, sendo determinados: elastância estática (Est), componente
viscoelástico da elastância (∆E), e pressões resistiva (∆P1), viscoelástica (∆P2) e
total (∆Ptot). Ao final dos experimentos, preparamos os pulmões para análises de
histologia, imunohistoquímica e bioquímica, sendo determinado influxo de
macrófagos e neutrófilos, bem como estresse e dano oxidativo. P15 apresentou
aumento significativo de todos os parâmetros de mecânica pulmonar, exceto ∆P1,
em relação aos grupos CTRL e FILTRO. Já no grupo P5 apenas ∆P2, ∆Ptot e ∆E
foram significativamente maiores que CTRL e FILTRO. Avaliando a morfometria
alveolar, o grupo P15 apresentou uma percentagem maior de alvéolos colapsados e
menor de normais quando comparado com o grupo CTRL. P5 apresentou uma
resposta semelhante ao CTRL. Em relação ao influxo de macrófagos e neutrófilos,
P15 foi o grupo que mostrou maior resposta, sendo inclusive diferente do P5 em
relação ao número de neutrófilos. Ao avaliarmos a via de indução de dano oxidativo,
tanto o TBA quanto o 8-isoprostano foram expressos em maior quantidade no grupo
P15. Este também apresentou aumento significativo dos níveis de catalase e MPO e
redução na relação GSH/GSSG, em relação ao CTRL, enquanto o grupo P5 revelou
elevação apenas em MPO quando comparado com CTRL. Podemos concluir que a
exposição aguda de material particulado fino, em doses ambientalmente relevantes,
induz inflamação pulmonar, estresse oxidativo e piora a mecânica e histologia
pulmonar em camundongos.
 x

Palavras-chave: material particulado, lesão pulmonar, estresse oxidativo.

Rio de Janeiro, Julho de 2009.
 xi

ABSTRACT

PULMONARY ALTERATIONS INDUCED BY FINE PARTICLES ACUTE

EXPOSURE
Douglas dos Reis Riva
Orientador: Walter Araújo Zin
Co-orientadora: Débora Souza Faffe
Abstract da Dissertação de mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em
Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciências.

The association between air pollution and increasing in morbi-mortality induced by

respiratory diseases is knowed. However, the mechanisms involved are not clear.
Particulate matters (≤ 2.5 μm) can access the alveolar region, increasing the
probability of lung diseases. The objective of this research is to test the hypothesis
that the acute exposition of low doses of fine particulate matter (PM2.5) may induce
functional and histological lung changes and to be able of unchain inflammatory
process an oxidative stress. PM2.5 was collected from the air of São Paulo city in
polycarbonate filters with a Harvard impactor with flow of 10 L.min-1during 24 hours.
Particulate matter was extracted from the filters in distillated water by agitation in
ultrasonic sonicator during 8 hours, and was submitted to an analysis of elements
composition and the polycyclic aromatic hydrocarbons. Healthy BALB/c mice
received intranasal instillation of 30 μL saline (CTRL), 30 μL distillated water
(FILTRO), or PM2.5 at 5 or 15 μg (P5 and P15, respectively). Twenty four hours later
the mices were anesthetized and mechanically ventilated with flow (1 mL/s) and
volume (0.2 mL) constant. Pulmonary mechanic was analysed by end-inflation
occlusion method and determined: static elastance (Est), viscoelastic component of
elastance (∆E), and pulmonary resistive (∆P1) and viscoelastic (∆P2) and total
(∆Ptot) pressures. In the end of experimentals, we prepare the lungs to histological
analyses, imunohistochemical and biochemical, determining macrophages and
neutrophils. Furthermore oxidative stress was analysed by 8-isoprostane methods
and biochemical analyses. Inhalation of 15 μg of PM2.5 induced significant increase
in all mechanical parameters, except ∆P1, compared with CTRL and FILTRO.
Although the lower dose of PM2.5 also increased all mechanical parameters, only
∆P2, ∆Ptot and ∆E were significantly higher than CTRL and FILTRO. In an alveolar
morphometry analyses, P15 showed a higher percentage of collapsed and reduced
in normal alveoli when compared with CTRL, P5 was similar to CTRL. Macrophages
and neutrophils response was higher in P15 when compared with CTRL. When
assessing the means of induction of oxidative damage, both the TBA and the 8-
isoprostane were expressed in greater quantity in the group P15, furthermore P15
showed significative increasing in catalase and MPO and reduced the relation GSH/
GSSG, in relation to CTRL, while P5 increased just MPO. Acute exposure to very low
doses of fine particulate matter induced lung inflammation, oxidative stress and
worse lung impedance and histology in mice.

Keywords: Particulate matters, lung injury, oxidative stress.

Rio de Janeiro
Julho de 2009
 xii

ÍNDICE

FICHA CATALOGRÁFICA iv
AGÊNCIAS FINANCIADORAS v
AGRADECIMENTOS vii
RESUMO ix
ABSTRACT xi
ÍNDICE xii
ÍNDICE DE FIGURAS xiv
ÍNDICE DE TABELAS xvi
ABREVIATURAS xvii
1 INTRODUÇÃO 01
1.1 ASPECTOS GERAIS SOBRE POLUIÇÃO 02
1.2 MATERIAL PARTICULADO 08
1.2.1 Toxicidade do material particulado 15
1.3 ESTRESSE OXIDATIVO – NOÇÕES BÁSICAS 21

1.3.1 Radicais livres 22

1.3.1.1 Reações de Fenton e de Haber-Weiss 24

1.3.2 8-isoprostano 25

1.3.3 Peroxidação lipídica 26

1.3.4 Sistema de defesa antioxidante 27

1.3.4.1 Catalase 29

1.3.4.2 Glutationa 30

1.3.5 Estresse oxidativo 31

2 JUSTIFICATIVA 33
3 OBJETIVOS 35
3.1 OBJETIVO GERAL 36
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 36
4 MATERIAIS E MÉTODOS 37
4.1 AMOSTRA DAS PARTÍCULAS 38
4.2 GRUPOS EXPERIMENTAIS 39
4.3 EXPERIMENTOS 39
4.3.1 Análise de metais 40
4.3.2 Análise de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos 41
4.3.2.1 Extração 42
4.3.2.2 Purificação 42
4.3.2.3 Fracionamento 43
4.3.2.4 Condições cromatográficas 44
4.3.2.5 Quantificação 44
4.3.3 Mecânica respiratória 44
4.3.4 Histologia pulmonar 51
4.3.4.1 Fixação e preparo das laminas para microscopia óptica 52
4.3.4.2 Análise histológica 52
4.3.5 Estudo imunohistoquímico 54
 xiii

4.3.5.1 8-Isoprostano 54
4.3.5.1.1 Hidratação e bloqueio 54
4.3.5.1.2 Recuperação antigênica 54
4.3.5.1.3 Incubação com o anticorpo primário anti-8-epi-PGF-2α 54
4.3.5.2 Marcação de macrófagos e neutrófilos 55
4.3.5.2.1 Hidratação e bloqueio 55
4.3.5.2.2 Recuperação antigênica 56
4.3.5.2.3 Incubação com anticorpo primario antimacrófagos F4/80 e antineutrófilos 56
4.3.6 Ensaios bioquímicos de estresse e dano oxidativo 57
4.3.6.1 Dosagem de proteínas 57
4.3.6.2 Medida do dano oxidativo 58
4.3.6.3 Catalase 59
4.3.6.4 Mieloperoxidase 59
4.3.6.5 Glutationa oxidada/glutationa reduzida (GSH/GSSG) 60
4.4 ANÁLISE ESTATISITICA 60
5 RESULTADOS 62
5.1 ANÁLISE DAS PARTÍCULAS 63
5.2 ANÁLISE DA MECÂNICA PULMONAR 63
5.3 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA 65
5.3.1 Análise qualitativa 66
5.3.2 Análise quantitativa 67
5.4 IMUNOHISTOQUÍMICA 69
5.4.1 8-Isoprostano 69
5.4.2 Atividade da mieloperoxidase 70
5.5 ENSAIOS BIOQUÍMICOS DE ESTRESSE E DANO OXIDATIVOS 71
6 DISCUSSÃO 76
7 CONCLUSÃO 89
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 91
ANEXOS 113
ANEXO A – Parâmetros da mecânica pulmonar em cada animal 114
ANEXO B – Percentual de alvéolos normais e colapsados em cada animal 117
ANEXO C – Contagem de macrófagos em cada animal 119
ANEXO D – Contagem de neutrófilos em cada anima 120
ANEXO E – Quantificação do TBARS em cada animal 121
ANEXO F – Score de 8-isoprostano em cada animal 122
ANEXO G – Quantificação de catalase em cada animal 124
ANEXO H – Quantificação de MPO em cada animal 125
ANEXO I – Quantificação da relação GSH/GSSG em cada animal 126
 xiv

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Classificação do material particulado de acordo com diâmetro aerodinâmico 10

Figura 2. Relação entre tamanho e massa das partículas 12

Figura 3. Deposição de partículas durante respiração nasal 14

Figura 4. Deposição de partículas durante respiração oral 14
Figura 5. Geração de espécie reativa de oxigênio durante fosforilação oxidativa 22
Figura 6. Mecanismo de defesa antioxidante 31
Figura 7. Esquema da metodologia utilizada na análise dos hidrocarbonetos policíclicos 41

aromáticos
Figura 8. Montagem experimental da mecânica in vivo 47
Figura 9. Método de oclusão ao final da inspiração 49
Figura 10. Retículo com 100 pontos e 50 linhas utilizado para análise histológica 53
Figura 11. Variações de pressão necessárias para vencer os componentes resistivo e 64

viscoelástico/inomogêneo pulmonares e pressão total exercida contra os componentes

viscosos e viscoelásticos do pulmão

Figura 12. Elastância estática e componente elástico da viscoelasticidade do pulmão 65
Figura 13. Fotomicrografias do parênquima pulmonar 66
Figura 14. Fotomicrografias representativa da marcação para 8-isoprostano 66
Figura 15. Fotomicrografias representativa da marcação para macrófago 67
Figura 16. Fotomicrografias representativa da marcação para neutrófilo 67
Figura 17. Fração de área de alvéolos normais e colapsados no parênquima pulmonar 68
Figura 18. Quantidade de macrófagos e neutrófilos 69
Figura 19. Escore de intensidade de coloração para 8-isoprostano 70
Figura 20. Atividade da enzima mieloperoxidase 71
Figura 21. Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico 73
Figura 22. Atividade de catalase 74

Figura 23. Relação entre a atividade da glutationa reduzida/glutationa oxidada 75

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Padrões de qualidade da United States Environmental Protection Agency 3

Tabela 2. Padrões de qualidade do ar da Organização Mundial da Saúde 4
Tabela 3. Característica física de nuvens de partículas com concentração no ar de 10 µg/m3 12
Tabela 4. Distribuição dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos e metais no material particulado 63
 xv

ABREVIATURAS

∆E – componente elástico da viscoelasticidade

∆P – variação de pressão

∆P1 –pressão relativa ao componente viscoso pulmonar

∆P2 –pressão relativa ao componente viscoelástico e/ou inomogêneo pulmonar

∆Peq – variação de pressão determinada pelo equipamento

∆Ptot –pressão total pulmonar

∆V –volume gasoso mobilizado

Al - alumínio

AP-1 – ativador de proteína 1

ATP – adenosina tri-fosfato

B[a]P – benzo[a]pireno

BSA – albumina de soro bovino

C – carbono

C/EBP – proteína estimuladora de ligação/c

Ca – cálcio

CAT – catalase

Cd – cádmio

CETESB – Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental

CEUA – comissão de ética no uso de animais

Co - cobalto

CO – monóxido de carbono

CoQ – coenzima Q

Cr – cromo

CRF – capacidade residual funcional

Crs – complacência do sistema respiratório

Cu - cobre

CVF – capacidade vital forçada

 xvi

DAB – 3,3 diaminobenzidina

DNA – ácido desoxirribonucléico

DTNB – 5,5’ ditiobis 2-ácido nitrobenzóico

E – elastância

Edyn – elastância dinâmica do pulmão

EPA – Environmental Protection Agency

EPM – erro padrão da média

Est – elastância estática do pulmão

EUA – Estados Unidos da América

Fe – ferro

GPx – glutationa peroxidase

GR – glutationa redutase

GSH – glutationa reduzida

GSSG – glutationa oxidada

HClO – ácido hipocloroso

HO2 – hidroperoxila

H2O – água

H2O2 – peróxido de hidrogênio

HE – hematoxilina e eosina

HTBA – brometo de cetildimetiletilamônio

IL-6 – interleucina 6

i.n. – intranasal

i.p. – intraperitoneal

IARC – International Agency for Research on Cancer

K – potássio

L- – radical alquila

LO- – alcoxila

LOO- – peroxila

LOOH – lipídio hidroperóxido

MAC – concentração alveolar mínima

 xvii

MDA – malondialdeído

MEF – fluxo instantâneo forçado

Mn – manganês

MPO – mieloperoxidase

MT – metalotioneina

Na – sódio

NAAQS – National Ambient Air Quality Standards

NADPH – nicotinamida-adenina dinucleotídio-fosfato

NF-KB – fator de transcrição nuclear kapa B

Ni – níquel

NOX – óxidos de nitrogênio

O2 – oxigênio

O2- – radical superóxido

O3 – ozônio

OH- – radical hidroxila

OMS – Organização Mundial da Saúde

P – fósforo

Pb – chumbo

PBS – tampão fosfato/salina

PEEP – pressão positiva ao final da expiração

PEF – pico de fluxo expiratório

Pel – pressão de retração elástica do pulmão

Pi – pressão pulmonar no ponto de inflexão

PIR – pireno

PL – pressão transpulmonar

PM – material particulado

PM10 – material particulado grosso

PM2,5 – material particulado fino

Pmáx – pressão máxima ou de pico inspiratório

PPM – partículas por milhão

 xviii

Pres – pressão resistiva

Ptr – pressão traqueal

QE – quinona redutase

R – resistência do sistema respiratório

Req – resistência do equipamento

rpm – rotações por minuto

Si - silício

SOX – óxidos de enxofre

SO2 – ddióxido de enxofre

SOD – superóxido dismutase

TBA – ácido tiobarbitúrico

TGF-β - fator de crescimento tumoral beta

Ti – titânio

TMB – 3,4,5 – ácido trimetoxibenzóico

TNF-α – fator de necrose tumoral alfa

V – vanádio

V’ – fluxo

VEF1 – volume expiratório forçado no primeiro segundo

VT – volume corrente

WHO – World Health Organization

Zn – zinco.
INTRODUÇÃO
 2

1 INTRODUÇÃO

1.1 ASPECTOS GERAIS SOBRE POLUIÇÃO

A preocupação com poluentes aéreos data do ano de 1272 DC, quando uma

neblina de fumaça de carvão foi descrita pelo Rei Edward I (STERN et al., 1984). A

partir de então, houve eventos documentados tanto na Europa quanto nos Estados

Unidos.

Um importante incidente ocorreu no Vale de Meuse, Bélgica, em dezembro de

1930. Durante aproximadamente 5 dias, parte da Bélgica permaneceu coberta por

fumaça. A partir do terceiro dia, milhares de pessoas apresentaram graves sintomas

respiratórios, como: dor retroesternal, tosse, dispnéia, edema pulmonar e outros. Os

mais afetados foram idosos, asmáticos, debilitados e cardiopatas. Mais de 60

pessoas morreram (NEMERY et al., 2001).

Houve pelo menos dois grandes episódios de poluição na cidade de Londres

e seus subúrbios em 1952, Nesse período ocorreu uma inversão de temperatura

que, associada à queima de carvão para aquecimento de espaços e geração de

energia, levou a um significativo acúmulo de poluentes atmosféricos. Esse

fenômeno, que ficou conhecido como London Fog, foi associado a um abrupto

aumento na taxa de mortalidade, resultando em aproximadamente 4000 mortes e

um aumento não quantificado em morbidade por problemas cardiorrespiratórios

entre residentes da cidade (LOGAN, 1953). A fumaça de Londres se tornou um

marco histórico no que diz respeito à poluição atmosférica e seu estudo

epidemiológico. E, além disso, permitiu aos pesquisadores realizar a primeira análise

detalhada relacionando níveis de poluentes aéreos e aumento de morbidade e

mortalidade (NEMERY et al., 2001).

 3

Diversos outros países aderiram ao estudo inglês e começaram a voltar à

atenção para estudos sobre poluição ambiental, levando a uma grande diminuição

dos problemas relacionados à combustão a partir da década de sessenta em países

da Europa e Estados Unidos. Esse efeito está diretamente relacionado à utilização

de equipamentos para controlar as emissões de dióxido de enxofre (SO 2), partículas

totais suspensas e ao uso de combustíveis com baixas taxas de enxofre para

geração de energia e aquecimento (www.epa.gov).

A situação mostra-se diferente em países em desenvolvimento, onde os

problemas de combustão não controlada, utilização de combustíveis com altas taxas

de enxofre e emissões industriais permanecem até hoje.

Em 1970, a agência norte americana de proteção ambiental (Environmental

Protection Agency – EPA), à qual foi delegado o controle de qualidade de ar

americano, criou o National Ambient Air Quality Standards (NAAQS), padronizando a

concentração de seis poluentes atmosféricos, dentre eles o material particulado 2,5

(Tabela 1), o que resultou em uma redução significativa dos mesmos.

Poluente 24 horas Anual

Material Particulado (PM2,5) 35 µg/m3 15 µg/m3

Tabela 1. US Environmental Protection Agency, 1970.

A poluição atmosférica, mesmo em valores abaixo do nível estabelecido pelos

órgãos responsáveis, tem afetado de forma significativa a vida dos seres vivos,

sendo estes saudáveis ou portadores de doenças respiratórias prévias (SALDIVA et

al., 1995; DUSSELDORP et al., 1995).

Em 2005, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estipulou novos padrões de

qualidade do ar para o material particulado, como mostra a Tabela 2:

 4

Poluente 24 horas Anual Observação

Material Particulado (PM2,5) 25 µg/m 3
10 µg/m 3
Valores-Guia
37,5 µg/m3 15 µg/m3 Nível de Proteção - 1
50 µg/m3 25 µg/m3 Nível de Proteção - 2
75 µg/m3 35 µg/m3 Nível de Proteção - 3
Tabela 2. Organização Mundial da Saúde, Europa, 2005.

Por não haver padrões de qualidade do ar na legislação brasileira para o

PM2,5, a Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental (CETESB/SP)

elaborou um estudo em 2008. Os padrões, americano e da OMS, estabelecem que

as médias anuais de medição não devam ultrapassar 15 µg/m³ e 10 µg/m³

respectivamente. Como resultado do estudo, não há indicação de tendência de

redução dos níveis de PM2,5 nos locais monitorados na região metropolitana de São

Paulo, visto que de 2003 a 2007, as concentrações médias permaneceram

praticamente imutáveis; as concentrações médias anuais de PM2,5 são bastante

elevadas se comparadas aos padrões de qualidade do ar dos Estados Unidos ou ao

valor guia da OMS. As concentrações alcançam valores altos e chegam a até 48%

do padrão anual americano e a 100% do valor anual proposto pela OMS; a

comparação dos valores médios anuais com as metas temporais da OMS indica que

as médias anuais situam-se entre o do nível de proteção 1 (15 µg/m³) e o de

proteção 2 (25 µg/m³) (CETESB, 2008).

De acordo com Brunekreef & Holgate (2002), há cerca de 20 anos, obteve-se

sucesso no controle dos poluentes. Porém, nas duas décadas seguintes, a poluição

do ar retornou como uma questão de saúde ambiental. Possivelmente, apesar da

queima de combustíveis fósseis estar atualmente reduzida, se comparada àquela de

50 anos atrás, outros fatores ganharam proeminência:

a) A poluição aérea fotoquímica, caracterizada por elevadas concentrações

de ozônio;
 5

b) A concentração de óxido de nitrogênio, produzido por veículos

motorizados;

c) As partículas ambientais que tiveram suas composições e distribuições de

tamanhos alterados, mudando sua toxicidade.

Apesar de drásticos episódios de poluição atmosférica estarem associados

com excessiva mortalidade e afecções respiratórias em diferentes regiões do mundo

(LOGAN, 1953; NEMERY et al., 2001), o ozônio (O3), os aerossóis ácidos e os

materiais particulados podem ser os principais responsáveis pelos efeitos adversos

à saúde.

Atualmente, partículas ambientais associam-se freqüentemente a efeitos

adversos à saúde, levando a elevadas taxas de morbidade e mortalidade por

problemas cardiorrespiratórios (DOCKERY, 1993; SCHWARTZ et al., 1994; POPE

III, 1996). Com a industrialização crescente dos países, a emissão de poluentes

liberados na atmosfera, tanto por indústrias quanto por meios de transporte,

aumenta; além disso, a ação de ventos, umidade, temperatura, luz solar e tempo de

permanência dos poluentes na atmosfera, criam um ambiente propício para diversas

reações químicas, originando novos componentes tóxicos no ar, levando a sérios

riscos para a saúde pública. Temos como exemplos países como a China, Rússia,

Estados Unidos, Brasil e a Europa Oriental, onde a falta de controle da emissão de

poluentes gera divercidade cada vez maiores de poluentes aéreos.

Os meios de transporte desempenham um papel fundamental na vida dos

indivíduos e na sociedade atual. A maneira com que as pessoas interagem,

trabalham, organizam a produção, desenvolvem as cidades e têm acesso a serviços

e bens está intimamente relacionada com o desenvolvimento da mobilidade. Em

sociedades aonde as pessoas dependem de meios de transporte motorizados,

 6

espera-se que os veículos se tornem cada vez mais seguros, luxuosos e velozes,

sendo, assim, utilizados com cada vez maior freqüência. Essas expectativas,

entretanto, não levam em consideração as conseqüências: aumento no consumo de

combustível, elevação das emissões de gases poluentes e grande número de

pessoas expostas a poluentes perigosos, que causam sérios problemas de saúde

(WHO; 2005).

O tráfego contribui com uma gama de poluentes aéreos gasosos e material

particulado suspenso de diferentes tamanhos e composições. Emissões de

partículas primárias por escapamentos de meios de transporte urbano respondem

por até 30% de material particulado (PM) fino (≤ 2,5 μm de diâmetro aerodinâmico

ou PM2,5) em áreas urbanas (TAKIZAWA; 2004). O transporte urbano mostra-se,

também, o maior contribuinte para emissão de dióxido de nitrogênio e benzeno em

cidades, sendo essa a principal razão do não cumprimento dos valores limites para

esses poluentes, estabelecidos pela União Européia (WHO; 2005).

A deterioração da qualidade do ar na região metropolitana da cidade de São

Paulo é decorrente das emissões atmosféricas de cerca de 2000 indústrias de alto

potencial poluidor e da frota registrada de aproximadamente 8,4 milhões de veículos,

que representam cerca de 1/5 do total das frotas veicular nacional. De acordo com

as estimativas de 2007, essas fontes de poluição respondem pelas emissões para a

atmosfera dos seguintes poluentes: 1,5 milhão de t/ano de monóxido de carbono,

365 mil t/ano de hidrocarbonetos, 339 mil t/ano de óxidos de nitrogênio, 29,5 mil

t/ano de material particulado total e 8,2 mil t/ano de óxidos de enxofre. Desses totais,

os veículos são responsáveis por 97% das emissões de CO, 97% de

hidrocarbonetos, 96% de óxidos de nitrogênio (NOX), 40% de material particulado e

32% de óxidos de enxofre (SOX). Saliente-se que o Brasil é o único país no mundo
 7

que conta com uma frota veicular que utiliza etanol em larga escala como

combustível. Na frota atual da região metropolitana da cidade de São Paulo, os

veículos movidos a etanol hidratado representam 11,4% e os movidos a gasolina

(mistura 22% de etanol e 78% de gasolina), representam 61%. O álcool etílico,

considerando-se suas formas anidra e hidratada, corresponde a 55,1% do

combustível consumido, segundo dados de consumo. Os veículos do tipo “flex-

fuel” (bi-combustível), lançados recentemente no mercado, correspondem a 10,1%,

as motocicletas representam 12,1% e os veículos movidos a diesel constituem 5,4%

da frota. Deve-se também destacar que a frota da região metropolitana da cidade de

São Paulo é bastante antiga, sendo que 49,5% desta é anterior a 1997 (CETESB

2007). Esteves (2007), em estudo realizado na cidade de São Paulo, constatou que

as doenças pulmonares causam 13 mil internações por ano (16% do total de

internações). Calculou-se, também, em aproximadamente US$ 59 milhões os gastos

com saúde pública de 1998 a 2006 na região metropolitana da cidade de São Paulo.

Além das emissões industriais e veiculares, características dos grandes

aglomerados urbanos, em cidades brasileiras menores existem outras fontes de

emissão de poluentes, que podem colocar em risco a saúde da população (BRAGA

et al., 2007). Tanto a queima de florestas, quanto aquelas realizadas

deliberadamente, promovem danos consideráveis à saúde da população exposta

(ARBEX et al., 2004). A queima de biomassa representa uma importante fonte de

poluente do ar, sendo apontada como indutora de alterações morfológicas e

funcionais em camundongos saudáveis (MAZZOLI-ROCHA et al., 2008). Uma outra

fonte de poluição do ar por material particulado pode ser encontrada em áreas de

atividade de mineração como em Itabira, Minas Gerais, onde há grandes jazidas de

minério de ferro que são extraídas em lavras mecanizadas a céu aberto, provocando
 8

grande emissão de PM para a atmosfera por escavação, explosão, e ressuspensão

do material pela movimentação de escavadeiras, tratores e caminhões. Em estudo

feito nessa região, Braga et al., em 2007, mostraram que ocorre elevado número de

atendimentos por doenças respiratórias, em crianças e adolescentes, e por doenças

cardiovasculares, em adultos, moradores da região. Além disso, há aumento de

incidência (12% em atendimentos de adolescentes por doenças respiratórias e 4%

relacionados a doenças cardiovasculares) quando há acréscimo de 10 µg/m3 na

concentração do material particulado característico da região.

Sendo assim, os efeitos da poluição atmosférica permanecem relevantes para

pesquisadores e profissionais de saúde, devido ao aumento constante da

dependência de meios de transporte, rápida transformação dos meios de produção,

crescimento da população mundial e migração da população rural para áreas

urbanas. Destacam-se os países não desenvolvidos, já que há um número reduzido

de estudos sobre os efeitos respiratórios do material particulado proveniente da

queima de combustíveis fósseis provenientes desses países.

1.2 MATERIAL PARTICULADO

A atmosfera contém material particulado, que pode ser de origem primária ou

secundária, formado por mistura heterogênea de gases, partículas líquidas e sólidas,

que mantêm entre si interação física e química constante. As partículas de origem

primária são aquelas emitidas diretamente pelas fontes, sejam elas fontes naturais

(por exemplo, erupções vulcânicas, incêndios em florestas, pólen, aerossol marinho)

ou antropogênicas, enquanto que as partículas secundárias não são emitidas

diretamente, mas se formam a partir da transformação dos gases e vapores em

partículas. Em áreas urbanas, além das fontes naturais, há as antropogênicas, que

são divididas em estacionárias e móveis. Dentre as estacionárias, destacam-se as

 9

emissões da queima de combustíveis, dos processos industriais, da construção civil,

da demolição, das indústrias processadoras de metais e petroquímicas, bem como

da queima de biomassa. Nas fontes móveis, constituídas pelos veículos

automotores, incluem-se as emissões pelo escapamento e a poeira ressuspensa

proveniente das vias pavimentadas ou não (CETESB, 2008). Todavia, milhares de

substâncias químicas foram detectadas no material particulado originário de

diferentes fontes, que incluem, além de nitratos e sulfatos, os compostos orgânicos

como hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, compostos biológicos como

endotoxina, células fragmentadas e vários metais como ferro, cobre, níquel, zinco e

vanádio (CARNELLEY & LÊ, 2001).

Desde 1970, quando o material particulado foi apontado como um dos

principais poluentes a ser controlado pelo Clean Air Act, a concentração de PM nos

EUA tem sido monitorada (OSTRO & CHESTNUT, 1998).

Classifica-se o material particulado de acordo com seu diâmetro aerodinâmico

em grosso, fino e ultrafino. As partículas grossas são aquelas com diâmetro

aerodinâmico entre 2,5 e 10 µm (PM10), as finas apresentam diâmetro entre 0,1 e

2,5 µm (PM2,5) e as ultrafinas ≤ 0,1 µm (DONALDSON et al., 2001; TAO et al.,

2003). Um quarto grupo, denominado nanopartículas, é formado por partículas com

diâmetro aerodinâmico de 0,01 µm a 0,056 μm (SHI et al., 2001; KITTELSON et al.,

2004; LIN et al., 2005; DUFFIN et al., 2007) (Figura 1).

 10

Figura 1. Classificação do material particulado de acordo com seu diâmetro aerodinâmico

(DONALDSON et al., 2001).

Em geral, as partículas de maior diâmetro, também denominadas partículas

inaláveis, são geradas por processos mecânicos. Essas partículas depositam-se

predominantemente na nasofaringe e orofaringe, podendo penetrar nos pulmões,

onde são, então, removidas pelo clearance muco ciliar e deglutidas, ou, ainda,

eliminadas por processos mecânicos, como tosse e espirro. Em contrapartida, as

partículas finas e ultrafinas, conhecidas como partículas respiráveis, originam-se de

combustão, condensação ou reações químicas, sendo encontradas na fumaça de

queima de madeiras, carvão e petróleo, provenientes da exaustão de motores.

Diferentemente das partículas grossas, as partículas respiráveis apresentam tempo

mais longo de suspensão na atmosfera (dias e semanas) e dispersão mais uniforme

em zonas urbanas, depositando-se nas vias aéreas extratorácicas ou, dependendo

do fluxo de ar e da difusão, penetrando nas pequenas vias aéreas e alvéolos, onde

permanecem por semanas ou meses (DUSSELDORP et al., 1995; PETERS et al.,

1997; BROWN et al., 2002; TAO et al., 2003). As partículas finas e ultrafinas podem

ser eliminadas pelo sistema muco-ciliar, funcionante desde a traquéia proximal até
 11

os bronquíolos terminais ou, então, ser fagocitadas por macrófagos, quando

depositadas nas regiões alveolares (DONALDSON & STONE, 2003). Além disso,

ambas podem alcançar o parênquima pulmonar e chegar à corrente sanguínea.

A maior capacidade de deposição alveolar das partículas ultrafinas é

atribuída, em parte, à sua maior concentração. A concentração das partículas se

refere ao número ou massa de partículas por unidade de volume (µg/m3). Para uma

determinada massa, as partículas ultrafinas possuem uma área de superfície de 102

a 103 vezes maior do que as partículas finas e aproximadamente 105 vezes maior do

que as grossas (HARRISON & YIN, 2000; DONALDSON & STONE, 2003) (Tabela

3). Essa razão, massa por área de superfície, pode influenciar a toxicidade das

partículas no sistema respiratório, uma vez que uma grande área de superfície por

massa permite maior transporte de metais catalíticos e outros componentes

adsorvidos à sua superfície (HITCHINS et al., 2000; SHI et al., 2001), aumentando,

assim, a toxicidade pulmonar do PM.

 12

Concentração em Diâmetro da Partículas / Área de superfície da

massa no ar (µg/m3) partícula (µm) mL de ar partícula (µ3/mL de ar)
10 2 1,2 24
10 0,5 153 120
10 0,02 2400000 3016
Tabela 3. Características físicas de nuvem de partículas com concentração no ar de 10 µg/m 3 de
massa, sendo composta por partículas de vários diâmetros. O número de partículas por unidade de
volume no ar aumenta consideravelmente com a área de superfície por unidade de volume de ar,
associado à redução do tamanho da partícula. Fonte: DONALDSON et al., 2001.

A figura abaixo ilustra a relação entre número de partículas, área de superfície

e grau de deposição em regiões de troca gasosa (KITTELSON et al., 2004) (Figura

2). Podemos observar que partículas finas e ultrafinas contribuem em maior

concentração e deposição alveolar, quando comparadas às partículas grossas.

Figura 2. Relação entre tamanho e massa das partículas e suas respectivas deposições no sistema
respiratório (KITTELSON et al., 2004).

Além da influência exercida pelo diâmetro aerodinâmico na deposição

alveolar, a penetração das partículas também será alterada pelo padrão respiratório

utilizado, resultando em diferentes mecanismos de deposição como: (a) impactação,

 13

predominante para partículas de maior diâmetro aerodinâmico na nasofaringe; (b)

sedimentação, deposição de partículas intermediárias em bronquíolos terminais e

respiratórios, como resultado da ação da gravidade ou (c) difusão, movimento

randômico, em zigue-zague, de partículas ≤ 0,1 µm de diâmetro, resultante da força

exercida por moléculas de gás até as pequenas vias aéreas e alvéolos. A

penetração de partículas nos pulmões, e a quantidade de deposição por

sedimentação e difusão, podem ser aumentadas durante inspirações lentas e

profundas. O exercício provoca aumento de freqüência respiratória que, por sua vez,

aumenta a deposição por impactação (RAABE, 1999). Estudos relatam deposição

de 0%, 15% e 25% de PM 10, PM2,5 e partículas ultrafinas, respectivamente,

durante respiração nasal, demonstrando a eficiência da filtração nasofaríngea

(Figura 3). Por outro lado, em respirações orais ocorre grande deposição de

partículas na região de troca gasosa, inclusive aquelas ≥ 10 µm, como mostra a

figura 4 (CHENG et al., 1989, 1990).

 14

Figura 3. Deposição de partículas durante respiração nasal com freqüência respiratória de 15 ciclos por
minuto e VT = 750 mL (CHENG et al., 1989; RAABE, 1999).

Figura 4. Deposição de partículas durante respiração oral com freqüência respiratória de 15 ciclos por
minuto e VT = 750 mL (CHENG et al., 1990; RAABE, 1999).
 15

1.2.1 Toxicidade do material particulado

Além dos efeitos das partículas relacionados ao seu diâmetro aerodinâmico e

sua conseqüente capacidade de deposição alveolar, a composição específica do PM

também pode estar relacionada à sua toxicidade. Todo material particulado contém

material biológico, compostos orgânicos, hidrocarbonetos, íons, aerossóis ácidos,

gases reativos e metais adsorvidos ou ligados a um centro carbonáceo. O PM10 é

constituído primariamente por material biológico, material da crosta terrestre e sal,

enquanto o PM2,5 consiste primariamente de metais, hidrocarbonetos e partículas

secundárias formadas por reações químicas com poluentes gasosos. A composição

específica do PM em determinado local depende da localização geográfica, clima,

estação do ano e fontes de poluição (TAO et al., 2003).

Os poluentes gasosos e o PM inalável gerados a partir da queima de

combustível fósseis apresentam efeitos diretos sobre o sistema respiratório, em

especial de crianças e idosos. Esses efeitos foram medidos por aumento no número

de atendimentos em pronto-socorro (LIN et al., 1999; MARTINS et al., 2002;

FARHAT et al., 2005), e internações hospitalares (BRAGA et al., 2001; DOMINICI et

al., 2006; MEDINA-RAMÓM et al., 2006), e elevação da mortalidade (FREITAS et

al., 2004; LACASANA et al., 2005; OSTRO et al., 2006).

Estudos examinando tanto PM10 quanto PM2,5 demonstraram maior

associação de morbi-mortalidade com níveis de PM2,5 do que com PM10

(SCHWARTZ et al., 1996; CIFUENTES et al., 2000). Em estudo realizado em

crianças moradoras da cidade de Linz, Bélgica, comparando a resposta

espirométrica a PM2,5, NO2 e PM10, encontrou-se que PM2,5 e NO2 foram

responsáveis pela maior redução nos parâmetros de volume expiratório forçado no

primeiro segundo (VEF1), pico de fluxo expiratório (PEF) e fluxo instantâneo forçado
 16

(MEF) do que o PM10 (MOSHAMMER et al., 2006). Outros autores identificaram

associação apenas com PM2,5, mas não com PM10 (ANDERSON et al., 2001;

POPE III et al., 2002), enquanto não foi encontrada associação com PM10 ou PM2,5

(LIPFERT et al., 2000). Acréscimos de 1,5% na mortalidade são descritos para um

aumento de 10 µg/m3 na concentração de PM2,5 (SCHWARTZ et al., 1996; LADEN

et al., 2000, 2006) e para o mesmo aumento de PM10 foi mostrado, por Braga et al.,

em 2007, que ocorre elevação na morbidade por doenças respiratórias em 12% em

adolescentes e por afecções cardiovasculares em 4% em idosos.

De forma semelhante, diminuição de 0,73% no risco de mortalidade pode ser

observada para cada 10 µg/m3 de redução de PM2,5, mostrando que estes efeitos

são, em parte, reversíveis (LADEN et al., 2000, 2006).

Saldiva et al (1994 e 1995) apontaram forte correlação entre mortalidade

infantil e de idosos com poluição atmosférica na cidade de São Paulo. Os achados

experimentais desse grupo reforçam os epidemiológicos: em 1992, Saldiva (a) e

colaboradores observaram que a exposição crônica à poluição do ar de São Paulo

promove significante alteração nas propriedades de defesa muco ciliar e

predisposição à infecção respiratória em animais de experimentação. Outro trabalho

realizado em São Paulo, por Miraglia et al., em 2005, mostrou a proporção de óbitos

em idosos (18,6%) e em crianças (36,2%) por doenças respiratórias durantes os

anos de 1991 e 1994. Os efeitos adversos das partículas estão relacionados à sua

ação diretamente no trato respiratório, através da indução de um processo de

estresse oxidativo que, quando não controlado, desencadeia inflamação das vias

aéreas, levando à destruição dos mecanismos de defesa (lesão grave dos cílios e

espessamento do muco), aumento da susceptibilidade já existente a alérgenos e ao

aparecimento de novos quadros de susceptibilidade. Os efeitos desse processo

 17

inflamatório se manifestam a curto, médio e longo prazos. Agudamente, aumentos

nas concentrações de PM2,5 foram associados ao aumento dos casos de

exacerbações de crises asmáticas e de sintomas respiratórios como tosse, coriza e

espirros; aumento da procura de prontos-socorros e de internações hospitalares por

quadros de rinite, sinusite, bronquite, asma e pneumonia. Esses aumentos na

morbidade por doenças respiratórias associadas ao material particulado fino variam

de 8% (entre os não portadores de doenças prévias) até 30% (entre crianças

asmáticas e idosos com doença pulmonar obstrutiva crônica) (BERNSTEIN et al.,

2004).

Apesar de ser tema de intensa investigação, os mecanismos envolvidos na

associação entre material particulado e efeitos adversos à saúde permanecem

desconhecidos, porém acredita-se que há forte relação com o processo inflamatório

e o estresse oxidativo (DONALDSON & TRAN, 2002; UPADHYAY et al., 2003;

SCHINS et al., 2004; KNAAPEN et al., 2004). Achados epidemiológicos de efeitos

tóxicos e pró-inflamatórios relacionados ao material particulado foram reproduzidos

experimentalmente (NEL et al., 2001). A inalação ou instilação de PM provoca

resposta inflamatória em modelos animais e em humanos (LI et al., 1997; KENNEDY

et al., 1998; CLARKE et al., 1999, 2000a, b; GHIO & DEVLIN, 2001; GHIO et al.,

2001), caracterizada por liberação de citocinas derivadas de macrófagos, estresse

oxidativo e aumento da permeabilidade vascular, com concomitante recrutamente de

neutrófilos (FERIN et al., 1992; LI et al., 1996, 1997; KENNEDY et al., 1998). A

exposição a PM aumenta a expressão de genes relacionados à ativação de NF-κB,

incluindo TNF-α, TGF-β e IL-6 (SHUKLA et al., 2000; STONE et al., 2000).

Radicais livres e estresse oxidativo estão amplamente implicados na resposta

inflamatória associada à exposição ao material particulado (DONALDSON &

 18

STONE, 2003; DONALDSON et al., 2005; PEREIRA et al., 2007). O estresse

oxidativo mediado por material particulado pode originar-se de diferentes fontes,

envolvendo: (I) geração direta de espécies reativas de oxigênio através da superfície

do particulado, (II) componentes solúveis como metais de transição e componentes

orgânicos, (III) alteração na função das mitocôndrias ou NADPH-oxidase e (IV)

ativação de células inflamatórias capazes de gerar espécies reativas de oxigênio e

espécies reativas de nitrogênio (RISOM et al, 2005). A geração direta de espécie

reativa de oxigênio pode ocorrer pela presença de radicais livres e oxidantes na

superfície da partícula. Muitos mediadores inflamatórios induzidos pela exposição a

PM são regulados por fatores de transcrição sensíveis à óxido-redução, como NF-

κB, AP-1 e C/EBP, sugerindo um aumento da produção de espécies reativas de

oxigênio após exposição a PM (JIMENEZ et al., 2000; LI et al., 2002; GONZALEZ-

FLECHA, 2004; DONALDSON et al., 2003; OHYAMA et al., 2007). A capacidade de

gerar espécies reativas de oxigênio estaria relacionada à maior área de superfície da

partícula, independentemente de sua composição (BROWN et al., 2000). No

entanto, evidências sugerem que metais e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos,

principais constituintes do PM, possam atuar sinergicamente, produzindo espécies

reativas de oxigênio (PARK et al., 2006; KAMPA & CASTANAS, 2007; OHYAMA et

al., 2007).

Dentre os metais, os mais encontrados nos particulados são Cr, Co, Ni, Mn,

Zn, Cu, e, principalmente, Fe (GURGUEIRA et al., 2002). Este último surge em

maiores concentrações nas partículas de queima de combustíveis fósseis, se

comparado aos demais metais (PARK et al., 2006). Muitos trabalhos

epidemiológicos mostram influência da exposição ocupacional a metais sobre os

parâmetros espirométricos, com diminuição do volume expiratório forçado no

 19

primeiro segundo (VEF1), capacidade vital forçada (CVF), e pico de fluxo expiratório

(PEF) associados à inalação crônica de Pb (BAGCI et al., 2004; HONG et al., 2007),

Mn (BOOJAR & GOODARZI, 2002; HONG et al., 2007), Zn (LAGORIO et al., 2006)

e Fe (DUSSELDORP et al., 1995; SEATON et al., 1995; ROEMER et al., 2000).

Adicionalmente, a instilação intratraqueal de ferro, associado às partículas ultrafinas,

potencializa o recrutamento de células no lavado broncoalveolar, efeito não

observado após instilação isolada de Fe (WILSON et al., 2002). Alguns metais

também são conhecidos por induzir efeitos pró-oxidativos e pró-inflamatórios (PARK

et al., 2006). Gurgueira et al. (2002) observaram presença de estresse oxidativo em

estudo in vivo após inalação de partículas ultrafinas contendo metais como Mn, Fe,

Cu e Zn. A presença de Fe nas partículas parece exercer maior influência na

formação de espécies reativas de oxigênio do que os demais metais (PARK et al.,

2006; GHIO & COHEN, 2005). Já foi visto que vanádio e cromo presentes em PM2,5

estariam associados com a indução de estresse oxidativo, que levaria à produção de

tumor pulmonar, tendo, assim, potencial cancerígeno (SORENSEN et al., 2005).

Em relação aos compostos orgânicos, 16 hidrocarbonetos policíclicos

aromáticos são considerados particularmente importantes no monitoramento

ambiental de poluentes orgânicos prioritários: acenafteno, acenaftileno, antraceno,

benzo[a]antraceno, benzo[a]pireno, benzo[b]fluoranteno, benzo[ghi]perileno,

benzo[k]fluoranteno, criseno, dibenzo[a,h]antraceno, fenantreno, fluoranteno,

fluoreno, indeno[1,2,3-c,d]pireno, naftaleno e pireno (US EPA, 1987). Os

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos com atividade carcinogênica, incluindo

benzo[a]antraceno, benzo[b]fluoranteno, benzo[j]fluoranteno, benzo[k]fluoranteno,

benzo[a]pireno, dibenzo[k]antraceno e indeno[1,2,3-c,d]pireno (CASTAÑO-VINYALS

et al., 2004) merecem atenção especial. Dentre esses, o benzo[a]pireno apresenta

 20

atividade carcinogênica 10-100 vezes maior do que os demais hidrocarbonetos

policíclicos aromáticos (SORENSEN et al., 2003).

Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos originam se da combustão

incompleta de matéria orgânica, sendo o processo influenciado principalmente por

fatores como temperatura e pressão. Deste modo, incêndios florestais e de campos,

assim como a queima de combustíveis fósseis, representam importantes fontes de

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos para o meio ambiente. Porém, as maiores

emissões de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos provêm de processos

industriais ligados à produção de aço e alumínio, exaustão de incineradores,

resíduos sólidos industriais, e atividades petroquímicas (SISINNO et al., 2003). As

concentrações de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos podem variar de dezenas

de ng/m3, em áreas não poluídas ou pouco poluídas, a centenas de ng/m3 em

regiões de maior poluição (KURE et al., 1997; CASTAÑO-VINYALS et al., 2004).

Compostos orgânicos, incluindo os benzenos, foram associados à formação de

espécies reativas de oxigênio e peroxidação lipídica (SORENSEN et al., 2003),

induzindo estresse oxidativo em macrófagos alveolares (HIURA et al., 1999) e

células epiteliais. Adicionalmente, os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos se

distribuem pelos tecidos, onde são biotransformados em intermediários

quimicamente ativos. Esses intermediários podem ligar se ao ácido

desoxirribonucléico (DNA) por ligação covalente (adutos de DNA), gerando mutação

ou iniciando processo tumoral. A formação de adutos de DNA é considerada

essencial para o potencial carcinogênico desses compostos (SORENSEN et al.,

2003; CASTAÑO-VINYALS et al., 2004).

 21

1.3 ESTRESSE OXIDATIVO - NOÇÕES BÁSICAS

A bioquímica celular do oxigênio (O2) é reconhecida pelos seus pontos

positivos e negativos (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). Os aspectos positivos

incluem numerosas reações catalisadas, essenciais para a vida e função celular

normal. Por outro lado, incluem a possibilidade de formação de espécie reativa de

oxigênio, exercendo um efeito deletério (LI et al., 2003). O principal papel do O2 no

metabolismo normal é o processo de fosforilação oxidativa, um evento que ocorre na

mitocôndria e responsável pela produção de adenosina trifosfato (ATP). Para a

fosforilação oxidativa faz-se necessário que o oxigênio esteja apto a receber

elétrons. Normalmente quatro elétrons são necessários para formar a H2O. (Figura

5) A adição de um único elétron resulta na formação do radical superóxido (O 2-),

enquanto a adição de dois ou três elétrons leva à gênese de peróxido de hidrogênio

(H2O2), ou radical hidroxila (OH-), respectivamente (Figura 5). Sob condições

normais, essas espécies reativas formam-se em número reduzido. Essas espécies

reativas mostram-se muito eficazes para reagir com proteínas, lipídios e DNA,

levando ao dano celular (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999, GRIFFITHS, 2000).

 22

Figura 5. Geração de espécies reativas de oxigênio durante fosforilação oxidativa. Nesse processo O2
recebe quatro elétrons para formar H2O. Ocasionalmente a adição de um elétron resulta na formação
de O2-, que pode ser convertido para H2O2 ou OH-. Adaptada de Li et al., 2003.

1.3.1 Radicais livres

Em circunstâncias normais, os elétrons orbitam em volta do núcleo do átomo

em pares, com oposição dos “spins”. Quando um átomo possui um elétron não

pareado, sua reatividade aumenta, tornando-o um átomo instável, sendo, então,

definido como um radical livre. Esses radicais livres são constantemente produzidos

e eliminados no organismo.

Em condições normais, os radicais livres e outras substâncias com eles

relacionadas também são responsabilizados pela regulação de importantes

mecanismos fisiológicos, tais como: sinalização celular, regulação da expressão de

alguns genes, mediação de reações inflamatórias e potencialização dos

mecanismos de defesa orgânica, uma vez que fazem parte do arsenal de armas

letais leucocitárias (PRYOR, 1986; DROGE, 2002; HII & FERRANTE, 2007). Por

serem muito instáveis e normalmente produzidos em pequenas quantidades, sua

depuração celular é rápida, geralmente secundário ao decaimento espontâneo ou

 23

por ação de anti-oxidantes naturais. Porém, quando presentes em grandes

quantidades, causam lesões à célula através de dano a macromoléculas como

lipídios, proteínas, carboidratos e DNA, levando ao dano da função celular ou até

mesmo à morte da célula (CIENCEWICKI et al., 2008).

Os radicais livres podem ser encontrados em grande quantidade na natureza

associados aos átomos de oxigênio, nitrogênio, hidrogênio, carbono, enxofre, sendo

classificados em função do átomo portador dos elétrons desemparelhados

(VASCONCELOS et al., 2007). Todavia, os radicais livres de oxigênio: radical

superóxido (O2-), hidroxila (OH-) e hidroperoxila (HO2) são os que possuem maior

relevância biológica, não só devido à sua elevada toxicidade, mas, também, pelo

fato de serem os mais prevalentes nos organismos vivos que utilizam o oxigênio

como comburente. Existem, contudo, outras moléculas altamente reativas e

potencialmente tóxicas para o organismo, as quais, por não conterem nenhum

elétron desemparelhado nos seus orbitais, não se enquadram na definição de radical

livre. Apesar de não serem verdadeiros radicais, estas moléculas, que incluem o

peróxido de hidrogênio (H2O2) e o ácido hipocloroso (HClO), são potenciais

geradoras de radicais livres, e, por esta razão, as suas repercussões orgânicas,

fisiológicas ou tóxicas, devem ser igualmente consideradas. (PRYOR, 1986; SHAN

et al., 1989; HALLIWELL, 1991; LEE, 2004). Logo, ao invés da denominação

“radicais livres”, passou-se a utilizar “espécies reativas”, para englobar, além dos

radicais, estas moléculas. Como em sua maioria tais espécies são derivadas do

metabolismo do O2, normalmente utiliza-se o termo espécies reativas de oxigênio

(FERREIRA & MATSUBARA, 1997).

A presença de pares redox responsáveis pelo fluxo de elétrons determina o

equilíbrio redox em líquidos biológicos, organelas, células ou tecidos. Esses sofrem

 24

freqüentes interconversões entre os estados reduzido e oxidado (VASCONCELOS

et al., 2007). Cabe recordar que reações de redução implicam em ganho de elétrons,

e as de oxidação em perda dos mesmos. Portanto, quando no metabolismo normal

ocorrer uma redução do oxigênio molecular (O2), este ganhará um elétron, formando

o radical superóxido (O2-), considerado instável por possuir número ímpar de

elétrons na ultima camada (Figura 5).

Encontram-se espécies reativas de oxigênio em todos os sistemas biológicos.

As fontes geradoras são: cadeia de transporte de elétrons da mitocôndria, retículo

endoplasmático e nicotinamida-adenina nucleotídeo (NADH/NADPH) oxidase

associada à membrana. Durante esse processo formam-se intermediários reativos,

como os radicais superóxido (O2-), hidroperoxila (HO2) e hidroxila (OH-) e o peróxido

de hidrogênio (H2O2) (Figura 5). Este, apesar de não ser um radical livre, pela

ausência de elétrons desemparelhados na última camada, se constitui em um

metabólito do oxigênio extremamente deletério, uma vez que participa da reação

que produz o OH-, atravessa camadas lipídicas, pode reagir com a membrana

eritrocitária e com proteínas ligadas ao ferro, mostrando-se altamente tóxico para as

células. A entrada de quatro elétrons no processo de redução do O2 neutraliza a

reatividade das espécies reativas de oxigênio.

1.3.1.1 Reações de Fenton e de Haber-Weiss

Os metais de transição foram selecionados na evolução molecular para

efetuar grande número de funções biológicas, com resultado de suas interações com

o oxigênio e suas ações na formação de complexos doador-receptor (coordenação).

Estes metais são micronutrientes essenciais utilizados em vários aspectos da função

celular normal. Estas mesmas propriedades químicas que elegeram estes metais

como catalisadores de numerosas reações do oxigênio molecular para catalisar as

 25

funções homeostática e de síntese de O2-, o H2O2 e o OH• gerados a partir de

reações celulares de Fenton e de Haber-Weiss (DUNFORD, 1987; ARUOMA, 1989;

HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1990), em que estes metais participam, também

fazem deles uma ameaça para a vida pela geração de espécie reativa de oxigênio

(GHIO et al. 1998).

As reações são:

Reação de Fenton:

Fe2+ + H2O2 -----------------------> Fe3+ + OH• + OH-

Reação de Haber-Weiss:

H2O2 + O2- -----------------------> O2 + OH• + OH-

Fe3+/Cu2+

Consequentemente, os metais de transição devem ser transportados e

estocados de forma a prevenir a formação de espécie reativa de oxigênio (GHIO et

al. 1998).

Embora o cobre possa, também, catalisar a reação de Haber-Weiss, o ferro é

o metal pesado mais abundante no organismo e está biologicamente mais

capacitado para catalisar as reações de oxidação de biomoléculas (AUST &

MILLER, 1991).

1.3.2 8-isoprostano

Isoprostanos são compostos semelhantes às prostaglandinas, produzidos

pela peroxidação de ácidos graxos essenciais, principalmente o ácido aracdônio,

catalizado por radiacais livres. A quantificação dos isoprostanos gera informações

importantes na análise do estresse oxidativo em doenças pulmonares (JANSSEN,

2001; WOOD et al., 2003; MONTUSCHI et al., 2004).

 26

Concentrações elevadas de 8-isoprostano foram demonstradas em crianças

(BARALDI et al., 2003a, 2003b; MONDINO et al., 2004; SHAHID et al., 2005) e

adultos asmaticos (MONTUSCHI et al., 1999; ANTCZAK et al., 2002; BATTAGLIA et

al., 2005), em doença pulmonar obstrutiva crônica (MONTUSCHI, et al., 2000;

KOSTIKAS, et al., 2003; BIERNACKI, et al., 2003; KO, et al., 2006) levando a piora

da função pulmonar (MONTUSCHI et al., 2000).

1.3.3 Peroxidação lipídica

A peroxidação lipídica pode ser definida como uma cascata de eventos

bioquímicos resultante da ação dos radicais livres sobre os lipídeos insaturados das

membranas celulares, gerando principalmente radical alquila, alcoxila e peroxila,

levando à destruição de sua estrutura. Todos os componentes celulares são

suscetíveis à ação das espécies reativas de oxigênio, porém a membrana é um dos

mais atingidos, há perda da seletividade na troca iônica e liberação do conteúdo de

organelas, como as enzimas hidrolíticas dos lisossomas, e formação de produtos

citotóxicos (como o malondialdeído e isoprostanos). Todas essas modificações

oxidativas causam mudanças nas propriedades físicas e químicas das membranas,

culminando com a morte celular. A lipoperoxidação também pode estar associada

aos mecanismos de envelhecimento, câncer e a exacerbação da toxicidade de

xenobióticos. Nem sempre os processos de lipoperoxidação são prejudiciais, pois

seus produtos atuam significativamente na reação em cascata a partir do ácido

aracdônico (formação de prostaglandinas) e, portanto, na resposta inflamatória

(HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1990). Todavia, o excesso de tais produtos pode ser

lesivo (ROSS & MOLDEUS, 1991, VASCONCELOS et al., 2007).

A peroxidação lipídica é uma reação em cadeia, representada pelas etapas

de iniciação, propagação e finalização. A etapa de iniciação, como já descrito,

 27

compreende o ataque de uma espécie reativa (geralmente OH-), que abstrai um

átomo de hidrogênio de um grupo metileno, normalmente de um ácido graxo poli-

insaturado, deixando um elétron desemparelhado no carbono. Este radical é

comumente estabilizado por rearranjo molecular, formando um dieno conjugado.

Sob condições aeróbicas, o radical de carbono do dieno conjugado reage com O2

(que é uma molécula hidrofóbica e, portanto, se concentra no interior das

membranas) e forma o radical peroxila. Este radical peroxila pode capturar prótons

de moléculas de lipídeos adjacentes, cujo radical de carbono sofre novo rearranjo,

reage com O2 e forma outro radical peroxila e, assim, sucessivamente,

caracterizando a reação em cadeia da etapa de propagação. O radical peroxila

combina-se, então, com o hidrogênio abstraído, gerando o lipídeo hidroperóxido que,

ao sofrer quebra, forma aldeídos como malonaldeido entre outros. A decomposição

dos hidroperóxidos lipídicos gera radicais peroxila e alcoxila pela reação de Fenton.

A terceira e última etapa da peroxidação lipídica, a etapa de finalização, instala-se

com a neutralização dos radicais formados por ação de antioxidantes lipossolúveis

ou pela reação de dois radicais lipídicos, formando produtos sem radicais.

1.3.4 Sistemas de defesa antioxidante

Devido ao elevado potencial de toxicidade do oxigênio e à sua grande

utilização pelos organismos aeróbios, torna-se necessário que estes estejam

suficientemente munidos de uma diversidade de sistemas antioxidantes para

proteger suas células dos efeitos nocivos das espécies reativas de oxigênio

(EVANS, 2000; BANERJEE, 2003; LAMBERTUCCI et al., 2007).

Um antioxidante é, por definição, qualquer substância que, quando presente

em baixas concentrações em relação às dos potenciais substratos oxidáveis, retarda

significativamente, ou inibe, a oxidação desses substratos pelas espécies reativas

 28

de oxigênio (HALLIWELL, 1991; SIES, 1997; DROGE, 2002). Estas substâncias

possuem a propriedade de fornecer elétrons/átomos de hidrogênio às espécies

reativas de oxigênio sem se transformarem em moléculas instáveis. Os mecanismos

de defesa antioxidante nos diferentes tecidos compreendem sistemas enzimáticos e

não enzimáticos, que atuam convertendo espécie reativa de oxigênio para espécies

menos tóxicas, tendo, assim, um importante papel na proteção sistemica contra

espécie reativa de oxigênio (GOLDFARB, 1999, LI et al., 2003). Podem ser

classificados em função da sua localização orgânica (antioxidantes intracelulares e

extracelulares) e da sua origem, seja da dieta (antioxidantes exógenos), ou da

síntese endógena (antioxidantes endógenos).

No interior da célula, a eliminação dos compostos reativos constitui um pré-

requisito para a sobrevivência celular, sendo normalmente efetuada por: 1) sistemas

enzimáticos, tais como a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT), a

glutationa peroxidase e a glutationa redutase e 2) sistemas não-enzimáticos, tais

como glutationa reduzida (GSH), coenzima Q (CoQ), ácido úrico, vitamina E (α-

tocoferol), vitamina C (ácido ascórbico), flavonóides, carotenóides, proteínas de

transporte de metais de transição, ferritina, transferrina e ceruloplasmina (Figura 6)

(BECKMAN & AMES, 1998; SEN, 2001, LI et al., 2003). Destes, os agentes que

apresentam o papel preponderante dentro dos sistemas intracelulares de defesa

antioxidante são a SOD, a CAT e a glutationa peroxidase (LEE, 2004; MORENO,

2005; FORONJY, 2006). Quando as espécies reativas de oxigênio alcançam níveis

que superam a capacidade de ação deste sistema de defesa, durante um estado

fisiopatológico como em um evento toxicológico, ocorrem alterações químicas dos

processos biológicos moleculares do estresse oxidativo lesivo (FERREIRA et al.,

2006; ESPEY et al., 2000). As ações deflagradas pelos radicais livres, por sua vez,
 29

também induzem reações auto-catalíticas, pelas quais moléculas com as quais eles

interagem são convertidas a radicais livres, propagando e perpetuando a cadeia de

danos. As lesões secundárias ao estresse oxidativo contribuem para o aparecimento

de doenças degenerativas e inflamatórias como câncer, doenças cardiovasculares e

pulmonares, declínio do sistema imune, disfunção cerebral e catarata, podendo

agravar doenças pré-existentes e levar ao óbito (LI et al., 2003, KELLY, 2003).

1.3.4.1 Catalase (CAT)

A CAT é uma enzima presente na maioria dos organismos aeróbios,

responsável pela conversão do H2O2 intracelular em água e oxigênio (Figura 6).

Grande parte da atividade desta enzima localiza-se nos peroxissomas. Na maioria

dos animais, há CAT em praticamente todos os órgãos, estando particularmente

concentrada no fígado e nos eritrócitos. As mitocôndrias e o retículo endoplasmático

contêm, também, alguma atividade da CAT, embora muito reduzida. O encéfalo, o

coração e os músculos esqueléticos contêm pequenas quantidades desta enzima.

(HALLIWELL, 1991; FERREIRA et al., 2006).

 30

1.3.4.2 Glutationa

A glutationa reduzida (GSH) está presente na maioria das células e é o

composto orgânico tiol mais abundante no meio intracelular (Meister & Anderson,

1983). Pode ser considerada um dos agentes mais importantes do sistema de

defesa antioxidante celular (VAN ASBECK BS, et al., 1985), protegendo a célula

contra lesão resultante da exposição a agentes como íons ferro (Galleano &

Puntarulo, 1995). Além disto, atua como transportadora e reservatório de

aminoácidos e participa da detoxificação de agentes químicos e da eliminação de

produtos da lipoperoxidação (Deneke & Fanburg 1989).

Após exposição da GSH ao agente oxidante, ocorre sua oxidação a GSSG

(HEBBEL 1986) (Figura 6). A recuperação da GSH é feita pela enzima glutationa

redutase, uma etapa essencial para manter íntegro o sistema de proteção celular

(GILBERT et al., 1990).

A glutationa peroxidase é considerada a enzima mais importante para a

oxidação do H2O2 a água. A glutationa peroxidase dos mamíferos tem maior

afinidade pelo H2O2 do que a CAT, significando que, em concentrações baixas de

H2O2, a glutationa peroxidase tem um papel muito mais ativo na sua remoção

celular. Apresenta-se sob quatro formas: glutationa peroxidase 1 ou clássica,

encontrada no citosol de todas as células do corpo; a glutationa peroxidase 2 ou

gastrointestinal, especifica do trato gastrointestinal; a glutationa peroxidase 3,

plasmática ou extracelular, encontrada no fluido do revestimento interno do pulmão e

no leite materno, além do plasma em mamíferos, e a glutationa peroxidase 4, que

atua sobre peróxidos de resíduos de ácidos graxos na membrana e lipoproteínas

(BAST et al., 1991). O seu correto funcionamento depende da presença de selênio

(nutriente antioxidante) na sua constituição e da disponibilidade de H 2O2 e de outros

 31

hidroperóxidos, utilizando a glutationa reduzida (GSH) como doador de elétrons,

formando a glutationa oxidada (GSSH) e água (Figura 6). Este mecanismo atribui à

glutationa peroxidase um papel importante na proteção celular das membranas

lipídicas, proteínas e ácidos nucléicos contra as espécies reativas de oxigênio

(HALLIWELL, 1991; FERREIRA et al., 2006).

Figura 6. Mecanismo de defesa antioxidante. Enquanto a superóxido dismutase (SOD) catalisa a

reação de O2- para H2O2, a catalase catalisa a decomposição de H2O2 para H2O. A glutationa peroxidase
(GPx) reduz hidroperóxidos pela oxidação de GSH em GSSG. A ferritina, libera Fe+2, que tem papel
importante na prevenção da formação de OH- tóxico pela prevenção da reação de Fenton. Além disso,
outras substâncias antioxidantes como as vitaminas C e E, quinona redutase (QE), e metalotioneina
(MT) podem efetivamente bloquear a geração de O2- pela redução dos compostos cíclicos. Adaptada de
Li et al., 2003.

1.3.5 Estresse oxidativo

O estresse oxidativo é uma condição biológica em que ocorre desequilíbrio

entre a produção de espécies reactivas de oxigénio e a sua degradação através de

sistemas biológicos que as removam ou reparem os danos por elas causados.

Quando o processo faz-se intenso e predominam as substâncias oxidantes, ocorre o

estresse oxidativo de grandes proporções, levando a dano tanto aos lipídeos quanto

ao DNA.

Em termos gerais, o estado de estresse oxidativo orgânico parece variar com

a concentração de oxigênio, o tipo de tecido analisado, a dieta e a idade do

 32

individuo, a ingestão de fármacos, a exposição a condições ambientais impróprias,

tais como radiação ultravioleta, poluição, umidade relativa, temperatura ambiente,

além de estresse emocional.

A situação de estresse oxidativo traduz-se na incapacidade de impedir ou

reparar as repercussões das espécies reativas de oxigênio sobre as estruturas

celulares e ocorre em todos os seres biológicos, mesmo em situações basais, isto é,

em repouso (MOTA, 2004). Um incremento do estresse oxidativo pode dever-se não

só ao aumento na produção de espécies reativas de oxigênio, mas, também, à

redução da capacidade antioxidante ou, ainda, à conjugação destes dois fatores.

JUSTIFICATIVA
 34

2 JUSTIFICATIVA

A relação entre poluição do ar ambiente e aumento da morbidade de doenças

respiratórias, mostrada em estudos epidemiológicos, está bem estabelecida em

áreas de poluição urbana, onde as principais fontes poluentes são tráfego e

indústrias. No entanto, o mecanismo fisiopatológico da ação prejudicial dessa

exposição à população ainda não está completamente esclarecido.

Conhecendo o histórico sobre poluição, sabe-se que, mesmo em

concentrações abaixo dos padrões estabelecidos pelos órgãos responsáveis pelo

controle de qualidade de ar, existe correlação de morbi-mortalidade com doenças

pulmonares. Sendo assim, há necessidade de estudos avaliando os níveis de

concentração de PM2,5 estipulados pela CETESB/SP e seus possíveis efeitos no

sistema respiratório.

Não há, na literatura, estudos correlacionando as propriedades de mecânica

pulmonar com alterações histológicos e processo inflamatório induzidos por

exposição aguda a PM2,5 oriundo da região metropolitana da cidade de São Paulo.

OBJETIVOS
 36

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Testar a hipótese de que a instilação aguda de material particulado fino

(PM2,5), em doses inferiores consideráveis aceitáveis pela CETESB/SP, induz

inflamação, estresse oxidativo, alterações funcionais e histológicas pulmonares.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar a composição do material particulado utilizado para instilação, bem como

estudar, após 24 horas da instilação intranasal de PM2,5, os efeitos sobre:

a) as propriedades elásticas, resistivas e viscoelásticas e/ou inomogêneas do

pulmão pelo método de oclusão ao final da inspiração;

b) as características morfométricas e contagem de macrófagos e neutrófilos

no parênquima pulmonar;

c) o processo inflamatório por meio de ensaios bioquímicos de estresse e

dano oxidativos.
MATERIAIS E MÉTODOS
 38

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 AMOSTRA DAS PARTÍCULAS

O material particulado 2,5 foi cedido pelo Laboratório de Poluição

Atmosférica, Departamento de Patologia, Universidade de São Paulo – USP.

Coletou-se o material particulado 2,5 em filtros de policarbonato (isopore

membrane filters) cat. no. ATTP03700, 0,8 µm, de 37 mm de diâmetro, marca

Millipore, utilizando o impactador Harvard (Air Diagnostics, Harrison, ME, EUA) que

permite a separação das partículas de 2,5 µm com um fluxo de 10 L.min-1 durante 24

horas. Os filtros foram secos durante 24 horas a 50 oC antes e depois da coleta para

pesagem. A diferença de peso do filtro (g) corresponde à massa de PM2,5 coletado.

As amostras foram coletadas na cidade de São Paulo, Brasil, no teto da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (aproximadamente 15 metros

acima do solo), localizada na interseção de duas movimentadas avenidas no centro

da cidade no intervalo de agosto de 2005 a abril de 2006. Neste local, 89% das

partículas finas são derivadas de tráfego (CETESB, 2006).

Ao recebermos os filtros contendo o material particulado, extraímos as

partículas em água destilada via agitação em um sonicador ultrassônico por

aproximadamente oito horas. A eficiência da extração foi determinada pelo peso dos

filtros antes e depois da extração, o peso foi avaliado após secá-los durante 24

horas a 50 oC (RIVERO et al., 2005). A proporção final partícula: volume foi 1:2 (1

µg: 2 µL), sendo utilizados 5 µg de massa de PM2,5 em 10 µL da solução final.

 39

4.2 GRUPOS EXPERIMENTAIS

Os animais utilizados, oriundos do Biotério do Laboratório de Fisiologia da

Respiração do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do

Rio de Janeiro, foram cuidados conforme o guia preparado pelo Comitê de Cuidados

e Uso dos Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisas dos Estados

Unidos (U. S. Department of Health and Humane Services, 1985). Aprovado pela

Comissão de Ética com Uso de Animais (CEUA), Centro de Ciências da Saúde,

Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob o número IBCCF 046.

Cinquenta e um camundongos BALB/c machos normais adultos, pesando 25

± 5 g (média ± erro padrão) foram divididos, aleatoriamente, em quatro grupos, a

saber:

 Grupo CTRL (n=9): animais receberam instilação intranasal de 30 μl de

solução salina (0,9% NaCl).

 Grupo FILTRO (n=5): animais receberam instilação intranasal de 30 μl de

solução de água destilada oriunda da ultrassonicação de filtros virgens de

policarbonato.

 Grupo P5 (n=16): animais receberam instilação intranasal de 5 μg de PM2,5

(volume total de 30 μL).

 Grupo P15 (n=16): animais receberam instilação intranasal de 15 μg de

PM2,5 (volume total de 30 μL).

4.3 EXPERIMENTOS

As doses de material particulado administradas correspondem às depositadas

nos pulmões de camundongos durante 24 horas de exposição ambiental em um dia

típico de São Paulo, que tem uma média diária ao longo de um mês igual a 23 e
 40

anual que pode variar entre 15 e 25 μg/m3 (CETESB, 2007 e 2008). Logo, a dose

acumulada de PM em 24 horas inalada por um camundongo nessa concentração

ambiental é cerca de 14,4 µg, considerando que um camundongo inspira 0,03 m3 de

ar em 24 horas. Considerando que apenas uma fração do PM administrado por

instilação nasal atinge a região alveolar, a dose utilizada é ambientalmente relevante

e inferior aos limites recomendados pelas agências reguladoras.

Para a instilação intranasal os animais foram anestesiados com sevofluorano

(1 mínima concetração alveolar – MAC) e se recuperaram rapidamente do

procedimento. A instilação provoca um reflexo de apnéia seguido por inspiração

profunda que conduz o líquido para dentro do pulmão. Os animais receberam três

instilações contendo 10 µl da solução totalizando os 30 µl finais. A técnica utilizada

foi eficaz para que evitasse o desperdício do material.

Todos os animais foram analisados 24 horas após a instilação, sendo

submetidos às análises de mecânica e histologia pulmonares, bem como de

estresse oxidativo.

4.3.1 Análise de metais

A análise dos metais (Na, Al, Si, P, S, K, Ca, Ti, V, Fe, Ni, Cu, Zn e Pb) foi

realizada no Laboratório de Poluição Atmosférica, Departamento de Patologia.

Universidade de São Paulo.

Analisou-se uma média de 102 filtros coletados durante o período de agosto

de 2005 e maio de 2007, utilizando um espectrômetro (EDX 700HS, Shimadzu

Corporation Analytical Instruments Division, Kyoto, Japan) (MAUAD et al., 2008).

 41

4.3.2 Análise de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

A análise de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos das partículas retidas

nos filtros foi realizada no Laboratório de Radioisótopos Eduardo Penna Franca,

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Baseia-se em técnicas cromatográficas de separação, divididas em quatro

etapas principais: extração, purificação, fracionamento e determinação dos

poluentes por cromatografia líquida de alta eficiência (Figura 7). Para cada amostra,

foi analisado um branco, que acompanhou todas as etapas descritas abaixo.

Extração 0,5 grama de peso seco (p.s.) em ultra-som

(banho quente) com n-hexano/acetona (3 x
20 min)

Coluna cromatográfica aberta com agente

Purificação
dessulfurizante (Al2O3/Na2SO3/NaOH em 11%
de água)O)

Coluna cromatográfica aberta contendo sílica gel

Fracionamento

Modelo: RF-10 (Shimadzu AxL, Corp, Kyoto, Japão)

Bombas: LC-10AT e LC-10AS.
Coluna: CLC-ODS: 25 cm; 4,6 mm d.i.; 5 μm; 120 Å.
Cromatografia líquida Fase móvel: acetonitrila/água (80:20 v/v)
Fluxo: 1,5 mL.min-1

Figura 7. Esquema da metodologia utilizada para análise de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos.

 42

4.3.2.1 Extração

Matrizes, como material particulado, apresentam uma gama de substâncias

orgânicas associadas, principalmente adsorvidas às partículas minerais. Para

melhor desempenho na extração de poluentes orgânicos com polaridades distintas,

se faz necessário a utilização de solventes orgânicos com polaridades

intermediárias. Solventes como acetona, diclorometano, n-hexano e acetonitrila são

amplamente utilizados na extração desses contaminantes (PASTOR et al., 1997;

TORRES et al., 1999).

Neste estudo foram pesados 0,5 grama de peso seco (p.s.) de amostra de

partículas em tubos de vidro. Os tubos foram vedados com tampas de Teflon e

identificados. Cada amostra foi extraída, adicionando-se uma mistura de 12 mL de n-

hexano/acetona (3x 20 minutos) utilizando um aparelho de ultra-som em banho

quente (~90oC). Para cada extração, a proporção da mistura era alterada da

seguinte forma: 1) 1:4 v/v n-hexano/acetona; 2) 1:1 v/v n-hexano/acetona; 3) 4:1 v/v

n-hexano/acetona. Foi adicionado 1 mL de isooctano para cada etapa. Após cada

lavagem, as amostras foram centrifugadas a 1800 rpm por 15 minutos e

posteriormente transferidas para balões de vidro.

4.3.2.2 Purificação

O extrato adquirido das matrizes contém poluentes como hidrocarbonetos

policíclicos aromáticos, mas também outros compostos que podem aumentar o ruído

analítico, dificultando a quantificação cromatográfica futura. Japenga et al. (1987)

desenvolveram técnicas cromatográficas de purificação para poluentes orgânicos,

utilizando reagentes com ação dessulfurizante (TORRES et al., 1999). Este agente é

composto de uma mistura de óxido de alumínio impregnado por uma solução

 43

aquosa de sulfito de sódio e hidróxido de sódio, em uma quantidade mínima de água

(11%).

Para a etapa de purificação, os extratos foram previamente concentrados em

evaporador rotatório para 1 mL. Após concentrado, cada extrato foi transferido para

uma coluna cromatográfica aberta, empacotada com 7 g de agente dessulfurizante

(Al2O3/Na2SO3/NaOH em 11% de água). Primeiramente, a coluna foi ativada pela

eluição de 20 mL de n-hexano. O primeiro solvente eluído foi descartado. A coluna

foi eluída, posteriormente, com 20 mL de n-hexano. Por fim, o eluato purificado foi

recolhido e avolumado em balões volumétricos de 50 mL. As amostras foram

armazenadas em freezer (-10oC) para a etapa seguinte.

4.3.2.3 Fracionamento

O fracionamento é uma etapa de separação, que facilita a análise e posterior

quantificação das substâncias em estudo. A outra vantagem da técnica de

fracionamento é preservar o equipamento cromatográfico contra possíveis

compostos mais reativos.

Para o fracionamento de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, foi retirada

uma alíquota de 20 mL de cada amostra. Consecutivamente, as amostras

purificadas foram concentradas em evaporador rotatório para 1 mL e transferidas

para uma coluna cromatográfica aberta, contendo 3 g de sílica gel. A sílica gel foi

previamente lavada com n-hexano em ultra-som por 20 min e seca em estufa (60oC)

por 12 h. Duas eluições foram realizadas: a primeira, foi eluída com 7 mL de n-

hexano e posteriormente descartada, este procedimento tem o objetivo de retirar

qualquer outro contaminante orgânico que possa atrapalhar a identificação futura de

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, na segunda eluição foram usados 35 mL de

n-hexano/éter (3:1; v/v) para cada amostra. Ao fim da eluição, as amostras foram
 44

concentradas em evaporador rotatório até a secura e solubilizadas em 0,5 mL de

acetonitrila.

4.3.2.4 Condições cromatográficas

As amostras foram analisadas em um cromatógrafo líquido de alta eficiência

acoplado a um detector de fluorescência, modelo RF-10 (Shimadzu AxL, Corp,

Kyoto, Japão) com duas bombas LC-10AT e LC-10AS, e coluna CLC-ODS: 25 cm;

4,6 mm d.i.; partícula com 5 μm e poro de 120 Å. A fase móvel é composta por uma

mistura de acetonitrila/água (80:20 v/v) com fluxo isocrático de 1,5 mL.min-1. O

detector foi programado em oito etapas de comprimento de onda para

excitação/emissão: 255/325; 253/350; 333/390; 287/462; 280/430; 294/404 300/500

e 300/421. Para análise de cada amostra, foi injetada uma alíquota de 20 µL. Foram

analisados 11 hidrocarbonetos policíclicos aromáticos neste estudo: naftaleno,

fluoreno, acenaftileno, fenantreno, fluoranteno, pireno, benzo[a]antraceno,

benzo[b]fluoranteno, benzo[k]fluoranteno, benzo[a]pireno e benzo[ghi]pirileno.

4.3.2.5 Quantificação

Utilizou-se o software Borwin 1.2 para a integração dos cromatogramas e

cálculo de concentração dos compostos. Para a identificação dos compostos,

comparou-se o tempo de retenção de cada um com o cromatograma de uma

solução padrão. A quantificação dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos foi

baseada na curva de calibração de uma solução padrão.

4.3.3 Mecânica respiratória

Vinte e quatro horas após a instilação, os animais foram sedados com

diazepam (1 mg i.p.), pesados (balança Filizola, modelo BR, Indústrias Filizola SA,

SP, Brasil) e, então, anestesiados com pentobarbital sódico (20 mg/kg i.p.).
 45

Depois de anestesiados, os animais foram colocados em uma pequena mesa

sob foco cirúrgico em decúbito dorsal, sendo seus membros fixados por

esparadrapo. Os membros superiores foram mantidos horizontalmente abduzidos a

90 graus em relação ao corpo e os membros inferiores estendidos em diagonal.

Após o posicionamento cirúrgico, foi realizada traqueotomia com introdução de jelco

(20 G com 32 mm de comprimento e 0,8 mm de diâmetro interno), sendo a cânula

fixada à traquéia por meio de fios de algodão. Os animais foram paralisados com

injeção intravenosa de brometo de pancurônio (0,1 mg/kg).

Os camundongos foram, então, acoplados à prótese ventilatória e ventilados

por um ventilador de fluxo constante (Samay VR15, Universidad de la Republica,

Montevidéu, Uruguai) com freqüência de 100 incursões respiratórias por minuto e

um volume corrente (VT) de 0,2 mL.

Após a adaptação ao respirador, procedeu-se à tricotomia e abertura da pele

e do subcutâneo dos animais, na linha mediana, do manúbrio ao púbis. A seguir,

esses planos foram separados da musculatura por tração lateral. O plano muscular e

o peritônio foram, então, secionados bilateralmente, seguindo o bordo inferior das

costelas, até atingir a linha axilar anterior. Com a cavidade abdominal aberta, foi

possível visualizar o diafragma, que foi perfurado e secionado segundo a mesma

orientação da abertura da parede abdominal. Antes da perfuração do diafragma foi

instalada pressão positiva ao final da expiração (PEEP) de 2 cmH 2O, a fim de evitar

o desenvolvimento de colapso pulmonar (POWERS et al., 1973; SALDIVA, 1992;

RODRIGUES et al., 1993).

Após a retirada do diafragma, a parede torácica anterior foi removida por

incisões longitudinais bilaterais ao nível da linha axilar anterior, em toda sua

extensão, e incisão transversal superior, abaixo das clavículas.

 46

O ventilador foi ajustado previamente para gerar uma pausa de 5 segundos

ao final da inspiração. Foram tomados cuidados especiais para a manutenção de

volume (VT = 0,2 mL) e fluxo (V’= 1 mL/s) constantes em todos os animais, a fim de

evitar os efeitos de diferentes fluxos, volumes e tempo inspiratório nas variáveis

medidas (KOCHI et al., 1988a,b; SIMILOWSKI et al., 1989).

O tubo traqueal foi conectado a um pneumotacógrafo para pequenos animais,

como descrito por Mortola e Noworaj (MORTOLA & NOWORAJ, 1983), para medida

de fluxo aéreo (V'), sendo o respirador acoplado à outra extremidade do

pneumotacógrafo. Este é constituído por uma cânula metálica com duas saídas

laterais ligadas a um transdutor diferencial de pressão, Validyne MP45-2

(Engineering Sales Corp, Northridge, CA, EUA), para medida de fluxo aéreo, sendo

o volume corrente obtido por integração digital do sinal de fluxo. Através de outra

saída lateral, a via aérea foi conectada a um transdutor diferencial de pressão

Validyne MP45-2 (Engineering Sales Corp, Northridge, CA, EUA) para medida da

pressão traqueal (Ptr).

Uma vez que não houve modificações abruptas no diâmetro no nosso circuito,

provavelmente foram evitados erros de medida da resistência ao fluxo (CHANG &

MORTOLA, 1981; LORING, 1979). O espaço morto do equipamento foi de 0,3 mL.

Os sinais de V’ e Ptr foram condicionados e amplificados em um polígrafo Beckman

tipo R (Beckman Instruments, Schiller Park, IL, EUA). Os sinais foram, então,

passados através de filtros Bessel de 8 pólos (902LPF, Frequency Devices,

Haverhill, MA, EUA), convertidos de analógicos para digitais em conversor de 12 bits

(DT-2801A, Data Translation, Malboro, MA, EUA) e armazenados em computador.

Todos os dados foram coletados usando o software LABDAT (RHT-InfoData Inc.,

Montreal, QC, Canadá) A montagem experimental encontra-se na Figura 8.

 47

Figura 8. Montagem experimental consistindo de:

1 - Cilindro de ar comprimido.
2 - Válvula redutora de pressão.
3 - Ventilador de fluxo inspiratório constante composto por duas válvulas solenóides.
4 - Pneumotacógrafo.
5 - Peça em “T” para medida de pressão na abertura das vias aéreas.
6 - Cânula traqueal.
7 - Mesa cirúrgica.
8 - Transdutor diferencial de pressão transpulmonar.
9 - Transdutor diferencial de pressão para medida de fluxo.
10 - Polígrafo de oito canais para amplificação dos sinais de fluxo e pressão.
11 - Filtros passa-baixa Bessel de 8 polos.
12 - Conversor analógico-digital de 12 bits.
13 - Microcomputador.
Durante os experimentos evitou-se ao máximo a manipulação da cânula

traqueal com aspirações e insuflações, para eliminar possíveis interferências sobre

os parâmetros medidos.
 48

Os parâmetros da mecânica respiratória foram determinados 24 horas após a

instilação de salina, de água deionizada ou de PM. Para tanto, 10 ciclos respiratórios

foram capturados por animal e a análise efetuada pelo método de oclusão ao final

da inspiração.

O método de oclusão ao final da inspiração (BATES, 1985) permite analisar

separadamente os componentes elástico, resistivo e viscoelástico e/ou inomogêneo

do sistema respiratório.

No animal com o tórax aberto, a Ptr é, na realidade, a pressão transpulmonar

(PL), logo todos os parâmetros medidos correspondem à mecânica pulmonar. Após

a oclusão das vias aéreas ao final da inspiração, sob fluxo constante, ocorre uma

queda súbita da PL até um ponto de inflexão (Pi), a partir do qual o decaimento da

pressão assume caráter mais lento, atingindo um platô em sua porção terminal. Esta

fase de platô corresponde à pressão de retração elástica do pulmão (Pel). A

diferença de pressão, que caracteriza a queda rápida inicial (∆P1), é representada

pela diferença entre a pressão máxima inicial (Pmax) e o ponto a partir do qual a

queda se torna mais lenta (Pi) e corresponde ao componente viscoso pulmonar. A

segunda variação de pressão (∆P2), representada pela queda lenta, do Pi ao platô

(Pel), reflete a pressão dissipada para vencer os componentes viscoelástico (stress

relaxation) e/ou inomogêneo (pendelluft) do tecido pulmonar. A soma de ∆P1 e ∆P2

fornece a variação total de pressão no pulmão (∆Ptot) (Figura 9).

 49

Figura 9. Método de oclusão ao final da inspiração. Registros dos sinais de fluxo aéreo, volume (V) e
pressão transpulmonar (PL) em função do tempo. Os pulmões foram ventilados com volume corrente
de 0,2 mL e fluxo aéreo de 1 mL/s. O platô foi alcançado após uma pausa inspiratória de 5 s. Após a
oclusão das vias aéreas, há uma queda rápida na PL de seu valor máximo (Pmax) até um ponto de
inflexão (Pi), ∆P1, que corresponde à pressão dissipada para vencer o componente viscoso do pulmão.
Segue-se uma queda lenta (∆P2), pressão dissipada para vencer os componentes viscoelástico e/ou
inomogêneo do pulmão, até um ponto de equilíbrio elástico, representado pela pressão de retração
elástica pulmonar (Pel). A linha de base do registro de pressão corresponde à pressão positiva ao final
da expiração (PEEP) de 2 cmH2O. Ins, inspiração. VT, volume corrente.

As elastâncias estática (Est) e dinâmica (Edyn) do pulmão foram obtidas

dividindo-se Pel e Pi, respectivamente, pelo volume corrente. O componente

viscoelástico da elastância (∆E) foi, então, obtido pela diferença entre Edyn e Est.

Para a realização da oclusão, o ventilador mecânico utiliza uma válvula com

tempo de fechamento definido (10 ms). Como este fechamento não é absolutamente

instantâneo, o volume nunca cai à zero imediatamente após a oclusão, propiciando,

 50

assim, a existência de um pequeno fluxo. Este fluxo é responsável pelo aumento do

volume pulmonar e, conseqüentemente, de Pi e Pel. Por isso, foi feita correção de

acordo com KOCHI at al., (1988a).

As seguintes fórmulas foram utilizadas na análise da mecânica pulmonar:

∆P1 = Pmax – Pi

∆P2 = Pi – Pel

∆Ptot = ∆P1 + ∆P2

Est = Pel / VT

Edyn = Pi / VT

∆E = Edyn – Est

Ti = VT/V´

Onde:
∆P1 = variação de pressão utilizada para vencer o componente viscoso
∆P2 = variação de pressão relativa ao componente viscoelástico e/ou inomogêneo
∆Ptot = variação de pressão total
Pmáx = pressão máxima atingida
Pi = pressão no ponto de inflexão
Pel = pressão de retração elástica
Est = elastância estática
Edyn = elastância dinâmica
∆E = componente viscoelástico da elastância
VT = volume corrente
TI = tempo inspiratório
V’= fluxo inspiratório

A resistência total do equipamento (Req), incluindo a cânula traqueal, foi

previamente aferida através da aplicação de fluxos de ar ao sistema, com

concomitante registro das variações de pressão (∆P). Uma vez que R = ∆P / V’, a

resistência do equipamento corresponde ao coeficiente angular da curva ∆PxV’. A

 51

Req, constante até fluxos de 26 mL/s (bem acima da faixa de fluxo utilizada no

presente experimento), foi de 0,12 cmH2OmL-1s-1. A variação de pressão

determinada pelo equipamento (∆Peq = Req.V’) foi subtraída das pressões resistivas

do pulmão, de tal forma que os resultados representam propriedades mecânicas

intrínsecas.

4.3.4 Histologia pulmonar

4.3.4.1 Fixação e preparo das lâminas para microscopia óptica

Após a determinação da mecânica pulmonar, os animais foram heparinizados

(veia cava inferior, 1000 IU) e, em seguida, sacrificados por seção da aorta

abdominal e da veia cava inferior. A traquéia foi ocluída ao final da expiração com fio

de algodão. Os pulmões foram perfundidos com solução salina (NaCl a 0,9%). O

pulmão direito foi removido e homogeneizado (homogeneizador modelo NT 136,

Novatécnica, São Paulo, Brasil) com solução tampão (fosfato de potássio 100 mM +

EDTA 5 mM, solução final 1 mL) e centrifugado (centrífuga modelo 243M, FANEM,

São Paulo, Brasil) a 7000 g durante dez minutos. O pulmão esquerdo foi retirado

para analise histologica sendo então perfundindo com solução Millonig modificada

(100 mL de formol à 40%, 900 mL de água destilada, 18,6 g de NaH 2PO4, e 4,2 g de

NaOH) durante aproximadamente um minuto. Para tal, um scalp (19G) foi

introduzido no ventrículo direito e conectado ao frasco contendo a solução de

perfusão, a 50 cm de altura. A porção abdominal do esôfago foi identificada e

isolada, sendo presa por uma pinça hemostática. As estruturas do pescoço foram

dissecadas com liberação das vias aéreas. A pinça que prendia o esôfago foi

suavemente tracionada para cima, permitindo separá-lo das estruturas aderidas à

parede torácica posterior. Com todas as estruturas individualizadas, a traquéia foi

secionada acima do local ligado pelo fio e, posteriormente, o esôfago foi separado
 52

do conjunto por leve tração. O pulmão esquerdo foi removido en bloc e fixado em

solução Millonig modificada.

Depois da fixação, o material foi processado como de rotina para estudo

histológico e emblocado em parafina, obtendo-se, então, cortes histológicos com 4

µm de espessura.

As lâminas contendo os cortes pulmonares foram coradas com hematoxilina e

eosina (HE) e analisadas por microscopia óptica (Axioplan, Zeiss, Oberkochen,

Alemanha), segundo seus aspectos qualitativos e quantitativos.

4.3.4.2 Análise histológica

As lâminas com os cortes pulmonares montados foram analisadas por

microscopia óptica (microscópio Axioplan, Zeiss, Oberkochen, Alemanha) tanto

qualitativa quanto quantitativamente.

Para a análise qualitativa, toda a superfície da lâmina foi observada com

todas as estruturas pulmonares representadas, em aumento de 100x.

A análise quantitativa foi realizada por meio da técnica convencional de

contagem de pontos (point-couting) (GUNDERSEN et al., 1988), utilizando uma

ocular contendo um sistema de referência de 100 pontos e 50 linhas dispostos em

paralelo para contagem da morfometria alveolar (Figura 10). Para tal, foi utilizado o

estudo cego, onde o avaliador desconhecia a especificação dos grupos.

 53

Figura 10. Retículo com 100 pontos e 50 linhas utilizado para análise histológica.

Em um aumento de 200x foram avaliados de cinco a dez campos aleatórios e

não coincidentes por lâmina. Foi quantificada a fração de área ocupada por alvéolos

normais, colapsados e hiperinsuflados (WEIBEL, 1990), onde o número de pontos

que caíam em área de alvéolos normais, colapsados ou hiperinsuflados,

respectivamente, foi dividido pelo total de pontos contados em cada campo

analisado e expresso sob a forma de percentual.

Em um aumento de 200x foram avaliados dez campos, aleatórios e não

coincidentes, por lâmina para quantificação da celularidade no tecido pulmonar. O

número de macrófagos e neutrófilos foi medido como número de células sobre área

de tecido pulmonar. Para tal, foram computados o número de células que caíram

dentro da região alveolar, e a área de tecido em aumento de 200x. Os macrófagos e

neutrófilos na região alveolar de cada campo foram avaliados por dois examinadores

às cegas, posteriormente expressos como número de células/µm2 de tecido

pulmonar.
 54

Os valores finais foram expressos como média ± erro padrão da média

(EPM).

4.3.5 Estudo Imunuhistoquimico

4.3.5.1 8-Isoprostano

A marcação e quantificação da expressão de 8-isoprostano foram realizadas

no Laboratório de Poluição Atmosférica, Departamento de Patologia. Universidade

de São Paulo.

Cortes de tecido de pulmão de 4 µm foram montados em lâminas silanizadas

(3-aminopropil-trietoxi-silano) para avaliação da peroxidação lipídica pelo método

Biotina-estreptavidina peroxidase, utilizando-se anticorpo policlonal primário de

carneiro anti-8-epi-PGF2α (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, MI EUA)

seguido de um anticorpo monoclonal de coelho.

4.3.5.1.1 Hidratação e bloqueio

Após as lâminas serem desparafinizadas e hidratadas, foi feito o bloqueio da

peroxidase endógena com água oxigenada (H2O2) 10 V 3%, sete vezes de cinco

minutos cada, seguindo-se a lavagem com água e PBS (tampão fosfato/salina).

4.3.5.1.2 Recuperação antigênica

Posteriormente, a recuperação antigênica foi obtida através de tripsina

(0,25% em PBS [Sigma T 7409]) por 20 minutos 37ºC. Após este período, as

lâminas foram lavadas em PBS.

4.3.5.1.3 Incubação com o anticorpo primário anti-8-epi-PGF2α

Após o bloqueio, o anticorpo primário anti-8-epi-PGF2α título 1:500 para

material parafinado, foi diluído em BSA (albumina de soro bovina) e aplicado sobre
 55

os cortes e controles, positivo e negativo de tecido, e as lâminas incubadas

“overnight” em geladeira 4ºC em câmara úmida.

As lâminas então foram lavadas em PBS e incubadas pelo kit comercial

ABCKit Vectastain HRP (Vector Laboratories, Burlingame, CA EUA) para a reação

imunuhistoquímica por peroxidase. Após esta etapa, elas foram novamente lavadas

PBS e seguiu-se a revelação pelo cromógeno 3,3 diaminobenzidina (DAB) (Sigma

Chemical Co, St Louis, MO, EUA). As lâminas foram lavadas abundantemente em

água corrente e contra-coradas com Hematoxilina de Harris por 30 segundos

(Merck, Darmstadt, Alemanha). Por fim, as lâminas foram lavadas em água corrente,

desidratadas, diafanizadas e montadas com Entellan (Merck, Darmstadt, Alemanha).

As análises foram feitas por mais de um avaliador utilizando o modelo de

análise às cegas desconhecendo assim, a especificação de cada lâmina. Os grupos

foram avaliados baseados em escore que variava de 0 – sem cor, 1 – muito pouca, 2

– pouca, 3 – média, 4 – alta intensidade.

4.3.5.2 Marcação de macrófagos e neutrófilos

A marcação e quantificação de macrófagos e neutrófilos foram realizadas no

Laboratório de Reparo Tecidual, Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto

de Biologia Roberto Alcântara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro.

Para a marcação de macrófagos e neutrófilos utilizamos cortes de tecido de

pulmão de 4 µm montados em lâminas silanizadas (3-aminopropil-trietoxi-silano)

para avaliação do morfismo celular pelo método biotina-estreptavidina peroxidase

utilizando anticorpo policlonal anti-camundongo F4/80 (ABD SEROTEC Raleigh, NC,

USA) e antineutrófilo (ABD SEROTEC Raleigh, NC, USA) produzidos em ratos.

4.3.5.2.1 Hidratação e bloqueio

 56

Após as lâminas serem desparafinizadas em estufa a 56ºC por 5 minutos e

hidratadas, foi feito o bloqueio da peroxidase endógena com metanol (90%) +

peróxido de hidrogênio (H2O2) 10%, uma vez por 10 minutos, seguindo-se a lavagem

com água e PBS.

4.3.5.2.2 Recuperação antigênica

Posteriormente, a recuperação antigênica foi obtida através de tampão citrato

por 30 minutos 70ºC. Após este período, as lâminas foram lavadas em PBS.

4.3.5.2.3 Incubação com o anticorpo primário anticorpo AntiMacrófago F4/80 e

Antineutrófilo

Após o bloqueio dos sítios antigênicos inespecíficos com PBS/BSA 3% por 30

minutos, o anticorpo primário anti-macrófago F4/80 foi diluído em BSA e aplicado

sobre os cortes e controles, positivo e negativo de tecido, e as lâminas incubadas

em câmara úmida por 4 horas em temperatura ambiente e, posteriormente,

colocadas em geladeira 4 graus para período de “overnight”. Para a marcação de

neutrófilos seguiu-se o mesmo protocolo, alterando apenas o anticorpo primário,

utilizando o anticorpo primário antineutrófilo,

As lâminas então foram lavadas em PBS e incubadas com estreptavidina

conjugada a enzima peroxidase (One Lambda Inc, Canoga Park, CA, EUA) para a

reação imunuhistoquimica para macrófagos e neutrófilos. Após esta etapa, elas

foram novamente lavadas com PBS e seguiu-se a revelação com DAB (Sigma

Chemical Co, St Louis, MO, EUA). As lâminas foram lavadas abundantemente em

água corrente e contra-coradas com Hematoxilina de Harris por 30 segundos

(Merck, Darmstadt, Alemanha). Por fim, as lâminas foram lavadas em água corrente,

desidratadas, diafanizadas e montadas com Entellan (Merck, Darmstadt, Alemanha).

 57

4.3.6 Ensaios bioquímicos de estresse e dano oxidativo

As análises de estresse oxidativo no pulmão foram realizadas no Laboratório

de Reparo Tecidual, Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto de Biologia

Roberto Alcântara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro.

Para análise do desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes sofrido pelos

diferentes tecidos foram realizados ensaios bioquímicos que medem a atividade das

enzimas antioxidantes ou de marcadores de estresse e dano oxidativo.

O estresse oxidativo foi mensurado por atividade de enzimas antioxidantes

como a catalase (CAT). Já o dano oxidativo foi avaliado pelo método de estudo das

substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA) e foi analisada ainda a atividade

da mieloperoxidase (MPO), enzima lisossomal envolvida na atividade bactericida de

polimorfonucleares e a relação entre glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG).

Para estas análises, os brônquios principais direito e esquerdo foram ocluídos

com fio de algodão e os pulmões separados. O pulmão direito foi removido e

homogeneizado (homogeneizador modelo NT 136, Novatécnica, São Paulo, Brasil)

com solução tampão (fosfato de potássio 100 mM + EDTA 5 mM, solução final 1 mL)

e centrifugado (centrífuga modelo 243M, FANEM, São Paulo, Brasil) a 7000 g

durante dez minutos. O pellet foi descartado e o sobrenadante utilizado para análise.

Ao final, foi medida a quantidade de proteína em cada amostra.

4.3.6.1 Dosagem de proteínas

A dosagem de proteínas foi realizada pelo método de Bradford (BRADFORD,

1976), que utiliza o corante coomassie brilliant blue G-250 (Sigma-Aldrich, St. Louis,

MO, EUA) para a determinação de proteínas totais em uma amostra. Tal método
 58

consiste na interação entre o corante G-250 e macromoléculas de proteínas que

contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a

interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante estabiliza a forma

aniônica do mesmo, causando uma visível mudança de coloração inicialmente

castanha para tons em azul, de acordo com a concentração da proteína. G-250

ligado à proteína tem sua absorbância alterada de 465 nm para 595 nm. Em uma

placa de 96 poços, prepara-se a curva padrão com albumina (1 mg/mL) em triplicata

e, em seguida, o poço teste (200 µL de reagente Bradford e amostra). Após

completa mistura, observa-se se o tom de azul do poço teste está entre o menor ou

o maior valor da curva padrão. Uma vez estabelecido o valor da amostra, distribui-se

os diferentes grupos nos poços em duplicata com volume final de 200 µL,

colocando-se primeiramente o reagente Bradford (maior quantidade) e por último a

amostra (menor quantidade). Com auxílio de uma pipeta faz-se a homogeneização.

A leitura da placa foi realizada com leitor de ELISA (Modelo 550, Bio-Rad, Hercules,

CA, USA) no comprimento de onda de 595 nm.

4.3.6.2 Medida do dano oxidativo

O dano oxidativo foi mensurado pelo método de estudo das substâncias

reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA) (DRAPER & HADLEY, 1990). O ácido

tiobarbitúrico reage com lipídios de membrana oxidados gerando um subproduto da

lipoperoxidação (malondialdeído, MDA). O MDA reage com o TBA, gerando um

produto colorido róseo lido em espectrofotômetro (Ultrospec 2100 pro, Amersham-

Biosciences, Buckinghamshire, Inglaterra). Alíquotas do homogeneizado pulmonar

dos grupos CTRL, P5 e P15 (200 μL) foram desproteinizadas com 800 μL de 10% de

ácido tricloroacético e centrifugadas a 900 g por dez minutos. O sobrenadante (500

μL) foi misturado com 500 µL de TBA 0,67%. A mistura foi aquecida por trinta
 59

minutos em água fervente e, então, resfriada em temperatura ambiente por cinco

minutos. A fase orgânica contendo o cromógeno rosa foi extraída com 750 μL de n-

butanol e a absorbância a 532 nm mensurada usando o espectrofotômetro

(Ultrospec 2100 pro, Amersham-Biosciences, Buckinghamshire, Inglaterra). Os

valores das substancias reativas ao ácido tiobarbiturico (nMol/mg proteína) foram

expressos com base em uma curva padrão de malondialdeído purificado.

4.3.6.3 Catalase (CAT)

A análise bioquímica que avalia a atividade da enzima antioxidante catalase

(CAT), produzida por células e organelas, foi mensurada em resposta à quantidade

de peróxido de hidrogênio (AEBI, 1984). O consumo de H2O2 libera energia que

produz uma absorbância não visualizada a olho nu, sendo medida em

espectrofotômetro no comprimento de onda de 240 nm. Assim, misturou-se 60 µL do

homogeneizado pulmonar dos três grupos experimentais com tampão fosfato e

peróxido de hidrogênio 1,4 µL/mL. Os valores de CAT foram corrigidos pelo valor de

proteína de cada amostra (U catalase/mg proteína).

4.3.6.4 Mieloperoxidase (MPO)

Alíquotas do homogeneizado pulmonar (100 µL) foram extraídas pela adição

de 0,5 mL de HTBA (brometo de cetildimetiletilamônio) em temperatura ambiente por

20 minutos. Após esse período as amostras foram acondicionadas em estufa a 60ºC

por 2 horas. O material foi, então, centrifugado a 14000 g por 15 min. O

sobrenadante (600 µL) foi adicionado a 450 µL de TMB (3,4,5-ácido

trimetoxibenzóico, 8-dietilamina-octil éster) e o substrato foi lido em leitor de ELISA

(Modelo 550, Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) a 655 nm. Os resultados foram

referenciados com base em uma curva padrão de mieloperoxidase vs. neutrófilos.

 60

Para a curva padrão, foi utilizada mieloperoxidase purificada. O resultado foi dado

como atividade de MPO (mU/mg proteína) (SUZUKI, 1983)

4.3.6.5 Glutationa reduzida (GSH) / Glutationa oxidada (GSSG)

Para a técnica de GSH foi adicionado a cubeta 1400 µL de tampão fosfato de

potássio (KPE), 200 µL de amostra, 120 µL de DTNB (5,5´ ditiobis – 2-ácido

nitrobenzóico – Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e 120 µL de glutationa redutase

(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e mantido em repouso por 30 segundos. A

seguir foram adicionados 120 µL de NADPH e misturado novamente. Logo em

seguida foi realizada a leitura cinética em 412 NM (Rahman et al., 2006).

A técnica de análise de GSSG (2-vinilpiridina 97%, Sigma-Aldrich, St. Louis,

MO, EUA) foi realizada com a incubação de 4 µL de solução de 2-vinilpiridina com

200 µL de amostra por 1 hora. A seguir foram adicionados 12 µL de solução de

trietanolamina. Posteriormente foram adicionados à cubeta 1400 µL de tampão

fosfato de potássio KPE, 200 µL de amostra , 120 µL de DTNB e 120 µL de

glutationa redutase. Misturado e mantido em repouso por 30 segundos. Por fim,

adicionados 120 µL de NADPH e novamente misturado. Logo em seguida foi

realizada a leitura cinética em 412 NM. (Rahman et al., 2006).

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os valores finais foram expressos como média ± erro padrão da média

(EPM).

Inicialmente os dados foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov

(com correção de Lilliefors) para avaliar a normalidade de suas distribuições. A

seguir foi aplicado o teste da mediana de Levene para verificar a igualdade de

 61

variâncias. Os parâmetros de morfometria foram submetidos inicialmente à

transformada arcoseno para torná-los aproximadamente normais.

Quando ambas as condições foram satisfeitas, foi aplicada análise de

variância para um fator (one-way ANOVA), seguida pelo teste de Tukey para

comparações múltiplas, quando necessário.

Em todos os testes, o nível de significância considerado foi de 5%. As

análises estatísticas foram realizadas pelo programa Sigma Stat 3.11 (Systat

Software, Inc., Chicago, EUA).

RESULTADOS
 63

5 RESULTADOS

5.1 ANÁLISES DAS PARTÍCULAS

Foi observada grande presença relativa de metais e hidrocarbonetos

policíclicos aromáticos no material particulado (Tabela 4).

Amostra
Análise dos HPAs PM2,5 ng/g n=102 Peso em ppm
Naftaleno 797,99 Na 3615 ± 3802
Acenaftileno 483,91 Al 157 ± 789
Fluoreno 233,6 Si 1300 ± 2697
Fenantreno 3309,88 P 0,23 ± 0,22
Fluoranteno 1157,42 K 1884 ± 4313
Pireno 127,9 Ca 861 ± 1894
B[a]antraceno 5,01 Ti 242 ± 359
B[b]fluoranteno 9,45 V 99 ± 65
B[k]fluoranteno 1,38 Fe 3595 ± 4342
B[a]pireno 5,85 Ni 67 ± 69
B[ghi]perileno 0,36 Cu 322 ± 253
Zn 1620 ± 2164
Pb 172 ± 225
C(%) 96 ± 4
Tabela 4. Distribuição de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) e metais contidos no material
particulado PM2,5. Os hidrocarbonetos policícliocs aromáticos foram analisados através de 1 filtro contendo
material particulado. Os resultados de metais foram realizados em um projeto realizado no Laboratório de
Poluição Atmosférica, Departamento de Biologia. Universidade de São Paulo.

5.2 ANÁLISE DA MECÂNICA PULMONAR

As diferenças entre os parâmetros de mecânica respiratória (ΔP1, ΔP2, ΔPtot,

Est e ΔE) observadas entre os animais dos grupos que não receberam material

particulado (CTRL e FILTRO) e os dos grupos que receberam 5 µg ou 15 µg de

PM2,5 (P5 e P15) estão representadas nas Figuras 11 e 12.

Os animais do grupo P15 apresentaram aumento significativo de ΔP2, ΔPtot,

Est e ΔE em relação aos animais dos grupos CTRL e FILTRO, ao longo do período

de estudo. Já o P5 apresentou aumento significativo apenas de ΔP2, ΔPtot e ΔE

 64

quando comparado com o CTRL e FILTRO, o que sugere que as alterações sejam

dependentes da dose de PM2,5. Não houve diferença significativa entre P5 e P15

(Figura 11 e 12).

Os resultados de cada animal encontram-se no anexo A.

Figura 11. Pressão resistiva (1), viscoelástica (2) e a variação das pressões transpulmonares total (tot)
nos grupos Controle (CTRL n = 17), FILTRO (n = 5), P5 (n = 17) e P15 (n = 12). Os valores são a média
+ erro padrão. * Valores significativamente diferentes quando comparados com o grupo CTRL e
FILTRO (p<0,05).
 65

Figura 12. Elastância estática (Est) e do componente elástico da viscoelasticidade do pulmão (∆E) nos
grupos Controle (CTRL n = 17), FILTRO (n = 5), P5 (n = 17) e P15 (n = 12). Os valores são a média +
erro padrão. * Valores significativamente diferentes quando comparados com o grupo CTRL e FILTRO
(p<0,05).

5.3 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA

Visando a fundamentar os achados funcionais e avaliar o comprometimento

tecidual seguido à administração intranasal de material particulado de origem urbana

da cidade de São Paulo foram realizadas análises qualitativas e quantitativas no

tecido pulmonar.
 66

5.3.1 Análise qualitativa

A figura 13 apresenta fotomicrografias do parênquima pulmonar dos grupos

CTRL, P5 e P15. Podemos notar que a administração de P15 provocou colabamento

alveolar e inflamação do parênquima pulmonar, evidenciada pelo aumento de

celularidade. Nas figuras 14, 15 e 16 podemos observar as marcações de imuno-

histoquímica para 8-isoprostano, macrófagos e neutrófilos respectivamente.

Figura 13. Fotomicrografias do parênquima pulmonar de camundongos dividido nos grupos: CTRL
(animais receberam instilação intranasal de 30 μl de solução salina), P5 (animais receberam instilação
intranasal de 5 μg de PM2,5 diluiídos em 30 μL de salina) e P15 (animais receberam instilação
intranasal de 15 μg de PM2,5 diluídos em 30 μL de salina).

Figura 14. Fotomicrografias representativa da marcação do anticorpo Anti-8-epi-PGF2α no parênquima

pulmonar de camundongos dividido nos grupos: CTRL (animais receberam instilação intranasal de 30 μl
 67

de solução salina), P5 (animais receberam instilação intranasal de 5 μg de PM2,5 diluiídos em 30 μL de

salina) e P15 (animais receberam instilação intranasal de 15 μg de PM2,5 diluídos em 30 μL de salina).
A análise da marcação para quantificação do dano oxidativo causado via 8-isoprostano foi feito através
de escores de pontuação onde 0 – sem cor, 1 – muito pouca, 2 – pouca, 3 – média, 4 – alta
intensidade. As setas indicam a presença da marcação que foi avaliada por scores qualitativos.

Figura 15. Fotomicrografias representativa da marcação para macrófagos utilizando o anticorpo

primário F4/80 no parênquima pulmonar de camundongos dividido nos grupos: CTRL (animais
receberam instilação intranasal de 30 μl de solução salina), P5 (animais receberam instilação intranasal
de 5 μg de PM2,5 diluiídos em 30 μL de salina) e P15 (animais receberam instilação intranasal de 15 μg
de PM2,5 diluídos em 30 μL de salina). As setas indicam a presença de macrófagos na região intra
alveolar.

Figura 16. Fotomicrografias representativa da marcação para neutrófilos utilizando o anticorpo primário
antineutrófilo no parênquima pulmonar de camundongos dividido nos grupos: CTRL (animais
receberam instilação intranasal de 30 μl de solução salina), P5 (animais receberam instilação intranasal
de 5 μg de PM2,5 diluiídos em 30 μL de salina) e P15 (animais receberam instilação intranasal de 15
μg de PM2,5 diluídos em 30 μL de salina). As setas indicam a presença de neutrófilos na região intra
alveolar.

5.3.2 Análise quantitativa

A figura 17 apresenta a análise morfométrica do parênquima pulmonar dos

animais dos grupos CTRL e poluição, vinte e quatro horas após a instilação

intranasal de PM2,5. Houve aumento significativo na percentagem de colapso

alveolar, acompanhado por redução do percentual de áreas normais no grupo P15

comparado ao grupo CTRL. Não houve diferença entre os grupos P5 e CTRL.

 68

Nenhum alvéolo hiperinsulfrado foi encontrado nas amostras. Os valores de cada

animal encontram-se no anexo B.

Visando a avaliar o efeito de partículas ambientais na resposta inflamatória,

quantificamos a taxa de macrófagos e neutrófilos por área (Figura 18). Foi

observado influxo de neutrófilos significativamente maior no grupo P15 em relação

ao CTRL e P5. Além disso, P15 apresentou aumento de macrófagos quando

comparado com o grupo CTRL. Não houve diferença entre os grupos P5 e CTRL.

Os valores de cada animal encontram-se no anexo C e D.

Figura 17. Fração de área de alvéolos normais e colapsados no parênquima pulmonar de

camundongos dividido nos grupos: CTRL (animais receberam instilação intranasal de 30 μl de solução
salina, n = 5), P5 (animais receberam instilação intranasal de 5 μg de PM2,5 diluiídos em 30 μL de
salina, n = 5) e P15 (animais receberam instilação intranasal de 15 μg de PM2,5 diluídos em 30 μL de
salina, n = 5). Os valores correspondem à média + erro padrão de 5-10 campos por lâmina em um
aumento de 200x. * indica valores significativamente diferentes do CTRL (p<0,05).
 69

Figura 18. Quantidade de macrófagos (células mononucleadas) e neutrófilos (células

polimorfonucleadas) por área de parênquima pulmonar de camundongos dividido nos grupos: CTRL
(animais receberam instilação intranasal de 30 μl de solução salina, n = 6), P5 (animais receberam
instilação intranasal de 5 μg de PM2,5 diluiídos em 30 μL de salina, n = 5) e P15 (animais receberam
instilação intranasal de 15 μg de PM2,5 diluídos em 30 μL de salina, n = 5). Os valores correspondem à
média + erro padrão de 5-10 campos por lâmina de 5 animais por grupo. * , # indicam valores
significativamente diferentes do CTRL e P5 respectivamente (p<0,05).

5.4 IMUNOHISTOQUÍMICA

5.4.1 8-Isoprostano

A figura 19 apresenta a análise imunohistoquímica da marcação de 8

isoprostano do parênquima pulmonar dos animais dos grupos CTRL e poluição.

Vinte e quatro horas após a instilação intranasal de PM2,5. Os grupos foram

avaliados baseados em escore que variava de 0 (pouca ou nenhuma intensidade) a

 70

4 (muita intensidade). Foi possível observar um aumento significativo no escore do

grupo P15 comparado ao grupo CTRL, mostrando uma maior marcação de 8-

isoprostano. Os valores de cada animal encontram-se no anexo F.

Figura 19. Os valores correspondem a média + erro padrão de análise semi-quantitativa (score de
intensidade de coloração para 8-isoprostano) em 5-6 animais/grupo. O gráfico mostra animais nos
grupos: CTRL (animais receberam instilação intranasal de 30 μl de solução salina, n = 9), P5 (animais
receberam instilação intranasal de 5 μg de PM2,5 diluídos em 30 μL de salina, n = 12) e P15 (animais
receberam instilação intranasal de 15 μg de PM2,5 diluídos em 30 μL de salina, n = 8). *valor
significativamente diferente de CTRL (p<0,05).

5.4.2 Atividade da mieloperoxidase

Visando avaliar a resposta inflamatória aguda induzida por material

particulado 2,5, quantificamos a atividade da enzima Mieloperoxidase (MPO),

 71

envolvida na migração de neutrófilos para os tecidos após exposição à PM2,5.

Notamos que os grupos que receberam PM apresentaram maior atividade de MPO

em relação ao grupo CTRL (Figura 20). Os valores de cada animal encontram-se no

anexo H.

Figura 20. Atividade da mieloperoxidase (MPO) no pulmão de camundongos analisados 24 horas

após instilação de material particulado 2,5. O gráfico mostra animais nos grupos: CTRL (animais
receberam instilação intranasal de 30 μl de solução salina, n = 5), P5 (animais receberam instilação
intranasal de 5 μg de PM2,5 diluídos em 30 μL de salina, n = 5) e P15 (animais receberam instilação
intranasal de 15 μg de PM2,5 diluídos em 30 μL de salina, n = 5). Os valores correspondem à média
+ erro padrão. * indica valores significativamente diferentes do CTRL (p<0,05).

5.5 ENSAIOS BIOQUÍMICOS DE ESTRESSE E DANO OXIDATIVO

Visando avaliar o desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes sofrido pelos

tecidos após exposição ao PM2,5, foram realizados ensaios bioquímicos que

 72

medem a atividade das enzimas antioxidantes ou de marcadores de estresse e dano

oxidativo.

Observa-se na figura 21 que o grupo P15 apresentou maior dano em relação

aos grupos CTRL e P5 representado por uma maior expressão de substancias

reativas ao ácido tiobarbitúrio. Os valores de cada animal encontram-se no anexo E.

A figura 22 apresenta a quantidade de catalase (CAT) no pulmão. A atividade da

catalase foi maior no grupo P15 em relação aos demais grupos. Os valores de cada

animal encontram-se no anexo G. Por fim, a figura 23 apresenta a relação

GSG/GSSG, mostrando que o grupo P15 tem uma relação reduzida quando

comparado tanto com o grupo CTRL quanto com o P5. Os valores de cada animal

encontram-se no anexo I.
 73

Figura 21. Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA) no pulmão de camundongos

analisados 24 horas após a instilação de material particulado 2,5. O gráfico mostra animais nos
grupos: CTRL (animais receberam instilação intranasal de 30 μl de solução salina, n = 7), P5
(animais receberam instilação intranasal de 5 μg de PM2,5 diluídos em 30 μL de salina, n = 10) e
P15 (animais receberam instilação intranasal de 15 μg de PM2,5 diluídos em 30 μL de salina, n =
11). Os valores correspondem à média + erro padrão. * indica valores significativamente diferentes
do CTRL (p<0,05).
 74

Figura 22. Atividade de catalase no pulmão de camundongos analisados 24 horas após a instilação de
material particulado 2,5. O gráfico mostra animais nos grupos: CTRL (animais receberam instilação
intranasal de 30 μl de solução salina, n = 7), P5 (animais receberam instilação intranasal de 5 μg de
PM2,5 diluídos em 30 μL de salina, n = 10) e P15 (animais receberam instilação intranasal de 15 μg de
PM2,5 diluídos em 30 μL de salina, n = 10). Os valores correspondem à média + erro padrão. * indica
valores significativamente diferentes do CTRL (p<0,05).
 75

Figura 23. Relação entre as atividades das glutationas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) no pulmão
de camundongos analisados 24 horas após a instilação de material particulado 2,5. O gráfico mostra
animais nos grupos: CTRL (animais receberam instilação intranasal de 30 μl de solução salina, n = 8),
P5 (animais receberam instilação intranasal de 5 μg de PM2,5 diluídos em 30 μL de salina, n = 13) e
P15 (animais receberam instilação intranasal de 15 μg de PM2,5 diluídos em 30 μL de salina, n = 11).
Os valores correspondem à média + erro padrão. * e # indica valores significativamente diferentes do
CTRL e P5 respectivamente (p<0,05).
DISCUSSÃO
 77

6 DISCUSSÃO

O presente estudo mostra que o material particulado fino (PM2,5) oriundas da

região metropolitana da cidade de São Paulo contém metais e hidrocarbonetos

policíclicos aromáticos com características inflamatórias conhecidas e descritas na

literatura (WILSON et al., 2002; SORENSEN et al., 2003; GHIO & COHEN, 2005;

PARK et al., 2006). Além disso, a exposição aguda a doses inferiores às

concentrações estabelecidas pela CETESB/SP, provoca elevação nos valores de

MPO, influxo de macrófagos e neutrófilos, acompanhada por dano oxidativo via

substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e 8-isoprostano, e estresse oxidativo

caracterizado por aumento na expressão da enzima catalase e redução da relação

GSH/GSSG. Esses fatores provavelmente são os responsáveis por alterações

histológicas e por aumento dos componentes elástico, resistivo e viscoelástico da

mecânica pulmonar, gerando uma redução na função pulmonar normal.

O estudo dos efeitos da poluição atmosférica no parênquima pulmonar de

seres humanos torna-se difícil ou senão impraticável devido à necessidade de

medidas invasivas. Além disso, estudos com humanos apresentam diversas

variáveis difíceis de controlar, fatores como idade e consumo de cigarros poderiam

impedir a análise precisa das conseqüências da poluição atmosférica sobre o

parênquima pulmonar. Uma parte importante da interpretação dos resultados de

uma pesquisa biológica é a cuidadosa seleção da espécie animal a ser utilizada.

Existe uma enorme variedade de espécies animais disponíveis e, como regra geral,

a espécie filogeneticamente mais próxima à humana possui a melhor correlação

clínica. Os modelos experimentais auxiliam na compreensão dos fenômenos

naturais e possibilitam o estudo de estruturas e órgãos de difícil acesso em seres

humanos. Ainda, a possibilidade de controlar as variáveis ambientais, sociais e

 78

patológicas em animais de experimentação justificou, no nosso experimento, a

escolha de pequenos animais. Espécies de camundongo e rato têm sido utilizadas

para avaliar os efeitos cardiopulmonares da poluição ambiental (DYE et al., 2001;

GURGUEIRA et al., 2002; RIVERO et al., 2005; SAYES et al., 2007). Sendo assim,

escolhemos camundongos BALB/c machos adultos, os quais são utilizados para

estudos com poluição (MAZZOLI-ROCHA et AL., 2008 e LAKS et al., 2008) e não

necessitam de um período muito longo de tempo para se encontrarem em condições

de uso após seu nascimento. Neste estudo, a utilização de cerca de quinze

camundongos por grupo foi suficiente para detectar diferenças significativas entre os

mesmos.

O material particulado utilizado no presente estudo foi coletado na cidade de

São Paulo, Brasil, no teto da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

(aproximadamente 15 metros acima do solo), localizada na interseção de duas

movimentadas avenidas no centro da cidade. Neste local, 89% das partículas finas

são derivadas de tráfego (CETESB, 2006). A dose utilizada de partículas (10 µL i.n.

de solução a 0,5 µg/µL) através de 3 instilações intranasais, foi inferior aos níveis

máximos recomendados pelos órgãos competentes. Em nosso modelo experimental,

estes níveis foram, teoricamente, um pouco abaixo do que seria depositado nos

pulmões ao longo de 24 horas em uma cidade com as características de São Paulo,

que tem uma média de concentração diária de PM2,5 de 23 µg/m3 (CETESB, 2008).

Essa dose é significativamente menor do que as doses geralmente utilizadas em

estudos experimentais com material particulado como, por exemplo, o descrito por

Rivero et al., em 2005 que mostrou alterações cardiopulmonares em ratos expostos

a 100 e 500 µg de PM2,5, apresentando, assim, maior relevância ambiental, pois

corresponde aos níveis de exposição regular da população das áreas estudadas.

 79

As partículas em suspensão foram administradas aos camundongos por

instilação intranasal. Além de mais fisiológica, a respiração nasal caracteriza-se por

maior retenção de partículas nas regiões extratorácicas (nasofaringe e traquéia).

Esse modelo de instilação afeta não apenas a distribuição do tamanho das

partículas, mas também o padrão de deposição das mesmas. Nossos resultados

podem não refletir de forma precisa as interações das partículas com o sistema

respiratório quando administradas por aerossol, mas mostra-se conveniente para

conduzir estudos comparativos de toxicidade das partículas. Portanto, a escolha da

instilação intranasal, além de ser mais representativa da respiração utilizada por

seres humanos expostos à poluição, evitou, potencialmente, uma superestimativa

dos resultados.

A variedade de poluentes encontrados no ar ambiente e a capacidade de

interagirem sinergicamente, especialmente em misturas de variadas composições,

dificulta a identificação de um mecanismo específico da toxicidade da poluição do ar

(TRASANDE & THURSTON, 2005). Estudos prévios mostram que o conteúdo de

metais presente na composição do material particulado pode ser um dos

mecanismos pelo qual ocorra lesão pulmonar (PRAHALAD et al., 2000, 2001;

ROEMER et al., 2000). No presente estudo, os metais em maior concentração foram

o Na e o Fe. Estes resultados se assemelham aos de um recente estudo avaliando a

toxicidade pulmonar de partículas ultrafinas provenientes de Dunquerque, cidade

industrializada da França onde observaram que o metal em maior concentração

também foi o Fe (BILLET et al., 2007). Este último tem sido descrito como o principal

metal envolvido na geração de estresse oxidativo (PARK et al., 2006), por gerar

espécies reativas de oxigênio (SMITH & AUST, 1997) e facilitar a conversão de

ânion superóxido (O2-) e peróxido de hidrogênio (H2O2) em íons hidroxila (OH-)

 80

(STOHS & BAGCHI, 1995). Os efeitos pulmonares subseqüentes incluiriam

disfunção do surfactante (CHAUHAN & MISRA, 1991), dano epitelial, aumento da

permeabilidade e resposta inflamatória, que podem resultar em prejuízo da função

pulmonar normal (ROEMER et al., 2000; SOUKUP et al., 2000; BERGAMASCHI et

al., 2001; DYE et al., 2001; LAGORIO et al. 2006; HONG et al., 2007). Outros metais

de transição como Cu, Ni, Co e Cr também são conhecidos por gerar espécies

reativas de oxigênio, como H2O2, O2- e OH-, iniciando processo inflamatório (STOHS

& BAGCHI, 1995). Já foi mostrado que o vanádio também é capaz de induzir

estresse oxidativo e está intimamente relacionado com processos cancerígenos.

(SORENSEN et al., 2005). A fase inicial da resposta pulmonar à exposição a

partículas parece ser influenciada por metais individualizados, enquanto a

persistência da resposta refletiria a complexidade da interação entre os diferentes

metais (DREHER et al., 1997; ANTONINI et al., 2004).

Ainda em relação à composição dos particulados, as concentrações de

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, particularmente benzo[a]antraceno,

benzo[b]fluoranteno, benzo[k]fluoranteno, benzo[a]pireno, são consideradas de

potencial risco carcinogênico de acordo com IARC (CASTAÑO-VINYALS et al.,

2004). Mazzoli-Rocha et al., (2008) mostrou a presença de benzo[a]pireno (B[a]P)

(benzeno de maior atividade carcinogênica) em amostras de Partículas Totais

Suspensas oriundas de São Paulo, assim como benzo[a]antraceno, confirmando os

altos níveis de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos nos grandes centros urbanos.

De acordo com Caricchia et al. (1999), pode ocorrer perda de hidrocarbonetos

policíclicos aromáticos de partículas coletadas em filtros quando analisados 24 h ou

mais após a coleta. Os filtros utilizados neste trabalho ultrapassaram este tempo

desde a sua coleta na cidade de São Paulo até sua análise realizada no Instituto de
 81

Biofísica Carlos Chagas Filho. Dessa forma, os níveis de hidrocarbonetos

policíclicos aromáticos podem ter sido subestimados. A presença de

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em particulados tem sido associada à

indução de inflamação, formação de espécies reativas de oxigênio, produção de

interleucinas e apoptose celular (LI et al., 2002; SORENSEN et al., 2003), tanto em

macrófagos alveolares (HIURA et al., 1999) quanto em células epiteliais (LI et al.,

2002). Estudos sobre a retenção pulmonar de hidrocarbonetos policíclicos

aromáticos em solução após instilação intratraqueal em ratas indicaram que eles são

rapidamente absorvidos pelo trato respiratório (WOLFF et al., 1989). Todavia, os

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos inalados são predominantemente absorvidos

sob a forma de partículas de fuligem, estando adsorvidos principalmente a partículas

ultrafinas, penetrando nas células do epitélio brônquico, onde são metabolizados,

ativados e biotransformados (SORENSEN et al., 2003; CASTAÑO-VINYALS et al.,

2004). Acredita-se que a elevada produção de adutos de DNA (seqüências de DNA

alteradas) nas células implique em efeito mutagênico (AKCHA et al., 2000). Uma

possibilidade para tal está na mutação da proteína p53, responsável pelo controle da

proliferação celular em mamíferos, quando exposta ao B[a]P (BINKOVÁ et al.,

2000). Binková et al. (2000) observaram formação de adutos de DNA, seguido de

formação de proteína p53, em fibroblastos pulmonares após exposição a

benzo[a]pireno e dibenzo[a]pireno. Embora a simples análise química das partículas,

como empregado no presente trabalho, não permita o estabelecimento de

correlação direta entre composição e efeito, vale ressaltar que a preponderância de

metais e de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (tráfego), na composição do

material particulado, pode induzir alterações semelhantes nos componentes elástico

e viscoelástico pulmonares, achados similares ao de MAZZOLI-ROCHA et al., 2008.

 82

A identificação da toxicidade relativa de constituintes das partículas é crucial

para o melhor entendimento da patogênese da lesão induzida por material

particulado. Como regra geral, partículas produzidas pelo tráfego têm maior

conteúdo de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. É importante ressaltar que as

amostras testadas no presente estudo foram coletadas do ar ambiente. Logo, não é

possível excluir a contribuição de outras fontes sobre a composição do particulado.

Nossos resultados confirmam o conceito de que partículas ambientais induzem

inflamação pulmonar aguda, caracterizado por alterações na mecânica e histologia

pulmonares bem como no achados imunológicos e bioquímicos (Figuras 11 a 23).

Focalizamos nossas medidas na resposta produzida por exposição a partículas finas

em 24 horas. Estudos prévios (MAZZOLI-ROCHA et al., 2008 e LAKS et al., 2008),

já demonstraram aparecimento de efeitos respiratórios adversos à exposição de

partículas totais suspensas ou partículas de diesel isoladas no período de 24 horas.

Confirmando, assim, que alterações na funcionalidade pulmonar já podem ser

observadas em um período de exposição aguda ao material particulado.

Neste estudo, medidas da função pulmonar foram usadas como instrumentos

para analisar possíveis alterações induzidas por PM2,5. Mensurar parâmetros da

função pulmonar em animais tão pequenos quanto os camundongos representa um

desafio. Entretanto, está comprovado que, com o equipamento adequado, como foi

o caso do presente estudo, as medidas são fiéis e fornecem informações

importantes para a compreensão dos mecanismos envolvidos nas doenças

pulmonares (IRVIN & BATES, 2003).

Para o estudo da mecânica respiratória, utilizamos o método de oclusão ao

final da inspiração. Esse método permite a identificação dos componentes elástico,

resistivo e viscoelástico e/ou inomogêneo da mecânica pulmonar (BATES et al.,

 83

1985b, 1988). Este método tem sido amplamente utilizado, permitindo a avaliação

da mecânica respiratória em animais e seres humanos anestesiados (D’ANGELO et

al., 1989; 1994; SALDIVA et al., 1987), em procedimentos cirúrgicos (AULER et al.,

1987; MOREIRA et al., 1997; RODRIGUES et al., 1993; ZIN et al., 1989), assim

como em diferentes modelos experimentais que mimetizam afecções encontradas

na prática hospitalar (AULER et al., 1987; MOREIRA et al., 1997).

Por estarmos trabalhando com camundongos, não dividimos o sistema

respiratório em seus componentes de parede torácica e sistema respiratório, pois

retiramos a porção anterior do gradil costal. Portanto, avaliamos os componentes

resistivo, elástico e viscoelástico pulmonares. Estudos prévios mostraram que a

toracotomia influi sobre a mecânica respiratória, havendo discreto aumento da

elastância e da resistência tecidual pulmonar; além disso, durante a anestesia, há

formação de áreas de atelectasia com conseqüente redução da capacidade residual

funcional (CRF) (HEDENSTIERNA, 1990; POWERS et al., 1973), porém essas

alterações podem ser prevenidas pelo uso de pressão positiva ao final da expiração

(PEEP). O uso de PEEP pode levar a um aumento do volume pulmonar, relacionado

a uma melhor oxigenação (BEREND et al., 1982) e é capaz de alterar por si só os

parâmetros da mecânica respiratória, reduzindo a resistência e a elastância do

pulmão, porém não afeta o comportamento dinâmico dos tecidos (D’ANGELO et al.,

1989). A resistência pulmonar representa principalmente a resistência das vias

aéreas, que diminui com o aumento do volume pulmonar, a queda dessa resistência

com o uso de PEEP provavelmente se deve a um aumento do diâmetro das vias

aéreas secundário ao incremento do volume pulmonar. A redução da elastância

pulmonar pode ser explicada por vários fatores, entre eles a abertura de pequenas

vias aéreas e/ou eliminação de atelectasias (D’ANGELO et al., 1992). No presente

 84

trabalho o nível de PEEP utilizado foi de aproximadamente 2 cmH2O, a fim de evitar o

desenvolvimento de colapso pulmonar e atelectasias (SALDIVA et al.,1992,b).

Ao realizarmos o processo de extração da material particulado do filtro via

agitação em um sonicador ultrassônico poderíamos estar extraindo, além do material

particulado, partículas do próprio filtro e estas estarem superestimando nossos

resultados. A fim de evitar qualquer viés, sonicamos um filtro virgem, sem nenhum

componente externo, pelo mesmo período do filtro com material particulado.

Posteriormente, instilamos 30 µL de solução em novos camundongos e chamamos

esse grupo de FILTRO. Esse grupo apresentou comportamento de mecânica

ventilatória similar ao CTRL, excluindo assim qualquer dúvida em relação ao

processo de sonicação.

Em um animal destituído de sua parede torácica e, considerando-se o volume

corrente e o fluxo aéreo constantes, as alterações observadas em ∆Ptot refletem as

modificações nos componentes resistivos e viscoelásticos e/ou inomogêneos do

pulmão. ∆P1 reflete a pressão dissipada para vencer a resistência de vias aéreas

centrais (SIMILOWSKI et al., 1989). ∆P2 está relacionada ao relaxamento por

tensão (stress relaxation) do tecido pulmonar, juntamente com pequena contribuição

do pendelluft (BATES et al., 1988; D’ANGELO et al., 1989; SALDIVA et al., 1992,b).

Nossos resultados não mostram alterações nos valores da pressão resistiva

(∆P1), mostrando que a dose utilizada não foi suficiente para desencadear

alterações dos parâmetros resistivos de vias aéreas superiores. Resultado similar foi

encontrado em estudo feito em 2008 por Mazzoli-Rocha et al., onde utilizaram

instilação intranasal de partículas toais suspensas da cidade de São Paulo. O

componente viscoelástico (∆P2) se mostrou alterado em ambos os grupos que

receberam material particulado. Essa alteração torna o pulmão mais rígido e pode
 85

ser atribuída à capacidade que o material particulado tem de adentrar na região

alveolar e recrutar mais células inflamatórias as quais gerariam o dano oxidativo

(figuras 17 a 23) e as modificações estruturais no pulmão conforme mostrado na

figura 13. Aumentos significativos em ∆P2 geram um aumento de ∆Ptot (Figura 11).

Nos achados relacionados aos valores da elastância estática (Est) e do componente

elástico da viscoelasticidade do pulmão (∆E) foi possível observar um aumento,

principalmente nos animais do grupo P15 que receberam partículas com maior

concentração de material particulado (Figura 12), similar aos encontrados

previamente em estudos avaliando as partículas totais suspensas e diesel intranasal

(MAZZOLI-ROCHA et al., 2008, LAKS et al., 2008). Esses aumentos também podem

ser resultados de alterações estruturais no pulmão decorrentes da inflamação e do

dano oxidativo no pulmão (figuras 17 a 23).

Os achados funcionais descritos acima foram acompanhados por alterações

morfológicas do parênquima pulmonar evidenciadas na microscopia óptica (figura

13). O colapso alveolar (Figura 17), observado no grupo P15, acarreta

heterogeneidade do parênquima pulmonar, contribuindo potencialmente para o

aumento de ∆P2, Est e ∆E (BATES, 1985a, b). Outros fatores também podem ter

contribuído para esse aumento, como distorção dos alvéolos patentes, o processo

inflamatório desencadeado e disfunção do surfactante pulmonar (LIU et al., 1996).

Poluentes aéreos (como Fe, Cd, Ni e Co) que interagem com componentes do

surfactante, como proteínas e fosfolipídios, podem prejudicar a secreção de

surfactante pelos pneumócitos tipo II ou modificar sua composição, elevando a

tensão superficial, gerando, assim, áreas de colapso com conseqüente aumento da

Est (JOHANSSON et al., 1983; SRIVASTAVA & MISRA, 1986; CHAUHAN & MISRA,

1991; MÜLLER et al., 1998).

 86

Entre os tipos celulares que participam do processo inflamatório temos

macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e células epiteliais com capacidade de gerar

espécies reativas de oxigênio (CHANEZ et al., 1990, VACHIER et al., 1994, EVANS

et al., 1996 HORVATH et al., 1998, MAJORI et al., 1998). Neutrófilos e macrófagos

alveolares possuem um papel importante na atividade de defesa pulmonar contra

componentes nocivos e agentes infecciosos. Macrófagos alveolares são capazes de

fagocitar partículas solúveis e participar no início da resposta inflamatória no pulmão,

através da indução de enzimas antioxidantes (RISOM et al., 2005). Os achados de

celularidade no presente estudo vão de acordo com as alterações mecânicas

encontradas, demonstrando que o grupo P5 que foi submetido a menor

concentração de PM2,5 desencadeia menor resposta inflamatória demonstrada pelo

menor aumento da enzima Mieloperoxidase (MPO) (Figura 20), que traduz a

resposta de leucócitos a um processo inflamatório (SUZUKI, 1983), e,

conseqüentemente, menor alteração estrutural no pulmão. Por outro lado, o grupo

P15, apresenta maior resposta inflamatória demonstrada tanto no aumento de MPO

(figura 20) quanto no maior influxo das células de defesa ativadas, como neutrófilos

e macrófagos, do que o grupo CTRL (figura 18) o que pode estar originando o

aumento da percentagem de alvéolos colapsados e a conseqüente redução

percentual de alvéolos normais, possivelmente devido ao déficit na síntese e

armazenamento de surfactante. Esse comportamento também se assemelha ao

descrito em outros estudos experimentais, com recrutamento de neutrófilos e

macrófagos alveolares 24 horas após instilação intratraqueal de 500 µg

(OBERDÖRSTER et al., 1992) e de 380 µg/m3 (ANDRÉ et al., 2006) de partículas

ultrafinas e instilação intranasal de 100 e 500 µg de PM2,5 oriundos da cidade de

São Paulo em ratos saudáveis (RIVERO et al., 2005). Estudo epidemiológico

 87

elaborado por Nightingale et al., em 2000 mostrou que humanos expostos a

partículas de diesel apresentaram inflamação das vias aéreas com aumento de

neutrófilos e MPO, correlacionando os achados com a presença de metais e

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. Vale ressaltar, no entanto, que no presente

estudo as alterações inflamatórias e de morfometria pulmonares foram induzidas por

dose significativamente menor de material particulado.

Como resultado do estresse oxidativo, tais espécies animais tentam reduzir o

dano utilizando-se do sistema de defesa antioxidante. Foram medidas, algumas

enzimas envolvidas na cadeia do estresse oxidativo (catalase e relação

GSH/GSSG), bem como o dano oxidativo, avaliado pelo método das substâncias

reativas ao ácido tiobarbitúrico e 8-isoprostano em amostras de tecido pulmonar de

camundongos intoxicados com PM2,5. (Figuras 19 a 23).

Sabe-se que a peroxidação lipídica (ou lipoperoxidação) é um indicativo de

que a condição do estresse oxidativo está estabelecida (JAYARAJ, 2006; WENG et

al., 2007). A lipoperoxidação é uma cascata de eventos e cada evento da reação, a

partir do radical lipídico, gera um subproduto que pode ser dosado para quantificar

dano oxidativo. O TBA bem como o 8-isoprostano estão no início dessa cascata de

eventos, porém cada um desencadeia uma via diferente. Nosso estudo mostrou

aumento tanto de substancias reativas ao ácido tiobarbitúrio quanto de 8-isoprostano

no grupo P15 em relação ao CTRL; podemos afirmar, então, que se instalou a

condição de dano oxidativo no pulmão destes animais. Estudo prévio mostra que 8-

isoprostano está presente, tanto em sangue quanto em urina de pacientes asmáticos

(DWORSKI et al., 2001). Dois estudos realizados em 12 diferentes cidades

americanas mostraram que tanto as substancias solúveis quanto as insolúveis são

capazes de desencadear aumento de TBA (GHIO et al., 1996, 1999).

 88

A catalase é a primeira linha de defesa contra as espécies reativas de

oxigênio (FORONJY, 2006). O presente trabalho mostrou aumento na atividade de

catalase no grupo P15 (figura 22). Muitos trabalhos afirmam que o consumo das

enzimas antioxidantes, no fígado e no rim de diversas espécies, bem como o

aumento da peroxidação lipídica (JAYARAJ, 2006; WENG et al., 2007), ocorrem em

situação de estresse oxidativo (MORENO, 2005; SICINSKA, 2006; JAYARAJ, 2006;

PRIETO et al., 2006, 2007; ATENCIO, 2008).

Estresse oxidativo foi também definido pela diminuição da glutationa reduzida

(GSH) e aumento na produção de glutationa oxidada (GSSG), levando a uma

redução na relação intracelular GSH/GSSG (RAHMAN et al., 1999). Nosso resultado

da relação entre a GSH/GSSG, mostrou uma redução para o grupo P15, resultado

semelhante ao de LI et al., 2003, mostrando a presença do estresse oxidativo e que

este pode iniciar a expressão de citocinas próinflamatórias. Em estudo feito por Li et

al em 2000 mostrou que os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos presentes em

partículas de diesel estão relacionados com a redução da relação GSH/GSSG.

Powell et al., em 1994 demonstraram redução nos níveis de GSH em adultos e

crianças asmáticas, mostrando uma relação com o processo inflamatório.

Sendo assim, quantidades de PM2,5 abaixo do nível de concentração

estabelecido pela CETESB/SP no período de 24 horas, foram um potente indutor de

processo inflamatório, desencadeando estresse oxidativo, o que poderá

desencadear inflamação alérgica e induzir exacerbação da asma (LI et al., 2003).

Sob condições de abundante produção de espécies reativas de oxigênio como na

asma ou na exposição a PM, a defesa antioxidante pulmonar pode estar

prejudicada, levando ao estado de estresse oxidativo celular, o qual, por sua vez,

pode causar alterações na função pulmonar.

CONCLUSÃO
 90

7 Conclusões

Foram encontrados vários tipos de metais na amostra, sendo o ferro um dos

mais abundantes. Em relação aos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, temos,

em maior quantidade, a presença de Fenantreno e Fluotranteno, também foram

identificadas as presenças de Pireno e B[a]pireno. Todos esses elementos são

característicos da queima de combustível fóssil.

Esse estudo foi pioneiro ao avaliar as alterações dos componentes viscoso,

elástico e viscoelástico do pulmão exposto a PM2,5.

Três instilações intranasal de baixa dose de material particulado 2,5 oriundos

da região metropolitana da cidade de São Paulo, induz alterações significativas da

mecânica pulmonar in vivo, acompanhadas por inflamação pulmonar, estresse

oxidativo e colapso alveolar em camundongos saudáveis.

Nossos resultados fornecem suporte experimental para observações

epidemiológicas de associação entre efeitos respiratórios e PM2,5, indicando que,

mesmo em concentrações abaixo dos padrões de qualidade do ar aceitos

atualmente e em curto espaço de tempo, o material particulado pode induzir

alterações na função pulmonar.

 REFERENCIAS
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ANEXOS
 114

ANEXO A – Parâmetros da mecânica pulmonar em cada animal dos grupos CTRL, FILTRO, P5 e P15.

CTRL
Fluxo Volume Est Edyn ∆E ∆P1 ∆P2 ∆Ptot Ti
CTRL 1 0,994 0,191 22,536 28,613 6,078 0,602 1,163 1,765 0,193
CTRL 2 0,999 0,199 27,475 32,352 4,877 0,623 0,972 1,594 0,200
CTRL 3 1,000 0,187 24,256 32,048 7,792 0,506 1,459 1,965 0,187
CTRL 4 1,000 0,200 24,858 29,703 4,845 0,427 0,970 1,397 0,200
CTRL 5 1,006 0,213 15,125 19,097 3,972 0,343 0,842 1,185 0,211
CTRL 6 0,999 0,200 23,149 27,872 4,723 0,833 0,944 1,777 0,200
CTRL 7 1,003 0,197 17,449 25,986 8,537 0,356 1,536 1,892 0,197
CTRL 8 1,000 0,194 12,257 17,304 5,047 0,434 0,932 1,366 0,194
CTRL 9 1,003 0,199 12,257 28,438 4,117 0,470 0,758 1,229 0,199
CTRL 10 0,999 0,193 12,257 25,886 4,861 0,541 0,882 1,423 0,193
CTRL 11 1,005 0,201 12,257 23,669 4,856 0,643 0,947 1,590 0,200
CTRL 12 1,000 0,201 12,257 25,235 4,120 0,573 0,817 1,390 0,201
CTRL 13 1,002 0,203 12,257 28,914 4,605 0,584 0,902 1,486 0,202
CTRL 14 0,998 0,203 12,257 31,533 6,027 0,841 1,081 1,922 0,203
CTRL 15 1,006 0,213 15,125 19,097 3,972 0,343 0,842 1,185 0,211
CTRL 16 1,003 0,197 17,449 25,986 8,537 0,356 1,536 1,892 0,197
CTRL 17 1,000 0,194 12,257 17,304 5,047 0,434 0,932 1,366 0,194

Média 1,01 0,20 20,44 25,49 5,05 0,36 1,01 1,36 0,20
DP 0,01 0,00 4,97 5,83 1,60 0,08 0,32 0,37 0,00
EPM 0,00 0,00 1,88 2,20 0,61 0,03 0,12 0,14 0,00
n 17 17 17 17 17 17 17 17 17
DP/Média 1,29% 1,33% 24,33% 22,87% 31,71% 23,34% 31,64% 27,06% 1,94%

P5
 115

Fluxo Volume Est Edyn ∆E ∆P1 ∆P2 ∆Ptot Ti

P51 1,003 0,194 53,591 64,325 10,734 0,880 2,080 2,960 0,193
P52 1,000 0,211 35,692 42,918 7,226 0,881 1,527 2,408 0,211
P53 1,002 0,204 31,458 38,729 7,271 0,617 1,486 2,102 0,204
P54 1,001 0,204 30,877 37,759 6,882 0,606 1,402 2,008 0,204
P55 1,005 0,197 20,755 25,853 5,098 0,589 1,004 1,592 0,196
P56 0,998 0,194 38,703 54,894 16,191 0,788 3,133 3,921 0,194
P57 1,002 0,207 25,232 32,031 6,799 0,379 1,410 1,788 0,207
P58 1,004 0,195 22,443 30,987 8,545 0,337 1,664 2,001 0,194
P59 1,002 0,196 33,300 43,650 10,349 0,603 2,030 2,633 0,196
P510 1,002 0,191 32,425 42,859 10,433 0,671 1,995 2,665 0,191
P511 1,003 0,205 26,555 34,880 8,326 0,393 1,707 2,100 0,205
P512 0,996 0,200 27,230 36,330 9,100 0,331 1,821 2,152 0,201
P513 1,000 0,208 19,520 27,523 8,003 0,392 1,668 2,060 0,208
P514 1,002 0,212 25,769 33,171 7,402 0,440 1,569 2,010 0,211
P515 1,002 0,203 20,806 27,341 6,535 0,520 1,324 1,845 0,202
P516 1,002 0,200 25,015 35,613 10,599 0,804 2,128 2,932 0,200
P517 1,002 0,194 24,120 33,790 9,669 0,804 1,878 2,682 0,194

Média 1,002 0,201 29,029 37,803 8,774 0,590 1,754 2,345 0,201
DP 0,002 0,006 8,134 9,619 2,446 0,186 0,452 0,554 0,006
EPM 0,000 0,002 1,973 2,333 0,593 0,045 0,110 0,134 0,002
n 17 17 17 17 17 17 17 17 17
DP/Média 0,002 0,032 0,280 0,254 0,279 0,315 0,257 0,236 0,032

P15
Fluxo Volume Est Edyn ∆E ∆P1 ∆P2 ∆Ptot Ti
 116

P151 0,999 0,207 31,884 38,201 6,317 0,824 1,310 2,135 0,208
P152 0,999 0,198 29,098 36,458 7,360 0,768 1,454 2,222 0,198
P153 1,000 0,204 34,707 42,345 7,638 0,740 1,557 2,297 0,204
P154 1,001 0,206 29,555 35,782 6,228 1,030 1,280 2,310 0,205
P155 1,002 0,196 46,671 57,824 11,153 0,597 2,183 2,780 0,195
P156 0,999 0,201 29,255 36,706 7,451 0,468 1,498 1,966 0,201
P157 1,000 0,195 39,689 52,166 12,476 0,563 2,433 2,996 0,195
P158 1,003 0,198 36,102 48,803 12,701 0,444 2,516 2,960 0,197
P159 0,998 0,194 38,703 54,894 16,191 0,788 3,133 3,921 0,194
P1510 0,998 0,210 26,159 33,472 7,312 0,544 1,534 2,078 0,210
P1511 1,000 0,201 27,446 34,063 6,617 0,426 1,328 1,754 0,201
P1512 1,001 0,191 24,615 34,246 9,631 0,556 1,844 2,400 0,191

Média 1,000 0,200 32,824 42,080 9,256 0,646 1,839 2,485 0,200
DP 0,001 0,006 6,236 8,534 3,056 0,176 0,570 0,568 0,006
EPM 0,000 0,002 1,800 2,464 0,882 0,051 0,164 0,164 0,002
n 12 12 12 12 12 12 12 12 12
DP/Média 0,001 0,028 0,190 0,203 0,330 0,272 0,310 0,229 0,028

FILTRO
Fluxo Volume Est Edyn ∆E ∆P1 ∆P2 ∆Ptot Ti
FILTRO1 1,001 0,198 21,831 25,709 3,879 0,454 0,766 1,221 0,197
FILTRO2 0,997 0,197 24,163 27,981 3,819 0,629 0,751 1,380 0,197
FILTRO3 0,982 0,190 22,810 26,646 3,836 0,403 0,732 1,135 0,194
FILTRO4 0,995 0,295 19,181 22,375 3,194 0,549 0,735 1,285 0,296
FILTRO5 0,997 0,209 17,483 20,340 2,857 0,409 0,598 1,008 0,210

Média 0,995 0,218 21,094 24,610 3,517 0,489 0,717 1,206 0,219
DP 0,007 0,039 2,433 2,826 0,416 0,087 0,060 0,127 0,039
EPM 0,003 0,018 1,088 1,264 0,186 0,039 0,027 0,057 0,017
n 5 5 5 5 5 5 5 5 5
DP/Média 0,007 0,180 0,115 0,115 0,118 0,179 0,084 0,106 0,177

ANEXO B – Percentual de alvéolos normais e colapsados em cada animal dos grupos CTRL, P5 e P15.
 117

CTRL
 118

%NORMAL %COLAPSO
CTRL 1 97,72 2,28
CTRL 2 96,58 3,42
CTRL 3 97,37 2,63
CTRL 4 96,56 3,44
CTRL 5 97,54 2,46

Média 91,02 8,98

DP 7,25 7,25
EPM 2,74 2,74
n 5 5
DP/Média 7,97% 80,77%

P5
%NORMAL %COLAPSO
P5 1 95,85 4,15
P5 2 91,89 8,11
P5 3 96,57 3,43
P5 4 89,49 10,51
P5 5 95,08 4,92

Média 90,40 9,42

DP 5,34 4,98
EPM 2,67 2,49
n 5 5
DP/Média 5,91% 52,86%

P15
%NORMAL %COLAPSO
P15 1 94,57 5,43
P15 2 89,71 10,29
P15 3 90,70 9,30
 119

P15 4 85,88 14,12

P15 5 88,10 11,90

Média 86,83 13,17

DP 5,42 5,42
EPM 1,81 1,81
n 5 5
DP/Média 6,25% 41,18%
 120

ANEXO C – Contagem de macrófagos em cada animal dos grupos CTRL, P5 e P15.

CTRL
Células x 10-3/área
CTRL 1 5,1
CTRL 2 17,1
CTRL 3 10,2
CTRL 4 5,1
CTRL 5 8,5
CTRL 6 3,4

Média 8,2
DP 4,9
SEM 2,0
n 6

P5
Células x 10-3/área
P5 1 17,1
P5 2 11,9
P5 3 15,3
P5 4 5,1
P5 5 8,5

Média 11,5
DP 4,8
SEM 2,1
n 5

P15
Células x 10-3/área
P15 1 17,1
P15 2 17,1
P15 3 17,1
P15 4 34,1
P15 5 63,1

Média 29,6
DP 20,0
SEM 8,9
n 5
 121

ANEXO D – Contagem de neutrófilos em cada animal dos grupos CTRL, P5 e P15.

CTRL
Células x 10-3/área
CTRL 1 23,9
CTRL 2 22,2
CTRL 3 10,2
CTRL 4 11,9
CTRL 5 11,9
CTRL 6 58,0

Média 23,0
DP 18,0
SEM 7,3
n 6

P5
Células x 10-3/área
P5 1 40,9
P5 2 22,2
P5 3 15,3
P5 4 29,0
P5 5 22,2

Média 25,9
DP 9,6
SEM 4,3
n 5

P15
Células x 10-3/área
P15 1 80,1
P15 2 71,6
P15 3 49,4
P15 4 23,9
P15 5 52,9

Média 55,5
DP 21,8
SEM 9,7
n 5
 122

ANEXO E – Quantificação do TBARS em cada animal dos grupos CTRL, P5 e P15.

CTRL
nMol de TBA/mg de proteína
CTRL 1 0,090
CTRL 2 0,066
CTRL 3 0,072
CTRL 4 0,093
CTRL 5 0,088
CTRL 6 0,092
CTRL 7 0,082

Média 0,086
DP 0,012
SEM 0,004
n 7

P5
nMol de TBA/mg de proteína
P5 1 0,070
P5 2 0,103
P5 3 0,068
P5 4 0,144
P5 5 0,091
P5 6 0,113
P5 7 0,075
P5 8 0,081
P5 9 0,083
P5 10 0,089

Média 0,091
DP 0,023
SEM 0,007
n 10
 123

P15
 124

nMol de TBA/mg de proteína

P15 1 0,117
P15 2 0,123
P15 3 0,122
P15 4 0,137
P15 5 0,086
P15 6 0,089
P15 7 0,089
P15 8 0,078
P15 9 0,129
P1510 0,126
P1511 0,114

Média 0,110
DP 0,020
SEM 0,006
n 11

ANEXO F – Score de 8-isoprostano em cada animal dos grupos CTRL, P5 e P15.

CTRL
Score
CTRL 1 3
CTRL 2 3
CTRL 3 3
CTRL 4 3
CTRL 5 2
CTRL 6 1
CTRL 7 1
CTRL 8 2
CTRL 9 1

Média 2,111
DP 0,928
SEM 0,309
n 9

P5
Score
 125

P5 1 3
P5 2 3
P5 3 3
P5 4 3
P5 5 1
P5 6 3
P5 7 2
P5 8 3
P5 9 2
P5 10 3
P5 11 3
P5 12 2

Média 2,583
DP 0,669
SEM 0,193
n 12

P15
Score
P15 1 3
P15 2 4
P15 3 4
P15 4 4
P15 5 4
P15 6 3
P15 7 2
P15 8 3

Média 3,375
DP 0,744
SEM 0,263
n 8

ANEXO G – Quantificação de catalase em cada animal dos grupos CTRL, P5 e P15.

 126

CTRL
U de catalase/mg de proteina
CTRL 1 0,206
CTRL 2 0,201
CTRL 3 0,172
CTRL 4 0,157
CTRL 5 0,208
CTRL 6 0,188
CTRL 7 0,135

Média 0,181
DP 0,0276
SEM 0,0104
n 7

P5
U de catalase/mg de proteina
P5 1 0,27
P5 2 0,44
P5 3 0,32
P5 4 0,27
P5 5 0,25
P5 6 0,19
P5 7 0,28
P5 8 0,20
P5 9 0,20
P5 10 0,23

Média 0,266
DP 0,0736
SEM 0,0233
n 10

P15
U de catalase/mg de proteina
P15 1 0,38
 127

P15 2 0,49
P15 3 0,45
P15 4 0,32
P15 5 0,32
P15 6 0,19
P15 7 0,21
P15 8 0,19
P15 9 0,19
P1510 0,19

Média 0,295
DP 0,115
SEM 0,0363
n 10

ANEXO H – Quantificação de MPO em cada animal dos grupos CTRL, P5 e P15.

CTRL
MPO (mU/mg ptn)
CTRL 1 3,98
CTRL 2 3,72
CTRL 3 4,15
CTRL 4 4,43
CTRL 5 2,80

Média 0,181
DP 0,0276
SEM 0,0104
n 5

P5
MPO (mU/mg ptn)
P5 1 6,46
P5 2 6,15
P5 3 6,33
P5 4 5,40
P5 5 1,73

Média 0,266
DP 0,0736
SEM 0,0233
n 5

P15
 128

MPO (mU/mg ptn)

P15 1 6,58
P15 2 5,66
P15 3 7,60
P15 4 5,94
P15 5 5,39

Média 0,295
DP 0,115
SEM 0,0363
n 5

ANEXO I – Quantificação da relação GSH/GSSG em cada animal dos grupos CTRL, P5 e P15.

CTRL
GSH / GSSG (nM/mg protein)
CTRL 1 1,954
CTRL 2 1,817
CTRL 3 1,575
CTRL 4 2,414
CTRL 5 1,698
CTRL 6 1,729
CTRL 7 2,206
CTRL 8 2,108

Média 1,938
DP 0,287
SEM 0,101
n 8
 129

P5
GSH / GSSG (nM/mg protein)
P5 1 2,128
P5 2 2,255
P5 3 2,274
P5 4 1,998
P5 5 1,872
P5 6 2,332
P5 7 2,038
P5 8 2,118
P5 9 1,870
P5 10 1,838
P5 11 1,873
P5 12 1,499
P5 13 1,934

Média 2,002
DP 0,226
SEM 0,0627
n 13

P15
GSH / GSSG (nM/mg protein)
P15 1 1,317
P15 2 1,533
P15 3 1,599
P15 4 1,632
P15 5 1,558
P15 6 1,709
P15 7 1,958
P15 8 1,666
P15 9 1,562
P1510 1,632
P1511 1,688

Média 1,623
DP 0,154
SEM 0,0464
n 11