UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJA

CENTRO DE ENSINO SUPERIOR DE CINCIAS TECNOLGICAS DA TERRA E DO MAR CURSO DE CINCIAS BIOLGICAS NFASE EM BIOTECNOLOGIA

PRODUO DE MUDAS DE Etlingera elatior ATRAVS DA CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS IN VITRO.

Cristine Luciana de Souza Rescarolli

Orientador: Gilmar Roberto Zaffari, Doutor

Itaja, 28 de maio, 2007

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJA

CENTRO DE ENSINO SUPERIOR DE CINCIAS TECNOLGICAS DA TERRA E DO MAR CURSO DE CINCIAS BIOLGICAS NFASE EM BIOTECNOLOGIA

TRABALHO DE CONCLUSO DE CURSO

PRODUO DE MUDAS DE Etlingera elatior ATRAVS DA CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS IN VITRO.

Cristine Luciana de Souza Rescarolli

Trabalho de Concluso apresentado ao Curso de Cincias Biolgicas, como parte dos requisitos para obteno do grau de Bacharel em Cincias Biolgicas. Orientador: Gilmar Roberto Zaffari

Itaja, 28 de maio, 2007

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Dedico a Deus que me permitiu brincar de me natureza. E a toda minha famlia e amigos.

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AGRADECIMENTOS
Primeiramente gostaria de agradecer a Deus, essa fora superior que criou a vida, que me deu a vida, e em certo ponto me devolveu ela, para que eu pudesse estud-la e aproveitala. Gostaria de agradecer em especial toda a minha famlia, meus amados pais Romalino e Mrcia, e meu super-irmo Jnior, por eles terem aturado todas as minhas crises durante a faculdade, principalmente durante a fase de concluso do TCC, por muitas vezes terem que apertar o oramento para que eu pudesse terminar meus estudos fora, terem entrado na minha loucura de ser operada em pleno ltimo semestre da faculdade, e muito mais, AMO VOCS! Agradecer aos tios, tias, primos, avs e a minha cunhada Daisy, que mesmo no sabendo direito o que eu estava fazendo na faculdade, davam um grande apoio, e at se orgulhavam. Agradecimentos tambm para a Maria Carol, que teve a (in)felicidade de passar quase 90% do tempo de faculdade comigo, muitas coisas boas, outras nem tanto, com certeza nos tornamos gente grande uma com a ajuda da outra, afinal, se passamos mais de 75% de nossas vidas juntas, no foi por acaso. Um grande abrao para o Vincius, um amigo que apareceu h to pouco tempo, mas me ajudou a tomar decises importantes, alm de no ter medo de falar muitas verdades, que na maioria das vezes eu no queria ouvir (meu maninho por opo). E como no lembrar de todo o pessoal do Laboratrio de Cultivo Celular Vegetal? Os que faziam parte do quadro de estagirios, Julio, que alm de monitor, teve a honra de dividir um teto comigo, e se tornou mais um grande amigo, daqueles pra vida toda, Daniel (e o dramalho do artigo 170), Golda (e a cachacinha de banana), Andr (e o bolo da me dele), e todos que passaram por l. Em especial agradeo ao meu orientador Doutor Zaffari, acima de tudo por ter me aceito como orientanda, por ter, pelo menos tentado, responder a minha chuva de e-mails, e ter compreendido a minha ausncia no ltimo semestre. Um grande abrao para o casal Fernanda & Pipoca (eles so uma entidade s), que mostraram o verdadeiro sentido da amizade (dar carona para as festas, brincadeirinha!). Falando em festa, aos meus colegas de aula, pelas timas festas /churrascos /acampamentos /fiascos em geral, pessoal que tornava at um momento de reviso pr-prova (leilo) divertido, CDFs que guardarei no lado esquerdo da memria. A todos (as) os amigos (as), cmplices, companheiros de crime, companheiros reais ou virtuais, todos os que me mostraram que muitos dos drages que eu queria enfrentar eram na realidade moinhos de vento, a estes que eu no poderia nomear um a um, meu muiiiiito obrigada por existirem no lugar certo e na hora certa. Gostaria de agradecer a empresa de navegao Santa Catarina, por ter me proporcionado muitas viagens de ferry-boat, nem todas agradveis, e a auto-viao Rainha, por ter feito eu tomar a deciso de me mudar para Itaja, depois de 3 anos de idas e vindas. Alm de mandar aquele abrao pra Praiana que recolhe os restos dos que voltam das festas as 6:00 da manh. Aos barzinhos do entorno da faculdade por ter afogado muitas notas baixas. E ao Hospital do Corao por terem sido 100% durante minha estadia l. A TODOS QUE DE ALGUMA FORMA FAZEM PARTE DA MINHA HISTRIA, MEU MUITO OBRIGADA POR TUDO!!!

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SUMRIO

AGRADECIMENTOS ........................................................................................................... IV SUMRIO................................................................................................................................ V LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ VI LISTA DE TABELAS .......................................................................................................... VII RESUMO .............................................................................................................................VIII INTRODUO ........................................................................................................................ 1 BOTNICA DA ESPCIE ETLINGERA ELATIOR .......................................................................... 1 PRODUO DE FITOTERPICOS ................................................................................................ 3 MICROPROPAGAO ......................................................... ERRO! INDICADOR NO DEFINIDO. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 7 OBJETIVOS GERAIS: ................................................................................................................. 7 OBJETIVOS ESPECFICOS: ......................................................................................................... 7 MATERIAIS E MTODOS.................................................................................................... 8 RESULTADOS E DISCUSSO ........................................................................................... 10 ASSEPSIA ............................................................................................................................... 10 MULTIPLICAO ................................................................................................................... 13 ENRAIZAMENTO .................................................................................................................... 15 CONCLUSES ...................................................................................................................... 17 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................................. 19 APNDICES ........................................................................................................................... 23

LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Basto do Imperador em ambiente natural, com diferentes coloraes da flor, vermelho (A) e Cor-de-rosa (B). A) Etlingera elatior em viveiro (fonte: ALOHA TROPICALS). B) Detalhe da flor Etlingera elatior. (fonte: MONTOSO GARDEN)..............4

Figura 2. Viso geral das culturas in vitro de Etlingera elatior mantidas em cmara de crescimento sob 16 horas de fotoperodo a 40 a 50 mol.m-2.s-1 e 28 2 C. A= 10, B= 30 e C= 45 dias de cultivo................................................................................................................10

Figura 3. Gemas laterais de Etlingera elatior durante a fase de assepsia. A Contaminao por bactria e morte em meio de cultura MS + 0,5 BAP. B Contaminao por bactria e morte em meio de cultura MS + 0,5 BAP suplementado com estreptomicina. C Plntula aparentemente assptica, apresentando crescimento, em meio de cultura MS + 0,5 BAP suplementado com estreptomicina............................................................................................12

Figura 4. Diferentes padres morfogenticos de Etlingera elatior apresentados na fase de proliferao. A Brotamento de gema lateral sem apresentar crescimento do explante. B Crescimento do explante, com inibio do crescimento do broto lateral. C Crescimento do explante e das brotaes laterais...............................................................................................15

Figura 5. Induo e formao de razes em plntulas de Etlingera elatior, durante a fase de enraizamento in vitro, aps 22 dias de cultivo..........................................................................17

VI

LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Tempo de imerso dos explantes aos agentes desinfestantes qumicos utilizados no processo de assepsia na cmara de fluxo laminar de gemas laterais de Etlingera elatior.........8

Tabela 2. Meio de cultura slido de Murashige & Skoog (1962) (MS), adicionado de diferentes concentraes da citocinina BAP para a fase de proliferao de plntulas de Etlingera elatior .........................................................................................................................9

Tabela 3. Meio de cultura slido de Murashige & Skoog (1962) (MS) com 50% da concentrao salina, na presena e na ausncia da auxina AIB para a fase de enraizamento das plntulas de Etlingera elatior .....................................................................................................9

Tabela 4. Porcentagem de contaminao e sobrevivncia das gemas laterais de Etlingera elatior submetidas desinfestao, e inoculadas em meio slido Murashige & Skoog (1962) (MS), adicionado de 0,5 mg.L-1 BAP, aps 100 dias de cultivo in vitro..................................11

Tabela 5. Valores mdios do crescimento e do nmero de razes e brotos na fase de proliferao de gemas laterais de Etlingera elatior, cultivadas em meio slido de Murashige & Skoog (1962) (MS) adicionado das diferentes concentraes de BAP, aps 20 dias de cultivo in vitro (N=3)................................................................................................................14

Tabela 6. Efeito de diferentes concentraes de auxina AIB sobre o enraizamento de plntulas de Etlingera elatior em meio slido de Murashige & Skoog (1962) (MS) com 50% da concentrao salina, aps 22 dias de cultivo in vitro. (N=4)....................................................16

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RESUMO
O uso de produtos naturais para o tratamento de doenas algo que o ser humano j est habituado a realizar desde o incio dos tempos. A utilizao de Etlingera elatior (Basto do Imperador), uma herbcea muito comum nos jardins e em reas de banhado, para o tratamento de dores musculares e reumatismo citada pela cultura popular, o que incentivou a indstria farmacutica a comear investir nos estudos sobre sua atividade. Porm, a produo de biomassa atravs de plantas sadias e de alta qualidade ainda incipiente. O uso da biotecnologia vegetal, a cultura de tecidos vegetais in vitro, permite a produo em larga escala de plantas e/ou biomassa vegetal, de alta qualidade gentica e fitossanitria, em curto espao de tempo e pequena rea fsica. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de agentes desinfestantes na obteno de explantes asspticos e da composio do meio de cultura no desenvolvimento, multiplicao e enraizamento das plntulas in vitro, visando estabelecer o processo de micropropagao. Gemas laterais foram submetidas a desinfestao com etanol e hipoclorito de clcio e de sdio. Os explantes asspticos foram multiplicados em meio de cultura MS adicionado de BAP (0,5; 1,0; 2,0 e 3,0 mg.L-1) e enraizados em meio MS com 50% da concentrao salina, suplementado (0,5 e 1,0 mg.L-1 de AIB) ou no. O estabelecimento das culturas asspticas foi obtido variando de 10 a 40%. A taxa de multiplicao obtida no apresentou diferena significativa para o nmero de brotos. Apenas foram registradas diferenas quanto ao nmero de razes, indicando o meio MS com 50% da concentrao salina + 0,5 mg.L-1 de AIB como o mais recomendado. Do ponto de vista econmico, recomenda-se mais estudos na fase de multiplicao das culturas.

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INTRODUO
O uso de produtos naturais pelo ser humano remonta idade antiga. Sabe-se que muito mais provvel encontrar atividade biolgica em plantas orientadas pelo seu uso na medicina popular do que em plantas escolhidas ao acaso. Cerca de 75% dos compostos puros naturais, empregados na indstria farmacutica, foram isoladas, seguindo recomendaes da medicina popular (YUNES; CALIXTO, 2001). A espcie Etlingera elatior (Figura 1), popularmente conhecida como Basto do Imperador, planta ornamental e medicinal, tem sido indicada, segundo a medicina popular, para o tratamento de dores musculares e reumatismo.

Botnica da Espcie Etlingera elatior

Etlingera elatior, pertencen Ordem Scitamineae, famlia Zingiberaceae a qual compreende plantas herbceas aromticas geralmente rizomatosas do qual nasce o caule areo, com folhas geralmente disticamente dispostas, larga bainha na base que envolve o caule, e uma lgula desenvolvida. Flores hermafroditas, fortemente zigomrficas, com perianto bastante distinto em clice e corola, geralmente rodeadas por brcteas e dispostas em inflorescncias do tipo paniculada - inflorescncia composta homognea de cacho de cachos, ou capituliforme - inflorescncia racimosa aonde as flores se inserem num receptculo, rodeada por brcteas (VIDAL; VIDAL, 2003), raramente essas flores se encontram isoladas (JOLY, 1998). Famlia com ampla disperso nos trpicos e subtrpicos de todo mundo, principalmente no sudeste da sia, contendo 49 gneros com 1500 espcies (JOLY, 1998). Alguns gneros dessa famlia se destacam pela sua beleza e so cultivados e apreciados como plantas ornamentais, e tambm gneros como Zingiber (Gengibre) e Cardamon (Cardamomo) so muito apreciados como condimentos na culinria. Uma espcie do gnero Zingiber, da qual os rizomas so utilizados, comumente aplicado na medicina popular, assim tambm algumas espcies do gnero Costus, do gnero Renealmia, Alpinia e outros (JOLY, 1998). O gnero Etlingera consiste em cerca de 57 espcies de plantas rizomatides com haste em forma de basto, folhas arredondadas, inflorescncia em captulo, nativas do Sri Lanka a Nova Guin. Etilingera elatior, nativa da Indonsia, a nica espcie que extensamente cultivada. A espcie Etlingera elatior uma herbcea rizomatosa, vivaz, onde a planta tem rgos areos anuais, dotada de rizomas, tubrculos, bulbos (VIDAL; VIDAL, 2003). Espcie 1

de clima quente, mido e de pleno sol, originria da sia, conhecida como Basto-doImperador, pois, floresce lanando hastes compridas com inflorescncias nas extremidades. Apresenta belssimas flores que podem variar de branco, rosa ao vermelho intenso, sendo considerada a flor mais bela do mundo. Floresce o ano inteiro, com em mdia 60 floraes/ano, alm de possuir uma sobrevida de at oito dias aps o corte. a mais durvel de todo o gnero Etlingera, e muito utilizada como planta ornamental e como flor de corte em floriculturas, utilizada tambm para proteo de crregos (BUTTERFLY PAVILION). O rizoma da Etlingera elatior utilizado pela medicina popular para o tratamento de reumatismo e dores musculares, mas os estudos cientficos sobre a ao farmacolgica ainda so poucos pela dificuldade de cultivo dessa espcie em larga escala, com o estado fitosanitrio adequado. As flores grandes com brcteas coloridas enceradas e quando dobradas para trs expem a densa cabea da flor que se encontra ali dentro. A cor rosa sombreando o branco ou com as pontas quase transparentes cria o impressionante efeito de porcelana, por isso, muitas vezes chamada de Rosa de Porcelana, tambm devido sua durabilidade. Possui as folhas de textura lisa, largas, verde-escuras. Quando termina a florao o ponto principal de uma semente decorativa aparece (RAREXOTICSEEDS).

Figura 1: Etlingera elatior em ambiente natural, com diferentes coloraes da flor, vermelho (A) e Cor-de-rosa (B). A) Etlingera elatior em viveiro (fonte: ALOHA TROPICALS). B) Detalhe da flor Etlingera elatior. (fonte: MONTOSO GARDEN)

Produo de fitoterpicos
Um dos aspectos mais crticos na produo de plantas medicinais para a utilizao teraputica , sem dvida, a quantidade e a qualidade da matria-prima vegetal. Vrios fatores climticos afetam diretamente a qualidade, a eficcia e a segurana do produto final. Para evitar tais problemas, e, sobretudo, evitar o extrativismo descontrolado, as indstrias vm atuando no sentido de aumentar a quantidade e melhorar a qualidade dessa matria-prima atravs do cultivo de plantas medicinais em larga escala. Alm de poder eliminar variaes oriundas de fatores como o clima, nutrientes e luminosidade, a produo massal de plantas permite selecionar espcies com maior teor de princpios ativos, controlar pragas, ou ainda o que fundamental, evitar a contaminao por metais pesados, inseticidas e outros fatores que podem influenciar na eficcia e segurana clnica dos medicamentos fitoterpicos (SIANI, 2003). Desta forma, a produo de mudas in vitro permite estabelecer cultivos a campo proporcionando o manejo sustentado da espcie. O cultivo de plantas medicinais em ambiente natural possui funes ecolgicas importantes para a sobrevivncia da espcie; so produzidos princpios ativos de interesse pelo metabolismo secundrio. Segundo Montanari Jr. (2002), embora o metabolismo secundrio no seja essencial para o desenvolvimento do indivduo, essencial para a continuidade da espcie dentro do ecossistema. responsvel pelas relaes entre a planta e o ambiente aonde se encontra, e devido ao seu carter adaptativo pode ser manipulado geneticamente. Este fato faz com que as tcnicas de cultivo adotadas na produo de plantas medicinais influenciem no produto final. Aonde importante que as plantas que compem a populao sob cultivo sejam aparentadas, como no caso do cultivo in vitro clones, pois isso, alm de facilitar o manejo em si, faz com que a matria prima seja quimicamente homognea e atinja um padro de qualidade necessrio para a viabilizao tcnica/comercial da produo. O cultivo in vitro j tem se mostrado uma opo vivel para outros membros da famlia Zingiberaceae como Curcuma domestica, Zingiber officinale e Alpinia purpurata. Estas tcnicas de cultivo in vitro apresentam grande eficincia favorecendo a rpida multiplicao e produo de Zingiberceas em quantidade e qualidade superiores quelas obtidas atravs de mtodos convencionais, contornando problemas srios como a dormncia dos rizomas durante o perodo do inverno e transmisso de doenas comuns em sistemas de propagao vegetativa (MELLO; AMARAL; MELO, 2000).

A produo massal de plantas medicinais pode ser obtida atravs da cultura de tecidos vegetais in vitro, mtodo bastante eficiente quando se trata de produo de mudas em larga escala, fornecendo matria-prima de alta qualidade gentica e fitossanitria, em curto espao de tempo. Em condies de viveiro e em hidroponia sob ambiente controlado, foi verificado que a propagao vegetativa do Pfaffia glomerata (ginseng brasileiro) via estaquia resulta num nmero de mudas bastante reduzido em razo da pequena disponibilidade de estacas (mdia de 30) de ramos/planta de dois anos de idade (NICOLOSO, FORTUNATO, FOGAA, 1999, NICOLOSO, CASSOL, FORTUNATO, 2001a). Nicoloso, Erig e Martins (2001b) desenvolveram um protocolo altamente reproduzvel para a micropropagao da P. glomerata, in vitro, a partir de um nico segmento nodal, sendo possvel obter 15.000 plantas dentro de um perodo de seis meses. Segundo Nascimento (2006), a espcie Etlingera elatior tambm apresenta dificuldades de produo massal em viveiro. O uso de sementes induz um maior perodo de juvenilidade s plantas, retardando o seu florescimento. Por outro lado, a propagao vegetativa por meio da diviso de rizomas propicia elevada incidncia de doenas e a necessidade de tratamentos fitossanitrios, alm de somente ser realizada nas pocas mais quentes do ano.

Cultura de Tecidos Vegetais in vitro

A biotecnologia abrange tcnicas a serem aplicadas a microrganismos, plantas e animais a fim de se obter processos e produtos de interesse. Visando agilizar a produtividade e fornecer espcies ideais de plantas se utiliza a micropropagao in vitro, ou clonagem. Segundo Roca e Mroginzki (apud SCHLICHTING, 2001) os objetivos da utilizao do cultivo in vitro de tecidos vegetais so numerosos e diferentes, possibilitando a sua aplicao em: estudos bsicos de fisiologia; gentica; bioqumica e cincias afins; bioconservao e produo de compostos teis; incremento da variabilidade gentica; obteno de plantas livres de patgenos; propagao de plantas; conservao e intercmbio de germoplasma. A cultura de tecidos vegetais in vitro, tambm denominada de micropropagao por causa do tamanho dos propgulos utilizados, a aplicao mais prtica da cultura de tecidos e aquela de maior utilizao para a produo de mudas de elevada qualidade (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).

Comercialmente j realidade para muitas espcies, principalmente frutferas e ornamentais. Sua aplicao no Brasil recente, e a maioria dos trabalhos nesta rea so feitos em instituies de pesquisa e universidades. H empresas na rea, mas existe tendncia ascenso. Os trabalhos so feitos objetivando a multiplicao de mudas sadias e de alto valor gentico (SCHLICHTING, 2001). A tcnica de cultivo in vitro baseia-se no princpio de totipotncia celular, ou seja, cada tecido ou clula de um organismo capaz de regenerar, em condies apropriadas, um organismo completo; a cultura de tecidos vegetais um processo no qual atravs de um explante retirado de uma planta e conduzido em meio assptico e com balano nutricional e hormonal adequado, capaz de originar uma nova planta (TORRES; CALDAS; BUSO, 1998). O sistema de micropropagao foi estabelecido na dcada de 70, onde Murashige (1974) (apud TORRES; CALDAS; BUSO, 1998), estabeleceu um conceito sobre estgios de desenvolvimento no processo de micropropagao divididos em: Estgio I: seleo de explantes, desinfestao e cultura em meio nutritivo sob condies asspticas; Estgio II: multiplicao de propgulos atravs de sucessivas subculturas em meio prprio para a multiplicao; Estgio III: transferncias das partes areas produzidas para meio de enraizamento e, subseqente, transplantio das plantas obtidas para substrato ou solo. Tambm pode ser citado um Estgio 0, sendo que este ir compreender o tratamento que a planta matriz recebeu antes de ser retirado o explante. Conforme o explante utilizado e sua subseqente manipulao a micropropagao pode ser conduzida por uma destas trs maneiras: I. Multiplicao atravs da proliferao de gemas axilares; II. Multiplicao atravs de induo da embriognese somtica; III. Multiplicao atravs da induo de gemas adventcias por organognese direta ou indireta. O primeiro caso abrange a maioria dos sistemas de micropropagao, envolvendo o isolamento de rgos meristemticos pr-formados, a quebra da dominncia apical e a multiplicao de partes areas com aplicao de citocinina. As gemas axilares que naturalmente se formam nas inseres das folhas so estimuladas a crescer, dando origem a novas partes areas, que por sua vez, repetem o mesmo processo (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Segundo Grattapaglia e Machado (1998), a organognese direta se refere reconstituio de um rgo diretamente, no ocorrendo desdiferenciao, uma vez que o explante j est diferenciado, tendo que reconstituir sistema radicular e parte area; 5

organognese indireta ocorre quando o processo de regenerao de gemas precedido pela formao de calo. A partir de clulas no organizadas do calo, surgem gemas adventcias que crescem e se desenvolvem em novas partes areas. As multiplicaes sucessivas podem dar-se seja pela subdiviso do calo e manuteno de um sistema adventcio, ou alternando-se o processo para a proliferao axilar sem a passagem por calo. Seja qual for a maneira, as partes areas produzidas so individualizadas, enraizadas e transplantadas. A embriognese somtica tambm pode ser direta ou indireta. A maioria dos sistemas de embriognese somtica ocorre pela via indireta, onde calos embriognicos so induzidos e mantidos ao longo da multiplicao. Grandes quantidades de embries podem se formar em suspenses de clulas embriognicas com um mnimo de manipulao manual e espao fsico de laboratrio, principais componentes do custo de uma planta micropropagada. (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). A partir do momento em que se fala do cultivo in vitro, deve-se pensar nas condies em que sero conduzidas as partes vegetais de interesse, pois o comportamento destas passa de autotrfico para heterotrfico, sendo necessrio, portanto, um meio que contenha os nutrientes essenciais para o desenvolvimento e a gerao de uma nova planta; os meios nutritivos utilizados para a cultura de clulas, tecidos e rgos de plantas fornecem as substncias essenciais para o crescimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padro de desenvolvimento in vitro (TORRES; CALDAS; BUSO; 1998).

OBJETIVOS
Objetivos gerais:
Estabelecer um protocolo de cultura de tecidos vegetais in vitro de Etlingera elatior e verificar a sua viabilidade.

Objetivos especficos:
a) Estabelecer o tipo de explante e o processo de desinfestao mais apropriado para o estabelecimento de cultura assptica; b) Definir a composio dos meios de cultura para a multiplicao e o enraizamento de plntulas; c) Definir o tempo de permanncia dos explantes na fase inicial e das plntulas na fase de multiplicao e de enraizamento in vitro;

MATERIAIS E MTODOS
O estudo foi conduzido no laboratrio de cultivo celular vegetal, no Centro de Cincias Tecnolgicas da Terra e do Mar, da Universidade do Vale do Itaja. Os materiais utilizados como explantes foram gemas laterais de Etlingera elatior provenientes de plantas matrizes em boas condies fitossanitrias, mantidas a campo, no banco de germoplasma da Empresa de Pesquisa Agropecuria e Extenso Rural de Santa Catarina (Epagri) - Estao Experimental de Itaja. Os materiais utilizados como fonte de explante foram gemas laterais retiradas em forma de cubos com tamanho aproximado de 1 cm3. Aps seccionados, os explantes foram imediatamente imersos em gua destilada e submetidos pr-desinfestao em bancada. As gemas laterais foram lavadas em gua corrente com detergente neutro e gua destilada sob agitao, imersos em soluo desinfestante contendo Benlate (1 g.L-1) + Manzate (1,5 g.L-1) + Sulfato de Estreptomicina (200 mg.L-1), por 20 minutos, e posteriormente em hipoclorito de clcio 4% (CaClO 4%) por 2 minutos. Aps a pr-desinfestao foram realizados cinco tratamentos de desinfestao (Tabela 1) em cmara de fluxo laminar com Etanol 70% e CaClO 5%. Os explantes que apresentaram contaminao por bactrias aps duas semanas de cultivo, foram submetidos nova desinfestao (TA06), em etanol 70%, NaClO1% e em CaClO 2%. Posteriormente foram inoculados em meio de cultura de Murashige & Skoog (1962) (MS) com 9 g.L-1 de gar e 30 g.L-1 de sacarose, adicionado de 0,5 mg.L-1 de 6benzilaminopurina (BAP).

Tabela 1. Tempo de imerso dos explantes aos agentes desinfestantes qumicos utilizados no processo de assepsia na cmara de fluxo laminar de gemas laterais de Etlingera elatior. Tratamentos TA01 TA02 TA03 TA04 TA05
15 10 13 08 10 Nmero de observaes

Etanol 70% 1 min. 2 min. 3 min. 4 min. 5 min. Etanol 70% 15 seg. NaClO 1% 5 min.

CaClO 5% 30 min. 25 min. 20 min. 15 min. 10 min. CaClO 2% 10 min.

TA06*

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Aps 100 dias de incubao, os explantes estabelecidos assepticamente foram utilizados nos experimentos das fases seguintes. Na fase de proliferao os explantes foram inoculados em meio slido MS, na presena da citocinina BAP, com trs repeties por tratamento e um explante por parcela, durante 40 dias (Tabela 2). Para o enraizamento, as plntulas foram submetidas a trs tratamentos em meio MS com 50% da concentrao salina, na presena e na ausncia da auxina AIB (cido Indol Butrico), sendo 4 repeties por tratamento e 1 explante por parcela, durante 20 dias (Tabela 3). As culturas foram mantidas em sala de crescimento sob temperatura de 28 2C, e fotoperodo de 16 horas com intensidade luminosa de 40 a 50 mol.m-2.s-1. Os dados obtidos nos diferentes ensaios foram submetidos anlise de varincia e as mdias foram comparadas pelo teste de Tukey ao nvel de significncia de 5%.

Tabela 2. Meio de cultura slido de Murashige & Skoog (1962) (MS), adicionado de diferentes concentraes da citocinina BAP para a fase de proliferao de plntulas de Etlingera elatior . Tratamentos Regulador de Crescimento MS BAP mg.L-1 0,5 TP01 1,0 TP02 2,0 TP03 4,0 TP04

Tabela 3. Meio de cultura slido de Murashige & Skoog (1962) (MS) com 50% da concentrao salina, na presena e na ausncia da auxina AIB para a fase de enraizamento das plntulas de Etlingera elatior . Tratamentos Regulador de Crescimento AIB mg.L-1 MS 50% T06 MS 50% 0,5 T07 MS 50% 1,0 T08

RESULTADOS E DISCUSSO
Assepsia
O sucesso na obteno de explantes asspticos para o estabelecimento da cultura in vitro depende da eficincia da combinao dos agentes qumicos, das concentraes e dos tempos de exposio em relao ao nvel de contaminao dos tecidos. A exposio das gemas laterais de Etlingera elatior aos tratamentos de desinfestao resultou em nveis de contaminao que variaram de 25,00 a 66,67% e de 10,00 a 75,00% para bactrias e fungos, respectivamente (Tabela 4). O aumento gradual do tempo de exposio dos explantes ao Etanol 70% (1, 2, 3 e 4 minutos) combinado com a diminuio gradual do tempo de exposio ao CaClO 5% (30, 25, 20 e 15 minutos), apresentou uma tendncia de reduo do nvel de contaminao por bactrias, e um aumento da contaminao por fungos. Entretanto, a imerso dos explantes em Etanol 70% por 5 minutos, e CaClO 5% por 10 minutos (TA05) apresentou menor eficincia na eliminao de bactrias (60,00%) e um aumento na eficincia do controle de fungos (20,00%) (Figura 2). Tabela 4. Porcentagem de contaminao e sobrevivncia das gemas laterais de Etlingera elatior submetidas desinfestao, e inoculadas em meio slido de Murashige & Skoog (1962) (MS), adicionado de 0,5 mg.L-1 BAP, aps 100 dias de cultivo in vitro.
Tratamento TA01 - etanol 70% 1min + CaClO 5% 30 min TA02 - etanol 70% 2min + CaClO 5% 25 min TA03 - etanol 70% 3min + CaClO 5% 20 min TA04 - etanol 70% 4min + CaClO 5% 15 min TA05 - etanol 70% 5min + CaClO 5% 10 min TA06 - etanol 70% 15 seg + NaClO1% 5min + CaClO 2% 10 min Nmero de observaes 15 10 13 08 10 10 Contaminao (%) Bactria 66,67 30,00 38,46 25,00 60,00 50,00 Fungo 13,33 40,00 30,77 75,00 20,00 10,00 Sobrevivncia/ Morte (%) 20,00/0,00 30,00/0,00 30,77/0,00 0,00/0,00 10,00/10.00 40,00/10,00

O tratamento de desinfestao de gemas contaminadas por bactrias, aps duas semanas de cultivo in vitro (TA06), utilizando Etanol 70% por 15 segundos; NaClO 1% por 5 minutos e CaClO 2% por 10 minutos, tambm apresentou uma elevada taxa de contaminao por bactrias (50,00%). Entretanto, apesar do maior tempo de exposio dos tecidos aos agentes qumicos, este tratamento apresentou a maior taxa de sobrevivncia de culturas

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asspticas. A exposio das gemas ao etanol 70% e aos compostos a base de cloro, hipoclorito de sdio e de clcio, promoveu elevada contaminao dos explantes por bactria.

Figura 2. Viso geral das culturas in vitro de Etlingera elatior durante a fase de obteno de culturas asspticas, mantidas em cmara de crescimento sob 16 horas de fotoperodo a 40 a 50 mol.m-2.s-1 e 28 2 C. A= 10, B= 30 e C= 45 dias de cultivo. Segundo Grattapaglia e Machado (1998), vrias substncias com ao germicida so utilizadas para fazer a desinfestao de explantes, sendo que sua composio e concentrao no podem ser txicas aos tecidos, e que o pr-tratamento aplicado na planta matriz determinante para o sucesso da desinfestao, principalmente no que se refere aos microrganismos endgenos. rgos de plantas que crescem sob o solo no so os melhores explantes para iniciar uma cultura devido a alta taxa de contaminao (HUSSEY, 1925 b, c), como o caso das gemas laterais de Etlingera elatior. Segundo Kane (2000) e Schwertner e Zaffari (2003) outros fatores como o tamanho inicial do explante e suas caractersticas morfolgicas podem interferir na eficincia do etanol e do hipoclorito de clcio na eliminao dos agentes contaminantes. Enjalric, Carron e Lardet (1988) obtiveram 21% de culturas asspticas a partir de gemas axilares com 3 mm de Hevea, 42% a partir de meristemas com 6 mm, e 74% a partir de pices caulinares com 1 mm. Apesar da dificuldade de obter culturas asspticas de gemas laterais de Cochlearia armoracia, Gorecka (1987) obteve excelentes resultados na assepsia de segmentos foliares desta espcie. Segundo Grattapaglia e Machado (1998) contaminaes bacterianas endgenas, so de difcil destruio e se tornam um srio problema nas fases de multiplicao das culturas. Os percentuais de sobrevivncia de explantes asspticos obtidos nos tratamentos TA01, TA02 e TA03 apresentaram uma correlao positiva com o aumento do tempo de exposio ao etanol 70%. Entretanto, o aumento do tempo de exposio das gemas laterais de 3 para 4 e 5 minutos

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ao etanol 70% resultou em diminuio da sobrevivncia de explantes asspticos. Este fato pode ser explicado, uma vez que o etanol um desnaturante de protenas, solvente lipdico e desidratante o que leva a lesar as estruturas celulares fundamentais dos microrganismos e da clula vegetal (PELCZAR, REID, CHAN, 1980). Segundo Grattapaglia e Machado (1998), alm da ao germicida, o etanol surfactante, removendo as ceras superficiais dos tecidos e se aplicado inicialmente, facilita a ao de outros agentes desinfestantes. Juntamente com o etanol 70%, os compostos base de cloro, tais como o hipoclorito de clcio (CaClO) e de sdio (NaClO), so os agentes mais comuns utilizados na desinfestao de material vegetal. Sendo que os hipocloritos sofrem hidrlise, e formam o cido hipocloroso e este tambm decomposto, libera oxignio nascente que age sobre os constituintes celulares, oxidante enrgico, e leva os microrganismos morte. A destruio destes microrganismos e do tecido vegetal pelo cloro e seus derivados, tambm se deve combinao do cloro com protenas da membrana citoplasmtica e com enzimas (PELCZAR, REID, CHAN, 1980). A sensibilidade dos tecidos dos explantes aos agentes desinfestantes, etanol e hipoclorito, varia com a espcie e com o tipo de tecido. Kosh-Khui e Sink (1982 a) verificaram que meristemas de rosa foram mais sensveis ao excesso de hipoclorito de sdio do que as gemas laterais, mesmo quando submetidos a tratamentos leves. Estudos com pices caulinares de Vitis apresentaram elevada taxa de mortalidade quando tratados com hipoclorito (MARTINEZ E TIZIO, 1989). Entretanto, o estabelecimento de culturas asspticas de Cordyline sp. s foi possvel a partir de gema apical, uma vez que solues de etanol e hipoclorito penetram no caule e matam as gemas laterais (DEBERGH E MAENE, 1981). Gemas de Seringa e de outras plantas ornamentais arbustivas so muito sensveis ao hipoclorito quando coletadas antes da primavera, porm gemas extradas um ano aps foram mais resistentes s solues de desinfestao, porm apresentaram elevada contaminao. Grattapaglia e Machado (1998) afirmam que as bactrias endgenas, em geral, no so patognicas, mas, competindo pelo meio de cultura, comprometem a multiplicao, o crescimento e posterior enraizamento da planta. Por serem de lento crescimento e de difcil visualizao, podem ser transmitidas de um material para outro. Outro fator que favorece a disseminao dessas bactrias o fato de serem resistentes s rpidas imerses em etanol absoluto e s altas temperaturas atingidas durante a flambagem dos instrumentos. A adio de antibiticos aos meios de cultura interessante para o controle de contaminaes bacterianas endgenas, entretanto, dificilmente esses antibiticos conseguem eliminar completamente as bactrias, por possurem ao bacteriosttica (Figura3).

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Figura 3. Gemas laterais de Etlingera elatior durante a fase de assepsia. A Contaminao por bactria e morte em meio de cultura MS + 0,5 BAP. B Contaminao por bactria e morte em meio de cultura MS + 0,5 BAP suplementado com estreptomicina. C Plntula aparentemente assptica, apresentando crescimento, em meio de cultura MS + 0,5 BAP suplementado com estreptomicina.

Multiplicao
A induo de brotos na fase de proliferao estimulada pela diminuio da dominncia apical, que pode ser induzida por dano mecnico na gema apical ou pelo controle qumico com adio de citocininas ao meio de cultura. Entretanto, o cultivo de gemas laterais de E. elatior em meio MS adicionado de 0,5; 1,0; 2,0; e 4,0 mg.L-1 de BAP no promoveu satisfatoriamente a induo de brotos (Tabela 5). Tabela 5. Valores mdios do crescimento e do nmero de razes e brotos na fase de proliferao de gemas laterais de Etlingera elatior, cultivadas em meio slido de Murashige & Skoog (1962) (MS) adicionado das diferentes concentraes de BAP, aps 20 dias de cultivo in vitro (N=3).
Tratamento TP01 - MS + 0,5 BAP mg.L-1 TP02 -MS + 1,0 BAP mg.L-1 TP03 - MS + 2,0 BAP mg.L-1 TP04 - MS + 3,0 BAP mg.L-1 Crescimento das Plntulas (cm) 0,53 a 0,67 a 0,40 a 0,60 a Nmero de Razes 0,00 a 0,67 a 0,33 a 0,00 a Nmero de brotos 0,00 a 0,33 a 0,33 a 0,33 a

Mdias seguidas da mesma letra no diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p< 0,05).

Na maioria das plantas superiores, o crescimento da gema apical inibe o crescimento das gemas laterais (Figura4), enquanto que a aplicao direta de citocininas estimula a diviso celular e o crescimento dessas gemas, suprimindo o efeito inibitrio do pice caulinar (TAIZ E ZEIGER, 2004). Provavelmente, o menor desenvolvimento dos brotos laterais na espcie E.

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elatior na fase de multiplicao se deve alta dominncia apical das plntulas, e/ou a ineficincia dos nveis de citocinina presente no meio de cultura em alterar a relao auxinas/citocininas nos tecidos. A adio de fitorreguladores em culturas vegetais in vitro tem o objetivo principal de suprir as possveis deficincias dos teores endgenos de hormnios nos explantes que se encontram isolados das regies produtoras na planta-matriz (GEORGE, 1993). Entretanto, o tempo de permanncia de apenas 20 dias na presena de citocinina pode no ter sido suficiente para a induo dos brotos. Segundo Peres (2002), a falta de ao do regulador de crescimento na morfognese in vitro depende da sensibilidade e do metabolismo na clula, alm do nvel endgeno de outros reguladores.

Figura 4. Diferentes padres morfogenticos de Etlingera elatior apresentados na fase de proliferao. A Brotamento de gema lateral sem apresentar crescimento do explante. B Crescimento do explante, com inibio do crescimento do broto lateral. C Crescimento do explante e das brotaes laterais. A ao da citocinina BAP sobre o crescimento das plntulas, no promoveu um efeito significativo mesmo com o aumento da concentrao no meio de cultura. Apesar da citocinina estimular o crescimento da parte area, a obteno de baixa resposta morfogentica no nmero de brotos e no crescimento das plntulas pode ser devido falta de ao do regulador de crescimento, uma vez que as plntulas apresentaram alta dominncia apical. O efeito inibitrio da citocinina na induo de razes pode ser observado nos tratamentos com maior concentrao, o que corrobora com os resultados de que as citocininas so responsveis pela inibio do crescimento e diviso celular das razes in vitro (TAIZ E ZEIGER, 2004). Entretanto, apenas os explantes cultivados em meio MS adicionado de 1,0 e 2,0 mg.L-1 de BAP e que apresentaram brotao promoveram a formao de razes. Este fato

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pode estar relacionado produo de auxina pela parte area da planta e dos brotos, pois o transporte baspeto do cido Indol Actico (AIA) rpido e promove alterao no balano endgeno auxina/citocinina.

Enraizamento
A induo de razes na fase in vitro ocorreu em todos os tratamentos. Entretanto, a rizognese no promoveu diferenas significativas no crescimento das plntulas, no nmero de brotos e no comprimento das razes (Tabela 6).

Tabela 6. Efeito de diferentes concentraes de auxina AIB sobre o enraizamento de plntulas de Etlingera elatior em meio slido de Murashige & Skoog (1962) (MS) com 50% da concentrao salina, aps 22 dias de cultivo in vitro. (N=4)
Crescimento Tratamento das Plntulas (cm) Nmero de Brotos Nmero de Razes Comprimento das Razes (cm) Morfologia das Razes

TE01 - MS 50%

2,25 a

0,00 a

2,75 ab

4,21 a

Finas com ramificaes

TE02 - MS 50% + 0,5 AIB mg.L-1

Finas com
2,15 a 0,50 a 4,00 a 2,52 a

ramificaes
TE03 - MS 50% + 1,0 AIB mg.L-1

Grossas sem
3,05 a 1,25 a 1,50 b 3,00 a

ramificaes
Mdias seguidas da mesma letra no diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p< 0,05).

A presena de brotaes nesta fase pode ser devido ao efeito residual da citocinina da fase de multiplicao, sabendo-se que o efeito da citocinina no se restringe a uma subcultura (GRATTAPAGLIA E MACHADO, 1998) ou ento devido reduo da dominncia apical, realizada mecanicamente, na fase anterior (TAIZ E ZEIGER, 2004). O cultivo das plntulas de Etlingera elatior em meio MS com 50% dos sais, adicionado de 0,5 mg.L-1 de AIB induziu o maior nmero de razes (Figura 5), diferindo significativamente do tratamento com o dobro da concentrao de auxina. Vrias espcies enrazam na presena de nveis muito baixos, ou mesmo, na ausncia de auxina no meio de cultura (ANDERSON, 1984). No presente trabalho, as plntulas apresentaram resposta morfogentica positiva na induo de razes quando da utilizao de diluio na formulao do meio e da adio de baixas concentraes de auxina. De acordo com Grattapaglia e

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Machado (1998), mesmo na presena de auxinas, altas concentraes de sais tendem a inibir as fases do enraizamento, particularmente a de crescimento das razes, aonde as diluies das formulaes bsicas dos meios de cultura tm possibilitado melhor enraizamento.

Figura 5. Induo e formao de razes em plntulas de Etlingera elatior, durante a fase de enraizamento in vitro, aps 22 dias de cultivo. Tratamento TE02.

As diferentes morfologias das razes obtidas parecem estar relacionadas concentrao de auxina (AIB) presente no meio de cultura. Os tratamentos que apresentam baixa concentrao (0,5 mg.L-1) ou ausncia ramificaes. Entretanto, a adio de 1,0 mg.L
-1

de AIB induziram razes finas com de AIB ao meio de cultura promoveu a

induo de razes grossas sem ramificaes. Zimmerman (1984) afirma que a melhor concentrao de auxina a mnima necessria para proporcionar uma iniciao radicular satisfatria desde que esta possibilite o maior crescimento e desenvolvimento das razes sem a formao de calo. No entanto, mesmo em menores concentraes a presena de auxina durante todo o perodo de enraizamento pode tornar-se prejudicial ao desenvolvimento das mesmas. Possivelmente, isto pode explicar a alterao morfolgica das razes, de finas com ramificaes para grossas sem ramificaes no presente trabalho.

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CONCLUSES
Com base nos resultados obtidos, verificou-se que possvel o cultivo in vitro de Etlingera elatior visando produo de mudas de alta qualidade gentica e fitossanitria, como fonte de matria-prima para utilizao teraputica. O estabelecimento de culturas asspticas de Etlingera elatior pode ser obtido com uso de etanol 70% e CaClO 5% como agentes desinfestantes. Os explantes contaminados na fase de estabelecimento das culturas asspticas podem ser submetidos a novo processo de desinfestao viabilizando maior nmero de culturas asspticas para a fase seguinte. A elevada dominncia apical das plntulas de Etlingera elatior reflete a baixa taxa de multiplicao. A induo da rizognese em plntulas de Etlingera elatior independe da presena de auxina. Concentraes menores de AIB so mais eficientes na induo de razes O tempo de permanncia dos explantes durante a fase inicial deve ser em torno de 90 100 dias, sendo este um tempo eficiente para a anlise da contaminao ou no por bactrias endgenas. A permanncia das plntulas de Etlingera elatior na fase de enraizamento por 20 dias suficiente para que estas possam seguir para a aclimatizao. A alta dominncia apical das plntulas de Etlingera elatior verificada na fase de multiplicao no permite estabelecer o tempo necessrio nesta fase.

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CONSIDERAO FINAL
Considerando-se que o processo de produo de mudas in vitro deve ser economicamente vivel, h necessidade de mais estudos visando aumentar a taxa de multiplicao dos explantes, pois a espcie apresenta elevada dominncia apical.

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APNDICES
Meio de Murashige & Skoog (1962) (MS) Macronutrientes g.L-1 KNO3 1,9 CaCl2.H2O 0,44 MgSO4.7H2O 0,37 KH2PO4 0,17 NH4.NO3 1,65 Micronutrientes g.L-1 MnSO4.4H2O 0,0223 ZnSO4.7H2O 0,0086 0,0062 H3BO3 KI 0,0083 Na2MoO.2H2O 0,00025 CuSO4.5 H2O 0,00025 CoCl2.6 H2O 0,00025 Fe.EDTA g.L-1 0,0372 Na2- EDTA FeSO4- . 7 H2O 0,0278 Vitaminas g.L-1 Glicina 2,0 cido nicotnico 0,5 Piridoxina 0,5 Tiamina 0,1

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